JPH05501503A - 多量体ゲルゾリン融合構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲルゾリン融４ １朋」」ｕｌを肚 本発明は、多量体およびヘテロ多量体のゲルゾリン融合構築物、それらを含有す る組成物、およびそれらの使用法に関する。さらに特に、本発明は、ポリホスホ イノシチドを有する小胞に、少なくとも２つのゲルゾリン融合ポリペプチドが結 合している、多量体ゲルゾリン融合構築物に関する。本発明はさらに、機能的部 分に結合したゲルゾリン部分を含有するゲルゾリン融合ポリペプチドに関し、特 にゲルゾリン部分に結合したヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を有するＣＤ −４ゲルゾリン融合ポリペプチドに関する。

１１区血 バイオテクノロジーの急速な発展により、薬物、ワクチン、診断薬、および他の 生物活性分子の新規の輸送系および担体系を生み出された。最適には、これらの 系により、分子が担持する性質を促進し、それらが不足する特徴を補足し、そし て異なる分子の有用な特徴を組み合わせる。研究者が特に興味を持つのは、生物 活性の血清中半減期、それらの標的粒子および標的細胞への親和性、生物活性分 子の標的能力、生物活性、免疫原性および数種類の分子を同時に投与あるいは輸 送し得る能力である。科学者は、これらの系に宵利に発展させ得る、タンパク質 を含む新しい分子を同定することを追い続けている。

ゲルゾリンは、哺乳類および他のを椎動物に見い出されるタンパク質である［Ｈ ，Ｌ、　ＹｉｎおよびＴ、Ｐ、　５ｔｏｓｓｅｌ、　−Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆ　Ｃ ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ａｃｔｉｎ　Ｇｅ１−ｓｏｌ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ　ｂｙ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ、　ａ　Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ 　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−、Ｎａｔｕｒｅ、　２８１、　ｐｐ 、　５８３−８６　（１９７９）；　Ｆ、Ｓ、　５ｏｕｔｈｖｉｃｋおよびＭ、 Ｊ、　ＤｉＮｕｂｉｌｅ、　”Ｒａｂｂｉｔ　Ａｌｖｅｏｌａｒ　Ｍａｃｒｏｐ ｈａｇｅｓ　Ｃｏｎｔａｉｎ　ａ　Ｃａ”−５ｅｎｓｉｔｉｖｅ、　４１，００ ０−ｄａｌｔｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗｈｉｃｈ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ　Ｂｌ ｏｃｋｓ　ｔｈｅ”Ｂａｒｂｅｄ’　Ｅｎｄｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　Ｆｉｌａａ ＋ｅｎｔｓ　ｂｕｔ　Ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　５ｅｖｅｒ　Ｔｈｅｍ−、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６１．　ｐｐ、　１４１９１−９５　（１９８６ ）；　Ｔ、　Ａｎｋｅｎｂａｕｅｒら、＋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｉ ｎｇ　Ａｃｔｉｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｉｎ　Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅ ａｒｌｙ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｂ工臣姐１ａｅｖｉｓ：Ｇｅ１ ｓｏｌｆｎ　Ｉｓ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ａｃｔｉｎ −ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−、二Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１０ユ、Ｉ ）ｌ）、１４８９−９８　（１９８８）；　Ｈ，Ｌ、Ｙｉｎら、”１ｄｅｎｔｉ ｆｉｃａｔｆｏｎ　ｏｆ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ、　ａ　Ｃａ”−ｄｅｐｅｎｄｅｎ ｔ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　Ｇｅ１−ｓｏ ｌ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　［ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌ ａｒ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ＶａｒＩｅｔｙ　ｏｊｃｅｌｌｓ 　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ−、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　９１．　ｐｐ 、　９０１−０１＋　（１９８０）；　Ｃ，Ｗ、　Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、 −Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　 ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎＤｕｒｉｎｇ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６４．　ｐｐ、　１３２８１−８８　（１ ９８９）］。補乳類では、ゲルゾリンは２つの形態をとるー細胞質型および血清 型である。ゲルゾリンは、細胞の構造および運動に関与する主要なタンパク質で あるアクチンの活性を調節する。アクチンは、重合してフィラメントを形成し得 る、やや伸長した形態の球状タンパク質である。アクチンの単量体の反矢じり端 （”ｂａｒｂｅｄ″ｅｎｄ）が、非共有的に、および可逆的に、他のアクチンの 矢じり端じｐｏｉｎｔｅｄ″ｅｎｄ）に結合すると重合が起こる。はとんどの細 胞内では、単量体および短いフィラメントは、単量体が活性化されてフィラメン トになり、そしてフィラメントが活性化されて架橋し、細胞骨格の一部を形成す る、より固い「ゲル」の状態になるまで、液状の「ゾル」の状態で存在する。カ ルシウムイオンの存在下では、ゲルゾリンが、単量体およびフィラメントのゲル 相からゲル相への遷移を防ぐことが、研究者によって観察されている。

ゲルゾリンは、３つの様式でアクチンに作用する。第１に、ゲルゾリンは、アク チンフィラメントを構成するアクチン単量体間の非共有結合を切断する（「切断 」）。第２に、ゲルゾリンは、アクチンフィラメントの反矢じり端に結合し、そ の末端からのフィラメントの伸長を防ぐ（「キャッピング」）。第３に、それは アクチン単量体に結合して重合の核を提供することにより、アクチンフィラメン トの形成を促進する（「核化」）。その結果、短いアクチンフィラメントがゲル 相を保持し得ないような安定した状態となる［ｐ、Ａ、　Ｊａｎｍｅｙら、−Ｉ ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ　ａｎｄ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ −ａｃｔｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｗｉｔｈ　Ａｃｔｉｎ、　Ｅｆｆｅｃｔｓ　 ｏｆ　Ｃａｌｃｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃｔｉｎ　Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ、　Ｆｉｌａ ｍｅｎｔ　Ｓｅｖｅｒｉｎｇ、　ａｎｄ　Ｅｎｄ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ−、Ｂｉｏ ｃｈａｍｉｓｔｒ　、　２４゜ｐｐ、　３７１４−２３　（１９８５）］。

ゲルゾリンのアクチン切断機能は化学量論的であるニゲルプリンの１分子がアク チンフィラメントの２個の単量体に結合し、フィラメントを壊し、両方の単量体 に結合したまま残る。単量体の１つへのゲルゾリンの結合は、Ｃａ”＋に依存し 、ＥＧＴＡのようなキレート剤は、１つの単量体のみからのゲルゾリンの解離を 起こす。

研究者は、ゲルゾリンの機能に結合して調節する２つのホスファチジルイノシト ールリン酸リン脂質を同定している。

それらは、ホスファチジルイノシトール４−−リン酸（ＰＩＰ）およびホスファ チジルイノシトール４．５−二リン酸（ＰＩＦ２）である［Ｐ、Ａ、　Ｊａｒ＋ ｍｅｙら、−Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｊｄｅ　Ｍｉｃｅｌｌｅｓ　 ａｎｄＰｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｖ ｅｓｉｃｌｅｓ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｇｅ１ｓｏｌ ｉｎ−ａｃｔｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｍｏｔｅ　Ａｃｔｉｎ 　Ａｓ５ｅ＋ｍｂｌｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｐａｓｔ−ｇｒｏｗｉｎｇ　Ｅｎｄ 　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ　Ｇｅ１ｓｏ ｌｉｎ−、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２．　ｐｐ、　１２２２８− ３６（’１９８７）、　Ｐ、Ａ、　ＪａｎｍｅｙおよびＴ、Ｐ、　５ｔｏｓｓｅ ｌ、　−Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆＧｅｌｓｏｌｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂ ｙ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　４．５−ｂｉｐｈｏｓｐｈａ ｔｅ−、Ｎａｔｕｒｅ、　３２５．　ｐｐ、　３６２−６４　（１９８７）およ びＰ、Ａ、　Ｊａｎｍｅｙおよびτ、Ｐ、　５ｔｏｓｓｅ１．−Ｇｅｌｓｏｌｔ ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｎｏｓｉｔｉｄｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−１Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４．　ｐｐ、　４８２５−３１　（１９８９）］ 。これらのポリホスホイノシチドは、細胞のシグナル伝達で役割を演ずルマイナ ーな膜リン脂質である［Ｂ、　Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌ＋、第２版、　Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　７０ ２−７０３　（１９８９）］。それらを併せても総細胞膜リン脂質の１０％より 少なく、ＰＩＦ２は１％より少ない。これらの２つの分子は、Ｃａ−に依存しな い様式で、ゲルゾリンに結合し、それら結合するアクチン単量体を置き換えるこ とにより、ゲルゾリン活性を阻害する。

よく超音波処理された水性懸濁液中では、ＰＩＰおよびＰＩＦ２の両方は小胞を 形成する。ＰＩＦ２は、ミセルとも呼ばれる、直径約８ｏｎＩ１１の、約１００ 個のＰＩＦ２分子を含有する小胞を形成する。各ＰＩＰ２ミセルは、約８個のゲ ルゾリン分子に結合する。ＰＩＦはより大きな、単層状（一層の）の小胞を形成 する。ミリモル濃度のＭｇ”＋あるいは非イオン性界面活性剤の存在下で、Ｐ　 ［Ｐ２が凝集して大きな単層あるいは複数層の小胞を形成すると、アクチンフィ ラメントを切断するゲルプリンの機能を阻害するＰ　ＩＦ５の能力は低下する。

たとえ小胞がＰＩＦ２に対して非常に高い割合でホスファチジルフリン（ＰＣ） を含有していても、最大活性の約３分の１が残りはするが、ＰＣで構成される、 混合された小胞へのＰＩＦ２の取り込みもまた、この能力を低下させる。組成が 細胞膜（Ｐ　ＩＦ５が３％より少ない）とほぼ同じである混合脂質小胞もまた、 ゲルゾリン活性を阻害する。構築され得るか、あるいはすでに自然界に同定され ている、他のい（つかのポリホスホイノシチドもゲルゾリンに結合すると予想さ れる。

ヒト血漿ゲルゾリンをコードするｃＤＮＡは、７５５個のアミノ酸プラス２７個 のアミノ酸シグナル配列をコードする［Ｋ曹１ａｔｋｏｖｓｋｉら、−Ｐｌａｓ ｍａ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｇｅ１ｓｏ目ｎｓ　Ａｒｅ　Ｅｎｃｏ ｄｅｄ　ｂｙａ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔａｉｎ　ａ　Ｄｕ ｐｌｉｃａｔｅｄ　Ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇＤｏ＋＊ａｉｎ−、Ｎａｔｕｒ ｅ、　３２３．　ｐｐ、　４５５−５８　（１９８６）コ。このｃＤＮＡ配列は 血漿型および血清型ゲルゾリンの両方に相当する。この両者は、７０ｋｂの長さ の１つの遺伝子の異なる転写開始部位およびメツセージプロセシングの結果であ る［Ｄ、　Ｋｖｉａｔｋｏｖｓｋｉら、＋Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ−、Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０６．　ｐｐ、　３７５−８４　（１９ｇｇ＞］。血漿 型と細胞質型との違いは、血漿型ゲルプリンには２５個のアミノ酸残基が延長し ていることである。

これが、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により 得られた、各々９３ｋＤおよび９０ｋＤの、相対的分子量の差に相当するようで ある。

研究者は、ゲルゾリンのいくつかの機能性ドメインを同定した［Ｈ，Ｌ、　Ｙｉ ｎら、−Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｉ ｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　ｉｎ　Ｇｅ１ｓｏｌｉ ｎ　Ｗｈｉｃｈ　Ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｉｄｅｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　 Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ−、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０６．　ｐｐ、　８ ０５−１２　（１９８８）およびり、　Ｋｗｉａｔｋｏｖｓｋｉら、−Ｉｄｅｎ ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎ ｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｄｏａ＋ａｊｎｓ　ｉｎ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ−。

Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０８．　ｐｐ、　１７１７−２６　（１９８ ９）］。ゲゲルゾリン部分Ａは、分子を２つにほぼ等分する強い縦列反復を有す る。これらの構造的等分は、２つの機能的等分に相当する：このタンパク質のア ミノ末端側の半分は、Ｃａ−非感受性アクチン切断機能を有し、カルボキシ末端 側半分はＣａ”感受性アクチン結合ドメインを宵する。これらの２つの縦列反復 内に、低い相同性の６つのドメインがある。ポリペプチドは、３つのアクチン結 合部位を有する。２つの単量体結合部位は２６−１３９位および４０７−７５６ 位（たぶん６６１−７３８位）の間にあり、アクチンフィラメント結合部位は、 １５１−４０６位の間に位置する。アミノ酸残基７３２−７３８位は、Ｃａ”９ 節に潜在的に重要である。残基６６０−７３８位は、核化に重要である。この機 能はたぶん、この分子の半分上にあるアクチン結合部位を必要とする。切断機能 は、残基１−１６０位にあり、それはたぶん１３９−１６０位の間であり、１５ ０−１６０位の配列（ドメイン２の最初の１１残基）に決定的に依存する。ゲル ゾリンの切断機能のＰＩＦ２による調節は、明かに最初の１６０個の残基内にあ る。ドメイン２および３の配列は、潜在的Ｃａ０惑受性ドメインを隠ぺいするよ うである。なぜならば、それらが排除されると、ゲルゾリンの切断機能はＣａ０ ＋依存性になるからである。

重要なことには、ゲルゾリンのアミノ酸配列はいくつかの他のアクチン結合タン パク質との相同性を示す。を推動物の刷子縁微絨毛に見い出され、同じ＜Ｃａ− 依存性アクチン切断機能を有するビリンと４５％の相同を有する。それはまた、 セベリン（５ｅｖｅｒｊｎ）およびフラグミンと３３％の相同性を冑する［Ｐ、 　ＭａｔｓｕｄａｉｒａおよびＰ、　Ｊａｎ＋ｓｅｙ、　−Ｐｉｅｃｅｓ　ｉｎ 　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎ−ｓｅｗｅｒｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｚｚｌｅ−、 Ｃｅ１ｌ、旦、ｐｐ、　１３９−４０　（１９８ｇ＞］。さらにこれらのポポリ ペブチは、ＰＩＰおよびＰＩＦ２に結合する。

バイオテクノロジーの進歩にもかかわらず、薬物、ワクチン、診断薬および生物 活性分子の特徴および輸送を最適にする方法および生産物の必要性がまだ存在し ている。これらには多価性、１つの標的粒子に対する親和性、血清中半減期、生 物活性、およびある場合には免疫原性が含まれる。さらに、構成部分を容易に変 え得る系は、とくに有用である。なぜならば、最適な特徴を有する種類をテスト することが可能になるからである。

及コＩＩＬ旨 本発明は、多量体およびヘテロ多量体のゲルゾリンを提供することにより、これ らの問題を解決する。多量体ゲルプリン融合構築物は、ゲルゾリン融合ポリペプ チドが結合しているＰＩＦあるいはＰＩＦ２のようなポリホスホイノシチドを、 少な（とも１つ含有する小胞である。ゲルゾリン融合ポリペプチドは、薬剤、ワ クチン、診断薬あるいは他の生物活性分子であり得る機能的部分に結合したゲル ゾリン部分を含有する。ヘテロ多量体ゲルゾリン融合構築物は、少なくとも２つ の異なっり機能的部分あるいはゲルゾリン部分を有する。

ゲルゾリンは、脂質小胞に付着するものの候補として特に興味深い。なぜならば 、それはポリホスホイノシチドに特異的に、そして高い親和性で結合するからで ある。ポリホスホイノシチドに同様に特異的に結合する、ゲルゾリンに関連する 他のタンパク質も、使用し得る。いくつかの例には、ビリン、フラグミン、セベ リン、プロフィリン、コフイリン、Ｃａｐ４２（ａ）、ｇＣａｐ３９、ＣａｐＺ およびテストＩＪ　７がある。リホコルチン（アネ牛シン、Ａｎｎｅｘｉｎ）お よびＤＮａｓｅ　Ｉは、ポリホスホイノシチドに結合する他の分子である。他の 脂質に特異的に結合するタンパク質および脂質に非特異的に結合するタンパク質 もまた、使用され得る。

本発明の融合構築物は、複数のコピーのゲルゾリン融合ポリペプチドに結合する ポリホスホイ／シチド小胞の能力を有利に使用する。従って単量体分子とは対照 的に、機能性部分としてそれらに結合している生物活性分子は、次の１つあるい はそれ以上によって特徴付けられる：すなわち多価性、増加した血清中半減期、 標的粒子あるいは標的細胞への親和性、より強い生物活性あるいは免疫原性、お よび標的能力である。

本発明はさらに、ゲルプリン融合ポリペプチドを提供する。

ゲルゾリン融合ポリペプチドは、機能性部分に融合した、あるいは化学的に結合 したゲルゾリン部分を含有する。特に、本発明はＣＤ−４ゲルゾリン融合ポリペ プチドを提供する。

さらに小胞の脂質組成物は、流動性、サイズ、それに結合するゲルゾリン分子の 数、および血流中での分解速度が異なる小胞の産生を可能にするように変化させ 得る。

機能性部分に何を選択するかによって、多量体およびヘテロ多量体のゲルゾリン 融合構築物は、多くの使用法によって特徴付は得る。抗体の抗原結合部位を有す る分子、ウィルス上のレセプター、あるいは細胞のレセプターのような認識分子 は、タンパク質が特定の抗原を標的とするための機能性部分として有用である。

このようにして標的にすると、多量体ゲルゾリン融合構築物は、ウィルスが細胞 に結合して感染するのを阻止し、あるいは病理学的炎症の特徴づける他の細胞に 細胞が結合するのを阻止するのに有用である。本発明の融合構築物の多価性から 、それらは標的に対して、−価の分子より強い親和性を有すると我々は考える。

本発明の１つの実施態様では、機能性部分は、ヒトのリンパ球上のレセプターで あるＣＤ４であり、これは、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの病因であるＨＩＶウィルス の標的である。

ヘテロ多量体融合構築物は、認識分子と毒素、抗レトロウィルス剤、あるいは放 射性核種との組み合わせを有するゲルゾリン融合ポリペプチドを含有する。これ らの物質は、標的を捜して破壊する治療薬として有用である。

認識分子を宵する多量体ゲルゾリン融合構築物は、さらに、診断用アッセイでシ グナルを促進するのに有用である。大きな多量体分子なので、それらは、ホース ラディツシュパーオキシダーゼが結合した抗体のような、レポーター分子に多く の結合部位を提示する。あるいは、それらは、認識分子および多量体レポーター グループを有するヘテロ多量体構築物の形態をとり得る。

機能性部分が、１つあるいはそれ以上の病原体からの１つあるいはそれ以上の免 疫原である場合、本発明の融合タンパク質は、ワクチンに有用である。

さらに、多量体ゲルプリン融合構築物は、機能性グループが酵素、基質あるいは インヒビターの場合、高い生物活性を有する薬剤として使用され得る。

本発明はさらに、その構成物にはポリホスホイノシチドが含まれ、その中に生物 活性物質を含有するリポソームである、多量体ゲルゾリン融合構築物を提供する 。

本発明はさらに、ゲルプリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、それら を有する組み換えＤＮＡ分子、およびそれらによって形質転換された単細胞宿主 を提供する。そして本発明は、そのような宿主を培養することにより、これらの 融合ポリペプチドを生産する方法を提供する。

さらに本発明は、上述に認定した、治療薬、予防薬あるいは診断薬として有用な 、いかなる融合ポリペプチドあるいはタンパク質をも含有する組成物を提供する 。多量体ＣＤ４−ゲルゾリン融合構築物は、ＡＩＤＳ％Ａ　ＲＣ，あるいは旧Ｖ 感染の診断、予防および処置に使用し得る。

乱ｉユ！！呈説ユ 図ＬＡ−ＩＰ　（ｒ図Ｉ　Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）は、Ｄ、Ｊ、　 Ｋｖｉａｔｋｏｖｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２３．　ｐｐ、　４５５−５８ 　（１９８６）に記載のヒトのゲルゾリンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列 を示す。負の番号をつけたアミノ酸は、シグナル配列に相当し、それは成熟ポリ ペプチドにはない。本明細書を通して、ヒトのゲルゾリンのアミノ酸配列あるい はＤＮＡ配列を指すときは、この図に統合され、記載されているものに相当する 。

図２は、ヒトのゲルゾリンのアミノ酸配列の機能性領域を示す。

図３Ａ−３Ｄ（ｒ図３Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　ハ、ｌ＝　）　（ ７）ＣＤ４　ＤＮＡノＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。１−７５位の ヌクレオチドはプラスミドｐ１７０．２に由来する。７６−７４１位のヌクレオ チドは、プラスミドルＣＤ４−ゲルゾリンに由来する。７４２がら１３７７位の ヌクレオチドは、ｐ１７０．２に由来する。本明細書を通して、特に示されない 限り、ＣＤ４のアミノ酸あるいはＤＮＡ配列を指すときは、本図に統合されたも のに相当する。

図４は、ヒトのＣＤ４タンパク質のドメイン構造を示す。番号のついたアミノ酸 は、図３のジスルフィド結合に関与するシスティン残基である。

図５は、本願の実施例に記載されている工程に使用されるオリゴマーのＤＮＡ配 列を示す。この図のゲルゾリン配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１ニ由来する。Ａ ＣＥ　１４４は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｏｎ’ある。ＡＣＥ　１４５ハ、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：４ｒある。　Ｔ４ＡＩＤ−１３３は、ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：５であ る。Ｔ４ＡＩＤ−１３４ハ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６テある。　Ｔ４ＡＩＤ−１ ３７は、５ＥＱＩＤ　ＮＯ＋７である。Ｔ４ＡＩＤ−１７６は、ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：８である。Ｔ４ＡＩＤ−１７６は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９である。

図６は、プラスミドルＣＤ４−ゲルゾリンの構築を示す。

図７Ａ−７８（ｒ図７Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）は、ｐＣＤ４−ゲ ルゾリンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。

図８は、ｐＣＤ４−ゲルゾリンの制限酵素地図である。

図９は、プラスミドｐＤｃ２１９の構築を示す。

図１ＯＡ−１０Ｆ　（ｒ図１０Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）は、ｐ２ １８−８のＤＮＡ配列を示す。

図１１は、プラスミドｐλＰＬ１８０ｃｙｓの構築を示す。

図１２Ａ−１２１（ｒ図１２Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）は、ｐＢＧ ３９１のＤＮＡ配列を示す。

図１３Ａ−１３Ｈ（ｒ図１３　Ｊ　）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）　ハ、ｐ ＥＸ４６ノＤＮＡ配列を示す。

及囚聯」す酊り疲五 「ヒトの血漿ゲルゾリン」とは、図１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ）に示すアミ ノ酸配列の一２７位から＋７５５位を有するポリペプチドを言う。ポリペプチド の発現はしばしば、シグナル配列の切断、分子内ジスルフィド結合、糖付加など のような翻訳後の修飾を含むことは理解されるべきである。ヒトの血漿ゲルゾリ ンという用語の使用は、図１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１）のアミノ酸配列のよ うな修飾を意図する。さらにこの用語は、天然、組み換えあるいは合成の原料か ら得られるゲルゾリンを含む。

「多量体ゲルゾリン融合構築物」および「ヘテロ多量体ゲルゾリン融合構築物」 は、各々、凝集したリン脂質の小胞に結合したゲルゾリン融合ポリペプチドを包 含する。「ゲルゾリン融合ポリペプチド」は、機能性部分に結合したゲルゾリン 部分を包含する。「機能性部分」は、ポリペプチド（「ポリペプチド部分」）あ るいは化合物（「化学部分」）である。

本明細書を通して、特定のゲルゾリン融合ポリペプチドは、機能性部分の名前に よって呼ばれる。例えば我々は、ＣＤ４を機能性部分として有するゲルゾリン融 合ポリペプチドをＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドと呼ぶ。ヘテロ多量体ゲ ルゾリン融合構築物は、少なくとも２つの異なる機能性部分あるいはゲルゾリン 部分を含有する。

機能性部分がポリペプチドである場合、ゲルゾリン融合ポリペプチドは、化学的 架橋あるいは遺伝子融合によって製造し得る。遺伝子融合には、ポリペプチドを コードするＤＮＡ配列が、ゲルゾリン部分をコードするＤＮＡ配列の５゛末端あ るいは３′末端に融合されたハイブリッドＤＮＡ配列が含まれる。適当な宿主で 発現されると、このハイブリッドＤＮＡ配列は、ポリペプチド部分がゲルプリン 部分のＮ末端あるいはＣ末端に融合されたゲルゾリン融合ポリペプチドを産生ず る。

本明細書で使用される「ゲルゾリン部分」は、ポリホスホイノシチドに特異的に 結合するゲルゾリンあるいはその断片である。好ましくは、ゲルゾリン部分はヒ トの血漿ゲルゾリンに由来する。ゲルゾリン部分は、好ましくは、図１　（ＳＥ ＱＩＤ　ＮＯ：１）の＋１５０位から＋１６０位のアミノ酸を含む。本明細書で 証明するように、図１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）の＋１５０位から＋１６９ 位のアミノ酸を含有するポリペプチドは、ＰＩＰ２に結合する能力を有する。ヒ ト以外のを推動物に由来するゲルゾリンもまた、本発明により有用であると我々 は考える。ゲルゾリンの構造は、進化の過程で高く保存されており、ヒト以外の 哺乳類からのゲルゾリンは、ヒトに対して免疫原性であり得ない。

ゲルゾリン以外の脂質結合タンパク質（ｒＬＢＰＪ　”）もまた、存在すること が知られている。特定の脂質に結合するこれらのタンパク質あるいはそれらの断 片は、ＬＢＰ部分（ゲルゾリン部分と同様に）として、特定の脂質を含有する小 胞に結合するＬＢＰ融合ポリペプチドを生産するのに有用である。これは、多量 体あるいはへテロ多量体ＬＢＰ融合構築物を生み出す。ポリホスホイノシチドに 特異的に結合するゲルゾリン関連タンパク質には、ビリン、セベリン、フラグミ ン、プロフィリン、コフィリン、Ｃａｐ４２（ａ）、ｇＣａｐ３９、ＣａｐＺお よびテストリンが含まれる［Ｅ、　Ａｎｄｒｅら、”　５ｅｖｅｒｉｎ、　Ｇｅ １ｓｏｌｉｎ、　ａｎｄ　Ｖｉｌｌｉｎ　５ｈａｒｅ　ａ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕ ｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｒｅｇｉｏｎｓ　Ｐｒｅｓｕｍｅｄ　ｔｏ　Ｃｏ ｎｔａｉｎ　Ｆ−ａｃｔｉｎ　Ｓｅｖｅｒｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎｓ”、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６３．　ｐｐ。

７２２−２７　（１９８ｇ）　：　Ｗ、　Ｌ、Ｂａｚａｒｉら、−Ｖｉｌｌｉｎ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍａｐ　Ｉｄｅｎｔｉｆｙ　Ｓ ｉｘ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｄｏｍａｉｎｓ”、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．　ｐｐ、４９８６−９０　（１９８８）；　Ｃ ，Ａ＋ｉｐｅら、−Ｔｈｅ　Ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｕ ｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｐｒｏｆｉｌｉｎ：　Ｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃａ１ｆ　５ｐｌｅｅｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ”、　■邸」 コ■肛り、２２８．　ｐｐ、１７−２１　（１９８８）；　Ｄ、Ｊ、　Ｋｖｉａ ｔｋｏｖｓｋｉおよびＧ、Ａ、Ｐ。

Ｂｒｕｎｓ、”）Ｉｕｍａｎ　Ｐｒｏｆｉｌｉｎ”、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈ ｅｗ、、　２６３．　ｐｐ、　５９１０−１５　（１９８８）　；　１．　Ｌａ ｓｓｉｎｇおよびＵ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　−５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆ　 ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｐｈｏｓｐｂａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ　４．５−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｐｒｏ ｆｉｌｉｎ：　Ａｃｔｉｎ　Ｃｏａ＋ｐｌｅｘ”、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、、　３７．　ｐｐ、　２５５−６７　（１９８８）；　Ｃ， ＡｍｐｅおよびＪ、　Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ、　−Ｔｈｅ　Ｆ−ａｃｔ ｉｎ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｌ巨肛■ｇ虹■」立り巳−、 ＥＭＢＯ，Ｊ、、　Ｌ　ｐｐ、　４１４９−５７　（１９８７）　；　１．　Ｌ ａｓｓｉｎｇおよびＵ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　−５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅ ｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ 　４．５−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｆｉｌａｃｔ［ｎ”、　Ｋ ａｔｕｒｅ、３１４．　ｐｐ、４７２−７４　（１９８５）；　Ｆ、−Ｘ、Ｙｕ ら、−ｇＣａｐ３９．　ａＣａｌｃｉｕｍ　Ｉｏｎ−ａｎｄ　Ｐｏｌｙｐｈｏｓ ｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ＡｃｔｉｎＣａｐｐｉｎｇ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ”、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０．　ｐｐ、　１４１３−１５　 （１９９０）；およびＮ、　Ｙｏｎｅｚａｖａら、−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆＣｏｆｉｌｉｎ、Ｄｅｓｔｒｉｎ 　ａｎｄ　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｌ　ｗｉｔｈ　Ａｃｔｉｎ　 ｂｙＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ”、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６ ５．　ｐｐ、８３８２−８６（１９９０）］。ポリホスホイノシチドに特異的に 結合する他のＬＢＰは、リポコルチン［Ｋ、　Ｍａｃｈｏｃｚｅｋら、−Ｌｉｐ ｏｃｏｒｔｉｎ　Ｉ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ　ＩＩ　Ｉｎｈｉｂｉｔ　 Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｏ１ｙｐｈｏｓｐｈｏｉｎ。

５ｉｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃ−ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２５ユ、　ｐｐ、　２０？−１２（１９１１９）］および ＤＮａｓｅ　Ｉ［Ｊ、Ａ、　Ｃｏｏｐｅｒら、”Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅｏｆ　Ａｃｔ ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ”、 　Ａｎｎ、　Ｒａｙ。

…１．■、　ｐｐ、　５８５−６０５　（１９９１）］である。プロティンキナ ーゼＣもまた、ある種のリン脂質に結合するＬＢＰである。

ゲルゾリン部分をコードするＤＮＡ配列は、ゲルゾリンをコードするＤＮＡ配列 に由来する。これらのＤＮＡ配列を得るには、いくつかの方法がある。先ず、市 販の化学合成機を使用して、ゲルゾリン遺伝子あるいはその退縮型を化学的に合 成し得る。

図１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）にゲルゾリンのＤＮＡ配列を記載する。コー ド領域は、＋１位から＋２３６０位のヌクレオチドを含む。

第２に、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲルゾリンを コードするｃＤＮＡ配列を単離し得る。多くのスクリーニング法が、当分野で知 られている。例えば、コロニーは、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、核酸 ハイブリダイゼーシゴンによりスクリーニングし得る。プローブは、既知のゲル ゾリンのＤＮＡ配列の一部を有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成すること により、調製され得る。その他に、ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔｌｌのような 発現ベクターに構築し得、コロニーは、抗ゲルゾリン抗体でスクリーニングし得 る。

第３に、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）でＤＮＡを複製すること により、ゲルゾリンあるいはゲルゾリン部分をコードするｃＤＮＡを単離し得る 。我々は、この工程を実施例Ｉに記載する。

次に、ゲルゾリン部分をフードするＤＮＡ配列を、ポリペプチド部分をコードす るＤＮＡ配列に融合し得る。本発明で有用なポリペプチド部分のＤＮＡ配列は、 多くの原料から入手可能である。

これらのＤＮＡ配列には、文献に記載されているＤＮＡ配列および、どのような 一般的な分子クローニング技術によっても得られる特定のポリペプチドのＤＮＡ 配列が含まれる。

広い範囲のポリペプチドが、本発明のゲルゾリン融合ポリペプチドの生産に有用 である。最も有用なものには、多量体の形態で有利に投与されるポリペプチドが 含まれる。例えば、ウィルスのレセプター、細胞のレセプター、あるいは細胞の リガンドが、有用である。なぜならば、それらは、多数のコピーのレセプターを 提示する、粒子あるいは細胞レセプターに典型的に結合するからである。これら の融合ポリペプチドを有する構築物は、ウィルス−細胞間あるいは細胞−細胞間 の結合の抑制を伴う治療に有用である。有用なウィルス−細胞レセプターには、 ＩＣＡＭＩ、ライノウイスルレセブター、ポリオウイ／Ｌ／スＬ／セブターが含 まれる［Ｊ、Ｍ、　Ｗｈｉｔｅおよびり、Ｒ，Ｌｉｔｔｗａｎ、”Ｖｉｒａｌ　 Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｗｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｕｐｅ ｒｆａＩＩｌｉｌｙ”２皿、■、　ｐｐ、７２５−２８　（１９８９）］および 、最も好ましくは、Ｈ１’／レセプターであるＣＤ４である。細胞−細胞レセプ ターあるイハリガントニは、Ｉ　ＣＡＭＩ、ＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭ　１およびＶ ＣＡＭｌｂ、　およびリンパ球の、それらに相当するもの（リガンド）であるＬ ＦＡｌ、ＣＤＸおよびＶＬＡ４、のような血管細胞接着分子ファミリーのメンバ ーが含まれる。これらの分子は、病理的炎症に関与する［Ｍ、Ｐ、Ｂｅｖｉｌａ ｃｑｕａら、−Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌ ｅＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌｅ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ土、ＵＳＡ、８４．　ｐｐ、９２３８−４２　（１９８７）；　 Ｌ、０ｓｂｏｒｎら、−Ｄｉｒｅｃｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ　 １：　Ａ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−４ｎｄｕｃｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔＢｉｎｄｓ　ｔｏ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”、　Ｃｅ１ ｌ、　５９．　ｐｐ、　１２０３−１１　（１９８９）；Ｃ，Ａ、Ｈｅ５ｓｉｏ ｎら、−Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ−１ｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓ ｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　（ＥＬＡＭｓ）ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　１ ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　（ＭＩＬＡｓ ）−、Ｎｏ　９０／１３３００１゜ＬＦＡ２（ＣＤ２）およびＬＦＡ３　（どち らもＣＤＩＩ／ＣＤ１ｇファミリーのメンバー）のような、他のリンパ球関連抗 原およびＰＡＧＥＭもまた、有用である。

細菌性免疫原、寄生虫性免疫原、およびウィルス性免疫原は、ポリペプチド部分 として、ワクチンとして有用な多量体あるいはへテロ多量体ゲルゾリン融合構築 物の生産に使用され得る。これらの免疫原の細菌原料には、細菌性肺炎およびユ ニーモジステイス症肺炎の原因微生物が含まれる。寄生虫［料ニは、Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍのようなマラリア寄生虫が含まれる。

ウィルス原料には以下のものが含まれる二例えば、牛痘ウィルスおよび年度ウィ ルスのようなポックスウィルス；単純へルビウィルス１型および２型、Ｂ−ウィ ルス、バリセラーシスターウィルス、サイトメガロウィルスおよびエプスタイン ・バーウィルスのようなヘルペスウィルス；マストアデノウィルスのようなアデ ノウィルス；パピローマウィルス、およびＢＫおよびＪＣウィルスなどのポリオ ーマウィルス、のようなパポバウイルス；アデノ関連ウィルスのようなバルボウ イルス；レオウィルス１．２および３のようなレオイルス；コロラドダニ熱ウィ ルスのようなすルビウィルス；ヒトのロタウィルスのようなロタウィルス；東部 脳炎ウィルスおよびヴエネズエラ脳炎ウィルスのようなアルファウ゛イルス；風 疹ウィルスのようなルビウイイルス；黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本 脳炎ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルスのようなフラビ ウイルス；　ヒトのコロナウィルスのようなコロナウィルス；パラインフルエン ザ１．２．３および４、およびおたふくかぜウィルスのようなバラミキソウイル ス；麻疹ウィルスのようなモルビリウィルス；呼吸器融合細胞ウィルスのような ニニーモウイルス；水庖性口内炎ウィルスのようなベジキュロウイルス；狂犬病 ウィルスのようなリサウイルス；インフルエンザＡおよびＢのようなオルソミキ ソウイルス；ラクロソセウイルス（ＬａＣｒｏｓｓｅ　ｖｉｒｕｓ）のようなブ ンヤウイルス；　リフトバリー熱ウィルスのようなフェルボウイルス；コンゴ出 血熱ウィルスのようなナイロウイルス；Ｂ型肝炎ウィルスのようなヘパドナウィ ルス；　１ｃｍウィルス、Ｌａ５ｓａウイルスおよびＪｕｎｉｎウィルスのよう なアレナウイルス；１（ＴＬＶ　Ｉ、　ＨＴＬＶ　Ｉｔ％ＨＩＶ　ｌ、および旧 Ｖ　１１（７）ようなレトロウィルス；ポリオウィルス１．２、および３、コク サラキーウィルス、エコウィルス、ヒトのエンテロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス 、Ｅ型肝炎ウィルス、およびノーワークウィルスのようなエンテロウィルス；ヒ トのライノウィルスのようなライノウィルス；および、マールブルグ（病）ウィ ルスおよびアデノウィルスのようなフィロウィルスである。

標的の分子に結合する免疫グロブリンあるいはその断片もまた、機能性部分とし て使用し得る。免疫グロブリン分子は２価であるが、多量体免疫グロブリン−ゲ ルゾリン融合構築物は多価であり、標的に対する親和性あるいは結合活性が上昇 することを示し得る。研究者はさらに、抗体の一ドメイン（ｄＡｂｓ）を使用し 得るようにした［Ｅ、Ｓ、　Ｗａｒｄら、−Ｂｉｎｄｉｎｇ　ＡｃｔＬｖｉｔｉ ｅｓ　ｏｆ　ａ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇ ｌｏｂｕｌｉｎ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｄｏｍａｉｎｓ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｒ ｏ＋ｗ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ”、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｉ４１、９ Ｉ）、　５４４−４６　（１９８９）］。特定の抗原を認識するモノクローナル Ｆａｂ断片は、Ｈｕｓｅらの方法を用いて作成し得、本発明に従って、多量体あ るいはへテロ多量体ゲルゾリン融合構築物の機能性部分として、個々のドメイン を使用し得る［Ｗ、Ｄ、　Ｈｕｓｅら、”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｌ ａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｍ ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　Ｐｈａｇｅ　Ｌａ＋ ＊ｂｄａ”、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２４６、　ｐｐ、　１２７５−８１　（１９８９）］。さらに、Ａ、　５ｋｅｒ ｒａおよびＡ、　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ　＋Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ａ　Ｆｕｎ ｃｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｆｖ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　 ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ−、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０．　ｐｐ 、１０３８−４３　（１９８８）］を参照のこと。

本発明に従って、機能性部分が酵素、酵素基質、あるいは酵素インヒビターであ る多量体ゲルゾリン融合構築物を産生じ得る。我々は、そのような物質は単量体 分子よりも強い生物活性を示すと考える。なぜならば、多量体はより高い部分密 度を有し、増加した触媒速度を示すからである。例えば、我々は、組織プラスミ ノーゲン活性化因子を有する多量体ゲルゾリン融合構築物はその一価のものより 強い凝固溶解性触媒活性を有すると考える。同様に、我々は、ヒルジンを有する 多量体ゲルゾリン融合構築物は、ヒルジン単独より強い抗凝固活性を示すと考え る。

他の有用な機能性部分には、以下のものが含まれるが、これらに限られるわけで はない。すなわち、種々のＩＦＮ−α、特にＣ２、Ｃ５、Ｃ８、ＩＦＮ−βおよ びＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、■Ｌ−４、ＩＬ−５、（Ｌ−６ 、ＩＬ−７およびＩＬ−８を含む種々ノイ７９−　ａ　イキン、および腫瘍壊死 因子ＴＮＦ−αおよびβを含むサイトメガロのようなポリペプチドである。さら に、機能性部分には、単球コロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）、顆粒球コロニー刺 激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ ）、エリスロポエチン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＰ）、および、成長ホルモ ンおよびインシニリンを含むヒｔ・および動物のホルモンが含まれる。

本発明の１つの実施態様によると、多量体ゲルゾリン融合構築物はＣＤ４−ゲル ゾリン融合ポリペプチドを含有する。ＣＤ４は、白血球である１９７８球上のレ セプターであり、それは、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの病因である旧Ｖを認識する［ Ｐ、Ｊ、　Ｍａｄｄｏｎら、Ｔｂｅ　Ｔ４　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｓ　ｔｈｅ 　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　Ｉｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅ ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｂｒａｉｎ −、江■、　４７．　ｐｐ、　３３３−４８　（１９８６）］。詳細には、ＣＤ ４は、ＨＩ■ウィルス表面ノタンパク賀ｇｌ）１２０およびｇｐｔ６ｏを認識す る。ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドでは、機能性部分は、全長のＣＤ４あ るいはその断片、好ましくは可溶性ＣＤ４を含有するポリペプチド部分である。

本明細書中のＣＤ４という用語は、特に示さない限り、全長のＣＤ４あるいはＣ Ｄ４の断片を指し得る。

全長のヒトのＣＤ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびその推定アミノ 酸配列を図３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２）に記載する。（さらに、Ｐｉ、Ｍａ ｄｄｏｎら、−Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃＤＩＪＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅ１ ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔ４Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅ＋ａｂｅｒ　ｏｆ 　ｔｈｅ　１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｆａ＋ａｉｌｙ−、Ｃａ １Ｌ　４２．　ｐｐ、　９３−１０４　（１９８５））推定−次構造に基づイテ 、ＣＤ４ポリペプチドは、次のような機能性ドメインに分１１１される：第１免 疫グロブリン関連ドメインはさらに、可変部関連（Ｖ）領域および、約＋９５位 のアミノ酸から始まる連結部（Ｊ）関連部分に分けられる［Ｓ、Ｊ、　Ｃ１ａｒ ｋら、−Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　 ｏｆ　Ｒａｔ　ＣＤ４　（Ｗ３／２５）　Ａｎｔｉｇｅｎ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ 　ｆｏｒ　Ｄｅｒｉｖａむｔｏｎ　ｆｒｏｍ　ａ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗｊｔ ｈ　Ｆｏｕｒ　ＩＩｌｔｘｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄＤｏｍａｉ ｎｓ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ＋、ＵＳＡ、　８４．　 ｐｐ、　１６４９−５３　（１９８７）］。

これらのドメインは、ドメイン内のジスルフィド結合によって、ＣＤ４タンパク 質の構造ドメインにほぼ対応している。従って、ジスルフィド結合は、第１の免 疫グロブリン関連ドメインの＋１６位と＋８４位のアミノ酸、第２の免疫グロブ リン関連ドメインの＋１３０位と＋１５９位のアミノ酸、および第４の免疫グロ ブリン関連ドメインの＋３０３位と＋３４５位のアミノ酸を結合させている。図 ４に、ヒトＣＤ４タンパク質の全長のドメインの構造を示す。

可溶性ＣＤ４タンパク質を、全長のＣＤ４タンパン質をアミノ酸＋３７５位で切 断して、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを削除して構築した 。このようなタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生産され、組換え可溶性 ＣＤ４　（ｒｓＣＤ４）と称される［Ｒ，Ａ、　Ｆｉｓｈｅｒら、−ＨＩＶ　Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　ＩｎＶｉｔｒｏ　ｂｙ　Ｒｅｅｏｍ ｂｉｎａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４−、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．　ｐｐ 、７６−７８　（１９８ｇ）；　Ｆｉｓｈｅｒら、ＰＣＴ特許出願Ｎｏ　８９１ ０１９４０　（本明細書に参考として援用されている）］。これらの可溶性ＣＤ ４タンパク質は、ＣＤ４タンパクを発現する細胞のＨＩＶ感染を阻害する機構を 、プロ、りするかあるいは競合的に結合することによって、ＣＤ４°リンパ球／ ＨＩＶ相互作用を都合よく妨げる。第１の免疫グロブリン関連ドメインは、ｇｐ １２０とｇｐ１６０とに結合するのに十分である。可溶性ウィルスレセプターと して作用することによって、可溶性ＣＤ４タンパク質は、ＨＩＶのＣＤ４“リン パ球への結合を阻害し、ウィルス誘導性の合胞体の形成を阻害する、抗ウイルス 治療剤として有用である。

本発明に有用なＣＤ４ポリペプチドには、ｇｐ１２０およヒｇｐ１６０ニ結合あ るいは他の方法で阻害する全てのＣＤ４ポリペプチドが含まれる。これらには、 図３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　にＤアミノ酸＋３７１位から＋３９１位の トランスメンブランドメインが欠損しているＣＤ４のフラグメントが含まれる。

このような断片は、ＣＤ４の先端切断型か、あるいは第４の免疫グロブリン関連 ドメインが親水性の細胞質ドメインに直接結合している融合タンパク賃であり得 る。本明細書では、図３　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２）のアミノ酸位＋１位から ＋Ｘ位、および必要に応じてＮ末端メチオニンあるいはｆ−メチオニン含んでい る、ＣＤ４ポリペプチドを”　ＣＤ４（Ｘ）″と称することにする。ＣＤ４ポリ ペプチドが工学的にカルボキシ末端のシスティンを含む場合に、ＣＤ４（ＸＣｙ ｓ）″と称している。

例えば、図３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２）によると、第１の免疫グロブリン様 ドメインを含む可溶性ＣＤ４タンパク質は、好ましくは、少なくともアミノ酸＋ １位から＋８４位、最大＋１位から＋１２９位を含む。最も好ましくは、可溶性 ＣＤ４タンパク賃は、アミノ酸位＋１位から＋１１１位を含む［ＣＤ４（１１１ ）］。第１の２つの免疫グロブリン様ドメインを含む〕溶性ＣＤ４は、好ましく は、少な（とも＋１位から＋１５９位、最大＋１位から＋３０２位を含む。さら に好ましくは、可溶性タンパク質は、少な（ともアミノ酸＋１位から＋１７５位 、最大＋１位から＋１９０位を含む。最も好ましくは、可溶性ＣＤ４９ンｌ”） 質は、アミン酸＋１位から＋１８１位を含む［ＣＤ４（１８１）］、アミノ酸＋ １位から４８３位［ＣＤ４　（１８３）］、あるいはアミノ酸＋１位から＋１８ ７位［ＣＤ４（１８７）］を含む。第１の４つの免疫グロブリン様ドメインを含 む可溶性ＣＤ４タンパク質は、好ましくは、少なくともアミノ酸＋１位から＋３ ４５位［ＣＤ４（３４５）コ、および最大アミノ酸＋１位から＋３７５位［ＣＤ ４（３７５）］を含む。これらのいずれの分子も、必要に応じて、図３　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２）のアミノ酸−２３位から一１位のＣＤ４シグナル配列を含 み得る。さらに、これらの分子は、アミノ酸＋１位の前に改変されたメチオニン 残基を有し得る。

本発明の融合ポリペプチドおよび方法に有用な可溶性ＣＤ４タンパク質は、種々 の方法によって生産され得る。図３　（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２）の同じ系によれ ば、Ｔ細胞から単離された成熟ＣＤ４タンパク質のアミノ末端アミノ酸は、図３ 　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＯ２０のヌクレオチド１３６位から１３９位にコードさ れるリシンである。

［Ｄ、Ｒ，Ｌｆｔｔｍａｎら、”Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ＣＤ４５ｅｑｕｅｎｃｅ −、Ｃｅ１ｌ、５５゜１）、５４１　（１９８Ｂ）、コさらに、可溶性ＣＤ４タ ンパク質は、アミノ酸＋１位がアスパラギン、＋６２位がアルギニン、および＋ ２２９位がフェニルアラニンであるアミノ酸を含む。従って、ＣＤ４と称するき きは、これらの任意の置換あるいは全ての置換を含んでぃるアミノ酸配列を含む ことを意図する。可溶性ＣＤ４ポリペプチドは、すりゴヌクレオチド特異的変異 誘発、および制限酵素消化、その後のリンカ−の挿入、あるいは酵素による全長 のＣＤ４タンパク質の消化を含む、従来の組換え技術によって生産され得る。

可溶性ＣＤ４タンパク質には、本明細書に参考として援用されている、本願譲渡 人に共通に譲渡されている係属中の、１９８７年９月４日に出願された米国特許 出願系０９４．３２２号および１９８８年１月７日に出願の第１４１．５４９号 、および１９８８年９月１日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／１ｌｓ１１ １１１０２９４０号、および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９１０１９４０の方法に 従った組換え技術によって生産され得る。

可溶性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列によって特徴付けられる微生物 および組換えＤＮＡ分子は、ＰＣＴ特許出願ＷＯｇ９１０１９４０に記載されて いる培養物によって例示される。これらは、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　Ｍａｒｙｌ ａｎｄ、　ＵＳＡのインビトロ　インターナシラナル　インコーポレーテイッド 　カルチャーコレクシコン（Ｉｎ　Ｖｉｔｏｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 、　Ｉｎｃ、　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、１９８７年９月２ 日に寄託され、受託番号は下記の通りである。

ＥＣ工００：　Ｌ立性ンＪＭＥ１３／ｐＥｃｌｏｏ　−工Ｖ工１０１４６ＢＧコ ア７：　ｚ１ｓｓロー、ＭＣ１０６１／ｐＢＧ：１７７　−　ｒＶＴ　１０１４ ７ＢＧ］８０：　ｚユ≦＝≧Ｌ裏　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３８０　−　工Ｖ工　 １０１４８ＢＧコ８１：　ｚ１ＳＳ８−２ＭＣ１０６１／ｐＢＧ：３８１　−　 工Ｖ工　１０１４９このような微生物および組換えＤＮＡ分子は、インビトロ　 インターナシラナル　インコーポレーティッド　力ルチャーコレクンヨンに、１ ９８８年１月６日に寄託されている培養物によっても例示され、その受託番号は 下記の通りである。

ＢＧ−３９１：　：二≦■Σに：　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ：１９１　−　工Ｖ工 　１０１５４ＢＧ−３９２：　ｚ１ｓ９」−２ＭＣ１０６エ／ｐＢＧコ９２　− 　工Ｖ工　１０１５２ＢＧ−３９：ｌ：　ｚ１≦＝Σ【λ　ＭＣ１０６１／ｐＢ Ｇコ９３　−　工Ｖ工　１０１５：ＩＢＧ−３９４：　＝ユ≦■Σ【λ　ＭＣ１ ０６１／ｐＢＧ］９４　−　工Ｖ工　１０１５４ＢＧ−３９６：　ｚユ≦■Σに λ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ：＋９６　−　工Ｖ工　１０１５５２０３−５　：　 Ｌ皿ムＳＧ９］６／ｐ２０３−５　−　工ｖ工１０１５６さらに、このような微 生物および組換えＤＮＡ分子は、１９８８年８月２４Ｂに、インビトロ　インタ ーナシラナル　インコーボレーティッド　カルチャーコレクシコンに寄託された 培養物によって例示され、その受託番号は下記の通りである。

２１１−１１：　ｚ１≦■ｌＬ裏　Ａ８９／ｐＢＧ２１１−１１　−　工Ｖ工　 １０１８３２１４−１０：　Ｌｉ１ｉＡＩ３９／ｐＢＧ２１４−４０　−　ｒＶ Ｔ　１０１８４２１５−７　：　Ｌ区ムＡ８９／ｐＢＧ２１５−７　−　ｒＶＴ １０１８５ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドを有する、多量体のＣＤ４−ゲ ルゾリン構築物は、ＡＩＤＳ、　ＡＲＣ，旧Ｖ感染、あるいはＨＩＶに対する抗 体を有するヒトを処置する薬学的組成物に用いられ得る。従って、この構築物は ■ＩＶ感染の免疫不全効果を減少させるか、あるいはＨＩＶ感染の発生あるいは 拡散を予防するのに用いられ得る。さらに、これらの融合タンパク質および方法 は、サル免疫不全ウィルスのようなヒトを含む哺乳類でのレトロウィルスが原因 であるＡＩＤＳ様疾患の処置に用いられ得る。

ゲルゾリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、多量体のゲルゾリン融 合構築物を生産するのに有用である。これらのＤＮＡ配列を用いる好ましい方法 には、適切な宿主でのゲルゾリン融合ポリペプチドの発現、ポリペプチドの単離 、およびこのポリペプチドのポリホスホイノシチドを含む小胞への結合が含まれ る。

当分野には公知のように、本発明のＤＩＪＡ配列を発現するために、このＤＮＡ 配列は、適切な発現ベクターの発現制御配列に作動可能に結合され、適切な単細 胞宿主に形質転換するために発現ベクターとして用いられる。このように本発明 のＤＮＡ配列を発現制御配列に作動可能に結合することには、もちろんＤＮＡ配 列の上流に正しいリーディングフレームで翻訳開始シグナルを提供することを含 む。発現される特定のＤＮＡ配列がＡＴＧから始まらないときは、開始シグナル は、他のアミノ酸すなわち生成物のＮ末端に配置しているメチオニン（あるいは 細菌ので一メチオニン）である。このようなメチオニン含有の生成物は、本発明 の組成物および方法に直接に用いられ得るが、通常は、使用の前にメチオニンが 除かれるのが望ましい。このように、ポリペプチドからそれと共に発現されるＮ 末端メチオニンを削除する方法は、当業者には公知である。例えば、ある種の宿 主および培養条件では、インビボでＮ末端メチオニンの実質的に全てを削除し得 る。他の宿主での発現には、インビトロでＮ末端メチオニンの削除が必要である 。しかし、このようなインビボおよびインビトロの方法は、当分野では公知であ る。

宿主／発現ベクターの種々広範囲の組み合せは、本発明のＤＮＡ配列を発現する のに用いられ得る。有用な発現ベクターは、染色体のセグメント、非染色体のセ グメントおよび合成りＮＡ配列からなり得る。例えば、ｃｏＩＥｌ、ｐｃＲｌ、 ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含むＥ、　ｃａｌｆ由来のプラ スミドのようなＳＶ４０の既知の種々の誘導体および既知の細菌プラスミド；　 ＲＰ４、ファージＤＮＡなどの広範囲宿主プラスミド；　ＮＭ９８９などのλフ ァージの多くの誘導体；およびＭ１３および１本鎖ＤＮＡファージのフィラメン トなどの他のＤＮＡファージ；２μプラスミドあるいはその誘導体などの酵母プ ラスミド、およびファージＤＮＡあるいは他の発現制御配列に用いるために改変 されたプラスミドのようなプラスミドとファージＤＩＩＩＡとの組み合せ由来の ベクターでなり得る。

さらに、任意の種々広範囲の発現制御配列、すなわち作動可能に結合されたＤＮ Ａ配列の発現を制御する配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するこれらのベクタ ーに用いられ得る。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０ある いはアデノウィルスの初期および後期プロモーター、しに系、ｍ系、ｎｑあるい は１系、λファージの主要オペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコー トタンパク質の制御配列、３−ホスホブリン酸牛ナーゼあるいは他の解糖系酵素 のプロモーター、Ｐｈｏ５などの酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母α接 合因子プロモーター、バキニロウイルス系のポリへドロンプロモーターおよび原 核あるいは真核細胞あるいはそのウィルス、および種々のそれらの組み合わせた ものの遺伝子を制御することが知られている他の配列が含まれる。

さらに、種々の広範囲の単細胞宿主が、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である 。これらの宿主には、Ｅ、　ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａΣ、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ、江２肛姐こ旦などの細菌株；酵母のなどの真菌類；およびＣｌｌ０および マウス細胞などの動物細胞、ＣＯ５−１、ＣＯ５−７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０お よびＢＭＴ　１０などのアフリカミドリザル細胞；昆虫細胞；および組織培養の ヒト細胞および植物細胞：などの公知の真核および原核宿主が含まれる。動物細 胞の発現には、Ｃｌｌ０細胞およびＣＯ５−７細胞が好ましい。

本発明のＤＮＡ配列を発現するのに、全てのベクターおよび発現制御配列が同等 に機能するのではないことは、もちろん理解されるべきである。同じく、全ての 宿主が、同じ発現系で十分に同等に機能するわけではない。しかし、当業者は、 過度の実験をせずに、そして本発明の範囲を逸脱することなく、特にこれらのベ クター、発現制御配列および宿主を選択し得る。例えば、ベクターの選択では、 そのなかで複製しなければならないので宿主を考慮するべきである。ベクターの コピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクタ ーによってフードされる任意の他のタンパク質の発現もまた考慮されるべきであ る。

発現制御配列の選択においては、種々の因子がさらに考慮されるべきである。例 えば、これらには、系の相対的な強さ、その制御能、および本発明の特定のＤＮ Ａ配列、特に可能な二次構造に関する適合性が含まれる。単細胞宿主は、選択さ れるベクターに対しての適合性、本発明のＤＮＡによる発現においてコードされ た生成物の宿主に対する毒性、分泌特性、正確にタンパク質を折り畳む能力、そ の培養条件、および本発明のＤＮＡ配列によって発現するようにコードされた生 成物の精製の容易さを考慮して選択されるべきである。

これらのパラメーター内で、当業者は、発酵あるいは、例えばＣＨＯ細胞あるい はＣＯ５−７細胞などの大規模な動物細胞培養において、本発明のＤＮＡ配列を 発現する、種々のベクター／発現制御系／宿主の組み合わせを選択し得る。

本発明の１つの実施態様では、ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペチドをフードする ＤＮＡ配列をλＰＬプロモーターの発現制御配列に作動可能に結合したものを含 有するプラスミドを、ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドを生産するためにＥ 、ｃｏｌｆにおいて発現させる。

本発明のＤＮＡ配列の発現において生産されるポリペプチドおよびタンパク質は 、種々の従来法を用いて、発酵あるいは動物細胞培養物から単離され、そして精 製され得る。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、最も適した単離法お よび精製法を選択し得る。

さらに、固相合成法［Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　”５ｏｌｉｄ　Ｐｈ ａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　１．　Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｔａｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ−。

Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、、　８３．　ｐｐ、　２１４９−５４ 　＜１９６３）コなどの従来のペプチド合成法を用いて、化学合成によってゲル ゾリン融合ポリペプチドが生産され得る。

遺伝子融合および化学合成に加えて、ゲルゾリン融合ポリペプチドを生産するた めの有用な他の方法は、ゲルゾリン部分に機能性部分を化学的にカップリングす ることによる。この方法は、化学的な部分およびポリペプチド部分の両者に有ゲ ルゾリン部分をポリペプチド部分に化学的にカップリングするための数種のアプ ローチが可能である。好ましいストラテジーは、ポリペプチド部分の活性を壊す ことなくゲルゾリン部分に選択的に結合するような、ポリペプチド部分の部位を 同定あるいは形成することである。ＣＤ４のような糖タン、ｆり質は、限られた 数の糖を有していて、これは架橋部位として有用である。糖は酸化されてアルデ ヒドになり、次に、アルデドは、ゲルゾリン部分のアミン基と反応してアルデヒ ド−アミン結合を形成する［Ｐ、に、　ＮａｋａｎｅおよびＡ、　［ａｖａｏｉ 、”Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：　Ａ　Ｎｅ ｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ＋、　Ｊ、　Ｈ’ｓｔｏｃｈ ｅｍ、　Ｃｔｏｃｈｅ＋ａ、、　２２．　ｐ、　１０８４　（１９７３）、およ びＴ、−Ｈ，Ｌｉａｏら、”Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｉａｌｙｌ　 Ｒｅ５ｉｄｕｅｓ　ｏｆ　５ｉａｌｏ１ｙｃｏｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　５ｕｒｆａｃｅ−９Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、、２４８．　ｐｐ、８２４７−５３　（１９７３）］。Ｃ Ｄ４は、アミノ酸＋２６９位から＋２７１位および＋２９８位から＋３００位と に２つの機能的グリコジル化部位（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３を参照）を有してい る。これらは、ｇｐ１２０の結合領域外にあり、タンノ４り質の最初の１１３個 のアミノ酸中にある［　Ｂ、　Ｈ，Ｃｈａｏら、−Ａ　１１３−ａｍｉｎｏ　Ａ ｃ１ｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＤ４　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｆ　Ｂｌｏｃｋｓ　Ｈｕｍ介してのＣＤＪカップリング は、機能を妨げてはならない。あるいは、ＣＤ４は、グリコジル化部位の１つを 遺伝子工学的に削除され得る。このことは、結合の間に選択的に増加する。ＣＤ ４を用いてのアルデヒド−アミン結合を実施例■に記載している。

タンパク質の化学者は、さらに、チオール基を介してのポリペプチドの共有結合 によるカップリングの特異的な化学理論を開発した。遊離のチオール基を有する ポリペプチド部分は、システィンを含有するゲルゾリン部分に結合させ得る。

このことは、ジスルフィド結合の直接形成、あるいは同種の２つの官能性の架橋 剤によるジスルフィド結合の間接的な形成のいずれかによってなされる。同種の ２つの官能性の架橋剤の１つの例は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）であっ て、これはチオール反応性のマレイミド基を有していて、遊離のチオールと共有 結合を形成する。これらの方法には、アミン末端あるいはカルボキシ末端にシス ティンを含むゲルゾリン部分の構築が必要である。ペプチド合成機（実施例■、 ２項）は、これらの構築に有用である。

ポリペプチド部分が遊離のチオール基を有していない場合には、このような基を 誘発し得る。例えば、ポリペプチドは、チオール含有のアミンに結合し得る。さ らに詳しくは、ポリペプチド部分の酸化された糖は、上記のようにアミンと反応 し得る。

さらに、システィンは、ポリペプチド部分のアミノ酸配列に、部位特異的変異誘 発よって導入し得る。

あるいは、ポリペプチド部分およびゲルゾリン部分は、異なる２官能性の架橋剤 によって架橋され得る。これらは、官能基の１つがポリペプチド部分に結合し、 他の１つがゲルゾリン部分のチオールに結合するように選択される。例えば、ス クシンイミド基は、例えば、マレイミドあるいは活性化されたチオール基がゲル ゾリン部分のシスティンに結合し得るように、ポリペプチド部分のアミン基およ びチオール反応基に結合し得る。

実施例■にＣＤ４を用いての、チオール結合を包含する方法が記載されている。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ、　ＩａｏＩｌｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏ ｇｕｅおよびＨａｎｄｂｏｏｋ　Ｖｏｌｕｍｅ　１　ｊ　Ｅ４−Ｅ１２、Ｅ４１ −Ｅ４８、およびＥ３１−Ｅ４０に、多くの有用な同種および異種の２官能性の 架橋剤、チオール含有のアミン、および反応基を宵する分子が記載されている。

ポリペプチドおよび化学的な部分の両者のカップリングに有用な他の方法には、 例えば、ゲルタールアルデヒドを用いる方法［Ｍ、　Ｒｅ１ｃｈｌｉｎ、　”Ｕ ｓｅ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ａｓ　ａ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ａ ｇｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｕｔｆｄｅｓ−、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ士り阻ｕ註国■、７０．　ｐｐ、１５９−６５　（１９８０）コ、’ｐ ｉ−ｘチ／Ｉ／−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド［Ｔ、 Ｌ、Ｇｏｏｄｆｒｉｅｎｄら、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｂｒａｄｙｋｉ ｎｉｎ　ａｎｄ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ：　Ａ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃａｒｂｄｉ ｉｍｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−、５ｃｉｅｎｃｅ、１４４．　ｐ ｐ、１３４４−４６　（１９６４）］あるいは］Ｎ−エチルーＮ−３−ジメチル アミノプロピル）−カルボジイミドおよびスフニル化されたキャリアーの混合物 ［Ｍ、Ｈ，Ｋｌａｐｐｅｒおよび１．Ｍ、　Ｋｌｏｔｚ、　−Ａｃｙｌａｔｊｏ ｎ　ｗｉｔｈ　Ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ” 、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、　２５．　ｐｐ、　５３１− ３６　（１９７２）］が含まれる。化学的なカップリングは、ゲルゾリン部分の １つの部位に限定されないので、各々のゲルゾリン部分に１つ以上の反応性部分 がカップリングし得る。

本発明の多量体およびヘテロ多量体のゲルゾリン融合構築物は、ゲルゾリン融合 ポリペプチドを小胞に凝集されたリン脂質に結合させることにより生産され得る 。小胞は、ゲルゾリンに結合する、少なくとも１種のリン脂質を含有しなければ ならないが、しかし他のものも含み得る。ホスファチジルイノシトール、ＰＩＰ およびＰＩＦ２が、ゲルゾリンに結合するので、小胞の好ましい構成成分である 。効果的であるためには、小胞は少な（とも３％のＰＩＦあるいはＰＩＦ２を含 むのが好ましい。

小胞を構成し得る他の脂質には、限定はされないが、ホスファチジルコリン（Ｐ Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ ）が含まれ得る。さらに、Ｔｒｉｔｏｎのような界面活性剤を含有する小胞も形 成され得る。

リン脂質小胞の製造は、当分野では公知である［　Ｄ、　Ｍ、　Ｈａｙｅｒｓｔ ｉｃｋおよびＭ、Ｇｌａｓｅｒ、−Ｖｌｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ” −１ｎｄｕｃｅｄＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　Ｄｏｍａｉｎｓ−、Ｐｒｏｃ−Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　５４、　Ｉ）Ｉ）、　４４７５−７ ９　（１９８７）］。例えば、乾燥脂質を水と混合して、その混合物を超音波処 理し、小胞をつくる。ＰＩＦは、同じ大きさおよび結合の小胞を得るためにＰＩ Ｆ２よりも徹底的に超音波処理しなければならない。次に、ゲルゾリン融合ポリ ペプチドを加えて、小胞に結合させる。この得られた生成物は、多量体ゲルゾリ ン融合構築物である。

小胞が多くの異なる脂質および界面活性剤を含有し得る事実は、所望の特性を有 する融合構築物を工学的に得るのに多大な融通性をもたらしている。例えば、さ らに大きな小胞をつくるために出発物質の脂質組成物を変えることによって、あ るいは小胞中のＰＩＦあるいはＰＩＦ２の割合を増すことによって、異なるの数 のゲルゾリン融合ポリペプチドを結合する小胞をつくり得る。さらに、機能性部 分の半減期を変え得る。

これらの小胞は最終的にはリパーゼによって分解されると考えられる。小胞の脂 質組成物を変えることによって、小胞の崩壊速度を変え得る。

本明細書に例示したように、空洞を有するリン脂質小胞が、生物活性を有する分 子の存在下に調製されると、その分子は小胞中に取り込まれる。従って、生物活 性を有する薬剤を取り込んだ、多量体ゲルゾリン融合構築物を生産し得る。これ らのリポソームは、細胞膜に融合し得、内容物を細胞に配送し、ゲルゾリン融合 ポリペプチドを細胞膜に付加する。

ヘテロ−多量体ゲルゾリン融合構築物は、少なくとも２つの異なる機能性部分あ るいは２つの異なるゲルゾリン部分を含有する。例えば、ヘテロ−多量体ゲルゾ リン融合構築物は、２つの、異なるポリペプチド部分、２つの異なる化学的部分 、あるいはポリペプチド部分および化学的部分の両方を含有する。

ヘテロ−多量体ゲルプリン融合構築物は、特に、異なる部分が互いに相補的であ る場合に有用である。例えば、毒あるいは抗レトロウィルス剤とともに、本発明 の融合タンパク質において、特定の標的粒子あるいは細胞に結合するレセプター を組み合わせて、標的となる毒素あるいは抗レトロウィルス剤を生産することは 可能である。毒として有用なポリペプチドには、限定はされないが、リシン、ア ブリン、アンギオゲニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ、ヤ マゴボウ（ｐｏｋｅｖｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、サポニン、ゲロニン（ｇ ｅｌｏｎｉｎ）およびジフテリアトキシン、あるいはその毒素部分が含まれる。

有用な抗レトロウィルス剤には、スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）　、アジドチミジ ン（ＡＺＴ）、ジデオキシンチジンおよびカスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏ ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、デオキシノジリマイシン（ｄｓｏｘｙｎｏｊｉｒｉ＋＊ｙ ｃｉｎ）およびその誘導体などのグルコシダーゼインヒビターが含まれる。

さらに、本発明のへテロー多量体ゲルゾリン融合構築物は、サンプル中あるいは インビボでの標的分子の存在を同定するための診断薬として有用である。このよ うなタンパク質には、標的分子に結合する免疫グロブリンあるいはその断片（Ｆ ａｂ。

ｄＡｂ）などの認職分子である１つの機能性部分［前述Ｗａ　ｒｄら、を参照］ 、および放射性核種、酵素（例えば、ホースラディフンユバ−オキシダーゼ）、 あるいは蛍光または化学ルミネッセントマーカーなどのリポータ−基である第２ の機能性部分が含まれる。典型的には、リポータ−基は、直接にリポータ−基に 結合される。例えば、ＨＲＰは直接免疫グロブリンに結合される。多くのリポー タ−基は、多量体ゲルゾリン融合構築物に力、ブリングして、そのことによって シグナルを促進し得る。これらの構築物は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのサン プルに接触させる認識分子として、あるいはインビボでイメージング剤として抗 体を置換するのに用いられ得る。本発明のへテロー多量体ゲルゾリン融合構築物 は、さらにマルチワクチンとして用いられ得る。例えば、同じ感染性の物質から の数種の異なる抗原決定基を用いて、このような構築物を産生じ得る。さらに、 数種の感染性の物質、例えば、ポリオ、麻疹、オタフクカゼ、および子どもの予 防接種に用いられる他のものの抗原決定基を含有する構築物が生産され得る。

本発明の薬学的組成物は、典型的には、多量体ゲルゾリン融合構築物の薬学的に 有効な量、および薬学的に受容可能なキャリアーを含有する。本発明の治療法に は、これらの組成物を用いて薬学的に受容可能な様式で患者を処置する工程が包 含される。これらの組成物は、ヒトを含む哺乳類を治療するのに用いられ得る。

本発明の薬学的な組成物は、種々の形態で有り得る。例えば、これらには、錠剤 、ピル、粉末、溶液、あるいは懸濁液、リポソーム、座薬、注射液、注入できる 液、徐放型法などの固体、半固体および液体の投与形態が含まれる。好ましい形 態は、投与および治療の適用の目的とされる方法に依存する。

さらに、組成物には、好ましくは、当業者には公知の、従来の薬学的に受容可能 なキャリアーおよびアジュバントが含まれる。

一般的に、本発明の薬学的組成物は、αインターフェロンのような薬学的に重要 なポリペプチドに用いられるのと同様の方法および組成を用いて、処方されそし て投与される。本発明の融合構築物は、従来の投与経路、例えば、非経口的、皮 下、静脈内、筋肉内、あるいは病巣的経路で投与され得る。

従来の使用は、含まれる特定の分子部分に依存して変化することは理解される。

本発明がさらによく理解されるために、次に実施例をあげる。これらの実施例は 、例示することのみを目的とし、如何なる方法においても本発明を限定するよう には構成されていない。

次ぎの実施例において、クローニング、制限酵素による切断、ＤＮＡ断片の単離 、フレノウ酵素およびデオキシリボヌクレオチドトリホスファート（ｄＸＴＰ） による修復、ライゲージコン、Ｅ、ｃｏｌｊの形質転換などの、用いられる分子 生物学の方法は、従来からのプロトコールに例示されており、ざらにＪ、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏ　ａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ、ｙ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（ １９８９）に記載されている。

実施例Ｉ　恒仁竺ヱＡ工乙鼠會ヱエヱエヱヱニ融へによる生 １、匹旦ゴａしムム乙鉦ムエニ三１１ ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するプラス ミド発現ベクターを構築し、モしてＥ、　ｃｏｌ　ｉを形質転換するのに用いた 。コーディング領域は、アミノ酸１２個のスペーサーおよびゲルゾリンのアミノ 酸１５０−１７３位をフードする、５′末端の１４０ｂｐの断片に融合したＣＤ ４（１８１）のＤＮＡ配列を含有する。これは、ＰＩＰ２結合ドメインを含む。

次のようにプラスミドを構築した。（図６を参照）最初に、ヒトゲルゾリンＰ　 ＩＦ２結合ドメインを含有するＤＮＡ配列を作製した。ＰＩＰ２結合ドメインは 、図１　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１）のアミノ酸＋１５０位から＋１６９位（ヌ クレオチド５４１−６００）を包含する。図１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）の ｃＤＮＡヒトゲルゾリンのコード配列を含有するプラスミドｐＭＩＤからこのＤ ＮＡ配列を作製した。　（プラスミ　ドｐＭＩＤは、Ｄａｖｉｄ　ＫＷｉａｔｋ ｏｖｓｋｉ、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏ１．Ｂｏｓｔｏｎ、 　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓの寄贈であった。）ポリメラーゼチェーン（ＰＣ Ｒ）反応を用いて、ＰＩＰ２結合ドメイン用にｃＤＮＡ配列を増幅した（　５１ Ｈｂｒｏｏｋら、１４章）。ＴｕＤＮＡポリメラーゼと、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼおよびＡＴＰによって予めリン酸化されたプライマーとを用いて、全て の増幅を行った。オリゴヌクレオチドＡＣＥ　１４４　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋ ３）をセンスプライマー（これはアンチセンスストランドに）＼イブリダイズす る）として、そしてＡＣＥ　１４５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）をアンチセン スプライマーとして用いた。（図５を参照）増幅された断片をフレノウ酵素およ びｄＸＴＰで補充した。このことによって、５°末端近くのＬＬＬ　Ｉ　１部位 および３′末端近くのＥｃｏＲ１部位を含有する、平滑末端化された１４０ｂｐ のＤＮＡ断片を作製した。この断片は、ゲルゾリンのアミノ酸＋１４３位から＋ １７３位をコードした（　５ＥＱＩＤＮＯ：１を参照）。

次に、中間生成物のプラスミドｐＮＮＯ３をＥｃｏＲＶで消化し、末端を脱リン 酸化して再環状化を防いだ。プラスミドｐＮＮＯ３は、ポリリンカー（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｆｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の組み込みによってｐＵｃ１３ から得られる。１４０ｂｐの断片をこのプラスミドにサブクローン化した。得ら れたプラスミドをｐＧｅｌｌと称した。

次に、ｐＧｅｌｌ由来のゲルゾリンＰＩＰ２結合ドメインをコードするＢａ１ｌ ｌ／ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片を、ＣＤ４　（１１１１）をコードし、ｐＥＸ５６ 由来のＤＮＡ配列を含有する原核生物の発現ベクターへ挿入した。

プラスミドｐＥＸ５６は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンをコードする ＤＮＡ挿入物の５′末端にフレームが合うように融合されたＣＤ４　（１８１） をフードする。この挿入は、５′および３′末端のＥｃｏＲ１部位が境界であっ て、ＣＤ４−エンドトキシン配列の連結部位に１１１部位を含有する。Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓエントド牛シン遺伝子は、リポソーム結合領域を除去するために 改変した。プラス！　ＦｐＥＸ５６ｔｔ、ｐＥＸ４６　（実施例■、項２および 図１　ａ　（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１３））の、オリゴヌクレオチドＴ４−ＡＩＤ 　Ｉ７６　（図５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）による部位特異的変異誘発によっ て作製した。［プラスミドは、本明細書に参考として援用されている、係属出願 のＰＣＴ特許ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４５ｇ４に記載されている。］ｐＥＸ５６の 最初のサンプルをＥｃｏＲＩおよびＬＬＬＩ＋で消化し、ＣＤ４（１８１）をコ ードする５１３ｂｐの断片を単離した。次に、ｐＥＸ５６の第２のサンプルをＥ ｃｏＲＩで消化し、断片を脱リン酸化して、ｐＥＸ５６ベクタ一部分を提示する ３９２２ｈｐの断片を単離した。３９２２ｂｐの陰ｏＲ断片、６１３ｂｐの社旦 Ｒ１／シュＩ＋断片、および１４０ｂｐの■Ｌ目／　ＥｃｏＲ１断片をいっしょ にライゲートした。このライゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１［Ａ ＴＣＣ３３８７５］を、標準のＣａＣｌ２法によって形質転換した。　（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、１．　８２章を参照）プラスミドルＣＤ４−ゲルゾリンおよびｐα ＣＤ４−ゲルゾリン（逆配置で、発現しない）を、ミニプラスミドＤＮＡｍ製物 の制限酵素消化物によって同定した。ｐＣＤ４−ゲルゾリンのプラスミドマツプ は、図８に示す。得られたＣＤ４−ゲルプリン融合ポリペプチドのＤＮＡ配列お よび推定されるアミノ酸配列は、図７　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　１０　）に示 す。ｐＣＤ４−ゲルゾリンの単離物は、インビトロ　インターナショナル（Ｉｎ 　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に寄託し、受託番号は、ＩＶＩ− １０２５３ｒある。

２、ＣＤ４−ゲルゾリンの発 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１およびＥ、ｃｏｌｉ　Ａｇ３　（ｈｔｐＲ−プロテア ーゼ欠損変異体）をｐＣＤ４−ゲルゾリンおよびｐαＣＤ４−ゲルゾリンで形質 転換した。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａｇ３　は、Ｅ、ｃｏｌｉ　５Ｇ９３６［ＡＴＣＣ３ ９６２４］のテトラサイクリン感受性変異体である。次に、ＣＤ４−ゲルゾリン 生産用の培養物を調べた。我々の結果は、ｐαＣＤ４−ゲルゾリンではなくて、 ｐＣＤ４−ゲルプリンが、ＣＤ４ゲルゾリンと推定される分子量のポリペプチド を生産したことを示した。

ＬＢ＋　１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で、５ｍｌを３０℃で一夜培 養する。−夜培養したものをＬＢ＋　１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンへ １＝１０の割合で希釈し、培養物が５５Ｏｒ＋ｍでの吸光度が１と１．５との間 になるまで増殖した。次に、４２℃で、等容量のＬＢ＋　１２．５μｇ／ｌａ　 ｌのテトラサイクリン中にその培養物を加えた。２時間後に細胞を回収して溶解 し、そして、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）に よってＣＤ４−ゲルゾリン融合分子と思われるサイズに相当するタンパク質のバ ンドを分析した。約２８ｋＤの分子量を宵するタンパク質を同定した。

実施例■、項２ｂのプロトコールを用いて、このタンパク質を単離した。

実施例■　アルデヒド−アミド結合を　してのゲルゾリン部　のＣＤ４への　・ １ ＣＤ４（３７５）　（Ｂｉｇｅｎ、Ｉｎｃ、、　Ｃａ＋ａｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａ ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓからの寄贈）を、ＣＤ４Ｍタンパク質の糖を酸化してア ルデヒドにし、ついでゲルゾリン部分のアミンにアルデヒドを反応させて、アル デヒド−アミン結合を形成することによって、ゲルゾリン部分に架橋結合した。

１、競■Ｈ■立豊化 １００μＭのＣＤ４（３７５）タンパク質を４℃で、ｐＨ５，０のＯ，１Ｍ酢酸 ナトリウムに透析した。ＩＩＩＩＭ過ヨウ素酸ナトリウム溶液で、２３℃で１時 間、調製物をインキュベートし、直ちに、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，０、 ｌｏｏｍＭ　ＮａＣ１で平衡化したＰ６ＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）で脱塩した。酸化されたＣＤ４（３７５） を、引き続きの使用のために４°Ｃで貯蔵するか、あるいは長期保存のために一 ７０℃で貯蔵した。酸化の度合をトリチウムで標識した水素化ホウ素の取り込み を測定することによってモニターした。典型的には、ＣＤ４（３７５）当り８− １０アルデヒドが生じた。

酸化がＣＤ４（３７５）の機能を妨害しないことを確かめるために、ＥＬＩＳＡ 形式で改変されたタンパク質のｇｐ１２０に結合する能力をアッセイした。ＩＭ ＭＵＬＯＮ　Ｉρプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　 Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　’／ｉｒｇｉｎｉａ）をｇｐ１２０　（Ｂｉｏｇｅｎ、 　Ｉｎｃ、、からの寄贈、およびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから商業的に入手可能）でコートし、ＣＤ４（３７ ５）あるいは酸化されたＣＤ４（３７５）を添加し、そして次に、ホースラディ ノシュパーオ牛シダーゼに結合された０ＫＴ４抗体（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ　Ｓｙｓｔａｍｓ、Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから入 手可能な）を用いて、リポータ−系との結合を測定した。可溶性ＣＤ４タンパク 質あるいは酸化されたＣＤ４のｇｐ１２０への結合には、相違がなかった。さら に、アミノ酸分析においては、個々のアミノ酸の酸化には明かな効果がないこと は、両者のサンプルに認ゲルゾリン部分ＧＥＬ　ｌを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａペプチド合成機を用いて合成した。ＧＥＬＩは、下記 のアミノ酸配列を有する。

Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ａ５ｎ −Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ− ｃＩｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（ＳＥＱより　ＮＯ：１４ ）最後の２０個のアミノ酸は、＋１５０位から＋１６９位のアミノ酸の、ゲルゾ リンのＰＩＰ２−結合配列を構成する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を参照）。ＧＥ Ｌ　１とＣＤ４（３７５）とを架橋するために、ＧＥＬＩの種々の濃度で、２３ ℃で一夜、５０＋ａＭ　ＭＥＳ、　ｐＨ６，５および５＋ｎＭ　シアツボＯハイ ドライドの存在下、１０μＭの酸化されたＣＤ４（３７５）　とインキュベート した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルの架橋結合を調べた。サンプルは、直接にク ーマシーブリリアントブルーによる染色によって、あるいはＥＬＬに対するウサ ギ抗血清を用いてのウェスタンプロットによって分析した。免疫原は、ゲルター ルアルデヒドでキーホールリンベットヘモシアニンに架橋したＧＥＬＩからなる 。

ＧＥＬＩ処理されたＣＤ４の分子量の増加がＧＥＬＩの濃度に依存的であり、タ ンパク質が改変されたことを示す。低濃度のペプチドでは、ＣＤ４（３７５）の 移動度にはほとんど影響がない。しかし、１ｍＭ　ＧＥＬＩとインキュベートし たときには、ＣＤ４（３７５）の約５０％が、ＣＤ４（３７５）当り１個のＣＥ ＬＬペプチドを含有する分子量に一致する、明かに増加した分子量の位置に移動 した。ＣＤ４（３７５）が１０＋ｍＭ　ＧＥＬＩとインキュベートされると、全 てのタンパク質は、高分子量の形態にシフトする。ＣＤ４（３７５）当り１つ、 ２つ、お上び３つのゲルゾリン部分に相当するらしい、一連のバンドを観察した 。架橋反応を行うために、ＣＤ４（３７５）に対して過剰モルのＧＥＬＩの必要 性は、アミノ基含宵の他の試薬による、過ヨウ素酸酸化ＣＤ４を改変するために 得られた結果に一致する。（実施例■を参照） ＧＥＬ　１がＣＤ４（３７５）に架橋したことを確認するために、選択された画 分を、ＧＥＬ　１に対する抗体を用いて、ウェスタンプロ。

ットによって分析した。目だった免疫反応のバンドが、架橋後のサンプルに観察 された。このバンドは、未処理のＣＤ４サンプルのウェスタンプロットには存在 しない。

３、ＣＤ４−ゲルゾリン　４ポリペプチドの架橋結合の化学が、ＣＤ４（３７５ ）のｇｐ１２０への結合する能力には影響を及ぼさないことは、上記で確かめた 。さらに、ＣＤ４（３７５）−ゲルプリン融合ポリペプチドはＰＩＰ２小胞に結 合することを確立した。

ＣＤ４（３７５）−ゲルゾリンのＰＩＦあるいはＰＩＰ２小胞に結合する能力を 、Ｊａｎｍｅｙら、−Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　Ｍｉｃｅｌｌｅｓ　 ａｎｄ　Ｐｏ１ｙｐｈ。

ｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ　Ｄｉ ｓｓｏｃｉａｔｅ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ−ａｃｔｉｎ　Ｃ ｏｍｐｌｅｘｅｓ　ａｎｄ　ＰｒｏＩＩｌｏｔｅ　Ａｃｔｉｎ　Ａｓ５ｅ＋ａｂ ｌｙＦｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｆａｓｔ−ｇｒｏｗｉｎｇ　Ｅｎｄ　ｏｒ　Ａｃｔｉｎ 　Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ　Ｇｅ１ｓｏｌｉｎ−、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２−６２．　ｐｐ、１２２２８−３６　（１９８ ７）に記載されているのと同様の凝集アッセイ法を用いてアッセイした。このア ッセイにおいて、用いられるタンパク質の量はＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプ チドの分子量を考慮して適切に調整する。Ｍｇ０は、純粋なポリホスホイノシチ ドのミセルを凝集して、より大きな小胞にし、溶液の懸濁度を増す。しかし、ゲ ルゾリンは、この凝集を阻害する。ＣＤ４（３７５）−ゲルゾリンは、このアッ セイではＧＥＬＩペプチドの様に挙動することがわかった。組換え５ＣＤ４のみ では、このアッセイでは活性を示さなかった。

ゲルゾリンペプチドの断片とスペーサーとの連結領域は天然ではないので、機能 を最適に用いるにはスペーサー領域の組成あるいは長さを変える必要がある。こ のことには、アミン末端あるいはカルボキシ末端のいずれかに他の配列を付加し て、ゲルゾリンペプチド断片を再合成することが含まれる。

カップリングの化学は影響されない。あるいは、結合配列から選択されたアミノ 酸を、Ｐ　ＩＦ５に対する融合ポリペプチドの親和性を変えるために、変えるの には都合がよい。

実施例■　チオール　を　してのＣＤ４加４の　′チオール基を介しての、ＣＤ ４ポリペプチドとゲルゾリン部分との架橋結合の　３つの方法を本明細書に記載 する。これらには、ＣＤ４タンパク質が、システィン、遊離のチオール、あるい はチオール反応基を含有するような改変を包含する。

１、ＣＤ４への　チオールの 最初に、システィン、シスタミンあるいはグルタチオンのようなチオール含有ア ミンを用いて、ＣＤ４へチオール基を導入し得る。アルデヒドはＣＤ４へ導入し 、次に、アルデヒド−アミン結合を形成する（実施例■を参照）。一旦、チオー ル含有ＣＤ４が生じると、選択的にゲルゾリン部分に架橋し得る。

過ヨウ素酸酸化ＣＤ４（３７５）　（０，５ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭ　ＭＥＳ、 　ｐＨ６゜５．５ＩＩＩＭナトリウムシアノボロハイドライド中、２３℃で一夜 、２０ＩＩＩＭのシスタミン、酸化システィンあるいは酸化グルタチオンのいず れかとインキュベートして、ＣＤ４（システィン）、ＣＤ４（シスタミン）、お よびＣＤ４　（グルタチオン）を作製した。

サンプルを４０ｍＭ　ＤＤＴで、２３℃で４０分間処理した。次に、保存バッフ ァー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０，１００ｍＭ　ＮａＣ１）に対して 透析した。エルマン試薬を用いて改変の程度をモニターした。要するに、サンプ ルを、１００ｍＭ　リン酸ナトリウムｐＨ８，０，０，５ｏＭ　ＤＴＮＢの１０ ０μ＋に加えて希釈し、５分後に４１０ｎｍでの吸光度を測定した。グルタチオ ンの減少に伴う標準曲線によってサンプルを計算した。シスタミン処理およびグ ルタチオン処理の両者は、ＣＤ４当り３から５基であった。引き続いての研究の ために、調製物をｃＥＮｒ＋ｕｃｏＮ−１４−過ユニット（Ａａ＋ｉｃ。

ｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、５ｍｇ／ｌ ｌに濃縮した。

これらの分子を、ＢＭＷ、　あるいは。−またはｐ−フェニレンジマレイミドの ような、２つのチオール反応基を有する同種２官能基架橋剤を用いて、チオール 基を介してゲルゾリン部分に結合し得る。この方法は、架橋させると考える。な ぜならば、これらの試薬でＣＤ４　（シスタミ）を処理するとＣＤ４の２量体お よび高分子量複合体が形成されるからである。はぼ化学量論的な量の架橋剤を用 いて、５０％を越えるＣＤ４の架橋をなし得る。

同様の方法が、システィン含有のゲルゾリン部分に用いられる。そこでは、シマ レイミド剤が架橋複合体を得るために用ド結合を介して架橋され得る。

（以下余白） ２０．、的“然・　人による ＣＤ４への　システィンの　人　。

第二に、遺伝子工学的手法を用いて、遊離のシスティンをＣＤ４の一次配列に導 入し得る。ゲルプリン部分への架橋は、本実施例の１項での方法を用いて行われ る。我々は、本明細書に、Ｃ末端にンステイン残基を含むように操作された、２ つのＣＤ４の先端切断型の構築および単離について記述する。

ａ、ＤＣ２１９の　およびＣＤ４１１１Ｃ３の発ＣＤ４（１１１Ｃｙｓ）を調製 するために、我々は、発現プラスミドｐＤＣ２１９を構築した（図９参照）。λ ＰＬプロモーターがＣＤ４（ｉｌｌ）の発現を制御するプラスミドである、Ｐ２ １８−８から出発した。

このプラスミドは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ３９１０１９４のｐ、　７７／９３、図 ２８に記載されている。ｐ２１１１−ＢのＤＮＡ配列は、図１ｏ　＜ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ＋１１）に示す。我々は、９２１８−８の第一のサンプルをＰｓｔｌお よびＢ　ＩＩＩで消化し、そして３６４５ｂｐのフラグメントを単離した。

上 次に、り２１８−８の第二のサンプルをＴ’ｓｔｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、 ２６９ｂｐのフラグメントを単離した。ｐ２１８−８の第三のサンプル；よ、Ｅ ｃｏＲＩおよびｂ上ＭＩで消化し、３９５ｂｐのフラグメントを単離した。

これらの消化した産物をアガロースゲル上で電気泳動することによって、フラグ メントを単離し、関係のある１＜ンドを切り出し、電気的にＤＮＡフラグメント を溶出した。この電気溶出したＤＮＡフラグメントをエタノールで沈澱させ、混 合物を遠心分離にかけ、ＤＮＡフラグメントを沈澱させた。次にこのフラグメン トをｌｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ａ＋Ｍ　ＮａｚＥＤＴＡ中 で再懸濁させた。

オリゴヌクレオチドＴ４ＡＩＤ−１３３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびＴ４ ＡＩＤ−１３４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）　（図５）を、バクテリオファージ Ｔ４のポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。これらのオリゴヌクレ オチドは、ＢＪＬＬＩ＋認識配列を有する。次に精製したＤＮＡフラグメントと このオリゴヌクレオチドとをライゲーションした。

この反応混合物を用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩを形質転換した。３０℃、１２ ．５μｇ　／　ｍ　１のテトラサイクリン中で生育したコロニーを選択し、そし て正しい配列であるかどうかを１１■で消化することによって分析した。この付 加的なＬｇＩ１１部位を有するプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析に供した。こ のようにしてｐＤｃ２１９を得た。

ＣＤ４　（１１ＬＣｙｓ　）を調製するために、Ａｌ１９細胞をｐＤｃＺ１９で 形質転換し、１０リツタースケールで発酵培養した。（発現レベル１３％を達成 した。）細胞ペレットを凍結させて、保存した。

ＣＤ４（１１１ｃｙｓ）を単離するために、５０ｇの凍結した全細胞を溶かし、 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．４μｇ／ｍｌリ ゾチーム中で懸濁し、そしてＰｏ１ｙｔｒｏｎ　（Ｂｒｉｎｋａ＋ａｎ　１ｎｓ ｔｒｕａ＋ｅｎｔｓ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　Ｎ、Ｙ、）とともに混合した。細 胞のスラリーを室温で１時間攪拌し、次にあらかじめ冷却しておいたＭａｎｔｏ ｎ　Ｇａｕｌｉｎフレンチプレス（５５０セツテイング）を３回パッシングさせ た。

溶解物をそれぞれのバ・１シングの合間に氷上で冷やした。粒子を５Ａ６００ロ ーターで１５分、１０．０ＯＯｒｐ＋１１で沈澱させ、この沈澱物を、２０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，ｏ中ｂ４で希釈し、洗浄して、そして前記と同様に沈澱さ せた。　（ここで述べる全ての割合は、バッファーの容積に対する全細胞の重量 である。）次にこの沈澱物を０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐ Ｈ９，０中１＝４で希釈し洗浄して、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎで再懸濁し、前述の条件 を用いて、沈澱を遠心分離させた。この最終沈澱物を、抽出用バッファー（７Ｍ 尿素、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ９．０．１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）中１： ４の希釈で抽出し、１５分間室温で攪拌した。抽出後の残骸を、５Ａ６ＧＯロー ターを用いて、１５．０ＯＯＧで３０分間の遠心分離によって除去した。

清澄な上清を新鮮な抽出用バッファーで、１：４の割合で希釈し、そしてあらか じめ抽出用バッファーで平衡化しておいたＦａｓｔ　Ｓカチオン交換カラム（フ ァルマシア）中を、全細胞Ｌ　ｇｌに対し４＋＋１の樹脂の割合で通過させた。

さらにカラムを抽出用バッファーでよく洗浄し、次に、カラムの１７２容積のそ れぞれ０．０５Ｍ、　０．０７５Ｍ、　０．１Ｍ５０．１５Ｍおよび０．２Ｍ　 ＮａＣ１を含有する抽出用バッファーの段階的塩濃度によって、タンパク質を溶 出した。　ＣＤ４（１１１Ｃｙｓ）は、ルーチンの手順では、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１の段階で溶出される。

ＣＤ４（１１１ｃｙｓ）のピークをプールし、そして２１１０ｎｍでＯ，Ｄ、０ ．５の吸光度になるように希釈した。次にこのサンプルを、外液を３Ｍ尿素、２ ０ｗＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５にし、１：１０００の体積比で、−晩透析した。

外液は１回交換した。この透析物を、２０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７゜５中の１ Ｍ尿素に希釈し、そして０．４５μの滅菌フィルターユニットで濾過した。１時 間４°Ｃで振とうさせしながら、このＣＤ４を濾液から６Ｃ６−セファロースに 結合させた。６Ｃ６は、Ｂｉｏｇｅｎで作成したモノクローナル抗体であり、Ｃ Ｄ４を認識し、ＣＤ４がｇｐ１２ｏに結合するのを阻害する。あるいは、Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｒ＋ｔａｉｎ　Ｖｉｅｖｔ、Ｃａ１ｉｆ ｏｒｎｉａから市販されている抗Ｌｅｕ−３ａモノクローナルを泪い得る。次に このスラリーをカラムの中に注ぎ、０．５カラム容積の５０１１ＩＩＭ　Ｔｒｉ ｓ　ｐＨ？、５．０．５Ｍ　ＮａＣ１で２回洗浄しく洗浄２）、そして０．５カ ラム容積の洗浄１のバ、、ファーで２回洗浄した（洗浄３）。ＣＤ４　（１１１ Ｃｙｓ）を、一連の５０ｍＭグリシン、　ｐＨ３，０，２５０ｍＭ　ＮａＣ１を ０．１カラム容積加えることによって、樹脂から溶出した。溶出した液を２Ｍ　 Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，ｏを加えて５０＋ａＭにすることによって、中和した。

その結果生じた、親和性によって精製したタンパク質は、９０％がＣＤ４（ｌｌ ｌｃｙｓ）のモノマーであって、多量体のバンドのコンタミを含む。還元条件下 で行うと、これらの付加的なバンドは、単量体になり、これらがジスルフィド型 のタンパク質であることが判った。１ｇｍ湿重量の細胞から０．５＋＊ｇと０． ７５＋＊ｇとの間の量のＣＤ４　（１１１Ｃｙｓ）を回収した。ｇｐ１２０結合 活性をアッセイし、全長のＣＤ４に見られる特異的活性の約半分であることが判 った。

操作して導入したシスティンの、マレイン酸イミドによる修飾に対する感受性を 試験するために、マレイン酸イミドブチリルビオシチン（ＭＢＢ＞を用いて、ビ オチン化実験を行った。

ビオチンを追跡するアビジン結合ＨＲＰを用いて、ウエスタンブロット法でビオ チン標識をモニターした。新鮮な試料を分析した場合には、ＣＤ４　（Ｉ　ＬＩ Ｃｙｓ）の特異的ビオチン標識が観察された。しかし、標識の効率は、試料が古 くなるために、時間が経つにつれ減少していった。

ｂ、λＰ　８０ｃｓの　およびＣＤ４１８０Ｃ３のＣＤ４　（ｔｇｏｃｙｓ）を 調製するために、発現プラスミドλＰＬ１８０ｃｙＳを構築した。このプラスミ ドでは、λＰＬプロモーターがＣＤ４（１８０ｃｙｓ）をコードするＤＮＡ配列 の発現を制御しているく図１１参照）。

まず、ＣＤ４（３７５）を発現する動物細胞発現ベクターである、プラスミドｐ ＢＧ３９１から始めた。　（このプラスミドのＤＮＡ配列は、図１２　（ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：１２）に示しである）。ｐＢＧ３９１を江ｕｌで切断した。鈴ユ １は、ＣＤ４遺伝子のアミノ酸１８２位に対するコドンを切断する。オリゴヌク レオチドＴ４ＡＩＤ−１３７（ＳＥＱ　ＩＤＮ０ニア）およびＴ４ＡＩＤ−１３ ８（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｖａ）　（図５）をリン酸化し、そして５ｔｕｌで切断 したｐＢＧ３９１にライゲーションして挿入し、ｐＢＧ３９８Ｃ２を作成した。

ｐＢＧ３９８Ｃ２は、８１１部位と丁４ＡＩＤ−１３７とのつなぎめに生じる石 旧部位の存在によって確認した。

次に、ｐＢＧ３９８Ｃ２を匡ＩおよびしＬＬＩＩで切断し、そして４９０ｂｐの フラグメントを単離した。ｐＥＸ４６をＳａｃ　ＩおよびＢａｎ旧で切断し、そ して大きい方のフラグメントを単離した。　（ｐＥＸ４６のＤＮＡ配列は、図１ ３　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１３）に示しである）。次に、この２つのフラグメ ントをライゲーションし、プラスミドλＰＬ１８０ｃｙｓを作成した。

１０！Ｉｄ−発酵培養では、ＣＤ４　（１８０ＣｙＳ）は、全細胞のタンパク質 の約５％の発現量であった。

発酵培養した細胞を、Ｉｇｍの湿重量の細胞当り、８ｇ＋１の２０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣＩ、ｌｄ　ＮａｚＥＤＴＡ、　ｐＨ７Ａ中で懸濁し、フレンチブＬ／スを ２回通して破砕し、そしてＩｇｍの湿重量の細胞当り２０重１の、１Ｍグアニジ ン−ＨＣｌ、１Ｍ尿素、１５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５で２回洗浄し、ついで 、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｌｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，７で２回 洗浄した。洗浄した沈澱物を、Ｉｇｍの湿重量細胞当り、２５ｍ１の６Ｍグアニ ジン−〇〇Ｉ、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１０ｉ＋Ｍ　ＤＴＴ、　ｐＨ７ ，７で、−晩室温にて抽出した。この懸濁液を５Ｓ−３４０−ターで、２０゜０ ００ｒｐａ＋にて４５分間遠心分離した。上清を冷Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　２０ｍＭ 、ｐＨ７、７に１＝６０の割合で希釈し、そして最終濃度がＯ，Ｓｍｇ／ｍｌに なるようにＢＳＡを加えた。

マイクログラム単位の量のタンパク質を作るため、この希釈した抽出物を、ＰＭ Ｉ　ｎメンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過によって濃縮し、ついで６ Ｃ６−セファロース４Ｂ上でアフィニティーにより精製した。あるいは、ＣＤ４ （１８０ＣｙＳ）は、以下のように調製され得る。上記のようにして得られた希 釈した抽出物のｐＨを塩酸で７．０に下げ、そして１％ｖｏｌ／ｖｏｌの割合で 、２０＋＋＋ＭＴｒｉｓ−ＢＣＩ、ｐＨ７，０で平衡化したＦａｓｔ　Ｓカラム にかけた。結合したタンパク質をカラムの５倍容量の平衡化バッファーで洗浄し 、そして０．２ＭのＮａＣ１を含む同じバッファーで溶出させた。溶出したプー ルを等量の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，７で希釈し、そして６Ｃ６− セファロース４Ｂカラムにかけた。結合したタンパク質を洗浄し、５０ｍＭグリ シン、２５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ３，０で、アフィニティーカラムから溶出し た。溶出画分を１７１５容量の０．５ＭＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５で中和し、Ａ２ ８．のプロフィールにしたがってプールし、４℃で保存した。

この実施例の１項でのべた化学物質を用いて、ＣＤ４　（１ｆｌＣｙｓ）あるい はＣＤ４　（１８０ｃｙｓ）を、チオールを含むゲルゾリン部分に結合させ得る 。

３、ヘテロ２−　性の架　剤 第３の方法によると、ＣＤ４はまたへテロ２官能性の架橋剤を用いて、システィ ンを含むゲルゾリン部分と架橋し得る。このような架橋剤には、スクシンイミジ ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボ亭シレート（ＳＭ ＣＣ）、国−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ ＭＢＳ）、あるいはＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオール）プロ プリオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）　（ＳＰＤＰ）力（含まれる。

これらの架橋剤のスクシンイミジルのアームは、ＣＤ４の一級アミンに結合する 。ＳＭＣＣおよびＭＢＳの反応性のチオール（マレイン酸イミド）および５ＰＤ Ｐの活性化されたチオールは、ゲルゾリン部分のシスティン由来のチオールと反 応し、共有結合を形成する。

ＳＭＣＣおよびＭＢＳとの反応を行うために、架橋剤をＣＤ４とともに０．５時 間ｐ［Ｉ６．ｏ、２３℃でインキュベートする。次に結合していない架橋剤を脱 塩用のカラムで除去した。５ＰＤＰは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏ、のユーザー マニュアルに記載されているように用いられる。次に遊離の末端のシスティンを 有するゲルゾリン部分が加えられる。混合物を２３°Ｃで３時間インキュベート し、共有結合を作成する。反応していないゲルゾリン部分は、脱塩用のカラムで 除去する。

修飾の程度および特異性は、実施例１１に記載のように分析され得る。ＣＤ４の リジン含有量は高く、従って、リシンとの反応は、あまり特異的には行われない 。しかし、加える架橋剤の量を制限することにより、特に反応性のある１つある いは少数のりシンへ架橋することが可能で有り得る。

あるいは、ヘテロ２官能性の架橋剤の反応性のチオール基を、ＣＤ４に導入され たチオール基に結合させ、そして次にスクシンイミジルアームを、ゲルゾリン部 分のアミンに結合させ得る。

１１匹ニー　ゲルゾリン融合 ＣＤ４ゲルゾリン融合ポリペプチドが、ｇｐ１２０に対する親和性を保持し、そ して、ゲルゾリン部分を介してＰＩＰ２小胞と結合することが判った。このこと によって、我々が多量体ゲルゾリン融合構築物を作成するために考えた化学理論 が正しいことが判る。次の段階として、我々は多量体のＣＤ４（３７５）−ゲル ゾリン融合構築物を作成し、そして試験した。

ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドを含む多量体ゲルゾリン融合構築物は、融 合ポリペプチドをＰＩＦ２小鉋に結合することを含む方法を用いて作成した。

ＰＩＦ２小胞は、次のように作成した。ＰＩＰ２は、凍結乾燥した固体として得 られ得る（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　 Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。この乾燥した試料に水を加えて、ｌｌ１ｇ／＋ａｌから３ ａ＋ｇ／ｍｌの濃度にし、この混合物を３０秒と２分との間にかけて、Ｈｅａｔ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ中で最大の強度で、視覚的に透明の溶液が作られるまで超音波 処理した。このシステムはＵｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、（Ｆａｒｍｉｎ ｇｄａｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）ｆ１８５’Ｅ’装置あるいはそれに等しい働 きをするものである。これらの試料を４°Ｃに保ち１週間以内に使用するか、あ るいは将来使用するために、凍結保存した。

保存のために試料を等量ずつに分け、液体窒素中で凍結させ、使用するまで一７ ０°Ｃで保存した。使用の前に、試料を暖かい水流下ですばやく溶かし、そして 水浴超音波処理器中で３０分間室温で超音波処理した。

次に、タンパク質に対する脂質の割合を５モルから１０モル過剰にし、ＣＤ４− ゲルゾリン融合ポリペプチドを脂質に加えた。この混合物を５分間室温でインキ ュベートした。

我々は、多量体のＣＤ４（３７５＞ゲルゾリン融合構築物のｇｐ１２０への結合 能をＥＬＩＳＡ型アッセイで、試験した。すなわち、プレートを［ｐ１２Ｇでコ ートし、融合構築物を加え、そして、抗ＣＤ４をレポーター抗体として用いて結 合の試験を行った。多量体のＣＤ４（３７５）−ゲルゾリン融合構築物のｇｌｌ １１２０への結合は見られなかった。

融合構築物の生物学的活性も、係属中の米国出願第０７１５８３．０２２号（こ こで参考として援用されている）に記載したのと同様のウィルス複製アッセイに よって、試験した。すなわち、この融合構築物を旧Ｖとともにインキュベートし 、Ｔ細胞株の細胞を加え、そして感染の発生率を測定した。多量体のＣＤ４　（ ３７５）−ゲルゾリン融合構築物は、このアッセイで感染を阻害しなかった。

結果として、このｒｓＣＤ４は、ＰＩＰ２小胞にそれ自体が結合し、結合の間は ｇｐ１２０への結合能は不活性化されることを見いだした。組換え５ＣＤ４は、 正電荷のポケットを有しており、このため、中性のｐＨで、カチオン交換マトリ ックスに高い結合活性で結合する。我々は、ＰＩＰ２小胞がカチオン交換マトリ ックスと同様に高い負の電荷を有しているため、ｒｓＣＤ４のＰＩＰ２小胞への 結合は、そのイオン特性によっていると考える。

従って、ＰＩＰ２小胞に結合しなくなるようにＣＤ４部分の電荷を変えることに よって、ｇｐ１２０に結合する多量体のＣＤ４−ゲルゾリン融合構築物を作成し 得る。ｒｓＣＤ４の始めの１１３個のアミノ酸は、ｇｐＬ２０結合ドメインを含 み、１６個の塩基性アミノ酸残基を含む。このうち１３個がりシン残基であり、 そして３個がアルギニン残基である。部位特異的突然変異導入法を用いて、これ らのうちの１個あるいはそれ以上を、塩基性ではあるが極性はより少ないアミノ 酸である、ヒスチジン、あるいは中性のアミノ酸に変え得る。これらの改変型Ｃ Ｄ４のなかから、ｇｌ）１２０に結合するがＰＩＰ２小胞には結合しない分子を 選択し得る。

我々は、これらの改変型ＣＤ４が、ｇｐ１２０結合能を有する多量体のＣＤ４− ゲルゾリン融合構築物を作成するのに有用であると考えている。

ｇｌ）１２０には結合しないが、多量体のＣＤ４（１８１）−ゲルゾリン融合構 築物には、他の用途がある。例えば、抗ＣＤ４抗体を誘導するための抗原として 有用である。診断用のアッセイでは、試料中の抗ＣＤ４の存在を検出するのに有 用である。ＨＩＶに感染した患者のある程度（Ａ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　’ｏ ｆ）が抗ＣＤ４抗体を有している。

中性のｐＨで正の電荷があること、および高い塩濃度があることは、タンパク質 では、あまりない。従って、本発明の多量体ゲルゾリン融合構築物を作成するの に用いられる場合、ＣＤ４以外の多くのタンパク質が不活性化を示すとは考えて いない。しかし、潜在的官能性部分のイオンの性質および脂質結合性は、これら を用いて作成される多量体ゲルゾリン融合構築物の最終的な生物学的活性および 性質を予想する際に考慮するべき要因である。

本発明の微生物および組換えＤＮＡ分子は、Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ、　ｉｎ　Ｌｉｎｔｈｉｃｕａ＋。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡに１９９０年５月４日に寄託され、以下のように番 号付されている培養物によって例証される。

ｐＣＤ４−ゲルシリア　１Ｖト１０２５３ｐ１７０．２　１ＶＩ−１０２５２ これまで本発明の実施態様を多数記載してきたが、我々の基本的な実施態様を改 変して本発明の方法および組成物を用いた他の実施態様を提供し得ることは、明 かである。従って、本発明の範囲が、前述の明細書中および添付の請求の範囲に よって定義される、全ての他の実施態様および改変型を含むことが理解される。

そして本発明は、本明細書に実施例として提供されている特定の実施態様に制限 されない。

（以下余白） 配列表 （１）全般的なインフォメーション （ｉ）　出願人：　ＰＥＰＩＮＳＫＹ、　Ｒ，ＢＬＡＫＥＲＯＳＡ、　ＭＡＲＧ ＡＲＥＴ　Ｄ。

５ＴＯＳＳＥＬ、　ＴＨＯＭＡＳ　Ｐ （ｉ　ｉ＞発明の名称：多量体ゲルプリン融合構築物（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数： １４ （ｉｖ）通信の住所： （Ａ）受信人：　ＦＩＳＦｌ　＆　ＮＢＡ’／Ｅ（Ｂ　）　５ＴＲＥＥＴ：　８ ７５　Ｔｈ１ｒｄ　Ａｖｅｎｕｅ（Ｃ）　ＣＩＴＹ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（Ｄ） 　５ＴＡＴＥ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（Ｅ　）　Ｃ０ＵＮＴＲＹ：　Ｕｎｉｔｅｄ 　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａ＋ｅｒｉｃａ（、Ｆ　）　ＺＩＰ：１００２２ （ｖ）　コンピューター判読の璽 （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ両立式％式％ （ｖ　ｉ）関連出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ）識別： （ｖｉｉ）優先出願データ （Ａ）出願番号：　ｔｌｓ　Ｏ，７１５２０，３６８（Ｂ）出願口：　１９９０ 年３月４日 （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ　）　ＡＴＴＯＲＮＥＹ／ＡＧＥＮＴ　インフォメーション（ Ａ）名前：　Ｉ（ａｌｅｙ　Ｊｒ、、　Ｊａｍｅｓ　Ｆ。

（Ｂ）登録番号：２７，７９４ （Ｃ）レファレンス／許可証番号：　Ｂ１４４ＣｒＰ（Ｌｘ）テレコミニニケー シ目ンインフオメーシ１ン（Ａ）電話：　（２１２）７１５−０６００（Ｂ）テ レファックス：　（２１２）−７１５−０６３４（Ｃ）テレックス：　１４−８ ３６７ （ｘｌ）配列ノ本別ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１人ＣＡＧＣＣＴＣＴＧ　へＣτ：Ｃ 入τＣＡＣｅ入＾Ｇ＾ＴＧＧＡＣτへＣＣＣＣ入＾ＧＣへＧ入Ｃτｃｘｃｃτ　 ＣＴＣＣＣ；τＣＣττ@ユ１４０ ＣＣ’ＴＣＡＧＧＧＣＧ　ＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧ　（ＪＣ ，τＣ，−ＣＡ　Ａｉｌ；ＡＡＣＴにＧＣＯＧＣ−ＡＣＣＣ`ＧＡＣ１２００ ０八ＧＡＣＡＧ八丁Ｇ　ＧＣＣ？ＧＧＧＣ？Ｔ　ＣＴＣｃ′ＴＡＣＣ′：’：　 ＴＣＣＡＣＣＣ１％？Ａ　＝ｃｃｃｃＡＡｃｃ＝　ＣＸａＡfＣＧＧＣＴＧ　１ ２６０ ｅｅ−、、ＣＧＡＣＣｅｃｃｃ（ＡＣＣＩ：’ｒ　ＧＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣＩＩ；　ＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡ　ＣＧＣＣＸ丁fＧ入Ｙ　ｌコ２゜ Ｇ入ＡＧＴＣ；ＴＧ　２５８１１ （ν人下色色） （ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２こ八ＧＣＴＣＣＡＧＡ　ｋｋｋｋ ＴＴＴＧＡＣＣＴＯＴＧＡＧＧＴＧ　ＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡ　ＣＣＴＣＣＣＣＴ ＡＪ　ＧＣ１’ＣＡＴＧＣsＧ　１０２０ ＾ＧＣＴＴＧ入Ａ＾ＣＴＧＧｋＧｋ）＋Ｃｋｋ　ＧＧＡＧＧ口入入λＧ　ＧＴＣ 丁ＣＧ入ＡＣ−ＣＧＧＧｋＧＡＡＧＧＣＧＯＴにＴＧＧＧＴf　１０８０ Ｃ？Ｇ入ＡＣＣＣＴＧ　Ａ（４ＣＯＧＣＧＡＴ　Ｃ％１．ＣＡＣＴＧ？　ＣＴＣ Ｃ？ＣＡＣＴＧ　ＡＣ？ＣＣＣＣＡＣＡ　ＧＯＴＣＣＴＧＣsＧ　１１４０ Ｇ入＾ＴＣＣ入＾ＣＡ　ＴＣ入入ＣＣ）ＴＣτ　ＧＣＣＣ八Ｃ入へＧＧ　ＴＣＧ ＡＣＣＣＣＣＧ　ＴＧＣ八ａへｅ入八τへｃｃｃｃｃ’ｒｃ■tフ　）２００ ＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧ　にＣＣＴＣ（、ｅｃｃ；ｔｌ；　ＣＣ？ＣＣＴＣＣ？” 　？ＴＣＡｍＧＧＧＣＴＡＣＣＣＡ？Ｃ？Ｔ　Ｃ？’ＴＣＴbＴＧＴＣ１２６０ ＡｃｃｉＧｃｅｃｃｃ　Ａｃ口ＧｋｋＧＧＣＧ　ＣＯ入ｋＧｃＪｈＧ＾に　ＣＧ ＱｋＴＧＴＣＴＣＡＧ八へＣλ＾Ｇ＾Ｇ　λＣ〒ｃｅｃｃ＾fτ　工３２０ ＧＡＧＡＡにＡＡＧＡ　ｃｃＴｃｅｃＡｃｔｃ　ＣＣｅ？ＣＡＣＣＧＣ：デ７Ｃ ＡＧＡＡＧＡ　ＣＡＴＣ：Ｔ＾ＧＣＣ’　ＣＡτＴ？Ｇ＾　H３フフ （し・Ｘ千余白ン （ｘ　ｆ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：八ＧＡＴＣＴＡＣＧＧ　ＧＧ ＧＣＧＴＧＧＣＡ　ＴＣ八へＧ八へ丁ＣＡ　ＡＧＣＡＣＧτ　３７（１ス゛陳幻 （ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：ＧｋｋＴτＣττＡＧ　ＧＣＪ ＊ＣＧＧ八ＣＣＡ　へＡＣＧＣＣＧ　２７（工大下＃色） （ｘｌ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡ　ＴＡＧ ＴＡＡＧＡＴＣ？７にＣＡ　２５〔工・人千湧ｂｂ） （ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：入Ｇ入τＣフτ入Ｃフ　入ＴＣ ＡＡに入　１７（ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア・入ＴＣＣＣＴＧ ＴＣＣＧＴ八へＡＡＧＣ？Ｔ　ＡＴＣＧＡ？　２６（２’）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：８のインフォメーション：（Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：（ｘｉ）配列の識別：ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：９：ＧＧＡＧＧ入ＣＣＡＧ　入入ＡＧＡＡＧＡＡＧ　ＴＴＣＡＧＣ τｃｃτ　ＧＧＴτフτＣＧＧＡ　ＴτＧ八Ｃへ　４６（工大王＃知） （ｘｌ）配列の識別＋ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋ＩＯ＋（ｘｉ）配列の識別ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＣＩＩＩＣＧＧＣＣ？口入ＴＯＡＧＣＣＣ−＋Ｓａ−７ＣＧＧＣＧＴＧ ＧＧ　ＴＸＴＧＧＴＣＧＣ）＋　ＧＧＣＣＣＣ；７ＧＧ　Ｃ０（ｒｃＧＧｃＡメ f：　ユｏ２０ Ｃ７７ＧＣ’ＧＣＣＣ口　ＡＴＣＴＣＩ：Ｔ’ＴＣＣＡＣＧＣｋＣＯλ’：”： 　Ｃ−−−ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣごＴＣＡ　ＡＣＣＣＣFτＣＡＡ　１０８ ０ ＱＣ？＾ｅ＝ＡｅＴｃ　ＧＧＣＴＧＣ？？ＣＣ？ＡＡＴＧＣＡＣＧＡ　Ｇ７ＣＧ ｅＸ：ｉ−ｊ＋ｃ　ＣＣＡＧＡＧＣＣ？ＣＧＴＣＣｏＡＴＧbＣ！１４０ Ｃτ）ＣλＣ，Ａ（、：Ｃτ丁Ｃ入ＡＣＣ：ｋＧ　ＴＣ）＋ＧＣＴＣＣ：：　Ｃ ＣＣＣ？ＧＣＣ：ＣＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡ　Ｃ？Ｘ？ＣＧＴbＣＣユ２００ ＣＧＣＡＣ？’：入＝ｈｃフＣτ−−−ＣＴ　−−ＸＴＣＡ７ＧＣＡ　ＡＣＴＣ Ｇ？ＡＧＣＡ　ＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧ　ＣＡＧＣＣＣＴＣＴf　−２６０ ｅＣ丁：λττフフ：　ＧＧｃｃｋＧＧ＾ＣＣＧＣ＝τ丁ＣＧＣＴＣにＡＧＣＣ ＣｊＡＣＣＡＴＣＪＬＴＣＧＧＣｅ　ＴＣ丁ＣＧ；τテＧＣPコ２゜ 入＾ＣＣＣＧＣ；７ｋｋ　ＧｋＣＡＣＧＡ　Ｃ−−ＡＴＣＧＣＣＡＣ？Ｇ　ＧＣ ＡＧＣＡＧＣＣｋ　Ｃ７ＣＣ；？ＡＡＣＡＧ　ＧＡ？ＴＡＧbＡＧＡ　２７６０ ＧＣＧλＱ８″：λＴＣフ入ＧＧＣＧＧ丁Ｃご　：λＣＡＣＡＣ，−Ｃ：ｉｃ入 ＾ｃ−、：：−、ＧＱＣＣ’：）Ｊ（ＣＴλ　ＣＧＧＣ？ＡbＡＣ？　２ε２゜ ＡＧ入λ１１４λＣ＾Ｃ）λ−−−ＣＣＴＡ？　Ｃ’：ＧＣＧＣ”’、Ｃ：Ｇ　 ＣＴＣＡＡＣｅＣＡＧ　−、：ＡＣＣ？’：ＣＣＧ　入入入■OＧＡｌｌ；？？ 　２＋１８０ ０ＣＴｋＧσＴＣＴτ　Ｇ入’！’Ｃ（ｇｃ＾＾　＾α入入１ｕＣＣＡＣ：　Ｇ ＣＴＷＴＡＣＱｌｉ　Ｃ？ＧＣｒフフフフ　〒Ｃ？？？ＣＣ`ＡＣ２９４０ ＧこλＴＯ入入人体ｃ　入７）人体λ？ＣＣ？　Ｔ入？入＾ＣＧＣＣＣＣＡＴ’ ｒＧＣ？’ｒＡＣ人体入＾＾：τＣ’：Ｃ人体ＡＣ；？ＴｋfｃＣコ４８０ Ｔに？ＴＣＴＣＡＣＣτ人体ＱＣ？τＡＧＡ　ＡＣＣ？？ＴＡＣＣ％　入ＡＣＣ ？ＣＡＴＣＣｃｃＡにＡ（：ＡＴｅＣＣＴ入入ＧＣＡＣ）Ｊ{　３６６０ Ｃニ入入入入入λａｃｅ＾ＧＴＧ入７丁口τ　ＧＣ入τ丁Ｃフ′ＧＧ：　＝ｃｘ ｃｃ７７Ｃｘ　Ａ（、Ｃ？入＾７７Ｃ；　０ＴａｘｃｃｃＣOｃ　３７２０ こ入ＡＣＡ（ＪＣＴＩ’　Ｃ入＾ＧＣＣ入ｋＧｃ　？？？ｃＣ’ｒｃｘＣＣｃ入 入ｔ：、、入ｘ７　ＴＣＴＣＣ：：：ＡＣＣ：：（−ｋＧＯ汲fＧ　３７Ｂ。

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国際調査報告 　０ｆ　２ Ａｌｌ）ＩＥＸ　Ｍ３ Ｐ（＝「＾Ｑ＋Ｉｃｍ＋’＋ｔ’ｆＧｕｌｄ＊−シａｌＩ＃ｚ−ａｒ−１ｅＩＩ −１．Ｂ１４４ＣＩＰ

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲルゾリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分 子であって、ポリペプチド部分をコードする第一のＤＮＡ配列およびゲルゾリン 部分を含む第二のＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
2. ２．前記ゲルゾリン部分が、ヒト血漿ゲルゾリン由来である、請求項１に記載の 組換えＤＮＡ分子。
3. ３．前記ゲルゾリン部分が、図１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）の＋１位から＋１ ６９位までのアミノ酸を含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. ４．前記ゲルゾリン部分が、図１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）の＋１５０位から ＋１６９位までのアミノ酸を含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. ５．請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記ポリペプチド部分が、ウ イルスのレセプター、細胞のレセプター、細胞のリガンド、細菌の免疫原、寄生 虫の免疫原、ウイルスの免疫原、免疫グロブリンあるいは標的分子に結合するそ のフラグメント、酵素、酵素のインヒピター、酵素の基質、サイトカイン、成長 因子、コロニー刺激因子、ホルモンおよび毒素、でなる群から選択される、組換 えＤＮＡ分子。
6. ６．前記ポリペプチド部分が、可溶性のＣＤ４タンパク質である、請求項５に記 載の組換えＤＮＡ分子。
7. ７．請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記可溶性のＣＤ４タンパク 質が、ＣＤ４（１１１）、ＣＤ４（１１１Ｃｙｓ）、ＣＤ４（１８０ｃｙｓ）、 ＣＤ４（１８１）、ＣＤ４（１８３）、ＣＤ４（１８７）、ＣＤ４（３４５）、 およびＣＤ４（３７５）、でなる群から選択される、組換えＤＮＡ分子。
8. ８．ｐＣＤ４−ゲルゾリンである、請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子。
9. ９．請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記ポリペプチド部分が、Ｉ ＣＡＭ１、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂ、ＬＦＡ３、ＣＤＸ、および ＶＬＡ４、でなる群から選択される、細胞のレセプターあるいは細胞のリガンド である、組換えＤＮＡ分子。
10. １０．前記ゲルゾリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、発現制御配 列に作動可能に結合している、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
11. １１．請求項１０に記載の組み換えＤＮＡ分子であって、前記発現制御配列が、 ＳＶ４０あるいはアデノウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーター、 ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣあるいはＴＲＣシステム、λファージ の主要オペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御 領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、あるいは他の解糖系の酵素、酸性ホス ファターゼのプロモーター、酵母のα接合因子のプロモーター、バキユロウイル スシステムの多角体プロモーターおよび原核細胞あるいは真核細胞あるいはその ウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の配列、およびそ れらの様々な組み合せ、でなる群から選択される、組換えＤＮＡ分子。
12. １２．脂質結合タンパク質融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換 えＤＮＡ分子であって、ポリペプチド部分をコードする第一のＤＮＡ配列および 脂質結合タンパク質部分をコードする第二のＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分 子。
13. １３．請求項１２に記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記脂質結合タンパク質 部分が、プロテインキナーゼＣ、リポコルテン、セベリン（ｓｅｖｅｒｉｎ）、 ピリン、フラグミン、プロフィリン、コフィン、Ｃａｐ４２（ａ）、ｇＣａｐ３ ９、Ｃａｐ２、ゲストリンおよびＤＮａｓｅ　Ｉ、でなる群から選択される、組 換えＤＮＡ分子。
14. １４．請求項１あるいは１２に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した単細胞宿 主。
15. １５．請求項１４に記載の単細胞宿主であって、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、例えば酵母のような 真菌類、例えばＣＨＯおよびマウス細胞のような動物細胞、例えばＣＯＳ−１、 ＣＯＳ−７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＨＴ１０のようなアフリカミドリ ザルの細胞、昆虫の細胞、および組織培養中のヒト細胞および植物細胞でなる群 から選択される、単細胞宿主。
16. １６．前記宿主が、ＣＯＳ−７細胞あるいはＣＨＯ細胞である、請求項１５に記 載の単細胞宿主。
17. １７．機能性の部分および脂質結合タンパク質部分を含む、脂質結合タンパク質 融合ポリペプチド。
18. １８．前記脂質結合タンパク質が、ピリン、セベリン、フラグミン、プロフィリ ン、コフィン（ｃｏｆｉｎ）、Ｃａｐ４２（ａ）、ｇＣａｐ３９、Ｃａｐ２およ びゲストリン、でなる群から選択される、請求項１７に記載の脂質結合タンパク 質融合タンパク質。
19. １９．前記脂質結合タンパク質が、タンパク質キナーゼＣ，リポコルテンおよび ＤＮａｓｅ　Ｉ、でなる群から選択される、請求項１７に記載の脂質結合タンパ ク質融合ポリペプチド。
20. ２０．機能性の部分およびゲルゾリン部分を含む、ゲルゾリン融合ポリペプチド 。
21. ２１．前記機能性の部分が、ポリペプチド部分である、請求項２０に記載のゲル ゾリン融合ポリペプチド。
22. ２２．請求項２０に記載のゲルゾリン融合ポリペプチドであって、 前記機能性の部分が、ウイルスのレセプター、細胞のレセプター、細胞のリガン ド、細菌の免疫原、寄生虫の免疫原、ウイルスの免疫原、免疫グロブリンあるい は標的分子に結合するそのフラグメント、酵素、酵素のインヒピター、酵素の基 質、サイトカイン、成長因子、コロニー刺激因子、ホルモンおよび毒素、でなる 群から選択される、ゲルゾリン融合ポリペプチド。
23. ２３．前記機能性の部分が、可溶性のＣＤ４タンパク質である、請求項２２に記 載のゲルゾリン融合ポリペプチド。
24. ２４．請求項２３に記載のゲルゾリン融合ポリペプチドであって、前記可溶性の ＣＤ４タンパク質が、ＣＤ４（１１１）、ＣＤ４（１１１ｃｙｓ）ＣＤ４（１８ ０ｃｙｓ）ＣＤ４（１８１）、ＣＤ４（１８３）、ＣＤ４（１８７）、ＣＤ４（ ３４５）、ＣＤ４（３７５）、ＣＤ４（シスタミン）、ＣＤ４（システイン）お よびＣＤ４（グルタチオン）、でなる群から選択される、ゲルゾリン融合ポリペ プチド。
25. ２５．前記機能性の部分が、ＩＣＡＭ１，ＥＬＡＭ１，ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ ｂ、ＬＦＡ３、ＣＤＸおよびＶＬＡ４、でなる群から選択される、細胞のレセプ ターあるいは細胞のリガンドである、請求項２２に記載のゲルゾリン融合ポリペ プチド。
26. ２６．前記ポリペプチド部分のＣ末端が、前記ゲルゾリン部分のＮ末端に融合さ れている、請求項２１に記載のゲルゾリン融合ポリペプチド。
27. ２７．前記ポリペプチド部分が、ゲルゾリン部分に化学的に結合している、請求 項２１に記載のゲルゾリン融合ポリペプチド。
28. ２８．前記ポリペプチド部分が、アルデヒドーアミン結合を介して、前記ゲルゾ リン部分と化学的に結合している、請求項２７に記載のゲルゾリン融合ポリペプ チド。
29. ２９．前記ポリペプチド部分が、チオール基を介して、前記ゲルゾリン部分と化 学的に結合している、請求項２７に記載のゲルゾリン融合ポリペプチド。
30. ３０．前記ポリペプチド部分が、アミノ末端あるいはカルボキシ末端のシステイ ンを含む、請求項２７に記載のゲルゾリン融合ポリペプチド。
31. ３１．前記機能性の部分が、毒素、抗レトロウイルス剤、酵素の基質、および酵 素のインヒピター、でなる群から選択される、請求項２０に記載のゲルゾリン融 合ポリペプチド。
32. ３２．前記機能性の部分が、ＡＺＴである、請求項３１に記載のゲルゾリン融合 ポリペプチド。
33. ３３．請求項２０に記載のゲルゾリン融合ポリペプチドであって、酵素、放射性 核種、蛍光マーカー、および化学ルミネセンスマーカー、でなる群から選択され る、レポーターーグループを含む、ゲルゾリン融合ポリペプチド。
34. ３４．ゲルゾリン融合ポリペプチドおよびポリホスホイノシチドを含む小胞を含 むゲルゾリン融合構築物であって、多量体あるいはヘテロ多量体である、ゲルゾ リン融合構築物。
35. ３５．前記ポリホスホイノシチドがＰＩＰあるいはＰＩＰ２である、請求項３４ に記載のゲルゾリン融合構築物。
36. ３６．前記構築物が、ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドを含む、請求項３５ に記載のゲルゾリン融合構築物。
37. ３７．前記ＣＤ４−ゲルゾリン融合ポリペプチドが、ＣＤ４（１８１）−ゲルゾ リン融合ポリペプチドである、請求項３６に記載のゲルゾリン融合構築物。
38. ３８．請求項３４に記載のゲルゾリン融合構築物であって、ＥＬＡＭ１−ゲルゾ リン融合ポリペプチド、ＶＣＡＭ１−ゲルゾリン融合ポリペプチド、ＶＣＡＭ１ ｂ−ゲルゾリン融合ポリペプチド、ＩＣＡＭ１−ゲルゾリン融合ポリペプチド、 ＣＤＸ−ゲルゾリン融合ポリペプチド、ＶＬＡ４−ゲルゾリン融合ポリペプチド およびＬＦＡ３−ゲルゾリン融合ポリペプチド、でなる群から選択される、ゲル ゾリン融合構築物。
39. ３９．請求項３４に記載のヘテロ多量体ゲルゾリン融合構築物であって、 ウイルスのレセプター、細胞のレセプター、および細胞のリガンド、でなる群か ら選択される第一の機能性の部分；および 毒素および抗レトロウイルス剤、でなる群から選択される第二の機能性の部分； を含む、ゲルゾリン融合構築物。
40. ４０．前記構築物が、認識分子およびレポーターグループを含む、請求項３４に 記載のヘテロ多量体ゲルゾリン融合構築物。
41. ４１．前記構築物が、少なくとも２つの免疫原を含む、請求項３４に記載のヘテ ロ多量体ゲルゾリン融合構築物。
42. ４２．前記構築物が、主にＰＩＰあるいはＰＩＰ２からなる小胞を含む、請求項 ３４に記載のゲルゾリン融合構築物。
43. ４３．前記小胞が、ＰＣ、ＰＥ、およびＰＳ、でなる群から選択される脂質を含 む、請求項３４に記載のゲルゾリン融合構築物。
44. ４４．前記構築物が、混合した脂質の小胞を含む、請求項３４に記載のゲルゾリ ン融合構薬物。
45. ４５．前記小胞が、界面活性剤を含む、請求項３４に記載のゲルゾリン融合構築 物。
46. ４６．前記小胞が、生物活性を有する物質を含有する、請求項３４に記載のゲル ゾリン融合構築物。
47. ４７．脂質結合タンパク質融合構築物であって、脂質結合タンパク質融合ポリペ プチドおよび該脂質結合タンパク質融合ポリペプチドに結合し得る脂質を含む小 胞を含み、多量体あるいはヘテロ多量体である、構築物。
48. ４８．請求項４７に記載の脂質結合タンパク質融合構築物であって、前記脂質結 合タンパク質が、ピリン、セベリン、フラグミン、プロフィリン、コフィン、Ｃ ａｐ４２（ａ）、ｇＣａｐ３９、Ｃａｐ２、およびゲストリン、でなる群から選 択される、構築物。
49. ４９．前記脂質結合タンパク質が、プロテインキナーゼＣ，リポコルチンあるい はＤＮａｓｅＩである、請求項４７に記載の脂質結合タンパク質融合構築物。
50. ５０．多量体あるいはヘテロ多量体ゲルゾリン融合ポリペプチドを製造する方法 であって、 ゲルゾリン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、発現制御配列に作動可 能に連結させて有する組換えＤＮＡ分子で、単細胞宿主を形質転換する工程 を包含する、方法。
51. ５１．ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、ＨＩＷ感染あるいはＨＩＶに対する抗体を有する被験 体を処置する方法であって、 該被験体に治療上有効な量の多量体あるいはヘテロ多量体のＣＤ４−ゲルゾリン 融合構築物を投与する工程を包含する、方法。
52. ５２．前記融合構築物が、毒素あるいは抗レトロウイルス剤を含む、請求項５１ に記載の方法。
53. ５３．試料中の標的分子の存在を確認する方法であって、該試料を請求項４０に 記載のヘテロ多量体ゲルゾリン融合構築物と接触させる工程 を包含する、方法。
54. ５４．インビボで標的分子の存在を確認する方法であって、被験体に、請求項４ ０に記載のヘテロ多量体のゲルゾリン融合構築物の有効な量を投与する工程 を包含する、方法。