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Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles Globulin A
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enthaltenden Konzentrats Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines antihämophiles Globulin A enthaltenden Konzentrats aus Proteinlösungen
unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose, das für eine therapeutische Anwendung
geeignet ist.
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Bisher hat man zur Herstellung von therapeutisch anwendbaren Konzentraten
des antihämophilen Globulins (ARG oder Faktor VIII) zur Anreicherung des antihämophilen
Globulins immer Fällungsmethoden angewendet.
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Die in der Literatur beschriebenen Verfahren zur Reinigung von ARG
an modifizierter Cellulose, um zu klinisch geeigneten
Präparaten
zu kommen, sagen durchweg aus, daß man mit Diäthylaminoäthylcellulose nur unbefriedigende
Ausbeuten an dem gewünschten Produkt erhält (vgl. Blood Coagulation, Haemostasis
and Thrombosis, edited by Rosemary Biggs, Blackwell Scientific Publications, S.
249, 1972). Nach Literaturangaben sollen auch Fällungsverfahren unter Verwendung
von Alkohol, Äther, Kälte, Polyäthylenglykol, Aminosäuren oder Gerbsäure Produkte
ergeben, bei denen die Plasmaproteine so verändert bzw. denaturiert werden, daß
sie häufig zu Unverträglichkeit führen. Auch werden die im Ausgangsmaterial vorhandenen
Proteine so verändert bzw. denaturiert, daß sie nicht mehr intravenös angewendet
werden können. In allen Fällen ist die Ausbeute an ARG nur sehr gering (vgl. Blood
Coagulation, Haemostasis and Thrombosis, edited by Rosemary Biggs, Blackwell Scientific
Publications, S. 233 - 248).
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Besonders vorteilhaft soll das von J. Pool (Pool, J.G., Hershgold,
E.J. u. Shannon, A.E. Federation Froc. 24 (1965) B. 512) beschriebene Erypräzipitat
als Ausgangsmaterial für hochkonzentrierte F VIII-Präparate sein. Bei Anwendung
dieses Verfahrens sollen im günstigsten Fall 50 * des ARG ausgefällt werden, normalerweise
bei 20 - 30 * der Ausgangsmenge an AHG. Das Kryopräzipitat wird dabei entweder direkt
verwendet oder dient als Ausgangsmaterial höher gereinigter
AHG-Präparate.
Die Methoden zur weiteren Reinigung des ARG aus Kryopräzipitat verwenden wiederum
Fällungsmethoden.
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Der Nachteil aller beschriebenen Methoden der weiteren Reinigung des
ARG aus Kryopräzipitat besteht immer in den großen Ausbeuteverlusten, die bei diesem
Verfahren auftreten.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man unter bestimmten
Versuchsbedingungen ARG an Diäthylaminoäthylcellulose adsorbieren und anschließend
eluieren und auf diese Weise ein therapeutisch geeignetes LHG-Konzentrat herstellen
kann.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles
Globulin A enthaltenden Konzentrats aus Proteinlösungen unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Proteinlösung in bekannter Weise aus
stabilisiertem Plasma gewonnene unverdünnte Proteinlösungen oder den Faktor VIII
enthaltende verdünnte Proteinlösungen mit einer Proteinkonzentration von etwa 1
* verwendet, in diese Lösungen Diäthylaminoäthylcellulose einrührt, nach beendeter
Adsorption die Cellulose abzentrifugiert und mit einer Pufferlösung wäscht und danach
mit einer anderen Pufferlösung eluiert.
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Vorzugsweise verwendet man eine Cellulose, wie sie von der Firma Whatman
in ihrem Ionenaustauscher verwendet wird, für den folgende Merkmale bekannt sind:
Makers- Funktionelle Physika- Geringste Protein- Wassergrade Gruppen lischer Ionen-
kapazität rückgewinn Zustand kapazität mg/g mÄquivalent/g CM 32 CO (Naform) mikro-
1.0 1260 3.1 - 4.0 granular (Na+form) CM 52 C000 mikro- 1.0 1260 granular, vorgequollen
Die verwendeten AHG-haltigen Proteinlösungen können unterschiedlichster Natur sein.
Als Ausgangsmaterial zur Adsorption des F VIII eignen sich Plasma (das Plasma kann
auf verschiedene Weise stabilisiert sein, wie z. B. mit Citrat, Zitronensäure-Dextrose,
Heparin) Kryopräzipitat, Äthanol-Kryopräzipitat, Cohn-I-Fraktion, F VIII-haltige
PEG-Fällungen und F VIII-haltige NaCl-Fällungen.
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Die Cellulose wird in die ARG-haltigen Lösungen eingerührt und bleibt
so lange darin, bis das ARG adsorbiert ist. Für die verschiedenen AHG-haltigen Proteinlösungen
sind die äeweils optimalen Adsorptionsbedingungen sehr verschieden voneinander,
die durch die verschiedenen Proteinkonzentrationen
der AHG-Lösungen
bedingt sind. Die AHG-Adsorption aus in bekannter Weise stabilisiertem Plasma erfolgt
aus den unverdünnten Plasmalösungen. Werden F VIII-haltige Proteinlösungen, wie
z. B. Kryopräzipitat, Xthanol-Kryopräzipitat, Cohn-I-Braktion, F VIll-Eftrakte aus
PEG oder NaCl-Fällungen als Ausgangsmaterial für die ARG-Adsorption mit der besonderen
Cellulose verwendet, müssen diese Lösungen auf eine Proteinkonzentration von etwa
1 % verdünnt werden. Bei höheren Proteinkonzentrationen d-eser Lösungen erfolgt
nur eine unzureichende Adsorption des F VIII. So wird aus den genannten unverdünnten
y VIII-haltigen Lösungen bei Proteinwerten um 5 * nur etwa 30 70 bis 50 * des vorliegenden
ARG adsorbiert, während nahezu 100 * des ARG's aus diesen Lösungen adsorbiert wird,
wenn die Proteinkonzentration der Lösungen auf etwa 1 % eingestellt wird.
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Nach der ARG-Adsorption an die Diäthylaminoäthylcellulose wird zentrifugiert
und die Cellulose mit einem geeigneten Puffer-System gewaschen.
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Geeignete Waschpuffer sind kochsalzhaltige Citratpuffer oder Phosphatpuffer
mit niedriger Molarität. Vorzugsweise verwendet man einen 0,03 M Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,0. Durch das Waschen wird überschüssiges Protein von der
Diäthylaminoäthylcellulose entfernt.
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Danach wird das ARG mit einem geeigneten Puffersystem von der Diäthylaminoäthylcellulose
entfernt. Geeignete Elutionsmittel sind 0,3 - 0,7 M Phosphatpuffer. Vorzugsweise
verwendet man einen o,4 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0. Die weitere
Reinigung des ARG aus dieser Lösung kann in bekannter Weise erfolgen. Dieses Verfahrensschema,
bei dem therapeutisch anwendbares AHG-Eonzentrat gewonnen wird, hat folgende Vorteile
gegenüber der AHG-Gewinnung nach bekannen Verfahren: 1. Das von MG befreite Plasma
enthält keine Zusätze, wie dies bei verschiedenen bekannten Verfahren der Ball ist,
wie z. B. Äthanol bei der Cohn-Fraktionierung oder Polyäthylenglykol bei der Polyäthylenglykolfraktionierung.
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2. Die AHG-Ausbeute ist wesentlich höher als bei allen anderen bekannten
Verfahren, da sich das ARG nahezu quantitativ an die Cellulose adsorbieren läßt.
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3. Das ARG ist nur minimal mit anderen Proteinen verunreinigt.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht man mit Bezug auf das
als Ausgangsmaterial verwendete Kryopräzipitat eine Ausbeute an ARG von 40 - -50*,
während bei den bekannten
Verfahren meistens nur 10 so, im günstigsten
Falle höchstens 20 %, bezogen auf das verwendete Plasma, gewonnen wurden.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
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Beispiel 1 Herstellung von antihämophilem Globulin-A-Eonzentrat aus
Plasma Spender-Venenblut wurde in bekannter Weise mit 3,8 %iger Imatriun-Gitrat-Lösung
im Verhältnis 9 + 1 gemischt. Das Blut wurde möglichst innerhalb von 2 Stunden nach
der Blutentnahme zentrifugiert. Das Plasma wurde innerhalb von 48 Stunden, vorzugsweise
bei -40 , eingefroren.
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Für die nachstehend beschriebene Weiterverarbeitung wurden folgende
Reagenzien verwendet: Puffer-Herstellungen 1. 0,02 M Tris-Puffer pH 7,0 : 2,42 g
Tris (hydroxymethyl)-aminomethan wurden in 900 ml dest. H20 gelöst. Durch Zugaben
von etwa 16 ml 1N HCl wurde der pH auf 7,0 gestellt und die Lösung mit destilliertem
H20 auf 1 Liter aufgefüllt.
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2. 0,03 M Phosphatpuffer pH 7,0 : 5,34 g sekundäres Natriumphosphat
(Na2HPO4 x 2EI20) wurden mit destilliertem H20
gelöst und auf 1
Liter aufgefüllt. 4,14 g primäres Natriumphosphat (NaH2P04 x H20) wurden mit dest.
H20 gelöst und auf 1 Liter aufgefüllt.
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Zur p11-Einstellung wurde die sekundäre Natriumphosphatlösung vorgelegt
und durch Zugabe der primären Natriumphosphatlösung der pH auf 7,0 eingestellt.
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3. 0,4 M Phosphatpuffer pH 7,0 : 71,2 g sekundäres Natriumphosphat
(Na 2HP04 x 2H20) wurden mit destilliertem H20 gelöst und auf 1 Liter aufgefüllt.
55,2 g primäres Natriumphosphat (NaH2P04 x H20) wurden mit destilliertem H20 gelöst
und auf 1 Liter aufgefüllt. Die pH-Einstellung auf 7,0 erfolgte durch Zugabe der
Lösung des primären Natriumphosphats zur Lösung des sekundären Natriumphosphats.
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4. 1hatman DE 52 Cellulose der Firma Vetter KG wurde wie folgt behandelt:
1 kg der Cellulose wurde mit 15 1 0,5 N HCl 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt.
Anschliessend wurde die Cellulose nach Zentrifugation oder Filtraktion mit 16 Liter
destilliertem H2O 5 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend 2mal mit
15 Liter 0,5 N DSaOH 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, wobei zwischen den
NaOH-Waschungen eine Waschung mit destilliertem H20 erfolgte. Anschließend an die
NaOH-Waschungen erfolgte eine Neutralwaschung mit 1120. Die neutralgewaschene Cellulose
wurde mit physiologischem NaCl suspendiert und 20 Minuten bei 121 °C mit Heißluft
sterilisiert.
Vor Verwendung der Cellulose für die Adsorption wurde die Cellulose in 0,03 If Phosphatpuffer
vom pH 7,0 suspendiert. Eine gut gießbare Suspensicn enthält 100 g Trockensubstanz
in 150 ml.
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5. Regenerierung der Cellulose: Bereits verwendete Oellulose wurde
erneut mit 0,4 M Phosphatpuffer vom p11 7,0 30 Minuten bei Zimmertemperatur gewaschen
und anschliessend, wie unter 4. beschrieben, behandelt.
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6. F VIII-Lösungs-Puffer: 5,88 g Tri-Na-Citrat wurden in etwa 800
ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zugabe von
0,1 M Citronensäure (2,1 g Citronensäure in 100 ml destilliertem K20 lösen) auf
einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Diese Lösung wurde mit destilliertem H20 auf
1 Liter auf gefüllt.
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Dazu wurde 1 Liter 0,9 *ige NaCl-Lösung gegeben. Pro 1 Liter der
1:1-Mischung der beiden Lösungen wurden 7,5 g Glycerin zugesetzt.
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Verfahren: Das gefrorene Plasma wurde bei Zimmertemperatur aufgetaut
(das Plasma kann bei Temperaturen bis 37 s aufgetaut werden).
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Das Plasma mehrerer Spender wurde gepoolt. Zu dem Plasma-Pool wurde
die vorbehandelte, sterilisierte Cellulose bis zu einer Konzentration von 5 bis
20 g*, vorzugsweise 10 g*, gegeben. Die Adsorption des ARG erfolgte in 20 Minuten
bis
2 Stunden, vorzugsweise unter Rühren in 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
Anschließend wurde zentrifugiert. Der Uberstand kann zur weiteren Plasmaprotein-Fraktionierung
verwendet werden.
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Die abzentrifugierte Cellulose wird 30 Minuten bei Zimmer-1 temperatur
unter Rühren mit 10 des Ausgangsplasmavolumens an 0,03 M Phosphatpuffer mit einem
pH-Wert von 7,0 gewaschen. Nach dem Abzentrifugieren der Diäthylaminoäthylcellulose
wird das ARG mit 0,4 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 von der Cellulose
eluiert. Elutionsbedingungen: Pro 100 Liter Plasma wurden 2,5 1 Elutionspuffer verwendet.
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Die Elution erfolgte bei Zimmertemperatur innerhalb von 30 Minuten.
Nach Trennung des Eluates von der Cellulose durch Zentrifugation wurde eine zweite
Elution durchgeführt.
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Die Bedingungen der zweiten Elution waren identisch mit den Bedingungen
für die erste Elution. Aus den vereinigten Eluaten wurde das ARG in geeigneter bekannter
Weise (a.a.O., Seiten 233 - 248) weiter gereinigt, sterilfiltriert und gefriergetrocknet.
Löst man das gefriergetrocknete AHG-Konzentrat in Wasser, so enthält es eine etwa
25fache Aktivität des F VIII gegenüber einem Normalplasma. Das Konzentrat ist zur
Therapie vpn F VIII-Mangelzuständen, beispielsweise der Hämaphilie A, geeignet.
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Beispiel 2 Als Ausgangsmaterial zur AHG-Herstellung diente aus Humanplasma
hergestelltes Eryopräzipitat.
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Das aufgetaute Eryopräzipitat wurde mit 0,02 M Tris-Puffer vom pH
7,0 auf einen Proteinwert von 1 * gebracht und 30 Minuten bei Zimmertemperatur extrahiert.
Ungelöste Bestandteile wurden abzentrifugiert. Danach wurde die Lösung mit 2 * Al(OH)3-Suspension
(pro 1 Liter Lösung 20 ml Al(011)3 Suspension) 5 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt.
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Zu der F VIII-Lösung wurde vorbehandelte, sterilisierte Diäthylaminoäthylcellulose
bis zu einer Konzentration von 10 g% gegeben. Die AHG-Adsorption erfolgte unter
Rühren in 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Anschließend wurde zentrifugiert. Die
abzentrifugierte Cellulose wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, weiterbehandelt.
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Beispiel 3 Als Ausgangsmaterial zur EIG-Herstellung wurden nach der
in Beispiel 2 beschriebenen Methode die nachstehend auf geführten F VIII-haltigen
Proteinlösungen verarbeitet:
1) Äthanol-Kryopräzipitat 2) Cohn-I-Fraktion
3) AHG-haltige Polyäthylenglykolfällungen 4) AHG-haltige Kochsalzfällungen.
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Die dabei erhaltenen Ausbeuten liegen bei etwa 40 Cfó.