KR20030064377A - Ｔ 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상에서 T 세포 매개 병증을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 적어도 한가지 및(또는) 두가지 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 각 키메라 단백질은 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 특정의 T 세포로부터의 TCR의 V_α또는 V_β영역의 적어도 일부, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이뮤노글로불린 V_α및(또는) V_β쇄를 코딩하는 유전자 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자를 단리하여 발현 벡터내에 삽입한다. 발현 벡터를 곤충 세포주에 도입하여 키메라 단백질을 제조한다. 항체 친화성 컬럼을 사용한 다음, 면역원성 운반체인 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH)에 화학적으로 연결하여 키메라 단백질을 정제한다. 컨쥬게이트는 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 특정 T 세포로부터 특이적으로 생성된 키메라 단백질을 포함하기 때문에, 사이토카인, 예를 들어 과립구-대식세포-CSF, 또는 케모카인의 존재 또는 부재하에 상기 대상에게 투여되는 경우, 면역 반응을 유도하여 T 세포 매개 병증을 개선시킬 수 있다.

Description

Ｔ 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 방법 및 조성물 {Method and Composition for Altering a T cell Mediated Pathology}

관련 출원

본원의 우선권은 미국 가출원 제60/224,723호 (발명의 명칭: "Method for Producing an Idiotypic Vaccine"), 미국 가출원 제60/224,722호 (발명의 명칭: "Expression Vectors for Production of Recombinant Immunoglobulin" 및 미국 가출원 제60/266,133호 (발명의 명칭: "Method and Composition for Altering a T Cell Mediated Pathology")이다.

본 발명은 전체적으로 면역학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 T 세포 악성종양 및(또는) 자가면역 질환과 같은 T 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

면역시스템은 항체-매개 반응 및 세포-매개 반응 둘 다를 나타낸다. 각 유형의 면역 반응은 특정한 유형의 림프구, 즉 B 세포 (항체-매개 반응의 경우) 및 T 세포 (세포-매개 반응의 경우)에 의해 조절된다. T 세포는 외래 단백질 (항원)의 일부가 주조직 적합 결합체 분자 ("MHC"), 전형적으로 항원 제시 세포 ("APC") (항원은 이 APC 내에서 단편으로 분해되어 그의 MHC에 결합된 채로 APC의 표면에 제시됨) 상의 MHC와 결합할 때 외래 단백질 (항원)의 일부에 결합한다.

T 세포 림프종은 결국 면역계의 기능 손상을 일으키는 부적절한 T 세포 복제로부터 발병하는 T 세포 매개 병증이다. T 세포 림프종은 현재 이용가능한 약물로는 효과적으로 치료하기 어려우며, 의사의 치료 이외에도 추가의 치료 전략이 요망된다.

다른 T 세포 매개 병증으로는 숙주 자신의 면역계가 그 자신의 조직을 공격하는 자가면역 질환으로 분류되는 다수의 인간 질병을 들 수 있다. T 세포는 면역계의 주요 조절자의 하나이며, 상기 자가면역 질환에 직간접적으로 영향을 준다. 상기 자가면역성 질환의 예로는 류마티스성 관절염 (RA), 중증 근무력증 (MG), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 자가면역성 갑상선염증 (하시모또 (Hashimoto's) 갑상선염증), 그레이브 (Graves') 병, 염증성 장질환, 자가면역성 포도막 망막염, 다발성근염 및 여러 유형의 당뇨병을 들 수 있다. 이러한 자가면역성 질환에 대한 현재의 치료로는 이 질환을 치료하지 못하며, 다만 증상을 치료할뿐이다.

현재 상기 질환 및 기타 자가면역성 질환은 T 세포 수용체 (TCR)의 MHC/자가항원 (또는 비-자가항원) 결합체로의 결합에 의해 자극된 T 헬퍼 세포의 작용을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이러한 자가면역성 질환의 가능한 치료는 MHC/항원 결합체와 TCR의 상호작용을 파괴하여 달성할 수 있다.

대부분의 성숙 T 림프구의 표면에 존재하는 TCR은 가장 통상적으로는 α및 β쇄를 포함하는 헤테로이량체 전체 막 단백질이다. TCR의 전체 3차원 구조는 각각의 α및 β쇄가 항원을 인식하는 작용을 하는 아미노 말단의 가변 (V) 영역 및 인식 반응을 세포의 내부로 신호화하는데 중요한 카르복시 말단의 불변 (C) 영역을 포함한다는 점에서 B 세포상의 세포 표면 결합 이뮤노글로불린 (Ig)의 구조와 유사하다. β쇄는 또한 다양성 (D) 및 연결 (J) 유전자 단편에 의해 코딩되는 추가의 아미노산을 포함한다. 이러한 V, D, J 및 C 유전자 단편은 염색체상에서 다른 분리된 부위에 위치한다. V_β, D_β, J_β및 C_β유전자 단편을 조합하여 β쇄를 코딩하는 기능적 전사 단위를 생성시킨다. 기능적 α쇄 전사 단위는 V_α, J_α및 C_α단편의 재조합에 의해 형성된다. 림프구 클론에서 V_α, J_α및 C_α유전자 단편에 더하여진 V_β, D_β, J_β및 C_β유전자 단편의 특이적 재조합은 특정 림프구에만 존재하는 특이적 단백질 결정자인 이디오타입 (Id)을 형성시킨다.

TCR 분자를 이뮤노글로불린 분자와 구별짓는 중요한 차이점이 존재한다. 이뮤노글로불린은 일반적으로 그의 리간드를 용액상에서 B 세포 항원 수용체 또는 분비 분자로 인식하지만, TCR은 리간드를 다른 세포의 세포 표면에 존재하는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자와 결합하는 단백질 항원 유래의 펩티드 단편으로만 인식한다. 또한, 이뮤노글로불린과는 달리, 분비 TCR 쇄를 생성시키는 TCR mRNA의 다른 스플라이싱은 일어나지 않으며, 따라서 TCR 분자는 T 세포 표면상의 전체 막 단백질로서만 존재한다. 마지막으로, T 세포가 항원 인식 이후에 활성화될 때, 체세포 돌연변이를 수행하여 그의 리간드에 대한 친화성을 증가시키는 B 세포내의 이뮤노글로불린의 V-유전자 단편과는 달리, TCR 가변 영역 유전자 단편의 과다돌연변이는 일어나지 않는다.

자가면역질환에 대한 폭넓은 연구를 기초로 하여, T 세포 및 이들의 발현된 TCR 쇄는 다른 T 세포의 면역조절의 대상일 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다 (Vandenbark et al., "Human TCR as antigen: Homologies and potentially cross-reactive HLA-DR-2 restricted epitopes with the AV and BV CDR2 loops," Critical Reviews in Immunol., 20:57-83, 2000). 현재, TCR 쇄의 펩티드 단편은 효소적으로 처리되며, MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자 둘다와 결합하는 활성 T 세포의 세포 표면에 존재하는 것으로 생각된다. MHC 클래스 II 분자는 활성화 이후의 T 세포에만 존재하며, 최근의 증거는 TCR 펩티드 제시가 활성화 이후에 발현이 상향조절되는 MHC 클래스 I 분자의 하위군을 통해 일어난다는 사실을 시사한다 (Ware et al., Immunity 2:177-184, 1995; Jiang et al., Immunity 2:185-94, 1995). 이러한 MHC/TCR-펩티드 착물은 MHC 클래스 I 제한된 CD8⁺및 MHC 클래스 II 제한된 CD4⁺이펙터 T 세포 형태로 자가-조절성 면역을 유도한다. T 세포 매개 자가면역 질환의 상황에서 선택된 TCR 펩티드 백신의 면역조절 특성에 대하여 보고된 바 있다 (Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507-10, 1997). 또한, 전체 TCR 쇄는 T 세포에 클론상으로 분포되어 있기 때문에 (B 세포의 클론상 이뮤노글로불린과 같이), 원형의 기능성 TCR은 T 세포 림프종에 대한 잠재적인 종양 특이적 항원의 후보가 된다. 항원으로 원형 TCR을 이용하는 잠재적인 단점들 중에는 α및 β쇄의 불변 영역에 대하여 면역 반응을 나타내는 것으로부터 발생할 수 있는 합병증이 있다.

TCR 쇄에 대하여 특이적인 면역조절 세포 매개 반응은 TCR 쇄의 가변 영역에서 생식세포 코딩된 결정자에 대하여 지시되는 것으로 보인다. TCR 쇄는 Ig 분자와 유사하게 돌연변이되기 어렵기 때문에, 일반적인 TCR 쇄의 치료 용도는 동물 연구에서의 실험적 증거에 의해 제안된다. 박테리아에서 생산된 분비 TCR β쇄 (Kumar, J. Immunol 159:5150-56, 1997), TCR β쇄를 발현시키는 백시니아 바이러스 구조물 (Chundru, J. Immunol. 156:4940-45, 1996), 또는 단일 TCR β쇄를 코딩하는 "네이키드 (naked)" DNA 구조물 (Waisman, Nat. Med. 2:899-905, 1996)을 이용한 백신접종은 모두 면역화 TCR β쇄에 대하여 지시되는 조절성 T 세포 반응을 유도하였다.

T 세포 매개 질병을 치료하기 위한 치료제로서 정해진 화학적 특성을 갖는 특이적 TCR 모티프를 기초로 한 펩티드 백신의 용도를 시험하였다. 몇몇 연구자들은 TCR 쇄의 프레임워크/CDR 영역 유래의 펩티드가 특정 질병 상태에서 과다발현된 TCR 쇄로부터 유래한 펩티드로 치료하는 경우 동물에서 자가면역 병증의 발병을 예방할 수 있다는 것을 알아내었다. 이는 T 세포가 그 자신의 내부 TCR 쇄를 프로세싱하며, 계속되는 T 세포-T 세포 상호작용이 병원체 세포를 조절하는 작용을 할 수있도록 하는 방식으로 TCR 쇄를 다른 T 세포로 다시 제공한다. 그러나, TCR 펩티드 인식은 TCR 쇄가 MHC 분자와 결합된 표적 T 세포의 표면에 제시되는 펩티드 단편으로 프로세싱될 것을 요구하기 때문에, 특정 TCR로부터의 어떤 펩티드가 임상 상황에서 효과적일 것인지를 미리 예상하기란 극히 어렵다. 이는 근친교배 설치류에서 TCR 펩티드에 대한 MHC 클래스 II 제한된 반응을 입증하는 연구 조사에 의해 예증된다 (Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507-10, 1997, supra). 따라서, 대부분의 단백질과 유사하게, V_β서열 및 MHC는 둘 다 어떤 에피토프가 T 세포를 자극하는지를 결정하며, 관련 TCR 펩티드가 존재하는 V_β아미노산 서열을 예상하는 분명한 규칙은 없다. 이러한 시도는 인간 집단에 존재하는 다양한 정도의 MHC 다형성에 의해 혼합된다.

T 세포 매개 면역 반응을 조절하는 TCR 이디오타입의 제조가 어려운 것은 TCR이 전체 막 단백질이며, 통상적으로 가용성 단백질로 합성 및 분비되지 않기 때문이다. 따라서, 치료 용도로 사용하기 위해 병원체 세포, 예를 들어 종양 세포로부터 충분량의 TCR을 통상적으로 정제하는 것은 가능하지 않다.

곤충 세포를 사용하여 분비 형태의 헤테로이량체 TCR을 대량으로 제조하려는 시도가 수행되었다. 이러한 분비성 분자는 전체 V_αJ_αC_α/V_βD_βJ_βC_β세포외 도메인을 포함하였으며, 형태적으로 특이한 항-TCR V_β항체를 사용한 검출을 기초로 정확하게 폴딩되었다. 그러나, 분비성 분자의 생산 수준은 적을 수 있다. 다른 연구자들은 다양한 방법을 이용하여 재조합 TCR 쇄를 제조하였으며, 이들은 모두 그의동족체 파트너인 MHC+ 펩티드를 인식하는 기능성 TCR을 생성하는 가용성 헤테로이량체 구조물을 형성하기 위한 것이다.

여러가지 다른 방법을 이용하여 치료 목적의 가용성 TCR 부분을 제조하기 위한 노력은 다른 중요한 문제에 직면하게 되었다. 이와 같은 관련된 노력으로는 (1) 이. 콜라이에서 봉입체 (inclusion body)로부터 정제된 다음 재폴딩될 수 있는 단쇄 Fv 구조물의 제조 (Kurucz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:3830-34, 1994); (2) 박테리아에서 재조합 TCR 분자의 제조 (Kumar et al., J Immunol. 159:5150-56, 1997; Offner et al., J Immunol. 161:2178-86, 1998; Novotny et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8646-50, 1991), (3) TCR 가변 영역에 더하여 TCR 불변 영역 전부 또는 거의 전부와, 포유동물 세포로부터 분비될 수 있는 Ig 불변 영역 사이의 융합에 의해 형성된 키메라 단백질의 생산 (Gregoire et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8077-81, 1991; Weber et al., Nature 356:793-96, 1992; Eilat, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:6871-75, 1992), (4) 포스파티딜 이노시톨-특이적 포스포리파제 C의 작용에 의해 절단될 수 있는 포스파티딜 이노시톨 글리칸 연결을 통한 포유동물 세포 표면상 TCR의 세포질외 도메인의 발현 (Lin et al., Science 249:677-79, 1990; Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12654-58, 1994; Okada et al. J Immunol., 159:5516-27, 1997), 및 (5) 곤충 세포에서 분비 단백질로서 단일 또는 헤테로이량체의 완전한 TCR 쇄의 발현 (Kappler et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:8462-66, 1994)을 들 수 있다. 박테리아를 이용하는 각 방법과 관련된 단점으로는 박테리아에서 제조된 용이한 높은 수율의 잠재적인단백질이 확실히 용해되며 내독소에 의해 오염될 수 있다는 점을 들 수 있다. 포유동물 세포에서 제조된 단백질의 경우, 바이러스 감염에 대한 염려가 있다. 인지질-결합 단백질을 정제하는데 있어서의 어려움과 더불어 이러한 문제점으로 인해 상기와 같은 방법은 임상 상황에서 훨씬 적은 관심의 대상이 된다.

이. 콜라이에서 제조된 항체는 목적하는 결합 특이성을 코딩하는 유전자를 확인하는데 있어서의 유용성에도 불구하고 일반적으로 치료에 사용하기에는 유용하지 않다는 추가의 문제점이 따른다. 통상적으로, 항체의 항원 결합 단편인 Fab 또는 Fv만이 박테리아에서 분비된다 (예를 들어, 문헌 (Kurucz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:3830-34, 1994) 참조). 드물게, 전체 쇄 사량체 IgG가 이. 콜라이에서 생산되는 경우, 항체는 부적절하게 글리코실화된다. 적절하게 글리코실화되지 않으면, 항체는 수동 면역요법을 강력하게 만드는 항체-지시된 세포의 세포독성 (ADCC)의 세포용해 활성 및 보체 활성을 개시하지 않을 것이다. 한편, 포유동물 발현계는 글리코실화된 항체를 제조한다. 그러나, FDA의 CBER 부에서 "고려할 점 (Points to Consider)"에 대한 최근의 변화는 포유동물 세포 발현계에서 생산되는 모노클로날 항체와 관련된 바이러스 감염에 대한 관심사를 분명하게 나타낸다. 또한, 포유동물 발현계에서 생산되는 임의의 조작된 항체는 상당히 고가일 것으로 예상된다 (투여 당 미화 1500 달러 내지 5000 달러).

바쿨로바이러스 발현계는 이. 콜라이 및 포유동물 세포에서 항체를 생산하는 우수한 대안이다. 바쿨로바이러스 시스템을 이용하여 진핵 세포에서 생물학적으로 활성인 단백질을 높은 수율 (1-100 mg/L)로 생산할 수 있다 (Haseman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3942-46, 1990). 바쿨로바이러스/곤충 세포계는 재조합 단백질이 원핵세포에서 과다발현되는 경우 종종 직면하는 용해도 문제를 회피한다. 또한, 곤충 세포는 진핵 세포에 존재하는, 정확한 폴딩, 디술피드 형성, 글리코실화, β-히드록실화, 지방산 아실화, 프레닐화, 인산화 및 아미드화를 일으키는 번역 후 변형 기작을 포함한다. 바쿨로바이러스 발현계로부터 인간 결장직장 암세포를 인식하는 기능성 글리코실화 모노클로날 항체를 생산하는 것은 최근에 이르러 입증되었다 (Nesbit, J. Immunol. Methods, 151:201-208, 1992). 이 바쿨로바이러스에 의해 생성된 항체는 ADCC를 매개하는 것으로 밝혀졌지만, 대조적으로 박테리아에서 제조된 항체는 글리코실화되지 않으며, 따라서 검출가능한 ADCC 활성을 갖지 않는다.

어떤 경우, 생물학적으로 활성인 단백질의 발현을 위해 바쿨로바이러스 시스템을 이용하는 것은 과도한 단백질용해 분해 없이 재조합 단백질을 효과적으로 용해시킬 수 없음으로 인해 제한되었다. 곤충 세포에서 재조합 단백질의 발현이 직면하는 용해도 및 단백질용해 문제를 회피하기 위해, 생물학적으로 활성인 단백질을 효율적으로 분비하는 바쿨로바이러스 전달 벡터를 개발하였다. 숙주 곤충 세포로부터 재조합 단백질의 분비를 촉진시키는 이러한 벡터는 폴리헤드린 프로모터 하류의 기능성 분비 리더 서열을 삽입시켜 제작한다. cDNA 서열의 프레임내 삽입은 재조합 단백질을 분비 경로로 지시한 이종 신호 서열을 포함하는 단백질을 합성시킨다. 인간 및 곤충 리더 서열을 모두 시험하여 곤충 세포로부터 이종 단백질의 분비를 최대화하였다. 인간 태반의 알칼리 포스파타제 신호 서열(MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG (서열 1); DNA 서열: ATG GTG GGA CCC TGC ATG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTA GGC CTG AGG CTA CAG CTC TCC CTG GGC (서열 2)) 및 꿀벌 멜리틴 신호 서열 (MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 3); DNA 서열: ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATG GTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG (서열 4))는 모두 많은 박테리아 및 인간 단백질의 분비에 유용한 것으로 입증되었다 (Mroczkowski et al.,J Biol. Chem. 269:13522-28, 1994 and Tessier et al., Gene 98:177-83, 1991).

바쿨로바이러스 발현계의 사용은 (McKeever et al. (J Exp. Med 184:1755-68, 1996) 마우스 IgG₁중쇄의 힌지, CH₂및 CH₃도메인에 연결된 TCR 쇄 (V_α-C_α및 V_β-C_β)의 세포외 도메인으로 구성된 키메라 단백질을 형성시킬 수 있었다. 췌장 β-세포 항원에 대해 특이적인 T 세포 클론으로부터 생성된 가용성 TCR-IgG₁키메라 단백질을 사용하여 비만하지 않은 암컷 당뇨병 (NOD) 마우스를 면역화하였다. 교배 후에, 이 마우스의 자손을 분석하여 모계 전달된 항-TCR 항체의 당뇨병발생 활성에 대한 효과를 결정하였다. 이러한 연구는 TCR의 α 또는 β 쇄의 가변 영역이 가용성 형태로 투여되는 경우 그가 유도된 종의 마우스에서 면역원성일 수 있음을 입증하였다. 이 연구는 또한 가용성 TCR-IgG₁으로의 면역화가 천연 클론형 에피토프를 인식하는 항체의 생산을 자극할 수 있음을 입증하였다. 맥키버 (McKeever) 등은, 비교적 간단한 발현 및 정제 전략을 이용하여 α 및 β 쇄의 모두를 포함하는 가용성 TCR-IgG₁단백질을 제조할 수 있음을 분명히 입증하였으며, 여기서 TCR 부분은 면역원성이며 TCR의 기능적으로 활성인 세포 표면 형태로 존재하는 것과 교차 반응성인 클론형 결정자를 보유한다.

여러 다른 연구자들은 또한 다양한 방식으로 TCR 분자를 Ig 쇄로의 분자 융합물로 발현시켰다. 그러나, 이러한 모든 연구에서는 전체 TCR 구조물, 즉 가변 및 불변 영역을 사용하여 Ig 백본의 여러 부분과 융합시켰으며, 이들은 모두 TCR 가변 영역의 인식 기능을 재생시키기 위한 것이다. 또한, 다양한 형태의 TCR 쇄를 동물 연구에서 백신으로 사용하여 자가면역 질환을 예방/치료할 수 있음이 입증되었다. 예를 들어, 오까다 (Okada) 등 (J Immunol., 159:5516-27, 1997)은 포유동물 세포로부터 얻어진 가용성 TCR 쇄를 사용하여 마우스에서 T 세포 종양을 치료할 수 있음을 보여주었다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 이러한 TCR 분자의 생산은 어려우며, 생산 수준은 낮았다.

또한, TCR 단백질의 용도는 수의학 분야에서 치료 가치를 가질 것으로 예상된다 (국제 특허 출원 제PCT/US99/17309호, WO 00/06733, 1999년 7월 29일 출원).

<발명의 개요>

본 발명은 환자에서 T 세포 매개 병증을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 갖는 1종 이상의 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 존재하는 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 링커 영역 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 TCR 불변 영역의 부분은 약 3개 내지 약 30개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어진다. 링커 영역은 TCR 불변 영역의 부분을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 불변 영역의 부분은 불변 영역의 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인 잔기까지를 포함하는 아미노산 잔기를 포함하였다. 이 조성물에 사용되는 V_β또는 V_α쇄는 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 T 세포로부터의 특정 TCR과 결합하였다. 상기 조성물을 환자에게 투여한 다음, 환자에서 T 세포 매개 병증이 개선되었다.

본 발명은 또한 두가지 다른 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 투여하여 환자에서 T 세포 매개 병증을 개선시키는 방법을 제공한다. 각 키메라 단백질은 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부를 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 존재하는 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 링커 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 TCR 불변 영역의 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 링커 영역은 TCR 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질의 불변 영역의 부분은 불변 영역의이뮤노글로불린 폴드에서 첫번째 시스테인 잔기의 아미노 말단 측면에 대한 아미노산 잔기의 일부 또는 전부를 포함한다. 키메라 단백질의 부분인 V_β및(또는) V_α쇄는 T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터의 특정 TCR과 결합한다.

환자 유래의 특이적 V_α및(또는) V_β쇄를 포함하는 특정의 TCR 단백질을 치료 조성물로 개발할 수 있다. 의심되는 자가 항원을 이용하여 자가면역 T 세포 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 중증 근무력증 (MG), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 자가면역성 갑상선염증 (하시모또 (Hashimoto's) 갑상선염증), 그레이브 (Graves') 병, 염증성 장질환, 자가면역성 포도막 망막염, 다발성근염 및 여러 유형의 당뇨병과 같은 자가면역 T 세포 병증에 관여하는 T 세포를 선택적으로 자극하여 확장시킬 수 있다. 또는, 자가면역 공격을 수행하는 조직으로부터 단리된 T 세포는 T 세포 성장 인자, 즉 IL-2, IL-4를 사용하여 선택적으로 확장시킬 수 있다. 도면, 도식 및 표를 포함하여 전체가 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Wilson et al. (J Neuroimmunol. 76:15-28, 1997))에서는 다발성 경화증과 관련된 T 세포를 이러한 방식으로 특성화한다. 다른 T 세포 매개 병증과 관련된 T 세포는 윌슨 (Wilson) 등에 의해 기재된 방법에 의해 변경되는 것을 특징으로 할 수 있다. 소수의 병원성 T 세포를 정제한 다음, 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 PCR에 의해 이러한 세포에 의해 발현된 T 세포 수용체의 가변성 부분을 클로닝할 수 있다. 클로닝되면, T 세포 병증에 특이적으로 관여하는 수용체의 V_α및(또는) V_β부위를 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 바쿨로바이러스계에서 발현될수 있는 키메라 단백질을 제조할 수 있다.

상기 조성물 및 키메라 단백질에 사용되는 이뮤노글로불린 불변 영역은 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂, IgM, IgD, IgE 중쇄, 및 κ또는 λ경쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 일부일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 키메라 단백질만이 이뮤노글로불린 불변 영역과 함께 TCR의 V_β또는 V_α쇄를 포함한다. 키메라 단백질의 예에는 V_β-IgG_γ1, V_α-κ 또는 V_α-λ, 또는 V_α-IgG_γ1, V_β-κ 또는 V_β-λ가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 이뮤노글로불린 불변 영역과 함께 V_β및 V_α쇄를 각각 포함하는 두 가지 키메라 단백질을 함유한다. 키메라 단백질의 예로는 V_β-IgG_γ1및 V_α-κ, 또는 V_β-IgG_γ1및 V_α-λ 및 V_α-λ, 또는 V_α-IgG_γ1및 V_β-κ, 또는 V_α-IgG_γ1이 포함된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 링커 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 어떤 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 TCR 불변 영역의 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 불변 영역의 부분은 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인 잔기의 아미노 말단 측면에 대한 아미노산 잔기의 일부 또는 전부를 포함한다. 그러한 예로는 V_β-C_β-IgG_γ1및 V_α-C_α-κ, 또는 V_β-C_β-IgG_γ1및 V_α-C_α-λ, 또는V_α-C_α-IgG_γ1및 V_β-C_β-κ, 또는 V_α-C_α-IgG_γ1및 V_β-C_β-λ를 들 수 있다.

본 발명은 재조합 DNA 기술 및 발현 시스템을 사용하여 키메라 단백질을 생산하는 방법도 제공한다. 이 방법에는 (a) T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터 TCR의 V_β또는 V_α쇄를 코딩하는 유전자를 단리하는 단계, (b) TCR의 V_β또는 V_α쇄를 코딩하는 유전자 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입하여 키메라 단백질이 발현되도록 하는 단계, (c) 발현 벡터를 곤충 세포주 내로 도입하여 그의 발현을 허용함으로써 키메라 단백질을 생산하는 단계, 및 (d) 상기 키메라 단백질을 단리하는 단계를 포함한다. 키메라 단백질을 생산하는 방법은 TCR의 V_β또는 V_α쇄를 코딩하는 유전자, 및 제2의 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입하여 제2의 키메라 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. TCR의 V_β또는 V_α쇄를 코딩하는 단리된 유전자는 약 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 TCR의 불변 영역의 일부를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 환자에서 T 세포 매개 병증을 개선하기 위한 조성물을 추가로 제공한다. 이 조성물은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 갖는 하나 이상의 키메라 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 약 30개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 TCR 쇄의 불변 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 TCR 불변 영역의 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 TCR 불변 영역의 부분은 불변 영역의 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인 잔기의 아미노 말단 측면에 대하여 아미노산 잔기의 일부 또는 전부를 포함한다. 키메라 단백질의 부분인 V_β또는 V_α쇄는 T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터의 특정 TCR과 결합한다. 조성물은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부 및 제2 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 갖는 제2 키메라 단백질을 추가로 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 링거 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 링커 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 TCR 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질에서 불변 영역의 부분은 불변 영역의 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인 잔기의 아미노 말단 측면에 대하여 아미노산 잔기의 일부 또는 전부를 포함한다. 제2 키메라 단백질의 부분인 V_β또는 V_α쇄는 T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터의 특정 TCR과 결합한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 두 가지 키메라 단백질을 포함한다.제1 키메라 단백질은 이뮤노글로불린 IgG_γ1의 전체 V_β영역 및 인간 불변 영역을 포함하고 (TCR V_β-IgG_γ1), 제2의 키메라 단백질은 전체 V_α및 인간 κ또는 λ불변 영역을 포함한다 (TCR V_α-κ 또는 TCR V_α-λ). 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키메라 단백질들 중 하나 또는 둘 다는 TCR의 V_β또는 V_α영역의 적어도 일부, 링커 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질의 각각 또는 모두의 링커 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 TCR 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 조성물은 두가지 키메라 단백질을 포함하는데, 첫번째 하나는 전체 V_β영역, 30개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 TCR β쇄 불변 영역 (C_β)의 일부 및 이뮤노글로불린 IgG_γ1의 인간 불변 영역으로 이루어진다 (TCR V_βC_β(1-30)-IgG_γ1)). 바람직한 실시양태에서, 사용된 C_β의 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 제2 키메라 단백질은 전체 V_α영역, 30개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 TCR α쇄 불변 영역 (C_α)의 일부 및 인간 κ불변 영역으로 이루어진다 (TCR V_αC_α(1-30)-κ)). 바람직한 실시양태에서, 사용된 C_α의 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 조성물은 환자의 T 세포 유래의 특정 TCR로부터의 V_β또는 V_α쇄, 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 포함하는 단일 키메라 단백질을 포함한다. 그러한 예로는 키메라 단백질 V_β-IgG_γ1, V_α-κ 또는 V_α-λ, 또는 V_α-IgG_γ1, V_β-κ, 또는 V_β-λ를 들 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질은 TCR의 V_β또는 V_α쇄의 적어도 일부, 링커 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 단백질 각각 또는 모두의 링커 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 TCR 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 키메라 단백질을 발현시키는 데 사용된 발현 벡터는 바쿨로바이러스 벡터이다. 이 벡터는 프로모터, 분비 신호 서열 및 키메라 단백질을 각각 갖는 두 개의 발현 카세트를 함유한다. 한 발현 카세트는 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열에 연결된 바쿨로바이러스 AcNPV p1O 프로모터를 포함한다. 다른 발현 카세트는 인간 태반 알칼리 포스파타제 신호 서열에 연결된 폴리헤드린 프로모터를 갖는다. 상기 프로모터 및 신호 서열 이외에, 당업자에게 알려진 다른 프로모터 및 신호 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대상 환자 유래의 이뮤노글로불린 유전자와 결합된 내부 신호 서열이 사용된다. TCR의 V_β또는 V_α쇄, 링커 영역, 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자는 따로 및(또는) 함께 상기 바쿨로바이러스 벡터 발현 카세트 내로 삽입하여 하나 또는 두 개의 키메라 단백질을 발현시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, V_β또는 V_α쇄와 함께 IgG_ν1과 같은 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역을 폴리헤드린 프로모터로 조절한다.

생산된 키메라 단백질은 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역의 경우 단백질 A, 카파 경쇄의 경우 단백질 L, 및(또는) 이뮤노글로불린 결합 도메인에 결합하는 임의의 다른 단백질과 같은 항-이뮤노글로불린 항체 또는 Ig-결합 단백질을 포함하는 친화 컬럼을 사용하여 정제한다.

본 발명은 키메라 단백질을 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 같은 운반 단백질에 공유결합적으로 커플링시키는 것도 고려한다. 본 발명의 조성물은 과립구-단핵구-CSF (GM-CSF)와 같은 사이토카인, 또는 단핵구 주화성 단백질 3 (MCP3)와 같은 케모카인과 함께 환자 내로 투여할 수도 있다. 키메라 단백질(들)을 함유하는 본 발명의 조성물이 T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터 유래된 특정한 TCR에 특이적으로 관련되기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하면 특정한 V_β또는 V_α단편이 포함되는 질환 특이적 이디오타입에 대한 면역 반응이 유도된다. T 세포에 대한 유사한 반응은 V_α또는 V_β단편과 같은 TCR V-영역 단편의 제한된 레파토리를 사용하는 T 세포를 수반하는 자가면역 질환과 관련된다. 따라서, 본 발명의 조성물을 투여하면 환자에서 T 세포 매개 병증 및(또는) 자가면역 질환이 개선된다. 본 발명의 조성물의 투여 경로에는 경구 전달, 흡입 전달, 주사 전달, 경피 전달등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

임의의 도면 및 표를 포함하는 모든 미국 특허 및 출원; 외국 특허 및 출원; 과학 잡지; 책; 및 본 명세서에 기재된 공개문헌은 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 그의 전문이 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

본 발명은 전체적으로 면역학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 T 세포 악성종양 및(또는) 자가면역 질환과 같은 T 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

도 1: T 세포 매개 병증을 앓는 환자로부터 유래된 T 세포의 특정한 TCR의 V_β또는 V_α쇄에 대한 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 일반적인 개요.

도 2: 멀티플 클로닝 부위가 있는 바쿨로바이러스 발현 벡터 p2Bac의 플라스미드 맵 (map).

도 3: 바쿨로바이러스 발현 벡터 p2Bac (서열 5)의 DNA 서열. 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다. p2Bac 벡터는 AcNPV 폴리헤드린 유전자 프로모터 (진뱅크 접근번호 X06637 (서열 44)의 뉴클레오티드 1 내지 120) 및 AcMNPV p1O 프로모터 (진뱅크 접근번호 A28889 (서열 45)의 뉴클레오티드 8 내지 237)를 포함한다.

도 4: 플라스미드 pTRABac/9F12의 DNA 서열. 이 플라스미드는 안정한 인간 세포주 9F12 (서열 41)에 의해 발현되는 중쇄 및 경쇄 (κ)에 대한 유전자를 포함한다. 이 세포주는 파상풍 독소에 특이적인 인간 IgG1/κ항체를 생산한다. 밑줄친 영역은 성숙 9F12 IgG₁(TTTACCC....) 및 카파쇄 (ATCGACA...) 각각을 코딩하는 서열을 나타낸다. 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다.

도 5a: IgG_γ1및 κ 불변 영역이 있는 재조합 바쿨로바이러스 발현 벡터pTRABacHuLC_κHC_γ1의 플라스미드 맵.

도 5b: IgG_γ1및 λ 불변 영역이 있는 재조합 바쿨로바이러스 발현 벡터 pTRABacHuLC_λHC_γ1의 플라스미드 맵.

도 6A: pTRABacHuLC_κHC_γ1의 DNA 서열 (서열 6). 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다.

도 6B: pTRABacHuLC_λHC_γ1의 DNA 서열 (서열 7). 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다.

도 6C: 카파 스터프 (stuff) 프라이머 (서열 42)를 사용한 변형 후의 pTRABacHuLC_κHC_γ1의 DNA 서열. 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다.

도 6D: 람다 스터프 프라이머 (서열 43)를 사용한 변형 후의 pTRABacHuLC_λHC_γ1의 DNA 서열. 이 서열은 5'에서 3'으로 도시되어 있다.

도 7은 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄에 대한 대표적인 단백질 서열이다. 두 서열의 불변 영역에는 밑줄을 그었으며, 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인 잔기에는 두 줄로 밑줄을 그어 표시하였다 (서열 24 및 서열 25).

도 8a는 V_α및 V_β영역에 대한 삽입 부위를 나타내는 IgG_γ1및 κ불변 영역을 사용하는 재조합 바쿨로바이러스 발현 벡터 pTRABacHuLC_κHC_γ1의 플라스미드 맵이다.

도 8b는 V_α및 V_β영역에 대한 삽입 부위를 나타내는 IgG_γ1및 λ불변 영역을 갖는 재조합 바쿨로바이러스 발현 벡터 pTRABacHuLC_λHC_γ1의 플라스미드 맵이다.

도 9는 TCR V_β-Ig 키메라 단백질 제제를 사용하는 종양 보유 마우스의 치료를 나타낸다.

본 발명에서, T 세포 악성종양 및 병증을 치료하기 위해 면역계의 독특한 특성을 변화시켰다. 본 발명에서, 각각의 특이한 TCR V 유전자 족의 5' 말단으로부터 유도된 프라이머 및 TCR 불변 영역 프라이머를 사용하여 T 세포 수용체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하였다. 전형적으로, 이러한 방법은 PCR과 같은 여러 적합한 클로닝 기술 중 하나를 이용한다. α 쇄에 대한 하나 및 β 쇄에 대한 하나로 이루어진 이러한 TCR 불변 영역 프라이머를 사용하여 가변 영역을 클로닝함으로써 V_α또는 V_β및 IgG₁불변 영역으로 이루어진 키메라 단백질을 제조하였다. 또한, 당업자라면 이러한 시스템에 동등하게 사용하여 용이한 서브클로닝을 위한 임의의 한쌍의 항체 가변 영역을 증폭시키는 동등한 결과를 얻을 수 있는 여러 다른 프라이머를 선택할 수 있을 것이다. 또는, 5'RACE와 같은 기술을 이용하여 키메라 단백질을 제조하는 단계로서 TCR 쇄의 가변 영역을 클로닝할 수 있다.

키메라 단백질은 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산되었다. 전체 C_α또는 C_β도메인 모두가 없이 생산된 키메라 단백질은 존재하는 전체α또는 β쇄를 갖는 키메라 TCR/Ig 분자로부터 구별된다. 예를 들어, 이러한 키메라 단백질은 TCR 가변 영역에 대하여 지시되는 형태적으로 특이한 일부 항체, 예를 들어 항-마우스 V_β6 (클론 RR4-7) 및 항-마우스 V_β12 (클론 MR11-1) (PharMingen, San Diego, Ca.)에 의해 인식되지 않는다. 이러한 특이적 키메라 단백질은 치료를 복잡하게 만들 수 있는 통상의 결정자가 자가면역반응을 자극하지 않기 때문에 백신접종에 있어서 우수한 항원인 것으로 예상된다. 또한, 가용성 TCR 키메라 단백질을 제조하기 위한 선행 기술의 시도는 적절한 펩티드/MHC 결합체에 결합시키기 위해 천연 형태의 TCR을 채택한 단백질에 대하여 지시되었다.

본 발명은 T 세포 매개 병증 및 자가면역 질환의 효과적인 치료를 위한 많은 요구를 충족시킨다. 본 발명은 T 세포 발병기전에 관여하는 T 세포의 표면상에 존재하는 특이적 세포 표면 항원 (이디오타입)을 이용한다. 이를 수행하기 위해, 환자-특이적 방식으로 백신을 제조할 필요가 있다. 이러한 백신은 대상 환자에 존재하는 병원성 T 세포에 특이적인 마커로 맞추어짐으로써 정확한 선택성을 제공한다.

본 발명을 특정 환자에 맞게 만들기 위해, 먼저 독특한 항원을 찾아 단리하는 것과, 이 항원을 생산하는 수단이 필요하다. 이러한 항원의 제조는 당업자가 이용할 수 있는 다수의 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 요건에 맞는 최근에 개발된 방법은 신규 바쿨로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용하고 면역요법용 기능성 항체의 효율적인 생산을 위해 최근에 개발되었다 (미국 가출원 제60/244,722호, 발명의 명칭: "Expression Vectors for Production ofRecombinant Immunoglobulin"). 이 바쿨로바이러스 발현 벡터는, 용이한 서브클로닝 및 인간 카파 경쇄 또는 IgG_γ1중쇄를 갖는 키메라 단백질로서의 발현을 위해 임의의 한쌍의 항체 가변 영역을 증폭하는 데 있어서 단지 두 개의 유전자-특이적 프라이머가 필요하도록 디자인하였다. 중쇄 및 경쇄를 분비 경로로 안내하는 이종 분비 신호 서열은 곤충 세포로부터 대량의 활성 이뮤노글로불린을 발현시키기 위해 삽입시켰다. 이 벡터는 인간 태반 알칼리 포스파타제 분비 신호 서열을 통해 분비되는 인간 카파 불변 영역과 프레임내로 임의의 카파 경쇄 가변 영역 (V_L)을 발현시키는 데 유용할 것이고, 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열에 의해 분비되는 인간 IgG_γ1불변 도메인과 프레임내로 임의의 중쇄 가변 영역 (V_H)을 발현시키는 데에도 유용할 것이다. 각각 모노클로날 세포주로부터 유래하거나 파아지 디스플레이 클로닝에 의해 확인된 임의의 마우스 또는 인간 모노클로날 항체는 2단계의 간단한 서브클로닝 이후에 이러한 벡터에서 전체 인간 IgG₁/κ또는 IgG₁/κ로서 쉽게 발현시킬 수 있었다.

본 발명의 한 실시양태에서, 이 바쿨로바이러스 발현 벡터는, 용이한 서브클로닝 및 융합된 V_α쇄, 링커 및 IgG₁중쇄로서의 발현을 위해 임의의 한쌍의 TCR 가변 영역을 증폭하는 데 있어서 단지 두 개의 유전자-특이적 프라이머가 필요하도록 디자인하였다. V_α및 V_β쇄를 분비 경로로 안내하는 이종 분비 신호 서열은 곤충 세포로부터 대량의 키메라 단백질을 발현시키기 위해 삽입시켰다. 이 벡터는 인간태반의 알칼리 포스파타제 분비 신호 서열을 통해 분비되는 Ig 카파 불변 영역과 프레임내로 임의의 TCR α 쇄 가변 영역 (V_α)을 발현시키는 데 유용할 것이고, 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열을 통해 분비되는 IgG₁불변 영역과 프레임내로 임의의 TCR β쇄 가변 영역 (V_β)을 발현시키는 데에도, 또는 그 반대의 경우에도 유용할 것이다.

바쿨로바이러스계를 이용한 재조합 단백질의 발현에 의해 박테리아에서 제조된 단백질과 관련된 많은 단점을 갖지 않는 생물학적으로 활성인 다량의 단백질이 생산되며, 포유동물 세포 사용시의 복잡함을 회피한다. 예를 들어, 시판 바쿨로바이러스 단일 프로모터 벡터 (pVL1392) 또는 이중 프로모터 벡터 (pAcUW51)(이들 둘 다 BD-Pharmingen에서 시판함)를 이용하고, 혈청 무함유 배지를 사용하여 분비 TCR 래트 쇄를 단량체 β쇄 또는 헤테로이량체 αβ 쌍으로 제조하였다. 이러한 쇄의 존재는 ELISA에서 항-C_β불변 영역 포획 항체 (R73, Pharmingen) 및 항-V_β검출 항체 (R78; 항-래트 V_β8.2 또는 HIS 42; 항-래트 V_β16, Pharmingen)를 사용하여 검출할 수 있다. 생산 수준은 약 300 ng/ml인 것으로 결정되었다. TCR 쇄는 천연 형태로 제조 및 분비되며, α및 β쇄는 안정한 디술피드 연결 헤테로이량체를 형성시켰다 (Gold et al., 1997, supra).

특정 단편의 특정한 에피토프를 포함하는 가용성 인간 TCR 단편은 유전 공학 기술을 통해 곤충 숙주 세포에서 생산할 수 있다. 환자로부터 유래된 특정 V_β또는 V_α쇄를 포함하는 가용성 재조합 TCR 단백질은 치료 조성물로서 사용할 수 있다. 이 단백질이 환자 내로 투여되는 경우, 상기 단백질은 생체내에서 T 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 세포 매개 면역 반응을 특이적으로 유도할 것이다.

이 기술은 B 세포 림프종에 의해 발현된 환자-특이적 V_H및 V_L유전자의 신속한 동정 및 클로닝에 이어서 곤충 세포에서 이들을 재조합 I_G1/κ 또는 λ 분자로 발현시키는 것에도 적용한 바도 있다 (미국 가출원 제60/224,723호, 발명의 명칭: "Method for Producing Idiotype-Vaccine"). 이 방법에 의해 생산된 분자는 제형화하여 환자 특이적 방식으로 림프종에 대한 항-이디오타입 세포-매개 면역을 유도하는 데 사용하였다.

용어 "개선하는" 또는 "개선하다"는 T 세포 매개 발병기작을 조정하는 본 발명의 화합물의 능력을 말한다. T 세포 병증을 개선시키는 화합물은 T 세포 매개 병증을 일으키는 세포를 파괴하는 화합물에 대한 항체 반응의 생성, T 세포 매개 병증에 관여하는 세포의 아폽토시스의 유도, T 세포 매개 병증을 일으키는 세포의 추가 성장 및 분열의 억제, T 세포 매개 병증을 일으키는 세포에 대한 세포-매개 면역의 유도, 병원성 T 세포의 활성의 억제를 비롯한 다수의 가능한 메카니즘에 의해 T 세포 매개 발병기작을 조정할 수 있다. 이러한 개선이 일어나도록 하는 정확한 메카니즘은 확인할 필요가 없을 뿐만 아니라, T 세포 매개 병증의 개선은 본 발명의 분자 및 조성물의 첨가로 인한 몇몇 메카니즘에 의해 일어난다.

용어 "T 세포 매개 병증" 또는 "T 세포 병증"은 T 세포의 부적절한 복제 또는 활성으로부터 일어나는 질환 및 증상을 말한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명을 이용하여 T 세포 매개 병증은 T 세포의 부적절한 복제로부터 야기되는 T 세포 림프종인 T 세포 매개 병증을 치료한다. T 세포 림프종은 현재 사용되는 의학적 방법으로 효과적으로 치료하기 어렵다. T 세포의 부적절한 복제를 수반하는 T 세포 병증의 다른 유형에는 만성 및 급성 T 세포 백혈병 및 균상식육종이 포함된다. 다른 바람직한 실시양태는 숙주 자체의 면역 시스템이 숙주 자체의 조직을 공격하는 자가면역 질환, 예컨대, 류마티스성 관절염 (RA), 중증 근무력증 (MG), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 자가면역성 갑상선염증 (하시모또 (Hashimoto's) 갑상선염증), 그레이브 (Graves') 병, 염증성 장질환, 자가면역성 포도막 망막염, 다발성근염 및 여러 유형의 당뇨병이 포함된다. 이들 자가면역 질환에 대한 현 치료법은 이들 질환을 치유하지 못하고, 그 대신에 증상만을 완화시킨다.

용어 "T 세포"는 유기체 (즉, T 세포 매개 병증을 앓지 않는 유기체)의 정상 기능화에 있어서 세포 매개 면역에 관여하는 유기체의 면역 시스템을 구성하는 세포를 말한다.

용어 "병증"은 의사에 의해 비정상적인 것으로 인식되는 유기체 (예를 들어, 인간)의 상태를 말한다. 본 발명에서 치료할 병증은 T 세포의 기능 또는 복제의 비정상을 특징으로 한다.

용어 "환자"는 특정 병증, 보다 구체적으로 T 세포 병증을 치료할 필요가 있는 유기체를 말한다. 이 용어는 임상적 환경 하에서 치료제로 치료할 필요가 있음을 암시하는 특정한 증상 또는 증상들을 제공하는 살아있는 대상체를 말한다. 치료는 일반적으로 의학계에서 허용될 수 있거나 실험적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트 및 마우스를 비롯한 포유동물이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 환자는 인간이다. 환자의 진단은 질환의 진행 과정 동안, 자발적으로, 또는 치료 처방이나 치료 과정 동안에 변경될 수 있다.

"유기체"는 단세포 또는 다세포 유기체일 수 있다. 이 용어에는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이 포함된다. 바람직한 유기체에는 마우스가 포함되는데, 이는 마우스를 치료하거나 진단하는 능력이 종종 인간과 같은 다른 유기체에서 작용할 능력을 암시하기 때문이다. 다른 바람직한 유기체에는 영장류가 포함되는데, 이는 영장류를 치료하거나 진단하는 능력이 종종 인간과 같은 다른 유기체에서 작용하는 능력을 암시하기 때문이다.

용어 "키메라 단백질"은 2종 이상의 다른 단백질로부터 유래된 단편들을 포함하는 단일 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질을 말한다. 키메라 단백질의 단편은 이종성 단백질로부터 유래해야 한다. 즉, 모든 키메라 폴리펩티드의 단편들이 동일한 단백질로부터 유래하지 않는다. 본 발명의 키메라 단백질은 TCR의 V_α또는 V_β쇄의 일부를 포함하는 단백질을 포함하지만, α 또는 β 쇄의 전체 불변 영역을 포함하지 않는다.

용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "단편" 또는 "일부"는 그가 유래된 전장 폴리펩티드보다 길이가 더 짧은, 키메라 단백질에 대한 공급원으로 사용되는 단백질의 아미노산 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 말하는 데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 단편은 아미노산 약 10, 15, 20, 21, 22, 30, 40, 70, 100, 150, 300 또는 450개 길이이다. 이러한 단편들은 천연 폴리펩티드의 1종 이상의 특징 부위를 보유할 수 있는 것임을 이해해야 한다. 이러한 보유되는 특징의 예에는 천연 폴리펩티드 또는 그의 에피토프에 특이적인 항체와의 결합이 포함된다.

용어 "자연" 또는 "천연"은 천연 공급원으로부터 단리된 단백질을 말한다. 따라서, 자연 발생 단백질은 천연 상태로 발견되는 단백질을 말한다. 천연 단백질은 천연 상태로 발견되거나 천연 상태로 합성되는 단백질을 말할 수 있다. 이들 용어들은 본 발명의 바쿨로바이러스 시스템 또는 환자로부터 유래된 세포의 배양물과 같은 생물학적 시스템에 의해 생산되는 단백질에도 적용할 수 있다. 또는, 천연 단백질은 변성되지 않은 단리된 단백질을 말한다. 용어 "천연"은 폴리펩티드 또는 단백질이 천연 상태로 발견되는 유사한 단백질을 닮도록 단독으로 또는 다른 폴리펩티드와 함께 폴딩되는 방식, 또는 천연 상태로 발견되는 유사 단백질을 닮도록 번역 후 수식 ("번역 후 수식")되는 방법을 말한다. 자연 발생 단백질은 단일 환자로부터 유래된 병원체 B 세포에서만 발견될 수 있음에도 불구하고, 이것은 자연 발생 단백질로 간주될 수 있다.

용어 "V_α" 및 "V_β"는 TCR의 폴리펩티드 쇄의 가변 영역, 또는 이러한 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산을 말한다. 당업자는 이들 용어의 의미를 정확히 이해한다. 가변 영역의 정확한 서열은 예측할 수 없고 해당 서열을 단리함으로써 결정해야 한다. 그러나, TCR 유전자로부터의 가변 영역의 여러 하위군이 확인 및 특성화되었다 (문헌 (Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:455-500, Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:501-530, and Clark et al., Immunogenetics, 1995, 42:531-540) 참조). 이러한 V_α및 V_β영역들 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 알파 쇄의 정확한 서열은 TCR α쇄 로커스의 V 영역, J 영역 및 불변 영역의 클론 재배열에 의해 결정된다. 베타 쇄의 정확한 서열은 TCR β쇄 로커스의 V 영역, D 영역, J 영역 및 불변 영역의 클론 재배열에 의해 결정된다. 용어 "V_α" 및 "V_β"는 또한 V_α또는 V_β쇄의 일부 또는 단편을 의미한다. V_α또는 V_β쇄의 단편은 V 영역의 아미노산 약 30개 이상을 포함할 수 있다. V_α또는 V_β쇄의 단편은 또한 V 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함할 수도 있다. "실질적으로 전부"라는 용어는 전체 가변 영역의 약 90% 또는 약 80%를 의미할 수 있다. 용어 "V_α" 및 "V_β"는 또한 하기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 쇄의 기능성 유도체를 의미한다. 용어 "전체 V_α쇄"는 α쇄의 가변 영역의 전부를 의미한다. 용어 "전체 V_β쇄"는 β쇄의 가변 영역의 전부를 의미한다.

용어 "링커 영역" 또는 "링커"는 가변 영역을 코딩하는 서열을, 이뮤노글로불린 불변 영역 분자의 일부를 코딩하는 서열과 연결하는 DNA의 단편을 의미한다. 링커 서열은 편리한 클로닝을 허용하는 합성 서열이거나, TCR의 C_α또는 C_β의 일부일 수 있다. 각 경우에서, 링커 영역은 본 발명의 키메라 단백질에서 이뮤노글로불린 가변 영역의 부분과 불변 영역의 부분 사이의 리딩 프레임을 파괴하지 않을 것이다. "링커 영역"이라는 용어는 또한 링커 영역 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "합성 링커 영역" 또는 "합성 링커"는 T 세포 수용체 유전자 또는 이뮤노글로불린 유전자 이외의 공급원으로부터 얻어진 링커 영역을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 합성 링커는 연구자들에 의해 디자인되어 시험관내에서 합성된다. 합성 링커는 키메라 단백질의 T 세포 수용체 및 이뮤노글로불린 유전자 부분의 오픈 리딩 프레임을 파괴하지 않을 것이다. 링커 영역은 TCR의 C_α또는 C_β의 일부를 포함하며, 이뮤노글로불린 폴드의 불변 영역 개시부와 첫번째 시스테인 잔기 사이에 아미노산의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

용어 "C_α" 및 "C_β"는 TCR 폴리펩티드 쇄의 불변 영역 또는 이러한 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산을 의미한다. 당업자라면 이러한 용어의 의미를 이해할 것이다. "단편" 또는 "일부"라는 용어는 본 발명에서 불변 영역을 의미하는 경우 TCR의 불변 영역의 모두를 포함하지 않지만, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 18, 22, 26 또는 30개의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커 영역에는 1 내지 약 30의 임의의 정수를 포함하여 임의의 코돈수가 존재할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, TCR의 불변 영역의 아미노산 중 약 80% 이하가 존재할 수 있다. 단편은 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인까지 C_α쇄의 처음 22개의 아미노산의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 표시된 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인을 갖는 인간 TCR 알파 쇄의 대표적인 서열이 도 8에 제시되어 있다. 단편은 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인까지 C_β쇄의 처음 30개의 아미노산의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 표시된 이뮤노글로불린 폴드의 첫번째 시스테인을 갖는 인간 TCR 베타 쇄의 대표적인 서열이 도 8에 제시되어 있다. 용어 "C_α" 및 "C_β"는 또한 하기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 쇄의 기능성 유도체를 의미한다.

용어 "TCR" 또는 "T 세포 수용체"는 두 폴리펩티드 쇄, 즉 알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하는, T 세포의 표면에 존재하는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "TCR" 또는 "T 세포 수용체"는 또한 이러한 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산을 의미할 수도 있다. 면역계의 정상적인 발달로 인해, TCR은 문헌 (Bell et al. (Bell et al., 1995, T Cell Receptors, Oxford University Press, Oxford))에 기재된 바와 같은 DNA 재배열 조작으로 인해 상당한 서열 다양성을 나타낸다. 주어진 TCR의 정확한 서열은 해당 TCR의 코딩 핵산 또는 단백질을 서열화하여 결정해야 한다. TCR의 잠재적인 서열들 중 어떤 것을 본 발명에 사용할 수 있다.

용어 "이뮤노글로불린 불변 영역"은 이뮤노글로불린의 가변 영역에 의해 코딩되지 않는 모든 이뮤노글로불린 분자 부위 또는 이 부위의 일부를 말한다. 용어 "이뮤노글로불린 불변 영역"은 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열을말할 수도 있다. 이뮤노글로불린 불변 영역은 단편 C_L, C_H1, C_H2, C_H3및 힌지 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 유형에는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgA₁, IgA₂, IgM, IgD, IgE 중쇄, 및 κ또는 λ경쇄 또는 그의 단편이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 9F12 세포로부터 유도된다. 임의의 공급원으로부터의 임의의 이뮤노글로불린 불변 영역 단편을 본 발명에 사용할 수 있으며, 단, 상기 단편은, 예컨대 단백질 G, 단백질 A, 단백질 L 또는 적당한 항체와의 결합을 통해 키메라 분자의 친화성 정제에 사용될 수 있도록 한다. 상기 기재된 바와 같이, 이뮤노글로불린 불변 영역 단편의 기능성 유도체도 사용할 수 있다.

용어 "이뮤노글로불린 폴드 (fold)" 또는 "이뮤노글로불린 도메인"은 이뮤노글로불린 거대족의 구조적 요소를 말한다. 이뮤노글로불린 도메인은 각각 대략 110개의 아미노산으로 구성된 보존된 반복 구조 도메인이다. 각 도메인 내에는 일반적으로, 각각 4개 및 3개의 스트랜드로 이루어진 2개의 쉬이트로 배열된 7개의 반대로 평행한 β스트랜드, 및 아미노산 약 60개의 루프를 형성하는 쇄내 디술피드 결합이 존재한다. 2개의 쉬이트는 일반적으로 소수성 아미노산이 내부로 향하고 친수성 아미노산이 외부로 향하도록 서로 마주보고 있다.

이뮤노글로불린 도메인은 항체, T 세포 항원 수용체, 사이토카인 수용체 (예를 들어, Ig 도메인이 5개인 혈소판-유래 성장 인자 수용체), 세포 부착 분자 (예를 들어, ICAM-1/CD54) 등과 같은 많은 단백질 분자에서 발견된다. 두 개의 이뮤노글로불린 도메인이 각 TCR에서 발견되는데, 하나는 가변 영역에 있고, 다른 하나는 불변 영역에 있다. 두 개의 이뮤노글로불린 도메인은 항체 경쇄에서 발견되고, 4개의 도메인은 IgG 중쇄에서 발견된다.

용어 "카파 불변 영역", "람다 불변 영역", "κ불변 영역" 및 "λ불변 영역"은 면역 시스템의 발달 동안 불변 상태로 남아있는 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄의 불변 영역을 말한다. 이 용어들은 DNA 서열 또는 단백질의 아미노산 서열을 말할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 1종 이상의 다른 단백질로부터 유래된 아미노산을 포함하는 키메라 단백질 형태로 구성될 수 있다.

용어 "IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgA₁, IgA₂, IgM, IgD, IgE"는 인간 이뮤노글로불린의 클래스 및 서브클래스를 말한다. 이 용어들은 단백질의 DNA 서열 또는 아미노산 서열을 말할 수 있다. 이뮤노글로불린 분자의 클래스 및 서브클래스는 그의 중쇄에 의해 결정된다. 예를 들어, IgG 및 IgD는 이뮤노글로불린의 다른 클래스이다. IgG₁및 IgG₂는 이뮤노글로불린 분자의 다른 서브클래스이다. 용어 "IgA"는 IgA 분자의 임의의 서브클래스를 말할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, IgA는 IgA₁분자를 말한다. 다른 바람직한 실시양태에서, IgA는 IgA₂분자를 말한다. 일부 실시양태에서, 사용되는 이뮤노글로불린 중쇄는 제2의 단백질로부터 유래된 아미노산을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다.

용어 "IgG_γ1"은 이뮤노글로불린의 IgG₁클래스와 관련된 중쇄를 말한다. IgG₁은 인간 IgG 이뮤노글로불린의 대략 66%를 차지한다 (Roitt et al.,Immunology, Mosby, St. Louis, pg. 4.2, 1993).

용어 "투여하는"은 화합물을 유기체의 세포 또는 조직과 접촉시키는 방법을 말한다. T 세포 매개 병증은 유기체의 세포 또는 조직이 유기체 또는 유기체 외부에 존재하는 경우 예방되거나 치료될 수 있다. 유기체의 외부에 존재하는 세포는 세포 배양 디쉬에서 유지시키거나 생장시킬 수 있다. 유기체 내에 존재하는 세포의 경우, 경구 전달, 비경구 전달, 피내 주사 및 에어로졸 도포를 포함하나 이에 제한되지 않는, 화합물을 투여하기 위한 많은 기술이 당업계에 존재한다. 이후, 유기체 기능에 대한 화합물 투여의 효과를 모니터링할 수 있다. 유기체는 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 또는 염소, 보다 바람직하게는 원숭이 또는 유인원, 가장 바람직하게는 인간이다.

용어 "조성물"은 원하는 단백질을 함유하는 혼합물을 말한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 추가 성분, 예컨대, 항원보강제, 안정화제, 부형제 등을 함유할 수 있다.

T 세포 클론과 가변 영역의 관계를 고려할 때 용어 "와 관련된"은 특정 T 세포 클론에 의해 생산되는 이뮤노글로불린 상에서 발견되는 가변 영역을 말한다.

용어 "T 세포 클론"은 단일 T 세포의 클론 후손을 말한다. T 세포의 클론 후속은 생산되는 항체에서 모세포와 동일한 이디오타입을 발현한다. 당업자는 T 세포의 클론 후속이 TCR 유전자내에서 체세포 돌연변이를 겪을 수 있지만 T 세포 클론의 일부는 여전히 남아 있음을 알 것이다.

용어 "단리하는"은 자연 발생 핵산 서열의 정상 세포 환경으로부터 상기 핵산 서열을 분리해내는 것을 말한다. 따라서, 상기 서열은 세포가 없는 용액 중에 있을 수 있거나, 상이한 세포 환경 하에 놓여질 수 있다. 이 용어는 상기 핵산 서열이 뉴클레오티드쇄만 존재한다는 것을 의미하는 것이 아니라, 이 뉴클레오티드쇄와 천연적으로 결합되어 있는 비-뉴클레오티드 물질이 실질적으로 없어 (약 90-95% 이상의 순도), 단리된 염색체로부터 구별되는 것을 의미하는 것이다. 핵산과 관련하여 용어 "단리하는"은 특정한 DNA 또는 RNA 서열이 그가 분리되는 세포에 존재하는 것보다 관심있는 용액 중에 존재하는 총 DNA 또는 RNA 중 훨씬 더 높은 비율 (2 내지 5 배)로 증가됨을 의미한다. 당업자는 존재하는 다른 DNA 또는 RNA의 양에서의 선택적인 감소, 또는 특정 DNA 또는 RNA 서열의 양에서의 선택적인 증가, 또는 상기 감소와 증가의 조합에 의해 상기 단리를 달성할 수 있다. 그러나, 풍부하다는 것은 다른 DNA 또는 RNA 서열이 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것이 아니라, 관심있는 서열의 상대적인 양이 상당히 증가되었음을 의미하는 것임을 알아야 한다. 용어 "상당히"는 증가도가 이러한 증가를 달성하는 당업자에게 유용함을 나타내는 데 사용되고, 일반적으로 다른 핵산에 비해 약 2 배 이상, 보다 바람직하게는 5 내지 10 배 이상의 증가를 의미한다. 또한, 이 용어는 다른 공급원으로부터 유래된 DNA 또는 RNA가 없음을 의미하는 것이 아니다. 다른 공급원으로부터 유래된 DNA는 예를 들어, 효모 또는 박테리아 게놈으로부터 유래된 DNA, 또는 pUC19와 같은 클로닝 벡터를 포함할 수 있다. 이 용어는 한 mRNA의 수준이 다른 종의 mRNA에 비해 자연적으로 증가될 수 있다는 점에서 바이러스 감염 또는 종양 성장과 같은 자연 발생적인 경우와는 구별된다. 즉, 상기 용어는 당업자가 원하는 핵산의 비율을 상승시킨 경우만을 포함하는 것이다.

단리된 DNA 서열은 천연 환경 하에서의 DNA 서열보다 상대적으로 더 순수하다 (천연 수준에 비해 이 수준은 예를 들어, mg/mL의 단위로 2 내지 5 배 이상이어야 함). PCR로부터 얻은 개별 서열은 전기영동시 균일한 정도로 정제할 수 있다. 이 PCR 반응으로부터 얻은 DNA 분자는 총 DNA 또는 총 RNA로부터 얻을 수 있다. 이들 DNA 서열들은 자연 발생적인 것이 아니라, 바람직하게는 부분 정제된 자연 발생 물질 (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA))의 개조를 통해 얻는다. 예를 들어, mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작하는 것은 합성 물질 (cDNA)의 생성을 수반하고, cDNA 라이브러리를 포함하는 세포로부터의 클론 선별에 의해 합성 라이브러리로부터 순수한 개별 cDNA 클론을 단리할 수 있다. mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작하는 것과 개별 cDNA 클론을 단리하는 것을 포함하는 방법으로 천연 메신저를 대략 10⁶배만큼 정제할 수 있다. 따라서, 1차수 이상의 크기, 바람직하게는 2 또는 3차수의 크기, 보다 바람직하게는 4 또는 5차수의 크기의 정제가 확실히 예상된다.

용어 "코딩 유전자"는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 서열을 말한다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA의 분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 분자는 DNA 분자이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 분자는 RNA 분자이다. RNA 분자로서 제공되는 경우, 분자는 숙주 세포의 리보좀을 번역 개시 부위 (예를 들어, 개시 코돈, ATG)로 안내하고 상기 리보좀을 번역 종결 부위 (예를 들어, 정지 코돈)으로 안내하는 서열을 포함할 것이다. 개시 코돈과 정지 코돈 사이에는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 있다. 당업자는 이 용어들의 의미를 매우 잘 알 것이다.

용어 "곤충 세포주"는 곤충으로부터 유래하고 바쿨로바이러스에 의한 감염에 민감한 세포주를 말한다. 당업자는 이러한 세포주, 및 이들 세포주를 사용하기 위해 필요한 기술을 잘 알 것이다. 곤충 세포주의 대표적인 예에는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (sf9) 및 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) (Hi-5) 세포주가 포함된다.

용어 "트리코플루시아 니 (하이-5) 세포" 및 "스포도프테라 프루기페르다 (sf9) 세포"는 바쿨로바이러스 발현 벡터와 함께 사용되는 곤충 세포주를 말한다. 당업자는 이들 세포주, 및 이들을 얻은 방법을 알 것이다.

용어 "항원보강제"는 선택될 항원 또는 면역원에 대한 동물 내의 면역 반응을 상승시키고자 할 때 선택될 항원 또는 면역원, 예를 들어, 면역 반응이 요구되는 단백질 또는 폴리펩티드에게 제공되어 면역 반응을 상승시키는 물질을 말한다. 당업자는 선택하여 사용할 적당한 항원보강제를 알 것이다. 인간에 사용하도록 허가된 항원보강제에는 알루미늄염 및 MF59가 포함된다 (Singh and O'Hagan, Nature Biotech 17: 1075-81, 1999). 다른 항원보강제는 개발 중에 있고 (Id.), 본 발명에 사용할 수 있다.

용어 "키홀-림펫 헤모시아닌" 또는 "KLH"는 면역화 과정에서 운반 단백질로서 통상 사용되는, 키홀 림펫으로부터 단리된 단백질을 말한다. 당업자는 용어 키홀-림펫 헤모시아닌의 의미를 안다.

용어 "사이토카인"은 주로 백혈구로부터 분비되는 성장 인자의 부류에 속하는 가용성 (당)단백질을 말한다. 사이토카인은 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응 둘 다뿐 아니라, 식세포의 활성화를 자극한다. 사이토카인은 면역 시스템 내에 있는 다양한 세포 타입 (림포카인, 인터루킨, 모노카인, 종양 괴사 인자, 인터페론의 경우)뿐만 아니라 혈액학의 연구와 관련된 다른 세포 (콜로니-자극 인자의 경우), 종양학의 연구와 관련된 다른 세포 (형질전이 성장 인자의 경우) 및 세포 생물학의 연구와 관련된 다른 세포 (펩티드 성장 인자, 열 충격 단백질 및 다른 스트레스 단백질의 경우)에 의해서도 합성되어 저장되고 수송된다.

림프구로부터 분비되는 사이토카인은 림포카인으로 불리지만, 단핵구 또는 대식세포에 의해 분비되는 사이토카인은 모노카인으로 불린다. 림포카인 중 대다수는 인터루킨 (IL)으로도 불리는데, 이는 이들이 백혈구에 의해 분비될 뿐 아니라 백혈구의 세포 반응에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 구체적으로, 인터루킨은 조혈 세포에 표적화되는 성장 인자이다.

용어 "성장 인자"는 세포의 표면 상의 수용체에 결합하여 세포 증식 및(또는) 분화를 활성화시키는 단백질을 말한다. 많은 성장 인자가 다용도로 사용되고 매우 다양한 세포 유형에서 세포 분열을 자극할 수 있지만, 나머지 성장 인자들은 특정 세포 유형에 특이적이다.

용어 "케모카인"은, 백혈구에 대한 화학유인제 및 활성화제로 작용하고 30종이 넘는 주화성 사이토카인의 거대족을 나타내는 작은 전구염증성 사이토카인으로 구성되는 군을 말한다. 케모카인은 면역 시스템 세포를 활성화하고 이들 세포가혈액 또는 골수로부터 감염 및 손상 조직의 부위로 이동하도록 조정한다. 케모카인은 성숙 면역 세포로 발달하는, 골수에서 발견되는 원시 줄기세포의 성장 및 증식에서 필수적인 역할도 한다. 케모카인은 다양한 범위의 급성 및 염증성 질환에 관여하고 7개의 막횡단 헬릭스를 갖는 부류의 수용체에 결합함으로써 작용한다.

종종 분자량이 8 내지 11 kDa인 케모카인은 1 내지 100 ng/ml의 농도 범위에 걸쳐 활성을 나타내고, 매우 다양한 세포 유형에 의해 생산된다. 케모카인의 생산은 전형적으로 외재 자극제 및 내재 매개제, 예컨대, IL-1, TNF-알파 및 PDGF에 의해 유도된다. 케모카인은 특정한 세포 표면 수용체에 결합하고 제1 순위의 전구염증성 사이토카인보다 다면발현성이 더 낮은 것으로 보이는 제2 순위의 사이토카인으로 간주될 수 있는데, 이는 이들 케모카인이 다른 사이토카인의 강력한 유도제가 아니고 염증 및 회복에서 보다 전문화된 기능을 발휘하기 때문이다.

용어 "과립구-대식세포 콜로니-자극 인자" 또는 "GM-CSF"는 분비되는 소단백질 (20 kDa 미만의 단백질)을 말한다. 이 인자는 특정한 세포 표면 수용체에 결합하고 골수 세포의 종-특이적 자극제로서 작용한다. GM-CSF는 수상세포, 과립구, 대식세포, 호산구 및 적혈구를 비롯한 여러 조혈 세포 계통의 성장 및 분화를 자극한다. 특히, 이 사이토카인은, T-세포 증식을 상승시키고 (Santoli et al., J. Immunol. 141 (2): 519-26, 1988), 과립구 및 단핵구 상의 부착 분자의 발현을 증가시키고 (Young et al., J. Immunol. 145 (2): 607-15, 1990; Grabstein et al., Science 232 (4749): 506-08, 1986), 항원 제시를 상승시킴으로써 (Morrissey et al., J. Immunol 139 (4): 1113-9, 1986 ; Heufler et al., J Exp. Med. 167 (2):700-05, 1988; Smith et al., RImmunol. 144 (5): 1777-82, 1990) 세포 면역을 형성하는 데 있어서 중요한 역할을 수행한다.

용어 "단핵구 주화성 단백질-3" 또는 "MCP-3"는 주로 단핵구에 의해 생산되는 케모카인을 말한다. MCP-3는 넓은 범위의 주화성을 나타내고, 단핵구, 수상세포, 림프구, 자연살 세포, 호산구, 호염기구 및 호중구를 유인한다. MCP-3의 cDNA는 1993년에 클로닝되었다 (Minty et al., Eur Cytokine Netw 4 (2): 99-110, 1993, and Opdenakker et al., Biochem Biophys Res Commun., 191 (2): 535-42, 1993). 그의 특성은 문헌 (Proost et al., J Leukoc Biol. 59 (1): 67-74, 1996)에 의해 최근에 보고된 바 있다.

용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된 경우 관심있는 선택된 유전자, 통상 단백질을 발현하도록 디자인된 재조합 DNA 제작물을 말한다. 당업자는 이 용어를 이해한다. 발현 벡터에는 통상 관심있는 유전자가 삽입되는 부위의 5' 말단에 있는 프로모터, 및 상기 부위의 3' 말단에 있는 종결 영역이 포함된다. 종종 관심있는 유전자는 선택된 제한효소 절단 부위를 통해 적절한 부위 내로 삽입된다. 또한, 용어 "발현 벡터"는 관심있는 생성물을 코딩하는 관심있는 유전자가 이미 삽입되어 있는, 상기 기재된 것과 같은 DNA 제작물을 말한다.

용어 "바쿨로바이러스 발현 벡터"는 바쿨로바이러스 시스템에서 사용될 때 선택된 유전자를 발현하도록 디자인된 DNA 제작물을 말한다. 바쿨로바이러스 시스템에서 작용하도록 디자인된 가능한 바쿨로바이러스 또는 발현 벡터 중 임의의 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 유사한 방식으로, 용어 "발현 벡터"는 바쿨로바이러스 발현 벡터의 구체적 실시양태를 포함하는 부류이지만, "발현 벡터"는 곤충 세포주 이외의 세포 또는 세포주에서 작용할 수 있다.

용어 "발현시킨다"는 발현 벡터를 관심있는 유전자가 발현될 환경 하에 두는 것을 말한다. 이는 통상적으로 프로모터 및 유전자 발현에 필요한 다른 영역이 숙주 세포의 구성성분에 의해 인식되고 관심있는 유전자를 발현시키는 경우 발현 벡터를 적합한 세포 유형에 삽입하는 것을 의미한다. 발현은 일반적으로 두 단계, 즉 전사 및 번역으로 구성된다. 발현은 세포로부터 유래된 구성성분들을 사용하여 시험관내에서 수행할 수도 있다. 당업자는 이 기술들을 알고, 이 기술들은 문헌 (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현된 생성물은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 발현된 생성물은 V_β/IgG_γl, V_β/C_κ, V_β/C_λ, V_α/C_κ, V_α/C_λ또는 V_α/IgG_γl이다.

용어 "분비 신호 서열"은 펩티드 서열을 말한다. 이 서열이 선택된 폴리펩티드의 아미노-말단에 부착된 펩티드로서 프레임내로 번역되는 경우, 분비 신호 서열은 숙주 세포의 기구와 접촉함으로써 선택된 폴리펩티드를 분비시킬 것이다. 분비 과정의 일부로서, 이 분비 신호 서열은 관심있는 폴리펩티드가 세포 밖으로 분비된 후 관심있는 폴리펩티드만을 남기고 절단되어 제거될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열이 사용된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 인간 태반 알칼리 포스파타제 분비 신호 서열이 사용된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상 환자로부터 유래하는 이뮤노글로불린 유전자와 관련된 내부 분비 서열이 사용된다. 본 발명은 이들 분비 신호 서열에 의해 제한되지 않고, 당업자에게 잘 알려진 다른 분비 신호 서열을 상기 신호 서열 대신에 또는 상기 신호 서열과 함께 사용할 수 있다. 또한, 용어 "분비 신호 서열"은 분비 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 말한다.

용어 "ELISA"는 ELISA 플레이트의 플라스틱 웰과 단백질을 결합시킨 후 정량될 또는 검출될 단백질에 특이적인 항체로 검출함으로써 단백질의 존재 또는 농도를 측정하는 "효소-결합 면역흡착 분석"을 말한다.

용어 "프로모터 조절"은 프로모터가 관심있는 유전자의 5'에 놓여 DNA 서열이 mRNA 분자로 전사되도록 하는, 발현 벡터 내의 DNA 배열을 말한다. 전사 후 이 mRNA 분자는 숙주 세포 기구에 의해 번역된다. 당업자는 이 용어의 의미를 잘 안다.

용어 "단백질 A", "단백질 G" 및 "단백질 L"은 항원 결합 부위와 상호작용하지 않으면서 이뮤노글로불린 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 특정한 박테리아 단백질을 말한다. 단백질 A는 이뮤노글로불린 분자의 Fc 영역에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터 단리된 폴리펩티드이다. 단백질 G는 인간 군 B 스트렙토코쿠스 균주 (G148)로부터 단리된, 이뮤노글로불린 G (IgG)에 대한 친화성을 갖는 박테리아 세포벽 단백질이다. 단백질 L은 혐기성 박테리아 종 펩토스트렙토코쿠스 매그누스 (Peptostreptococcus magnus) 중 일부 균주에 의해 발현되는 이뮤노글로불린 경쇄-결합 단백질이다.

단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때 사용되는 용어 "단리하는"은 자연 발생 폴리펩티드 또는 단백질을 그의 정상 세포 환경으로부터 분리하는 것을 말하거나, 또는 발현 시스템 (예컨대, 본 명세서에 기재된 바쿨로바이러스 시스템)에서 합성되는 폴리펩티드 또는 단백질을 상기 발현 시스템의 다른 성분으로부터 분리하는 것을 말한다. 따라서, 폴리펩티드 서열은 세포가 없는 용액 중에 있을 수 있거나, 상이한 세포 환경 하에 놓여질 수 있다. 이 용어는 폴리펩티드 서열이 아미노산쇄만 존재한다는 것을 의미하는 것이 아니라, 아미노산쇄와 자연적으로 결합되어 있는 비-아미노산-기재 물질이 실질적으로 없다는 것을 (약 90-95% 이상의 순도)을 의미하는 것이다.

폴리펩티드와 관련되어 사용되는 용어 "풍부"하다는 것은 특정 아미노산 서열이 정상 또는 병든 세포에 존재하는 것 또는 그가 분리되는 세포에 존재하는 것보다 관심있는 세포 또는 용액 중에 존재하는 총 아미노산 서열의 훨씬 더 높은 비율 (2 내지 5 배)을 구성한다는 것을 의미한다. 당업자는 존재하는 다른 아미노산 서열의 양에서의 선택적인 감소, 또는 특정 아미노산 서열의 양에서의 선택적인 증가, 또는 상기 감소와 증가의 조합에 의해 폴리펩티드를 풍부하게 할 수 있다. 그러나, 풍부하다는 것은 다른 아미노산 서열이 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것이 아니라, 관심있는 서열의 상대적인 양이 상당히 증가되었음을 의미하는 것임을 알아야 한다. 본 명세서에서 용어 "상당히"는 증가도가 이러한 증가를 달성하는 당업자에게 유용함을 나타내는 데 사용되고, 일반적으로 다른 아미노산 서열에 비해 약 2 배 이상, 보다 바람직하게는 5 내지 10 배 이상의 증가를 의미한다. 또한, 이 용어는 다른 공급원으로부터 유래된 아미노산 서열이 없음을 의미하는 것이 아니다. 아미노산 서열의 다른 다른 공급원은 예를 들어, 효모 또는 박테리아 게놈에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 pUC19와 같은 클로닝 벡터에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 상기한 바와 같은 키메라 단백질이다. 상기 용어는 당업자가 원하는 아미노산 서열의 비율을 증가시킨 경우만을 포함하는 것이다.

아미노산 서열은 정제된 형태인 것이 일부 목적상 유리할 수도 있다. 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 용어 "정제된"은 절대적인 순도 (예컨대, 균질한 시료)를 요구하는 것이 아니라, 천연 환경 하의 순도보다 상대적으로 더 높은 순도를 갖는다는 것을 의미한다. 천연 수준과 비교할 때, 이 수준은 (예를 들어, mg/mL의 단위로) 2 내지 5 배 이상 더 커야한다. 1차수 이상의 크기, 바람직하게는 2 또는 3차수의 크기, 보다 바람직하게는 4 또는 5차수 크기의 정제가 확실히 예상된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 기능적으로 유의한 수준의 오염이 없는 순도, 예를 들어, 90%, 95% 또는 99% 순도를 갖는다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 관심있는 DNA 유전자가 전사되어 번역되도록 프로모터 또는 인핸서와 같은 조절 영역이 관심있는 연결 DNA 유전자에 부착되어 있는 DNA의 배열을 말한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 분비 신호 서열과 같은 프로세싱 신호를 코딩하는 DNA 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 연결되어 단일 오픈 리딩 프레임을 형성하는 것을 말할 수도 있다. 전사 및 번역 후, 분비 신호 서열은 번역된 폴리펩티드를 분비시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 당업자는이 용어의 의미를 알고 있다.

유용한 키메라 단백질의 기능적 유도체

본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 기능적 유도체도 본 명세서에 제공된다. "기능적 유도체"는 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 "화학적 유도체", "단편" 또는 "변이체" (이들 용어들은 하기에 정의되어 있음)를 의미한다. 기능적 유도체는 단백질 기능의 적어도 일부, 예를 들어, 그가 본 발명에 따라 사용될 수 있도록 하는, 단백질에 특이적인 항체와의 반응성 또는 비촉매성 도메인을 통해 매개되는 결합 활성을 보유한다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해 다수의 상이한 핵산 서열들이 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 아미노산 서열에서의 보존적 변화가 본래 단백질 또는 폴리펩티드의 기능성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 만들 수 있다는 것도 당업계에 잘 알려져 있다. 두 경우, 모든 변경은 본 명세서의 개시 내용에 포함되는 것이다.

본 명세서에 기재된 단리된 핵산 분자의 기능적 등가물도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 유전 코드의 축퇴성은 특정 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈으로 치환되어 동일한 단백질이 생성되는 것을 허용한다. 핵산 서열은 메티오닌 및 트립토판을 제외하고 공지된 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 코딩될 수 있기 때문에 실질적으로 다양할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자의 일부 또는 모든 유전자는 천연 상태로 발견되는 서열과는 상당히 다른 핵산 서열이 생성되도록 합성할 수 있다. 그러나, 상기 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존될 것이다.

결합체의 "키메라 유도체"는 단백질의 정상적인 일부가 아닌 추가 화학 잔기를 갖는다. 단백질 또는 펩티드의 공유결합 변형도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 변형은 하기한 바와 같이, 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 분자 내에 도입할 수 있다.

시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민)과 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성시킨다. 또한, 시스테이닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술파이드, 메틸 2-피리딜 디술파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.

히스티딜 잔기는 디에틸프로카르보네이트가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문에 pH 5.5 - 7.0에서 디에틸프로카르보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다. 파라브로모펜아실 브로마이드도 유용한데, 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1 M의 소듐 카코딜레이트 중에서 수행한다.

리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 무수물 또는 기타 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 물질을 사용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하에 영향을 주거나 리시닐 잔기의 전화를 역전시킨다. 1차 아민 함유 잔기를 유도체화하기에 적합한 다른 시약에는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로히드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실에이트와의 트랜스아미나제-촉매화 반응이 포함된다.

아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 통상적인 시약과의 반응에 의해 변형되고, 이들 시약으로는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린이 있다. 아르기닌 잔기를 유도체화하기 위해서는 구아니딘 관능기의 높은 pK_a때문에 반응을 알칼리성 조건 하에서 수행해야 한다. 게다가, 이들 시약들은 라이신 기뿐 아니라 아르기닌 α-아미노기와 반응할 수 있다.

티로실 잔기는 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의한 분광 표지의 도입을 위한 변형의 잘 공지된 표적이다. 가장 통상적으로는, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체 각각을 형성한다.

카르복실 측기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 같은 카르보디이미드 (R'-N-C-N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아민화된다. 또는, 이들 잔기는 약한 산성 조건 하에서 탈아민화된다. 이들 잔기 중 어느 형태도 본 발명의 범위 내에 속한다.

이관능성 물질을 사용한 유도체화는 예를 들어, 단백질의 구성 펩티드를 서로 가교결합시키거나, 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 다른 거대분자 담체와의 결합체 중의 다른 단백질에 가교결합시키기에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제에는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예컨대, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종이관능성 이미도에스테르 (3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함함), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드가 포함된다. 메틸-3-[p-아지도페닐]디티올프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광의 존재 하에 가교결합을 형성할 수 있는 광활성화성 중간체를 생성시킨다. 별법으로, 반응성 수-불용성 매트릭스, 예컨대 시아노겐 브롬마이드에 의해 활성화된 탄수화물 및 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 기질들을 단백질 고정에 사용한다.

다른 변형에는 프롤린 및 라이신의 히드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86,1983); N-말단 아민의 아세틸화; 및 일부 경우 C-말단 카르복실기의 아미드화가 포함된다.

이러한 유도체화 잔기는 안정성, 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 또는, 이 잔기들은 단백질 결합체 등의 바람직하지 못한 임의의부작용을 없애거나 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 잔기들은 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)]에 개시되어 있다.

아미노산 잔기가 결실, 삽입 및(또는) 치환된 단백질의 기능성 유도체는 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 기능성 유도체의 변형된 성분들은, 변형될 코딩 서열이 변형되도록 DNA 코딩 서열의 뉴클레오티드가 변형되는 부위-지정 돌연변이유발 기술 [문헌 (Adelman et al., DNA 2: 183, 1983)에 예시되어 있음]을 이용하여 생산한 후, 상술된 기술과 같은 기술을 이용하여 이 재조합 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시킨다. 별법으로, 아미노산 결실, 삽입 및(또는) 치환이 있는 단백질은 당분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 직접적인 화학적 합성에 의해 편리하게 제조할 수 있다. 단백질의 기능성 유도체들은 전형적으로 천연 단백질과 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다.

용어 "단편"은 그가 유도된 전장 폴리펩티드 미만의 길이를 갖는 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 나타내는데 사용된다. 이러한 단편은 예를 들어 전장 단백질의 단백질분해 절단에 의해 유도될 수 있다. 바람직하게는, 단편은 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 C-말단, N-말단 및(또는) 천연 서열내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산을 결실시키도록 적절히 변형시켜 재조합적으로 얻는다. 이러한 단편은 천연 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성화 부위, 기능 또는 특성을 보유할 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 보유 특성의예로는 촉매 활성; 기질 특이성; 원형 세포에서 다른 분자와의 상호작용; 조절 기능; 또는 천연 결합체에 대해 특이적인 항체 또는 그의 에피토프와의 결합을 들 수 있다.

본 발명의 범위내인 것으로 의도되는 다른 기능성 유도체는 "변이체" 폴리펩티드이며, 이는 천연 폴리펩티드에 대하여 하나 이상의 아미노산이 결여되어 있거나, 부가 또는 치환된 아미노산을 포함한다. 변이체는 자연 발생적인 복합체 성분으로부터 단백질 DNA 코딩 서열을 적절힌 변형시켜 C-말단, N-말단 및(또는) 천연 서열내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈을 부가, 제거 및(또는) 변형시킴으로써 유도될 수 있다. 부가, 치환 및(또는) 추가의 아미노산을 갖는 이러한 변이체는 상기 기재된 바와 같이 천연 단백질의 하나 이상의 특징적인 부위를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 키메라 단백질의 용도에 관한 것이다. 바람직한 용도에는 약제학적 용도 및 수의학적 용도가 포함되는데, 본 발명에 따른 유효량의 키메라 단백질 (바람직하게는 본 발명에 따른 조성물 중의 키메라 단백질)을 환자에게 투여한다. 이 방식으로, 이 키메라 단백질이 환자의 세포와 접촉한 후 원하는 생물학적 반응을 일으킨다. 본 발명의 키메라 단백질을 사용하는 방법에는 유기체에서 면역 반응을 일으키는 방법, 유기체에서 항체 (B 세포 면역 반응)을 일으키는 방법, 유기체에 의한 T 세포 면역 반응을 유도하는 방법, 및 T 세포 병증을 개선시키는 방법이 포함된다. 본 발명에는 본 발명의 키메라 단백질을 투여함으로써 T 세포 매개 발병기작을 변화시킬 수 있는 면역 반응을 증가시키기위한 대상체의 치료 방법도 포함된다.

전형적으로, 이러한 방법들은 본 발명에 따른 유효량의 키메라 단백질을 유기체에 전달함으로써 달성된다. "유효량"은 원하는 생물학적 반응이 일어나도록 하는 양을 말한다. 이러한 양을 구성하는 정도는 다를 것이고, 구체적인 키메라 단백질, 일으키려 하는 원하는 생물학적 반응, 키메라 단백질의 제형, 치료받을 유기체의 연령, 체중, 성별 및 건강, 투여 방법, 치료하거나 예방될 질환 또는 증상 등을 비롯한 다양한 인자에 달려 있다. 본 발명의 키메라 단백질 및 조성물이 투여될 수 있는 유기체에는 포유동물, 바람직하게는 소과 동물, 개과 동물, 말과 동물, 고양이과 동물, 양과 동물, 돼지과 동물 및 영장류 동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 포유동물이 포함된다. 특히 바람직한 유기체는 인간이다.

본 명세서에 기재된 화합물은 그 자체로 인간 환자에게 투여될 수 있거나, 조합 요법에서와 같이 다른 활성 성분, 적당한 담체 또는 부형제(들)와 혼합된 약제학적 조성물 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 사용되는 화합물의 제형화 및 투여 기술은 문헌 ("Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition)에서 찾을 수 있다.

투여 경로

적당한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여; 근육내, 피하, 정맥내, 연수내 주사, 경막내 주사, 직접적인 심실내 주사, 복강내 주사, 비강내 주사 및 안구내 주사를 비롯한 비경구 전달이 포함된다. 당업자는 본 발명의 조성물을 특정한 투여 경로에 맞게 만드는 다양한 변형을 이해할 것이다.

별법으로, 당업자는 전신적인 방식보다 국소적인 방식으로 화합물을 투여할 수 있는데, 예를 들어, 화합물을 종종 저장 제형 또는 지속 방출 제형으로 충실성 종양 내로 직접 주입함으로써 투여할 수 있다.

조성물/제제

본 발명의 제약 조성물은 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분쇄, 에멀젼화, 캡슐화, 엔트랩핑 또는 동결건조 방법에 의해 제조할 수 있다.

따라서 본 발명에 따라 사용되는 제약 조성물은 활성 화합물의 제약상 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제제화할 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존한다.

주사의 경우, 본 발명의 제제는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충액, 예를 들어 행크 (Hank's) 용액, 링거 (Ringer's) 용액, 또는 생리학적 염수 완충액 중에 제제화할 수 있다. 경점막 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 투과제를 제제 중에 사용한다. 이러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 제약상 허용되는 담체와 배합하여 화합물을 쉽게 제제화할 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 치료될 대상에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액상제, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액제 등과 같이 제제화될 수 있도록 한다. 적합한 담체로는부형제, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당과 같은 충전제; 및 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및(또는) 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로스 제제를 들 수 있다. 원한다면, 붕해제, 예를 들어 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산, 또는 이들의 염, 예를 들어 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.

당의정제 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이러한 목적을 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및(또는) 이산화티탄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는 농축 당 용액을 사용할 수 있다. 활성 화합물 투여의 상이한 조합을 확인하거나 특성화하기 위해 정제 또는 당의정제 코팅에 염료물질 또는 안료를 첨가할 수 있다.

경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨로 이루어진 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 활성 성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제 및(또는) 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및, 임의로 안정화제와 혼합하여 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분은 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제제는 이러한 투여에 적합해야 한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 편리하게는 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제공 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는, 예를 들어 젤라틴으로 된 캡슐 및 카트리지는 화합물과, 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 포함하도록 제제화할 수 있다.

화합물은 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화할 수 있다. 주사용 제제는 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다중-투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정제 및(또는) 분산제와 같은 제제화 물질을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제약 제제는 활성 화합물의 수용액을 수용성 형태로 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일 주사 현탁액으로 제조할 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어 세삼유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 들 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를들어 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 텍스트란을 포함할 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액을 제조할 수 있게 하는 적합한 안정화제 또는 물질을 포함할 수도 있다.

또는, 활성 성분은 사용에 앞서 적합한 비히클, 예를 들어 무균 발열물질 무함유 물로 녹이는 분말 형태일 수 있다.

앞서 설명된 제제 이외에, 화합물은 저장용 제제로 제제화할 수도 있다. 이러한 장기 작용성 제제는 이식 (예를 들어, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 즉, 예를 들어 화합물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용가능한 오일 중 에멀젼으로) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 저 용해성 유도체, 예를 들어 저 용해성 염으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 소수성 화합물을 위한 제약 담체는 벤질 알콜, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함하는 공용매계이다. 공용매계는 VPD 공용매계일 수 있다. VPD는 3% w/v 벤질 알콜, 8% w/v 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80, 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜의 용액이며, 순수 에탄올로 부피를 조절한다. VPD 공용매계 (VPD:D5W)는 수용액 중 5% 덱스트로스로 1:1 희석된 VPD로 구성된다. 이 공용매계는 물론 소수성 화합물을 용해시키며, 그 자체는 전신 투여시 낮은 독성을 나타낸다. 물론, 공용매계의 비율은 그의 용해도 및 독성 특성을 변화시키지 않으면서 상당히 달라질 수 있다. 또한, 공용매계 성분의 존재는 달라질 수 있는데, 예를 들어 폴리소르베이트 80 대신 다른 저독성의 비극성 계면활성제를 사용할 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜의 비율 크기를 다르게 할 수 있고, 다른생적합성 중합체로 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈을 대체할 수 있으며, 덱스트로스를 다른 당 또는 폴리사카라이드로 대체할 수 있다.

또는, 소수성 제약 화합물에 대하여 다른 전달계를 사용할 수 있다. 리포좀 또는 에멀젼은 소수성 약물에 대한 전달 비히클 또는 운반체의 예로서 잘 알려져 있다. 여러 유기 용매, 예를 들어 디메틸술폭시드를 사용할 수도 있지만, 일반적으로는 큰 독성을 나타낸다. 또한, 지속 방출계, 예를 들어 치료제를 포함하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 화합물을 전달할 수 있다. 다양한 지속 방출형 물질이 확립되었으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 지속 방출형 캡슐은 그의 화학적 특성에 따라 화합물을 몇주 내지 100일 동안 방출시킨다. 치료제의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가의 전략을 이용할 수 있다.

제약 조성물은 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수도 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러가지 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물 중 많은 것들은 제약상 상용성인 카운터이온을 갖는 염으로 제공할 수 있다. 제약상 상용성인 염은 염산, 황산, 아세트산, 젖산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 산과 함께 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태보다는 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해되는 경향이 있다.

유효 투여량

본 발명에 사용하기 적합한 제약 조성물로는 활성 성분이 그의 목적하는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 포함된 조성물을 들 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량은 질환의 증상을 예방, 감소 또는 개선시키거나, 치료될 대상의 생존을 연장시키는데 효과적인 화합물의 양을 의미한다. 치료 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명에 비추어 충분히 당업자의 능력 범위내이다.

본원에 기재된 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서, 예를 들어 LD₅₀(집단의 50%에 대해 치명적인 투여량) 및 ED₅₀(집단의 50%에 치료 효과가 있는 투여량)을 결정하기 위한 표준 제약학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이며, LD₅₀및 ED₅₀사이의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이타는 인간에 사용되는 투여량 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위내이다. 투여량은 이러한 범위내에서 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 증상을 살펴보는 담당 의사에 의해 선택될 수 있다 (문헌 (Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1) 참조).

투여량 및 간격을 개별적으로 조절하여 요구되는 효과를 유지하는데 충분한활성 잔기의 혈장 수준, 또는 최소 유효 농도 (MEC)를 제공할 수 있다. MEC는 각 화합물에 대하여 달라질 것이다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 각 특성 및 투여 경로에 의존할 것이다. 그러나, HPLC 분석 또는 생분석을 이용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.

투여 간격은 또한 MEC 값을 이용하여 결정할 수 있다. 화합물은 혈장 수준을 시간의 10 내지 90%, 바람직하게는 30 내지 90%, 가장 바람직하게는 50 내지 90% 동안 MEC를 넘게 유지하는 요법을 이용하여 투여해야 한다.

국소 투여 또는 선택적 수용의 경우, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.

투여되는 조성물의 양은 물론 치료될 대상, 대상의 체중, 증상의 심도, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 의존할 것이다.

포장

조성물은 원한다면 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 분배 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어 발포제 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배 장치에는 투여용 지침이 수반될 수 있다. 팩 또는 분배 장치에는 또한 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부처에 의해 승인된 형태로 용기에 부착된 표식이 수반될 수도 있으며, 이 표식은 인간 또는 동물 투여를 위한 폴리뉴클레오티드 형태에 대한 정부 부처의 승인을 반영한다. 이 표식은 예를 들어 처방 약물 또는 승인된 제품 삽입물에 대하여 미국 식약청에 의해 승인된 표지일 수 있다. 또한, 상용성인제약 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하여 적절한 용기내에 넣고, 지시된 증상의 치료에 대하여 표지할 수 있다. 표지상에 나타낸 적합한 증상으로는 종양, 류마티스성 관절염 및 당뇨병 등의 치료를 들 수 있다.

하기 기술에서, 면역학, 세포 생물학 및 분자 생물학 분야의 숙련자들에게 공지된 다양한 방법을 참고로 할 것이다. 참고한 이러한 공지된 방법들을 기재하는 간행물 및 기타 문헌은 거명을 통해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1.T 세포 림프종 이디오타입 (Id) 확인 및 클로닝을 위한 조직 처리:

말초 림프절로부터의 종양 샘플을 무균 조건하에 임상적으로 지시된 바와 같이 생검하고, 이를 사용하여 환자의 이디오타입-특이적 재조합 V_α및 V_β-Ig 키메라 단백질을 생성시켰다. 남은 림프절 생검 재료를 나중에 사용하기 위해 조직 세포 은행에서 액체 질소중에 보관하였다.

세포 단리: 무균 PBS 중에 잠기게 하면서 일회용 0.38 mm 철망 스크린을 통해 생검된 림프종 조직을 밀어내어 환자의 림프절 생검체의 단일 세포 현탁액을 얻었다. 분산된 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 재현탁시키고, 계수하였다. 세포의 10% 분획을 총 RNA 추출로 처리하고, 남은 세포를 30% 우 태아 혈청 및 10% DMSO를 포함하는 RPMI 1640 조직 배양 배지중에 재현탁시킨 다음, 액체 질소중에 보관하였다. 임상 샘플의 모든 처리는 생물학적으로 안전한 캐비넷에서 수행하였다.

총 RNA 제조: 제조자의 지시에 따라 RNeasy 기트 (Qiagen)를 이용하여 균질화된 림프절 세포로부터의 총 RNA를 단리하였다. 분광광도법을 이용하여 총 RNA를 정량하였다.

T 림프종 세포로부터의 TCR의 V _α 및 V _β 쇄를 코딩하는 유전자의 cDNA 합성 및 PCR 증폭: 하기 상술한 바와 같이, 제조자에 의해 정확하게 기술된 바와 같이 5'RACE 시스템 (Gibco BRL)을 이용하여 T 림프종 세포 수용체의 V_α및 V_β쇄 둘 다를 확인하였다. 제1 스트랜드 cDNA 합성을 위한 템플레이트로서 약 5.0 ㎍의 총 RNA를 사용하여 제1 스트랜드 DNA를 프라이밍하기 위해 C_α특이적 프라이머 CADS3, 또는 C_β특이적 프라이머 CBDS3 (표 1 참조)를 사용하였다. 제조자의 추천에 따라 폴리 dC 테일링을 수행하였다. 이어서, 제조자에 의해 제공된 5' 프라이머, 및 제2 C_α특이적 CADS2 또는 C_β특이적 CBDS2 안티센스 프라이머 (이들 각각은 cDNA 합성을 위해 사용된 각 프라이머 (표 1 참조)에 대해 내부적임)를 사용하여 V_α및 V_β확인을 수행하였다.

(CB/IgG1: 서열 문자 중 소문자는 ApaI 클로닝 부위를 생성시켜 IgG₁키메라 단백질을 형성시키는 변화를 나타낸다. C/G 및 G/T로 나타낸 염기는 C_β1 & 2 사이의 차이로 인해 이들 두 위치에서 사용되는 각 염기를 나타낸다)

(CA/IgK: 서열 문자 중 소문자는 DraIII 클로닝 부위를 생성시켜 카파 경쇄를 갖는 키메라 단백질을 형성시키는 bp 변화를 나타낸다)

PCR 생성물의 클로닝 및 서열화:

V_α및 V_β쇄에 대한 종양 특이적 서열을 포함하는 것으로 결정된 반응으로부터의 PCR 생성물을 제조자의 추천에 따라 플라스미드 pCR2.1-TOPO에 직접 클로닝하고, Top10 컴피턴트 이. 콜라이 세포 (Invitrogen)내에 도입하였다. QIAPrep 스핀 미니프렙 키트 (Qiagen)를 이용하여 카르베니실린 내성 박테리아 콜로니로부터 24 미니프렙 DNA 플라스미드를 제조하고, 분광광도법에 의해 정량하였다. Cy5/Cy5.5 염료 프라이머 사이클 서열화 키트 (Visible Genetics)를 사용하여 각 플라스미드200 ng을 서열화하였다. 서열화 반응을 완료한 다음, 샘플을 오픈진 (OpenGene) 자동 DNA 서열화 시스템으로 전기영동하고, GeneObjects 소프트웨어 패키지 (Visible Genetics)를 사용하여 데이타를 처리하였다. SEQUENCHER 버전 4.1.2 DNA 분석 소프트웨어 (GENE Codes Corp.)를 사용하여 서열 정렬을 포함하는 추가의 분석을 수행하였다. V_α또는 V_β에 대한 종양 특이적 서열은 샘플의 75% 중에 존재하는 경우, 예를 들어 24개 중 18개 이상이 컨센서스 군을 형성하는 경우에 고려된다. 이용가능한 경우 2개의 독립적인 생검 샘플을 비교하였다.

실시예 2.이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 바쿨로바이러스 발현 벡터 pTRABacV _α HC _γ1 및 pTRABacV _β HC _γ1 의 제작

분비 신호 서열의 p2Bac로의 클로닝: pTRABacHuLC_κHC_γ1및 pTRABacHuLC_λHC_γ1구조물에 대한 기본 벡터는 p2Bac (도 2, 서열 5, Invitrogen, Carlsbad, CA)이었다. 2개의 분비 신호 서열을 이 기본 벡터내에 클로닝하고, 제1 중간체 바쿨로바이러스 발현 벡터 p2BacM을 생성시켰다. 일반적으로, 벡터 p2Bac는 먼저 바쿨로바이러스 AcNPV P10 프로모터의 전사 조절하에 위치된 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열의 아미노 말단 도메인을 코딩하는 상보적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 변형시켰다. 멜리틴 서열 클로닝을 위해, p2Bac 2 ㎍을 37 ℃에서 4시간 동안 NotI 및 SpeI으로 절단하였다. Qiaex II 수지 (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용한 1% 아가로스 겔을 통해 전기영동한 다음, 선형 벡터를 정제하였다. 이어서, 정제된 DNA를 물 50 ㎕로 용출시키고, DNA 농도를 결정하였다. 프라이머MelS/N (서열 16) 및 MelN/S (서열 17) 각각 1 ㎍을 절단 완충액 M (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 10 ㎕ 중에 혼합하고, 70 ℃로 5분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켜 상보적인 프라이머를 어닐링하였다. 어닐링된 프라이머 10 퍼센트를 반응물 20 ㎕ 중에서 37 ℃에서 4시간 동안 NotI 및 SpeI으로 절단하고, 절단된 프라이머를 Qiaex H 수지를 사용한 15% 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동 후에 정제하고, 어닐링된 프라이머에 대한 DNA 농도를 결정하였다. p2Bac 벡터 및 어닐링된 멜리틴 단편의 DNA를 1:10 벡터 삽입 비율로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이 (Stratagene, San Diego, CA)를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트에 플레이팅하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 표준 방법으로 미니프렙 콜로니를 제조하고, 플라스미드를 서열화하여 구조물을 확인하였다. 생성된 벡터 p2BacM은 멜리틴 분비 신호 서열을 포함하였다.

AcNPV 폴리헤드론 프로모터의 전사 조절하에 있는 인간 태반 알칼리 포스파타제 분비 신호 서열의 아미노 말단 도메인을 코딩하도록 p2BacM 벡터를 유사하게 추가로 변형시켜 제2 중간체 바쿨로바이러스 발현 벡터 p2BacMA를 생성시켰다. 알칼리 포스파타제 서열을 도입하는 방법으로 일반적으로 다음과 같이 클로닝하였다: p2BacM 플라스미드 2 ㎍을 BamHI 및 EcoRI으로 절단하고, Qiaex II 수지를 사용한 아가로스 겔로부터 선형 벡터를 겔 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 벡터의 DNA 농도를 결정하였다. 프라이머 APB/E (서열 18) 및 APE/B (서열 19) 각각 1 ㎍을 절단 완충액 M 10 ㎕ 중에 혼합하고, 70 ℃로 5분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켜 상보적인 프라이머를 어닐링하였다. 어닐링된 프라이머 10 퍼센트를 반응물 20 ㎕ 중에서 37 ℃에서 4시간 동안 BamHI 및 EcoRI으로 절단하였다. 이어서, 절단된 프라이머를 Qiaex II 수지를 사용한 15% 폴리아크릴아미드 겔로부터 정제하였다. 절단된 프라이머의 DNA 농도를 또한 결정하였다. 이어서 선형 p2BacM 벡터 및 알칼리 포스파타제 단편을 1:10 벡터 삽입 비율로 라이게이션하고, 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 콜로니를 제조하고, 플라스미드를 서열화하여 구조물을 확인하였다. 생성된 중간체 벡터 p2BacMA는 인간 태반 알칼리 포스파타제에 대한 분비 신호 서열을 포함하였다. p2BacMA 플라스미드로dcm메틸라제 활성이 결여된 SCS-110 이. 콜라이 균주 (Stratagene)를 추가로 형질전환시킨 다음, κ불변 영역을 메틸-감수성 StuI 부위에 클로닝하였다.

IgG _γ1 및 경쇄의 불변 영역의 증폭 및 클로닝: 인간 세포주 9F12 (ATCC#HB8177)로부터 추출된 RNA로부터 인간 모노클로날 항체 9F12의 인간 카파 (κ) 불변 및 인간 IgG_γ1불변 도메인을 PCR 증폭시켰다. κ불변 영역을 알칼리 포스파타제 신호 서열의 뒤쪽에 클로닝하였다. IgG_γ1불변 영역을 멜리틴 분비신호 서열로부터의 하류에 삽입하여 벡터 (pTRABacHuLC_κHC_γ1, 도 5a)를 형성시켰다. κ경쇄 불변 영역을 λ경쇄 불변 영역으로 대체하여 인간 람다 (λ) 경쇄 불변 영역을 포함하는 벡터 (pTRABacHuLC_λHC_γ1, 도 5b)를 제조하였다. RT-PCR에 의해 만성 림프구성 백혈병 세포 RNA 시료로부터 경쇄를 단리하였다. 클로닝 방법에 대한 상세한 설명은 하기와 같다:

9F12κ및 IgG _γ1 불변 영역 단편의 증폭: 제조자의 지시에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 9F12 세포 (ATCC#HB8177)로부터의 총 RNA를 추출하였다. 올리고 (dT) 프라이머와 함께 수퍼스크립트 (SuperScript) 역전사효소 (GIBCO BRL, Rockville, MD)를 사용하여 단일 스트랜드 cDNA를 합성하였다. 합성된 단일 스트랜드 cDNA의 1/20을, κ및 IgG_γ1특이적 올리고뉴클레오티드 (각각, 서열 22 + 서열 23, 및 서열 20 + 서열 21)를 사용하는 익스팬드 하이 피델러티 태크 (Expand High Fidelity Taq)(Roche)로 100 ㎕ PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭된 9F12 이뮤노글로불린으로부터의 단편을 Qiaex II 수지를 사용한 1.5% SeaKem 아가로스로부터 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 단편에 대한 DNA 농도를 결정하였다. 정제된 9F12 이뮤노글로불린 단편을 TA-II (Invitrogen) PCR 클로닝 벡터에 별도로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 콜로니를 제조하고, 플라스미드 DNA를 서열화하였다.

9F12κ불변 영역의 발현 벡터로의 삽입: κ불변 도메인의 경우, κ불변 영역을 포함하는 플라스미드 DNA 5 ㎍ 및 SCS110 이. 콜라이로부터 정제된 벡터 p2BacMA에 대한 DNA 2 ㎍을 StuI 및 HindIII로 절단하였다. κ불변 영역을 포함하는 320 bp 단편 및 p2BacMA 벡터를 포함하는 7.1 kb 단편을 Quiex II로 겔 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 두 단편에 대한 DNA 농도를 결정하였다. 이어서, 정제된 단편을 래피드 (Rapid) 라이게이션 키트 (Roche)로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 박테리아 콜로니를 제조하고, 재조합 DNA를 서열화하여 적절한 κ불변 영역 삽입을 확인하였다. 생성된 플라스미드 벡터는 pTRABacLC_κ이었다.

IgG _γ1 불변 도메인의 벡터로의 부가: IgG_γ1불변 영역을 포함하는 플라스미드 DNA 5 ㎍ 및 벡터 pTRABacLC_κ에 대한 플라스미드 DNA 2 ㎍을 먼저 SpeI 및 XbaI으로 절단하여 IgG_γ1불변 도메인을 벡터에 부가하였다. IgG_γ1불변 영역의 1 kb 단편 및 pTRABacLC_κ벡터의 7.4 kb 단편을 Quiex II를 사용한 아가로스 플러그로부터 겔 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 두 단편의 DNA 농도를 결정하였다. 이어서, 정제된 단편을 래피드 라이게이션 키트 (Roche)를 사용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 콜로니를 제조하고, 제한 분석 및 제한 부위의 서열화에 의해 IgG_γ1삽입체의 라이게이션 및 배향을 결정하였다. 생성된 재조합 벡터는 pTRABacHuLC_κHC_γ1이었다.

상기 플라스미드 pTRABacHuLC_κHC_γ1을 추가로 정제하여 각각, 멜리틴 분비 서열과 C_γ1영역 서열 사이, 및 알칼리 포스파타제 분비 서열과 C_κ영역 서열 사이에 번역 종결 코돈을 부가하였다. 이러한 변형을 달성하기 위해, SpeI + ApaI으로 절단한 다음, pTRABacHuLC_κHC_γ1벡터를 선형화하였다. 이어서, 선형화된 벡터를 어닐링된 상보적인 프라이머 γ1-스터프1 (서열 53) 및 γ1-스터프1' (서열 54)과 함께 라이게이션하여 프레임내 종결 코돈을 도입하였다. 이후, 이러한 변형으로부터 형성된 벡터를, StuI (AGGCCT) + DraIII (CACnnnGTG)로 절단하여 선형화한 다음, 어닐링된 상보적인 프라이머 κ1-스터프1 (서열 55) 및 κ1-스터프1' (서열 52)과 함께 라이게이션하여 프레임내 종결 코돈을 도입하였다. 이러한 변형의 순 효과는 각각 도 6C 및 6D에 나타낸 서열에 제시되어 있다 (부가된 서열은 밑줄을 두번 긋고 두꺼운 글씨로 나타내어 강조했다).

λ불변 영역의 벡터로의 부가: RNeasy 기트 (Qiagen)를 사용하여 λ경쇄 이디오타입을 나타내는 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자로부터 얻어진 정제된 말초혈 림프구 (PBL)로부터의 총 RNA를 추출하였다.

제조자의 추천에 따라 수퍼스크립트 프리앰플리피케이션 (SuperScript Preamplification) 시스템 (Gibco BRL)을 사용하여 제1 스트랜드 cDNA 합성에 대한 템플레이트로서 총 RNA 약 2.0 ㎍을 사용하였다. 프라이밍을 위해 올리고 (dT)를 사용하였다. 합성된 단일 스트랜드 cDNA의 1/20을, PCR 반응에서 Vλ신호 서열의 일부와 동일한 상류 프라이머 (TTGCTTACTG CACAGGATCC GTG; 서열 47), 및 λ불변 영역의 마지막 몇몇 코돈 및 3' 비번역 영역의 일부에 상보적인 하류 프라이머(TGCCGTCGGC AGGAGGTATT TCATTATGAC TGTCTCCTTG CTATTATGAA CATTCTGTAG GGGCCA; 서열 48)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 pCRII 벡터 (Invitrogen)내에 클로닝하고 서열화하여 동일성을 확인하였다. 정확한 λ불변 영역 서열을 포함하는 플라스미드를 제2 PCR을 위한 템플레이트로 선택하였다. 이 반응에서, Jλ의 인접 하류의 λ불변 영역의 서열에 상응하는, 조작된 DraIII 제한 부위를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드인 Cλ-5'(서열 49) 및 λ불변 영역 인접 하류의 STOP 코돈에 걸쳐 있는 HindIII 포함 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머인 Cλ-3' (서열 50)을 이용하였다. 생성된 PCR 생성물을 pCR2.1-TOPO 벡터내에 클로닝하고 서열화하였다. λ불변 영역 서열을 포함하는 단편을 삽입체의 배향에 따라 몇몇 플라스미드로부터의 HindIII 제한으로 방출시켰다. HindIII로 절단하여 선형화한 다음, 제한 단편을 겔 단리하고, pTRABacHuLC_κHC_γ1(도 5A)내에 클로닝하여 λ및 κ불변 영역 둘 다를 포함하는 중간체 플라스미드를 생성시켰다. 이 플라스미드를 StuI 및 DraIII로 제한하여 κ서열을 제거하였다. 이어서, 선형화된 플라스미드를 어닐링된 상보적인 프라이머 λ-스터프1 (서열 51) 및 λ-스터프1'과 함께 라이게이션하여 최종 형태의 pTRABacHuLC_λHC_γ1(도 5B)을 생성시켰다.

pTRABacHuLC_κHC_γ1및(또는) pTRABacHuLC_λHC_γ1의 구조물에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머의 종류는 하기 표 2 및 3에 나타낼 수 있다.

pTRABacHuLC_κHC_γ1및(또는) pTRABacHuLC_λHC_γ1을 사용하여, κ또는 λ불변 영역과 알칼리 포스파타제 신호 서열 사이의 특이적 클로닝 서열StuI 및DraIII를포함하는 임의의 V_α또는 V_β쇄에 대한 유전자, 및 IgG_γ1불변 영역과 멜리틴 분비 신호 서열 사이의 특이적 클로닝 서열SpeI 및ApaI을 포함하는 임의의 V_β또는 V_α쇄에 대한 유전자를 삽입할 수 있다. 이어서, 생성된 발현 벡터를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)(Sf-9) 곤충 세포로의 형질도입에 이용하여 재조합 버딩 바쿨로바이러스를 생산할 수 있다. 이후, 재조합 바쿨로바이러스를 Sf-9 세포에서 단계적으로 증폭시켜 높은 역가의 재조합 바쿨로바이러스 스톡을 제조하였다. 이러한 높은 역가의 재조합 바쿨로바이러스 스톡을 이용하여 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni(High-5)) 세포를 감염시킨 다음, 키메라 TCR/Ig 단백질을 제조하였다.

실시예 3.환자 유래의 이디오타입 V _α 및(또는) V _β 쇄에 대한 유전자의 발현 벡터로의 삽입

V_α및(또는) V_β쇄에 대한 종양 유래의 서열을 상기와 같이 단리한 다음, 멜리틴 리더 펩티드 (V_β쇄 클로닝의 경우) 말단의 40개의 뉴클레오티드 (서열 8 - ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTA CATCTATGCG), 알칼리 포스파타제 리더 펩티드 말단의 31개의 뉴클레오티드(V_α쇄 클로닝의 경우) (서열 9 - AGGCCTGAGG CTACAGCTCT CCCTGGGC) 및 상기 기재된 분석으로부터 결정된 각각의 V_α또는 V_β유전자의 처음 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하였다. α또는 β쇄 불변 영역으로부터의 CA (CA/IgK; 서열 15)의 염기쌍 4 내지 36, 및 CB (CB/IgG₁; 서열 14)의 염기쌍 6 내지 35에 상보적인 역 올리고뉴클레오티드 프라이머. 클로날 V_α또는 V_β서열을 갖는 것으로 이미 확인된 재조합 플라스미드를 제2 PCR 라운드를 위한 템플레이트로 사용하였다. 사이클링 조건은 상기 설명한 바와 같다.

V _α 영역의 발현 벡터로의 삽입: 서열 확인된 플라스미드 시료로부터 증폭된 PCR 유래의 DNA 단편을 제한 효소StuI 및DraIII로 절단한 다음, 아가로스 겔 상에서 분리하였다. V_α유전자를 포함하는 약 360 bp의 추정의 단편을 용출시키고,적절한 바쿨로바이러스 이뮤노글로불린 발현 전달 벡터내에 삽입하였다. 기본적으로, PCR 유래의 V_α생성물, 및 상응하는 pTRABacHuLC_κHC_γ1또는 pTRABacHuLC_λHC_γ1카세트 벡터 2 ㎍을StuI 및DraIII로 절단하였다. 환자 유래의 V_α쇄로부터의 360 bp의 DNA 단편 및 선형 pTRABacHuLC_κHC_γ1또는 pTRABacHuLC_λHC_γ1벡터에 대한 8.4 kb 단편을, Qiaex II 수지를 사용한 아가로스 겔 플러그로부터 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 두 단편에 대한 DNA 농도를 결정한 다음, 래피드 라이게이션 키트 (Roche)를 사용하여 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 콜로니를 제조하고, 제한 분석 및 서열화에 의해 재조합 DNA 플라스미드를 확인하였다. 생성된 벡터는 pTRABacV_αHuLC_κHC_γ1또는 pTRABacV_αHuLC_λHC_γ1으로 명명하였다.

V _β 쇄의 발현 벡터로의 삽입: 서열 확인된 플라스미드 시료로부터 증폭된 PCR 유래의 DNA 단편을 제한 효소SpeI 및ApaI으로 절단하였다. V_β유전자를 포함하는 약 360 bp의 절단된 단편을 겔 정제하고, 관련된 V_α유전자를 포함하는 적절한 바쿨로바이러스 이뮤노글로불린 발현 전달 벡터인 pTRABacV_αHuLC_κHC_γ1또는 pTRABacV_αHuLC_λHC_γ1, 또는 관련된 V_α유전자를 포함하지 않는 pTRABacHuLC_κHC_γ1내에 삽입하였다. 기본적으로, PCR 유래의 V_β생성물, 및 pTRABacV_αHuLC_κHC_γ1,pTRABacV_αHuLC_λHC_γ1, pTRABacHuLC_κHC_γ1벡터의 DNA 2 ㎍을SpeI 및ApaI으로 절단하였다. V_β쇄의 360 bp 단편 및 pTRABacV_αHC_γ1, pTRABacV_αHuLC_κHC_γ1또는 pTRABacV_αHuLC_λHC_γ1벡터의 8.8 kb 단편 또는 pTRABacHuLC_κHC_γ1벡터의 8.4 kb 단편을, Qiaex II 수지를 사용한 아가로스 겔 플러그로부터 정제하고, 물 50 ㎕로 용출시켰다. 두 단편에 대한 DNA 농도를 결정한 다음, 래피드 라이게이션 키트 (Roche)를 사용하여 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물로 컴피턴트 XL1-블루 이. 콜라이를 형질전환시키고, LB-카르베니실린 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미니프렙 콜로니를 제조하고, 재조합 DNA 플라스미드를 서열화하였다. 생성된 벡터는 pTRABacV_αHuLC_κV_βHC_γ1, 또는 pTRABacV_αHuLC_λV_βHC_γ1또는 pTRABacHuLC_κV_βHC_γ1으로 명명하였다.

실시예 4.V _α 및(또는) V _β 쇄 이디오타입을 포함하는 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용한 곤충 세포주의 형질감염 및 재조합 키메라 단백질의 생산:

곤충 세포 배양: 변형된 바쿨로바이러스 벡터로 2가지 확립된 곤충 세포주 (Sf9및 High-5)를 형질감염시켜 재조합 키메라 V_H/이뮤노글로불린 및(또는) V_L/이뮤노글로불린 단백질을 제조하였다. 140 내지 150 rpm으로 작동하며 50% 이하의 액체 용적을 갖는, 배기구를 갖춘 일회용 무균 진탕 플라스크 (Coming)를 이용하여 모든 곤충 세포를 28 ℃에서 겐타마이신 50 ㎍/L를 함유하는 ESF-921 혈청 무함유 곤충 배지 (Expression Systems LLP) 중에서 배양하였다. 세포를 2일 내지 3일마다 계대배양하였다. 동결 세포를 각각의 제품 로트에 대해 운영되는 세포 은행으로부터 또는 6주마다 해동시켜 (Cryo-보존 배지: 10% DMSO, 40% ESF-921 배지, 50% High-5 조정 배지), 바쿨로바이러스에 의한 감염에 대해 신축적이지 않은, 대수적으로 성장하는 세포의 지속적인 스톡을 보장하였다.

Sf9 세포 형질감염 및 재조합 분석: BacVector-3000 형질감염 키트 (Invitrogen)를 사용하여 V_α및(또는) V_β영역에 대한 유전자, 및 이뮤노글로불린 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 변형된 바쿨로바이러스 발현 벡터로Sf9세포를 공동 형질감염시켰다. 10개의 개별 플라크를 아가로스 오버레이로부터 떠내었다. 단리된 플라크로부터의 바이러스를 사용하여 5 ml ESF-921 배지에서 50% 전면배양으로, Sf-9 세포를 파종한 T-25 플라스크를 감염시켰다. T-25 플라스크에서 증폭된 클로날 바이러스 단리체를, 2가지 프라이머 (서열 37 - TTTACTGTTT TCGTAACAGT TTTG 및 서열 38 - GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)를 사용하는 PCR에 의해 시험하여 단리된 플라크의 클론성 및 야생형 바이러스 오염의 부재를 확인하였다. 일반적으로, 재조합 전달 벡터 플라스미드 200 ng을, Bac Vector 매뉴얼 (Novagen)에 기재된 바와 같이 제공된 유펙틴 (Eufectin) 액체 시약을 사용하여 트리플-컷 Bac-Vector-3000과 함께 공동 형질감염시켰다. 이 형질감염 혼합물을 단계적으로 5배 희석하였다. 100 마이크로리터 분획을, 2.5 x 10⁶개의 부착성 Sf9 세포를 포함하는 60 mm 조직 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 1시간 후, 세포를 ESF-921 배양 배지에서 1% 아가로스 용액 4 ml로 오버레이하였다. 형질감염 144시간 후, 뉴트럴 레드 (Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 생존 세포에 대하여 염색한 다음, 아가로스 오버레이에서 배양된 형질감염된 세포로부터 10개 클론을 각각 떠내었다. 바이러스를 ESF-921 배지 1 ml에서 밤새 증식한 플라크 플러그로부터 용출시켰다. Sf-9 세포를 T-25 플라스크에 ESF-921 배지 5 ml 중 50% 전면배양으로 파종하고, 용출된 클로날 바이러스 0.5 ml로 감염시켰다. 감염 96시간 후에, 배지 0.5 ml를 T-25 플라스크로부터 빼내어, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 니트로셀룰로스상 도트 블로팅에 의해 이뮤노글로불린 활성에 대하여 분석하였다. 또한 야생형 바이러스의 부재를 하기와 같이 PCR에 의해 시험하였다.

재조합 바쿨로바이러스를 포함하는 감염성 상청액 (10 ㎕)을, 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.1 mg/ml 젤라틴, 0.45% 노니뎃 (Nonidet) P-40 및 0.45% 트윈-20을 포함하는 용해 완충액 (프로테이나제-K 6 ㎍포함) 90 ㎕에 가하였다. 혼합물을 60 ℃에서 1시간 동안 가열하고, 95 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 프로테이나제-K를 변성시켰다. 가열된 혼합물 25 ㎕를 냉각시킨 다음, 새 PCR 튜브로 옮기고, 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.1 mg/ml 젤라틴, 0.45% NP-40, 0.45% 트윈-20, 400 μM의 각 dNTP, 5 mM MgCl₂, 50 pM의 각 PCR 프라이머 (최종), 및 2.5 U의 Taq 폴리머라제 (Roche)를 포함하는 혼합물 25 ㎕를 가하였다. 92 ℃에서 1분, 58 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1분 동안의 40 사이클로 바이러스 DNA를 증폭시켰다. 재조합 바쿨로바이러스의 PH 정방향 프라이머 (서열 37) 및 PH 역방향 프라이머 (서열 38)를 사용하여 T 세포 수용체 유전자의 일부를 발현시키는 폴리헤드론 로커스를 증폭시켰다. 아가로스 겔을 통한 전기영동 후에 PCR 생성물을 분석하였다. 재조합 바쿨로바이러스는 1300 bp의 단편을 증폭시켰지만, 야생형 바쿨로바이러스는 상기 프라이머 세트를 갖는 약 800 bp의 단편을 생성하였다. 야생형 바이러스로 오염된 재조합 바이러스는 두 단편의 크기를 증폭시켰다.

Sf-9 곤충 세포에서 높은 역가의 바이러스 스톡의 제조: T-25 1차 배양물 2 ml를, ESF-921 배지 10 ml에서 50% 전면배양으로 Sf-9 세포를 포함하는 T-75 플라스크로 옮기고, 세포를 28 ℃에서 120시간 동안 배양하였다. 2차 T-75 배양물 5 ml를, Sf-9 세포 50 ml를 2 x 10⁶세포/ml의 밀도로 포함하는 150 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 세포를 28 ℃에서 120시간 동안 배양하였다. 150 ml 진탕 플라스크로부터의 25 ml를 1L 진탕 플라스크에서 2 x 10⁶세포/ml 밀도의 Sf-9 세포 500 ml에 넣고, 28 ℃에서 배양하였다. 배양물이 20%에 도달했을 때, 트립판 블루 염색 (감염 후 시간 t는 120 내지 144시간임)으로 생존 세포의 점수를 매기고, 바이러스 배양물을 3000 x g로의 원심분리에 의해 수획하여 50 ml 무균 튜브들에 나누어 담고, 튜브의 절반을 -80 ℃에서 정치시켜 4 ℃에서 보관하였다. 이후, 수획된 높은 역가 (1 x 10⁸pfu/ml 초과)의 바이러스 스톡 500 ml로 High-5 곤충 세포를 감염시켜 키메라 단백질을 생산하였다. 바쿨로바이러스 래피드 역가 키트 (Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 바이러스 역가 (pfu/ml)를 결정하였다.

High-5 곤충 세포에서 TCR/Ig 키메라 단백질의 생산: High-5 곤충 세포 (BTI-TN-5B1-4)는 Sf-9 세포에 비해 재조합 이뮤노글로불린을 높은 수준 (2 내지 20배)으로 분비하였으며, TCR/Ig 키메라 단백질의 생산을 위해 선택되는 세포주이다. 배기 밀폐구를 갖춘 1리터 용량의 1회용 배양 플라스크내의 ESF921 배지 (Expression Systems LLP)에서 초기 대수기 High-5 세포 (1.0 내지 2.0 x 10⁶세포/ml)를 5 x 10⁵세포/ml의 밀도로 파종하였다. 플라스크를 28 ℃에서 140 내지 150 rpm으로 진탕하고, 플라스크내 배지의 부피를 시간에 따라 500 ml 이하로 조정하였다. 세포 밀도가 500 ml 배지에서 1.5 내지 2.5 세포/ml에 도달했을 때, 높은 역가의 재조합 바쿨로바이러스 스톡을 사용하여 플라스크를 대략 0.5:1 (pfu/세포)의 다중 감염도 (MOI)로 감염시켰다. 이어서, 플라스크를 28 ℃에서 140 내지 150 rpm으로 진탕하였다. 세포 생존율을 매일 확인하고, 감염후 96시간 이내에 생존율이 50% 미만으로 감소되지 않는 경우에 배양물을 수획하였다.

실시예 5.V _α 이뮤노글로불린 및 V _β 이뮤노글로불린을 포함하는 키메라 단백질의 정제

60분 동안 약 5,000 x g로 원심분리한 다음, 0.2 μPES 무균 필터 유닛을 통해 여과하여 세포 및 찌꺼기를 제거하였다. 단백질-A 하이 트랩 (High-Trap) 카트리지 (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 처리한 다음, 50% 포화 암모늄 술페이트 중에 침전시켜 투명한 조직 배양 배지로부터 키메라 단백질을 정제하였다. 정제된 키메라 단백질을 크기 분리하고, FPLC 크로마토그래피에 의해 PBS로 완충액 교환하였다. 단백질 정제에 사용되는 모든 시약은 USP 생물공학 등급 (GenAr, Mallinckrot Baker, Parris, KY)의 것이었으며, 내독소는 제조자에 의해 시험되었다. 무균 USP 등급의 물을 사용하여 모든완충액 및 기타 용액을 제조하였다. 완충액 및 기타 용액은 생물학적으로 안전한 캐비넷에서 제조하였으며, 0.2 ㎛ PES 필터 유닛을 통해 무균 여과하였다.

키메라 단백질의 단백질 A 세파로스 친화성 정제: 조직 배양 배지를 성장 배양 플라스크로부터 제거하고, 60분 동안 5,000 x g로 회전시켜 세포 및 찌꺼기를 침전시켰다. 0.2 μPES 필터 유닛을 사용하여 여과하여 상청액을 무균화하였다. Tris 완충액 (1M, pH 7.4)을, V_H및(또는) V_L이뮤노글로불린 키메라 단백질을 포함하는 여과된 배지에 20 mM의 최종 농도로 가하였다. 세정 플라스크내에 통과 유체를 모으는 연동 펌프 (Amersham Pharmacia)를 사용하여 완충된 조직 배양 상청액을 1 내지 5 ml/분의 유속으로 5 ml 하이트랩 재조합 단백질 A 세파로스 친화성 카트리지상에 로딩하였다. 칼럼을 PBS (pH 7.4) 25 ml로 5 ml/분의 유속으로 세척하였다. 흐름 방향을 반전시키고, 컬럼을 추가의 PBS 25 ml로 세척하였다. 0.05M 시트르산 (pH 3.5)을 사용하여 1 ml/분의 유속으로 칼럼을 역으로 용출시키고, 1 ml 분획을 모았다. 1M Tris (pH 9.0) 0.3 ml를 용출된 1 ml 분획에 가하여 pH를 대략 8.0으로 즉시 조절하였다. 단백질 G, 단백질 L, 또는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 단백질 칼럼을 동일한 방식으로 사용할 수 있었다.

키메라 단백질의 암모늄 술페이트 침전물: 단백질 A 세파로스로부터 용출된 분획을 포함하는 V_α및(또는) V_β-Ig를 분광광도법으로 확인하였다. 피크 분획을 푸울링하고, 부피를 측정하였다. 이어서 동등한 부피의 암모늄 술페이트 포화 용액을 혼합하면서 적가하였다. 침전물을 실온에서 15분 동안 정치한 다음, 5000 x g로 원심분리하여 침전시켰다. 침전된 V_α및(또는) V_β-Ig 키메라 단백질을 무균수에 재용해시켰다. 하이트랩 탈염 카트리지 (Amersham Pharmacia)를 사용하여 V_α및(또는) V_β-Ig 키메라 단백질을 PBS 중에서 완충액-교환한 다음, 0.2μ 필터를 통해 최종 무균 여과하였다.

실시예 6.키메라 단백질과 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)의 결합:

정제 후에, V_α및(또는) V_β-Ig 키메라 단백질을 다음과 같이 글루타르알데히드 가교결합을 통해 GMP 등급 KLH (VACMUNE, Biosyn Corporation)에 결합시켰다. 정제된 무균의 이디오타입 키메라 단백질 5 mg 이상을 무균의 15 ml 원뿔형 튜브에서 같은 중량의 KLH와 배합하고, PBS 중 9 ml로 최종 조절하였다. 1% 글루타르알데히드 (25% 등급 1 수용액, Sigma) 1 ml를 0.1%의 최종 농도로 적가하였다. 이어서, 튜브를 실온에서 4시간 동안 천천히 진동시켰다. 컨쥬게이트를 무균 일회용투석기 (DispoDialyzers)(Spectrum Labs)에서 2리터 무균 PBS에 대하여 투석하고, 생물학적으로 안전한 후드에서 24시간 이상에 걸쳐 완충액을 3회 교환하였다. 최종 V_α및(또는) V_β-Ig 키메라 단백질-KLH 컨쥬게이트를 투석 챔버로부터 무균적으로 제거하고, 무균 튜브에 옮기고, 혼합한 다음, 바이알로 분획화하였다. 최종 생성물의 각 바이알에 로트 번호, 환자 식별기, 바이알 번호 및 날짜를 표지하고, 바이알들로 나누었다. 최종 로트의 10%를 무균성에 대하여 시험하고, 바이알을 선택하여 내독소에 대하여 시험하였다.

실시예 7.제품 시험:

제조 로트 상청액을 포함하는 바쿨로바이러스의 DNA 서열: 감염된 곤충 세포 제조 배양물 상청액의 샘플 1 ml 분획을 수획하고, 데스크탑 원심분리로 3000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 세포 찌꺼기를 제거하였다. 바쿨로바이러스 입자를 포함하는 이와 같은 투명한 상청액 0.1 ml 이상을, 1 내지 9의 부피 비율로 용해 완충액 (10 mM Tris, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml 젤라틴, 0.45% 노니뎃 P-40, 및 0.45% 트윈-20)과 합하고, 60 ℃에서 1시간 동안 프로테이나제 K (최종 농도 60 ㎍/ml)로 단백질분해한 다음, 95 ℃에서 15분 동안 변성시켰다. 이어서, PCR 반응을 수행하기 위해, 상기 용해물 25 ㎕를, 400 μM의 각 dNTP, 5 mM MgCl₂, 25 pmol 올리고뉴클레오티드 (서열 32 및 서열 35; 또는 서열 36 및 서열 37)(표 4 참조), 및 2.5 U Taq 폴리머라제 (Roche)를 포함하는 상기 용해 완충액 추가의 25 ㎕와 함께 합하였다. 사이클링 조건은 다음과 같다: (i) 92 ℃에서 2분 동안의 초기 변성, (ii) 이후 92 ℃, 58 ℃ 및 72 ℃에서 각각 1분의 40 사이클, 및 (iii) 72 ℃에서 7분의 최종 연장. 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 생성물을 예상 크기 및 양에 대하여 평가하였다. 이후, 2종 이상의 네스티드 프라이머를 사용하여 PCR 생성물을 직접 서열화하였다. 상기 기재된 바와 같이 오픈진 자동 DNA 서열화 시스템 (Visible Genetics) 및 서열화 분석 소프트웨어를 사용하여 완전한 V_α및(또는) V_β뉴클레오티드 서열을 결정하고, 환자의 이디오타입에 상응하는 pTRABac(NHL-FV-8786-XXX) 벡터의 V-유전자 서열과 비교하였다.

항 인간 IgG ELISA의 이뮤노글로불린 분석을 이용한 키메라 단백질의 분석: 4 ℃에서 밤새 탄산 완충액 중 염소 항-인간 IgG 중쇄 특이적 항체 (Fischer, Pittsburgh, PA)의 3 ㎍/ml 희석액 100 ㎕로 미세역가 플레이트 웰을 코팅하고, TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) 100 ㎕로 2회 세척하였다. 이어서, 22 ℃에서 1시간 동안 웰을 TBSB (TBS + 1% BSA) 200 ㎕로 차단하였다. 2배의 단계 희석액 중 희석된 샘플 100 ㎕를 웰에 반복적으로 가하고, 22 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 정제된 인간 IgG₁/κ 또는 IgG₁/λ 표준물 (Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 이 분석을 반복하였다. TBST (TBS + 0.1% 트윈 20) 200 ㎕를 사용하여 웰을 4회 세척하였다. 검출 항체인 염소-항-인간 H 및 L-HRP (Chemicon, Temecula, CA)를 TBSB 중에 1:2000으로 희석하고, 100 ㎕를 웰에 가하여 22 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBST 200 ㎕로 웰을 6회 세척하였다. 기질 (TMB 1 성분, KPL Inc., Gaithersburg, MD) 100 ㎕를 웰에 가하고, 30분 동안 전개시키고, 샘플을 OD₆₅₀크로마토그램으로 측정하였다. 하이트랩 탈염 칼럼으로부터 용출된 주요 단백질 피크는 인간 IgG ELISA 활성에 상응해야 한다.

실시예 8.키메라 단백질의 농도 및 순도:

제조 상청액 중 바쿨로바이러스의 V_α및(또는) V_β유전자의 DNA 서열은 제조 벡터의 DNA 서열과 동일해야 한다. 키메라 단백질의 농도는 OD₂₈₀을 기준으로 0.5 mg/ml를 초과해야 하며, 인간 IgG ELISA 활성에 상응해야 한다.

하기 표 4는 최종 생성물 동일성을 확인하는데 사용된 프라이머 서열의 요약을 나타낸다.

실시예 9.V _α 및(또는) V _β -Ig 키메라 단백질 및(또는) 그의 사이토카인과의 컨쥬게이트의 공동 투여:

쥐의 T 세포 림프종 라인 RMA에 의해 발현된 TCR Vβ12 유전자 (문헌 (Van Hall et al., Identification of a Novel Tumor-Specific CTL Epitope Presented by RMA, EL-4, and MBL-2 Lymphomas Reveals Their Common Origin. J. Immunol, 165:869-877; 2000)에 기재된 바와 같음)를, 멜리틴 리더 펩티드 말단의 40개의 뉴클레오티드 및 쥐의 Vβ12의 처음 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 5' 올리고뉴클레오티드 (서열 56: TTACTAGTTT TTATGGTCGT GTACATTTCT TACATCTATG CTGACGCTGG AGTTACCCAG A) 및 쥐의 Cb 및 인간 IgG₁의 5' 말단에 상보적인 3' 올리고뉴클레오티드 (서열 57: AGGAGACCTT GGGTGGAGTC GGGCCCTTCA GATCCTC)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 클로닝하였다. 형성된 PCR 생성물 (도 X 마지막 페이지 참조)을 pTRABacHuLC_κHC_γ1의 SpeI/ApaI 부위에 클로닝하여 벡터 pTRABacHuLC_κV_β-RMAHC_γ1을 형성시켰다. TCR V_β-RMAHC_γ1키메라 단백질을 곤충 세포에서 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 정제하였다. 이러한 단백질의 예로서 (도 9), C57/B16 마우스에 10,000 RMA T 세포 림프종 세포를 접종한 다음, 36시간 후에 100,000 IU/ml 농도의 사이토카인 GM-CSF와 함께 500 ㎍/ml 농도의 RMA-특이적 V_β-Ig 키메라 단백질을 포함하는 조성물로 처리하였다. 이 백신접종을 1x + GM-CSF x3로 매일 제공하였다. 이후 정확한 처리 프로토콜을 14일 간격으로 반복하였다. 이러한 방식으로 주사한 마우스의 60%가 종양 이식 40일 후 생존하였지만, 대조구 마우스의 90% 이상은 종양 추가항원자극으로 인해 사망하였다.

RMA Vb PCR 생성물의 서열은 다음과 같다 (꿀벌 멜리틴 신호 서열 포함):

이상 본 발명을 설명하였지만, 당업자라면 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 과도한 실험 없이도 동등한 파라메타, 농도 및 조건의 폭넓은 범위내에서 본 발명을 수행할 수 있음을 알 것이다.

본 발명은 그의 특정 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 추가로 변형시킬 수 있는 것으로 이해된다. 본 출원은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되거나 통상적으로 실시되며 하기 첨부된 청구의 범위에서와 같이 기재된 본질적인 특징으로 적용될 수 있는 바와 같이, 일반적으로 본 발명의 원리를 따라, 본원의 개시를 벗어나는 것을 비롯하여 본 발명을 임의로 변형, 이용 또는 개량하는 것을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims (56)

1. TCR의 V_β또는 V_α영역의 적어도 일부 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부 (상기 V_β또는 V_α영역은 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 T 세포로부터의 특정 TCR과 결합함)를 포함하는 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물의 투여로 상기 환자의 T 세포 매개 병증이 개선되는 것인, 상기 환자에서 T 세포 매개 병증을 개선하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 TCR의 V_α또는 V_β영역의 적어도 일부 및 제2 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 제2 키메라 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 IgG_γ1불변 영역을 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질의 TCR의 상기 V_α또는 V_β영역이 V_β인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질의 TCR의 상기 V_α또는 V_β영역이 V_α인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 상기 V_α또는 V_β영역과 상기 이뮤노글로불린 불변 영역 부분 사이에 링커 영역 (이는 TCR의 C_β또는 C_α영역의 일부이지만 전체 C_β또는 C_α영역은 아님), 또는 합성 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 제2 키메라 단백질이 상기 V_α또는 V_β영역과 상기 이뮤노글로불린 불변 영역 부분 사이에 제2 링커 영역 (이는 TCR의 C_β또는 C_α영역의 일부이지만 전체 C_β또는 C_α영역은 아님), 또는 합성 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 키메라 단백질의 TCR의 상기 V_α또는 V_β영역이 V_β이며, 상기 제2 키메라 단백질의 TCR의 상기 V_α또는 V_β영역이 V_α인 방법.
9. 제2항에 있어서, 상기 제2 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 κ또는 λ불변 영역을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, TCR의 상기 V_β영역이 전체 V_β영역인 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 V_β영역이 전체 V_β영역을 포함하며, 상기 C_β부분이 TCR β쇄 불변 영역(C_β)으로부터의 처음 9개의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, TCR의 상기 V_α영역이 전체 V_α영역인 방법.
13. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 V_α영역이 전체 V_α영역을 포함하며, 상기 링커 영역이 TCR α쇄 불변 영역(C_α)으로부터의 처음 9개의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 IgG_γ1불변 영역, 인간 IgG_γ2불변 영역, 인간 IgG_γ3불변 영역, 인간 IgG_γ4불변 영역, 인간 IgA₁불변 영역, 인간 IgA₂불변 영역, 인간 IgM 불변 영역, 인간IgD 불변 영역, 인간 IgE 불변 영역, 인간 κ쇄 불변 영역 및 인간 λ쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서,

    상기 T 세포 매개 병증을 앓는 환자의 T 세포로부터의 TCR의 상기 V_β또는 V_α영역을 코딩하는 유전자를 단리하는 단계;

    TCR의 상기 V_β또는 V_α영역을 코딩하는 상기 유전자, 링커 영역, 및 상기 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자를 발현 벡터내에 삽입하여 상기 제1 키메라 단백질을 발현시키는 단계;

    상기 발현 벡터를 곤충 세포주에 도입하여 상기 키메라 단백질을 생산하는 단계; 및

    상기 키메라 단백질을 단리하는 단계

    를 포함하는 방법에 의해 상기 키메라 단백질을 생산하는 방법.
16. 제15항에 있어서, TCR의 V_β또는 V_α영역을 코딩하는 유전자, 링커 영역, 및 제2 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 코딩하는 유전자를, 상기 발현 벡터내에 삽입하여 상기 제2 키메라 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 키메라 단백질의 상기 링커 영역이 TCR의 C_β또는 C_α영역의 일부이지만 전체 C_β또는 C_α영역은 아니거나, 합성 링커 영역인 방법.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 키메라 단백질을 운반 단백질에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 운반 단백질이 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH)인 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 사이토카인 또는 케모카인과 추가로 공동 투여되는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 사이토카인이 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)인 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 케모카인이 단핵구 주화성 단백질 3 (MCP 3)인 방법.
23. 제15항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바쿨로바이러스 발현 벡터인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스 발현 벡터가 꿀벌 멜리틴 분비 신호 서열 및 인간 태반 알칼리 포스파타제 분비 신호 서열을 포함하는 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 바쿨로바이러스 발현 벡터가 바쿨로바이러스 AcNPV p10 프로모터 및 AcNPV 폴리헤드린 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 p10 프로모터가 꿀벌 멜리틴을 조절하며, 상기 폴리헤드린 프로모터가 인간 태반 알칼리 포스파타제를 조절하는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, TCR의 상기 V_β영역을 코딩하는 상기 유전자 및 상기 제1 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 상기 유전자가 상기 바쿨로바이러스 발현 벡터에서 상기 p10 프로모터에 의해 조절되고, TCR의 상기 V_α영역을 코딩하는 상기 유전자 및 상기 제2 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 상기 유전자가 상기 바쿨로바이러스 발현 벡터에서 폴리헤드린 프로모터에 의해 조절되는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, TCR의 상기 V_β또는 V_α영역을 코딩하는 상기 유전자 및 상기 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 상기 유전자가 상기 바쿨로바이러스 발현 벡터에서 상기 p10 프로모터 또는 폴리헤드린 프로모터에 의해 조절되는 것인 방법.
28. 제15항에 있어서, 상기 제1 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 상기 유전자가 인간 IgG_γ1유전자를 포함하는 것인 방법.
29. 제16항에 있어서, 상기 제2 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 κ또는 λ불변 영역 유전자를 포함하는 것인 방법.
30. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 불변 영역을 코딩하는 상기 유전자가 인간 IgG_γ1불변 영역, 인간 IgG_γ2불변 영역, 인간 IgG_γ3불변 영역, 인간 IgG_γ4불변 영역, 인간 IgA₁불변 영역, 인간 IgA₂불변 영역, 인간 IgM 불변 영역, 인간 IgD 불변 영역, 인간 IgE 불변 영역, 인간 κ불변 영역 및 인간 λ불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
31. 제15항에 있어서, 상기 제1 키메라 단백질이 TCR V_β-C_β-IgG_γ1, TCR V_α-C_α-κ또는 TCR V_α-λ인 방법.
32. 제16항에 있어서, 상기 제1 및 제2 키메라 단백질이 TCR V_β-C_β-IgG_γ1및 TCR V_α-C_α-κ, 또는 TCR V_β-C_β-IgG_γ1및 TCR V_α-C_α-λ인 방법.
33. 제13항에 있어서, 상기 곤충 세포주가 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni)(Hi-5) 또는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)(sf9) 세포주인 방법.
34. 제15항 또는 제16항에 있어서, ELISA에 의해 상기 키메라 단백질의 발현을 분석하는 방법.
35. 제15항 또는 제16항에 있어서, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 이뮤노글로불린 결합 도메인에 결합할 수 있는 기타 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 사용하여 상기 키메라 단백질을 단리하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 이뮤노글로불린 결합 도메인에 결합할 수 있는 상기 기타 단백질이 항-이뮤노글로불린 항체인 방법.
37. 제1항에 있어서, 상기 T 세포 매개 병증이 T 세포 림프종인 방법.
38. 제1항에 있어서, 상기 T 세포 매개 병증이 다발성 경화증, 전신성 홍반 루푸스, 당뇨병, 염증성 장질환, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염 및 갑상선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역성 질환인 방법.
39. TCR의 V_β또는 V_α영역의 적어도 일부 및 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 키메라 단백질 (상기 V_β또는 V_α영역은 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 T 세포 클론으로부터의 특정 TCR과 결합함)을 포함하는, 상기 환자의 T 세포 매개 병증을 개선시키는 조성물.
40. 제39항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 상기 V_α또는 V_β영역과 상기 이뮤노글로불린 불변 영역 부분 사이에 링커 영역 (TCR의 C_β또는 C_α영역의 일부이지만 전체 C_β또는 C_α영역은 아님), 또는 합성 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
41. 제39항에 있어서, TCR의 V_β및 V_α영역의 적어도 일부 및 제2 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 제2 키메라 단백질을 추가로 포함하며, 상기 V_β및 V_α영역이 T 세포 매개 병증을 앓는 환자 유래의 T 세포 클론으로부터의 특정 TCR과 결합하는 것인 조성물.
42. 제40항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 상기 V_α또는 V_β영역과 상기 이뮤노글로불린 불변 영역 일부 사이에 링커 영역 (TCR의 C_β또는 C_α영역의 일부이지만 전체 C_β또는 C_α영역은 아님), 또는 합성 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
43. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 제13항 또는 제14항에 따라 생산되는 것인 조성물.
44. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 IgG_γ1불변 영역, 인간 IgG_γ2불변 영역, 인간 IgG_γ3불변 영역, 인간 IgG_γ4불변 영역, 인간 IgA₁불변 영역, 인간 IgA₂불변 영역, 인간 IgM 불변 영역, 인간 IgD 불변 영역, 인간 IgE 불변 영역, 인간 κ쇄 불변 영역 및 인간 λ쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
45. 제39항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 불변 영역이 TCR의 상기 V_β영역에 작동가능하게 연결된 IgG_γ1불변 영역을 포함하는 것인 조성물.
46. 제39항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 불변 영역이 TCR의 상기 V_α영역에 작동가능하게 연결된 κ또는 λ불변 영역을 포함하는 것인 조성물.
47. 제40항에 있어서, 상기 2가지 키메라 단백질이 V_β-IgG_γ1및 V_α-κ, 또는 V_β-IgG_γ1및 V_α-λ인 조성물.
48. 제39항 또는 제40항에 있어서, 운반 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
49. 제48항에 있어서, 상기 운반 단백질이 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH)인 조성물.
50. 제39항 또는 제40항에 있어서, 사이토카인 또는 케모카인과 추가로 공동 투여되는 조성물.
51. 제50항에 있어서, 상기 사이토카인이 과립구-대식세포-CSF인 조성물.
52. 제50항에 있어서, 상기 케모카인이 단핵구 주화성 단백질 3 (MCP 3)인 조성물.
53. 제39항 또는 제40항에 있어서, 면역요법제를 포함하는 조성물.
54. 제39항에 있어서, 상기 T 세포 매개 병증이 T 세포 림프종인 조성물.
55. 제39항에 있어서, 상기 T 세포 매개 병증이 다발성 경화증, 전신성 홍반 루푸스, 당뇨병, 염증성 장질환, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염 및 갑상선염으로이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역성 질환인 조성물.
56. 제39항에 있어서, 주사, 흡입, 경구 또는 경피 전달에 의해 추가로 투여되는 조성물.