JPH07501516A - ヒトの被験者におけるｈｉｖに反応するヘルパーｔリンパ球を刺激する多重決定基ペプチド抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの被験者におけるＨＩＶに反応するヘルパーＴリンパ球を刺激する多重決定 基ペプチド抗原 関連の出願 この出願は、１９９０年２月２８日に出願された米国出願番号０７／４９２．３ １８と、１９８８年１月２６日に出願された米国出願番号０７／１４８．６９２ の一部継続出願であり、両方とも、参考としてこの出願に組み込まれる。

発明の分野 この発明は、ＨＩＶ感染に対するワクチンの製造に有用であり、また、治療混合 物の成分として、またはＨＩＶ血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓ　１ｏｎ）の 診断キットの成分として、有効なペプチドを選択する方法に向けられている。こ の出願には、この方法で選択された一連のペプチドについても記述されている。

発明の背景 ＨＩＶに対する、弱毒化した生または不活化した全ウィルスワクチンは、最も広 範なウィルスの抗原決定基に対する免疫を刺激する能力がある。しかし、それら はまた、ウィルスによってできた、抑制されたエピトープまたはマスキングされ た炭水化物のような、免疫系から逃れるための構造や、ウィルスの感染性を増大 させる抗体（Ｔａｋｅｄａ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：５８ ０−５８３゜（１９８８）　：　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｗ、　Ｅ、　Ｊｒ、　ｅ むａ　１．、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ８６：４７１ ０−４７１４　（１９８９）：　Ｒｏｂｉｎｓ。

ｎ、Ｗ、Ｅ、Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、：Ｐｒｏｃ、Ｎａ　む　１　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：３１８５−３１８９（１９９０）　：Ｈａｌ ｓｔｅａｄ、Ｓ、Ｂ、５ｃｉｅｎｃｅ２３９　：４７６−４８１　（１９８８） ）や、ＨＩＶＩ：おける免疫不全に寄与し得る抗体またはＴ細胞（Ｗｅｉｎｈｏ ｌｄ、に、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｕｎｏ１１４２：３０９１− ３０９７（１９８９）：　５ｉｌｉｃｉａｎｏ、　Ｒ−Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ ｅ１ｌ　５４：５６１−５７５（１９８８）：　Ｍｉｔｌｌｅｒ、Ｒ，Ｓ、　ａ ｎｄ　Ｍ、に、Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：１３８０−１３ ８２　（１９８９）：Ｇｏｌｄｉｎｇ。

Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８３　：１４３０−１４ ３５　（１９８９））を増強するような有害な効果を引き起こす構造を含んでい るかもしれない。そのうえ、ＨＩＶのようなレトロウィルスについては、弱毒化 した生ワクチンだけでなく不活化したワクチンですら、全ウィルスワクチンの安 全性に対する懸念から、これらの全ウィルスワクチンは、多くの潜在的な被接種 者には受け入れられないかもしれない。精製したサブユニットワクチンは危険性 は少ないが、それでも全ウィルスワクチンの別の問題を抱えているかもしれない 。確かに、ウィルスは進化して免疫系を回避しているので、進化は、ワクチンと してほとんど適さないウィルス蛋白の発生を助は得る。したがって、進化によっ て反応を触媒するのに最も適切な形に磨き上げられている酵素とは違って、ウィ ルス蛋白は、より良いワクチンの開発のために性質を改良する少なからぬ機会を 科学者に残している。

（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｊ、Ａ、、　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８２ ：１８１１−１８１７　（１９８８））。

高度に設計された、合成または組換えの抗ウイルスワクチンを合理的にデザイン するには、免疫系の働きについて相当の知識、特に、ウィルスによって発現され る構造に対する免疫反応についての知識が必要である。本発明者らは、細胞毒性 Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原決定基を同定することを試みる研 究法（Ｔａｋａｈａｓｈ　ｉ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：３１０５−３１０９　（１９８８）；　Ｔａｋａｈ ａｓｈｉ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１１８−１２１　（１ ９８９）：　Ｔａｋａｈａｓｈ　ｉ、Ｈ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７０：２０２３−２０３５　（１９８ ９）：　Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｈ，ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ　１７１： ５７１−５７６（１９９０）：Ｈｏｓｍａｌｉｎ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８７　：２３４４−２３ ４８　（１９９０）’）と、ＣＴＬや抗体反応のいずれか一方に必要なヘルパー Ｔ細胞によって認識される抗原決定基を同定することを試みる研究法（Ｃｅａ　 ｓ　ｅ、に、Ｂ。

ｅｔ、　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４　： ４２４９−４２５３　（１９８７）：　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ、Ａ、　ｅｔ　 ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ３３４ニア０６−７０８　（１９８８）：ＣＩｅｒｉｃｉ 。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８３−３８５　（１９８９） 　：　Ｈａｌｅ、Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｌ：４０９−４１ｓ　（１９８９））を 創始した。しかしながら、いずれか一つの単一の抗原決定基を使用する際の考え られる問題は、Ｔ細胞は、宿主の主要組織適合性抗原遺伝子複合体（ＭＭＣ）に よってコードされた分子に関連した抗原を認識し、どの個体のＭＨＣ分子も、全 体として種が認識できる潜在的な抗原決定基のサブセットとしか結合および提示 しないであろうということである（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｂ、、　Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、１２０：１８０９−１８１２　（１９７８）：　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、 Ｒ，Ｈ，、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：２３７−２６１　（１９８ ５）：Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ、Ａ、、ｉｎ”Ｔｈｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ”、　 ｐｐ、１−１４６．Ｍ、Ｓｅ　ｌａ、ｅｄ　ｉ　ｔｏｒ、ｃ、１９８７　ｂｙ　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。このことは、マウスと同 様、人にも当てはまる（Ｓｉ１ｉｃｉａｎｏ、Ｒ−Ｆ、ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ　 ５４：５６１−５７５　（１９８８）：５ｃｈｒｉｅｒ、Ｒ，Ｄ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：１１６６−１１７６　（１９ ８９）：　Ｃａｌ　１ａｈａｎ、に、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　１４４：３３４１−３３４６（１９９０）：Ｍａｒｔｉｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、 。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４５：５４０−５４８　（１９９０）：Ｍａｒｔｉｎ、 Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７３：１９−２４　（１９９１ ）：Ｊａｒａｑｕｅｍａｄａ、Ｄ、ｅｔ　ａ　１．、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１． 　１４５：２８８０−２８８５　（１９９０）　）。

したがって、ヒトのように、広く異系交配した個体群に有用であるためには、ワ クチンは、そのような抗原決定基を多数含まなければならない。そのような抗原 決定基がいくつ含まれるべきかを示したデータは限られている。この数を達成す るのは非現実的ではないかという懸念はいくらかあるが、幾つかのデータによる と、その抗原決定基が４個あれば、異系交配したヒトの８５−９０％において反 応を誘引できることが示唆されている（Ｃ１ｅｒｉｃｉ、Ｍ、　ｅＬ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８３−３８５（１９８９））。

いくつかの抗原性ペプチドは、多くのＤＲ分子と関連した認識においては統一性 がないように見えることが認められている（Ｓｉｎｉｇａｇｌ　ｉａ、　Ｆ、ｅ ｔ　ａｌ、　、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：７７８−７８０　（１９８８）：Ｐａｎ ｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．１９：２２３７−２２４２　（１９８９））が、これは たぶん、ＤＲ分子が、保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）α鎖を共有するからで ある。マウスでは、幾つかの決定基は、α鎖を共有しない、異なる３つのＩ−Ａ 分子（Ｂｒｅｔｔ、Ｓ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４３ニア７１−７７９　（１９８９））、または、Ｉ−ＡとＩ−Ｅといった異 なるイソタイプのクラスＨのＭＭＣ分子によって提供される（Ｇｕｉｌ　ｌｅｔ 、Ｊ、−Ｇ、ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　二　８６５−８７０　（１９８７）　）　ことが報告 されている。しかし、このような統一性のないエピトープスがどのくらい一般的 なのかは、明らかになっていない。

ＨＩＶエンヴエローブの主なＴ細胞刺激部位の位置を決定する過程において、我 々は、異なったＭＨＣのハブロタイブのマウスによって識別される多数の重なっ た決定基を含む、シーフェンスの中の領域が存在することを観察した（Ｈａｌｅ 、Ｐ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１　：４０ ９−４１５　（１９８９））。各種マウスのＴ細胞により識別される決定基は厳 密には異なっていたが、それぞれの多重決定基の領域は、テストした４つのＭＨ Ｃタイプのうちの３ないし４つのタイプのマウスのＴ細胞を刺激する決定基を含 んでいた。それゆえ、我々は、このような多重決定基の領域を包含するペプチド は、マウスの、多くのあるいはほとんどのハブロタイブのＴ細胞と、おそらく、 多くのＨＬＡタイプのヒトのＴ細胞も刺激することができると推論した。したが って、この多重決定基のペプチドは、合成ワクチンの設計におけるＭＭＣによる 制限という問題を回避する方法を提供することができる。それゆえ、本出願人は 、この仮説を、マウスに局在するＨＩＶエンヴエローブ蛋白質の６つの多重決定 基の領域に相当する、それぞれ２０−３３残基の６つの合成ペプチドをつくって 調べた（Ｈａｌｅ、　Ｐ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｅｒｎａｌ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、　ｌ：４０９−４１５（１９８９））。そしてこれらのペプチドが、組換え ｇｐ１６０で免疫化されたマウスおよびＨＩＶに感染したヒトの末梢性血リンパ 球において、Ｔ細胞の反応を刺激する能力について調べた。すべてのペプチドが 、期待していた通りに広く認識されわけではなかったが、このペプチドのうちの 幾つかは、マウスとヒトの両方の、多数のＨ−２とＨＬＡタイプのＴ細胞により 広く認識されることが確認された。また、これらのペプチドは、マウスを免疫化 して、完全なＨＩＶエンヴエロープ蛋白質に対してＴ細胞の反応をおこすことが できるので、合成ワクチンの貴重な構成物として有用である。また、Ｔ細胞のこ れらペプチドに対する反応は、診断上の、または予後のマーカーとして有用であ る。

発明の概要 この発明の一つの目的は、ＨＩＶに対するワクチンの有用な候補である合成ペプ チドを選択する方法を示すことである。

さらに、特定のペプチドの組み合わせが、上記の方法においてその有用性が示さ れていることが記載される。最後に、この発明は、診断や治療の時に使用するこ とができる。

図面の簡単な説明 図１は、ｇｐ１６０免疫マウスのＴ細胞の、６個のクラスター（ｃｌｕｓｉｅｒ ）ペプチドに対する増殖反応を示す。

図２は、クラスターペプチドで免疫化されたマウスのリンパ節から分離したＴ細 胞の組換えｇｐ１６０に対する増殖反応を示す。

発明の詳細な説明 この発明を、下記の幾つかの実施例によって説明する。これらの実施例は、例示 を目的として提示しであるのであり、この発明の範囲を制限するものではない。

当業者が、これらの実施例の様々な修正や変更をおもいつくかもしれないが、こ れらはこの出願の精神と範囲に含まれ、また添付の請求の範囲に含まれる。

例１ インビトロでの、多数のＭＨＣタイプのマウスおよびＨＩＶ血清陽性のヒトの個 体群におけるＴ細胞の反応を誘起する、ＨＩＶエンヴニロープの　型決定基のク ラスターを包含するペプチドの選択 ■、ペプチドの合成 ６個のクラスターペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｅｅｍｓ　４３Ｏ Ａ自動ペプチド合成機で、ｔ−ｂｏｃｃｈｅｍｉ　ｓｔ　ｒｙを用いて合成した （Ｓ　ｔ　ｅｗａ　ｒ　ｔ。

Ｊ、Ｍ、　ａｎｃｌ　Ｊ、Ｄ、Ｙｏｕｎｇ、”５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔ ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１１１ｉｎｏｉｓ（１９８４））。これらのペ プチドを、樹脂からＨＦにより解体し、それをはじめに分子排除クロマトグラフ ィー（Ｐ４　ｂｉｏｇｅｌ、ＢｉｏＲａｄ）で精製した。純度を検定するためと 、より一層の精製を必要とする場合には、逆相ＨＰＬＣを用いた。ＨＰＬＣによ る分離は、Ｗａｔｅｒｓ　μｂｏｎｄａｐａｃｋ　逆相Ｃ１８分析カラムと予備 カラムを用いた。この実験のために合成したペプチドの配列を、以下の表１に示 した。

表１　クラスターペプチドの配列 ＰＣＬＵＳＩ　（１０９−４２８）　ＥＱＭＨＥＤＩ　工ＳＬＷＤＱＳＬＪＧ） ｍ　（ｌｊｊｌ１１４−ｊ　１）ＰＣＬＵＳ２　（３２４−３５６）　ＦＶＴ工 ＧＫＩＧＮＫＲＱＡＨＣＮＩＳＲＡＫＷＮ’ＮＴＬＫＱＩＤＳＫＬ（鯵Ｉ暗を２ ） ＰＣＬＵＳ３　（４２８−４５１）　ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰ工 ＳＧＱ工Ｒ（飴１１番号３）ＰＣＬＵＳ４　（４８：ｌ−５０６）　ＲＤＩＮＲ Ｓｚｒ、、ｙｘｙｘｗｘｕ：ｐｚｖ膚（Ｊ＋４−％　、ａ）ＰＣＬＵＳ５　（７ ８７−８２０）　ＲＩＶＥＬＬＧＲＲＧＭＬＬＱＹＷＳＱＥＴｊＣＮＳＡＶＳ（ 躯！■−Ｊ５５） ６個のクラスターペプチドによって包含されているペプチドを、以下の表２に示 した。

表２　クラスターペプチドとそれに包含されたペプチドの配列 ２、マウス ＢＩＯ，ＢＲ／５ｇＳｎおよびＢＩＯ，Ｄ２／ｎＳｎ種を、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、　ＵＳＡ）から得た。Ｂ ＩＯ，Ｓ　（９Ｒ）およびＢＩＯＡ（ＳＲ）種は、我々のコロニーで、それぞれ Ｊ、Ｓｔ　ｉｍｐｆ　Ｉ　ｉｎｇおよびＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓで得た種畜から生まれた。

３、ｇｐ１６０の調製 組換えｇｐ　１６０は、記載されたとおり、ＨＩＶ−１がら単Ｗ＄されたＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩＢのｇｐ１６０（７）遺伝子を発現している組換えバクロウィルスに 感染した細胞から調製した（Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、に、ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６７６８　−６７７２　（１９ ８９）　）。

４、ＴＭＵ胞の増殖アッセイ　（Ｃｏｒｒａｄｉｎ、Ｇ、。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１９：１０４８（１９７７））２０−３０μｇの、完 全なフロインドアジュバントに１：１で懸濁した組換えｇｐ１６０を、マウスの 尾に皮下注射して免疫化した。マウスは、免疫化してがら８−１１日後に殺し、 血を抜き取った鼠践部および大動脈周辺のリンパ節を回収し、完全なＴ細胞培養 液で単細胞懸濁液とした（Ｍａｔｉｓ、Ｌ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、１３０：１５２７−１５３５　（１９８３））ｏ　４Ｘ１０５の細胞を 、様々な濃度のクラスターペプチド（三速の最終濃度が２．０゜６６．０．２２ μＭ）が入った、９６ウエルの平底培養プレートに入れた。３７℃、５％Ｃｏｔ で４日間の培養の後、トリチウムチミジン（１ｍｃｉ）をすべてのウェルに加え た。２４時間後、細胞を自動回収装置（Ｓｋａｔｒｏｎ）で回収し、ＤＮＡに取 り込まれたチミジンを、シンチレーション係数によって測定した。刺激値は、培 養液だけで培養された細胞に取り込まれたｃｐｍに対する、抗原存在下で取り込 まれたＣｐｍの割合である。

表１のそれぞれのクラスターペプチドを、上記のように合成し精製して、組換え ｇｐ　１６０で免疫化された、４つのＭＨＣタイプのマウスのＴ細胞の増殖反応 を刺激する能力を調べた。ＭＨＣタイプのみ異なり、他は遺伝学的に同一の、Ｂ １０コンジェニックマウスを使用した。研究した４つのマウスＭ　ＨＣタイプを 選んだのは、これらは、それぞれＩ−ＡとＩ−Ｅ分子の両方を発現するが、これ らの両方の分子は互いに異なっているという、四つの独立したＭＨＣハブロタイ ブの一例だからである。したがって、４種で、８つの異なるマウスのクラス■Ｍ ＨＣ分子を発現する。マウスのＩ−Ｅ分子は、相同であるヒトＤＲ分子と同様に 、すべて保存されたα鎖を共有するが、β鎖が異なっているので、多形性をもつ 。

たいていの抗原に対する反応は、幾つかのＩ−ＥおよびＤＲ対立遺伝子の間で異 なり、これはα鎖を共有しているにも拘らず、ベータ鎖の重要な役割を示してい る。

それぞれのペプチドを、４つの独立した実験で研究しく最後に合成したクラスタ ーペプチド３に関しては３つの実験を行った）、その結果は、４つすべての実験 において、所定のペプチド濃度における刺激指数の等比中項を決定してプールし た。この結果は図１に示し、この刺激指数を培地内のペプチド濃度の関数とし、 ４つの異なるＭＨＣハブロタイブに相当する４つのコンジェニックマウスについ て示した。それぞれの値は、４つ（クラスターペプチド３の場合は３つ）の独立 した実験の刺激値の等比中項である。幾つかの実験の結果は、質的に似ているが 、刺激指数の絶対値は、このプロットの上にエラーパー（ｅｒｒｏｒ　ｂａｒ） を読みとるのが困難になるほど十分に変化している。その代わり、すべての実験 の刺激指数の平均値は、スチューデントのｔ検定（ｐ＜ｏ、０５）で調べたよう に、統計的に明らかにバックグラウンド（１，０）とは異なり、これらの値は星 印で示される。結果が陽性だと考えられるのは、この統計値が有意で、かつ、す べての実験の刺激指数の平均値が２より大きいときだけである。クラスターペプ チド３．４．６だけが、４つすべてのＭＨＣハブロタイブのマウスで、陽性の反 応を引き起こした。クラスターペプチド６はＢＩＯ，ＢＲおよびＢＩ　Ｏ，Ａ　 （５Ｒ）のマウスで、最も強く刺激し、Ｂ　１０．　Ｓ　（９Ｒ）およびＢＩＯ 。

Ｄ２で、それよりは弱いが有意に陽性で再現性のある反応を引き起こした。クラ スターペプチド４はＢＩＯ，Ｓ　（９Ｒ）で最も強く刺激したが、他の種でも同 様に有意で再現性のある陽性を示した。クラスターペプチド３は、ＢＩＯ，Ｓ　 （９Ｒ）で非常に強く刺激し、他の３種では、弱いが統計的に有意な反応を引き 起こした。反応は、他の種についての幾つかの実験においてもっと強い陽性を示 したが、反応の強さがまちまちで、統計的には有意であったが、比例中頃が小さ くなった。したがって、これらの３つのペプチドは、多くのハブロタイブのマウ スによって認識される多重の抗原決定基を包含する長いペプチドをつくることに よって、その結果できる構造は、すべてのまたはほとんどのハブロタイブに広く 認識されるという仮説（Ｈａｌｅ、　Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌ：４０９−４１５（１９８９））の予想 を実現した。

残りの３つのペプチドは、予想したよりも少ないマウスの種で反応を誘起した。

４種はすべて、この多重決定基領域の中の包含される少なくとも１つの部位を認 識したという、我々の以前の研究（Ｈａｌｅ、Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１：４０９−４１５（１９８９））にもかか わらず、クラスターペプチド２はＢ１０、Ｄ２およびＢ１０．ＢＲの２種でしか 強い陽性を示さなかった。同様に、４種はすべてこの多重決定基領域の構成物を 認識したにもかかわらず、クラスターペプチドｌは、Ｂ１０、ＢＲの１種でしか 強く認識されず、他のＢＩＯ，５（９Ｒ）種によってかろうじて認識された。最 も期待外れだったペプチドはクラスターペプチド５で、３種において有意な反応 を誘起できず、４番目のＢＩＯ，ＢＲ種で、かろうじて反応を引き起こしたにす ぎなかった。これらの結果から、大きいペプチドはど、単純に部分の集まりでは なく、より小さい構成物が刺激することができる種においても、刺激できなくな る。これは、多分、より大きい構造のある部分が、ＭＨＣまたはＴ細胞レセプタ ーとの反応を妨害するか、ペプチド自体を折り返してしまうため（Ｂｒｅｔｔ、 　Ｓ、Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６８：３５７−３７３　（１９８ ８）：　Ｇａｍｍｏｎ、　Ｇ、　ｅｔａｌ、、’Ｉｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、　 ９８：５３−７３　（１９８７）；　Ｖａｃｃｈｉｏ、Ｍ、Ｓ、　ｅｔａｔ、、 　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４３：２８１４−２８１９　（１９８９）：　Ｂ ｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｊ、Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、　１０６：５−３１　（１９８８） ）か、プロセッシングの必要条件が異なるためであろう。

５、ヒトＰＢＬによるＩＬ−２の生産 抗原によって誘起される、ヒトの末梢住血Ｔ細胞による工Ｌ−２生産のアッセイ のために、ＨＩＶ血清陽性で発病していない血液ドナーから、ＰＢＬをリンパ球 分離培地（ＬＳＭ。

○ｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐ、Ｄｕｒｈａｍ。

ＮＣ）に分離した。これを２度洗い、計測して、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよ び２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ ｌａｎｄ、ＮＹ）に３ＸＩＯ’／ｍｌで懸濁した。９６ウエル平底プレート（Ｃ ｏｓ　ｔ　ｅ　ｒ、Ｃａｍｂ　ｒ　ｉ　ｄ　ｇｅ、ＭＡ）の３運のウェルに、０ ．１ｍｌのＰＢＬを各ウェルに加え、刺激物を加えないか次の物質で刺激して培 養した；ａ）インフルエンザ入／パンコックＲＸ７３　（最終希釈１　：　１０ ００）；　ｂ）ＰＨＡ　（Ｇｉｂｃｏ）（抗原希釈１：１００）；またはＣ）最 終濃度２゜５ｐＭのクラスターペプチド。プールしたＡＢ＋プラズマを各ウェル に加えた（最終希釈１：２０）。抗Ｉ　Ｌ−２受容体抗体の抗Ｔａｃ　（Ｄｒ、 Ｔ、Ａ、Ｗａ　ｌｄｍａｎｎ、ＮＣＩから得た）を、ＩＬ−２の消費を防ぐため に培養のはじめに各ウェルに加えた（最終濃度５１Ｍ）。細胞培養液の上清を、 ７日後に回収し、−２０℃で凍結した。上清のＩＬ−２活性は、上述のように、 ＩＬ−２依存ＣＴＬＬ細胞系の増殖を刺激する能力として測定した（Ｃ１ｅｒｉ ｃｉ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８４：１８９２−１８ ９９（１９８９））。

先行文献は、マウスのＴ細胞の反応を誘起するペプチドは、ヒトのＴ細胞も同様 に誘起することを示している（Ｂ　ｅ　ｒ　ｚｏｆｓｋｙ、Ｊ、Ａ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｎａｔｕｒｅ　３３４ニア０６−７０８　（１９８８）：Ｃ１ｅｒｉｃｉ、 Ｍ、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８３−３８５　（１９８９）；Ｌａ ｍｂ、Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ３００　：６６−６９　（１９８ ２）：Ｈｕｒｗｉ　ｔｚ、Ｊ。

Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３３：３３７１−３３７７　（１ ９８４）：Ｇｏｏｄ、Ｍ、Ｆ、ｅｔ　ａ　１．。

Ｓｃ　１ｅｎｃｅ　２３５：１０５９−１０６２　（１９８７）：Ｇｏｏｄ、Ｍ 、Ｆ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８５　：１１９９−１２０３　（１９８８）：Ｄｏｎｔｆｒ ａｉｄ、Ｆ、ｅｊ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、５　：１８５−１９６　（１９８８））が、クラスターペプチドの成分 の幾つかに対する、ヒトＴ細胞についてのデー夕はなかった。したがって、この 発明にむすびついた実験は、多数のＭＨＣタイプのマウスで反応を誘起するペプ チドは、多数の）（ＬＡタイプのヒトでも同様に反応を誘起するという仮説を調 べるために計画された。

クラスターペプチド１に含まれているペプチドｅｎｖＴ２（１１２−１２４残基 ）と、クラスターペプチド３に含まれているｅｎｖＴｌ　（４２８−４４３残基 ）と、クラスターペプチド６に含まれているペプチドＴＨ４，１（８３４−８４ ８残基、ＨＰ５３としても知られている）は全て、インフルエンザＡウィルス（ ｆｌｕ）または破傷風トキソイドといったポジティブコントロールの再生抗原に 対して反応できる、ＨＩＶ感染した被験者の５０−６７％で、反応を刺激するこ とは、以前の研究かられかっていた（Ｃ１ｅｒｉｃｉ、Ｍ。

ｅｔ　ａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８３−３８５（１９８９））。しかし 、我々は、ヒトのこれらの別の多重決定基領域のペプチドについては、従来側の 経験もなかった。

可溶性蛋白質抗原に対して増殖したり、ＩＬ−２を生産したりする反応は、ＨＩ Ｖ感染によって、早い時期に、しばしば患者がまだ発病しておらず、ＣＤＡ＋の 細胞を通常と同じ数だけ持っているうちに失われる（Ｃ１ｅｒｉｃｉ、Ｍ、　ｅ Ｌ　ａｌ、、　Ｎａ　む　ｕｒｅ　３３９　：３８３−３８５　（１９８９）　 ：　Ｃ１ｅｒｉｃｉ、Ｍ、　ｅＬ　ａｍ、　Ｊ。

ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：１８９２−１８９９　（１９８９）：　Ｌ ａｎｅ、Ｈ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、ＮｅｗＥｎ　ｇ　１．　Ｊ、　Ｍｅ　ｄ、　３ １３　：　７９−８４　（１９８５）　）ので、これらの実験では、ｆｌｕと破 傷風トキサイドに対する反応を、全てのこういった再生蛋白質抗原に反応しない ドナーを除くために、ポジティブコントロールとして用いた。

６つのクラスターペプチド全てを、ＨＩＶ血清陽性だが発病していない一連のボ ランティアから採った末梢住血子細胞によるＩＬ−２生産を、）ＩＩＶ血清陰性 のコントロールと同様に、刺激する能力があるかについて試験した。１５の血清 陰性コントロールは全て、コントロールの再生抗原インフルエンザウィルス（ｆ ｌｕ）に対して反応したが、５９のＨＩＶ血清陽性ドナーのうち４２しかｆｌｕ に反応しなかった。

ｆｌｕや破傷風トキサイドのようなコントロールの再生蛋白質抗原に反応しなか った血清陽性ドナーは、ＨＩＶペプチドにも反応しない（Ｃｌｅｒｉｃｉ、Ｍ、 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８３−３８５　（１９８９））とい う我々の以前の経験から、ｆｌｕに反応しなかった１７人のドナーをこれ以降の 実験から除外した。何人かのドナーが実験可能であったとき、ペプチドのうちの 幾つかは精製されていなかったので、これらのペプチドはサブセットのドナーか らの細胞で試験した。４２のＨＩＶ血清陽性で且つｆｌｕ陽性のドナーと、１５ のコントロールのＨＩＶ血清陰性ドナーについての、６つのクラスターペプチド の結果は表３に示し、表４に要約した。

表３．ＨＩＶ血清陽性と血清陰性のヒト血液ドナーからとったＴ細胞によるＩＬ −２生産示した値は、前記のように、２．５μＭ濃度の指示したペプチドを含ん だ、必要なドナーから得たＰＢＬの３連の培養液からとった培養上清を１：２で 希釈したものの存在下での、Ｉ　Ｌ−２依存性ＣＴＬＬ細胞系の増殖に対する刺 激指数である。実験した血清陽性のドナーおよびコントロールの全てが、ポジテ ィブコントロールの再生蛋白質抗原のｆｌｕに反応した。値が陽性だと判断する には、２つの基準を同時に満たさなければならない。すなわち、ドナーのレプリ ケート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）がコントロールのレプリケートに比べて、スチュ ーデントのｔ検定（ｐ＜ｏ、０５）により統計的に有意に違わなければならない と同時に、刺激指数はコントロールのそれの２倍以上でなくてはならないことで ある。ＮＳとなった６つのケースで刺激指数が２．０より大きくなったが、統計 的に有意ではなかったので、陽性とは見なさなかった。

刺激値は２．０未満であった幾つかのケースで、レプリケートはバックグラウン ドと有意に差があったが、刺激指数が低かったので陽性とは見なさなかった。し たがって、２つの基準の要求することは、どちらか一つを用いるよりもより慎重 である。

表４．クラスターペプチドに対するヒトのＴ細胞のＩＬ−２反応の要約 クラスター　クラスター　クラスター　クラスター　クラスター　クラスターａ ｘｖ＋ｎ、ｕ＋　２３／３６　２１／３６　８／１１　１４／２７　１７／２９ ドナー　６４％　５８％　７３％　５２％　５９％　５８％ａｘｖ−ｒｘ、ｕ＋ 　１／１５　２／１５　０／１０　１／１１　０／１４コントロール　７％　１ ３％　０％　９％　０％　８％陽性についての基準は表３を参照のこと。

表５．ＨＩＶ血清陽性ドナーのＨＬＡタイプ９０　２４．２９　７，４４　２． ３ ３７５　２、２４　３５．６１　λ４　１　３１３１　１．３　７，６２　３　 １，３　λ４９０９　３０．３３　１７　３　１　１，２２３２　９．３１　１ ４．１８　３　２，３　３，５７５５　２、２ｇ　３５．１５　λ３　１，３　 ２，４７５　３０　７．１８　２ ３ω　２，３１　５１　２ ３１７　云　１２　３　１．２　２．４３９５　１．３　７．８ ６つのクラスターペプチドは全て、ＨＩＶ血清陽性でｆｌＵ陽性ドナーの半分以 上のＩ　Ｌ−２生産を刺激した。クラスターペプチド１と３は最も広く認識され 、それぞれドナーの６４％、７３％が反応を起こした。はぼ互角でクラスターペ プチド２．５と６が２番目で、それぞれ、５８．５９．５８％のドナーで陽性で あった。最も狭く認識されたのは、クラスターペプチド４だったが、それでも５ ２％のドナーを刺激した。これに対して、コントロールの血清陰性ドナーは、ク ラスターペプチド２以外のいずれのペプチドに対しても、だれも反応しないが、 または−人しが反応しながった。クラスターペプチド２は、１５人のコントロー ルドナーのうち２人を刺激した（１３％）。したがって、いずれのペプチドも非 特異的な細胞***誘起性を示さながった。ヒトのドナーは親戚関係のない空車の 人で、生まれがアメリカの異なる地域の出身で、多様なＨＬＡタイプである。利 用できる血液は限られていたので、多量の血液が必要なタイプ決定については、 ＨＩＶ＋のドナーのうち、１３人だけがＨＬＡタイプを決定することができ、ま た、８人だけがＤＲおよびＤＱについてタイプを決定することができた（表５） 。この限られたサンプルの中では、いずれがのペプチドに対する反応と、いずれ かのＨＬＡタイプとの相関性は見られなかった。我々は、これらの全てのクラス ターペプチドが、マウスのＴ細胞に広く認識されるペプチドは、ヒトＴ細胞にも 同様に広く認識されるという仮説に適合すると結論づけた。たしかに、クラスタ ーペプチドｌと５のような幾つがのペプチドは、実験した、多様な種の同系交配 されたマウスよりも、多様なＨＬＡタイプのヒトに広く認識された。

表３の結果は、ポジティブコントロールの抗原ｆｌｕに敏感な、最低３つのペプ チドで実験した、３６人のドナーのうち３１人（８６％）が、少なくともそのう ちの１つに反応したことを示している。反応した個体群の範囲をもっと調べるた めに、表３のドナーとは別の、ｆｌｕに敏感なＨＩＶ血清陽性ドナー１３人で、 ６つのクラスターペプチドをそれぞれ２．５μＭ含む混合物に対する反応を調べ た。これらの１３人のうち１０人、約７７％が反応したが、ところが、４人の血 清陰性ドナーは、ｆｌｕに陽性であるけれども、だれもペプチド混合物には反応 しなかった。混合物中のペプチドが、いくつかのＭＨＣ分子に結合するのに、互 いに競合する可能性はあり、研究した２つのグループのサンプル数は少ないが、 第１グループの、少なくとも１つのペプチドに反応するフラクションと、第２グ ループの、混合物に反応するフラクションの間には、恐らく、統計的に有意な差 はない。どちらの場合でも、相当多くの人は、Ｔ細胞にこれらのペプチドに対す る反応を行なわせることができると、結論づけた。

６、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける、完全なｇｐ１６０に反応するＴ細胞を誘発する ためのペプチドによる免疫化前記の２つのスクリーニング法によって同定された ペプチドがワクチンの成分として有用であるためには、ＨＩＶのエンヴエローブ 蛋白質ｇｐ１６０に対する免疫力を持っＴ細胞に認識されるだけでなく、インビ ボで、ｇｐ１６０に反応するＴ細胞を誘起する免疫原性をもたなければならない 。もちろん、まだ、臨床的に意味のある種、（感染していない）ヒト、で免疫化 を行うことはできないが、これらのペプチドに対して過敏なＴ細胞を持つ前記の マウスの種で、マウスが、インビボでペプチドによって免疫化され、インビトロ で無処理ｇｐ１６０に反応するＴ細胞を確実に誘起することが望ましい。それぞ れのペプチドは、図１のデータにもとづいてペプチドに最も反応するマウスを免 疫化することにより試験された。上記４種のマウスは、尾に、ＣＦＡで１：１に 懸濁した表記クラスターペプチド８−１０８−１Ｏｎを皮下注射することによっ て免疫化された。−匹のマウスについての最終量は、クラスターペプチド２は７ ５μｍで、それ以外は５０μｍであった。１２日後、血液を抜いたリンパ節をそ れぞれのグループ（種とペプチドの組み合わせ）の２匹からとり、前記のように アッセイした。結果は、培養液だけで刺激したｃｐｍに対する実験値ｃｐｍの割 合である刺激指数として表した。刺激指数は、別々のグループで３０００−７０ ００　ｃｐｍの範囲にわたった。

クラスターペプチド１、クラスターペプチド５、クラスターペプチド６で免疫化 されたＢＩＯ，ＢＲマウスは、すべて、インビトロで組換えｇｐ１６０によって 刺激されるＴ細胞を生産した（図２、パネルＡ）。組換えｇｐ１６０に細胞*** 誘起性があるかどうかのコントロールとして、完全なフロイントのアジュバント だけで免疫化したＢ１０．ＢＲマウスからとったＴ細胞は、インビトロでｇｐ　 １６０に有意に反応しなかった（図２、パネルＡ）。したがって、インビトロの 反応は、ペプチドによる免疫化の結果である。同様に、クラスターペプチド３か クラスターペプチド４で免疫化したＢ１０゜５　（９Ｒ）マウスからとったＴ細 胞は、インビトロで組換えｇｐ１６０に対して反応した。ところが、アジュバン トだけで免疫化した同類のマウスは、最も高い濃度のときにだけ弱い（***）反 応を起こしたく図２、パネルＢ）。同様に、クラスターペプチド６で免疫化した ＢＩＯ，Ａ　（５Ｒ）マウスおよびクラスターペプチド２で免疫化したＢ１０． Ｄ２マウスは、インビトロでｇｐ１６０に敏感なＴｍ胞を生産した（図２、パネ ルＣとＤ）。これらの反応はすべて、Ｔ細胞の増殖反応の典型的な高濃度での阻 害を示したが、この場合、３０μｇ／ｍｌでの反応の減少も、同様に、８Ｍ尿素 とドデシル硫酸ナトリウムに溶解した組換えｇｐ１６０調製液の毒性によるもの であろう。ｇｐ１６０は使う前に透析するが、除去できなかった残りの界面活性 剤は最も高濃度のときに毒性がある。これにも拘らず、すべての場合で、１０μ ｇ／　ｍｌのときにはっきりした反応がでたということは、６つすべてのクラス ターペプチドが、インビボで、ｇｌ）ｌ　６０と反応することができるＴ細胞を 誘導することを示している。

例２ 患者のＨＩＶ−１感染の診断上のアッセイにおけるクラスターペプチドの使用 表１で示したクラスターペプチドは患者の）（ＩＶ−１陽性血清転換の診断に使 用できる。これらのペプチドに対するＨＩＶ−１ｇｐ１６０に特異的なＴ細胞の 反応の検出は、例１の４と５の項で記載した通り、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２また は他のリンホカインの生産の標準的な方法で行うことができ、次の文献に書いで あるような方法で人に適用できる（Ｃｌ　ｅｒｉｃｉ　ｅｊ　ａｌ、、　Ｎａｔ ｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３３９、ｐｐ、、３８３−３８５　（１９８９））。

一方、診断上は、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、ｅｔ　ａｌ、の米国特許出願番号０７／ １４８，６９２にペプチドｅｎｖ−に１について記載しであるような細胞毒性の フォーマットで試験できる。このフτ−マットは、ＨＩＶに対する抗体をまだ生 産していない感染者を検出するのに良い。

例３ クラスターペプチドの薬理学的な特徴を強めるための化学修飾 血液中を循環している小さなペプチドは、蛋白質分解反応や、腎臓による清浄化 によって分解されやすい。しかし、例えばエンケファリンのような自然に存在す るペプチドは、循環血流中に多く見られる。これらの小さなペプチドは、しばし ばカルボキシ末端がアミド化されている（Ｋｉｔａｍｕｒａ、に、ｅｊ　ａｌ、 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１６９：１１６４−１１７１　（１９９０）：　Ｄｉｃｋｓ ｏｎ、Ｃ，Ｊ、　ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ。

Ｔ、、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２６６：３３４−３３８（１９９１）　）。

したがって、化学的に修飾したクラスターペプチドの誘導体をつくることは、治 療に適用するのに有利になる。合成ペプチドの酵素によるカルボキシ末端のアミ ド化は既に開示されている（Ｓｕｚｕｋｉ、に、　ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、９　：４２５９−４２６５　（１９９０）：Ｋａｔｏｐｏｄｉｓ、 Ｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：６１８９−６１９４ 　（１９９１））。また、免疫化のためのペプチドとキャリア蛋白質との架橋や 、イムノアッセイや抗体の精製のへの応用のための固形支持体との架橋に有用な 残基を付加することのは有利である。ペプチドの化学修飾にはいろいろな方法が この技術分野で知られている。

この発明のペプチドは、ＨＩＶまたはＨＩＶに特異的な細胞毒性Ｔ細胞に結合し ているペプチドか、ＨＩＶまたはＨＩＶに特異的な細胞毒性Ｔ細胞に対する中和 抗体の生産を誘起するペプチドと結合させるたり、同時に合成することができる 。この発明のペプチドはそういった構造物の中で、ＨＩＶ−■に特異的なキャリ アとして働き、ＨｒＶに晒された時にヘルパーＴ細胞の記憶応答を引き起こすＴ 細胞の記憶を、ウィルスに晒されてもそういった記憶応答を起こさないＨＩＶに 関連のないキャリアの使用にくらべて有利に誘起する。例えば、有用なＨＩ　Ｖ −ｒに特異的なキャリアは、次の文献に記載されている通りであり、これを参照 することによって本明細書に包含される：Ｇｏｏｄ、Ｍ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、５ ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２３５．ｐｐ、１０５９−１０６２（１９８７）　：　 Ｕ、　Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．　８８６゜７８２　ｔｏ　Ｇｏｏｄ　ｅ ｔ　ａｌ、：　Ｐａ１ｋｅｒ。

Ｔ、　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、１４２．ｐｐ、３６１２−３６１９　（１９８９）　。

旦土 ＨＩ　Ｖ−１に対するワクチンとしてのクラスターペプチドの投与 多くの生物医学の研究者の研究目的は、ＨＩＶ−１による感染から人を守り、Ａ ＩＤＳの診療において治療上有益なワクチンを製造することである。この発明は 、そういったワクチンとして有用であるペプチドを同定する方法と、ターゲット の蛋白質に対して反応するＴ細胞の産生にもとづいた候補として６つの特定のペ プチド（これらペプチドで免疫化されたマウスにおいて、これらのペプチドは、 ターゲットの蛋白質から誘導された）を指定する方法を提供している。ワクチン を含む、この発明の薬剤は、抗原としてまたは治療上効果のある量の、少なくと も一つのクラスターペプチドと、生理食塩水、毒性のない無菌緩衝液等のような 薬学的に許容可能な担体を含有する。もちろん、防腐剤、殺菌剤および補助薬等 のような当業者に公知の添加物もまた、調剤の効果を維持または増強するために 薬剤に含有させることができる。

イトウによって開示されたＢ型肝炎の合成ペプチドワクチンの霊長類に対する投 与（Ｉｔｏｈ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　８３：９１７４−９１７８　（１９８６））と同様の手法により、この発 明のペプチドも、ワクチンとして投与できることを提案している。ワクチン調製 のほかの方法として、抗体と免疫化した抗原の免疫複合体を結合した、プロティ ンＡでコートしたマイクロビーズを使う方法（Ｐｌａｔｔ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｕ、Ｓ、　ｐａｔｅｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ　４，４９３，８２５）も含む。この方 法は、前記文献を参照することにより本明細書に包含される。さらに、この発明 のクラスターペプチドは、結合または誘導されたペプチドと、共有或いは接合さ せることができる。

この発明についてこの様に述べてきたが、同じことがいろいろと多様化できるこ とは明らかであろう。そういった変形が、この発明の精神と範囲から逸脱するも のだとはみなされるべきではない。当業者にとっては明らかである、すべてのそ ういった変更が、次の請求の範囲の中に含まれることが意図されている。

刺激指数　１ 刺激指数 刺激指数 ペプチド濃度（μＭ） ペプチド濃度（μＭ） 刺激指数 ｇｐ１６０濃度（μｇ／ｍｌ） 刺激指数 刺激指数 ｇｐ１６０濃度（μｇ／ｍｌ） 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年２月２８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ｉ）ワクチン候補ペプチドであって、より長いターゲットの蛋白質のフラグメ ントまたはマイムトープス（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）を表現しているペプチドを化 学的合成または組換えＤＮＡ技術により製造すること、 （ｉｉ）ＭＨＣハプロタイプが異なるコンジェニックマウスを、ペプチドワクチ ンの完全な蛋白質ターゲットで免疫化すること、 （ｉｉｉ）前記免疫化されたマウスからリンパ節の懸濁液を製造し、前記懸濁液 から得たＴ細胞の、前記ワクチン候補ペプチドを用いた抗原投与に対する増殖反 応を試験すること、（ｉｖ）統計学的評価に有用なサイズのＨＩＶ血清陽性ヒト ドナーの個体群から、末梢性血リンパ球（ＰＢＬ）を分離すること、 （ｖ）コントロール記憶抗原に対して反応するインターロイキン−２の産生につ いて前記ＰＢＬを試験し、前記ワクチン候補ペプチドを用いた抗原投与に対して 反応した、前記ＰＢＬによるインターロイキン−２の産生について試験すること 、 （ｖｉ）マウスの免疫化で使用するための、工程（ｉｉｉ）および工程（ｉｖ） の両方で有意な反応を示したペプチドを選択すること、（ｖｉｉ）工程（ｖ）で 免疫化されたマウスから分離されたＴ細胞の、完全ターゲット蛋白質を用いた抗 原投与に対する増殖反応を試験すること、 （ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）において統計学的に有意な陽性反応を示したワクチ ン候補ペプチドを指定すること、を具備するＨＩＶに対するサブユニットワクチ ンに有用なペプチドの同定方法。 ２．工程（ｉｉ）で使用したマウスがＢ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎ種，Ｂ１０．Ｄ２ ／ｎＳｎ種、Ｂ１０．Ｓ（９Ｒ）種およびＢ１０．Ａ（５Ｒ）種である、請求の 範囲第１項の方法により選択されたペプチドを含むＨＩＶに対するワクチン。 ３．ターゲット蛋白質が、ＨＩＶ糖蛋白質１６０（ｇｐ１６０）である、請求の 範囲第１項の方法により選択されたべブチドを含むＨＩＶに対するワクチン。 ４．ターゲット蛋白質が、ＨＩＶｇｐ１６０である、請求の範囲第２項の方法に より選択されたペプチドを含むＨＩＶに対するワクチン。 ５．アミノ酸配列ＥＱＥＤＩＩＳＬＷＱＳＬＫＰＣＶＫを含むペプチド。 ６．アミノ酸配列ＦＶＴＩＧＫＩＧＮＭＲＱＡＨＣＮＩＳＲＡＫＷＮＮＴＬＫＱ ＩＤＫＳＬを含むペプチド。 ７．アミノ酸配列ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＰＰＩＩＲを含むペプチド。 ８．アミノ酸配列ＲＤＮＷＲＳＥＬＹＫＹＶＶＫＩＥＰＬＧＶＡＰＴを含むペプ チド。 ９．アミノ酸配列ＲＩＶＥＬＬＧＲＲＧＷＥＬＫＹＷＷＮＬＱＹＷＳＱＥＬＫＮ ＳＡＶＳを含むペプチド。 １０．アミノ酸配列ＡＶＡＥＧＴＤＲＶＩＥＶＶＱＧＡＹＲＡＩＲＨＩＰＲＲＩ ＲＱＧＬＥＲを含むペプチド。 １１．表１に列挙されたべブチドからなる群から選択される少なくとも一つのペ プチドを含むＨＩＶに対するペプチドワクチン。 １２．誘導体化されてい少いペプチドまたは前記ペプチドの活性を不都合に変更 しない他の僅かな修飾により得られるものよりも優れた薬理学的特徴を達成する ために、小さな部分で誘導体化することにより共有結合的に修飾された請求の範 囲第１１項のペプチド。 １３．表１に列挙されたペプチドからなる群から選択される少少くとも一つのペ プチドおよび薬学的に許容可能な担体を含むＨＩＶに対するワクチン。 １４．表１に列挙されたペプチドからなる群から選択される少なくとも２つのペ プチドの混合物お炭び薬学的に許容可能な担体を含むＨＩＶに対するワクチン。 １５．表１に列挙されたペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのペ プチドを含むＨＩＶの診断または予後のためのキット。 １６．表１に列挙されたペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのべ ブチドをアッセイで使用することを含むＨＩＶの診断または予後のための方法。 １７．前記アッセイにより、Ｔ細胞増殖、または、ＩＬ−２その他のリンホカイ ンの産生が測定される、請求の範囲第１６項の方法。 １８．請求の範囲第１４項の製剤のＨＩＶ血清陽性患者への投与を含むＨＩＶの 治療学的処理方法。 １９．化学的結合によりまたは同時合成により、Ｔ細胞またはＢ細胞のエビトー プを含む第２のペプチドと結合された請求の範囲第５項ないし第１０項および第 １２項に列挙されたペプチドの少なくとも一つを含む構造物。