JPH05506221A - Ｈｉｖエンベロープポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 台　ＨＩＶエンベロープポリペプチド ５　発明の分野 本発明は、ＨＩＶウィルスの抗原およびＨＩＶｅｎＶ糖タンパク賀中に認められ る生理学的に活性な新規ポリペプチドに関する。

）　発明の背景 ｒ　後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）と同 定されたレトロウィルスによって引き起こされる。いくつかの免疫学的異常がＡ ＩＤＳに関して記述されており、これらにはＢ細胞機能の異常、異常な抗体応答 、不完全な単球細胞機能、サイトカイン産生の損傷、ナチュラルキラーおよび細 胞障害性細胞機能の低下、ならびに可溶性抗原を認識し、これに応答するリンパ 細胞の能力の欠陥が含まれる。ＡＩＤＳに伴う他の免疫学的異常も報告されてい る。Ｔ４ヘルパー／インデューサーリンパ細胞集団の枯渇は、ＡＩＤＳ患者にお ける、より重要な免疫学的欠陥の１つである。

ＡＩＤＳに認められる深遠な免疫不全にもかかられず、免疫不全に寄与する機構 は明確には理解されていない。数種の仮定が存在する。許容されている１つの見 解は、免疫応答性の欠陥が、ヘルパーＴ細胞機能の損傷とその結果として起こる 正常な免疫応答に必要な細胞の枯渇をもたらす、ＨＩＶによるヘルパーＴ細胞の 感染によるというものである。インビトロおよびインビボ研究は、免疫応答にお いて補助細胞として必須の役割を果たすことが知られている単核細胞にもＨＩＶ が感染し得ることを示した。またＨＩＶは、感染細胞における正常なサイトカイ ン産生を妨害し、それにより例えばＩＬ−１およびＩＬ−２不全などの２次的免 疫不全をもたらすことによっても免疫不全をもたらし得る。ＨＩＶが誘発する免 疫不全のさらなる手段は、免疫応答を抑制し得る因子の産生からなる。これらの モデルはいずれも、複製ウィルスによる感染ではなくＨＩＶ自体の成分がＡＩＤ Ｓに伴う免疫学的異常に寄与しているか否かの疑問を解決しない。

ｒｏｗ、　Ｓ、ら、　Ｊ、ＶｉｒｏｌｏｇＹ　５１（２）　：、５７０（１９８ ７））。ＨＩＶウィルス粒子は宿主細胞の外膜から誘導される摸もしくはエンベ ロープ（包膜）によって覆われている。この膜は、カルボキシル末端領域で膜二 重層に固定されたエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１６０）の集団を含有する。

各糖タンパク質は２つのセグメントを含有する。Ｎ末端セグメントは約１２０ｋ Ｄの相対分子量を有するがゆえにＩＮ）１２０と呼ばれており、ウィルス粒子を 取り巻く水性環境中に突き出している。Ｃ末端セグメントはｇｐ４１と呼ばれて おり、膜をまたいでいる。ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、タンパク質加水分解切 断に対する感受性が著しく高いペプチドによって連結されている（例えば、Ｍｃ Ｃｕｎｅら、　ＥＰＯ出願第０３３５６３５号（優先日＝８８年３月２８日）お よびこの文献に引用された文献を参照のこと）。

ＨＩＶ−１がＡ１．ＤＳの病原物質として最初に同定されて以来、ＨＩＶ−１の 主要エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）は集中的な研究の対象となってき た（Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉら、　１９８３）。ｇｐ１２０分子は、ワク チン候補として（Ｂｅｒｍａｎら、１９８８：Ａｒｔｈｕｒら、　１９８７）、 ウィルス受容体ＣＤ４を介してのウィルス付着の媒介物質（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ ら、　１９８４　：　Ｋｌａｔｚｍａｎら、　１９８４）および細胞−細胞融合 （ンンンチウム形成）によるウィルスの蔓延の媒介物質として、ならびにそれ自 身免疫抑制効果を有する物質として（Ｓｈａｌａｂｙら、　１９８７　：　Ｄｉ ａｃｏｎｄら、　１９８８）、興味がもたれている。またこれはＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ におけるＨＩＶ−１の病原性の潜在的媒介物質でもあり（Ｓｉｌｉｃｉａｎｏら 。

１９８８　：　５ｏｄｒｏｓｋｉら、　１９８６）、免疫攻撃のために最も利用 しやすいウィルスタンパク質であると提唱されている。

最近ｇｐ１２０は、サブユニットワクチンの最良の候補と見なされている。その 理由は、（ｉ）ｇｐ１２０はＣＤ４結合ドメインを保持し、ＨＩＶはこのＣＤ４ 結合ドメインによってその標的細胞に付着することが知られていること、（ｉｉ ）ｇｐ１２０に対する抗体がインビトロでＨＩＶの感染性を中和し得ること、（ ｆｆｉ）ＨＩＶに感染した個体の血清中に存在するインビトロ中和活性の大部分 がｇｐ１２０アフィニティーカラムによって除去され得ること、および（ｔｖ） ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体が細胞−細胞融合によるＨＩ〜′の伝染に不可欠で あると思われることである。例えば、ｆｌｕら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１１ｔニア ２ｌ−７２４（１９８７）（ワクシニアウィルス−Ｈ１’ｖ’　ｅ　ｎ　ｖ組換 えワクチン）　＋　Ａｒｔｈｕｒら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３（１２）　： ５０４６−５０５３（１９８９Ｍ精■■ ｐ１２０）；およびＢｅｒｍａｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８５：５２００−５２０４ＣＬ９８８ン（g換 えエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０）を参照のこと。

ｇｐ１２０分子は膜結合性糖タンパク質ｇｐ１６０の一部として合成される（Ａ １１ａｎら、　１９８５）。宿生細胞が媒介する過程を介してｇｐ１６０が切断 されることにより、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質ｇｐ４１が生成する（ １？ｏｂｅｙら、１９８５）。

ｇＤ１２０とｇｐ４１は共同して、新たに放出されたＨＩＩＩウィルス粒子の表 面に認められるスパイクを形成する（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍら、　１９８７）。

ｇｐ１２０とｇｐ４１の間には共有結合が存在しないので、遊離のｇｐ１２０が 感染細胞およびウィルス粒子の表面から放出される（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍら、 　１９１１ｔ５）。

ｇｐ１２０分子は６００００ダルトンのポリペプチド核からなり、Ｎ−結合型グ リコシル化による大規模な修８４：よってその分子の見掛は上の分子量が１２０ ０００まで増大する（Ｌａｓｋｙら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３　：２０９− ２１２（１９８６））。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変ドメインに よって散在させられた５つの比較的保存された領域を含有する（Ｍｏｄｒｏｖら 、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１（２）　：５７０（１９８７）　；　ｆｉｌ ｌｅｙら、　ＰｒｏｃA　Ｎａ ｔＬ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３：５０３ｇ−５０４２（１９８６））。

超可変ドメインは多数のアミノ酸置換、挿入および欠失を含有する。これらのド メイン中の配列変化は、種々のウィルス単離物由来のｇｐ１２０分子間に２５％ までの総配列可変性をもたらす。この変化にもかかわらず、ｇｐ１２０の数種の 構造的および機能的要素が高度に保存されている。これらには、ウィルス受容体 ＣＤ４に結合するｇｐ１２０の能力、ｇｐ４１と相互作用Ｔることによってウィ ルスと宿主細胞膜の融合を誘発するｇｐ１２０の能力、ｇｐ１２０−欠配列中の １８１１のンステイン残基の位置、ならび１：ｇｐ１２０配列中の約２４個のＮ −結合型グリコリル化部位のうち１３部位の位置が含まれる。

当該分野の多くの研究者がｇｐ１２０の突然変異原性変種および断片変種を作成 しティる。例えばＭａｔｓｕｓｈｉｔａら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６２： ２１０７−２１１４（１９８ｇ）　：　Ｒｕ５ｃｈｅら、o ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８５：３１９８−３２ ０２（１９８８）　；　Ｇｏｕｄｓｍｉｔら、ＡＩＤＳ　２F１５ｌ５７−１６ ４（１９８ ；　Ｊａｖａｈｅｒｉａｎら、Ｐ　ｒＯｃ、　Ｎａ　ｊｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８６：６７６８−６７７２（１９８９）　；　kａ５ｋｙら、Ｃｅ １１５ ０：９７５−９８５（１９８７）　；　Ｋｏｗａｌｓｋｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２３７：１３５１−１３５５（１９８７）　；　Ｗｉｌｌ■凾轣AＰｒｏｃ、 　Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：５０３８−５０４２（１９８６ ）　；　Ｍｏｄｒｏｖら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１F５７０−５７８（ １９８７） を参照のこと。

ＩＮ）１２０内のジスルフィド結合様式および該分子上の実際のオリゴ糖部分の 位置は、ｇｐ１２０の機能的ドメインおよびその機能を薬学的に妨害するための 潜在的な部位（例えば型共通中和エピトープ）を明らかにする目的で行う突然変 異誘発および断片化の研究を指揮する上で有用な情報となるであろう。この情報 は、天然の供給源から入手できるｇｐ１２０の量が少ないこと、ｇｐ１２０中の ジスルフィド結合およびオリゴ糖構造が複雑であること、ならびに非哺乳類系で 生産されるｒｇｐ１２０の機能性あるいは構造上の関連性に関する不確定性（Ｍ ｏｏｒｅら。

印刷中）ゆえに、人手することが困難であった。

本発明者らは本発明において予想外にも、天然型ｇｐ１２０のいくつかの領域が 特定の三次元的立体配置で存在し、その立体配属がイソタイプおよび株間で保存 されていることを発見した。

本発明の目的は、ＨＩＶ感染の証拠について生物学的試料を検定するための診断 的手段として有用な新規ポリペプチドを提供することにある。

また本発明のさらなる目的は、ワクチンおよびＨＩＶ感染の過程の薬学的妨害に 使用できる新規ポリペプチドを提供することにある。

本発明のさらなる目的は、このようなポリペプチドおよびこのようなポリペプチ ドに対する抗体の製造法を提供することにある。

本発明の他の目的、性質および特徴は、以下の説明および添付の請求の範囲を考 究すれば明白になるであろう。

発明の要約 本発明の目的は、ＨＩＶ感染を有するかもしくはＨＩ　Ｖ感染を有する危険にあ るヒトまたはヒト以外の叡者への投与に適した、単離された環化ポリペプチドか らなる組成物の製造および投与によって達成される。これらの環化ポリペプチド （環化されたポリペプチド）は次の群から選択される。

ａ）ＣＶＫＬＴＰＬＣＣＮＴＳＶＩＴＱ、ＡＣ［配列番号１］および約２８アミ ノ酸残基未満を含有するもの； ｂ）ＰＩＨＹＣＡＰＡＧＦＡＩＬＫＣＮＮＫＴＦＮＧＴＧＰＣＴＮＶＳＴＶＱＣ ＴＨＧＩＲＰ　［配列番号２〕および約４５アミノ酸残基未満を含有するもの； ｃ）ＣＮＮＫＴＦＮＧＴＧＰＣ［配列番号３］および約２２アミノ酸残基未満を 含有するもの： ｄ）ＣＡＦ’ＡＧＦＡＩＬＫＣＣＴＮＶＳＴＶＱＣ［配列番号４コおよび約３０ アミノ酸残基未満を含有するもの； ｅ）ＰＩ、ＨＹＣＣＴＨＧＩＲＰ　Ｃ配列番号５］および約２２アミノ酸残基未 満を含有するもの； ｆ）ＧＧＤＰＥＩＶＴＨ３ＦＮＣＧＧＥＦＦＹＣＮＳＬＰＣＲＩＫＱＦＩＮＭＷ ＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩ　５ＧＱＩＲＣ３ＳＮＩＴＧ　［配列番号６コおよび 約６５アミノ酸残基未満を含有するもの：ｇ）ＣＧＧＥＦＦＹＣＣＲＩＫＱＦＩ ＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣ［配列番号７］および約４５アミ ノ酸残基未満を含有するもの；ｈ）ＣＡＳＤ、ＡＫＡＹＤＴＥＶＨＮＶＷＡＴＨ ＡＣ［配列番号８］おヨヒ約３０アミノ酸残基未満を含有するもの：および、１ ）ＴＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫＡＹＤＴＥＶＨＮＶＷＡＴＨ，ＡＣＶＰＴＤＰＮ　［ 配列番号９コおよび約５０アミノ酸残基未満を含有するもの。

さらに本発明は、下記の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ ＴＬＶ−ＩＩＩＢ株のＨＩＶｅｎｖポリペプチドの決定基と免疫学的に交差反応 する１または複数の抗原決定基を有する単離されたポリペプチド（単離ポリペプ チド）からなる組成物に関する。

ａ）残基１〜８０： ｂ）残基８〜１８０： Ｃ）残基１６５〜２６０： ｄ）残基１６０〜２６０゜ ｅ）残基２６０〜３１０；および、 ｆ）残基３２０〜４７９゜ とりわけ本発明は、本発明の組成物からなるワクチンに関する。本発明の組成物 は、その変種類縁体を含めて、腎者試料中のＨＩＶ中和抗体に関する診断的検定 にも有用である。

本発明の単離ポリペプチドに対するモノクローナル抗体が提供され、これｊヨ、 配位子に対するその親和性、エピトープ結合性、ならびにａ）ＣＤ４／ｇｐ１２ ０結合を遮断する能力、ｂ）ＨＩＶウィルス粒子を中和する能力、Ｃ）インビト ロで逆転写酵素活性を減少させる能力、およびｄ）ンンシチウム形成を阻害する 能力によって特徴づけられる。

これらの抗体は患者もしくは患者試料中のＨＩＶ感染の存在に関する診断手段と して有用であり、またＨＩＶｅｎｖのアフィニティー精製にも有用である。これ らの抗体はＨＩＶに感染した患者を受動的に免疫化する際にも有用である。特定 の態様として、細胞毒素、水不溶性マトリ・ソシス、あるいは検出可能なマーカ ー（標識）と結合した抗体を提供する。

特定の領域を指向するとして文献に記述されている抗体のすべてが、実際１こ本 明細書に定義するものと同じ残基番号に対応するわけではないことに注意すべき である（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：２１ ０７−２１４４（１９８ｇ）　：　ＥＰＯ出願番号ＥＰ３３９T０ ４　；　Ｒｕ５ｃｈｅら、　Ｐｒｏｃ、　！１ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、　８５　：３１９８−３２０２（１９８８）　＋@Ｌｏｏｎｅｙら、 　５ｃｉｅｎｃｅ ２４１　＋３５７−３３９（１９８８）を参照のこと）。

来の組換え融合糖タンパク質（９ＡＡ［配列番号１１３またはＣＬ４４　［配列 番号１２］）のＮ末端配列部分のアミノ酸配列を表す。９ＡＡおよびＣＬ４４構 築物中のｇＤｌおよびｇｐ１２０セグメント間の融合部位をそれぞれ（＊）およ び（＊＊）で記す。文字Ｔはｇｐ１２０セグメントについて認められたトリプシ ン切断を表し、それらのペプチドをその分子のＮ末端から出発して順番に並べで ある。

子番号に続く小文字は他の予期しなかったタンパク加水分解切断を示す。文字Ｈ はＣＬ４４の単純ヘルペスｇＤ１タンパク質部分について認められたトリプシン 切断を表す。ペプチドＴ２’はＣＬ４４中の融合部位を含有する。ｇｐ１２０の システィン残基を四角く囲み、潜在的Ｎ−グリコリル化部位を対応するアスパラ ギン残基上の点で示す。

図２は、ＲＣＭ　ＣＬ４４の逆相ＨＰＬＣトリプシンマツプを表す。このクロマ トグラムはトリプシン消化したＲＣＭ　ＣＬ４４　７．５止０１を用いて作成し たものである。クロマトグラフィー条件は「実験法」の項に記載の通りである。

ピークを集め、ＡＡＡによって同定し、場合により、Ｎ末端配列分析によって確 認した（表Ｉ）。同定したピークを図１に記載の命名法に従って命名する。加水 分解されなかった潜在的トリブ／ン部位を含有するペプチドを、コンマ（１）で 分けた２つの子番号で指定する。

図３は、９　Ａ　Ａの逆相ＨＰＬＣトリプシンマツプを表す。このクロマトグラ ムは６．８ｎＩＩｌｏｌの試料を用いて作成したものである。クロマトグラフィ ー条件は本明細書の実施例に記載の通りである。システィン残基を含有するピー クをＮ末端配列分析によって同定した。これらの同定を表ＩＩに要約する。

図４は、個々のジスルフィドを単離するために、９ＡＡのマツプから得たトリプ シンペプチドをさらに操作した結果を表す。これらのクロマトグラムは、（ａ） ペプチドＴＩ２、Ｔ１３、およびＴ１４（ピーク０１図３）のＰＮＧａｓｅＦ処 理とそれに続（−ンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ処理、（ｂ）ペプチドＴ３、Ｔ ４、およびＴ１１（ビークＦ１図３）のＰＮＧａｓｅＦ処理とそれに続くエンド ブロチイナーゼロへ５ｐ−Ｎ処理、ならびに（ｃ）ペプチドＴ２８およびＴ３１ （ピーク０１図３）の５、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼ処理、から得られる ペプチドの微小孔逆相ＨＰＬＣ分離の詳細である。クロマトグラフィー条件は本 明細書の実施例に記載の通りである。ピークの同定はＮ末端配列分析によって決 定し、その結果を表ＴＩＩに示す。

図５は、エンドグリコシダーゼ処理したＲＣＭ　ＣＬ４４の逆相ＨＰＬＣ１−リ プンンマップを表す。これらのクロマトグラムは、（ａ）非処理ＲＣＭ　ＣＬ４ ４、（ｂ）ＰＮＧａｓｅ　Ｆで処理したＲＣＭ　ＣＬ４４、および（ｃ）エンド Ｈで処理したＲＣＭＣＬ４４、のトリプシンマツプである。各トリプシンマツプ は７　、５　ｎｍｏｌの試料を用いて作成したものである。クロマトグラフィー 条件は「実験法」の頂に記載の通りである。ピークを集め、ＡＡ　八によって同 定した（非開示データ）。糖ペプチドピークを図１の命名法に従って命名する。

図６は、ＨＩＶ−１のｌｌｌ５単離物のｇｌ）１２０の模式図であり、アミノ酸 を１文字コードで表し［配列番号１０］、ジスルフィドとグリコジル化部位を示 す。

５つのジスフィト結合ドメインにローマ数字を付す。Ｍｏｄｒｏ曹ら、　Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、　６１　：５７０−５７８（１９８７）の５つの超可変領域を四角 く囲み、■１〜ｖ５で分類する。高マンノース型および／またはハイブリッド型 オリゴ糖構造を含有するグリコジル化部位を枝別れしたＹ記号で示し、複合型オ リゴ糖構造を含有するグリコジル化部位をｖ型記号で示す。

図７は、ＨＩＩ２のＨＩＶ且且ヱ糖タンパクｊｒｇｐ１２０の模式図であり、ジ スルフィドと潜在的グリコジル化部位を表す［配列番号１３］。Ｎ残基を四角く 囲むことによってグリコジル化部位を示す。５つのジスルフィド結合ドメインに ローマ数字を付す。

発明の詳細な説明 上述のように、本明細書におけるＨ　Ｉ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖを、本明細書に議論す るＨＩＶｅｎｖまたはその変種の共有結合的修飾によってインビトロで作成され る誘導体およびアミノ酸配列変種と共に、ヒト免疫不全ウィルスのエンベローブ ポリペプチドと定義する。本明細書で用いる場合、用語“ＨＩＶｅｎｖ”はｇｐ １２０および／または１６０のすべての形態（例えば断片を含む）、ｇｐ１６０ ／１２０もしくはそれらの断片の他のペプチドとの融合物、および異なるグリコ ジル化を受けえば、ＥＰ公開番号１８７０４１を参照のこと。以下、組換え細胞 培養中で製造されたｇｐ１２０をｒｇｐ１２０と記載する。安全で経済的である がゆえに組換え合成が好ましいのであるが、化学合成によるペプチド製造および ウィルス培養か、もしくはＨＩＶｅ旦ヱをコード化する遺伝子を含有する入手可 能なサブゲノムクローンから得られる。

本発明は単離されたポリペプチド（単離ポリペプチド）に関する。これらの単離 ポリペプチドのいくつかは特定のアミノ酸配列を含有する環化ポリペプチドとし て定義され、いくつかの単離ポリペプチドは特定のアミノ酸残基番号を表示する ことによって記述される。アミノ酸番号付与法は図６および図ＩＡ［配列番号ｌ Ｏ］に示す成熟ＨＩＶ−１ｇｐ１２０アミノ酸配列を反映しており、シグナル配 列や他の上ａ領域はいずれも数えていない。意図する残基を都合よく表示するた めに本明細書を通してこのアミノ酸番号付与法を使用するが、本発明がこれらの 特定の残基番号に限定されないことは理解されるところである。天然型ＨＩＶ− ＩＩＩＩ　Ｎ末端シグナル配列を含有するｇｐ１２０配列については、番号付与 法が異なり得る。上流の欠失または挿入がウィルスゲノムおよびＨＩＶｅｎｖの 長さを変化させている他の株には同じヌクレオチドおよびアミノ酸残基番号を適 用できないであろうが、ｇｐ１２０のこの部分をコード化する領域は本明細書の 教示を参照することにより容易に同定される。また、変種シグナル配列（例えば 、後述のように断片化したシグナル配列もしくは異種シグナル配列との融合によ ってもたらされるもの）はわずかに異なる番号付与法を導き得るが、図６および ／または図ＩＡ［配列番号１０］を参照することによって、すべての態様につい て正確なアミノ酸配列が識別される。

本発明の嵐離ポリペプチドという用語が本明細書で使用される場合、これらの用 語は、特定したアミノ酸配列を有するポリペプチド、脱グリコジル化もしくは非 グリコ／ル化誘導体、相同的アミノ酸配列変種、およびインビトロで作成した相 同的な変種および誘導体を包含し、前記の変種は図６または図７のＨＩＶｅｎＶ と同様の生物学的活性を発揮し得る。

単離ポリペプチドの生物学的活性は、１）少なくとも１つの単離ポリペプチドと の免疫学的交差反応性、あるいは２）ｊＩＩＭポリペプチドと定性的に共通する 少なくとも１つの接着もしくはエフェクター機能を保持すること、のいずれかと 定義される。単離ポリペプチドの定性的生物学的活性の例には、ウィルス受容体 ＣＤ４または既知のモノクローナル抗体に対する結合能力、およびｇｐ４１と相 互作用することによりウィルスと宿三細胞膜の融合を誘発するｇｐ１２０の能力 が含まれる。

本明細書で用いられる免疫学的交差反応性は、候補ポリペプチドが、既知の活性 類縁体に対して生じたポリクローナル抗血清とのこの反応性を有する単離ポリペ プチドの定性的生物学的活性を競争的に阻害し得ることを意味する。このような 抗血清は、従来の方法に従って例えば完全フロイントアンユバシト中の既知の活 性類縁体をヤギまたはウサギの皮下に注射し、次いで不完全フロイントでブース ター（追加免疫）腹腔内または皮下注射することによって調製される。

当業者は、請求の範囲に記載の単離ポリペプチドの突然変異誘発および断片変種 を指向するために、本明細書に記述する１）１２０内のジスルフィド結合様式お よび該分子上の実際のオリゴ糖部分の位置を利用することができる。本発明の変 種は１以上の残基が置換されている単離ポリペプチド、１以上の残基の欠失体、 および１以上のアミノ酸残基の挿入体を包含すると見なされる。

また本発明は単離ポリペプチドのアミノ酸配列変種をも包含する。アミノ酸配列 変種は、配位子または抗体に対する単離ポリペプチドの親和性を増大させたり、 単離ポリペプチドの安定性、精製および製造を促進したり、その血漿半減期を変 化させたり、医薬的効力を改善したり、単離ポリペプチドを医薬的に使用する際 の副作用の重篤度または出現を軽減させることを含む種々の目的をもって製造さ れる。以下の議論では、単離ポリペプチドのアミノ酸配列変種を選択され得る変 種の代表例として記載する。

単離ポリペプチドのアミノ酸配列変種は、挿入的変種、置換的変種、および欠失 的変種という３種類の群の１以上に属する。これらの変種は通常、単離ポリペプ チドをコード化するＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって 製造される。即ち、この部位特異的突然変異誘発によって変種をコード化するＤ ＮＡを得た後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させる。しかし、約１００ 〜１５０アミノ酸残基までを有する断片はインビトロ合成によって便利に製造さ れる。以下の議論はあらゆる単離ポリペプチドに、その構造または機能に適用可 能な範囲で適用される。

単離ポリペプチドのアミノ酸配列変種は、天然もしくは天然に存在する対立遺伝 子には認められない予定された変種である。単離ポリペプチド変種は典型的には 天然に存在する単離ポリペプチドもしくは単離ポリペプチド類縁体と同じ定性的 生物学的（例えば抗体結合）活性を発揮する。しかし抗体に対して結合できない 単離ポリペプチド変種および誘導体であっても、（ａ）単離ポリペプチドもしく はその単離ポリペプチドに対する抗体の診断的検定における試薬として、（ｂ） 既知の方法で不溶化した場合には、抗〜単離ポリペプチド抗体を血清もしくはハ イブリドーマ培養上清から精製するための試薬として、ならびに（Ｃ）単離ポリ ペプチドに対する抗体を生じさせるための免疫原として、もしくは免疫検定キッ ト成分として（標識されたものは天然型の単離ポリペプチドの競争試薬として、 また非標識のものは息離ポリペプチド検定の標準として）、少なくとも１つの単 離ポリペプチドエピトーブが活性な状態で残っている限り有用である。

アミノ酸配列変化を導入する部位は予め決定されるが、変異自体を予め決定する 必要はない。例えば、ある与えられた部位での変異の効果を最適化するために、 標的コドンにおいてランダム突然変異誘発もしくは飽和突然変異誘発（この場合 、考え得る２０残基すべてを挿入する）を行い、発現した単離ポリペプチド変種 を望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。このようなス クリーニングは当該技術分野の通常の技術に属する。

アミノ酸挿入は通常およそ１から１０アミノ酸残基までの程度であろう。置換は 典型的には単独の残基について導入する。欠失はおよそ１から３０残基の範囲で あろう。欠失または挿入を隣接する対で行うこと（即ち、２残基の欠失もしくは ２残基の挿入）が好ましい。置換、欠失、挿入、もしくはそれらのあらゆる組み 合わせを導入もしくは組み合わせることによって最終構築物に到達することは、 以下の議論より十分明らかになるであろう。単離ポリペプチドの挿入的アミノ酸 配列変種は、その単離ポリペプチドにとって外来性の１以上のアミノ酸残基が標 的単離ポリペプチド内の予定された部位中に導入され、それが先注の残基を転！ させたものである。

一般に挿入的変種は、単離ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシル末端 に対する異種タンパク質またはポリペプチドの融合物である。このような変種を 、単離ポリペプチドと単離ポリペプチドの挿入位置に通常認められる配列以外の 配列を含有するポリペプチドの融合物という。本発明には数群の融合物が包含さ れる。

本発明の新規な単離ポリペプチドは診断あるいは既知の免疫アフィニティー技術 による抗体または配位子の精製において有用である。

単離ポリペプチドの望ましい融合物（免疫学的に活性であってもよいし、あるい は免疫学的に活性でな（でもよい）には、天！ＡｓＭの単離ポリペプチドにとっ て異種のシグナル配列と成熟した単離ポリペプチド配列との上述ような融合物が 含まれる。シグナル配列融合物は、単離ポリペプチドの分泌をより能率的に指示 するために使用される。異種ノブナルで天然型の単離ポリペブチトングナルを置 換し、それによって得られた融合物が認識される場合、即ち、宿主細胞によるプ ロセシングを受け、宿主細胞によって切断される場合には、単離ポリペプチドが 分泌される。シグナルは意図した宿主細胞に基づいて選択され、これらには細菌 、酵母、哺乳票およびウィルス配列が含まれ得る。天然型ＨＩＶｅｎｖシグナル またはヘルペスｇＤ糖タンパク質シグナルが哺乳類発現系での使用に適している 。

単離ポリペプチドまたは単離ポリペプチド断片と免疫原性ハブテンまたは異種ポ リペプチドとのＣ末端またはＮ末端融合物は、ＨＩＶ感染に対して患者を免疫化 するためのワクチン成分として有用である。ハブテンまたは異種ポリペプチドと Ｔ細胞結合活性を保持する単離ポリペプチドまたはその活性断片との融合物は、 そのハブテンまたは異種ポリペプチドが標的表面受容体に結合し得る標的細胞に 対して細胞障害性Ｔ細胞を指向させる際に有用である。

融合を行う正確な部位は変化し得、特定の単離ポリペプチドの部位はその単離ポ リペプチドの生物学的活性、分泌あるいは結合性を最適化するために選択される 。特定の実施にとって最適な部位は日常的な実験によ・り決定されるであろう。

置換的変種は、単離ポリペプチド中の少なくとも１残基が除去されて、異なる残 基がその場所に挿入されているものである。このような置換は、単離ポリペプチ ドの特徴を精密に調節することを望む場合には、一般に次の表１に従って行われ る。

（以下余白） 、Ａｓｎ　ｇｉｎ：ｈｉｓ Ｈｉｓ　ａｓｎ：ｇｉｎ Ｐｈｅ　ｍｅｔ；ｌｅｕ：ｔｙｒ 新規アミノ酸配列は活性中心類縁体（アミノ酸その他）と共に本発明の範囲に包 含される。

機能上の同一性あるいは免疫学的同一性の本質的な変化は、表１の置換よりも保 存性の低い置換を選択することによって、即ち、（ａ）置換領域中のポリペプチ ド骨格の構造、例えばノートまたはらせん配座、（ｂ）標的部位おける分子の電 荷あるいは疎水性、もしくは（Ｃ）側鎖の嵩高さ、の維持に対する影響がより有 意に異なる残基を選択することによって起こる。一般に単離ポリペプチドの性質 に最大の変化を生み出すと予想される置換は次の置換であろう、（ａ）親水性残 基（例、セリンまたはスレオニン残基）で（を）疎水性残基（例、ロイシン、イ ソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン残基）を（に）置換す る、（ｂ）システィンまたはプロリンで（を）他のアミノ酸を（に）置換する、 （Ｃ）正荷電側鎖を有する残基（例：リジン、アルギニン、またはヒスチジン残 基）で（を）負荷電残基（例グルタミン酸またはアスパラギン酸残基）を（に） 置換する、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例：フェニルアラニン）で （を）側鎖を持たない残基（例、グリシン）を（に）置換する。

いくつかの欠失、挿入、および置換は、単離ポリペプチド分子の特徴に根本的な 変化をもたらさないであろう。しかし、置換、欠失、あるいは挿入の正確な効果 を前辺て予測することが困難な場合（例えば免疫エピトープを修飾する場合）に は、日常的なスクリーニング検定法によってその効果が評価されることを当業者 は理解するであろう。例えば典型的な場合、変種は、単離ポリペプチドをコード 化する核酸の部位特異的突然変異誘発、組換え細胞培養中での該変種核酸の発現 、ならびに任意の工程として、例えば（少なくとも１つの残存免疫エピトープで 該変種を吸着するための）ポリクローナル抗単離ポリペプチドカラムへの免疫親 和性吸着による、その細胞培養からの精製、によって作成される。次いで細胞溶 解液もしくは精製した単離ポリペプチド変種の活性を、望ましい特徴に適したス クリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、Ｔ細胞結合に対する親和性 などの単離ポリペプチドの免疫学的特徴の変化は競争型免疫検定法によって測定 される。単離ポリペプチドのインビボ機能についてより多くの知見が得られるよ うになれば、他の検定法もこのようなスクリーニングに有用になるであろう。酸 化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解減成に対する感受性、担 体との凝集傾向、多量体への凝集傾向などのタンパク質特性は当業者のよく知る 方法によって検定される。

単離ポリペプチド変種のもう１つの種類は欠失的変種である。欠失は、１以上の アミノ酸残基の、単離ポリペプチド配列からの除去を特徴とする。典型的には、 欠失を用いることによって単離ポリペプチドの生物学的活性に影響を与えるので あるが、単離ポリペプチドの生物学的活性あるいは免疫交差反応性を保存する欠 失が適切である。

システィンあるいは他の不安定残基の欠失も、例えば嵐離ポリペプチドの酸化安 定性を増大させる際などに望ましいであろう。潜在的タンパク質加水分解部位（ 例：＾ｒｇＡｒｇ）の欠失もしくは置換は、これらの塩基性残基の１つを削除す るか、あるいはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することによって達 成される。

いくつかの変種が生物学的活性の減少もしくは喪失を示し得ることは理解される であろう。それでもこれらの変種は、それらが単離ポリペプチドの免疫エピトー プを少なくとも１つ保持している限り、単離ポリペプチドについての免疫検定に おける標準として有用である。

現在のところ、本発明の単離ポリペプチドおよびペプチド組成物の３次元構造が 本明細書に記述するそれらの機能にとって重要であると考えられる。したがって 、請求の範囲の４１離ポリペプチドが形成する活性構造を模倣するすべての関連 構造類縁体は特に本発明の範囲に包含される。

グリコジル化変種は単離ポリペプチドの範囲に包含される。それらには、グリコ ジル化を完全に欠く変種（非グリコジル化体）および天然型より少なくとも１つ はグリコジル化された部位が少ない変種（脱グリコジル化体）ならびにグリコジ ル化が変化している変種が含まれる。脱グリコジル化および非グリコジル化アミ ノ酸配列変種、天然型の未改変単離ポリペプチドアミノ酸配列を有する脱グリコ ノル化および非グリコノル化単離ポリペプチド、および他のグリコジル化変種が 包含される。例えば、置換もしくは欠失突然変異誘発を利用して単離ポリペプチ ドのＮ−結合型もしくは〇−結合型グリコシル化部位を除去する（例えば、（ク リップ部位でない）アスパラギン残基を除去するか、あるいは他の塩基性残基（ リジンまたはヒスチジンなど）で置換する）。別法として、グリコジル化認識部 位を除去することによってグリコジル化を防止するために、アスパラギン残基に 手を加えることなく、グリコジル化部位を形成する隣接残基を置換または削除す る。

原核生物はポリペプチドにグリコ／ル化を導入する能力を有さないので、天然型 単離ポリペプチドのアミノ酸配列を有する非グリコノル化単離ポリペプチドは組 換え原核細胞培養中で生産される。

グリコジル化変種は適切な宿主細胞を選択するか、あるいはインビトロ法で製造 される。例えば、酵母は哺乳類系とはかなり異なるグリコジル化を導入する。

さらに、単離ポリペプチド抗原の供給源とは異なる種（例・ハムスター、ネズミ 、昆虫、ブタ、ラン、ヒツジ）や異なる組ｗＲ（例；肺、肝臓、リンパ系、開先 縁、表皮）由来の哺乳動物細胞も、例えばマンノースのレベルの上昇や、マンノ ース、フコース、シアル酸、および哺乳類糖タンパク質中に典型的に認められる 他の糖類の比率の変化などによって特徴づけられる変化したグリコジル化を導入 するその能力について日常的にスクリーニングされる。単離ポリペプチドのイン ビトロ・プロセシングは、典型的には、酵素的加水分解（例：ノイラミニダーゼ 消化）によって達成される。

クリップ部位を修飾しない単離ポリペプチド分子の共有結合的修飾は本発明の範 囲に包含される。このような修飾は、回収したタンパク質の標的アミノ酸残基を 選択した側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させること によって、あるいは選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利 用することによって、導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物学的活性 、単離ポリペプチドの免疫検定、あるいは組換え単離ポリペプチドを免疫アフィ ニティー精製するための抗単離ポリペプチド抗体の調製にとって重要な残基を同 定することを目指す計画において有用である。例えばニンヒドリンとの反応後に タンパク質の生物学的活性が完全に失活する場合、それは少なくとも１つのアル キニン残基もしくはりジン残基がその活性に極めて重要であることを示唆するも のであり、その後修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチド断片を単離するこ とによって、選択した条件下で修飾された個々の残基を同定する。このような修 飾は当該技術分野における常法に属し、おびただしい実験を伴うことなく実行さ れる。

二官能性試薬による誘導体化は、単離ポリペプチドのポリペプチドとの分子間集 合体を調製する際、ならびにその配位子の検定あるいはアフィニティー精製で用 いるために単離ポリペプチドを水不溶性の支持マトリックスまたは表面に架橋す る際に有用である。さらに、鎖内架橋の研究は立体配！構造に関する直接的情報 を提供するであろう。一般に使用される架橋試薬には、スルフヒドリル試薬、１ ．１−ビス（シア゛シアセチル）−２−フ二ニルエタン、グルタルアルデヒドド ロキンスクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）、 ホモニ官能性イミドエステル（３．　３’−ジチオビス（スクシンイミジループ ロピオネート）などのジスクノンイミジルエステルを含む）、およびビス−Ｎ− マレイミド−１、８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル− ３−ε（ｐ−アジドーフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化試 薬は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を与える。別法として、臭 化ンアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスおよび米国特許第３ ９５９０８０号、同第３９６９２８７号、同第３６９１０１６号、同第４１９５ １２８号、同第４２４７６４２号、同第４２２９５３７号、同第４０５５６３５ 号、および同第４３３０４４０号に記述された系反応性基質がタンパク質の固定 化および架橋に使用される。

一般的には、ポリマーは、そのポリマーおよびタンパク質の１以上のアミノ酸残 基もしくは糖残基と反応する多官能性架橋試薬を介して本発明の単離ポリペプチ ドに連結される。しかし、誘導体化したポリマーを単離ポリペプチドと反応させ るか、あるいはその逆によってポリマーを直接的に架橋させることも本発明の範 囲に包含される。アミノ基に対する共有結合は、シアヌル酸、カルボニルジイミ ダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒド のジエチルアセタール；ＰＥＧ＊ＤＭＳＯおよび酢酸無水物、あるいはＰＥＧ塩 化物−４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフニノキノド、スフノンイミジル活性 エステル、活性化ノチオカーボネートＰＥＧ，２．４．５−トリクロロフェニル クロロホルメートまたはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に 基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル基はカルボジイミドを用い てＰＥＧ−アミンをカップリングさせることにより誘導体化される。

Ｐｅ１ｔｏｎらの方法（Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　２９：２３７０−２３７ ５（１９８６））は、環状モノマーの生産についてＰｅ１ｔｏｎらが記述した希 釈反応混合物よりも高１度の溶液中で反応を行えば環状オリゴマーの比率がより 高くなる点を除いて、適切な方法である。これと同じ化学はダイマー（二量体Ｘ ＡＩ−Ａ＠　Ｐｅｎ　＋　Ａ４−Ａｓ　Ｃｙｓを用いる）、あるいは環状オリゴ マーまたは環状モノ？−（Ｐｅｎ　ＡＩ−Ａ＠　Ｃｙｓ、またはＰｅｎ　ＡＩ− Ａｒｅ　Ｃｙｓ　＋Ｃｙｓ　、ＡＩ−Ａｔｅ　Ｐｅｎ）の合成に有用である。ま たチオメチレン橋（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５（２０）＋ ２０６７−２０６８（１９８４））も有用である。Ｃｏｄｙら、　Ｊ、　Ｍｅｄ 、　Ｃｈｅｗ、　２８：５８３（１X８５） をも参照のこと。

目的の環状または多量化ペプチドはゲル濾過と、それに続く逆相高圧液体クロマ トグラフィーもしくは他の従来法によって精製される。ペプチドを滅菌濾過し、 従来の薬学的に許容される賦形剤中に製剤化する。

ある種の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作 用の結果である。グルタミル残基およびアスパラギニル残基はしばしば翻訳後に 脱アミド化されて対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に変換される 。あるいは、これらの残基は温和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残 基のどちらの形態も本発明の範囲に包含される。

他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基また はスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン 側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　”Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒ ｔｉｅｓ”（ｆ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏ）、　７９−８６頁（１X８３））、Ｎ末 端アミンのアセチル化、および場合により、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含 まれる。

単離ポリペプチドをコード化するＤＮＡはインビトロ法によって合成されるか、 もしくはｃＤＮＡライブラリーから容易に得られる。単離ポリペプチドをコード 化するＤＮＡの合成的作成手段は、手動による場合も、自動化装置による場合も 、特に本明細書の教示に照らして、当業者に一般に知られている。ポリヌクレオ チド合成に関連する技術分野の現状の例として、Ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ −（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８４ ））およびＨ盾窒魔≠狽■ ら、“デオキシヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトを用いる自動ＤＮＡ合成 装置（原題：　Ａｎ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　 Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　３’　|Ｐｈｏｓｐｈ 。

ｒａｍｉｄｉｔｅｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４ ：３１３−３２６（１９８７）を挙げることができる。

別法として、単離ポリペプチドをコード化するＤＮＡを得るためには、特定の動 物の細胞または組織から誘導したｃＤＮＡライブラリー中の相同的配列を含有す るクローンを検出するために単離ポリペプチドまたは単離ポリペプチド断片のい ずれかをコード化する標識されたＤＮＡ（普通はおよそ２０ｂｐより大きく、通 常はおよそ５０ｂｐ）を用いてハイブリッド形成スクリーニングを行い、次いで 全長クローンを同定するために制限酵素分析および核酸配列決定によってそれら のクローンを分析するだけでよい。全長クローンがそのライブラリー中に存在し ない場合には、適当な断片を種々のクローンから回収し、それらの断片に共通の 制限部位で連結することによって全長クローンを組み立てる。種々のイソタイプ および株由来の単離ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、そのような種の宿主 から得たライブラリーを単離ポリペプチドのアミノ酸配列でプローブするか、あ るいはその遺伝子をインビトロで合成することによって得られる。

本発明に有用なベクターを構築する際に、ＤＮＡ配列のクローニングには一般に 原核生物を用いる。例えば大腸菌に１２２９４株（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は 特に有用である。使用し得る他の微生物株には大腸ＭＢおよび大腸菌Ｘ１７７６ （ＡＴＣＣ番号３１５３７）が含まれる。これらの例は限定的なものではなく、 単なる例示である。別法としては、インビトロ・クローニング法（例：ポリメラ ーゼ連鎖反応）が適切である。

本発明の単離ポリペプチドは組換え宿主培養中でＮ末端メチオニル類縁体として 、あるいはハイブリッド／部分にとって異種のポリペプチド（好ましくは、シグ ナル配列もしくはハイブリッド／部分のＮ末端に特異的切断部位を有する他のポ リペプチド）との融合物として、直接的に発現される。例えば、単離ポリペプチ ド用の原核生物用分泌発現ベクターを構築する際には、天然型単離ポリペブチト ングナルをそのシグナルを認識する宿主と共に使用する。分泌先導（１ノーダー ）が宿主によって“認識“される場合、その宿主シグナルペブチダーセがＣ末端 で融合した先導ポリペプチドの融合物を切断して目的の成熟息離ポリペプチドを 与えることができる。天然型嵐離ポリペプチドシグナルを加工しｔ（Ａ宿主原核 生物については、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐお よび熱安定性エンテロトキンンＩＩリーダーからなる群がら選択５ｎる原核シグ ナルでそのシグナルを置換する。酵母分泌のためには、天然型単離ポＩＪペプチ ドシグナルを酵母インベルターゼ、α因子または酸性ホスファターゼ・リーダー で置換することができる。哺乳類細胞発現では、いくつかの嵐離ポリペプチドに つ（λて（ま天然型単離ポリペプチドシグナルもしくは天然型ＨＩＶｅｎｖシグ ナルで十分であるが、他の哺乳顕分泌タンパク質シグナルも、ウィルス分泌リー ダー（例え１；、単純ヘルペスｇＤシグナル）と同様に適当である。

単離ポリペプチドはいずれの宿生細胞中でも発現され得るが、哺乳類宿主中で合 成されることが好ましい。しかし、原核細胞、カビ、酵母、昆虫など由来の宿主 細胞も発現に利用できる。代表的原核生物はクローニング２二適した株ならびに 大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−１原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３２５）、セラチ ア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などの他の腸内 細菌属、ノ〈シラスおよび種々のシュードモナスである。宿主細胞が最小限のタ ン／＜り質加水分解酵素を分泌することが好ましい。

典型的な場合、発現ベクター中に連結された里離ポリペプチドをコードイヒする ＤＮＡで発現宿主を形質転換する。通常このようなベクター（よ複製部位を保持 する（ただし染色体組込みが起こる場合にはその必要はない）。また発現ベクタ ー（よ後述するように、形質転換された細胞に表現型選択を提供し得るマーカー 配ｍ＋をも含有する。例えば大腸菌は、典型的には、大腸菌種から誘導されたプ ラスミドであるｐＢ　Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　２：８５（１９ ７７））を用もＡで形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンビンリンおよびテトラ サイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、したがって、目的がクローニン グであるか発現であるかｊこか力）わらず、形質転換された細胞を容易に同定す るための手段を提供する。また最適な発現ベクターは転写および翻訳の制御に有 用な配列、例えばプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列（原核細胞につい て）もしくはプロモーターおよびエンハンサ−（哺乳類細胞について）をも含有 するであろう。プロモーターは誘導性であってもよいが、必ずしもその必要はな く、ＣＭＶプロモーターのように哺乳類宿主（二とって強力な構成的プロモータ ーでさえ宿主細胞毒性を伴わずに単離ポリペプチドを生産し得る。発現ベクター が発現制御、複製配列または選択遺伝子を含有する必要がないことも考えられる が、これらの配列の欠如は形質転換体の同定および高レベルのペプチド発現の達 成を妨げるであろう。

原核宿主での使用に適したプロモーターの例にはβ−ラクタマーゼおよびラクト ースプロ％−ター系（Ｃｈａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５（１９７ ８）　；　ＧｏｅｄｄｅＬら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４（１９７９））、 アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ ｄｄｅｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０ ）およびＥＰＯ出願公開番号３６７７６）およびｔａｃプロモーター（■、　ｄ ６　Ｂｏｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　 ８０：２ｌ−２５（１X８３）） などのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし他の機能的細菌プロモータ ーも適当である。これらのヌクレオチド配列は一般に知られており、それを治］ 用することによって当業者は、必要な制限部位を供給するリンカ−またｊ１アダ プターを用いて単離ポリペプチドをコード化するＤＮＡにそれらを機能的（＝連 結することができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１１２０：２６９（１９８ ０））。細菌系で使用するためのプロモーターは、単離ポリペプチドをコード化 するＤ　Ｎ　、Ａ、に機能的に連結されたシャイン・ダルガバＳ、Ｄ、）配列を も含有するであろう。

原核生物に加えて、酵母や糸状菌などの真核微生物も満足できる結果を与える。

サツカロマイセス・セレビシｚｌｔ最も一般的に使用される真核微生物であるが 、他の株のいくつかも一般に利用可能である。プラスミドＹＲｐ７は酵母（＝お （する良好な発現ベクターである（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、　Ｎａｔｕｒｅ　 ２８２：３９（１９７９）　ＨＫｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ　７：１４１（１ ９７９）　；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ　１０：１５７（１９８０）） 。このプラスミド（ま、トリプトファン中で生育する能力が欠如した酵母の変異 株（例えｌ１ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　（Ｊｏｎｅｓ 、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：１２（１９７７）））に選択マーカーを提供する ｔｒｐｌ遺伝子を既に含有している。したがって、酵母宿主細胞ゲノムの特徴と してのｔｒｐｌ欠損の存在はトリプトファン非存在下での生育によって形質転換 を検出するために効果的な環境を提供する。

酵母宿主と共に使用するのに適した促進配列には、３−ホスホグリセレートキナ ーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５＋２０７ ３（１９８０））または他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら。

Ｊ、＾ｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７二１４９（１９６８）　：　Ｈｏ１ ｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７：４９００（P９７８ン）（例え ば エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３〜リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー ゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６ −リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ 、トリオセホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、および グルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。

生育条件によって転写が制御されるという追加の利点を有する誘導プロモーター である他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロ ムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、 グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガ ラクトース資化に寄与する酵素群のプロモーター領域である。酵母発現での使用 に適したベクターおよびプロモーターについてはＲ，Ｈｉｔｚｅｍａｎら、欧州 特許公開番号７３６５７　、Ａにさらに詳しく記述されている。

真核細胞のための発現制御配列も知られている。基本的にすべての真核遺伝子は 、転写が開始する部位のおよそ２５〜３０塩基上流にＡＴが豊富な鎮域を有して いる。多くの遺伝子の転写開始部位の７０〜８０塩基上流に認められるもう１つ の配列はＣＸ　ＣＡ　Ａ　Ｔ領域（Ｘはいずれのヌクレオチドでもよい）である 。はとんどの真核遺伝子の３°末端にはＡ　Ａ　Ｔ　、Ａ　Ａ　Ａ配列が存在し 、この配列は解読鎖の３′末端にポリＡ尾を付加するためのシグナルであり得る 。これらの配列はすべて哺乳類発現ベクター中に挿入される。

哺乳類宿主細胞中でのベクターからの転写を制御するのに適したプロモーターは 種々の供給源（例えばポリオーマウィルス、ＳＶ４０、アデノウィルス、ＭＭ■ （ステロイド誘導性）、レトロウィルス（例：ＨＩＶのり、ＴＲ）、Ｂ型肝炎ウ ィルスおよび最も好ましくはサイトメガロウィルスなどのウィルスのゲノム）ま たは異種哺乳類プロモーター（例：ベータアクチンプロモーター）から容易に得 られる。

ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有 するＳＶ４０制限断片として便利に得られる。Ｆｉｅｒｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、 　２７３：１１３（１９７８人ヒトサイトメガロウィルスの即時型初期プロモー ターはＨｉｎｄＩＩＩ　Ｅ制限断片として便利に得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ 、　Ｐ、　Ｊら、Ｇｅｎｅ　１８：３５５−３６０（１９８２）。

より高等な真核生物による単離ポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写は、ベ クター中にエンハンサ−配列を挿入することによって増大する。エンハンサ−は ＤＮＡのシス作用性要素であり、通常はおよそｌＯ〜３００ｂｐであって、プロ モーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサ−は配向および位置に関 して比較的非依存的であり、転写単位の５′側（ＬａｉｔｔｒＬｎｓら、ＰＮＡ Ｓ　７８：９９３（１９８１））および３°側（Ｌｕｓｋｙ、　Ｍ、　Ｌ、ら、 　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　３：１１０８（１９８３））に発見されており 、またイントロン内（Ｂａｎｅｒｊ　ｉ、　Ｊ、　Ｌ、ら、Ｃｅ１ｌ　３３ニア ２９（１９８３））およびコード配列自体の中（Ｏｓｂｏｒｎｅ、　Ｔ、　Ｆ、 ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　４：１２９３（１９８４））にも発見さ れている。現在哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ トプロティン、およびインスリン）から多くのエンハンサ−配列が知られている 。しかし典型的には真核細胞ウィルス由来のエンハンサ−を利用するであろう。

例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサ−（ｂｐ１００〜２７０） 、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサ−１複製起点の後期側のポ リオーマエンハンサ−１およびアゾンウィルスエンハンサ−が含まれる。

真核宿生細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来 の有核細Ｎ？ｉ）中で使用する発現ベクターは、ｍＲＮ、Ａ発現に影響を与え得 る転写の終止に必要な配列をも含有するであろう。これらの領域は、ハイブリッ ド免疫グロブリンをコード化するｍＲＮ、Ａの非翻訳部分中のポリアデニル化さ れたセグメントとして転写される。この３°非翻訳領域には転写終止部位も含ま れる。

発現ベクターは選択遺伝子（これは選択可能マーカーとも呼ばれる）を含有して もよい。畷乳項細胞に適した選択可能マーカーの例はジヒドロフオレートレダク ターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、あるいはネオマイシンで ある。このような選択可能マーカーが成功裏に哺乳類宿主細胞内に導入されるな らば、形質転換されたその哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生き残る ことができる。選択方式には広く用いられている２つの異なる種類がある。第一 の種類は細胞の代謝、ならびに補足培地に依存せずに生育する能力を欠く変異細 胞系統の使用に基づいている。ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞 はその２例である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素 を添加しない条件下で生育する能力が欠如している。これらの細胞は完全なヌク レオチド合成経路に必要ないくつかの遺伝子を欠くので、補足培地中に欠失ヌク レオチドを添加しない限り生存することができない。培地を補足するかわりに、 無傷のＤＨＦＲもしくはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子が欠失している細胞中に 導入し、それによってその生育要求性を変化させることができる。ＤＨＦＲやＴ Ｋ遺伝子で形１を転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できない であろう。

本発明における好ましい態様として、ＤＨＦＲ“であるＣＨＯ細胞を単離ポリペ プチドの組換え発現に利用する。

第二の種類は優性選択、即ち、あらゆる細胞型で使用され、変異細胞系統の使用 を必要としない選択法である。この方法は典型的には宿主細胞の生育を停止する ための薬剤を使用する。異種遺伝子で成功裏に形質転換された細胞は薬剤耐性を 付与するタンパク質を発現し、それゆえにこの選択法に耐えることができる。

このような優性選択の例ではネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、　Ｊ、　Ｍｏ １ｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１：３２７（１９８２））、マイコフェノ ール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９：１４２２（１９８０） ）あるいはハイグＯ？インン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 　５：４１０−４１３（１９８５））などの薬剤を使用する。上記の３例では、 適切な薬剤、即ち、それぞれＧ４１８またはネオマイノン（ゲンタマイシン）、 ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）あるいはハイグロマイシンに対する耐性を獲得 するために、真核細胞の制御下で細菌遺伝子を利用する。

“増幅”とは細胞の染色体ＤＮＡ内の単離された領域の増大または複製をいう。

増幅は選択剤（例：ＤＨＦＲを不活化するメソトレキセー）（ＭＴＸ））を用い ることによって達成される。ＤＨＦＲ遺伝子の増幅もしくは継続的なコピーの生 産は、より大量のＭＴＸにもかかわらず生産されるより大量のＤＨＦＲをもたら す。常に大量のＭＴＸを培地に添加することにより、内因性ＤＨＦＲの存在にも かかわらず、増幅圧がかかる。目的の遺伝子の増幅は、目的のタンパク質をコー ド化するＤＮＡおよびＤＨＦＲ遺伝子または同時組込みを可能にする増幅遺伝子 を有するプラスミドで哺乳類宿主細胞を同時形質転換することによって達成する ことができる。常に大量のＭＴＸ濃度の存在下で生育できる細胞だけを選択する ことにより、細胞がより大量のＤＨＦＲを要求すること（この要求は選択遺伝子 の複製によって満たされる）を確実にする。目的の異種タンパク質をコード化す る遺伝子が選択遺伝子と同時に組み込まれている限り、この遺伝子の複製は目的 のタンパク質をコード化する遺伝子の複製を引き起こす。その結果、目的の異種 タンパク質をコード化する遺伝子のコピーの増大（即ち、遺伝子の増幅）がより 大量の目的タンパク質を発現させる。

単離ポリペプチドの発現に適した真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換されタ サル腎臓ｃｖ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、ヒト胚腎臓系 統（２９３細胞または懸濁培養中での成長のためにサブクローン化された２９３ 細胞、　Ｇｒａｈａｌｌｌ、Ｆ、Ｌ、ら、　Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　３６ ：５９（１９７７））、幼ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ。

ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　ＰＮＡＳ（［！５Ａ）７７　：４２１６ （１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ　４　、　Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　 Ｐ、　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２３＋２４３−２５１（１９８０）） 、サル腎臓細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、７Ｎ）ｈ　ミ）”Ｊｆル腎１ ｍ細胞（ＶＥＲＯ−７６、、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）、ヒト！１１部癌腫細 胞（ＨＥＬＡ、Ａ、ＴＣＣＣＣＬ　２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣ ＣＬ　３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　 １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８．ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）、ヒト肝臓細胞（ Ｈｅｐ　Ｇ２．ＨＢ　８０６５）、マウス乳腫瘍（Ｍ〜ＩＴ　０６０５６２．Ａ ＴＣＣＣＣＬ５１）、およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、ら、　Ａ ｎｎａｌｓ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　３８３：４４−６８（１， ９８２））が含まれる。

目的のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準的 な連結技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工修 復し、望ましい形態に再連結して目的のプラスミドを形成させる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、そのライゲーシ ョン混合物を用いて大Ｍｌ！ｌＫ１２２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転 換し、成功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピンリンもしくはテ トラサイクリン耐性によって選択する。その形質転換体からプラスミドを調製し 、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９＋３０９（１ ９８１）の方法もしくはＭａｌａｔｎら、１ｌｅｔｈｏｄｓ　奄■ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４９９（１９８のの方法で制限分析および／また は配列決定する。

宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換 体の選択あるいは目的の配列をコード化する遺伝子の増幅のために遍坐に改良し た従来の栄養培地中で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は発現のために選択 した宿主細胞についで過去に使用されたものであり、当業者には理解されるであ ろう。

本明細書における宿生細胞は、インビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内の細胞 をも包含する。

“形質転換“は、ＤＮＡが染色体外要素として、あるいは染色体組込みによって 、復製可能であるように生物申にＤＮＡを導入することを意味する。特に示さな い限り、本明細書で使用する宿主細胞の形質転換法はＧｒａｈａＩｌ、　Ｆ、お よびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

Ａ、　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−４５７Ｃ１９７３＞の方法である 。しかし、細胞中にＮＤＡを導入するための他の方１ｅ（ｉＰＩＩえば核注入ま たはプロトプラスト融合など）も使用できる。

原核細胞または強固な細Ｆ＆！構築物を含有する細胞を用いる場合に好ましいト ランスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎ、　Ｆ、　Ｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　６９：２１１０（１X７２） に記述されているように塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。

“トランスフェクション”とは、なんらかのコード化配列が最終的に発現される か否かにかかわらず、宿生細胞中にＤＮＡを導入することを意味する。例えばＣ ａＰＯ４およびエレクトロポレーションなど数多くのトランスフェクション法が 当業者に知られている。宿主細胞の形質転換はトランスフエタン３ン成功の指標 である。

本発明の新規ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸性抽 出、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、ヒ ドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含 む既知の方法によつて組換え細胞培養から回収・精製される。例えばＥＰ１８７ ０４１に記述された精製法を参照のこと。さらに逆相ＨＰＬＣおよび単離ポリペ プチドに対するリガンドを用いるクロマトグラフィーも精製に有用である。現在 のところ、ゲル透過クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー の使用が好ましく、標準的操作法によるカチオン交換および疎水相互作用クロマ トグラフィー（ＨＩＣ）がさらに好ましい。

任意の工程として、標準的な方法（Ｒａｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏ ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３０３：２２５−２２８（１９８４））によってアルデ ヒドシリカに共有結合させた単離ポリペプチド−抗体のカラムを通過させ、カラ ムを食塩溶液で洗浄し、溶出液を標準的な方法（例えば定量的アミノ酸分析など ）で分析することによって単離ポリペプチドを回収・精製する。グリセロールで 覆われた制御された多孔性ガラスに結合したモノクローナル抗体を用いる方法が 本発明の実施にとって望ましい。任意の工程として、低濃度（およそ１〜５ｍＭ ）のカルシウムイオンを精製の間存在させてもよい。単離ポリペプチドをＰＭＳ Ｆなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下で精製することが好ましいであろう。

単離ポリペプチドを必要な補因子と共に医薬的に許容される滅菌等張製剤中に入 れ、これを任意に当該分野でよく知られている標準的な手段で投与する。製剤は 液体であることが好ましく、普通はｐＨ６，８〜７６の非リン酸緩衝液を含有す る生理塩溶液であるか、あるいは凍結乾燥粉末であってもよい。

治療に使用する単離ポリペプチド組成物は製剤化され、投与量は、治療されるべ き障害、個々の也者の状態、単離ポリペプチドの送達部位、投与法および開業医 の知る他の要因を考慮のうえ、良い医療に合致する方法で確立されるであろう。

単離ポリペプチドは、望ましい純度の鳳離ポリペプチドを佐剤（アジュバント） または生理学的に許容される担体（即ち、使用する投与量および濃度において受 容者にとって非毒性である担体）と混合することによって、投与のために調製さ れる。佐剤および担体は、それ自体は標的抗原と免疫エピトープを共有しないが 、標的抗原に対する免疫応答を刺激する物質である。通常これは、蛍離ポリペプ チドを緩衝液、低分子量（およそ１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、 アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレ ート剤、および他の賦形剤と混きすることを必然的に伴うであろう。米国特許第 ４９６３３５４号でのサイトカイン（腫瘍壊死因子およびインターフェロンガン マなど）および種々の毒性微生物物質（ミコバクテリア抽出物など）のように、 この目的には一般にフロインドアジュバント（鉱油乳液）が使用されてきた。抗 原は佐剤と共に投与されることが望ましいが、最初の接種が佐剤と共に送達され る場合には、抗原による追加免疫が佐剤を必要としないこともある。担体はしば しば佐剤として作用するが、担体が抗原を凝集させる水不溶性の巨大分子粒状構 造を含有する点で一般には佐剤と区別される。代表的担体には水酸化アルミニウ ム、ラテックス粒子、ベントナイトおよびリポソームが含まれる。

本発明のワクチンの治療的投与の主要な経路は注射（筋肉内または皮下）である と想定され、静脈内送達またはカテーテルや他の外科チューブを通しての送達も 使用される。代雷経路には錠剤など、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾 燥した受容体もしくはエアゾル化した受容体の吸入が含まれる。液体製剤は粉末 製剤から再構成した後使用することができる。

本新規ポリペプチドを、微小球、リポソーム、他の微小粒状送達系あるいは血液 を含むい（つかの組織中に入れられる徐放性製剤を介して投与することもできる 。徐放性担体の好適例には成型物（例・座剤またはマイクロカプセル）の形態の 半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。埋め込み可能またはマイクロカプセ ル徐放性マトリックスにはポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５ ８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体 （Ｕ、Ｓｉｄｍａｎら、　Ｂｉｏｐｏｌｙ＋ｏｅｒｓ　２２（１）：５４７−５ ５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエ チレンビニルアセテート（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒら、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａ ｔｅｒ、　Ｒｅｓ、　１５　：　１６７−２７７（１９８１）およびＲ，Ｌａｎ ｇｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　１２：９８−１０５（１９８２））が含ま れる。単離ポリペプチドを含有するリポソームはよく知られた方法によって調製 される（ＤＥ３２１８１２１　、Ａ　：　Ｅｐｓｔｅｉｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２：３６８８−３６９２i１９ ８５）　；　ＴＪ ｔａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７ ７：４０３０−４０３４（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ　５２３Q２　、Ａ　；　Ｅ 　Ｐ ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ：ＥＰ１４２５４１Ａ； 日本国特許出願８３−１１８０８：米国特許４４８５０４５および同４５４４５ ４５　＋ＵＰ１０２３４２Ａ）。通常リポソームは小さい（およそ２００〜８０ ０オングストローム）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％コレステロー ル以上であって、その比率はポリペプチドの放出速度を最適に調節するように選 択される。

投与される単離ポリペプチドの量は使用する単離ポリペプチドの性質（例えばそ の結合活性およびインビボ血漿半減期）、製剤中の単離ポリペプチドの濃度、投 与経路、投与の部位および速度、患者の臨床的耐性、患者を冒している病理学的 状態などに依存し、これは医師の技量の範囲内に包含される。一般的には、１投 与あたり１患者あたり量離ポリペプチド約領５ｘｌＯ−’〜５　ｘ　１０−’Ｍ の投与量が好ましい。一連の連続的接種の間に異なる投与量を使用する。医師は 最初の接種を投与した後、比較的少量の里離ポリペプチドワクチンで追加免疫す ることができる。

本発明の単離ポリペプチドワクチンを種々の方法で異なる種類の受容者に投与す ることができる。本ワクチンを用いて、ＨＩＶにさらされる危険があるかも知れ ないし、ないかも知れない個体を予防接種し、さらに、本ワクチンを血清反応陽 性個体および過去にＨＩＶにさらされたことのある個体に投与することが望まし い（例えば５ａｌｋ、＼ａｔｕｒｅ　３２７：４７３−４７６（１９８７）およ び５ａｌｋら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９５：８３４−８４７（１９７７）を参照の こと）。

本単離ポリペプチドを他の抗原と共に単一の接種“カクテル”中に混合して投与 することができる。本単離ポリペプチドワクチンを経時的に投与される一連の接 種の１つとして投与することもできる。このような一連の接種にはＨｒＶ抗原ま たは他のワクチンの同じまたは異なる調製物による接種が含まれ得る。

選択した予防接種パラメーター（例えば投与量、投与計画、佐剤選択など）の妥 当性は、患者から血清の一部を採取し、免疫化プログラムの過程の間の抗体力価 を検定することによって決定される。別法として、後述の実施例１に記述する従 来法でＴ細胞の存在を監視することもできる。さらに、患者の臨床的状態を目的 の効果（例えば抗感染効果）について監視するであろう。予防接種が不十分であ る場合には患者をさらなる単離ポリペプチド予防接種で追加免疫することができ 、免疫応答を強化すると予期される様式（例えば抗原量および／または佐剤の増 加、抗原と担体の錯化あるいは免疫原性タンパク質への結合、もしくは投与経路 の変更）で予防接種パラメーターを改良することができる。

単離ポリペプチドをワクチンとして使用するためには、現在のところ、単離ポリ ペプチドで少なくとも３回は独立した接種を行い、第２回の接種を第１回の接種 の２週間以降、好ましくは３〜８週間後、より好ましくはおよそ４週間後に行う ことが好ましい。第３回の接種を第２回の“追加免疫”接種の数カ月以降、好ま しくは第１固接種の少なくとも５力月以降、より好ましくは第１固接種の６力月 〜２年後、さらにより好ましくは第１固接種の８力月〜１年後に行うことが好ま しい。患者の“免疫記憶”を増大させるために第３回以降の定期的接種も望まし い。

Ａｎｄｅｒｓｏｎら、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１６ ０（６）　：９６０−９６９（Ｄｅｃ、　１９８９）を参照■■■B 一般的に、比較的長期間の間隔をおいた頻繁でない単離ポリペプチドによる免疫 化のほうが、最大限の抗体応答を引き出し、防御効果を引き出すうえで、頻繁な 免疫化より好ましい。

任意に、本発明のポリペプチドをＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓまたは、へＲＣあるいは池のＨ ＩＶ関連疾患および感染の治療に用いられる他の薬剤（例えばＡＺＴＳＣＤ４、 抗生物質、インターフェロンなどの免疫変調因子、抗炎症剤、および抗腫瘍剤） と共に投与することできる。

抗体 本発明はモノクローナル抗体にも関する。本発明に従うことにより、単離ポリペ プチドまたは抗原として活性なその断片のエピトープを特異的に結合するモノク ロ−アル抗体が、抗原で誘導された（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｉｍｅｄ）免疫リン パ細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成した連続的継代ハイブリッド細胞系統 から単離される。

本発明の抗体は日常的なスクリーニングによって得られる。免疫毒素を含有する りンンＡ鎖としての細胞障害潜在能力についてモノクローナル抗体をスクリーニ ングするために検定を用いる。この検定法では細胞を試験抗体の希釈物で処理し 、次いでリジンＡ鎖に結合した第２抗体のＦａｂ断片で処理する（“間接検定法 つ。この間接検定法の細胞障害を、直接検定法（この検定法ではモノクローナル 抗体をリジンＡＭに結合させる）の細胞障害と比較する。間接検定法は与えられ たモノクローナル抗体の免疫毒素としての効力を正確に予言し、それゆえに免疫 毒素として使用するためのモノクローナル抗体をスクリーニングする際に有用で ある（Ｖｉｔｅｔｔａら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１１０９８−１１０４（１ ９？）およびｆｅｌｔｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７：５T５２（１ ９８７）をも参照のこと）。

モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる 。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含有 する従来の抗体（ポリクローナル）調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体 は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は抗原−抗体 結合を用いる診断的および分析的検定法の選択性および特異性を改善するのに有 用である。モノクローナル抗体の第２の利点は、それらがハイブリドーマ培養に よって合成され、他の免疫グロブリンが混入しないという点である。モノクロー ナル抗体を培養したハイブリドーマ細胞の上清から、もしくはハイブリドーマ細 胞をマウスに腹腔的接種することによって誘導した腹水から調製することができ る。

ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 、　６：５１１（１９７６）によって最初に記述されたハイブリドーマ技術は、 多くの特異的抗原に対するモノクローナル抗体を高レベルに分泌するハイブリッ ド細胞系統を作成するために広く通用されてきた。

本発明の特定の態様として、Ｂａ１ｂ／ｃあるいは好ましくはＣ５７ＢＬ／６な どのマウスを単離ポリペプチドに対して免疫化し、単離ポリペプチドと共に前イ ンキュベートした場合に単離ポリペプチドに対するその結合を阻害するクローン 化抗体についてスクリーニングすることによって抗体を得る。複数のモノクロー ナル抗体は親和性、免疫グロブリンクラス、起源の種、またはエピトープに関し て相違することが望ましい。それらは組換え細胞培養中で発現される抗体である か、もしくは既知抗体の予定されたアミノ酸配列変種であってもよく、単離ポリ ペプチドを指向する可変領域とヒトの定′ｆ領域を有する抗体のキメラも含まれ る。

一般に、宿生動物あるいはそこから得られる培夏抗体産生細胞の免疫化の方法お よび日程は、確立された従来の抗体刺激および生産技術と一致する。本出願人は 典型的にはマウスを試験モデルとして使用したが、ヒト対象を含むあらゆる哺乳 類対象あるいはそこから得られる抗体産生細胞も本発明の方法に従って操作する ことができ、それによってヒトを含む哺乳顕ハイブリッド細胞系統の作成の基礎 として機能するものと予期される。

免疫化の後、免疫リンパ系細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって培養でき 無限に継代できるハイブリッドｍ胞系統を作成し、大量のモノクローナル抗体を 生産する。本発明の目的のために融合用に選択される免疫リンパ系細胞は、免疫 化した動物のリンパ節組織または膵臓組織のいずれかから採取したリンパ細胞お よびその王宮に分化した子孫である。免疫膵臓細胞はマウス系に関してより高濃 度で便利な抗体産生細胞供給源を提供するので、本出願人は免疫膵臓細胞の使用 を好む。骨髄腫細胞は融合したハイブリッドの継続的増殖の基礎を提供する。

骨髄腫細胞は血漿細胞由来の腫瘍細胞である。

ある種の細胞を他の種の細胞と融合させることができる。しかし、免疫化した抗 体産生細胞の供給源と骨髄腫細胞の供給源が同じ種由来であることが好ましい。

ハイブリッド細胞系統を細胞培養培地中のインビトロ培養で維持することができ る。本発明の細胞系統をヒボキサンチン−アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ） 培地中の連続的継代細胞系統からなる組成物中で選択および／または維持するこ とができる。実際、一旦ハイブリドーマ細胞系統を樹立したら、それを種々の栄 養的に妥当な培地で維持することができる。さらに、ノゾブリッド細胞系統を、 凍結および液体窒素下での貯蔵を含むいくつかの従来法のいずれでも貯蔵および 保存することができる。凍結した細胞系統を再生し、モノクローナル抗体の合成 および分泌の再開を伴って無限に培養することができる。分泌した抗体を、沈殿 、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの従 来法を用いて組織培養上清から回収する。本明細書に記述する抗体は、これまで にＩｇＧまたはＩｇＭを計重した血漿から精製するために用いられきた場合と同 様に、これらの免疫グロブリンを精製するための従来法（例えばエタノール沈殿 法あるいはポリエチレングリコール沈殿法）によってもハイブリドーマ細胞培養 から回収される。精製した抗体を滅菌濾過し、任意の工程として、試験試料中の 単離ポリペプチドの診断的検定で使用するために酵素やスピンラベルなどの検出 可能なマーカーに結合させる。

本発明はマウスのモノクローナル抗体を用いる方法を包含するが、本発明はこれ に限定されるものではない。実際にヒトの抗体を使用することができ、またそれ が好ましいと判明することもあろう。このような抗体はヒトのハイブリ・ドーマ を用いることによって得ることができる（Ｃｏｔｅら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ”　（Ａｌａ ｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）、　７７頁（１９８５））。実際、本発明に従って、適当な 抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性（例えばヒトの 補体を活性化しＡＤＣＣを媒介する能力など）のヒト抗体分子由来の遺伝子と接 合することによるキメラ抗体を生産するために開発された技術（ｉｌｏｒｒｉｓ ｏｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８１　：６８５ １（１９８４）　；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、〜ａｔｕｒｅ　３１２：６０４（ １９８S）　：　Ｔａｋｅｄａら。

ｊｉａｔｕｒｅ　３１４：４５２（１９８５））を使用することができる。この ような抗体も本発明の範囲に包含される。

細胞融合技術に代わるもう１つの代替法として、ＥＢＶ〜不死化Ｂ細胞を用いて 本発明のモノクローナル抗体を生産する。組換えＤＮＡなど他のモノクローナル 抗体生産法も予期される。

（以下余白） 免疫毒素 本発明は、免疫毒素（抗体と細胞毒性部分の複合体）などの本発明の抗体の免疫 化学的誘導体にも関する。本抗体は、天然の補体過程を通して溶解を誘発し、正 常に存在する抗体依存性細胞障害細胞と相互作用させるためにも用いられる。

任意の工程として、精製し滅菌濾過した抗体をＡＩＤＳ治療で使用するためにリ シンなどの細胞毒素に結合させる。ＥＰＯ出願０２７９６８８（１９８８年８月 ２４日公開）はＨＩＶ惑染を治療するための免疫毒素の作成法とその使用法を例 示している。

ＨＩＶｅｎｖの領域を特異的に結合し得る本発明の免疫毒素は、既に感染し新し いウィルスを活発に生産している細胞を殺すために用いられる。細胞の死滅は、 感染細胞上に発現されたウィルス外殻タンパク質に対する免疫毒素の結合によっ て達成される。次いで免疫毒素が内在化され、その細胞を殺す。ウィルスゲノム をそのＤＮＡ中に組み込んでいるがウィルスタンパク質を合成していない感染細 胞（即ち、ウィルスが潜伏性である細胞）は、それらがウィルスを合成し始める までは、免疫毒素による死滅に対して感受性でないであろう。感染細胞に毒素を 送達するために、クリップ部位をまたぐ本発明の抗体および／または本明細書に 記述する他の抗体を単独で用いるか、あるいは組み合わせて用いることができる 。

さらに、毒素−抗体複合体は循環しているウィルスまたはウィルス外殻タンパク 質に結合することができ、それによってウィルスまたは外殻タンパク質を内在化 する細胞の死滅を達成するであろう。本発明は、本明細書に記述する抗体を用い る高度に選択的なＨＩＶ感染細胞破壊法を提供する。

本発明が特定の理論に束縛されることは望まないが、感染細胞表面上での標的抗 原の発現は一時的であると考えられる。抗体は抗原が存在する細胞表面上の部位 に到達し、これと相互作用することができなくてはならない。抗体が抗原と錯化 した後、エンドサイト−シスが起こって毒素をその細胞内に運搬する。

本発明の免疫毒素は、ＨＩＶウィルスに感染した単核細胞／マクロファージを殺 す際に特に有効である。Ｔ細胞からのウィルスの一時的生産とは対照的に、マク ロファージは高レベルのウィルスを長期間生産する。現在の療法はこれらの細胞 における新しいウィルスの生産の阻害には効果的でない。

単離ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体のすべてが高度に細胞障害性の 免疫毒素を作るわけてはないが、ある抗体の免疫毒素の一部として機能する能力 を予測するための検定は当該分野において日常的かつ一般に用いられている。

使用する抗体が数珠（あるいは全て）のＨＩＶと交差反応することが好ましい。

本免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬剤、あるいは細菌、カビ、植物または動 物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのような毒素の酵素的に活性な断片で あり得る。使用する酵素的に活性な毒素およびその断片はジフテリアＡ鎖、ジフ テリア毒素の非結合性活性断片、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエル ギノーゼ由来）、リンンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンへ＠、アルファーサルン ン、アレウリテス・ホルン（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｊｉ）タンパク質、 ジアンンン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（ｐｈ ｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＬ　ＰＡＰＩＬおよ びＰＡＰ−５）、モモルーディ力・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒ ａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サバオナリア・ オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害因子、 ゲロニン（ｇｅｔｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レスト リフトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃ ｉｎ）、二ノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコセセン１（ｔｒｉｃｏ ｔｈｅｃｅｎｅｓ）である。もう１つの態様として、抗体をシスプラチンまたは ５ＦＵなどの小分子抗癌薬に結合させる。モノクローナル抗体とこのような細胞 毒性部分の複合体は種々の二官能性タンパク質カップリング試薬を用いて作成さ れる。このような試薬の例は５ＰＤＰ、ＪＴ、ジメチルアジピミデートＭＣＩな どのイミドエステルの二官能性誘導体、スペリン酸ジスクシンイミジルなどの活 性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス−（ｐ−アジドベンゾ イル）へ本サンジアミンなどのビス−アジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウム ベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビス−ジアゾニウム誘導体、トリレン２ ．６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、１．５−ジフルオロ−２，４ −ジニトロベンゼンなどのビスー活性フッ素化合物である。毒素の溶解部分を抗 体のＦａｂ断片に結合することができる。

本明細書に議論するように免疫毒素を種々の方法で作成することができる。一般 的に知られている架橋試薬を用いて安定な複合体を得ることができる。

感染細胞表面に露出しているタンパク質のドメインを特異的に結合するモノクロ ーナル抗体を９／ンＡ＃１に結合させることが有利である。そのリジンＡ鎖を脱 グリコリル化し、組換え法で生産することが最も有利である。リジン免疫毒素を 作成する有利な方法はＶｉｔｅｔｔａら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１０９ｇ （１９８７）に記述されている。

診断的目的のために感染したヒト細胞をインビトロで殺すために用いる場合、典 型的には本複合体を細胞培養培地に少なくとも約１０ｎｊｌの濃度で添加するで あろう。インビトロ使用のための製剤および投与法は重要でない。通常は、培養 または潅流媒質と混和可能な水性製剤が用いられるであろう。細胞毒性は従来技 術によって読み取ることができる。

放射活性同位体（例：　Ｉ、ＹＳＰｒ）を抗体に結合させることによって感染細 胞を処理するための細胞毒性放射性医薬を作成することができる。α粒子放出同 位体の使用が有利である。本明細書で用いる場合、用語“細胞毒性部分”はこの ような同位体を包含するものとみなされる。

好ましい態様として、無関係なりリアランス機構（例えば肝臓）によるリジンＡ 鎖のクリアランスを減少させるために、リンンＡ鎖を脱グリコジル化するか、あ るいはオリゴ糖なしで生産する。もう１つの態様として、Ｂ鎖のガラクトース結 合性を遮断できる場合（“遮断リシン゛）には全リシン（Ａ鎖十Ｂ鎖）を抗体に 結合させる。

さらなる態様として、ＦａｂまたはＦ　（ａｂ’　）　２断片を用いて毒素−複 合体を作成する。それらの比較的小さいサイズゆえに、これらの断片は組織によ り良く浸透し、感染細胞に到達することができる。

もう１つの態様として、融合誘導性リポソームを細胞毒性薬剤で満たし、ＨＩＶ ｅｎｖを特異的に結合する抗体でそのリポソームを覆う。

抗体依存性細胞障害 本発明は、（ａ）単離ポリペプチドを指向する抗体であって、（ｂ）その抗体分 子が結合するＨＩＶウィルスに感染した細胞の溶解を媒介し得るサブクラスまた はイソタイプに属する抗体の使用に基づく方法をも包含する。より具体的には、 これらの抗体は、細胞表面タンパク質と錯化した時に、ナチュラルキラー細胞ま たはマクロファージなどのエフェクター細胞を活性化することによって抗体依存 性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介し、および／または、血清補体を活性化するサブ クラスまたはイソタイプに属するべきである。

また本発明は、ＡＩＤＳ治療のためのこれらの抗体のその天然型での使用にも関 する。例えば、ＨＩＶ関連細胞表面抗原を結合するＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３マ ウス抗体をＡＩＤＳ治療のためにインビトロで使用することができる。実際、Ｈ ＩＶｅｎｖは感染した単核細胞およびＴ−リンパ細胞上に存在するので、本明細 書に開示する抗体およびそれらの治療的使用は一般的な適用可能性を有する。

抗体の生物学的活性はその抗体分子のＦｃ領域によってがなりの程度決定される ことが知られている（ＵａｎａｎｕｅおよびＢｅｎａｃｅｒｒａｆ、ゴｅｘｔｂ ｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第２版、　ｆｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗ ｉｌｋｉｎｓ）、　２１８頁（１９８４））。これには白血球が達成すルノと同 様に抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力および補体を活性化する能 力が含まれる。異なるクラスおよびサブクラスの抗体はこの点で異なり、本発明 に従って望ましい生物学的活性を有するクラスの抗体を選択する。例えば、１ｇ Ｇ３およびＩｇＧ２ａクラスのマウス免疫グロブリンは同族体抗原を発現する標 的細胞に結合した際に血清補体を活性化する能力を有する。

一般的に、ＩｇＧ２ａおよび１ｇＧ３サブクラスの抗体ならびに場合によってＩ ｇＧ１の抗体はＡＤＣＣを媒介することができ、１ｇＧ３、ＩｇＧ２ａおよび１ ｇＭサブクラスの抗体は血清補体を結合し活性化する。補体活性化は一般に少な くとも２つのＩｇＧ分子が標的細胞上で密接に近接して結合することを必要とす る。しかし、ＩｇＭ分子は１つ結合するだけで血清補体を活性化する。

あらゆる特定の、抗体の補体活性化および／またはＡ　Ｄ　ＣＣによる標的細胞 の溶解を媒介する能力を検定することができる。興味のある細胞をインビトロで 生育させ、標識し、その細胞培養に、抗原抗体錯化によって活性され得る免疫細 胞または血清補体のいずれかと組み合わせて抗体を添加する。溶解した細胞から の標識の放出によって標的細胞の細胞溶解を検出する。実際、患者自身の血清を 補体および／または免疫細胞の供給源として用いることにより抗体をスクリーニ ングすることができる。次に、インビトロ試験で補体を活性化し得るかもしくは ＡＤＣＣを媒介し得る抗体を、その特定の患者中で治療的に用いることができる 。

その抗体が単離ポリペプチドエピトープを結合し、た２、補体を活性化し得るか もしくはＡＤＣＣを媒介し得るのであれば、基本的にあらゆる起源の抗体をこの 目的に使用することができる。モノクローナル抗体は継続的で豊富な供給という 利点を提供する。

抗体の治療的および他の使用 治療のためにインビボで使用する場合、本発明の抗体は治療的有効量（即ち、Ｔ 細胞数を修復する量）で患者に投与される。これらは通常は非経口的に投与され るであろう。投与量および投与法は感染の程度、特定の免疫毒素の特徴（使用す る場合）、例えば、治療的指標、患者、および患者の経縄などに依存するであろ う。脈管構造中の細胞を治療するためには静脈内に、また局所リンパ節を治療す るためには皮下および腹腔内に、本免疫毒素を１〜２週間にわたって継続的に投 与することが有利である。任意に、腫瘍壊死因子およびインターフェロンまたは 他の免疫変調剤の複合サイクルなどの補助的治療の過程中にこの投与を行う。

非経口投与のためには、医薬的に許容される非経口賦形剤と共に抗体を単位投与 注射可能剤形（溶液、懸濁液、乳液）で製剤化するであろう。このような賦形剤 は本質的に非毒性であり非治療的である。このような賦形剤の例は水、食塩水、 リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。不 揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤も使用することができる。

リポソームを担体として使用することができる。賦形剤は、等優性や化学的安定 性を増大させる物質などの少量の添加物（例えば、緩衝剤および保存剤）を含有 してもよい。典型的には、このような賦形剤中に約ｌｌｌ１ｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ ／ｍｌの濃度で抗体を製剤化する。

本抗原は標的細胞に高度に特異的であり、正常細胞にはめったに出現しないので 、ＩｇＭ抗体の使用は現在のところ好ましくない。ＩｇＧ分子はより小さいがゆ えに、ＩｇＭより感染細胞に局在化する能力が高いであろう。

生体内での補体活性化が、炎症性応答の誘発およびマクロファージの活性化を含 む種々の生物学的効果を導くという証拠がある（ＵａｎａｎｕｅおよびＢｅｎｅ ｃｅｒｒａｆ、ゴｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第２版、　 Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　ｆｉｌｋｉｎｓ）、　２１８頁（１９８４））。炎症に ■■ 血管拡張の増大は種々の抗ＡＩＤＳ剤の感染細胞中に局在化する能力を増大させ る。したがって、本発明によって特定される型の抗原−抗体の組合せは数多くの 方法で治療的に使用することができる。さらに、精製した抗原（Ｈａｋｏｔｎｏ ｒｉ、　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．２：Ｉ（＋３（１９８４） ）またはそのような抗原に関連する抗イデイオタイプ抗体（Ｎｅｐｏｍら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１：２８６４（１９８５）　＋ 　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、　ＰｒｏｃA　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　８１：２１６（１９８４））を、ヒト患者における活性な免疫応答を誘発 するために使用することができるであろう。このような応答には、ヒトの補体を 活性化し、ＡＤＣＣを媒介し得る抗体の形成が含まれ、そのような機構によって 感染細胞の破壊がもたらされる。

本発明の抗体は試験試料中のＨＩＶの診断にも有用である。これらをＨＩＶｅモ ノクローナル抗体と共に使用する。サンドイッチ検定法のいくつかの態様で使用 するために、池のモノクローナル抗体で用いられる従来の方法に従って、抗単離 ポリペプチド抗体を不溶化支持体に結合するか、もしくは検出可能な部分で標識 する。もう１つの態様として、それ自体は既に知られている方法を用いて朧離ポ リペプチドまたはＨＩ　Ｖ　ｅｎｖ結合を検出するために、抗単離ポリペプチド 抗体に結合し得る標識した抗体（例えば標識したヤギ抗ネズミＩｇＧ）を使用す る。

治療で使用する抗体組成物を製剤化し、その投与量を、治療すべき障害、個々の 患者の状態、該組成物の送達部位、投与法および開業医の知る他の因子を考慮の うえ、良い医療に合致する方法で確立する。本抗体組成物は、後述の投与用ポリ ペプチド調製の記述に従って投与のために調製される。

後述の実施例の理解を容易にするために、いくつかの頻繁に使用する方法および ／または用語について以下に説明する。

“プラスミド”は先行する小文字ｐおよび／またはそれに続く大文字および／ま たは数字によって指定される。不明細書における出発プラスミドは市販されてい るか、公的に無制限に利用できるか、もしくは利用可能なプラスミドから公表さ れた方法に従って構築することができる。さらＩこ、記載したプラスミドと等価 なプラスミドが当該技術分野で知られており、当業者には明らかであろう。

具体的には、これらのプラスミドが次の特徴のいくつかまたはすべてを有するこ とが好ましい。（１）最小数の宿主生物配列を保持すること；（２）望ましい宿 主中で安定であること：（３）望ましい宿主中で高コピー数で存在し得ること： （４）調節可能なプロモーターを保持する二と：および（５）新規ＤＮＡ配列が 挿入されるプラスミドの部分とは独立した部分に選択可能な特性をコード化する 少なくとも１つのＤＮＡ配列を有すること。利用可能な文献と不明細書の教示を 考慮すれば、当業者は上記の規準を満たすためのプラスミドの改変を容易に行う ことができる。上述の特性を有し、それゆえに本発明での使用に適したさらなる クローニングベクターが現在存在し得、あるいは発見されるであろうこと、なら びにこれらのベクターも本発明の範囲に包含されると見なされることは理解され るべきである。

ＤＮＡの“消化”とは、そのＤＮＡ中の特定の配列にしか作用しない制限酵素に よるそのＤＮＡの触媒的切断をいう。本明細書で使用される種々の制限酵素は市 販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は当業者が知７て いるであろう通りに使用した。分析的目的のためには、典型的には１μｇのプラ スミドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に約２０μｍの緩衝溶液中で使用 する。プラスミド構築用のＤＮＡ断片を単離する目的のためには、典型的にはよ り大きい体積中で５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素で消化する。

特定の制限酵素に適した緩衝液および基賞量はその製造者によって指定される。

通常３７℃で約１時間のインキュベーション時間が用いられるが、これは供給者 の指示に従って変化し得る。消化後、その反応液をポリアクリルアミドゲル上で 直接電気泳動することにより、目的の断片を単離する。

切断した断片のサイズ分離はＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、ら、　Ｎｕｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０）に記述されている８％ポリアクリ ルアミドゲルを用いて行う。

ＰＣＲ“（ポリメラーゼ連鎖反応）とはＤＮＡの断片を増幅する技術の一種であ る。増幅すべきＤＮＡ断片の３′および５′末端（センスまたはアンチセンス鏑 チェック）に対応するオリゴヌクレオチドブライマーを適当な条件下でハイブリ ッド形成させ、酵素Ｔａｑポリメラーゼまたはこれに等価な酵素を用いてプライ マー間に位置するＤＮＡのコピーを合成する。

”脱リン酸イじとは、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理すること による末端５′リン酸基の除去を意味する。この操作はｌＤＮＡ断片の２つの制 限切断末端が“環化”もしくは閉環を形成してその制限部位における別のＤＮＡ 断片の挿入を妨害するのを防止する。脱リン酸化の操作法および試薬顕は従来通 りである。Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ”、　１３３−１３４頁（１９８２）。ＢＡＰ調製物中に存在するすべてのエ キソヌクレアーゼの活性を抑制するために、ＢＡＰを用いる反応を５　Ｑｍｌｌ 　Ｔｒｉｓ中６８℃で行う。反応を１時間行う。反応後、ＤＮ、Ａ断片をゲル精 製する。

“オリゴヌクレオチド”とは、化学的に合成し得る一本鎖ポリゾオキシヌクレオ チドあるいは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。このような 合成オリゴヌクレオチドは５゛リン酸基を持たず、したがってキナーゼの存在下 でＡＴＰと共にリン酸塩を添加しないかぎり別のオリゴヌクレオチドに連結しな いであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片には連結す るであろう。

“連結゛とは、２つの二本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合が形成する過程 をいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、同上、１４６頁）、５特に述べない限り 、既知の緩衝液と条件を用いて、約等モル量の連結すべきＤＮＡ断片０．５μｇ あたり１０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（“リガーゼ”）で連結を行う。

゛充填“あるいは°平滑化′とは、制限酵素で切断した核酸の付着末端中の一本 鎖末端を二本鎖に変換する操作をいう。これにより付着末端が除去され、平滑末 端が形成される。この方法は、１または数種の他の制限酵素でしか生成しない末 端と付着し得る制限切断末端を、あらゆる平滑切断制限エンドヌクレアーゼまた は他の充填した付着末端と適合する末端に変換するための汎用性のある手段であ る。

典型的な場合、１０ｍｍ　Ｍｇ　ＣＩ　２．１ｍｊｌジチオスレイトール、５０ ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐＨ７，５）緩衝液中の標的ＤＮＡ２ 〜１５μｇを約３７℃でＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片８単位および各２ ５０μ夏の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下でインキュベートする ことにより平滑化を行う。

一般的には３０分後にこのインキュベーションを停止し、フェノールおよびクロ ロホルム抽出し、エタノール沈殿する。

本発明の教示を特定の課題または状況に適用することは本明細書に含まれる教示 を考慮すれば当業者の能力の範囲内であることは理解される。本発明の生産物の 例およびそれらの代表的単離方法、使用方法および製造方法を以下に記述するが 、これらが本発明を限定するものであると解釈してはならない。

実施例 筆者らは哺乳類細胞系で２つの異なるｒｇｐ１２０融合タンパク質を大量に生産 することが可能であった（Ｌａｓｋｙら、　１９８６）。これによって、ＣＨ○ 細胞中で生産されたＨＩＶ−１のｍｅ単離物由来のｒｇｐ１２０中の９個のジス ルフィド結合のすべて、使用されるグリコジル化部位の位置、および各部位に存 在するオリゴ糖部分の型を解明することが可能であった。

本実施例では、チャイニーズハムスター卵巣細胞中での発現によって生産される ヒト免疫不全ウィルス１′！Ａの組換えエンベロープ糖タンパク賀（ｒｇｐ１２ ０）の構造上の特徴づけについて記述する。ｒｇｐ　１２０の酵素的切断および 逆相高性能液体クロマトグラフィーを用いて、このタンパク質の一次構造を確認 し、鎖内ジスルフィド結合を同定し、Ｎ−グリコノル化のための潜在的部位を特 徴づけた。

同定されたトリプシンペプチドはすべてｃＤＮＡ配列から予期される一次構造と 合致した。トリプンンマッピング研究を単離したペプチドのＳ、　ａｕｒｅｕｓ 　Ｖ　８プロテアーゼ処理またはペプチド：Ｎ−グリコンダーゼＦ（ＰＮＧａｓ ｅ　Ｆ）処理ならびにそれに続くエンドブロティナーゼＡｓｐ−Ｎ処理と組み合 わせることによって、ｒｇｐ１２０の９個の鎖内ジスルフィド結合のＴべてを同 定することができた。結合している炭水化物構造のＰＮＧａｓｅＦに対する感受 性およびエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨに対する感受性を決定 することによって、２４＠の潜在的Ｎ−グリコリル化部位を特徴づけた。酵素的 に脱グリコリル化したｒｇｐ１２０のトリプ／ンマンピングを個々の処理ペプチ ドのエドマン分解および高速原子衝突質量分析と組み合わせて用いることにより 、これらの部位のうちどれがグリコジル化されているかを決定し、どの型の構造 が存在するかを決定した。これらの結果はｇｐ１２０の２４部位のすべてが使用 されており、そのうち１３部位は複合型オリゴ糖を主要構造として含有し、１１ 部位は主として高マンノース型および／またはハイブリッド型オリゴ糖構造を含 有することを示す。

便宜のために、完全な参考文献目録を本実施例の末尾に記載する。

寒憇迭 本実施例を通して使用する略号について説明する。ＡＡＡ、アミノ酸分析：ＡＩ ＤＳ、後天性免疫不全症候群：　ａｍｕ、原子質量単位；ＣＨＯ，チャイニーズ ハムスター卵巣；ＤＴＴ、ンチオスレイトール、ニンドＨ，エンド−β−Ｎ−ア セチルグルコサミニダーゼＨ，ＦＡＢ−ＭＳ、高速原子衝突質量分析；ｇＤｌ、 単純ヘルペス１型糖タンパク質Ｄ：ｇｐ、糖タンパク質；　ＨＩ　Ｖ、ヒト免疫 不全ウィルス：ＨＰＬＣ，高性能液体クロマトグラフィー＋ＩＡＡ、　ヨード酢 酸：ＰＮＧａｓｅ　Ｆ、ペプチド：Ｎ−グルコシダーゼＦ　、　ＰＴＨ，フェニ ルチオヒダントイン；尺ＣＭ、被還元被Ｓ−カルボキンメチル化；ｒｇｐ、組換 え糖タンパク質：ＳＩＶ、シミアン免疫不全ウィルス；ＴＦＡ、トリフルオロ酢 酸、ＴＰＣＫ、Ｌ−１−ρ−トシルアミドー２−フェニルエチルクロロメチルケ トン。

被照−過去に記述されたようにして、組換えｇｐ１２０タンパク質をＣＨＯ細胞 中で生産し、免疫アフィニティータロマドグラフィーで精製した（Ｌａｓｋｙら 、　１９８６）。

ＤＴＴ、ＩＡＡ、および２−アセタミド−１−β−（Ｌ−アスパルタミド）−１ ，２−ジデオキシ−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮ、Ａｃ−Ａｓｎ）はシグマ・ケミ カル・カンパニーがら入手した。逆相ＨＰＬＣにはＨＰＬＣ／スペクトロ・グレ ード・トリフルオロ酢酸（ピアス）、アセトニトリルＵＶ（アメリカンＢアンド Ｊ）およびミリＱｔＭ水（ミリポア）を使用した。使用した酵素はウォルンント ン・バイオメディカル・コーホレイテッド（ｆｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　）から入手したＴＰＣＫトリプシン、ベーリンガー ・マンハイム・ＧｍｂＨから入手したエンドブロティナーゼＡｓｐ−Ｎ（“シー クエンンング・グレード”）、ＩＣＮイムノバイオロジカルス（ＩＣＮ　Ｉｍｍ ｕｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）から入手したＳ　、　ａｕｒｅｕｓ　Ｖ　８プ ロテアーゼ、およびジェンザイムから入手したエンドＨおよびＰＮＧａｓｅ　Ｆ （Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ＧｌｙｃａｎａｓｅＴ″″））である。

還元およびＳ−カルボキンメチル化−組換えｇｐ１２０（ＣＬ４４　［配列番号 １２］　２．０ｍｇ）を、８Ｍ尿素および３ａＭ　ＥＤＴＡを含有する０、３５ ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，６）に対して透析した。ＤＴＴを１０℃濃度で加え 、その試料を周囲温度で４時間インキュベートした。次いで、この試料を遮光下 周囲温度で２５ｍＭＩＡＡで３０分間処理した。この反応を過剰量のＤＴＴでク エンチし、その試料を０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに対して透析し、次いで凍結 乾燥した。

ＲＣＭ　ｒｇｌ）１２０のＰＮＧａｓｅ　Ｆによる処理−１０ｗｎ　ＥＤＴＡお よび０．０２％ＮａＮ３を含有する０、　２５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，６ ）Ｏ，１ｆｆｉｌ中にＲＣＭ　ｒ　ｐ　ｇ　１２０（０，５ｍｇ）を濃度が５ｍ ｇ／ｍｌになるように再構成した。０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３を含有する０、０ ５１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）中にトリプシンペプチドを同じモル濃度 で再構成した。この試料にＰＮＧａｓｅＦをタンパク質ｌａ＋ｇあたり１２，５ 単位の比率で加え、その試料を３７℃で終夜インキュベートした。ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理したＲＣＭ　ｒｇｐ１２０を０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに対して透析 した。

ＲＣＭｒｇｌ）１２０のエンドＨによる処理−０，０２％ＮａＮ＝を含有する０ ６０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）Ｏ，１ｍｌ中にＲＣＭ　ｒ　ｇ　ｐ　 １２０（０，５ｍｇ）を再構成した。この試料にエンドＨ（２単位／社）をタン パク質ｌｌｌ１ｇあたり０．１単位の比率で加え、その試料を３７℃で終夜イン キュベートした。エンドＨで処理したＲＣＭ　ｒｇｐ１２０を０．１ｍ１重炭酸 アンモニウムに対して透析した。

ＴＰＣＫ−１−リプンンによる処理−インキュベーション０時間および６時間に 酵素を添加（基質に対する酵素の比率は１　：　１００ｔ／Ｗ）することにより 、０，１Ｍ重炭酸アンモニウム中の非処理のＲＣＭ　ｒｇｐ１２０ＳＰＮＧａｓ ｅ　Ｆ処理およびエンドＨ処理したＲＣＭ　ｒｇｐ１２０（それぞれＣＬ４４　 ｒ配列番号１２３０゜５　ｍｇ）を周囲温度でＴＰＣＫ−トリプシンで処理した 。２４時間後に試料を凍結することによってこの消化反応を停止させた。ジスル フィド決定のために、ｒｇｐ１２０の試料（９ＡＡ　［配列番号１１１０．５１ ｇ）を同じ条件を用いてＴＰＣＫ−トリプシンで処理した。

トリプシンペプチドのＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理とそれに続くエンドプロテイナーゼ ＡＳｐ−Ｎ処理−９ＡＡトリプシン消化の逆相ＨＰＬＣで精製したペプチド（０ ，５ｎｍ。

１から３．７ｎｍｏＬの範囲）を０．０２％ＮａＮ、を含有する０、　０５Ｍリ ン酸ナトリウム（ｐＨ７，０Ｘ０．０５ｍ１）中に再構成した。ＰＮＧａｓｅ　 Ｆ（０，０２％ＮａＮ３を含有する０、０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０） ０．０６ｍ１中５単位）を加え、その試料を３７℃で２０時間インキュベートし た。次にエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（２μｇ）を加え、その試料を３７℃ で２０時間インキュベートした。

トリプシンペプチドのＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼによる処理−９ＡＡ トリブ／ン消化の逆相ＨＰＬＣで精製したペプチド（３，Ｏｒ＋ａ＋ｏｌ）を０ ．０２％ＮａＮ３を含有する０　０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０Ｍ０．０ ４ｍ１）中に再構成した。

Ｖ８プロテアーゼ（５μｇ）を０時間および７時間に加え、試料を３７℃で２４ 時間インキュベートした。

５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，０ＸＯ，１ｍ１）中に再構成した。エンドＨ（ ０，０２％ＮａＮ３を含有する０、０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ６，０）０ ．０２５ｍｌ中０゜０５単位）を加え、その試料を３７℃で２０時間インキュベ ートした。次に、０゜０２３１　ＥＤＴＡおよび０．０２％ＮａＮ、を含有する ０、　５１１　’）　：／Ｍ＋　ト！Ｊ　’７ム（ｐＨ１０，３Ｘ０．１２５ｍ １）およびＰＮＧａｓｅ　Ｆ（６，２５単位）を加え、その試料を３７℃で２０ 時間インキュベートした。

逆相ＨＰＬＣ−トリプシン消化物を５ミクロン・ブイダック・Ｃ１８・エンドキ ＋ップト・カラム（Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８ｅｎｄｃａｐｐｅｄ　ｃｏｌｕｍｎ）（ ４，６ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）による逆相ＨＰＬＣで分画した。０．１％ＴＦＡ 水溶液で平衡化した後、０．０８％ＴＦＡを含有する０から４５％までのアセト ニトリルの９０分間の直線的勾配を用いて毎分１ｍｌでトリプシンペプチドの溶 出を行った。使用した系は６０００Ａポンプ２台、７２０コントローラー、ＷＩ ＳＰ７１０Ｂインジェクター、および２１４止にセットしたパーキン−エルマー ＬＣ７５単波長ＵＶ検出器から構成されるウォーターズ勾配液体クロマトグラフ である。

さらなる操作にかけるペプチドを、流速毎分Ｑ、２ｍｌおよび温度４０℃の０． １％ＴＦ　Ａ水溶液で平衡化したブイダック・Ｃ１８・カラム（２，１１ＩＩＸ ２５０１１１ｍ）を用いて分画した。これらのペプチドを０から６０％のアセト ニトリル（０，０８％ＴＦＡを含有する）の６０分間の直線的勾配で溶出させた 。使用した系はヒユーレット−バラカード１０９０Ｍ液体クロマトグラフである 。

ペプチドの同定−逆相ＨＰＬＣから集めたペプチドをＡＡＡおよび／またはＮ末 端配列分析によって同定した。Ａ　ＡＡ用の試料を真空下１１０℃で、グリコジ ル化の程度に応じて２４時間もしくは７２時間定沸点ＭＣＩで処理した。加水分 解を延長することによって、ＩｌｅおよびＬｅｕの定量を妨害し得るグルコサミ ンが分解される。分析はニンヒドリン検出を用いてベックマン・モデル６３００ アミノ酸分析機で行った。

Ｎ末端配列分析はアプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａ／１２ＯＡで 行った。ＧｌｃＮＡｃ−ＡｓｎのＰＴＨ誘導体をＤＴＴから分離するために、Ｐ ＴＨ分析系の平衡緩衝液中のアセトニトリル濃度を１０％から９％に減少させた 。

ＦＡＢ−ＭＳ−−ＪＥＯＬ　ＨＸ１１０ＨＦ／ＨＸ１１０ＨＦ９　ンデムｉｄＬ 分析計を通常の２セクターモードで操作してＦＡＢ質量スペクトルを得た。Ｆ　 Ａ　Ｂ　−ＭＳを６ｋｅＶ＃−ｉｒノン原子（１０ｍＡ放出電流）で行った。３ ８０〜４０００　ａｍｕの質量範囲にわたるデータが得られた。

結果 Ｌａ５ｋｙう（１９８６）は、単純ヘルペスｇＤ１のシグナルペプチドを用いて ＣＨＯ細胞中でｇｐ１２０を融合タンパク質として発現させた。このような２種 の融合タンパク質を本研究で使用した。大研究の大半で使用した組換え糖タンパ ク質（ＣＬ４４［配列番号１２コ）を、ｇｐ１２０の残基３１〜５０１に融合し たｇＤｌの最初の２７残基を含有する４９８アミノ酸融合タンパク質として発現 させた（Ｌａｓｋｙら、　１９８６）。この構築物には成熟ｇｐ１２０の最初の システィン残基がない。

ジスルフィドの同定は、ｇｐ１２０の残基４〜５０１に融合したｇＤｌの最初の ９残基を含有するもう１つの組換え融合タンパク質（９ＡＡ［配列番号１１］） で行った。これには最初のシスティン残基Ｃｙｓ２４が復活している。カルボキ シペプチダーゼ消化を用いるＣＬ４４　［配列番号１２コのカルボキシ末端分析 によって、グルタミン酸残基４７９がＣＨＯ細胞によって分泌される完全にプロ セシングされた分子のカルボキシ末端であることが示された（非開示データ）。

これら２種類の構築物のアミノ酸配列を図１に示す。

ＲＣ〜１ｃＬ４１リブノンマツプ−逆相ＨＰＬＣトリプシンマツピングを用いて 、該分子の一次構造を確認し、鎖内ジスルフィド結合を同定し、Ｎ−グリコジル 化のための潜在的部位を特徴づけた。ジスルフィドに関する情報を得ることを意 図しない実験では、トリプシンによる消化の前にタンパク質をＲＣＭとした。

この処理はタンパク質を展開させ、ジスルフィド結合を破壊し、それによって天 然型分子から得られるであろうものよりも小さいトリプシン断片をもたらす。

ＲＣＭ　ＣＬ４４の逆相ＨＰＬＣｌ−リブンンマップを図２に示す。Ｔ　Ｆ　、 Ａ、をイオン修飾剤とするアセトニトリル／水系を用いて、トリプシンペプチド を逆相ＨＰＬＣで分離した。後述するように、ピークの不均一性のほとんどは該 分子の極度に高い（全質量の約５０％）炭水化物含量に由来する。ピークを集め 、同定のためにＡＡ　Ａにかけた（表Ｉ）。いくつかの場合には、確認のために Ｎ末端配列分析を用いた（これらのピークを表１に示す）。図２において符号を 付いていないピークは同定しなかった。

（以下余白） 同定したペプチドはすべてｃＤＮＡ配列から予測される一次構造と一致した。

３以上のアミノ酸を伴う３８種の予測されるペプチドのうち、３６種をＲＣＭＣ Ｌ４４のトリプシンマツプ中で同定した。さらに、それぞれ２アミノ酸から構成 される４種の予測されるペプチドも同定した（Ｈ３、Ｈ４、Ｔ２３、およびＴ３ ５）。残基１３９〜１４１から構成されるトリペプチド（ＶＱＫ）はこのマツプ 中では同定されず、図２では符号を付さなかった。他のペプチドで唯一同定され なかったものはＴ１３（ＣＮＮＫ）である。ペプチドＴ１３のアスパラギン残基 ２００は潜在的グリコリル化部位であり、このペプチドには疎水性アミノ酸がな い。

したがって、この糖ペプチドは極度に親水性であり、逆相カラム上で塩両分から 十分に分離しないと思われる。

ペプチドＴ５とＴ６の間ならびにペプチドＴ８とＴ９の間ではトリプン切断が起 こらなかった。図２ではこれらを、コンマで分けた２つの丁番号として指定する （Ｔ５．６およびＴ８．９）。切断を受けなかったことはこれらのペプチドのＮ 末端分析によって確認した。これらはどちらの場合も切断部位のＣ末端側のアス パラギン残基が潜在的Ｎグリコジル化部位であり、炭水化物部分がトリプシンの 作用を妨害すると思われる。ペプチドＨ４と７２’の間ならびにペプチドＴ２３ とＴ２４の間にも不完全なトリプシン切断が認められた（Ｈ４，Ｔ２°およびＴ ２３、２４）。

非トリプシン切断から生じた数種のペプチドがＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマ ツプ中に観測された。予期されるトリプンンベブチドうち２種類が“キモトリプ シン様″切断によってさらに切断された。ペプチドＴＩ２はチロシン残基１８７ およびフェニルアラニン残基１９３の後ろで完全に切断されてＴ１２ａＳＴ１２ ｂ、およびＴ１２ｃを与えた。ペプチドＴ４はロインン残基９５の後ろで部分的 に加水分解されてＴ４ａおよびＴ４ｂを与えた。無傷のペプチドＴ４も存在した 。

トリプシンペプチドの１種Ｔ２２（ＱＡＨＣＮＩＳＲ）［配列番号１４］はＲＣ ＭＣＬ４４トリプンンマソブ中で２つの異なる位置（３２，４分および３４．１ 分）に溶出した。Ｐ　Ｎ　Ｇ　ａｓｅおよびエンドＨによる脱グリコジル化研究 （後述）はペプチドＴ２２の２つの形態の異なる保持時間が炭水化物の相違によ るものでないことを示した。この保持時間の不均一性はＮ末端グルタミン残基の ピログルタミン酸への部分的変換に起因するものと考えられる（Ｓａｎｇｅｒお よびＴｈｏａ＋ｐｓｏｎ、　１９５３）。

ｐ１２０中のジスルフィドの同定−成熟ｇｐ１２０は１８個のシスティン残基（ 図１中で四角く囲んだ残基）を含有し、それゆえに９個の鎖内ジスルフィド結合 を含有し得た。ＣＬ４４　［配列番号１２］構築物にはｇｐ１２０の最初のシス ティン残基であるＣｙｓ−２４が存在しない（Ｌａｓｋｙら、　１９８６）。そ こで、最初のシスティン残基が復活している異なる構築物（９ＡＡ［配列番号１ １］）を発現させ、ＣＬ４４とほぼ同程度に精製した（Ｌ、　Ｒｉｄｄｌｅ、　 Ｔ、　Ｇｒｅｇｏｒｙおよびり、　Ｄｏｖｂｅｎｋｏ、非公表データ）。エルマ ン試薬（Ｅｌｌｍａｎ、　１９５９）を用いて遊離のスルフヒドリル基が９ＡＡ 〔配列番号１１〕中に存在しないことを立証した（非開示データ）。したがって 、９Ａ、Ａ構築物についてジスルフィドの同定を決定した。

システィン残基をＳ−カルボキシメチル化しないで行ったトリプンマツピングの 研究によりジスルフィドの部分的同定が可能になった。９ＡＡのトリプシンマツ プを図３に示す。Ｎ末端配列分析によってビークを同定した（表ＩＩ）。これら の同定により、９個のジスルフィド結合のうち次の３個の明確な同定が可能にな った：Ｃｙｓ−１０１とＣｙｓ−１２７の間（ビークＡ１表１１）、Ｃｙｓ−２ ６６とＣｙｓ−３０１の間（ビークＢ、表ＩＩ）、およびＣｙｓ２４とＣｙｓ４ ４の間（ビーク２１表ＩＩ）。

残りのシスティン残基を含有するペプチドも同定した（表ＩＩ）。ペプチドＴ２ ８は３個のシスティン残基を含有し、１個の７ステイン残基を含有するペプチド Ｔ３１と同時に溶出する（ビー２０１表ＩＩ）。ペプチドＴｌｌは２個の７ステ イン残基を含有し、それぞれ１個のシスティン残基を含有するペプチドＴ３およ びＴ４と同時に溶出する（ピークＦ１表ＩＩ）。さらに、ペプチドＴ１４は２個 のシスティン残基を含有し、それぞれ１個のシスティン残基を含有するペプチド Ｔ１２およびＴ１３と同時に溶出する（ビークＣおよびＥ、表ＩＩ）。これらの 各場合では、１より多いジスルフィド結合がそのトリプシンペプチド群中に存在 し、それによって明確な同定が妨げられた。後述のようにこれらのトリプシンペ プチドをさらに操作することにより、単一のペプチド上に位置するシスティン残 基の間に選択的な切断を導入した。

（以下余白） 表ｕ　トリプノンマノプ９．Ａ、八で得たンステイン含宵ペプチドの同定号を付 し、ペプチドに：；図１で用いた命名法に対応下る丁番号を付す。

これらのペプチドはそれぞれシスティン残基の間に位置する潜在的Ｎ結合型グリ コリル化部位を有する。アスパラギンに結合した炭水化物を除去すると共にその 結合アスパラギン残基をアスパラギン酸に変換するＰＮＧａｓｅＦでこれらのペ プチドを処理した（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら、　１９８３）。得られるアスパラギ ン酸残基はエンドプロテイナーゼＡ　ｓｐ−Ｎによるそれらのペプチドの選択的 切断点として機能する（Ｄｒａｐｅａｕ、　１９８０）。これらのペプチドを逆 相ＨＰＬＣで分離し、Ｎ末端配列分析によって同定した。

ペプチドＴＩ２、Ｔ１３、およびＴ１４（ビークＣ１図３）のｐＮＧａｓｅＦ処 理とそれに続くエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ処理後に得られたＨＰＬＣクロ マトグラムを図４ａに示し、関連するペプチドの配列を表ＩＩＩに示す。これら の結果はｒｇｐ１２０がＣｙｓ−１９８とＣｙｓ−２０９の間およびＣｙｓ−１ ８８とＣｙｓ−２１７の間にジスルフィド結合を有することを示している（表Ｉ ＩＩ）。ペプチドＴ３、Ｔ４、およびＴ１１（ビークＦ、図３）のＰＮＧａｓｅ Ｆ処理とそれに続くエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ処理によって、Ｃｙｓ−８ ９とＣｙｓ−１７５の間およびＣｙｓ−９６とＣｙｓ−１６６の間にジスルフィ ド結合が存在することを立証する断片の回収が可能になった（図４ｂおよび表Ｉ ＩＩ）。

（以下余白） 表エエエ　図４で単離したペプチドのジスルフィドの同定表ＩＩで明確に同定で きなかったトリプシンペプチドを図４に記述したようにさらに操作した。ピーク をＮ−末端配列分析によって同定した。

ペプチド７２８およびＴ３１（ピー２０．．図３）を■８プロテアーゼで処理す ることによってＴ２８のンスティン残基間に位置するグルタミン酸残基およびア スパラギン酸残基のカルボキシ側を切断することにより（Ｄｒａｐｅａｕら、　 １９７２）、最後の２ｍのジスルフィド結合を同定した。Ｔ２８およびＴ３１の Ｖ８プロテアーゼ消化後に得られたクロマトグラムを図４０に示し、関連するペ プチドの配列を表ＩＩ工に示す。これらの結果はＣｙｓ−３４８とＣｙｓ−４１ ５の間およびＣｙｓ−３５５とＣｙｓ−３８８の間にジスルフィド結合が存在す ることを立証した。

このようにトリプンマツピング分析の結果とさらなる選択的分解の結果を組み合 わせることによって、ｒｇｐ１２０の９個の鎖内ジスルフィド結合すべてを同定 することが可能になった。ＣＩ、４４　Ｅ配列番号１２〕に関して平行して行っ た実験はこの構築物中の残っている８個のジスルフィド結合について同様の結果 を与えた（非開示データ）。ｒｇｐ１２０のジスルフィド結合の同定を図６に要 約する。

ｇｐ１２０のグリコジル化部位−成熟ｇｐ１２０は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−３ｅ ｒ（Ｔｈｒ）によって認識される（ＫｏｒｎｆｅｌｄおよびＫｏｒｎｆｅｌｄ、 　１９８５）　２４個の潜在的Ｎ−グリコジル化部位を含有する。図Ｉ八では、 これらの部位を対応するアスパラギン残基の上の点で示す。本研究では、酵素的 に脱グリコジル化したＣＬ４４　［配列番号１２］のトリプシンマツピングを個 々の処理ペプチドのエドマン分解およびＦＡＢ−ＭＳと組み合わせて用いること によって、２４個の潜在的Ｎ−グリコジル化部位のうちどれがグリコジル化され ているか、ならびにどれが不完全にプロセシングされた（即ち、高マンノース型 またはハイブリッド型）オリゴ糖であるかを決定した。

脱グリコリル化に使用した２種の酵素はＰＮＧａｓｅＦおよびエンドＨである。

ＰＮＧａｓｅＦはβ−アスパルチルグルコシルアミン結合を切断することによっ てすべての型のＮ−結合型オリゴ糖構造を放出させる（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら、 　１９８５）。エンドＨは２つの核Ｎ−アセチルグルコサミン残基の間を切断す ることによって高マンノース型およびハイブリッド型オリゴ糖構造のみを放出さ せる（Ｔａｉら、　１９７７）。ペプチドの脱グリコ／ル化は、逆相溶出特性図 中のその糖ペプチドに対応するピークの保持時間の増大によって監視することが できる。したがって、ＰＮＧａｓｅ　Ｆでの処理によってどのペプチドが脱グリ コジル化されたかを決定することができ、エンドＨに対する感受性に基づいて、 主要構造として高マンノース型および／またはハイブリッド型オリゴ糖が結合し ているペプチドを識別することができた。

ＣＬ４４　［配列番号１２〕の２４個の潜在的グリコジル化部位は１４種のトリ プシン糖ペプチド中に含有される。これらの糖ペプチドのうち１３種をＲＣＭＣ Ｌ４４のトリプシンマツプ中で同定した（図２）。上述のように、Ｔ１３（ＣＮ ＮＫ）［配列番号１５コは同定されなかった。図５に、ＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理し たＲＣＭＣＬ４４およびエンドＨ処理したＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマツプ をＲＣＭ　ＣＬ４４　トリプシンマツプと比較する。これら３つのトリプシンマ ツプのそれぞれでは糖ペプチドに対応するピークを分層しである。

高度にグリコジル化された分子に関して予期し得るように、ＲＣＭ　ＣＬ４４の ＰＮＧａｓｅＦによる処理（図５ｂ）はトリプシンマツプをかなり簡素化した。

典型的な場合、ＲＣＭ　ＣＬ４４　トリプシンマツプ（図５ａ＞中の潜在的糖ペ プチドに対応するピークは幅広く、しばしば多重線として現れた。脱グリコジル 化は各ペプチドについて鋭い単一ピークをもたらし、このことは糖ペプチドピー クの多重性および幅の広さが炭水化物の不均一性によるものであることを示した 。

ＲＣＭＣＬ４４のトリプシンマツプ中で同定された１３個の潜在的糖ペプチドの すべてが、ＰＮＧａｓｅＦ処理した試料のトリプシンマツプでは保持時間が長い 方に移動した。このことは２４個の潜在的部位のうち少なくとも１３個はグリコ ジル化されていることを明らかにしている。ペプチドＴ２８は脱グリコジル化後 に回収されなかった。このペプチドは多数の非極性アミノ酸を含有しており、親 水性炭水化物部分の除去後はＨＰＬＣカラムに不可逆的に結合し得る。上述のよ うに、ペプチドＴ２２はＲＣＭＣＬ４４トリプシンマツプでは、おそらくＮ末端 のグルタミンのピログルタミン酸への変換の結果として、２カ所に溶出する。

Ｔ２２ピークの両方の保持時間はＰＮＧａｓｅ　ＦおよびエンドＨによる処理に よって生成した脱グリコリル化試料中で変化せず、このことはＲＣＭ　ＣＬ４４ 　トリプシンマツプ中のペプチドＴ２２のこれらの形態間の相違が炭水化物の不 均一性によるものではないことを確認している。

エンドＨ処理したＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマツプ（図５ｃ）は１３種のト リプシン糖ペプチドのうち６種がエンドＨｇ受性（ペプチドＴ１４、Ｔ１６、Ｔ ２２、Ｔ２４、Ｔ２８、およびＴ３１）であることを示した。さらに、ペプチド Ｔ１５の少量がエンドＨ感受性を示した。これらの糖ペプチドのそれぞれについ て、エンドＨ処理塘ペプチドの溶出時間は対応するＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理糖ペプ チドの溶出時間より早かった。これはエンドＨ処理後にアスパラギン残基に結合 して残っている親水性Ｎ−アセチルグルコサミン残基によるものである。ペプチ ドＴ１６はエンドＨ処理したＲＣＭＣＬ４４のトリプシンマツプ中では同定され なかった。このペプチドは３個の潜在的グリコジル化部位を含有しており、どの ような状況下でも十分には回収されなかった。

ＰＮＧａｓｅＦおよびエンドＨに対する感受性に基づく各トリプシン糖ペプチド 上に存在するグリコジル化の型に関する結論を表■ｖに要約する。ＲＣＭ　ＣＬ ４４のトリプシンマツプ中で同定された１３種の塘ペプチドのうち７種はグリコ ジル化部位を１つだけ含有し、それゆえに酵素感受性に関して明確に特徴づける ことができた。ペプチドＴ２’（、Ａｓｎ−５８）、Ｔ２６（Ａｓｎ−３２６） 、およびＴ３２（Ａｓｎ−４３３）はＰＮＧａｓｅ　Ｆによってのみ脱グリコジ ル化され、したがって、結合した複合型オリゴ糖構造を含有している。ペプチド Ｔ２２（Ａｓｎ−３０２）、Ｔ２４（Ａｓｎ−３０９）、およびＴ３１（Ａｓｎ −４１８）はＰＮＧａｓｅＦおよびエンドＨの両方に対して感受性であり、した がって、高マンノース型および／またはハイブリッド型オリゴ糖構造を保持して いる。ペプチドＴ１５はエンドＨに対して部分的にのみ感受性であり、したがっ て、Ａｓｎ−２４６は主として複合型オリゴ糖を保持するが、結合した高マンノ ース型および／またはハイブリッド型オリゴ糖構造をもいくらか有する。

表ＩＶ　ＰＮＧａｓｅＦおよびエンドＨに対する感受性に基づくＲＣＭＣＬ４４ トリプシンペプチドのグリコジル化型の同定ＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマツ プにおけるペプチドの保持時間の増大によってＰＮＧａｓｅ　ＦまたはエンドＨ に対する感受性を決定した。ＰＮＧａｓｅＦはすべての型のＮ−結合型オリゴ糖 構造を放出させるが、エンドＨは高マンノースおよびハイブリッドオリゴ糖構造 だけを放出させる。

トリプシン　グリコジル化部位　ＰＮＧａｓｅ　Ｆに　工／ドＨに対　グリコノ ルイエＴ６　１０６．１１１　有　緘　複合１７９　１２６．１３０　有　無　 複合１Ｔｌｌ　１５６．１６７　有　熾　複合１Ｔ１４　２０４．２１１．２３ ２　有　育　高マン／−ス、ハイブリッド、および／または複合ゞ 丁１５　２４６　有　微量　複合（微量の高マンノースおよび／またはハイブリ ッド） Ｔ１６　２５９．２６５．２７１　有　有　高マンノース、ノーイブリッド、お よび／または複合ゞ Ｔ２２　３０２　有　育　高７７／−スおよび／またはハイブリッド 丁２４　３０９　！　Ｗ　高７７／−スおよび／またはハイブリッド Ｔ２６　３２６　有　集　複合 Ｔ２８　３５６．３６２．　ｉｆ　＊　高？　ン／　−ス、／％イブ’Ｊ　−／ 　Ｆ、３６７．３７６　および／または複合゛Ｔ３１　４１８　有　育　高マン ノースおよび／またはハイブリッド ゝ一方または両方の部位がグリコジル化されている。

゛１以上の部位に工／ドＨ感受性グリコ／ル化ペプチドＴ６、Ｔ９、およびＴｌ ｌはそれぞれ２個の潜在的グリコジル化部位を含有する。各ペプチドはＰＮＧａ ｓｅ　Ｆによって脱グリコリル化されたが、エンドＨによっては脱グリコジル化 されず、このことはほとんど複合型のオリゴ糖構造が存在することを示す。実際 にグリコジル化されているのが各ペプチド中の潜在的グリコジル化部位の１つで あるか、両方であるかを決定するために、ＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理した糖ペプチド をＦＡＢ−ＭＳかエドマン分解のどちらかにかけた。

ＰＮＧａｓｅＦによる処理は脱グリコジル化の間＋：１ｓ合アスパラギン残基を アスパラギン酸に変換する（Ｔａｒｅｎｔｊｎｏら、　１９８５＞。この変換は 脱グリコリル化された各部位について１ｃｍｕのペプチド質量の増大としてＦＡ Ｂ−ＭＳで検出することができ（ＣａｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ、　１９８６） 、あるいは適当なサイクルにおけるアスパラギン酸のＰＴＨ誘導体の出現によっ てエドマン分解で検出することができる。脱グリコジル化されたペプチドＴ５． ６のＦＡＢ−ＭＳは、このペプチドの質量＋２ａｍｕ（［ＭＨ］−観測値＋１１ ／２１７７２．６　；計算値：ｒｓ／ｚ　１７７２．７）に対応するイオンを明 らかにした。脱グリコジル化されたペプチドＴ９のＦＡＢ−ＭＳは同様の結果Ｃ ＥＭＨＥ−観測値：ｒａ／ｚ　１３０１．８　：計算値：ｍ／ｚ　１３０１．、 ｌ））を与えた。脱グリコジル化されたペプチドＴｌｌは高分子量（＞　２００ ０　ａｍｕ）であるので、このペプチドについてはＦＡＢ−ＭＳの代わりにエド マン分解を行った。

サイクル８（Ａｓｎ−１５６由来）および１９（Ａｓｎ−１６７由来）でアスパ ラギン酸が観測された。これらの結果を組み合わせることによって、Ａｓｎ残基 １０６．１１１．１２６．１３０．１５６、および１６７に結合した複合型オリ ゴ糖構造の存在が示される。

ＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマツプ中で同定された残りの３種の塘ペプチドは 複数の潜在的グリコジル化部位を含有し、エンドＨ感受性であった。ペプチドＴ １４、Ｔ１６、およびＴ２８は合計１０個の潜在的グリコジル化部位の説明とな る。各グリコジル化部位の特徴づけを、エンドＨ処理とそれに続＜ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理にかけたＨＰＬＣ精製ペプチドのエドマン分解によって達成した。

エンドＨが高マンノース型およびハイブリッド型オリゴ糖構造を放出させる場合 、そのペプチドのアスパラギン残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基が 残る（丁ａｒｅｎｔ４ｎｏら、　１９７４）。ｐＮＧａｓｅ　Ｆは二のＮ−アセ チルグルコサミン残基を除去しないが、β−アスバルチルグルコンルアミン結合 の切断によって残存するＮ−結合型オリゴ塘構造を放出させ、結合アスパラギン 残基のアスパラギン酸への変換をもたらす（Ｃｈｕ、　１９８６）。したがって エンドＨ処理とそれに続＜ＰＮＧａｓｅＦ処理は非グリコジル化部位にはアスパ ラギンを与え、王として高マンノース型および／またはハイブリッド型τリゴ糖 構造を含有するグリコジル化部位にはＧ　１ｃ、Ａ　ｃ−、Ａ　ｓｎを与え、主 として複合型オリゴ糖構造を保持するグルコシル化部位にはアスパラギン酸を与 えるであろう。Ｐａｘｔｏｎら（１９８７）はエドマン分解後にＧｌｃＡｃ−Ａ ｓｎのＰＴＨ誘導体を検出し得ることを示している。この方法を用いることによ って、ＣＬ４４　［配列番号１２］の残りのグリコジル化部位を特徴づけること ができた。例えば、３個の潜在的Ｎ−グリコジル化部位を含有する糖ペプチドＴ １６をエンドＨで処理し、続いてＰＮＧａｓｅ　Ｆで処理したところ、エドマン 分解中のサイクル７および１３にＧｌｃＡｃ−ＡｓｎのＰＴＨ誘導体が出現し、 サイクル１９にＰＴＨ−、Ａｓｐが出現した。したがって、糖ペプチドＴ１６は ＡＳｎ−２５９およびＡｓｎ−２６５に三として高マンノース型および／または ハイブリッド型オリゴ糖を保持し、Ａｓｎ−２７１に複合型オリゴ糖を保持する 。これらの実験の結果を表Ｖに要約する。これらの実験の結果はＣＬ４４　［配 列番号１２］がＡｓｎ残基２７１．３６７、および３７６に複合型オリゴ塘構造 を含有し、Ａｓｎ残基２０４．２１１．２３２．２５９．２６５．３５６、およ び３６２に高マンノース型および／またはハイブリッド型オリゴ糖構造を含有す ることを示している。

表Ｖ　複数の潜在的グリコジル化部位を含有するＲＣＭＣＬ４４１−リブシン糖 ペプチドのグリコジル化型の同定 エンドＨ処理とそれに続（ＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理にかけ、ＨＰＬＣで精製したベ プオリゴ糖構造が結合していたグリコジル化部位にはＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ、複 合オリゴ糖構造を保持していたグリコジル化部位には、Ａｓｐ残基を示す。

トリプシン　、ＡｓＴｌ残基番号　観測された残基　グリコジル化型２１１　Ｇ ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ　肩マンノースおよび／またはハイブリッド２３２　Ｇｌｃ Ｎ　Ａｃ−Ａ、ｓｎ　高マンノースおよび／またはハイブリッドＴ　１６　２５ ９　ＧｌｃＮＡｅ−Ａｓｎ　高マンノースおよび／または）・イブリッド２６５ 　ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ　高マン／−スおよび／またはハイブリッド２７１　Ａ ｓｐ　複合 Ｔ２８　３５６　ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ　高マンノースおよび／またはｌ！ブリ ッド３６２　ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ　高マン／−スおよび／またはノーイブリッ ド３６７　Ａｓｐ　複合 ３７６　Ａｆｐ　複合 残りのグリコジル化部位を含有するペプチドＴ１３は本明細書に記載したいずれ のトリプシンマップでも同定されなかった。しかし、エンドＨで処理し、次いで ＰＮＧａｓｅ　Ｆで処理したＲＣＭ　ＣＬ４４のトリプシンマ２プの排除ピーク から得られたＦＡＢ−ＭＳデータは、結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を 含有するこのペプチドのＭＨ”−に対応するイオン（観測値：ｍ／ｚ　７４０． １　：計算値・ｍ／ｚ　７４０．４）を明らかにした。ペプチドＴ１３が排除ピ ーク中に存在することをＡＡＡでさらに確認した。したがうて、筆者らは、Ａｓ ｎ−２００がグリコノル化されており、生として高マンノース型および／または ハイブリッド型オリゴ糖構造を保持していると結論する。

本明細書に記載したデータは、ｇｐ１２０の２４個の潜在的グリコジル化部位か すべて使用されていること、ならびに１３部位が主として複合型オリゴ糖構造を 含有し、ｌ１ｇ位が生として高マンノース型および／またはハイブリッド型オリ ゴ糖構造を含有することを明らかにしている。各部位におけるグリコノル化の型 を図６に要約する。

考察 筆者らはＨＩＶ−１のｌｌｌ５単離物由来のｒｇｐ１２０のオリゴ糖部分の結合 位！およびジスルフィド結合様式を決定した。この情報の模式的表現を図６［配 列番号１０］に記載する。構造上のデータを得たｒｐｇ１２０分子はＨＩＶ−１ ウィルス粒子によって生産されるｇＤ１２０が特徴とする機能上の性質（高親和 性ＣＤ４結合（Ｌａｓｋｙら、１９８７）およびＨＩ　Ｖ−１中和抗原性（Ｌａ ｓｋｙ、　１９８６）を含む）を保持している。したがってｉ者らは、Ｃ）（Ｏ が発現したｇｐ１２０は適切に折り畳まれており、この組換え分子について本明 細書に報告したジスルフィド結合ドメインがＨＩＶ−１ウィルス粒子が生産する ｇｐ１２０中に存在するものの典型であると結論する。

ｇｐ１２０構造の機能的側面一　ｇｐ１２０分子は５つのジスルフィド結合環構 造からなる。第１および第４の環構造は１つのジスルフィド結合によって形成さ れる単純な環であり、第２、第３および第５の環構造は入れ千秋に重なった（ｎ ｅｓｔｅａ）ジスルフィド結合によって形成される、より複雑な理配列である。

第４ジスルフイド結合ドメイン（残基２６６〜３ｏ１）が重要な型特異的中和エ ピトープ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、　１９８８　：　Ｒｕ５ｃｈｅら、１９８ ８　ＨＧｏｕｄｓｍｉｔら、　１９８１１１　；　Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ轣A　 １９８９）を含 存し、第５ジスルフイド結合ドメイン（残基３４８〜４１５）がＣＤ４結合にと って重要（Ｌａｓｋｙら、　１９８７　：　ＫｏｗａＬｓｋｉら、ｌ９８７ンで あることがゎがった。他の３つのジスルフィド結合ドメインについては！接的な 機能上の関連性は記述されていない。

ｇｐ１２０のアミノ酸配列はウィルス単離物間で高度に変化するが、その可変性 の大半は、他の比較的保存された配列中に介在する超可麦類域中に局在化してい る（ｆｉＬｌｅｙら、　１９８６　；　Ｍｏｄｒｏｗら、　１９８７）。Ｍｏｄ ｒｏｖら（１９８７）は配列変化、挿入および欠失によって特徴づけられる５つ の超可変領域を同定している。これらの超可変領域のうち４つは図６に詳しく輪 郭を描いた環構造に対応する。第３超可変環（ジスルフィド結合ドメイン■Ｖ） を除いて、これらの領域の機能上の意義はわがっていない。

ｇｐ１２０中のシスティン残基の位置、ならびにおそらくジスルフィド結合様式 も単離物間で高度に保存されている。ＨＩＶ−１単離物のながでこの保存性の唯 一の例外は２３単離物（Ｖｉｌｌｅｙら、　１９８６）であり、二の単離物は第 ３超可変ドメイン（残基３６３〜３８４）中に追加の一対のシスティン残基を有 する。これらの残基はこの単離物由来のｇｐ１２０中に１０番目のジスルフィド 結合を形成する可能性が極めて高い。このような超可麦類域中の余分な結合の存 在は、その分子の構造および機能に対して、その領域で起こる他の配列変化より 大きい効果を持たない。

図７に示すように、ＨＩＶ−２［配列番号１３〕中ならびに５ＩＶ（非開示デー タ）中では、ジスルフィド結合ドメイン１、ＩＩ、　ＩＶおよびＶ中のシスティ ン残基の位置が保存されている（”Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａ ｎｃｆ　ＡＩＤＳ−（１９８９）、　Ｇ、　Ｍｙｅｒｅｓ、＾、　Ｒ≠ｂ■ ｏｎ、　Ｓ、　Ｊｏｓｅｐｈｓ、　Ｔ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、　Ｂｅｒｚｏｆｓ ｋｙおよびＦ、　ｌｏｎｇ−Ｓｔａｈｌ曙、米国政府出版局A　Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｌｏｓ　Ａｌａｍ ｏｓ、　！ｉｅｖ　Ｍｅｘｉｃｏ几＾−ＵＲ，８９−７４３j。ドメイン ＩＩＩ中には２対の追加ジスティン残基（ＳＩＶ単離物Ｍ１４２中には３対）が 存在し、これらは図６に示したものに類似のフィンガ一様ドメインＩＩＩ構造内 でジスルフィド結合していると思われる。ＨＩｖ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ 間のもう１つの主要な相違点は、超可変領域Ｖ２がＨＩ　Ｖ−２およびＳＩＶで は５アミノ酸に減っていることである。ＨＩ　Ｖ−１、ＨＩ　Ｖ−２およびＳＩ Ｖ間の相違の機能上の意義は現時点ではわかっていない。

ｇｐ１２０の最も重要な機能の１つは、ＣＤ４に結合することによって感受性細 胞に対するウィルス粒子の結合を媒介する能力である（Ｋｌａｔｚｍａｎら、　 １９８４　；　Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、　１９８４）、突然変異誘発および構造 研究（Ｌａｓｋｙら、　１９８７　：　ＫｏｗＬｓｋｉら、　１９１１１？）に よってＣＤ４結合機能の位１が残基３２０と４５０の間の領域に特定されており 、この領域には第５ジスルフイド結合ドメインが含まれる。Ｌａ５ｋｙら（１９ ８７）は、残基３９６から４０７までの欠失およびＡｌａ−４０２のＡｓｐへの 突然変異誘発がＣＤ４結合を完全に破壊することを示した。また彼らはｇｐ１２ ０−ＣＤ４結合を遮断するモノクローナル抗体のエピトープを残基３９２〜４０ ２と位置づけた。

Ｋｏｗａｌｓｋｉら（１９８７）は３つの領域がＣＤ４結合に関与すると同定し た。残基３３３〜３３４．３８８〜３９０および４４２〜４４３の間の挿入はＣ Ｄ４結合を完全に破壊した。さらに残基４４１〜４７９の欠失はＣＤ４結合を完 全に破増し、一方、第４超可変領域内の残基３６２〜３６９の欠失は結合に影響 を及ぼさなかった。Ｃｏｒｄｏｎｎ　ｉｅｒら（１９８９）はＴ　ｒｐ−３９７ のＴｙｒまたはＰｈｅへの突然変異誘発がＣＤ４結合を減少させ、５ｅｒＳＧｌ ｙＳＶａｌまたはＡｒｇへの変化が結合を完全に破壊することを示している。！ ｉｙｇｒｅｎら（１９８ｇ）はｇｐ１２０の残基３２２からほぼＣ末端までのタ ンパク質加水分解断片がＣＤ４に対する結合能力を保持することを報告している 。これらの研究の結果はｇｐ１２０のＣＤ４結合能力が残基３２０と４５・Ｏの 間の領域に局在化しており、より具体的には３３３〜３３４．４４２〜４４３の 周辺の残基、および３３８と４０７の間の配列に局在化していることを示してい る。

ｇｐ１２０−ＣＤ４結合を遮断するモノクローナル抗体５　Ｃ２−Ｅ　５のエピ トープを位置決定するための努力の過程で、Ｌａ５ｋｙら（１９８７）はｒｇｐ １２０（ＣＬ４４［配列番号１２］）を酢酸で処理することによってこのタンパ ク質をアスパラギン酸残基で切断しくＩｎｇｒａｍ、　１９６３）、ペプチド断 片３８３−４２６を固定化抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体５Ｃ２−Ｅ５のカラ ムから単離した。還元したｒｇｐ１２０の消化物も同じ断片を与えた。したがっ て、ジスルフィド結合がＣｙｓ３８８と４１５の間に存在すると結論づけられた 。本明細書に報告した分析において、ｉ者らはこのジスルフィド結合を発見する ことができず、そのかわりに図６に要約したように、−貫してＣｙｓ−３５５と Ｃｙｓ−３８８の間およびＣＹＳ−３４８とＣｙｓ−４″、５の間にジスルフィ ド結合を発見した。筆者らは真のジスルフィド結合同定は図６に示した通りであ り、過去の研究における酢酸消化はいくつかのジスルフィド結合配置転換（Ｒｙ ｌｅおよびＳａｎｇｅｒ、　１９５５）をもたらしたものと考える。

ｇｐ１２０のオリゴ糖−ｇｐ１２０の見かけ上の分子量の約５０％は炭水化物で ある。ＣＬ４４　［配列番号１２］　ｒｇｐ１２０のヒドラジン分解によって放 出されるオリゴ糖部分の構造は詳細に分析されている（Ｍｉｚｕｏｃｂｉら、　 １９８８ａ　：　１ｌｉｚｕｏｃｈｉら、　１９８８ｂ）。これらの著者らはＮ −結合ｉオリゴ糖の３３％が高マンノース型であり、４％がハイブリッド型であ り、６３％が複合型であることを発見した。複合オリゴ糖のうち９０％はフコシ ル化されており、９４％はシアリル化されていた。その複合構造は約４％が１ア ンテナ状であり、６１％が２アンテナ状であり、１９％が３アンテナ状であり、 １６％が４アンテナ状であワた。〇−結結合型オリ精糖認められなかった。Ｇｅ ｙｅｒら（１９８１１１）はＨＩＶ−１に感染したヒト細胞のＩＩＩ。

単離物由来のｇｐ１２０のオリゴ糖を分析している。彼らは炭水化物構造の約５ ０％を占める高マンノース型オリゴ糖を発見した。残りの構造はフコシル化され 部分的にンアル化された２−１３−および４−アンテナ状の複合型オリゴ糖であ った。ヒト中で異好性抗原として作用すると期待し得る新規炭水化物構造または 部分はいずれの供給源由来のｇｐ１２０からも単離されていない。

ｉ者らは２４個のグリコノル化部位のすべてが使用されており、その２４部位の うち１３部位が複合型オリゴ糖を主たる構造として含有し、１１部位が王として ハイブリッドおよび／または高マンノース構造を含有することをここに示した。

２４部位中１１部位のエンドＨ感受性構造を明らかにしたことは、ｒｇｐ１２０ から放出される全オリゴ糖構造のほぼ４０％がハイ、ブリッドおよび／または高 マンノースオリゴ糖であることを決定したＭｉｚｕｏｃｈｉら（１９８８ａ、　 １９８８ｂ）の過去の結果と合致する。

ｇｐ１２０配列中の２４個の潜在的Ｎ−結合型グリコリル化部位は異なるウィル ス単離物間で高度に保存されている（Ｗｆｌｌｅｙら、　１９８６　；　Ｍｏｄ ｒｏｖら、　１９８７）、これらの文献中のｇｐ１２０配列の比較に基づけば、 ＨＩＶ−１のＩＨｓ単離物由来のｇｐ１２０上の部位のうち１３部位が完全に保 存されており、１１部位中８部位が主としてハイブリッド型および／または高マ ンノース型オリゴ糖を保持する。したがって、ｇｐ１２０の不完全にプロセシン グされた（即ち、エンドＨ感受性の）オリゴ環が、はとんど保存されたグリコジ ル化部位に選択的に認められる。残りの部位（８個の複合および３個のハイブリ ッド／高マンノース）の多くは超可麦類域中に存在するにもかかわらず、比較的 保存されている。これらの部位の位置は移動したり、欠失したりし得るが、常に 参照ｌｌｌ５部位の５〜１０残基内に１以上の新しい部位がある。豐１１１ｅｙ ら（１９８８）の研究は１．Ａｓｎ−２３２のＧｉｎへの突然変位誘発が、その 変異型ｇｐ１２０分子を含有するウィルス粒子の感染性を、ＣＤ４結合またはン ンシチウム形成に影響を及ぼすことなく、減少させることを立証した。現時点で は、いずれの部位のオリゴ糖構造にも特定の機能上の意義を帰することはできな い。

ＣＤ４結合におけるｇｐ１２０上の炭水化物部分の役割は数人の著者らによって 研究されてきた（Ｌｉｆｓｏｎら、　１９８６　：　Ｍａｔｔｈｅｖｓら、　１ ９８７　：　Ｆｅｎｏｕｉｌｌｅｔら、　１９８９）。界面活性剤存在下での酵 素的脱グリコノル化を用いた研究（Ｌｉｆｓｏｎら、　１９８６　；　Ｍａｔｔ ｈｅｖｓら、　１９１１ｔ７）によって、炭水化物は結合に直接的には関与しな いが、結合に必要なｇｐ１２０の立体配置を維持するためにこれらの炭水化物が 必要であると結論されている。対照的にＦｅｎｏｕｉｌｌｅｔら（１９８９）は 、界面活性剤の非存在下でｇｐ１２０を酵素的に脱グリコリル化し、ＣＤ４結合 親和性が保存されることを明らかにした。したがって、ｇｐ１２０の炭水化物部 分はＣＤ４に対するその結合にとっては必要でないが、脱グリコリル化後には界 面活性剤に対するｇｐ１２０の立体配置の安定性が失われるようである。

これらの決定に用いられたｒｇｐ１２ＱはＨＩＶ−１ｊ：感染した細胞が生産す るｇｐ１２０と機能的および構造的に等価である。

文献 ＾１１ａｎ、　Ｊ、　Ｓ、　、　Ｃｏｌｉｇａｎ、　Ｊ、　Ｅ、　、　Ｂａｒｉ ｎ、　Ｆ、　、　１ｌｃＬａｎｅ、　Ｍ、　Ｆ、　、　５ｏр窒盾唐汲堰A　Ｊ 、　Ｇ、　、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｃ，Ａ、　、　ｌ１ａｓｅｌｔｉｎｅ、　ｆ、　 Ａ、　、　Ｌｅｅ、　Ｔ、　Ｈ，およびＥｓ５ｅｘ、　Ｍ、　（１９８５）、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．１０９P−１０９４゜ Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、　Ｏ，、Ｐｙｌｅ、　Ｓ、　？、　、　Ｎａｒａ、　Ｐ、 　Ｌ、　、　Ｂｅ５ｓ、　Ｊ、　Ｗ、　Ｊｒ、　、　Ｇｏｎр＝A　Ｍ、＾、　 、　Ｋｅｌｌｉｈｅｒ、　Ｊ、　Ｃ，、Ｇ１１ｄｅｎ、　Ｒ，Ｖ、　、　Ｒｏｂ ｅｙ、　Ｙ、　Ｇ、　、　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、　Ｄ、　Ｐ、　、　Ｇａ１ｌｏ 、　Ｒ，Ｃ，およびＦｉ唐モ■奄獅■■秩A　Ｐ、　Ｊ、　（１９８７）、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．８５８３−８５８７ ゜Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、、Ｃｈｅｒｒｎａｎｎ、Ｊ、Ｃ，、Ｒｅ ｙ、Ｆ、、Ｎｕｇｅｙｒｅ、Ｍ、丁、、Ｃｈａｒａａｒｅｔ、r、、Ｇｒｕｅｓ ｔ、Ｊ。

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およびＢａｈｒａｏｕｉ、　Ｅ、　（１９８９）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｆｌｅｄ 、　１６９．８０７−８２２゜Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、　Ｈ，Ｒ，、Ｒｅｕｐｋ ｅ、　ＨおよびＰａｕｌｉ、　Ｇ、　（１９８５）、　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ、　 １０１６−P０１７゜ Ｇｅｌｅｄｅｒｂｌｏｍ、　Ｈ，Ｒ，、Ｅｌａｕｓｍａｎｎ、　Ｅ、　Ｌ　Ｓ、 　、　０ｚｅ１．　Ｍ、　、　Ｐａｕｌｉ、　ＧおよびＫｏモ■A　Ｍ、　Ａ、 　（１９８７）、　Ｖｉｒｏｌ、　１５６．１７１−１７６゜Ｇｅｙｅｒ、　［ １，、Ｈｏ１ｓｃｈｂａｃｈ、　Ｃ，、Ｈｕｎｓｍａｎｎ、　Ｇおよび５ｃｈｎ ｅｉｄｅｒ、　Ｊ、　（１９８ｇ）、　ＪA　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２ ６３、１１７６０−１１７６７゜ Ｇｏｕｄｓｍｉｔ、　Ｊ、Ｂｏｕｃｈｅｒ、　Ｃ，Ａ、　Ｂ、　、　Ｍｅｌｏｅ ｎ、　Ｒ，Ｆｉ、　、　Ｅｐｓｔｅｉｎ、　Ｌ、　Ｇ、　、@Ｓｍ１ｔル、、ｖ ａｎ　ｄｅｒ　Ｈｏｅｋ。

Ｌ、およびＢａｋｋｅｒ、　Ｍ、　（１９８８）、ＡＩＤＳ　２．１５７−１６ ４゜Ｉｎｇｒａｍ、　Ｖ、　（１９６３）、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　 ６．８３１−８４８゜Ｊ　ａｖａｈｅｒｉａｎ、　Ｋ、　、　Ｌａｎｇｌｏｉｓ 、　、Ｌ　Ｊ、　、　ＭｃＤａｎａｌ、　Ｃ，、Ｒｏｓｓ、　Ｋ、　、　Ｅｃｋ ｌ■秩A　Ｌ、　１．　、　Ｊｅｌｌｉｓ、　Ｃ，Ｌ、　、　Ｐｒｏｆｙ、　Ａ 、　Ｔ、　、　Ｒｕ５ｃｈｅ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、　Ｄ、　Ｐ 、　、　Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、　Ｄ、およびlａｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、　Ｊ、　 （１９８９）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６． ６７６８−６７７２゜Ｋｌａｔｚｍａｎ、Ｄ、、Ｃｈａｍｐａｇｎｅ、Ｅ、、Ｃ ｈａｒＩｌａｒｅｔ、Ｓ、、Ｇｒｕｅｓｔ、Ｊ、、Ｇｕｅｔａｒｄ、Ｄ、、Ｈｅ ｒモ■獅пA丁、、Ｇｌｕ ｃｋｍａｎ、　Ｊ、　ＣおよびＭｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　（１９８４）、 　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７６７−７６８゜Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｒ，およびＫ ｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｓ、　（１９８５）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　５４．６３１−U６４゜ Ｋｏｖａｌｓｋｉ、　Ｍ、　、　Ｐｏｔｚ、　Ｊ、　、　Ｂａ５ｉｒｉｐｏｕｒ 、　Ｌ、　、　Ｄｏｒｆｍａｎ、　Ｔ、　、　Ｇｏｈ、　ＷA　Ｃ，、Ｔｅｒｖ ｉｌｌｉｇｅｒ、　Ｅ、　、　Ｄａｙｔｏｎ、　Ａ、　、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｃ， 、Ｈａｓｅｌ　ｔｉｎｅ、　１．および５ｏｄｒｏｓｋｉ、　Ｊ、　（１９８７ ）、　５ｃｉｅｎモ■@２３７．１３５１−１３５ ５゜ Ｌａ５ｋｙ、　Ｌ、　Ａ、　、　Ｇｒｏｏｐｍａｎ、　Ｊ、　Ｅ、　、　Ｆｅｎ ｎ１ｅ、　Ｃ，１，、Ｂｅｎｚ、　Ｐ、　Ｍ、　、　Ｃａｐ盾氏A　Ｄ、　Ｊ、 　、　Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、　Ｄ、　Ｊ、　。

Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｇ、　Ｒ，、Ｎｕｎｅｓ、　Ｙ、　Ｍ、　、　Ｒｅｎｚ、 　Ｍ、　Ｅ、およびＢｅｒｍａｎ、　Ｐ、　Ｗ、　（１９８U）、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３３．２０ ｇ−２１２゜ Ｌａ５ｋｙ、　Ｌ、　Ａ、　、　Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｇ、　、　Ｓｍ１ｔｈ、 　Ｄ、Ｆｉ、　、　Ｆｅｎｎ１ｅ、　Ｃ，Ｓｈｉｍａｓａｋ堰A　Ｃ，、Ｐａｔ ｚｅｒ、　Ｅ、　、　Ｂｅｒｍａｎ。

Ｐ、　、　Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｔ、およびＣａｐｏｎ、　Ｄ、　Ｊ、　（１９８ ７）、　Ｃｅ１ｌ　５０．９７５−９８５゜Ｌｉｆｓｏｎ、　Ｊ、　、　Ｃｏｕ ｔｒｅ、　Ｓ８．　Ｈｕａｎｇ、　ＥおよびＥｎｇｌｅｍａｎ、　Ｅ、　（１９ ８６）、　Ｊ、　Ｅ：ｒ吹A　Ｗｅｄ、　１６４．２１０１−２ １０６゜ Ｍａｔｓｕｓｈｉ　ｔａ、　Ｓ、　、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、　Ｍ、　 、　Ｒｕ５ｃｈｅ、　Ｊ　、　、　Ｋｏｉｔｏ、　Ａ、　、@Ｈａｔｔｏｒｉ、 　Ｔ、　、　１ｌｌｏｓｈｉｎｏ、Ｆｉ、　。

Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、　Ｋ、　、　Ｔａｋａｔｓｕｋｉ、　Ｋ、およびＰｕｔ ｎｅｙ、　Ｓ、　（１９８８）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６Q．２１０７−２１ ４４つ １１ａｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、　Ｊ、　、　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、　Ｊ、　、 　Ｌｙｅｒｌｙ、　Ｈ，Ｋ、　、　Ｌａｎｇｌｏｉｓ、　ＡA　Ｊ、　、　ｆｉ ｇｚｅｌｌ、　Ｅｌ、およびＢｏｌｏｇｎｅｓｉ、　Ｄ、　Ｐ、　（１９８７） 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．５４２４− ５４２８゜Ｍｉｚｕｏｃｈｉ、　Ｔ、　、　Ｓｐｅｌｌｍａｎ、　Ｍ、　Ｗ、　 、　Ｌａｒｋｉｎ、　Ｍ、　、　Ｓｏｌｏｍｏｎ、　Ｊ、　、　Ｂａ５＝A　Ｌ 、　Ｊ、およびＦｅ１ｚｉ、　Ｔ、　（１９８８ａ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ 、　２５４．５９９−６０３゜Ｍｉｚｕｏｃｈｉ、　Ｔ、　、　Ｓｐｅｌｌｍａ ｎ、　Ｍ、　Ｗ、　、　Ｌａｒｋｉｎ、　Ｍ、　、　Ｓｏｌｏｍｏｎ、　Ｊ、　 Ｂａ５ａ、@Ｌ、　Ｊ、およびＦｅ１ｚｉ、　Ｔ、　（１９８８ｂ）、　Ｂｉｏ ｍｅｄ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　２．２６０−２７０゜Ｍｏｄｒｏｖ、　Ｓ 、　、　Ｈａｈｎ、　Ｂ」、　、　Ｓｈａｗ、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｇａ１ｌｏ、 　Ｒ，Ｃ，、ｌｏｎｇ−５ｔａｈｌ、　e、およびｆｏｌｆ、　Ｈ，（１９８７ ）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１．５７０−５７８゜Ｍｏｏｒｅ、　Ｊ、　Ｐ、 　、　ＭｃＫｅａｔｉｎｇ、　Ｊ、　Ａ、　、　Ｊｏｎｅｓ、　Ｉ、　Ｍ、　、 　５ｔｅｐｈｅｎｓ、　Ｐ、　ＥA　、　Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、　Ｇ、　、　Ｔｈ ｏｍｓｏｎ、　Ｓ。

およびＷｅｉｓｓ、　Ｒ＾、　（１９９０）、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、印 刷中。

Ｎｙｇｒｅｎ、　Ａ、　、　Ｂｅｒｇｍａｎ、　Ｔ、　、　Ｍａｔｔｈｅｖｓ、 　Ｔ、　、　Ｊｏｒｎｖａｌｌ、　Ｈ，およびｆｉｇｚｅｌ戟A　Ｅ［、（１９ ８８）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．６５４３−６５４６゜Ｐａｘ ｔｏｎ、　Ｒ，Ｊ、　、　Ｍｏｏｓｅｒ、　Ｇ、　、　Ｐａｎｄｅ、　Ｈ，、Ｌ ｅｅ、　Ｔ、　Ｄ、　、　５ｈｉｖｅｌｙ、　Ｊ、　d、　（１９ｇ？）、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４．９２０−９２ ４゜Ｒｏｂｅｙ、　ｆ、　Ｇ、　、　５ａｆａｉ、　Ｂ、　、　０ｒｏｓｚｌａ ｎ、　Ｓ、　、Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、　０．、　Ｇｏｎｄａ、　l、　Ａ、　、 　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，およびＦｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、　＜１９ ８５）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２１１ｔ、　５９３−５９５゜Ｒｕ５ｃｈｅ、　 Ｊ、　Ｒ，、Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、　Ｋ、　、　ＭｃＤａｎａｌ、　Ｃ，、Ｐ ｅｔｒｏ、　Ｊ、　、　Ｌｙｎｎ、　Ｄ、@Ｌ、　、　Ｇｒｉｍａｉｌａ、　Ｒ ，、Ｌａｎｇｌｏｉｓ、＾、　、　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、Ａｒｔｈｕｒ、　 Ｌ、　Ｏ，、Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、　、　Ｂｏｌｏｇｎｅ唐堰A 　Ｄ、　Ｐ、　、　Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、　Ｄ。

およびＭａｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、　Ｊ、（１９８８）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ！Ｓ＾８５．３１９８−３２O２゜ Ｒｙｌｅ、　Ａ、　Ｐ、およびＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、　（１９５５）、　Ｂｉｏ ｃｈｅａ、　Ｊ、　６０．５３５−５４０゜Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、およびＴｈｏ ｌｌｌｐｓｏｎ、　Ｅ、　０．　Ｐ、　（１９５３）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ 、　５３．３６６−３７S゜ ５ｈａｌａｂｙ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｋｒｏｗｋａ、　Ｊ、　Ｆ、　、　Ｇｒｅｇｏ ｒｙ、　Ｔ、　Ｊ、　、　Ｂｉｒａｂａｙａｓｈｉ、　Ｓ、@Ｅ、　、　ＭｃＣ ａｂｅ、　Ｓ、　Ｍ、　、　Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｄ、　Ｓ、　、　５ｔｉｔｅｓ 、　Ｄ、　Ｐ、およびＡｍｍａｎｎ、　Ａ、　Ｊ、　（１９ｇ？）、　Ｃｅ１Ｉ 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、@１１０．１４０−１４８゜ Ｓｉｌ　１ｃｉａｎｏ、　Ｒ，Ｆ、　、　Ｌａｖｔｏｎ、　Ｔ、　、Ｋｎａｌｌ 、　Ｃ−、Ｋａｒｒ、　Ｒ，ｆ、　、　Ｂｅｒｍａｎ、　ＰA　、　Ｇｒｅｇｏ ｒｙ、Ｔ、およびＲｅ１ｎｈｅｒｚ、　Ｅ、　Ｌ、　（１９８８）、　Ｃｅ１ｌ 　５４．５６１−５７５゜５ｏｄｒｏｓｋｉ、　Ｊ　、　、　Ｇｏｈ、　Ｗ、　 Ｃ，、Ｒｏｓｅｎ、　Ｃ，、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｋ、およびＨａｓｅｌｔｉｎ ｅ、　hｌ、　Ａ、　（１９８６）、　Ｎａｔｕｒｅ　３２２．４７０−４７４ ゜ Ｔａｉ、　Ｔ、　、　Ｙａｍａｓｈｉｔａ、　Ｋ、およびＫｏｂａｔａ、　Ａ、 　（１９７７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　qｅｓ、　Ｃｏｍｍ ｕｎ、　７８．４ ３４−４４１゜ Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ、　Ａ、　Ｌ、　、　Ｇｏｍｅｚ、　Ｃ，Ｍ、およびＰｌｕ ｍｍｅｒ、　Ｔ、　［Ｌ　Ｊｒ、（１９８５）、　Ｂｉｏｃ■■高奄唐狽窒凵@ ２４．４６６ ５−４６７１゜ Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ、＾、　Ｌ、　、　Ｐｌｕｍｍｅｒ、　Ｔ、　Ｈ，ｋ、およ びＭａｌｅｙ、　Ｆ、　（１９７４）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、@Ｃｈｅｍ、　２４ ９．８１８−８ ２４゜ Ｗｉｌｌｅｙ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、　Ｒ，＾、　、　Ｄｉａｓ 、　Ｓ、　、　Ｆｏｌｋｓ、　Ｔ、　、　ＴｈｅｏｄｏｒｅA　Ｔ、　、　Ｂｕ ｃｋｌｅｒ、　Ｃ，Ｅ、およびＭａｒｔｉｎ、　Ｍ、　Ａ、　（１９８６）、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．５０３８−５ ０４２゜Ｗｉｌｌｅｙ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、　Ｈ，、Ｌａ５ｋ ｙ、　Ｌ、　Ａ、　、　Ｔｈｅｏｄｏｒｅ、　Ｔ、　Ｓ、　、　Ｅａ窒戟A　Ｐ 、　Ｌ、　、　Ｍｏ５ｓ、　Ｂ、　、　Ｃａｐｏｎ。

Ｄ、　Ｊ、およびＭａｒｔｉｎ、　Ｍ、＾、　（１９８８）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　６２．１３９−１４７゜配列表 （１）　一般的情報 （ｉ）　特許出願人：ジエネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）　発明の名 称：ＨＩＶエンベロープポリベブチド（ｉｉｉ）　配列の数＝１５ （ｉｖ）　連絡先： （Ａ）　名宛人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り二ポイント ・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシ スコ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （Ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ、）　媒体型・５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）　コ ンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム：　ＰＣ− ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウエアニＰａｔｉｎ　（ジェネンテク）（ ｖｉ）　本出願のデータ： （Ａ）　出願番号： （Ｂ）　出願臼： （Ｃ）　分類： （ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０ ７１５０４．　７７２（Ｂ）　出願臼＋１９９０年４月３日 （ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名ニアドラ−、キヤロライン・アール（Ｂ）　登録番号：３２．３２ ４ （Ｃ）　参照／型理番号・６３９ （ｉｘ）　１話連絡先情報： （Ａ）　を話番号＋　４１５／２２６−２６１４（Ｂ）　ファックス番号：４１ ．）／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２ ）　配列番号１の情報： （１）　配列の特徴 （、へ）　長さ：１８アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポフノー：１１鎖状 （ｘｉ）　配列−配列番号１： ｃｙｓ　ｖａユ　Ｌｙｅ　Ｌ釣　丁ｈ：　Ｐｒｏ　Ｌ費ｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　λ ａｎ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　！Ｌ−Ｔｈｒ１　ｓ　ユ０　１Ｓ （２）　配列番号２の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、４０アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロン−直鎖状 （＼１）　配列、配列番号２： Ｐｒｏ　！ｉｓ　ＴＩＬｍ　Ｔｙｔ：　Ｃｙｓ　入λａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＧＬ ｙ　Ｐｈｅ　入１ａ　Ｈｅ　Ｌｍ　Ｌｙｅ　ａｙｓｓ　１０　：ｓ λａｎ　ｈｅｎ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　入ａｈ　Ｃ；Ｉｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ 　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　入ｓｎ　Ｖａｌ　ｆａｒ（２）　配列番号３の情報 。

（ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、１２アミノ酸 （Ｂ）　型　アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー二直頌状 （ｘｌ）　配列：配列番号３： （２）　配列番号４の情報。

（ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、２０アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｌ）　配列：配列番号４： Ｃｙｓ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｉｌ＠　Ｌａｕ　 Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　丁ｈｒ　入ｓｎ　Ｖａｌユ　５　ユＯｉｉ （２）　配列番号５の情報： （２）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トボロノー：Ｉ鎮状 （ｘｉ）　配列：配列番号５： （２）　配列番号６の情報・ （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、５８アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー二１！鎖状 （ｘｌ）　配列：配列番号６： （２）　配列番号７の情報： （ｉ）　配列の特徴 （、Ａ）　長さ：３６アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー・直鎖状 （Ｘユ）　配列　配列番号７： （２）　配列番号８の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、２１アミノ酸 （Ｂ）　型　アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号８ Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　Ａｌａ　？ｙｒ　Ａｓｐ　 丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｍ　Ａｓｎ　Ｖａｌ１　５　ユ０　二５ （２）　配列番号９の情＠： （ｉ）　配列の特徴 （、Ａ、）　長さ：３２アミノ酸 （Ｂ）　型、アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー二直鎖状 （ｘｉ）　Ｅ列；配列番号９： （２）　配列番号１０の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ＝４７９アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：直鎮状 （ｘｉ）　配列：配列番号１０： Ｔｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｌｅｓｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　７ｙｒ 　デｙｒＧユｙＶａユ　ｐｒｏ　Ｖａｌ　丁ｊ２ユ５１０１ｓ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　入工ａ　ｒｈｒ　Ｔｈｅ　丁ｈｒ　Ｌａｗ　Ｐｈｅ　ｅｙｓ　 Ａｉａ　Ｍｅｔ　λ＄Ｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａ１ａ？ｙｒ　ＡＭＰ　Ｔｈｅ　ａ ニー　ｖ１ユ　Ｃ４ｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔａｐ　Ａｌａ　Ｔｈｅ　１ｌｉｓ　 Ａｌｅ　Ｃｙｍ　ＶａｉＧｉｎ　４０　４５ Ｇ：＊　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　入ｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　入Ｌ’ｌ　入ｓｐ 　！’、鱈　ｖｉｌ　Ｇ：＊　Ｇｉｎ　ｘｅ：　ＨｉｓＧ二１１　Ａｇｐ　：二 ＃　エニｅ　５ｌｌｒ　二ｍｕ　Ｔｒｐ　入ｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｘ　Ｌａｕ　Ｌ ｙｓ　Ｐｒ口　Ｃｙｍ　Ｖａｌ８０　ｅｓ　９０ Ｌｙｓ　Ｌａｕ　？ｂｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｌａｕ　 Ｌｙｍ　Ｃ’ｙｓ　Ｔｈｅ　入−ｐ　Ｌａｇ　ユｙｓ９５　ユ００　二ＯＳ Ａｇｈ　Ａｇｐ　笥ｒ　Ａｇｎ　Ｔｈｅ　Ａｇｎ　５打　５６：　５＊ｒ　Ｃｒ ｙ　入ｒｇ　Ｍｅｔ　ＸＬａ　Ｍｅｔ　ＧユＵユユロ　１：５　ユ２ｃ ＬｙＩ　ＧＬｙ　にｉｕ　１ユ＊　Ｌｙｍ　入ｍｎ　Ｃｙｓ　Ｂａｒ　？：、ｅ 　入１ｎ　ニュー　５ｅｒ　τ？、＝　５鎌：　：二・二２５　ユ３０　ニコＳ Ａｒｇ　にｌｙ　二ｙ−νδユ　Ｇｉｎ　ニアＭ　Ｇ光　？＞′：　Ａｍｍ　？ ：、＊　Ｐｈｅ　？ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌａ−＾ｓｐユ４０　二４Ｓ　ユ５゜ １：＊　１：ｍ　Ｐｒ＋　エユ彎　入１Ｐ　入ｓｒ＋　Ａｓｐ　？？、ｒ　？？ 、？　ｓａｒ　τｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＬ＠ｕ　Ｌｙｅ　Ｃ’ ｙｍ　λ１れ　入ｓｎ　Ｌｙｅ　丁ｈｒ　Ｐｈｍ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　τＦ、ｔ＾ａｎ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　τＰｓ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｎ　Ｃｙｗ　？？ｒ　ｋｌｉｓ　Ｇｌｙ　ｘｌ会　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 ＶａＬ２ユ５　２２０　２２５ ｓＩＩ＋−Ｔｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌ會ｕ　Ｌｗ　入ｓｒ、ＯＲＹ　５＊ｒ　 ”−ｅａ　Ａｌａ　Ｇｌｖ　Ｇ１％ｌ　Ｇニー　Ｖａｌ２３０　：３５　２４０ Ｖｉｌ　Ｘユ値　入ｒｑ　Ｓｅｘ　入工ａ　Ａｓｈ　Ｐｈｅ　＝、、−人ｓｐ　 入Ｓコ　入工ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　に＠　ニューＶａｌ　Ｇ釦　Ｌｅｕ　Ａｇｎ 　Ｇｉｎ　５６１　Ｖａｌ　Ｇ二＝　１ユｅ　入ｓ＊　Ｃｙ雲　Ｔｈｅ　入ｒｇ 　Ｐｒｏ　入−ｎ＾ａｎ　Ａｇｎ　Ｔｈｒ　入ｒ９　二ｙｍ　ｌｅｔ　Ｘユ・　 λｚ；　：ユａ　Ｏ’−ｎ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　１ｌｒｏ　Ｇ：ｙ　入ｒ９２７５ 　：ＩＩＯ２８５ ＾ユａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　：？、ｒ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｃｏ　Ｇｌｙ　 入−ｒ＋　Ｍｉｌｅ　λｒｑ　Ｇｉｎ　λユａＭ土５Ｃｙｓ　Ａｌｎ　１：ｍ　 Ｓｅｔ　入；°９　人ユａ　＝ｙ審　：；ｐ　入港コ　Ａ１　フｈｒ　Ｌｗｕ　 Ｌｙｓ　Ｇ二ｎ！ｉ昏３０５　３二〇　コニＳ ？ｈ＊　Ｌｙｇ　Ｇｌｎ　Ｓａｔ　Ｂａｒ　ＧユｙＧユｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇ ユｕＸユ会　Ｖａｌ　丁ｈｒ　）ｌｉｓ　５ｉｒ二ｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　：ユ ＠　１ユ＊　にｅｔ　Ｔｒｐ　Ｇ釦　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　入Ｌａ 　Ｍｅｚ　：＝３５５　ａｏｏ　４０５ Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＬＪＩＩ！　Ｔｈｅ　＾ｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　入露＊　Ａｓｎ　入門　Ａｓｈ　Ｇｌｕ　５ｅｒ４２５　４コク　４ユ５ Ｇｘｕ　１１ｇａ　Ｐｈｅ　入ｒ９　？ｔ６　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　ｘｓｐ 　Ｍ＠−人ｒｇ　入−ｐ　Ａｌ１１１　丁ニア　入；７（２）　配列番号１１の 情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・９アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：＠＊状 （ｘｉ）　Ｅ列　配列番号１１： （２）　配列番号１２の情報。

（ｉ）　配列の特徴 （、へ）　長さ＝２７アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー＝ｉ！鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号１２： Ｌｙｅ　丁ｙ；　入１ａ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ａｍｐ　Ａｌａ　Ｓａｌ：　Ｌａｕ 　Ｌｙｅ　Ｍａｔ　Ａユ１　Ａｍｐ　Ｐｒｏ　入１コニＳ１０ニ５ （２）　配列番号１３の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ＝４８１アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロン一二［鎖状 （ｘｉ）　配列　配列番号１３・ 丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　ＶｉＬ　ＰＭ＋　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　 ＶａＬ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　丁ｒｐ　Ｌｙｓ　＾ｌｌ’１１　Ｓ　！ＯユＳ ＾ユ昌　丁？、ｒ　ズ１ｍ　Ｐｒｏ　−ｕ　Ｐｈ拳　Ｃｙｓ　入１畠　τｈｒ　 入；９　入車ｒ＋　Ａｒｇ　Ａｍｐ　？Ｍｒ　τＨＰＧＩＹ　丁ｈｒ　！！＠　 Ｇｉｎ　Ｃｙ璽　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ｋｓｎ　Ａｓｐ　入Ｎｐ　Ｔｙｒ　 Ｇｉｎ　Ｇ：’Ｊ　：ユ・フＳ　４０　ｔｓ ？！、ｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　７：ｘ　Ｇｉｕ　入１ａ　Ｐｈ−人１ｐ　 ＾−＠　Ｐｒｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　丁＝　〜°鳳↓Ｓｏ　５５　６０ 丁ｈｒ　Ｇｌｕ　ＧＩｎ　入１ａ　Ｈａ　Ｇｌｕ　Ａｇｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｅ　Ｈ Ｌｍ　Ｌａｕ　Ｐｈ自　（ｌｕ　：二：　５ｓｒ６５　ｔｏ　７５ Ｕ＠　Ｌ）４　Ｐｒｏ　Ｃｙｍ　ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＬＩＩＩＪ　？ｈｒ　Ｐｒｅ 　ＬＪＩＩ　ｅｙｓ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｍｅｚ　Ｌｙｓ８Ｑ　ε５　９０ 特表千５−５０６２２１　（２３） Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　ＴＦ、＝　ＨＬｍ　Ａｓｎ　ｅｙｓ 　ＧＬｒ＋　Ｐｈａ　入＃＋’ｌ　Ｍｌｌｔ、丁？、：　に撃■ ユ４０　ｉ４ｓ　１５０ ＬａｕＧｌｕ入ＱＡｌｐＬｙｍＸ＋ｙｓ＝）’ｓＯｗｎ？ｙｒＡ寥＊ＧユＵτｈ ｒ？ｒｐ？ｙＦ５鐙ｙユ５５　：６０　１６５ Ｌｙｓ　Ａｍｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｃ１ｕ　？ｈｒ　人参ｎ　入ｓｎ　 Ｓａｔ　τｈｒ　入＃＋’ｌ　Ｇ’ｔｎ　τ？、：　Ｇｉｎニアｏ　ニア５　ユ ａ。

Ｃｙｍ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　ｌ４Ｌｊ　Ｃ’ｆｌｌ　Ａｓｎ　丁？、＝　 ５ａｒ　Ｖａｌ　：１費　τｈｒ　（：ｌｕ　Ｓａｗ　Ｃｙ■ Ｉｒｉｓ　ユ９０　１ｌ５ 人ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　τり　入ｓｐ　ＡＬａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｐ ｈａ　入ｒｖ　＝ｙ＝　ａｙｓ　ｘｌ　Ｐｒ。

２００　２０％　２１０ ｐｒｏ　Ｇｕｙ　Ｔｙｔ：　Ａｌａシ＋ｕ　Ｌａｗ　Ａｒｇ　Ｃｙ＊λ１ｎ＾ａ ｐ　？ｈｒ＾ｚｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｘ　ＧｌｙＰｈ・　入１ａ　Ｐｒｏ　入＃ｎ　 Ｃｙｓ　５ＩＩｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　入１ａ　５ａｒ　τｈｒ　Ｃｙｓ 　τビ　入；９人ご９　Ａｌａ　Ｇｌｕ　入１ｎ　入ｒｇ　？ｈｘ　Ｔｙｒ　Ｉ ：會　７Ｙｒ　丁ｑ　ＨＬｍ　０１ｙ　入１９　ＡＱ　入−ｎ２６０　２６ｓ　 ２）Ｏ ＪＬｒｇ　？ｈｒ工１ｍ　Ｈｅ　Ｓｉｒ　Ｌ＠ｕ＾ａｎ　Ｌｙｅ　ｙｒ　７ｙｒ 　ｂａｎ　Ｌａｗ　Ｓａｔ　Ｌａｗ　Ｈ１ｍＣｙｓ　Ｌｙｓ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　＾Ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｙｌ　Ｇユｆｉ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ 　Ｌｅ＝　Ｍｔ２９０　２９５　３０Ｏ ５ｅｘ　Ｇユｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｈｉｓ　Ｓａｔ　Ｍｉｓ　Ｇｉｎ　 Ｐｒｏ　１１ｍ　Ａｓｒ＋　Ｌｙｅ　入：ｇ　Ｐｒ。

３ｏ５　３ユロ　コニＳ 入ｒｇ　Ｇ′、ｎ　Ａｌａ　丁ｒｐ　ｅｅｌｓ　？ＦＰ　Ｐｈ＠　Ｌｙｌ　Ｇｌ ｙ　５ｍ　Ｐｒｅ　Ｌｙｓ　λ寥２　＾：龜　８峠３２ｏ　３コＳ　３３０ ＧｉｎＧｌ＊ＶａｌＬｙｓＧｌｕ？九ｒＬｅｕλ二ａＬｙｅｐｉｓＰｒｏλｒｑ ？ｙｒ＾：；Ｃ１ｙτｈ；　入ａｎ　入ｓｐ　丁ｈｒ　入ｒｇ　入ｓｎ　ＸＬａ 　釦ｒ　Ｐｈａ　Ａｌｌ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙコ５０　３ ５５　３６０ ｆ＠ｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｈｒ　Ｈｅｒ　：ｒｐ　τ ｈｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　ＧＬｙ　ＧｌｕＬｙｓ　？ｈｒ　Ｉｎ−人ｒｇ 　Ａｓｎ　”ｙ：　ＡＬａ　ｐｒり　ｃｙｍ　ｌ！Ｌｓ　：ｌｕ　’−Ｙ８　Ｇ 工Ｉ’ｌ　ｒｉｇ　：１ｅ３９５４００＆０５ 人ａｎ　丁ｈｒ　丁ｒｐ　１４ｓ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　入６ｎ　 ｖ＠Ｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ口　入ｘ９４１０　Ｃ５４２０ ｃｌｕ　ＱＬｙ　Ｇｌｕ　ｌ４Ｌｊ　Ｓｕｒ　Ｃｙ−Ａｓｎ　Ｈｅｒ　？ｈｒ　 Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｓａｔ　Ｘ１ｍ　１１ｍ　入１鼻４２％　４３０　４３５ 人ｍｎ　Ｘユ・　入ｇｐ　Ｔｒｐ　Ｇ１１ｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　λｍ＊　Ｃ１ｒ ＋　７？、：　入ＩＦＩ　Ｉｌｅ　τｈｒ　ＰＭ　５ａｔＬ釣　ＶａＬ　Ｇｌｕ 　１１＊　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　！ｌ＠　Ｇｌｙ　ＰＭ　ＡＬａ　Ｐｒｐ　？ｈｒ　 ＬＹＩ　Ｇ１１ｌ　Ｌｙｓ（２）　配列番号１４の情報４ （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ＝８アミノ酸 （Ｂ）　型　アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）　配列・配列番号１４： （２）　配列番号１５の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ｃ）　トボロノー：ｉ！！Ｊｆ状 （ｘｌ）　配列　配列番号１５： 時間（分） ＦＩＧ、　４Ａ 時開（分） ＦＩＧ、　４Ｂ 特開（升） ＦＩＧ、　４Ｃ 時間（分） 特Ｖ（丹） ＦＩＧ、　６ ＨＩＶ−２）：”ｌ（３，７ 要約書 新規に単離された生理学的に活性なポリペプチド、ならびにその単離ポリペプチ ドに対する抗体を提供する。これらのポリペプチドおよび抗体の製造法および医 薬としての使用法をも提供する。

―原ｒ詰１？ｌＩ）　ｌ−一一一一一でクト−１！■−ニュー４６８番

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）ＣＶＫＬＴＰＬＣＣＮＴＳＶＩＴＱＡＣ［配列番号１］および約２８ア ミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基：ｂ）ＰＩＨＹＣＡＰＡＧＦＡＩＬＫＣ ＮＮＫＴＦＮＧＴＧＰＣＴＮＶＳＴＶＱＣＴＨＧＩＲＰ［配列番号２］および約 ４５アミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基； ｃ）ＣＮＮＫＴＦＮＧＴＧＰＣ［配列番号３］および約２２アミノ酸残基未満を 含有するアミノ酸残基； ｄ）ＣＡＰＡＧＦＡＩＬＫＣＣＴＮＶＳＴＶＱＣ［配列番号４］および約３０ア ミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基；ｅ）ＰＩＨＹＣＣＴＨＧＩＲＰ［配列 番号５］および約２２アミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基； ｆ）ＧＧＤＰＥＩＶＴＨＳＦＮＣＧＧＥＦＦＹＣＮＳＬＰＣＲＩＫＱＦＩＮＭＷ ＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧ［配列番号６］および約６ ５アミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基；ｇ）ＣＧＧＥＦＦＹＣＣＲＩＫＱ ＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣ［配列番号７］および約４５ アミノ酸残基未満を含有するアミノ酸残基；ｈ）ＣＡＳＤＡＫＡＹＤＴＥＶＨＮ ＶＷＡＴＨＡＣ［配列番号８］および約３０アミノ酸残基未満を含有するアミン 酸残基；および、ｉ）ＴＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫＡＹＤＴＥＶＨＮＶＷＡＴＨＡＣ ＶＰＴＤＰＮ［配列番号９］および約５０アミノ酸残基未満を含有するアミノ酸 残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基からなる単離された環化ポリペプ チド配列。
2. ２．第１項の環化ペプチドおよび医薬的に許容される賦形剤からなる滅菌組成物 の治療的有効投与量をＨＩＶ感染を有するかもしくはその危険にある患者に投与 することからなるＨｉＶ感染の予防または治療方法。
3. ３．治療的投与量が約０．５×１０−８〜５×１０−９Ｍである第２項の方法。
4. ４．組成物がさらに佐剤を含有する第２項の方法。
5. ５．第１項の単離された環化ポリペプチドが含有する抗原決定基に対する抗体。
6. ６．細胞毒素と結合した第５項の抗体。
7. ７．検出可能なマーカーまたは水不溶性マトリックスに共有結合した第５項の抗 体。
8. ８．滅菌された医薬的に許容される賦形剤中の第５項の抗体。
9. ９．ａ）残基１〜８０： ｂ）残基８〜１８０； ｃ）残基１６５〜２６０； ｄ）残基１６０〜２６０； ｅ）残基２６０〜３１０；および、 ｆ）残基３２０〜４７９、 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＩＶｅｎｖポリペプチドの決 定基と免疫学的に交差反応する１または複数の抗原決定基を有する単離されたポ リペプチド。
10. １０．ａ）残基１〜８０； ｂ）残基８〜１８０； ｃ）残基１６５〜２６０； ｄ）残基１６０〜２６０； ｅ）残基２６０〜３１０；および、 ｆ）残基３２０〜４７９、 かりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株のＨＩＶ ｅｎＶポリペプチドの決定基と免疫学的に交差反応する１または複数の抗原決定 基を有する単離ポリペプチドに対する抗体。
11. １１．細胞毒素に結合した第１０項の抗体。
12. １２．検出可能なマーカーまたは水不溶性マトリックスに共有結合した第１０項 の抗体。
13. １３．滅菌された医薬的に許容される賦形剤中の第１０項の抗体。
14. １４．第５項の抗体および医薬的に許容される賦形剤からなる滅菌組成物の治療 的有効投与量をＨＩＶ感染を有するかもしくはその危険にある患者に投与するこ とからなるＨＩＶ感染の予防または治療方法。
15. １５．該抗体が細胞毒素に結合している第１４項の方法。
16. １６．第１０項の抗体および医薬的に許容される賦形剤からなる滅菌組成物の治 療的有効投与量をＨＩＶ感染を有するかもしくはその危険にある患者に投与する ことからなるＨＩＶ感染の予防または治療方法。
17. １７．該抗体が細胞毒素に結合している第１６項の方法。