JPS63196297A - マリトオリゴ糖―配糖体化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関
する。更に詳しくは、高収率で高純度のマルトオリゴ糖
誘導体の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、α、β−核置換フェニルマルトオリゴ糖等のマル
トオリゴ糖誘導体の製造方法としては、化学的合成法及
び酵素法が知られている。

化学的合成法は、以下のようにして行われる〔特開昭５
４−２５８９３号〕。マルトペンタオース、マルトヘキ
サオース等のマルトオリゴ糖を、アセチル化して水酸基
を保護した後、アセチル化マルトオリゴ糖の末端をハロ
ゲン化する。次いで得られたハロゲン化アセチルマルト
オリゴ糖にα、β−核置換フェノールをピリジン等の溶
媒の存在下に作用させるとα、β−核置換フェニルマル
トオリゴシドのアセチル化物が得られる。得られたアセ
チル化物を脱アセチル化して目的とするα、β−核置換
フェニルマルトオリゴシドを得る。

酵素法は、以下のように行われる［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ　６１　（１９７８）、　３５
９〜３６ｇ］　、α−シクロキストリンとα、β−核置
換フェニルグルコキシドにサイクロデキストリングリコ
ジルトランスフェラーゼ等の転移酵素を作用させると、
α、β−核置換フェニルマルトオリゴシドの混合物が生
成する。次いで得られた混合物をカラムクロマトグラフ
ィーにより分画して、目的とするα、β−核置換フェニ
ルマルトオリゴシド、例えば４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−マルトヘプタオシドを得る。

しかるにこれらの方法のうち化学的合成法は、工程が多
く煩雑で、収率も低く又α、β体を自由に調製し得ない
という欠点がある。

又、酵素法は、反応工程は簡便であるが、重合度の接近
する同族体を多く生成する。そのため、グルコースの重
合度の異なったものの混合物となり、高純度品を得るた
めにはクロマトグラフィーによる分画が必要であった。

また収率も低いという欠点もあった。

ところでマルトオリゴ糖誘導体は、従来、ヒト体液中の
α−アミラーゼ活性測定用基質、各種生理活性物質、天
然低カロリー甘味料、色素等として利用されている。例
えば、ヒト体液中のα−アミラーゼ活性測定用基質とし
てマルトオリゴ糖誘導体を用いると、測定が簡便で、か
つ自動分析計による分析に対する適応性が良いという利
点を有している。ところが、該測定用基質としては、高
純度のマルトオリゴ糖誘導体が必要とされる。しかるに
前記従来法では、高純度のマルトオリゴ糖誘導体の調製
は容易ではなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

そこで本発明は、高純度のマルトオリゴ糖誘導体を高収
率で製造できるマルトオリゴ糖誘導体の製造方法を提供
することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、親水性有機溶媒と水との混合溶媒中で、マル
トオリゴ糖、又はアミラーゼの作用によってマルトオリ
ゴ糖に変換される物質と０−グルコシル誘導体との混合
物に、アミラーゼを作用させることを特徴とするマルト
オリゴ糖誘導体の製造方法に関する。

以下本発明について説明する。

本発明において用いられる「マルトオリゴ糖」とは、グ
ルコースの重合度２〜７のマルトオリゴ糖である。マル
トオリゴ糖の例として、マル）−ス、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオース、マルトヘプタオース等を挙げることができ
る。これらのマルトオリゴ糖は単独又は混合物であって
もよく、マルトオリゴ糖源としてマルトオリゴ糖を主成
分とする澱粉分解物を用いることもできる。又、本発明
においては、マルトオリゴ糖の他にアミラーゼの作用に
よってマルトオリゴ糖に変換される物質を用いることが
できる。アミラーゼの作用によってマルトオリゴ糖に変
換される物質としては、例えばアミラーゼによって重合
度２〜７のマルトオリゴ糖を主成分として生成し得る澱
粉分解物を挙げることができる。

一方、本発明において用いる０−グルコシル誘導体とは
、糖部非還元末端がグルコースである０−グルコシル化
合物をいう。

例えば、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用なα
、β−核置換フェニールマルトオリゴシドを調製する際
に用いる０−グルコシル誘導体としては、４−ニトロフ
ェニルα−Ｄ−グルコシド、４−ニトロフェニルβ−Ｄ
−”ルコシド、２−クロロ−４−二トロフェニルα−Ｄ
−１’ルコシト、２−クロロ−４−二トロフェニルーβ
−Ｄ−１’ルコシｌ’、２．４−ジクロロフェニル−β
−Ｄ−グルコシ）’、２．６　　”’クロロ４−ニトロ
フェニルβ−Ｄ−グルコシド等を挙げることができる。

更に、生理活性を有するＯ−グルコシル誘導体の例とし
ては、アルブチン、コニフェリン、サリシン等のフェノ
ール配糖体、センノシドＡ、Ｂ等のアントラセン配糖体
、ステビオシト、ベルベナリン等のテルペン配糖体、ゲ
ンチオピタリン等の苦味配糖体、ジギトニン等のステロ
イド配糖体、シラレンＡ１ラナタグリコシドＡ等の強心
配糖体、各種ジベレリングルコシドくピレノシノールグ
ルコシド等のリグナン配糖体等が挙げられる。但し、本
発明で用いられる０−グルコシル誘導体は上記化合物に
限定されるものではなく、糖部の非還元末端がグルコー
スである化合物であればよい。尚、本発明では、０−グ
ルコシル誘導体は、α体、β体のいずれを用いてもよく
、α体を用いればα−マルトオリゴシトが得られ、β体
を用いればβ−マルトオリゴシトが得られる。

本発明で用いるアミラーゼとしては澱粉を加水分解する
酵素であれば何れを用いてもよい。但し、効率よく目的
とするマルトオリゴ糖誘導体を生成させるためにはグル
コアミラーゼまたはマルトオリゴ糖生成アミラーゼが好
ましい。例えばゲルコアミラー、ゼ、マルトトリオース
生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、
マルトヘキサオース生成アミラーゼ等が特に好ましい。

マルトース生成アミラーゼとしては、大豆、麦芽等の植
物起源のβ−アミラーゼ以外に、バチルス・ポリ　ミ　
キサ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｏｌｙｍｙｘａ、　　
　Ｊ、　　　Ｒｏｂｙｔ　　ａｎｄ　　Ｄ。

Ｆｒｅｎｃｈ、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ　１０４．３３８　（１９６４）］、Ｙ、Ｔａ
ｋａｓａｋｉ、　　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅ
ｍ、、４０．　１５１５−１５２３（１９７６）　］、
シュードモナス属菌［：ｐｓＨｄｏｍｏｎａｓＳＩＮ：
　　Ｓ、　　５ｈｉｎｋｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ
、　　Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ。

５３、６９３−６９８　（１９７５））　、ストレプト
ミセス・ヒゲロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｏｔｏｍｙｃｅ
ｓ　ｈｉｇｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓ。

Ｙ、Ｈｉｄａｋａ　　ｅｔ　　ａｌ、、５ｔａｒｋｅ、
　　　２６．４１３　　（１９７４））　　、ストレプ
トミセス・プレコックス［５ｔｒｅ　ｏｔｏｍ　ｃｅｓ
ｐｒａｅｃｏｘ、　　若生勝男ら、澱粉化学、２５．１
５５　（１９７８））、、− 等の微生物起源のマルトース生成アミラーゼがある。

また、マルトトリオース以上のグルコース重合度を有す
るオリゴ糖を生成するアミラーゼとしては次のものが知
られている。

マルトトリオース生成アミラーゼ〔若生勝男ら：澱粉化
学、２６．１７５　（１９７９）、ストレプトミセス・
グリセウス（Ｓｔｒｅ　ｏｔｍ　ｃｅｓ　　ｒｉｓｅｕ
ｓ）起源のもの；高崎義幸：昭和５８年度日本農芸化学
大会要旨集、Ｐ１６９　（１９８３）、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　）属起源のもの〕マルトテトラオース生
成アミラーゼ（Ｊ、Ｆ。

Ｒｏｂｙｔ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｊ、　　Ａｃｋｅｒｍａ
ｎ　　：　　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１４５　、１０５　（１９７１）
、シュードモナス・ストッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　　５ｔｕｔｚｅｒｉ）　起源のももの〕 マルトペンタオース生成アミラーゼ（Ｎ、　５ａｉｔｏ
：Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１
５５．２９０　（１９７３）、バチルス・リケニホルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
起源のもの；小林ら；昭和５８年度日本澱粉学会大会要
旨集、Ｐ２Ｏ３（１９８３）　　；吉儀ら；昭和５９年
度日本農芸化学大会要旨集、Ｐ５８４　（１９８４））
マルトヘキサオース生成アミラーゼ〔に、　Ｋａｉｎｕ
ｍａら：ＰＥＢ５　Ｌｅｔｔ、、　２６．２８１　（１
９７２）、エアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）起源のもの；Ｊ、
Ｆ、ｋｅｎｎｅｄｙ　ａｎｄ　　Ｃ，Ａ、　Ｗｈｉｔｅ
　：５ｔａｒｋｅ。

３１、９３　（１９７９）　　；呑口ら：ｉｌ粉化学、
刀、１０７（１９８２）　；Ｙ、Ｔａｋａｓａｋｉ　　
：Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４７゜２１
９３　（１９８３）］ 本発明は、前記マルトオリゴ糖等及び０−グルコシル誘
導体に、親水性有機溶媒と水との混合溶媒中でアミラー
ゼを作用させる。

本発明において、親水性有機溶媒としては特に限定はな
く、水混和性の有機溶媒であることが特に好ましい。親
水性有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、
ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジオ
キサン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキサイド、エチレングリコール、プロピレング
リコール、等が挙げられる。特にアルコール系の溶媒が
好ましい。

これらの親水性有機溶媒は単独で使用してもよく、また
２種以上を混合して使用してもよい。

水との混合溶媒における親水性有機溶媒の含有率は、溶
媒の種類、基質の種類等によっても変わるが、約２０〜
８０％、好ましくは約３０〜７０％が適当である。

以下に本発明の反応条件について説明する。

マルトオリゴ糖等と０−グルコシル誘導体の反応時のモ
ル比は特に限定されることはなく、反応溶媒に対する溶
解度、反応速度、収率、経済性等を考慮して適宜決定す
ればよい。マルトオリゴ糖、又はアミラーゼの作用によ
ってマルトオリゴ糖に変換される物質と０−グルコシル
誘導体のモル比は通常約１：１から約１：５の範囲が好
ましい。

又、マルトオリゴ糖、又はアミラーゼの作用によってマ
ルトオリゴ糖に変換される物質と０−グルコシル誘導体
の混合溶媒中における合計濃度は、モル比と同様溶媒に
対する溶解度、反応速度、収率等を考慮して決定すれば
よいが、通常１０〜６０％、好ましくは２０〜５０％が
適当である。

反応温度は、約２０〜６０℃の範囲の通常アミラーゼの
至適温度附近で行えばよい。使用する酵素の種類、反応
の速度、収率等を考慮して選定することができる。反応
ｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨ附近、通常約４〜８の
範囲が適当である。

反応時間は、反応温度、酵素の使用量によって異るが、
通常約２時間〜１２０時間、好ましくは約１２時間〜４
８時間の範囲が適当である。

反応は、可溶性酵素を用いるバッチ式、あるいは固定化
酵素を用いる連続式の何れの反応形式を用いても行うこ
とができる。反応終了後ｐＨを酸性又はアルカリ性にす
るか、加熱して酵素反応を停止した後、カラムクロマト
グラフィー、溶媒抽出等によって分画を行い、目的とす
るマルトオリゴ糖誘導体を得ることができる。

また分画の際に未反応の０−グルコシル誘導体画分を回
収し、繰り返し再使用することも出来、これにより０−
グルコシル誘導体よりのマルトオリゴ糖誘導体の収率を
高めることが出来る。

本発明の主反応は次式の如く表すことができる。

Ｇｎ生成アミラーゼ Ｇ＋ａ十Ｇ１　　ＲＧｎ−ｔ　　Ｒ＋Ｇｎ”Ｇ＠−ｍこ
こにおいてＧ、、Ｇ、はそれぞれグルコースの重合度が
ｍＳｎであるマルトオリゴ糖を表し、ＧＩ−Ｒは０−グ
ルコシル誘導体でＲはアグリコン部を表す。０−グルコ
シル誘導体の糖部の糖の重合度は１以上でもよいが、こ
こでは非還元末端のグルコースのみをＧ１　で表すもの
とする。ｍ、ｎはそれぞれ整数でｎ＜ｍ≦２　ｎ　ｓ　
ｎ　＝１〜６の関係を有する。

上記反応を水溶液中で行うと加水分解反応が速やかに進
行してＧ１及びＧ、−７が主生成物となり、転移反応に
よるマルトオリゴシト誘導体（Ｇ、。１−Ｒ）の生成は
少なくマルトオリゴ糖誘導体を上記の反応により生成さ
せ採取することは極めて困難である。

しかるに本発明のように親水性有機溶媒と水との混合溶
媒中で反応を行うと、加水分解反応が抑制され、０−グ
ルコシル誘導体をアクセプターとし、マルトオリゴ糖等
をドナーとする転移反応が著しく促進される。

即ち、本発明によれば親水性有機溶媒と水との混合溶媒
中でマルトオリゴ糖と０−グルコシル誘導体にアミラー
ゼを作用させるという極めて簡便な方法で効率よくマル
トオリゴ糖誘導体を製造することが出来る。

本発明の製造方法によって、例えばヒト体液中のα−ア
ミラーゼ活性測定用基質として有用なマルトオリゴ糖に
アグリコンとして発色団が結合したマルトオリゴ糖誘導
体を調製することができる。

このようなマルトオリゴ糖誘導体は、α−グルコシダー
ゼおよび／またはβ−グルコシダーゼの存在下にα−ア
ミラーゼを作用させると発色団を遊離するため、ヒト体
液、例えば血清、尿等に含まれるα−アミラーゼ活性の
測定用基質として有用である。

又、本発明の製造方法によって、例えば生理活性を有す
る０−グルコシル配糖体のグルコース残基にマルトオリ
ゴ糖が結合したマルトオリゴ糖配糖体を得ることができ
る。これらの配糖体の糖部にマルトオリゴ糖が結合した
ものは、溶解度、呈味、生理活性、安定性等の物性の改
善が期待される。

生理活性を有する０−グルコシル配等体としては、例え
ば、利尿剤として有用なアルブチン、咳薬として有用な
コニフェリン、鎮痛剤として有用なサリシン等のフェノ
ール配糖体、皮膚薬、眼疾薬として有用なエスクリン等
のクマリン配糖体、下剤として有用なセンノシドＡＳＢ
等のアントラセン配糖体、健胃、強壮剤、甘味料として
有用なステヒオシド、凝血剤、子宮収縮剤として有用な
ペルベナリン等のテルペン配糖体、抗マラリャ剤として
有用なゲンチオピタリン等の苦味配糖体、コレステロー
ル沈澱剤として有用なジギトニン等のステロイド配糖体
、強心作用を有するシラレンＡ、ラナタグリコシドＣ等
の強心配糖体、植物伸長作用を有する各種ジベレリング
ルコシドであるジベレリン配糖体、血圧降下作用、強壮
作用を有するビルシノールジグルコシド等のリグナン配
糖体を挙げることができる。

以下に実施例を挙げて更に具体的に説明するが、本発明
は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの調
製 マルトペンタオース２４０ｍｇ　（０，２９ｍＭ　）と
４−二トロフェニルーβ−Ｄ−グルコシド２６０ｍｇ　
（０，８６ｍＭ　Ｎモル比１：３）とを、１５　ｍＭ酢
酸バッファー（ｐＨ６，０）＋メタノール（１：１）溶
液に加え全量１ｒｎｆ！とじた。

これに酵素としてシュードモナス　スフツェリ（Ｐｓｅ
ｎｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）由来のマルトテ
トラオース生成アミラーゼ０．２単位（１％可溶性澱粉
を基質として１分間に１μＭのグルコシド結合を分解す
る酵素量を１単位とする）を加え、３０℃で４８時間反
応を行った。

反応終了後０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９，８）を
加えて反応を停止し、濃縮した。Ｂｌｏ−Ｇｅ１−ｐ２
を用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより反応
生成物を分画して、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マル
トペンタオシド（Ｋ度９９．２％）９０ｍｇを得た（収
率３２．７％）。分画して得られた生成物が４−−−）
ロフェニルーβ−Ｄ−マルトペンタオシドであることは
、核磁気共鳴スペクトルにより確δ忍した。

実施例２ ４−ニトロフェニル−α−Ｄマルトペンタオシドの調製 マルトペンタオース１２０ｍｇ　（０，１４ｍＭ　）と
４−二）ロフェニルーα−Ｄ−１’ルコシ）’　８４　
ｍｇ（０，２８ｍＭ　Ｎモル比１：２）とをメタノール
−酢酸バッファー（ｐＨ６，０）（メタノール５０％）
に溶解し、全量１−とした。これにマルトテトラオース
生成アミラーゼ０．２単位を加え３０℃で２００時間反
応行った。

反応終了後実施例１と同様に処理し、１８ｍｇの４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド（純度９９
．５％）を得たく収率１３．１％）。

分画して得られた生成物が４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトペンタオシドであることは核磁気共鳴スペクト
ルにより確認した。

実施例３ ４−ニトロ、２−クロロ−β−Ｄ−マルトヘフクオシド
の調製 マルトヘプタオース６００ｍｇ　（０，５２ｍＭ　）と
４−二トロー２−１０口フェニルーβ−Ｄ−グルコシド
７００ｍｇ　（２，０８ｍＭ　）（モル比１：４）とを
メタノール−酢酸バッフｙ　−（１５ｍＭ　ｐＨ６，０
）溶液（メタノール４０％）に加え全量を５−とじた。

これにアエロバクタ−アエロゲネス （＾ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来の
マルトヘプタオース生成アミラーゼ０．４単位（１％可
溶性澱粉を基質として４０℃において１分間に１μＭの
グルコシド結合を切断する酸素量を１単位とする）を加
え、３０℃で１８時間反応を行った。

反応終了後実施例１と同様に処理し、１２０ｍｇの４−
二トロ、２−クロロフェニル−β−Ｄ−マルトヘプタオ
シド（純度９８．９％）を得た（収率１５．２％）。

分画して得られた生成物が、４−ニトロ、２−クロロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトヘプタオシドであることは、核
磁気共鳴スペクトルにより確認した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）親水性有機溶媒と水との混合溶媒中で、マルトオ
   リゴ糖、又はアミラーゼの作用によってマルトオリゴ糖
   に変換される物質とｏ−グルコシル誘導体との混合物に
   、アミラーゼを作用させることを特徴とするマルトオリ
   ゴ糖誘導体の製造方法。
2. （２）親水性有機溶媒がメタノール、エタノール、ｎ−
   プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジオキサ
   ン、ホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、エチレン
   グリコール、プロピレングリコール又はこれらの混合物
   である特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
3. （３）マルトオリゴ糖が、グルコースの重合度２〜７の
   マルトオリゴ糖である特許請求の範囲第（１）項記載の
   製造方法。
4. （４）アミラーゼの作用によってマルトオリゴ糖に変換
   される物質が、アミラーゼによって重合度２〜７のマル
   トオリゴ糖を主成分として生成し得る澱粉分解物である
   、特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
5. （５）アミラーゼがマルトオリゴ糖生成アミラーゼ又は
   グルコアミラーゼである特許請求の範囲第（１）項記載
   の製造方法。