JPH0580455B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血液凝固第因子の低温殺菌されそし
て精製された製剤の製法に関する。この製剤は血
液凝固障害の治療に使用されうる。
て精製された製剤の製法に関する。この製剤は血
液凝固障害の治療に使用されうる。
血液凝固は、数種の反応段階を経て進行しそし
てそれにはローマ数字で示される少くとも13種の
凝固因子（Ｆ）が関与している複雑な過程であ
る。凝固因子は主に蛋白質特にプロテアーゼまた
は促進剤の性質を備えたものである。唯一の有効
な基質はフイブリノゲンであり、このものは損傷
の際トロンビンによりその不溶性形態物であるフ
イブリンに変換され、このものが最初の創傷閉鎖
を形成する。13種の凝固因子のうちの１種が欠落
している場合、トロンビンおよびフイブリンの形
成が起らず、その結果は出血である。かかる例の
一つは出血性傾向を有する最も広く分布する疾患
でありかつ第因子の欠乏を特徴とするＡ型血友
病である。Ａ型およびＢ型（第因子欠乏）血友
病は欠落している因子を置換することによつての
み有効に治療されうる。
てそれにはローマ数字で示される少くとも13種の
凝固因子（Ｆ）が関与している複雑な過程であ
る。凝固因子は主に蛋白質特にプロテアーゼまた
は促進剤の性質を備えたものである。唯一の有効
な基質はフイブリノゲンであり、このものは損傷
の際トロンビンによりその不溶性形態物であるフ
イブリンに変換され、このものが最初の創傷閉鎖
を形成する。13種の凝固因子のうちの１種が欠落
している場合、トロンビンおよびフイブリンの形
成が起らず、その結果は出血である。かかる例の
一つは出血性傾向を有する最も広く分布する疾患
でありかつ第因子の欠乏を特徴とするＡ型血友
病である。Ａ型およびＢ型（第因子欠乏）血友
病は欠落している因子を置換することによつての
み有効に治療されうる。
特に患者の自己治療に必要であるような、良好
な収量および高い純度でのヒトの血漿からの第
因子の取得は今なお最適には解決されていない問
題である。このことは慣用の商業上の製品とます
ます置き代わる低温殺菌された第因子濃縮物に
特にあてはまる、何故ならそれによつて肝炎感染
の危険が排除されうるからである。
な収量および高い純度でのヒトの血漿からの第
因子の取得は今なお最適には解決されていない問
題である。このことは慣用の商業上の製品とます
ます置き代わる低温殺菌された第因子濃縮物に
特にあてはまる、何故ならそれによつて肝炎感染
の危険が排除されうるからである。
良好な収率で高度精製された第因子を単離す
ることは、第因子がクリオ沈澱
（cryoprecipitate）中でさえ濃縮されるが、しか
し第因子と類似した物理化学的性質を有する比
較的高分子で難溶性の２種類の蛋白質フイブリノ
ゲンおよびフイブロネクチンと会合しているとい
う事実により特に困難である。
ることは、第因子がクリオ沈澱
（cryoprecipitate）中でさえ濃縮されるが、しか
し第因子と類似した物理化学的性質を有する比
較的高分子で難溶性の２種類の蛋白質フイブリノ
ゲンおよびフイブロネクチンと会合しているとい
う事実により特に困難である。
第因子濃縮物はできるだけ純粋であるべきで
ある、すなわち望ましからぬ異種蛋白質そして特
に同種凝集素を含めた免疫グロブリンを含まざる
べきである。というのは非特異的な蛋白質の投与
は細網内皮組織系（RES）の過度緊張を来しそ
してリンパ球集団および免疫グロブリンの組成に
おける変化により明示される免疫防御の侵害を生
ずるからである。このことは、血友病がかかる第
因子濃縮物で終生治療されねばならないという
事実と組合わされると重要となる。このことから
天然の、高度精製され低温殺菌された
（pasteurized）第因子濃縮物、すなわち肝炎ウ
イルスおよび他の感染性物質の感染および同種抗
原に対する感作が排除された生成物への要求が生
ずる。
ある、すなわち望ましからぬ異種蛋白質そして特
に同種凝集素を含めた免疫グロブリンを含まざる
べきである。というのは非特異的な蛋白質の投与
は細網内皮組織系（RES）の過度緊張を来しそ
してリンパ球集団および免疫グロブリンの組成に
おける変化により明示される免疫防御の侵害を生
ずるからである。このことは、血友病がかかる第
因子濃縮物で終生治療されねばならないという
事実と組合わされると重要となる。このことから
天然の、高度精製され低温殺菌された
（pasteurized）第因子濃縮物、すなわち肝炎ウ
イルスおよび他の感染性物質の感染および同種抗
原に対する感作が排除された生成物への要求が生
ずる。
本発明はかかる肝炎感染が排除されかつ同種凝
集素を含まない製剤およびその製法に関する。
集素を含まない製剤およびその製法に関する。
実際上プロトロンビン複合物の因子（第，
，および因子）を含まない第因子含有溶
液が、それ自体知られた方法で、熱による不活性
化に対し保護するために炭水化物含有安定剤を添
加したのち低温殺菌し、この加熱された溶液をPH
５〜6.5で陰イオン交換体で処理し、吸着された
第因子から随伴蛋白質特にフイブリノゲン、フ
イブロネクチンおよび同種凝集素を含む免疫グロ
ブリンが除去されるまで洗い、ハロゲンとのNa
−，Ｋ−またはCa−塩の濃厚溶液で溶離しそし
て例えば沈澱により溶出液から取得されうること
が見出された。
，および因子）を含まない第因子含有溶
液が、それ自体知られた方法で、熱による不活性
化に対し保護するために炭水化物含有安定剤を添
加したのち低温殺菌し、この加熱された溶液をPH
５〜6.5で陰イオン交換体で処理し、吸着された
第因子から随伴蛋白質特にフイブリノゲン、フ
イブロネクチンおよび同種凝集素を含む免疫グロ
ブリンが除去されるまで洗い、ハロゲンとのNa
−，Ｋ−またはCa−塩の濃厚溶液で溶離しそし
て例えば沈澱により溶出液から取得されうること
が見出された。
エクテオラ（Ecteola）−セルロースおよび
QAE（第四アミノエチル）基を担持する陰イオン
交換体はすでに第因子の精製に使用された〔バ
ン・クレベルト・エス（van Creveld.S.）氏他、
「トロンボ・ジアス・ヘム（Thromb.Diath.
Haem.）」第巻第２／３号第282頁（1961年）
およびバウ・アール（Baugh.R.）氏他、「バイオ
ケム・バイオフイズ・アクタ（Bioch.Biophys.
Acta）」第371巻第360頁（1974年）参照〕。しか
しながらパイロツトプラントおよび製造規模への
移行は可能でなかつた。唯予め分別された物質の
高度精製にはイオン交換クロマトグラフイーが使
用できた〔フエイ・フ・ジエー（Fay，Ph.J.）
氏他の「プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.
Natl.Acad.Sci.）」第79巻第7200頁（1982年）参
照〕。高い特異性を以つて吸着させるのはPH約5.5
でのみ遂行される。しかしながら大抵のクリオ沈
澱中に含有される蛋白質、なかんずくヒトフイブ
リノゲンはすでにそして特にカラム中の吸着剤と
接触すると沈澱する。さらにここに引用された操
作法によれば比較的大量の吸着剤が必要である。
このことはまた明らかに第因子の大量の吸着剤
への非特異的吸着−その生理学的仕事は、結局、
非生理学的表面に付着することである−に起因し
てわずかであつた収量に法外な影響を及ぼしてい
たと思われる。QAE交換体で高度精製された物
質はその活性を速やかに失うことも見出された。
それゆえ第因子生成物には陰イオン交換体は使
用されなかつた。
QAE（第四アミノエチル）基を担持する陰イオン
交換体はすでに第因子の精製に使用された〔バ
ン・クレベルト・エス（van Creveld.S.）氏他、
「トロンボ・ジアス・ヘム（Thromb.Diath.
Haem.）」第巻第２／３号第282頁（1961年）
およびバウ・アール（Baugh.R.）氏他、「バイオ
ケム・バイオフイズ・アクタ（Bioch.Biophys.
Acta）」第371巻第360頁（1974年）参照〕。しか
しながらパイロツトプラントおよび製造規模への
移行は可能でなかつた。唯予め分別された物質の
高度精製にはイオン交換クロマトグラフイーが使
用できた〔フエイ・フ・ジエー（Fay，Ph.J.）
氏他の「プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.
Natl.Acad.Sci.）」第79巻第7200頁（1982年）参
照〕。高い特異性を以つて吸着させるのはPH約5.5
でのみ遂行される。しかしながら大抵のクリオ沈
澱中に含有される蛋白質、なかんずくヒトフイブ
リノゲンはすでにそして特にカラム中の吸着剤と
接触すると沈澱する。さらにここに引用された操
作法によれば比較的大量の吸着剤が必要である。
このことはまた明らかに第因子の大量の吸着剤
への非特異的吸着−その生理学的仕事は、結局、
非生理学的表面に付着することである−に起因し
てわずかであつた収量に法外な影響を及ぼしてい
たと思われる。QAE交換体で高度精製された物
質はその活性を速やかに失うことも見出された。
それゆえ第因子生成物には陰イオン交換体は使
用されなかつた。
しかしながら今、驚くべきことに、塩基性イオ
ン交換体でのクロマトグラフイーが第因子製剤
の生産に完全に適することが見出された。低温殺
菌されたクリオ沈澱から出発して、陰イオン交換
クロマトグラフイーにより高度精製された第因
子製剤が一段階で得られうることは驚くべきこと
であつた。
ン交換体でのクロマトグラフイーが第因子製剤
の生産に完全に適することが見出された。低温殺
菌されたクリオ沈澱から出発して、陰イオン交換
クロマトグラフイーにより高度精製された第因
子製剤が一段階で得られうることは驚くべきこと
であつた。
それゆえ本発明は第因子を含有する溶液を炭
水化物含有安定剤の存在下に低温殺菌および精製
することにより第因子製剤を製造するに当り、
この溶液を炭水化物に基づく陰イオン交換体で処
理し、その交換体を洗滌しそして第因子を溶離
することからなる方法に関する。
水化物含有安定剤の存在下に低温殺菌および精製
することにより第因子製剤を製造するに当り、
この溶液を炭水化物に基づく陰イオン交換体で処
理し、その交換体を洗滌しそして第因子を溶離
することからなる方法に関する。
出発物質としてはプール（Pool）氏他の「ネ
ーチヤー（Nature）」第203巻第312頁（1964年）
記載の方法により得られるクリオ沈澱、コーン
（Cohn）フランクシヨン〔ミノツト・ジー・ア
ール（Minot G.R.）氏他の「ジエー・クリン・
インベスト（J.Clin.Invest.）」第24巻第704頁
（1945年）参照〕、血漿、第：Ｃ因子含有細胞培
養基ならびにこれから得られた第因子含有副フ
ラクシヨンが適当である。しかしながらクリオ沈
澱またはコーンフラクシヨンを直接使用するの
が好都合である。
ーチヤー（Nature）」第203巻第312頁（1964年）
記載の方法により得られるクリオ沈澱、コーン
（Cohn）フランクシヨン〔ミノツト・ジー・ア
ール（Minot G.R.）氏他の「ジエー・クリン・
インベスト（J.Clin.Invest.）」第24巻第704頁
（1945年）参照〕、血漿、第：Ｃ因子含有細胞培
養基ならびにこれから得られた第因子含有副フ
ラクシヨンが適当である。しかしながらクリオ沈
澱またはコーンフラクシヨンを直接使用するの
が好都合である。
低温殺菌中第因子を熱による不活性化から保
護するための安定剤としては炭水化物およびアミ
ノ酸、好ましくは蔗糖35〜60ｇ／溶液100ｇおよ
びグリシン１〜３モル／溶液１ならびに場合に
よりカルシウムイオンが使用されうる。例えば西
ドイツ特許公開公報第2916711号または3237512号
の記載に従い操作しうる。
護するための安定剤としては炭水化物およびアミ
ノ酸、好ましくは蔗糖35〜60ｇ／溶液100ｇおよ
びグリシン１〜３モル／溶液１ならびに場合に
よりカルシウムイオンが使用されうる。例えば西
ドイツ特許公開公報第2916711号または3237512号
の記載に従い操作しうる。
第因子を吸着させるための陰イオン交換体と
しては例えばDEAE QAEまたはエクテオラ基を
担持する交換体そしてしかも特にセルロース、セ
フアデツクスまたはセフアロースに基くもの、が
適当であるがしかし好ましくはDEAE−セフアロ
ースが適当である。
しては例えばDEAE QAEまたはエクテオラ基を
担持する交換体そしてしかも特にセルロース、セ
フアデツクスまたはセフアロースに基くもの、が
適当であるがしかし好ましくはDEAE−セフアロ
ースが適当である。
バン・クレベルト（van Creveld）およびバウ
（Baugh）（前出）の方法と異なりこれらの交換体
は第因子の精製に事実適当であるが、しかしこ
れまで知られていずかつ以下に記載される条件下
においてである。
（Baugh）（前出）の方法と異なりこれらの交換体
は第因子の精製に事実適当であるが、しかしこ
れまで知られていずかつ以下に記載される条件下
においてである。
吸着条件は決定的に重要であることが証明され
た。すなわち第因子は生理学的な食塩環境中、
好ましくはPH5.5で実質上選択的にDEAE−セフ
アロースに結合され、一方フイブリノゲンおよび
フイブロネクチンのような随伴蛋白質は上澄み中
に残留する（バツチ法）かまたはカラムを通過す
ることが同様に驚くべきことに見出された。終り
に、これも驚くべきことに、クリオグロブリンの
低温殺菌された溶液が一般にPH5.5で生理学的な
食塩環境中においてクロマトグラフイーされうる
ことも見出された。というのはこの慣用条件では
すでにある種のクリオグロブリンなかんずくフイ
ブリノゲンが沈澱するからである。第因子が陰
イオン交換体に結合される吸着そして特にその異
性性は中性点に向うにつれて強く低下する。しか
しながら正常なクロマトグラフイ条件下では
DEAEはPH7.0以上ではじめて負荷される。しか
しながら沈澱はここに記載されている方法では起
らない。何故なら低温殺菌以来安定剤として添加
されそしてクリオ溶液中に存在する炭水化物がフ
イブリノゲンおよびcig（cold insoluble
globuline＝フイブロネクチン）を軽い酸性媒体
中で溶液中に保持するからである。
た。すなわち第因子は生理学的な食塩環境中、
好ましくはPH5.5で実質上選択的にDEAE−セフ
アロースに結合され、一方フイブリノゲンおよび
フイブロネクチンのような随伴蛋白質は上澄み中
に残留する（バツチ法）かまたはカラムを通過す
ることが同様に驚くべきことに見出された。終り
に、これも驚くべきことに、クリオグロブリンの
低温殺菌された溶液が一般にPH5.5で生理学的な
食塩環境中においてクロマトグラフイーされうる
ことも見出された。というのはこの慣用条件では
すでにある種のクリオグロブリンなかんずくフイ
ブリノゲンが沈澱するからである。第因子が陰
イオン交換体に結合される吸着そして特にその異
性性は中性点に向うにつれて強く低下する。しか
しながら正常なクロマトグラフイ条件下では
DEAEはPH7.0以上ではじめて負荷される。しか
しながら沈澱はここに記載されている方法では起
らない。何故なら低温殺菌以来安定剤として添加
されそしてクリオ溶液中に存在する炭水化物がフ
イブリノゲンおよびcig（cold insoluble
globuline＝フイブロネクチン）を軽い酸性媒体
中で溶液中に保持するからである。
すなわちここに記載される方法の長所は、炭水
化物の存在下における陰イオン交換体への低温殺
菌されたクリオグロブリンの吸着に際しフイブリ
ノゲンおよびフイブロネクチンが上澄み液中にま
たは流出液中に存在しそしてそれから低温殺菌さ
れた生成物として取得されうるという点にある。
フイブロネクチンは例えば西ドイツ特許公開公報
第2848529号記載の方法による。
化物の存在下における陰イオン交換体への低温殺
菌されたクリオグロブリンの吸着に際しフイブリ
ノゲンおよびフイブロネクチンが上澄み液中にま
たは流出液中に存在しそしてそれから低温殺菌さ
れた生成物として取得されうるという点にある。
フイブロネクチンは例えば西ドイツ特許公開公報
第2848529号記載の方法による。
例えばDEAEまたはQAE交換体でのクロマト
グラフイーは軽い酸性媒体（PH5.5）中でそして
適当に、例えば0.1モル／のリジンを含有する。
0.1モル／の酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平
衡化された交換体で遂行される。この緩衝液を用
いて、低温殺菌された第因子を含有する溶液を
それがバツチ法またはカラム法で交換体で処理さ
れる前に二倍量まで希釈することもできる。好ま
しくは用いられるバツチにおける吸着は、吸着期
間中交換体への第因子の結合を上澄み液中の第
因子の機能測定により追跡できそして活性消失
後吸着されなかつた因子を沈降または遠心分離に
よりイオン交換体から分離しそしてその直後に第
因子を負荷された交換体の洗滌を開始しうると
いう長所を有する。洗滌はバツチ中例えば吸引
過器上で実施されるのが好ましいが、一方溶離に
は交換体をカラム中に移すことが推奨される、何
故ならカラムクロマトグラフイーによる溶離は第
因子が比較的濃縮されて得られるという長所を
有するからである。実験条件下で第因子50〜
100IU／mlの準位である。
グラフイーは軽い酸性媒体（PH5.5）中でそして
適当に、例えば0.1モル／のリジンを含有する。
0.1モル／の酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平
衡化された交換体で遂行される。この緩衝液を用
いて、低温殺菌された第因子を含有する溶液を
それがバツチ法またはカラム法で交換体で処理さ
れる前に二倍量まで希釈することもできる。好ま
しくは用いられるバツチにおける吸着は、吸着期
間中交換体への第因子の結合を上澄み液中の第
因子の機能測定により追跡できそして活性消失
後吸着されなかつた因子を沈降または遠心分離に
よりイオン交換体から分離しそしてその直後に第
因子を負荷された交換体の洗滌を開始しうると
いう長所を有する。洗滌はバツチ中例えば吸引
過器上で実施されるのが好ましいが、一方溶離に
は交換体をカラム中に移すことが推奨される、何
故ならカラムクロマトグラフイーによる溶離は第
因子が比較的濃縮されて得られるという長所を
有するからである。実験条件下で第因子50〜
100IU／mlの準位である。
第因子を負荷された交換体を洗滌するには、
一方では第因子を解離させないが、しかし他方
では非特異的な蛋白質例えば免疫グロブリンおよ
び従つて同種凝集素のできるだけ定量的な分離に
適当である緩衝液が特に適する。適当な緩衝液と
しては、驚くべきことに、吸着させるための出発
物質がその中に溶解でき、そして0.1モル／の
酢酸ナトリウム、0.1モル／のリジンおよび１
ｇ／のNaClをPH5.5にて含有する緩衝液が良い
ことが判明した。この緩衝液を用いて、第因子
を負荷されたイオン交換体がその溶出液が同種凝
集素を含まなくなるまで洗滌された。試験するに
は不完全抗体をも示す高感度のクームス試験
（Cooms test）が用いられた。
一方では第因子を解離させないが、しかし他方
では非特異的な蛋白質例えば免疫グロブリンおよ
び従つて同種凝集素のできるだけ定量的な分離に
適当である緩衝液が特に適する。適当な緩衝液と
しては、驚くべきことに、吸着させるための出発
物質がその中に溶解でき、そして0.1モル／の
酢酸ナトリウム、0.1モル／のリジンおよび１
ｇ／のNaClをPH5.5にて含有する緩衝液が良い
ことが判明した。この緩衝液を用いて、第因子
を負荷されたイオン交換体がその溶出液が同種凝
集素を含まなくなるまで洗滌された。試験するに
は不完全抗体をも示す高感度のクームス試験
（Cooms test）が用いられた。
陰イオン交換体からの第因子の脱着にはカオ
トロピツクイオンを含む溶液例えばNaClを含有
する濃厚塩溶液が適当である。
トロピツクイオンを含む溶液例えばNaClを含有
する濃厚塩溶液が適当である。
しかしながらNa，ＫまたはCaとハロゲンとの
NaCl以外の塩、KBr，NaBrおよびCaCl2がより
好ましいことが判明した。これらは第因子が単
位容量当り高い活性を有する比較的シヤープなピ
ークとして溶離されるという長所、すなわち沈澱
にとつて重要である長所を有する。
NaCl以外の塩、KBr，NaBrおよびCaCl2がより
好ましいことが判明した。これらは第因子が単
位容量当り高い活性を有する比較的シヤープなピ
ークとして溶離されるという長所、すなわち沈澱
にとつて重要である長所を有する。
濃度は0.05モル／から飽和限界までの範囲に
ある。
ある。
終りに、収量はまた全く実質上溶離速度次第で
あり、これは毎時１〜10ml／cm2好ましくは５〜７
ml／cm2の準位にあるべきである。
あり、これは毎時１〜10ml／cm2好ましくは５〜７
ml／cm2の準位にあるべきである。
第因子を含有する溶出液は慣用の方法、すな
わち硫酸アンモニウムまたはNaClのような中性
塩、好ましくは硫酸アンモニウムと比較してより
速かに透析し出されそしてその上完全には除去さ
れる必要のないNaClを用いる沈澱により濃縮さ
れうる。
わち硫酸アンモニウムまたはNaClのような中性
塩、好ましくは硫酸アンモニウムと比較してより
速かに透析し出されそしてその上完全には除去さ
れる必要のないNaClを用いる沈澱により濃縮さ
れうる。
第因子を含有する沈澱をそれ以上処理するに
は沈澱残留物を例えば、クエン酸ナトリウム
（0.02モル／）、NaCl（0.06モル／）、グリシン
（20ｇ／）およびアルブミン（５ｇ／）を含
有するPH6.9の緩衝液（透析緩衝液）中に溶解さ
せそしてアルブミンを含まない同じ緩衝液で平衡
となるまで透析する方法で遂行される。透析され
た溶液はアルブミンを含有する透析緩衝液で希釈
することにより第因子活性25〜30IU／mlに調
整しそして滅菌過したのち容器に充填しそして
場合により凍結乾燥する。最終生成物は１分以内
に溶解し、蛋白質１mg当り第因子活性５〜
10IUを有し、低温殺菌されそして同種凝集素を
含まない白色の凍結乾燥物である。現在技術水準
による生成物に比較してこのものは何ら望まざる
蛋白質そして特に同種抗原として感受性化を招来
しえた蛋白質を含まないという長所を有する。こ
の生成物は血液群非受溶性を来さなかつた。ウイ
ルス性疾患特に種々の形態の肝炎の感染は排除さ
れていると見られる。この方法の長所は、それが
比較的簡単であることそしてそれゆえ工業的な規
模に困難なく移行されうることおよびわずかな操
作段階からなることである。操作段階の数が少な
いことは良好な収量を証明する、何故なら経験に
よればあらゆる精製段階は多かれ少なかれ活性損
失と結びついているからである。
は沈澱残留物を例えば、クエン酸ナトリウム
（0.02モル／）、NaCl（0.06モル／）、グリシン
（20ｇ／）およびアルブミン（５ｇ／）を含
有するPH6.9の緩衝液（透析緩衝液）中に溶解さ
せそしてアルブミンを含まない同じ緩衝液で平衡
となるまで透析する方法で遂行される。透析され
た溶液はアルブミンを含有する透析緩衝液で希釈
することにより第因子活性25〜30IU／mlに調
整しそして滅菌過したのち容器に充填しそして
場合により凍結乾燥する。最終生成物は１分以内
に溶解し、蛋白質１mg当り第因子活性５〜
10IUを有し、低温殺菌されそして同種凝集素を
含まない白色の凍結乾燥物である。現在技術水準
による生成物に比較してこのものは何ら望まざる
蛋白質そして特に同種抗原として感受性化を招来
しえた蛋白質を含まないという長所を有する。こ
の生成物は血液群非受溶性を来さなかつた。ウイ
ルス性疾患特に種々の形態の肝炎の感染は排除さ
れていると見られる。この方法の長所は、それが
比較的簡単であることそしてそれゆえ工業的な規
模に困難なく移行されうることおよびわずかな操
作段階からなることである。操作段階の数が少な
いことは良好な収量を証明する、何故なら経験に
よればあらゆる精製段階は多かれ少なかれ活性損
失と結びついているからである。
それゆえ本発明はまた免疫グロブリン、同種凝
集素、フイブロネクチンおよび凝固しうるフイブ
リノゲンを実際上含まずそして蛋白質１mg当り約
100単位の特異的な凝血（Ｃ）−活性（第：Ｃ因
子）および第：Ｃ因子対第因子Ｒ：Ag（関連
抗原）の比率が１より大きいことからなる低温殺
菌され、高度精製された第因子製剤にも関す
る。
集素、フイブロネクチンおよび凝固しうるフイブ
リノゲンを実際上含まずそして蛋白質１mg当り約
100単位の特異的な凝血（Ｃ）−活性（第：Ｃ因
子）および第：Ｃ因子対第因子Ｒ：Ag（関連
抗原）の比率が１より大きいことからなる低温殺
菌され、高度精製された第因子製剤にも関す
る。
第因子は第：Ｃ因子およびいわゆるフオ
ン・ビルブラント因子と称される第因子Ｒ：
Agとの間における非共有複合物として血液中を
循環している。PH5.5においてこの複合物は解離
される。本発明の方法によれば第：Ｃ因子は炭
水化物に基づく陰イオン交換体例えばDEAE−セ
フアロースに結合され、一方第因子Ｒ：Agは
上澄み液中に残留する。このために高度精製され
た第：Ｃ因子製剤が得られる。
ン・ビルブラント因子と称される第因子Ｒ：
Agとの間における非共有複合物として血液中を
循環している。PH5.5においてこの複合物は解離
される。本発明の方法によれば第：Ｃ因子は炭
水化物に基づく陰イオン交換体例えばDEAE−セ
フアロースに結合され、一方第因子Ｒ：Agは
上澄み液中に残留する。このために高度精製され
た第：Ｃ因子製剤が得られる。
第因子は下記の方法により測定されうる、す
なわち例えば西ドイツ特許公開公報第2316430号
の記載に従い調製された１部例えば0.1mlの部分
トロンボプラスチンを第因子欠乏血漿１部およ
び希釈された正常血漿１部と混合する。この混合
物を37℃に６分間保持する。予め37℃に加温され
た0.025モル塩化カルシウム溶液の１部を添加し
たのち、塩化カルシウム溶液の添加から凝血塊が
出現するまでに経過する時間を測定する。量的に
表示するには正常血漿の連続的希釈物を用いて用
意された検定曲線が用いられる。
なわち例えば西ドイツ特許公開公報第2316430号
の記載に従い調製された１部例えば0.1mlの部分
トロンボプラスチンを第因子欠乏血漿１部およ
び希釈された正常血漿１部と混合する。この混合
物を37℃に６分間保持する。予め37℃に加温され
た0.025モル塩化カルシウム溶液の１部を添加し
たのち、塩化カルシウム溶液の添加から凝血塊が
出現するまでに経過する時間を測定する。量的に
表示するには正常血漿の連続的希釈物を用いて用
意された検定曲線が用いられる。
第因子１国際単位（＝1IU）は第３回国際
WHO標準に対するサブ標準としての正常血漿１
mlの第因子活性に相当する。
WHO標準に対するサブ標準としての正常血漿１
mlの第因子活性に相当する。
低温殺菌されそして同種凝集素を含まない第
因子製剤の取得法を以下に説明する。
因子製剤の取得法を以下に説明する。
実施例
(1) 出発物質
粗製クリオ沈澱250ｇをグリシン（0.25モル／
）およびヘパリン（1.25USP−単位／ml）を含
有するNaCl溶液（0.08モル／）750ml中に30〜
37℃に加温しながら溶解させる。それにより0.06
モル／のNaCl，0.2モル／のグリシンおよび
ヘパリン約1USP−単位／mlの濃度を有する溶液
1000mlが得られた。この溶液のPH値は1N HClを
用いてPH6.5に調整した。
）およびヘパリン（1.25USP−単位／ml）を含
有するNaCl溶液（0.08モル／）750ml中に30〜
37℃に加温しながら溶解させる。それにより0.06
モル／のNaCl，0.2モル／のグリシンおよび
ヘパリン約1USP−単位／mlの濃度を有する溶液
1000mlが得られた。この溶液のPH値は1N HClを
用いてPH6.5に調整した。
(2) 水酸化アルミニウム吸着
前記(1)項で得られた溶液1000mlに10ｇ／の水
酸化アルミニウムを含有する懸濁液（ベーリング
（Behring）社製品、マールブルグ（Marburg））
80mlを加えそしてこの混合物を15分間攪拌した
（温度約30℃）。次に3000×ｇで15分間遠心分離
し、残留物を捨てそして上澄み液に安定剤を添加
したのち低温殺菌した。
酸化アルミニウムを含有する懸濁液（ベーリング
（Behring）社製品、マールブルグ（Marburg））
80mlを加えそしてこの混合物を15分間攪拌した
（温度約30℃）。次に3000×ｇで15分間遠心分離
し、残留物を捨てそして上澄み液に安定剤を添加
したのち低温殺菌した。
(3) 低温殺菌
前記(2)項で得られた上澄み液1000mlに下記安定
剤をこの順序で加えた。
剤をこの順序で加えた。
１モル／ CaCl2溶液５ml（５ミリモル／
） 蔗糖1000ｇ（溶液１Kg当り500ｇ） グリシン150ｇ（溶液１に対し２モル） PH値は2N NaOHを用いてPH7.3に調整した。
添加により容量は1700mlに増大した。この溶液を
水浴中60℃で10時間保持した。
） 蔗糖1000ｇ（溶液１Kg当り500ｇ） グリシン150ｇ（溶液１に対し２モル） PH値は2N NaOHを用いてPH7.3に調整した。
添加により容量は1700mlに増大した。この溶液を
水浴中60℃で10時間保持した。
(4) イオン交換体処理
前記(3)項で得られた溶液1700mlを、PH5.5の0.2
モル／の酢酸ナトリウムおよび0.2モル／の
リジンを含有する溶液1700mlで希釈した。PH値を
希酢酸を用いて5.5に調整しそしてPH5.5の酢酸ナ
トリウム（0.1モル／）、リジン（0.1モル／）
およびNaCl（１ｇ／）を含有する溶液を用いて
平衡化したDEAE−セフアロース6B Cl70mlを加
えた。この混合物を室温で２〜３時間攪拌しそし
て第因子の結合を上澄み液中における活性を測
定することにより測定した。第因子活性が４
IU／mlから0.1IU／mlまで低下したら、吸着剤を
遠心分離により除去した。
モル／の酢酸ナトリウムおよび0.2モル／の
リジンを含有する溶液1700mlで希釈した。PH値を
希酢酸を用いて5.5に調整しそしてPH5.5の酢酸ナ
トリウム（0.1モル／）、リジン（0.1モル／）
およびNaCl（１ｇ／）を含有する溶液を用いて
平衡化したDEAE−セフアロース6B Cl70mlを加
えた。この混合物を室温で２〜３時間攪拌しそし
て第因子の結合を上澄み液中における活性を測
定することにより測定した。第因子活性が４
IU／mlから0.1IU／mlまで低下したら、吸着剤を
遠心分離により除去した。
上澄み液を注ぎ出しそして吸着剤を上澄み液の
残りから分離した。PH5.5の0.1モル／の酢酸ナ
トリウム、0.1モル／のリジンおよび１ｇ／
のNaClを含有する溶液で洗滌することによりセ
フアロースから捕捉された蛋白質を除去しそして
次に同じ緩衝液中のスラリーとしてカラムに移し
た（寸法：10×３cm）。
残りから分離した。PH5.5の0.1モル／の酢酸ナ
トリウム、0.1モル／のリジンおよび１ｇ／
のNaClを含有する溶液で洗滌することによりセ
フアロースから捕捉された蛋白質を除去しそして
次に同じ緩衝液中のスラリーとしてカラムに移し
た（寸法：10×３cm）。
カラム中で280nmで何らの光線吸収ももはや測
定され得ずそして同種凝集素値がクームス試験で
検出限界となるまで洗滌した。
定され得ずそして同種凝集素値がクームス試験で
検出限界となるまで洗滌した。
(5) 溶離
前記(4)項で得られた交換体を0.1モル／の酢
酸ナトリウム、0.1モル／のリジンおよび0.3モ
ル／のCaCl2を含有するPH5.5の溶液を用いて溶
離した。その際波長280nmで測定しうるピークが
現われた。相当するフラクシヨンを集めそして第
因子40IU／mlを有するもの180ml量が得られ
た。
酸ナトリウム、0.1モル／のリジンおよび0.3モ
ル／のCaCl2を含有するPH5.5の溶液を用いて溶
離した。その際波長280nmで測定しうるピークが
現われた。相当するフラクシヨンを集めそして第
因子40IU／mlを有するもの180ml量が得られ
た。
(6) 第因子の沈澱
前記(5)項で得られた溶出液180mlに2.2モル／
のグリシンならびに150ｇ／のNaClを加えそし
て室温で30分間攪拌した。
のグリシンならびに150ｇ／のNaClを加えそし
て室温で30分間攪拌した。
沈澱は明らかな混濁により認められ得た。この
沈澱を超遠心器中30000×ｇで30分間遠心分離す
ることにより分離しそして上澄み液を注ぎ出した
のち４℃で一夜保持した。
沈澱を超遠心器中30000×ｇで30分間遠心分離す
ることにより分離しそして上澄み液を注ぎ出した
のち４℃で一夜保持した。
(7) 後処理
前記(6)で得られた沈澱を0.02モル／のクエン
酸ナトリウム、0.06モル／のNaCl，10ｇ／
のグリシンおよび５ｇ／のヒト−アルブミンを
含有するPH7.0の緩衝液（溶解緩衝液）145ml中に
とつた。この溶液については第：Ｃ因子活性
40IU／mlが測定された。これを何らアルブミン
を含有しない上記緩衝液で３時間室温で透析し、
透析物を30℃に加温しそして30000×ｇおよび25
℃で30分間遠心分離した。36IU／mlを示す第
因子測定後、この溶液を溶解緩衝液を用いて
30IU／mlに調整し、この溶液を37℃に加温しそ
してメンブランフイルターで滅菌過した。
酸ナトリウム、0.06モル／のNaCl，10ｇ／
のグリシンおよび５ｇ／のヒト−アルブミンを
含有するPH7.0の緩衝液（溶解緩衝液）145ml中に
とつた。この溶液については第：Ｃ因子活性
40IU／mlが測定された。これを何らアルブミン
を含有しない上記緩衝液で３時間室温で透析し、
透析物を30℃に加温しそして30000×ｇおよび25
℃で30分間遠心分離した。36IU／mlを示す第
因子測定後、この溶液を溶解緩衝液を用いて
30IU／mlに調整し、この溶液を37℃に加温しそ
してメンブランフイルターで滅菌過した。
これをバイアル瓶中に充填し、凍結させそして
凍結乾燥した。
凍結乾燥した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 免疫グロブリン、同種凝集素、フイブロネク
チンおよび凝固しうるフイブリノゲンを実際上含
まずそして蛋白質１mg当り100単位の特異的な凝
血（Ｃ）−活性（第：Ｃ因子）を有しかつ第
：Ｃ因子対第因子Ｒ：Ag（関連抗原）の比率
が１より大きいことからなる、低温殺菌された高
度精製された第因子製剤を製造するにあたり、
第因子を含有する、ヒト血漿のクリオ沈殿の溶
液を炭水化物の存在下PH５〜6.5で炭水化物に基
づく陰イオン交換体で処理し、この交換体を洗滌
しそして第因子をカオトロピツクイオンを含む
溶液を用いて溶離することからなる、第因子製
剤の製造方法。 ２ クリオ沈澱を蔗糖およびグリシンを含む溶液
に添加して溶解させ、カルシウムイオンを加え、
場合により低温殺菌し、冷却し、希釈しそしてPH
５〜6.5で第：Ｃ因子を炭水化物に基づく陰イ
オン交換体に吸着させそして吸着剤を異種蛋白質
がなくなるまで洗いそして第：Ｃ因子を緩衝さ
れた濃厚塩溶液を用いて溶離することにより溶出
させ、透析しそして凍結乾燥することからなる前
記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 蔗糖35〜60ｇ／100ml、グリシン１〜３モ
ル／およびカルシウム１〜20ミリモル／を用
いる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 陰イオン交換体からの溶出液にアミノ酸、炭
水化物およびカルシウムを添加した後低温殺菌す
ることからなる前記特許請求の範囲第２項記載の
方法。 ５ 陰イオン交換体としてセルロース、セフアデ
ツクスまたはセフアロースのDEAE，QAE、ア
ミン樹脂またはエクテオラ（Ecteola）誘導体が
使用されることからなる前記特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ６ 吸着剤を緩衝された希塩溶液で洗滌すること
からなる前記特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７ カオトロピツクイオンを含む溶液がナトリウ
ム、カリウムまたはカルシウムとハロゲンとの塩
の緩衝された濃厚水溶液である前記特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ８ 免疫グロブリン、同種凝集素、フイブロネク
チンおよび凝固しうるフイブリノゲンを実際上含
まずそして蛋白質１mg当り100単位の特異的な凝
血（Ｃ）−活性（第：Ｃ因子）を有しかつ第
：Ｃ因子対第因子Ｒ：Ag（関連抗原）の比率
が１より大きいことからなる、低温殺菌され高度
精製された第因子製剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843432083 DE3432083A1 (de) | 1984-08-31 | 1984-08-31 | Pasteurisierte, isoagglutininfreie faktor viii-praeparation und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3432083.0 | 1984-08-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6160614A JPS6160614A (ja) | 1986-03-28 |
| JPH0580455B2 true JPH0580455B2 (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=6244387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189997A Granted JPS6160614A (ja) | 1984-08-31 | 1985-08-30 | 第８因子製剤およびその製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173242B2 (ja) |
| JP (1) | JPS6160614A (ja) |
| AT (1) | ATE73666T1 (ja) |
| CA (1) | CA1265051A (ja) |
| DE (2) | DE3432083A1 (ja) |
| DK (1) | DK174066B1 (ja) |
| ES (1) | ES8702146A1 (ja) |
| IL (1) | IL76260A (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4952675A (en) * | 1985-02-01 | 1990-08-28 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| CA1339946C (en) * | 1987-03-31 | 1998-07-07 | Michael J. Griffith | Ultrapurification process for polypeptides |
| ATE85220T1 (de) * | 1988-05-27 | 1993-02-15 | Centre Regional De Transfusion | Verfahren zur herstellung eines hochreinen, virusfreien antihaemophiliefaktors mittels chromatographie. |
| AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
| DE3878245D1 (de) * | 1988-11-05 | 1993-03-18 | Octapharma Ag | Verfahren zur herstellung eines hochreinen, nicht infektioesen antihaemophiliefaktors mittels chromatographie. |
| DE3926034C3 (de) * | 1989-08-07 | 1996-11-21 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung eines stabilen Faktors VIII |
| DE4001451A1 (de) * | 1990-01-19 | 1991-08-01 | Octapharma Ag | Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix |
| DE4143678B4 (de) * | 1991-02-27 | 2005-03-10 | Holland Letz Felo Werkzeug | Halter für Schraubendreher-Einsätze |
| AT402891B (de) * | 1991-06-20 | 1997-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines inaktivierten blutproduktes |
| FR2681867B1 (fr) | 1991-09-26 | 1993-12-31 | Pasteur Merieux Serums Vaccins | Procede de purification du facteur viii et preparations obtenues. |
| AT399818B (de) * | 1992-04-24 | 1995-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer hochgereinigten virussicheren faktor viii-präparation |
| WO1994013329A1 (de) * | 1992-12-16 | 1994-06-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung eines virussicheren biologischen präparates |
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| DE4337573C1 (de) * | 1993-11-04 | 1995-05-18 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung einer virusinaktivierten Faktor VIII enthaltenden Fraktion mittels chromatographischer Methoden |
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-
1984
- 1984-08-31 DE DE19843432083 patent/DE3432083A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-08-21 AT AT85110499T patent/ATE73666T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-21 DE DE8585110499T patent/DE3585649D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-21 EP EP85110499A patent/EP0173242B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-29 ES ES546526A patent/ES8702146A1/es not_active Expired
- 1985-08-30 CA CA000489738A patent/CA1265051A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-30 DK DK198503981A patent/DK174066B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 IL IL76260A patent/IL76260A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 JP JP60189997A patent/JPS6160614A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57136526A (en) * | 1981-02-17 | 1982-08-23 | Green Cross Corp:The | Preparation of blood coagulation factor 8 |
| JPS5959626A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-04-05 | マイルス・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド | 抗血友病因子濃縮物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE73666T1 (de) | 1992-04-15 |
| EP0173242A2 (de) | 1986-03-05 |
| DK398185D0 (da) | 1985-08-30 |
| DE3585649D1 (de) | 1992-04-23 |
| CA1265051A (en) | 1990-01-30 |
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| ES8702146A1 (es) | 1986-12-16 |
| IL76260A (en) | 1992-02-16 |
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| EP0173242A3 (en) | 1987-10-07 |
| IL76260A0 (en) | 1986-01-31 |
| EP0173242B1 (de) | 1992-03-18 |
| JPS6160614A (ja) | 1986-03-28 |
| DK174066B1 (da) | 2002-05-21 |
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