JPH0566393B2 - - Google Patents

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JPH0566393B2
JPH0566393B2 JP59176320A JP17632084A JPH0566393B2 JP H0566393 B2 JPH0566393 B2 JP H0566393B2 JP 59176320 A JP59176320 A JP 59176320A JP 17632084 A JP17632084 A JP 17632084A JP H0566393 B2 JPH0566393 B2 JP H0566393B2
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Tokuji Ikenaka
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規なオリゴサツカライド誘導体及び
これを基質として用いるα−アミラーゼ活性の測
定方法に関する。 試料、特にヒトの生体内の唾液、膵液、血液、
尿中のα−アミラーゼ活性の測定は医学上の診断
において重要である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳
下腺炎においては、血液や尿中のα−アミラーゼ
活性は通常の値に比べて著しい上昇を示す。 α−アミラーゼ活性の測定方法については、こ
れまで種々の方法が発表されているが、大別する
と、でんぷん、アミロース、アミロペクチン等の
長鎖の天然物及びその修飾物を使用する方法と、
グルコース残基数が４〜７個のオリゴサツカライ
ド及びその誘導体を使用する方法の２種に分けら
れる。 しかしながら、最近では、例えばマルチテトラ
オース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオース等のオリゴサツカライド
を基質に用いる方法（特開昭50−56998号公報、
特開昭53−37096号公報）やｐ−ニトロフエノー
ル等の色原体を還元末端に結合したオリゴサツカ
ライドを用いる方法（特開昭54−51892号公報）
等、均一で構造の明確な基質を用いる方法がこれ
まで多く使用されてきたデンプンを用いる方法に
代わつてアミラーゼ測定法の主流となりつつあ
る。 これらの方法では通常、測定用共役酵素として
α−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.20；α−Ｄ−グ
ルコシドグルコヒドロラーゼ）又はグルコアミラ
ーゼ（E.C.3.2.1.3；１，４−α−Ｄ−グルカング
ルコヒドロラーゼ）、又はβ−グルコシダーゼ
（E.C.3.2.1.21；β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロ
ラーゼ）を必要とする。 これらの共役酵素は、α−１，４−グリコシド
結合を有する糖鎖の非還元性末端からα−１，４
−グリコシド結合を加水分解するエキソタイプの
酵素であり、α−アミラーゼ反応に関係なく基質
を分解してしまう欠点を有する。この為これら共
役酵素を用いる上記測定法に於ては、測定用試液
が不安定で、試薬盲検値が極めて高くそれにより
測定精度を著しく悪化してきた。さらに測定に充
分な量のグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコ
シダーゼを使用できず、正確で且つ精度の高い測
定法の組立が困難であつた。 かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、こ
れまで数種の新規な修飾オリゴサツカライドを合
成し、これらを用いるα−アミラーゼ活性の測定
法について特許出願している。 例えば、α−アミラーゼ活性を測定するに際
し、グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴ
サツカライドの非還元末端グルコースの６位の一
級アルコール（−CH2OH）が一般式−CH2Rで
表わされる基で置換された下記構造式を有するオ
リゴサツカライド誘導体を、基質として使用する
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法
がある。（特開昭59−51800号） （式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｋは
２〜５の整数であり、Ｒは、例えばピリジルアミ
ノ基を表わす。） これらの基質は、均一で構造が明確でありα−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコ
アミラーゼの基質とならない点に特徴を有してい
る。しかしながら、これらの基質を用いてα−ア
ミラーゼ活性を測定するには、高速液体クロマト
グラフイー法によるか、或いはα−グルコシダー
ゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼを
共役酵素に用いて生成するグルコースを測定する
方法によらねばならず、前者は特殊な機器を必要
とする点、後者は検体中に含まれるグルコースに
より影響を受ける点等に問題があつた。 今回、本発明者らは、このような問題点を有さ
ないα−アミラーゼ活性の測定法及びこれを用い
る基質について更に研究を重ねた結果、グスコー
ス鎖が４〜７個のオリゴサツカライドの非還元末
端グルコースの６位の一級アルコール（−
CH2OH）を−CH2R1（R1は特定の有機残基）に
置換し、更に還元末端グルコースの１位をフエノ
キシ基若しくは置換フエノキシ基又はウンベリフ
エリル基で置換した新規なオリゴサツカライド誘
導体を合成し、これをα−アミラーゼ活性測定用
の基質として用いることにより、上記した如き従
来法の問題点を全て解消した優れたα−アミラー
ゼ活性測定法を提供し得る本発明に到達した。 即ち、本発明は、グルコースが４〜７個からな
る直鎖状オリゴサツカライドの非還元末端グルコ
ースの６位の一級アルコール（−CH2OH）が−
CH2R1で示される基で置換され、更に、還元末
端グルコースの１位がフエノキシ基若しくは置換
フエノキシ基又はウンベリフエリル基で置換され
た、下記構造式〔１〕、 〔式中、ｎは２〜５の整数であり、R1は２−ピ
リジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基の如きピ
リジルアミノ基、アニリノ基若しくはメチルアニ
リノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフエ
ニルアミノ基の如き置換アニリノ基、低級アルキ
ルアミノ基、或いはカルボキシメトキシ基（−
OCH2COOH）又はその塩を表わし、R2は
【式】又は
【式】を表 わす。（但し、R3〜R6は水素、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、
スルホン基又はハロゲンを表わし、夫々同じであ
つても異なつていても良く、R7は水素、低級ア
ルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わす。ま
た、R8は水素又はメチル基を表わす。）〕 で示されるオリゴサツカライド誘導体、及びこれ
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法の
発明である。 本発明のオリゴサツカライド誘導体は、通常デ
キストリン、アミロース等の多糖類を原料とし
て、一般に下記の如く合成される。 合成例 １ (1) 先ず非還元末端グルコースの６位の一級アル
コールが２−ピリジルアミノ基で置換されたオ
リゴサツカライド誘導体を公知文献例えばジヤ
ーナルオブザバイオケミストリー93巻1055頁
（1983年）に従い合成する。 即ち、デキストリンのグルコース残基の６位
の一級アルコールをジメチルスルホキシドと
Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドで
部分酸化後、２−アミノピリジンとシツフの塩
基を形成させ、シアノボロハイドライドで還元
し、２−アミノピリジル基が導入されたデキス
トリンを得る。これにバチルス属由来液化型ア
ミラーゼとグルコアミラーゼを作用させ、非還
元末端グルコースに２−ピリジルアミノ基が導
入されたオリゴサツカライド誘導体の混合液を
得る。100℃、10分の加熱処理で、添加したア
ミラーゼとグルコアミラーゼを変性させた後、
過して不溶物を除く。次いで、要すれば、イ
オン交換カラムクロマトグラフイーにより精製
し、
【式】（Ｇはグルコース単位を 表わす。）で示されるＯ−６−デオキシ−６−
〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコピラノースの画分を得る。 (2) 次いで、これに例えば、ｐ−ニトロフエニル
−α−Ｄ−グルコシド若しくはｏ−クロロフエ
ニル−α−Ｄ−グルコシド又は４−メチルウン
ベリフエリル−α−Ｄ−グルコシド等と、バチ
ルス属由来のサイクロマルトデキストリン−グ
ルカノトランスフエラーゼ（E.C.2.4.1.19）を
加え反応させる。この反応を式で示せば下記の
如くなる。 （ここで、Ｇはグルコース単位を示し、PNP
はｐ−ニトロフエノキシ基を、OCPはｏ−ク
ロロフエノキシ基を、MUFは４−メトキシウ
ンベリフエリル基を夫々表わす。） 反応液をゲルクロマトグラフイーにより精製
し、
【式】（又は…−Ｇ− OCP、…−Ｇ−MUF等）で示されるＯ−６−
デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−ｐ−ニトロフエ
ニルグルコピラノース（又は…−ｏ−クロロフ
エニルグルコピラノース、…−４−メチルウン
ベリフエリルグルコピラノース等）を得る。 合成例 ２ (1) 非還元末端グルコースの６位の一級アルコー
ルがカルボキシメチル基で置換されたオリゴサ
ツカライド誘導体を、公知文献例えば、特開昭
59−31699号公報に従い合成する。即ち、分子
量約15000から20万のアミロース、水酸化ナト
リウム、そしてモノクロル酢酸を水溶液中で反
応させる。アミロースのグルコース単位１モル
に対し、アルカリは５〜30モル、モノクロル酢
酸は約0.5〜2.5モルを使用する。反応は約30〜
70℃で30分〜３時間加熱撹拌することにより進
行する。本反応によりグルコースの約15〜30個
毎にカルボキシメチル基又はその塩が入つた修
飾アミロースを得る。本反応はS.Peat等の方法
〔Nature、159、810（1947）〕による。 次いで生成物を中和後、外液に水を使用し透
析する。透析操作により、塩化ナトリウム、ハ
イドロキシ酢酸ナトリウム等の反応副生成物が
除去される。本液をPH約５〜７程度の緩衝液に
加え、さらにα−アミラーゼを加え37℃で一定
時間反応させる。 反応後、反応液を70℃以上の温度で、30〜60
分加熱し、α−アミラーゼを失活させる。加熱
処理後、反応液を約20℃程度まで冷却させ、液
のPHを６〜８の中性に調整後、α−グルコシダ
ーゼ又はグルコアミラーゼを加え、37℃で10〜
30時間作用させ、α−アミラーゼの作用により
生成したオリゴサツカライド誘導対（オリゴ糖
も含む）の非還元末端からα−１，４−グルコ
シド結合を分解し、カルボキシメチル基あるい
はその塩が非還元末端グルコースに入つたオリ
ゴサツカライド誘導体をうる。 次に、この混合物を濃縮し、H.Kondo等の
方法〔Agric.Biol.Chem.、45、2369（1981）〕に
従いゲル過によるクロマトグラフイーで、目
的とするオリゴサツカライド誘導体即ち、カル
ボキシメチル基又はその塩が非還元末端に入つ
たマルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオースの各分画を得る。 (2) 上で得た各分画を濃縮後、各々に、ｐ−ニト
ロフエニル−α−グルコシド若しくはｏ−メト
キシフエニル−α−グルコシド又は４−メチル
ウンベリフエリル−α−グルコシド等と、バチ
ルス属由来のサイクロマトデキストリングルカ
ノトランスフエラーゼ（E.C.2.4.1.19）を加え
反応させる。この反応を式で示せば下記の如く
なる。
【表】 （ここで、Ｇはグルコース単位を示し、PNP
はｐ−ニトロフエノキシ基を、OMPはｏ−メ
トキシフエノキシ基を、MUFは４−メチルウ
ンベリフエリル基を夫々表わし、ｍは４から６
までの整数を示す。） 反応液をゲルクロマトグラフイーにより精製
し、本発明のオリゴサツカライド誘導体、即
ち、カルボキシメチル基又はその塩が非還元末
端に入り、ｐ−ニトロフエノキシ基若しくはｏ
−メトキシフエノキシ基、又は４−メチルウン
ベリフエリル基等が還元末端に入つたマルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオースを得る。 合成例 ３ 合成例２に従い、カルボキシメチル基又はその
塩が非還元末端に入つたマルトテトラオース、マ
ルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルト
ヘプタオースの各分画を得る。この各分画を濃縮
後、各々に、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｄ−〔１−（ｐ−ニトロフエノキシ）グルコ
ピラノース〕若しくはα−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−Ｄ−〔１−（ｐ−クロロフエノキシ）
グルコピラノース〕又はα−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｄ−〔１−（４−メチルウンベリフ
エリル）グルコピラノース〕等と、バチルス属由
来のサイクロマルトデキストリングルカノトラン
スフエラーゼ（E.C.2.4.1.19）を加え反応させる。
この反応を式で示せば下記の如くなる。
【表】 （ここで、Ｇはグルコース単位を示し、PNPは
ｐ−ニトロフエノキシ基を、PCPはｐ−クロロ
フエノキシ基を、MUFは４−メチルウンベリフ
エリル基を夫々表わし、m′は３から６までの整
数を示す。） 反応液をゲルクロマトグラフイーにより精製
し、本発明のオリゴサツカライド誘導体、即ち、
カルボキシメチル基又はその塩が非還元末端に入
り、ｐ−ニトロフエノキシ基若しくはｐ−クロロ
フエノキシ基、又は４−メチルウンベリフエリル
基が還元末端に入つたマルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘ
プタオースを得る。 一般式〔１〕で示される本発明のオリゴサツカ
ライド誘導体に於て、R1で示される特定の有機
残基としては２−ピリジルアミノ基、３−ピリジ
ルアミノ基等のピリジルアミノ基、アニリノ基若
しくはメチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフエニルアミノ基の如き置換アニ
リノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロ
ピルアミノ基等の低級アルキルアミノ基、或いは
カルボキシメトキシ基（−OCH2COOH）又はそ
の塩が挙げられる。また、一般式〔１〕の−OR2
に於て、
【式】で表わされる置換 フエノキシ基としては、オリゴサツカライドの還
元末端に結合し、グルコアミラーゼ、α−グルコ
シダーゼ又はβ−グルコシダーゼの作用を受けて
加水分解され得るものであり、更に、水解後は、
ニトロフエノール類の如くそれ自体可視部に吸収
を有するものか、又はカテコールオキシダーゼ、
ラツカーゼ、チロシナーゼ、又はモノフエノール
オキシダーゼ等の酸化酵素の作用を受けてカプラ
ーとカツプリングして色素を生ずるか、或いは酸
化剤によりカプラーとカツプリングして色素を生
ずるものであればいずれにても良い。このような
条件を満足するR2としては、例えば、ｐ−ニト
ロフエニル基、ｍ−ニトロフエニル基、ｏ−クロ
ロフエニル基、ｐ−クロロフエニル基、２，６−
ジクロロフエニル基、ｏ−メトキシフエニル基、
ｐ−メトキシフエニル基、ｏ−メチルフエニル
基、ｏ−カルボキシフエニル基、ｏ−スルホフエ
ニル基等が挙げられるが、これらに限定されな
い。 また、一般式〔１〕の−OR2に於て、
【式】で表わされるウンベリ フエリル基としては、R8が水素のウンベリフエ
リル基又はR8がメチル基の４−メチルウンベリ
フエリル基が挙げられる。 本発明のオリゴサツカライド誘導体を基質とし
て用いるα−アミラーゼ活性測定法の測定原理は
概略次の通りである。
【表】 〓又はα−グルコシダーゼ、β−〓

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴ
    サツカライドの非還元末端グルコースの６位の一
    級アルコール（−CH2OH）が−CH2R1で示され
    る基で置換され、更に、還元末端グルコースの１
    位がフエノキシ基若しくは置換フエノキシ基又は
    ウンベリフエリル基で置換された、下記構造式
    〔１〕 〔式中、ｎは２〜５の整数であり、R1は２−ピ
    リジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基の如きピ
    リジルアミノ基、アニリノ基若しくはメチルアニ
    リノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフエ
    ニルアミノ基の如き置換アニリノ基、低級アルキ
    ルアミノ基、或いはカルボキシメトキシ基 （−OCH2COOH）又はその塩を表わし、 R2は【式】又は 【式】 を表わす。（但し、R3〜R6は水素、低級アルキル
    基、低級アルコキシ、ニトロ基、カルボキシル
    基、スルホン基又はハロゲンを表わし、夫々同じ
    であつても異なつていても良く、R7は水素、低
    級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わ
    す。また、R8は水素又はメチル基を表わす。）〕 で示されるオリゴサツカライド誘導体。 ２ グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴ
    サツカライドの非還元末端グルコースの６位の一
    級アルコール（−CH2OH）が−CH2R1で示され
    る基で置換され、更に、還元末端グルコースの１
    位がフエノキシ基若しくは置換フエノキシ基又は
    ウンベリフエリル基で置換された、下記構造式
    〔１〕、 〔式中、ｎは２〜５の整数であり、R1は２−ピ
    リジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基の如きピ
    リジルアミノ基、アニリノ基若しくはメチルアニ
    リノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフエ
    ニルアミノ基の如き置換アニリノ基、低級アルキ
    ルアミノ基、或いはカルボキシメトキシ基 （−OCH2COOH）又はその塩を表わし、 R2は【式】又は 【式】 を表わす。（但し、R3〜R6は水素、低級アルキル
    基、低級アルコキシ、ニトロ基、カルボキシル
    基、スルホン基又はハロゲンを表わし、夫々同じ
    であつても異なつていても良く、R7は水素、低
    級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わ
    す。また、R8は水素又はメチル基を表わす。）〕 で示されるオリゴサツカライド誘導体を基質とし
    て使用することを特徴とするα−アミラーゼ活性
    測定法。 ３ α−アミラーゼの共役酵素として、グルコア
    ミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシ
    ダーゼを用い、酵素反応により生成するニトロフ
    エノール類の吸収スペクトルを測定することによ
    りα−アミラーゼ活性を測定する、特許請求の範
    囲第２項記載の測定法。 ４ α−アミラーゼの共役酵素として、グルコア
    ミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシ
    ダーゼを用い、酵素反応により生成するフエノー
    ル又はフエノール誘導体に、必要によりカツプラ
    ーの存在下、カテコールオキシダーゼ、ラツカー
    ゼ、チロシナーゼ又はモノフエノールオキシダー
    ゼを作用させ、生成する色素の吸収スペクトルを
    測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定
    する。特許請求の範囲第２項記載の測定法。 ５ α−アミラーゼの共役酵素として、グルコア
    ミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシ
    ダーゼを用い、酵素反応により生成するフエノー
    ル又はフエノール誘導体に、必要によりカツプラ
    ーの存在下、酸化剤を作用させ、生成する色素の
    吸収スペクトルを測定することにより、α−アミ
    ラーゼ活性を測定する、特許請求の範囲第２項記
    載の測定法。 ６ α−アミラーゼの共役酵素として、グルコア
    ミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシ
    ダーゼを用い、酵素反応により生成するウンベリ
    フエロン又は４−メチルウンベリフエロンの蛍光
    強度を測定することにより、α−アミラーゼ活性
    を測定する、特許請求の範囲第２項記載の測定
    法。
JP59176320A 1984-08-24 1984-08-24 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 Granted JPS6183195A (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP59176320A JPS6183195A (ja) 1984-08-24 1984-08-24 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法
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