DE2653534C2

DE2653534C2 - Feste Antihämophilen-Faktor-Präparation und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2653534C2
Application number: DE19762653534
Authority: DE
Inventors: William R. Laguna Niguel Calif. Thomas
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1975-12-22
Filing date: 1976-11-25
Publication date: 1986-08-28
Also published as: AT351158B; MX4730E; ES454453A1; DE2653534A1; ATA956676A; CA1066189A; JPS5282716A; GB1540610A

Description

Die Erfindung betrifft eine rasch in Lösung bringbare, in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Patienten 3 bis 100 LE antihämophilen Faktor/ml ergebende, feste Antihämophilen-Faktor-Präparation, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Präparation. Die Präparation ist ein wertvolles Mittel zur Behandlung von Hämophilen bzw. Blutern.

Bei der Behandlung von Blutern besitzt die Zeit eine beachtliche Bedeutung sowohl für die Personen, die die Injektionen im Notfall verabreichen, als auch für die Personen, die diese Injektionen empfangen, da der Blutverlust des Hämophilen und/oder die Verletzung der Gelenke sich während der für die Solubilisierung der üblicherweise festen Zusammensetzung, durch die eine Injektion möglich wird, verschlimmern. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel mit kurzer Solubilisierungszeit zur Verfügung zu stellen, so daß eine rasche Injektion für den Verletzten möglich wird.
Es ist allgemeine Praxis, trockene Blutplasmafraktionen in Form eines festen Mittels zur Entfernung des Wassers daraus zu gefrieren und unmittelbar vor der Verwendung das feste Mittel in einem flüssigen, wäßrigen Medium unter Bildung einer Lösung, die dann dem Patienten injiziert wird, zu lösen. Die Blutplasmafraktionen werden durch Entfernung des Wassers aus dem Blutplasma erhalten (Blut aus dem die weißen und roten Zellen und die Blutplättchen entfernt wurden und das etwa 90% Wasser und 10% Feststoffe enthält). Die nach der Entfernung des Wassers aus dem Blutplasma verbleibenden Feststoffe werden in Blutplasmafraktionen getrennt Die für die vorliegende Erfindung am meisten geeigneten sind die antihämophiler Faktor- bzw. anti-hemophilic Faktor(AHF, Faktor VIII-)Fraktion (die Fibrinogen enthalten kann) und gegebenenfalls ein getrennter Fibrinogen- Faktor.

Man hat zur Solubilisierung von Blutplasmafraktionen Solubilisierungsmittel verwendet. Die Zeit die jedoch zur Auflösung solcher Fraktionen erforderlich ist, läßt viel zu wünschen übrig. Beispielsweise wird in der US-PS 28 26 533 die Zugabe von Dextrose zu einer Fibrinogen-, Blutplasma-Fraktion beschrieben, und es ist bekannt, daß die Solubilisierungszeit der Fibrinogenfraktion durch die Zugabe von Dextrose zu ihr vermindert werden kann.

Ferner ist aus der US-PS 28 26 533 die Verwendung von Kohlehydraten zur Stabilisierung und Solubilisierung von Fibrinogen zu stark konzentrierten Lösungen, d.h. zu Lösungen, die mehr als 2g Fibrinogen/lOOml enthalten, bekannt.

In der US-Patentschrift wird angegeben, daß die genannte Menge ein Schwellenwert für die Löslichkeitsschwierigkeiten bei Fibrinogen ist. Mit dieser bekannten Lösung soll dem Patienten, der ungenügend Fibrinogen enthält, Fibrinogen verabreicht werden. Es wird also davon ausgegangen, daß der AHF-Gehalt im Fatientenblut normal ist, daß aber jedoch der Fibrinogengehalt für die Gerinnung nicht ausreicht, so daß bei der bekannten Lösung so hohe Gehalte an Dextrose erforderlich sind. Aus dieser Entgegenhaltung konnte der Fachmann keine Hinweise entnehmen, welche Maßnahmen er ergreifen muß, um die Aufgabe, die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegt, zu lösen. Erfindungsgemäß soll AHF unverzüglich solubilisiert werden, so daß es sehr schnell verabreicht werden kann, wenn der Patient einen AHF-Mangel aufweist.

Es ist weiterhin bekannt, Dextrose zu AHF zuzugeben, wie es z. B. in »Journal of Thrombosis Research«, Band 1, Seiten 191 bis 200,1972, publiziert von Pergamon Press, Inc., beschrieben wird, wo die Zugabe von Dextrose zu AHF zur Erleichterung der Chromatographie von AHF beschrieben wird. Aus dem Artikel folgt, daß die Ausbeute an Bovin-Faktor VIII bei der Chromatographie an Anionenaustauschmedien durch Verwendung eines Kohlehydrats mit niedrigem Molekulargewicht wie Dextrose, in den Lösungsmitteln wesentlich verbessert werden kann. Weiterhin haben die Cutter Laboratories, Inc. ausreichend Dextrose zu ihren im Handel erhältlichen AHF-Präparationen zugegeben, so daß, wenn die Präparation entsprechend den Anweisungen rekonstituiert wird, die entstehende AHF-Lösung etwa 1 g Dextrose/100 ml Lösung enthält.

In der US-PS 30 57 781 wird schließlich die Stabilisierung von Plasma mit Invertzucker und Lävulinsäure beschrieben.
Obgleich Dextrose bei Blutplasmafraktionen für verschiedene Zwecke vielfach verwendet wurde, ergibt sich aus den obigen Erläuterungen, daß vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt wurde, daß durch genaue bzw. kritische Kontrolle der Menge an wasserlöslichem Kohlehydrat (das von Lävulinsäure frei ist) in dem festen Mittel das feste Mittel innerhalb etwa 90 Sekunden mit einem wäßrigen Medium solubilisiert werden kann.
Aus den Schriften

Gstirner. F.; Grundstoffe und Verfahren der Arzneibereitung; Enke-Verlag, Stuttgart 1960, Seiten 36—39,
Gstirner, F.; Einführung in die Verfahrenstechnik der Arzneiformung; Wiss. Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart 1973, Seiten 188,278 und 303, uad

Neumann, K.; Grundriß der Gefriertrocknung, 2. Auflage; Musterschmidt Wissenschaftlicher Verlag, Göttingen 1955, Seiten 146—147, sind pharmazeutische Zubereitungen, die zu Tabletten verformt werden, bekannt In diesen Schriften finden sich keine Hinweise, wie die Aufgabe, die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegt, gelöst werden kann. Tatsächlich ist die Herstellung AHF enthaltender Tabletten nicht sinnvoll, da das AHF seine biologische Proteinaktivität bei der Temperatur und den Drücken verliert, die für die Tablettenherstellung erforderlich sind. AHF zeigt auch in Tablettenform nicht die gewünschte Wirksamkeit, sondern es muß intravenös verabreicht werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, eine rasch in Lösung bringbare, in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Patienten 3 bis 100 I.E. antihämophilen Faktor/ml ergebende, feste AntihämophiJen-Faktor-Präparation zur Verfügung zu stellen.

Diese Präparation ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein wasserlösliches Kohlehydrat, das die Antihämophilen-Faktor-Präparation hydratisieren hilft, in einer Menge vom 1,6- bis 7,5fachen des Gewichtes des gesamten Proteins, das in der festen Antihämophilen-Faktor-Präparation enthalten ist, enthält

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der beschriebenen festen Präparation. Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß man eine Antihämophilen-Faktor-Präparation in wäßrigem Medium löst und die entstehende Lösung gefriertrocknet, wobei man der Zusammensetzung während oder vor dem Gefriertrocknen das Kohlehydrat hinzugibt

Im folgenden und anhand der Zeichnungen wird die vorliegende Erfindung näher erläutert

F i g. 1 ist eine graphische Darstellung der unerwartet überraschenden Verbesserung in der Solubilisierungsrate fester, AHF enthaltender Mittel, die man erhält wenn das Mittel in Anwesenheit von 0 bis 5 g Dextrose/ 100 ml rekonstituierter Lösung solubilisiert wird. Die verschiedenen Kurven werden bei unterschiedlichen Rekonstitutionstemperaturen und Volumen erhalten.

Die Aufgabe, die Auflösungszeit fester Mittel der oben beschriebenen Art zu vermindern, wird erfindungsgemaß durch die Zugabe zu dem festen Mittel einer kritischen Menge an wasserlöslichem Kohlenhydrat gelöst. Soll das erfindungsgemäße Mittel verwendet werden, muß man nur Wasser zugeben und, bedingt durch die Anwesenheit des Kohlenhydrats in dem festen Mittel, i'öst sich das Mittel in sehr kurzer Zeit, z. B. innerhalb 90 Sekunden, und kann dem Patienten injiziert werden.

Die Menge an zugegebenem Kohlenhydrat ist, wie angegeben, in dem Sinne kritisch, daß die einfache Zugabe des Kohlenhydrats selbst keine wesentliche Verbesserung in der Solubilisierungszeit ergibt. Man muß eine Schwellenkonzentration an Kohlenhydrat erreichen, bevor Verbesserungen in der Solubilisierungszeit erreicht werden. Danach zeigt eine weitere Zugabe von mehr Kohlenhydrat keinen wesentlichen Einfluß auf die Solubilisierungszeit. Diese Schwellenkonzentration wird innerhalb der angegebenen Bereiche schwanken, abhängig von Faktoren, von denen angenommen wird, daß sie die Menge und Identität des Proteins und die Salze in den AHF-Präparatione.i umfassen, wie auch in Abhängigkeit von der Identität des ausgewählten Kohlenhydrats. Die genaue optimale Menge an Kohlenhydrat wird somit in Abhängigkeit von dem ausgewählten Kohlenhydrat, dem Verfahren der AHF-Herstellung variieren und selbst bei getrennten Versuchen, bei denen das gleiche präparative Verfahren verwendet wird, kann sie variieren. Die geeignete Menge sollte daher durch an sich bekannte, übliche Solubilisierungszeitversuche für jede Charge AHF bestimmt werden.

Die Menge an Kohlenhydrat sollte ausreichen, daß die feste AH F-Präparation innerhalb etwa 90 Sekunden, bevorzugt 65 Sekunden, in Lösung gebracht wird. Der AHF sollte in dem festen Mittel in einer Menge vorhanden sein, die ausreicht, eine therapeutisch wirksame AHF-Konzentration nach der Solubilisierung des Mittels zu ergeben. Eine therapeutisch wirksame Konzentration an AHF in solchen Lösungen liegt z. B. im Bereich von 3 bis \r>0 Internationalen Einheiten (I.E.) AHF/ml, wobei ein bevorzugter Bereich bei etwa 3 bis 40 \.EJm\ liegt und der am meisten bevorzugte Bereich etwa 24 bis etwa 28 I.E7ml beträgt. Die in dem festen AHF-Mittel vorhandene Menge an Kohlenhydrat ergibt typischerweise bei der Rekonstitution mit Wasser oder einer anderen geeigneten Rekonstitutionsflüssigkeit eine therapeutisch wirksame Lösung von AHF, die mindestcns etwa 2 Gewichtseinheiten Kohlenhydrat (berechnet in Gramm) für jede 100 Volumeneinheiten Lösung (berechnet in Milliliter) enthält. Die Menge an Kohlenhydrat wird im allgemeinen zwischen etwa 2 und 10 g, bevorzugt etwa 2 bis 5 g Kohlenhydrat/100 ml Lösung variieren, wobei etwa 3 g das Optimum zu sein scheinen.

Zur Einstellung der gewünschten Kohlenhydratkonzentration in der Lösung ist das Kohlenhydrat beispielsweise in dem festen Mittel in der etwa 1,5- bis 7,5fachen Menge, bezogen auf die Menge an Gesamtprotein in dem festen AHF-Mittel, vorhanden. Bevorzugt beträgt die Kohlenhydratmenge etwa das 2,0- bis 5,0fache des Gewichtes an Gesamtprotein. Am meisten beträgt sie etwa das 2,0fache des Gewichtes an Gesamtprotein. Das feste Mittel kann etwa zwischen 2 und 200 I.E. AHF/g Protein enthalten, und man erhält trotzdem noch eine geeignete AHF-Lösung nach der Rekonstitution, die eine therapeutisch erkennbare Wirkung zeigt. Nach einer speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält das AHF-enthaltende Mittel als weiteres Protein Fibrinogen.

Bei der vorliegenden Erfindung können als wasserlösliche Kohlenhydrate irgendwelche Kohlenhydrate verwendet werden, die das AHF enthaltende Mittel hydratisieren. Diese sind ohne Beschränkung Monosaccharide, wie die im Handel erhältlichgen Hexosen einschließlich Dextrose (Glucose), Mannose, Galactose und Fructose; Disaccharide wie Maltose, Lactose und Saccharose; Trisaccharide wie Raffinose; und kurzkettige Dextrine, z. B. Dextrine, die eine Kettenlänge von weniger als etwa 4 Monosaccharideinheiten besitzen. Gemische aus geeigneten Kohlenhydraten können ebenfalls verwendet werden. Die bevorzugten Kohlenhydrate sind Dextrose, Saccharose, Maltose und Lactose, wobei Dextrose ein besonders bevorzugtes Material ist. Das Kohlenhydrat muß biologisch annehmbar sein, wenn der AHF für die menschliche Verabreichung verkauft wird. Das Kohlen-

hydrat kann mit dem AHF enthaltenden Mittel zu irgendeinem Zeitpunkt während oder vor der Herstellung des lyophilisierten Mittels vermischt werden. Nach einer speziellen Ausführungsform wird das Kohlenhydrat als wäßrige Lösung zugegeben.

Die AHF-Mittel, deren Solubilisierungsrate durch die Zugabe von Kohlenhydrat erfindungsgemäß verkürzt wird, können nach einer Reihe an sich bekannter Verfahren hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, indem man ein Gemisch aus Protein und AHF oder ein Gemisch aus Fibrinogen

und AHF, das aus Blutplasma oder seiner AHF-enthaltenden Fraktion durch Fraktionierung des Plasmas *«

erhalten worden ist, in einem wäßrigen Medium auflöst und unter Bildung einer klinisch anwendbaren, gefrierge- j|

trockneten, festen Präparation gefriertrocknet. Dabei kann das Kohlehydrat vor oder während der Gefrier- |j

ίο trocknungsstufe zugegeben werden. £t

Bei einem bevorzugten Verfahren wird das AHF und Fibrinogen enthaltende, feste Gemisch hergestellt, f

indem man von Plasma ausgeht, das bei etwa —25° C gefroren wurde und dann bei 4 oder 5° C unter Bildung f*

eines Cryopräzipitats, das abfiltriert wurde, getaut wurde. |

Das Cryopräzipitat wird dann in heparinisierter, mit Citrat behandelter Kochsalzlösung, zu der man §··

3,5 Gew.-% Polyäthyiengiykol zugegeben hat, suspendiert Das entstehende Gemisch wird zentrifugiert, und das f?

entstehende Fibrinogenpräzipitat wird verworfen, und die überstehende Lösung wrid gewonnen. Zu der über- M

stehenden Lösung gibt man etwa 7,5 Gewichtseinheiten Polyäthyiengiykol (ausgedrückt als Gramm) pro 100 |

Volumeneinheiten überstehender Lösung (ausgedrückt als Milliliter). Die entstehende Suspension wird etwa 15 |_;

Minuten bei Zimmertemperatur vermischt und dann zentrifugiert, und das entstehende Präzipitat wird gesam- |

melt Dieses Präzipitat oder festes Gemisch enthält AHF und Fibrinogen und kann als solches verwendet werden |.'

oder es kann weiter durch Glycinfraktionierung gereinigt werden. Man kann in jedem Fall das wasserlösliche %

Kohlenhydrat zu jedem dieser Gemische zugeben. Bevorzugt wird das feste Gemisch aus AHF und Fibrinogen |

in einem wäßrigen Medium, z. B. einer mit Dextrose, Citrat behandelten Salzlösung, gelöst, d. h. einer wäßrigen %

Lösung, die etwa 0,72% Natriumchlorid, 0,02 M Natriumeitrat und eine geeignete Menge an wasserlöslichem s

Kohlenhydrat enthält, so daß man die gewünschte, verbesserte Solubilisierungsrate erhält. Es ist weder notwen- \

dig noch bevorzugt, zu diesem Zeitpunkt Wasser bis zu einem Punkt zugegeben, wo die Lösung etwa 2 \

Gewichtseinheiten Dextrose/100 Volumeneinheiten Lösung enthält, da solche verdünnten Lösungen die für die ^:-

Lyophilisierung erforderliche Zeit unnötig verlängern. '■

Das Kohlenhydrat enthaltende, aufgelöste, feste Gemisch wird weiter geklärt, indem man es durch ein '·

Grobfilter leitet, wodurch ein Teil des Fibrinogens und andere unlösliche Proteine entfernt werden. Anschlie- ,

Bend kann die Probe gegebenenfalls weiter mit citratbehandelter Salzlösung auf eine Potenz von etwa 3 bis 75 ;,

I.E/ml verdünnt werden oder sie kann als Konzentrat belassen werden, das normalerweise 250 bis 1000LE/ml '

enthält Das gelöste Produkt wrid dann durch ein »Miilipore«-Membranfilter mit einer durchschnittlichen j

Porengröße von etwa 03 Mikron steril filtriert Die filtrierte Lösung wird bei aseptischen Bedingungen in i;

Fläschchen mit einem Inhalt von 10 bis 30 ml je nach Belieben eingefüllt, schnell gefroren und gefriergetrocknet. |

Bei der Verabreichung der AHF-Präparation an einen Patienten wird das übliche Verfahren zur Rekonstitu- |

tion des lyophilisierten Produktes zu einer Lösung verwendet, die etwa 3 bis etwa 100 I.E. AHF/ml und |

bevorzugt etwa 24 bis etwa 28 LEVmI, ungefähr 2 bis ungefähr 10 g Dextrose/100 ml, etwa 1,4 bis etwa 1,6 g |;

Protein/100 mL etwa 0,6 bis etwa 0,8 g Fibrinogen/100 ml und etwa 0,7 bis etwa 6 g Salze wie NaCI, Natriumci- |

trat Glycin und nicht identifizierte, restliche Feststoffe/100 ml enthält Typischerweise wird ein 10 ml-Fläsch- |:

chen an rekonstituierter AHF-Lösung etwa 270 LE AHF, etwa 03 g Dextrose, etwa 0,15 g Protein einschließlich |

etwa 0,07 g Fibrinogen, etwa 0,51 g Reststoffe und ausreichend Wasser bis zu einem Volumen von 10 ml |

enthalten. |

Nach einer speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält die Antihämophilen-Faktor-Präparation neben |

Protein als Kohlehydrat Dextrose, wobei 31 Gew.-Teile Dextrose, 16 Gew.-Teile Protein — einschließlich AHF t

in einer Aktivität von 2701.EJg Material — und 53 Gew.-Teile Salze. t;

Das lyophilisierte Produkt ist leicht in sterilem Wasser bei Zimmertemperatur löslich. Nach der Zugabe von ψ

Wasser ist es fast sofort für die Verabreichung an hämophile Patienten fertig, bedingt durch den Dextrosegehalt |

in der Lösung. |

so Zur Erläuterung der dramatischen, unerwarteten Ergebnisse, die erfindungsgemäß erhalten werden, werden |

die folgenden Versuche unter Verwendung von Fläschchen mit 10 ml und 30 ml Inhalt, die das erfindungsgemäße |

lyophilisierte Produkt enthalten, durchgeführt Die 10 ml- und 30 ml-Fläschchen werden mit 10 ml bzw. 30 ml | Wasser bei Zimmertemperatur und 37° C gefüllt Die 30 ml-Fläschchen enthalten ungefähr das 3fache an Produkt wie die 10 ml-Fläschchen. Die für die vollständige Auflösung einer solchen Probe erforderliche Zeit wird bestimmt Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I und in F i g. 1 dargestellt

Tabelle I

g Dextrose/l OO ml	Fi g. 1 Kurve	C	D
rekonstituiertem Mittel	A B
	Rekonstitutionsvolumen	3OmI	30 ml
	10ml 10ml
	Verdünnungstemperatur	37° C	Zimmer
	37°C Zimmer		temperatur
	temperatur

1 3 5 keine (Vergleich)

176 see
35 see
48 see

185 see

195 see
85 see
55 see

210 see

100 see
50 see
52 see

105 see

330 see
65 see
75 see

210 see

Die Vergleichsprobe in der obigen Tabelle ist in jeder Hinsicht identisch mit allen Proben, mit der Ausnahme, daß die Vergleichsprobe keine Dextrose enthält.

Die Ergebnisse der Tabelle I sind in F i g. 1 graphisch dargestellt. Die dargestellten Werte zeigen die überraschende Verbesserung in der Löslichkeitsrate, sobald eine Dextrosekonzentration 2 g/100 ml an rekonstituiertem Mittel überschreiteL Ähnliche überraschende Ergebnisse erhält man mit den anderen, oben beschriebenen Kohlenhydraten."

In dem obigen Beispiel wurde Polyäthylenglykol zur Fraktionierung des Blutplasmas verwendet. Man kann jedoch auch andere Verbindungen verwenden, wie Äthylenoxid-Propylenglykol-Kondensationsprodukte. Man kann weiterhin andere Verfahren für die Fraktionierung zur Herstellung eines Produktes verwenden, das entsprechend den Angaben in der vorliegenden Anmeldung leicht löslich ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Rasch in Lösung bringbare, in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Patienten 3 bis 100 LE antihämophilen Faktor/ml ergebende, feste Antihämophilen-Faktor-Präparation, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein wasserlösliches Kohlehydrat, das die Antihämophilen-Faktor-Präparation hydratisieren hilft, in einer Menge vom 1,6- bis 7,5fachen des Gewichtes des gesamten Proteins, das in der festen Antihämophilen-Faktor-Präparation enthalten ist enthält

2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sie als wasserlösliches Kohlehydrat Glucose, Mannose, Galaktose, Fruktose, Maltose, Laktose, Saccharose, Raffinose oder Dextrine mit einer Kettenlänge

to von weniger als 4 Monosaccharideinheiten enthält

3. Verfahren zur Herstellung der festen Präparation nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man eine Antihämophilen-Faktor-Präparation in wäßrigem Medium löst und die entstehende Lösung gefriertrocknet wobei man der Zusammensetzung während oder vor dem Gefriertrocknen das Kohlehydrat hinzugibt