JPH01502669A - 精製された血小板由来の成長因子及びその精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２６、＾ＴＣＣＮｏ、６７３５２で寄託された請求項２５に記載の細胞。 ２７、０．４μｇ／１０’細胞７２４時を上回る量でｒＰＤＧＦ　Ｂを産生する ことを特徴どするＣＩ’ＩＯ細胞系。 ２８、　ｒＰＤＧＦ　Ｂ遺伝子を含むＣＯＯ細胞系がらｒＰＤｃＦ　Ｂポリペプ チドを発現させることを特徴とするｒＰＤｃＦ　Ｂの産生方法。 ２９、非グリコジル化ｒＰＤＧＦ　Ｂ。 明細書 本発明は一般的に、高度に精製された組換え血小板由来成長因子（ｒＰＤＧＦ） 及びかかる物質の産生方法に係る。より特定的には本発明は、モノクローナル抗 体を使用したｒＰＤＧＦのアフィニティクロマトグラフィー精製、及びかがるモ ノクローナル抗体、及び粗ｒＰＤＧＦを十分な有用量で産生する方法に係る。 Ｒｏｓｓ等はＰｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７１：１２０ ７〜１２１０（１９７４）において、全血血清中で検出されるが血小板欠乏血清 中では検出されない因子として血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を開示している 。かかる因子は培養線維芽細胞の成長を助ける。 非還元ＲＤＧＦは分子量２７〜３５ｋｄのタンパクである。いくつかの分離ゲル で観察されるバンド数の違いは、グリコシレージョンの違い、精製中のプロテア ーゼ作用、または１種類以上の分子種の存在に起因する。　ＰＤＧＦの還元によ って、１０〜１８ｋｄの範囲の分子量をもつ２つ以上の小さいゲルバンドが生じ る。この分野の最も好ましいモデルによれば、分子量２７〜３５ｋｄをもつ天然 種が、分子量約１８ｋｄ及び１６ｋｄをもつ異なる２つの小さいサブユニットか ら成る。これらは夫々「＾」サブユニット及びｒＢ、サブユニット（またはＰＤ ＧＦ　Ａｊｉ［またはＰＤＧＦ　ＢＭ）と推移される。Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ等、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２Ｌ：２５７〜７６（１９８３）及びＮａｔｅｒｆｉｅｌｄ 等、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：２８１０〜１４（１９８３）は、ＰＤにＦの２つの サブユニットの部分的アミノ酸配列を開示し、ＰＤ（：Ｆ　ＢＭのアミノ酸配列 が、腫瘍性サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）に含まれた腫瘍遺伝子であるｖ−ｓｉｓ の予想タンパク産物と９０％以上相同であることを指摘した。＾鎖はＢ鎖にほぼ ６０％相同であることが知見された。 サル肉腫ウィルスをウーリーモンキーの線維芽肉腫がら単離した。このウィルス は細胞の腫瘍性形質転換を生起し、いくつかの動物で肉腫を発症させる。完全ｓ ｓｖゲノムがクローニング及び配列決定されており、腫瘍遺伝子領域（ｖ−ｓｉ ｓ）が同定され、これが分子量２８〜３３ｋｄの融合タンパクを有効にコードし 得ることが知見されている。この配列に基くペプチドに対する抗血清は、ｓｓｖ 感染細胞から２８ｋｄのタンパクを免疫沈降させた。このタンパクをｐ２８ｓｉ ｓと命名した（Ｒｏｇｇｉｎｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０５：６Ｇ５〜６０８（１ ９８３））、ｖ−ｓｉｓをプローブとして使用し、ｃ−ｘｉｓに対応する染色体 クローンをヒト肝臓ライブラリィがら単離した。　Ｃａ１ｌｏ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：３１（１９８１）及びＪｏｓｅｐｈ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２１９：５０ ３〜５０５（１９８３）及び＾ａｒｏａｓｏｎ等、虹■３７：１２３（１９８３ ））、更に、ｖ−ｓｉｓをプローブとして、多数のヒト腫瘍細胞系をｅ−ｓｉｓ 　ＲＮ八へ現に基づいてスクリーニングした。　に１１１０等、Ｎａｔｕｒｅ　 ２９５：１１６〜１１９（１９８２））、また、高い割合の開光組織由来の腫瘍 が、４．２ｋｂのｅ−ｓｉｓ　ＲＮ＾転写物を含むことを知見した。 Ｇａ１ｌｏ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３：４８７〜４９０（１９８４））は、ｖ −ｓｉｓに相同のヒト肝１１ｅ−ｓｉｓ染色体遺伝子の６つのエキソン全部の配 列を開示した。この開示されたＤＮＡ配列はＰＤ（：Ｆ　Ｂｇの既知のアミノ末 端配列とほぼ等しいタンパク産物を予想させた。 更に、このＤＮＡ配列は、タンパク配列決定によって推定されていなかったＰＤ にＦ　ＢＭのアミノ酸配列の残りを予想させた。 またＪｏｓｅｐｈ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６３６〜６３９（１９８４）は 、ＨＵＴ１０２腫瘍細胞に由来の２．７ｋｂのｅＤＮ＾ＤＮＡンを開示した。こ のクローンは、４．２ｋｂ　ＲＮＡの完全クローンではないが、活性ＰＤ（：Ｆ 　ＢＭをコードするために必要な配列をすべて含むと考えられる。　ＳＶ４０初 期プロモータの下流でベクターに挿入すると、このベクターによる３Ｔ３細胞の 形質転換が可能であった。 ＰＤ（：Ｆ及びその類似体は、外来遺伝子を含むベクターで形質転換された原核 細胞及び真核細胞の双方で発現した。 Ｈｕｒｒａｙ等、欧州特許出願第１７７．９５７号、Ｈａｎｎｉｃｋ等、Ｍｏｌ 。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ　、　６：１３０４〜１３１４（１９８６）、ｌ１ａｎｎｉ ｅｋ等、Ｈｏ１．Ｃｅ１ｌ。 Ｂｉｏｌ、　６：１３４：（−１３４８（１９８６）、Ｋｉｎｇ等、Ｐｒｏｃ、 Ｉｎｔ”　Ｉ＾ｅａｄ。 ムｊ工ｑ互υ−８２：　５２９５〜５２９９　（１９８５）　、Ｋ　ｅ　ｌ　ｌ 　ｙ等、ＥＭＢＯＪ、　Ｌ：３３９９〜３４０５（１９８５）、Ｊｏｓｅｐｂｓ 等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６３６（１９８４）、Ｃ１ａｒｋｅ等、Ｎａｔｕ ｒｅ　３０８：４６４（１９８４）、Ｇａｚｉｔ等、Ｃｅ１ｌ　３９：８９〜９ ７（１９８４）、　Ｈａｎｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ−、２５９：１０６４５〜 １０６４８（１９８４）。 しかしながらこれらの参考文献のいずれにおいても、培地中で５０ｎｙ／ｉ＋ｆ を上回る活性ＰＤＧＦの発現は開示されていない。 血小板ＰＤにＦの精製手順は、例えばＴｌｅｌｄｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１９ ：５１１（１９８６）、＾ｎｔｏｎｉａｄｅｓ、米国特許第４４７９８９６号及 びＲａ１ｎｅｓ等、１」上ｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　１０９ニア４９（１９８ ５）、Ｄｅｎｕｅｌ等（１９８１）、Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２５６：８８ ９６〜９９、　＾ｎｔｏｎｉａｄｅｓ（１９８１）、　Ｐｒｏｅ　。 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾７８ニア３１４〜１７に記載されているが 、これらの手順は***誘発活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ） のＰＤ（：Ｆ＾ホモダイマーまたはＰＤにＦ　Ｂホモダイマーを分離することが できない。 本発明は、ｒＰＤｃＦ　Ｂの構造的コンホーメーションの十分な部分をもち、Ｐ Ｄ（：Ｆ　Ｂｇのエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結合するエピトー プをもち、天然ＰＤＧＦの生物学的特性を１つ以上有し、還元５ＯＳ−ＰＡにＥ によって測定すると９５％を上回る純度をもつことを特徴とする精製及び単離さ れたポリペプチドを提供する０本文中でｒｒＰＤＧＦ　ＢＪなる用語は、特に注 釈がない限り、組換えＰＤにＦ　ＢＨの生物学的に活性のホモダイマーを意味す る０本発明のポリペプチドは好ましくは、自律的に複製するＤＮＡプラスミドま たはウィルスベクターに担持された外来ＤＮＡ配列の原核細胞または真核細胞中 の発現産物である。特に、ポリペプチドは、第１図に示すｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓ ｉｓまたはその任意の天然変種の構造的コンホーメーションを有するか、あるい は第２図に示すｒＰＤＧＦ　Ｂｃ−ｓｉｓまたはその任意の天然変種の構造的コ ンホーメーションを有する。 本発明は更に、ＰＤＧＦ　Ｂ鎖中で検出されるエピトープに特異的に結合するア フィニテイをもつ一群のモノクローナル抗体に係る。 本発明は更に、本発明のポリペプチドの精製方法を提供する。該方法は、ｒＰＤ ＧＦ　Ｂ中に検出されるエピトープに特異的に結合し得るアフィニテイをもつ基 質結合モノクローナル抗体を、ｒＰＤ（：Ｆ　Ｂ中で検出されるエピトープを少 なくとも１つ有するポリペプチドを含む溶液と接触させ、基質結合モノクローナ ル抗体からポリペプチドを溶出する段階を含む。 本発明はまた、有意量のｒＰＤＧＦ　Ｂを発現させる方法を提供する。該方法は 、適当なベクター中のｒＰＤＧＦ　Ｂ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ ＩＯ）細胞に導入し、遺伝子増幅を誘発して多量（＞０．４μｇ７１０″細胞７ ２４時；５日目の培地中の濃度〉１μｙ／ｙ１）の粗ｒＰＤ（：Ｆ　Ｂを産生さ せ、後述の手順で精製処理する段階を含む０本発明はまた、かかる発現系で有用 な細胞系に係る。 本発明はまた、本発明のポリペプチドを有効量で投与する創傷治癒の促進方法に 係る。 ’　ｎｉｏｗ＊ｒｑａ 第１図はｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓの一次アミノ酸配列、第２図はｒＰＤｃＦ　 Ｂｃ−ｓｉｓの一次アミノ酸配列、第３図はｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓクローン Ｕ２−ＯＳ５６．１の概略図、第４図はｒＰＤにＦ　Ｂをコードする第３図のク ローンに由来のエキソン２〜６の完全配列、 第５図はプラスミドｐＤｓＶＥの概略図、第６図はプラスミドｐＤｓＶＥ／ｅ− ｓｉｓの概略図、第７図はプラスミドｐＤｓＶＥ／ｖ−ｓｉｓの概略図、第８図 は推定ｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓ前駆体のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配 列、 第９図はプラスミドｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓの概略図、第１Ｏ図はｃｖ−ｓｉ ｓ遺伝子の予想初期翻訳産物のアミノ酸配列、 第１１図はＣＧＨ／ＰＤＣＦ融合タンパクＣにアンのアミノ酸配列、第１２図は 本発明のモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳ＾アッセイの結果を示すグラフ 、及び 第１３図はウサギ耳の打抜き標本の概略図である。 １ｒ１１ 本発明方法によって、活性ｒＰＤＧＦ　Ｈの構造的コンホーメーションの少なく とも一部を有する単離精製ポリペプチドが得られた０本発明のポリペプチドは、 ｒＰＤｃＦ　Ｂの一部のみまたは全部を含み、その他のＰＤＧＦ関連分子、即ち ＰＤＧＦ　Ａ鎖、　ＰＤＧＦ＾ホモダイマー及びＰＤｔｌ：Ｆ＾、Ｂヘテロダイ マーを実質的に含まない０本発明の精製ポリペプチドは、ｒＰＤｃＦ　Ｂ中で検 出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結合するエピトープを含む ことを特徴とし、５ＯＳ−ＰＡＧＥで定量すると９５％を上回る純度をもつ。 本発明ポリペプチドの精製方法は、ｒＰＤＧＦ　Ｂ中で検出されるエピトープに 特異的なモノクローナル抗体を結合させたクロマトグラフカラムに粗ポリペプチ ド含有溶液を通し、結合したｒＰＤＧＦ　Ｂをカラムから溶出する段階を含む。 本文中で使用される「生物学的に活性のｒＰＤｃＦ　ＢＪまたは「活性ｒＰＤＧ Ｆ　ＢＪなる用語は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ***誘発アッセイにおいて活性のｒＰＤ ＧＦ　Ｂを意味する。 本発明方法で有用なモノクローナル抗体の代表例は、１９８７年３月１８日に＾ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０ １　Ｆａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎ ｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、９３６６で寄託されたハイプリドーマ によって発現されたモノクローナル抗体［３０］、１９８７年３月１３日に＾− ｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａ＠ｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ％Ｍａｒｙｌａｎｄ　２ ０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、ＩＩＢ９３５７で寄託されたハイブリドーマ によって発現されたモノクローナル抗体［１３３］、１９８７年３月１３日に＾ ｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０ １　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ 　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、ｌ］Ｂ９３５４で寄託されたハイブリド ーマによって発現されたモノクローナル抗体［１５５］、１９８７年３月１８日 に＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２ ３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌ ａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＨｏ、９３７２で寄託されたバイプリド ーマによって発現されたモノクローナル抗体［２３２］、１９８７年３月１３日 に＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１ ２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌ ａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、ＢＢ９３６１で寄託されたハイブ リドーマによって発現されたモノクローナル抗体［５２］、１９８７年３月１８ 日に＾−ｅｒｉｃａｎ丁ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３ ０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ 　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、９３６８で寄託されたハイブリドーマに よって発現されたモノクローナル抗体［１９１３，１９８７年３月１３日に＾ｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ％Ｍａｒｙｌａｎｄ　 ２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、ＢＢ９３５５で寄託されたハイブリドーマ によって発現されたモノクローナル抗体［２０］、１９８７年３月１８日に＾− ｅｒｉｃｉｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅｔｉｏｎ−１２３０１ ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２ ０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ。 ９３６７で寄託されたハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体［ １１６］、１９８７年３月１８日にＡ＋＊ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ％　Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ。 Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、９３６９で寄託された バイプリドーマによって発現されたモノクローナル抗体［１９Ｂ］、１９８７年 ３月１３日に＾−ｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ％Ｍａ ｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号ＡＴＣＣＮｏ、ＢＢ９３５６で寄託された ハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体［１６２］、１９８７年 ３月１８日に＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ、１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ％Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａ ｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ。 ９３７０で寄託されたハイブリドーマによって発現されたモノクローナｌし抗体 ［２９８］、１９８７年３月１８日に＾−ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ。 Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、９３７１で寄託されな ハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体［２１９］である。 使用されるクロマトグラフシステムに適した特定カラム及び特定処理条件は当業 者に明らがであろう、好ましくは抗体アフィニティ力ラムを使用する０本発明の ポリペプチドの溶出に使用される溶媒も当業者に明らかであろう、好ましくは弱 酸例えば酢酸を使用する。また好ましくは、温度約４℃で精製処理を行なう。 本文中で使用される「構造的コンホーメーション」なる用語は、ｒＰＤｃＦ　Ｂ のアミノ酸配列の全部または一部を含む***誘発活性ポリペプチドの構造を意味 する。 本発明のポリペプチドの産生に有用な発現系は、細胞培養系、好ましくはＣＯＯ 細胞である０本文中の発現系以外に別の発現系を本発明で使用することも可能で あり、例えば。 プロテアーゼ開裂部位の変性、本発明のポリペプチドの宿主細胞からの分泌レベ ルを高める別のリーグ配列の使用等が考えられる。 本発明はまた、１９８７年３月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ％　 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、Ｃ ＲＬ９３５９で寄託されたｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓを産生するＣｌｌ０細胞系 及び１９８７年３月１３日に＾５ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ％Ｒｏｃｋ− ｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ ９３５８で寄託されたｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓを産生するＣＩＯ細胞系のごと きｒＰＤＧＦ　Ｂを産生する細胞系を提供する。 本発明はまた、ｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓ／ｖ−ｓｉｓ及びｒＰＤ（：Ｆ　Ｂｖ −ｓｉｓ／ニワトリ成長ホルモン（ｃｃｎ）２合ポリペプチド、これらをコード するＤＮＡセグメント及びかかるＤＮＡセグメントを含む形質転換ベクターを提 供する０本発明は特に、１９８７年３月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐｉｒｋ−Ｉａｗｎ　Ｄ ｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ％Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番号＾ ＴＣＣＮｏ　、ＣＲＬ９３６０で寄託されたｃｖ−ｓｉｓ細胞系及び＾ＴＣＣＮ ｏ、６７３５２として大腸菌ＡＭ７中で寄託されたＣＧＨベクターを提供する。 本発明のクローンｒＰＤＧＦ　Ｂ遺伝子の原核細胞または真核細胞発現によって 産生された生物学的に活性のｒＰＤＧＦ　Ｂは医者及び／または獣医によって補 乳顕のｉｎ　ｖｉν０治療に使用され得る。活性成分の量は勿論、治療される病 気の容態、選択される投与経路及びｒＰＤｃＦ　Ｂの特異的活性に基づいて、担 当医または獣医が決定する。＋１乳動物で治療反応を生じるように決定されたｒ ＰＤＧＦ　Ｂの量を、ｒＰＤＧＦ　Ｂ治療有効」量と推移する。かかる治療有効 量は当業者によって容易に決定できる。 ｒＰＤｃＦ　Ｂは治療すべき病気に適した任意の経路で投与され得る。好ましく は、ｒＰＤにＦ　Ｂを創傷に局所適用する０本発明のｒＰＤＧＦ　Ｂの局所適用 組成物は当業者が容易に製造できる。治療される病気次第で好ましい投与経路が 異なることも当業者には容易に理解されよう。 ｒＰＤｃＦ　Ｂは純粋または実質的に純粋な化合物として投与されてもよいが、 この化合物を含む調剤または製剤の形態で投与されるのが好ましい。 ヒト及びを椎動物に使用される本発明の製剤は、前記に定義の治療有効量のｒＰ ＤｃＦ　Ｂを１種想以上の薬剤上許容される担体及び任意に別の治療成分と共に 含有する。（１種類以上の）「許容される」担体なる用語は、製剤のその他の成 分と適合性であり且つ製剤の賦形剤に有害でない担体を意味する。好ましくは製 剤が酸化剤または還元剤を含有しない、製剤はまた、ペプチドとの不適合性が判 明しているその他の物質を含有しない、製剤が単位剤形として調製されるのが好 ましく、この調製のために当業界で公知の任意の方法を使用し得る。すべての調 製方法が、１種類以上の付加成分を含む担体と活性成分とを会合させる段階を含 む。 一般的な製剤調製方法では、液体担体または微粉固体担体またはその双方と活性 成分とを均−且つ均質に会合させ、必要に応じて所望の剤形に成形する。 非経口投与に適した製剤は、活性成分の無菌水溶液を好ましくは被投与体の血液 と等張の溶液と共に含む、かかる製剤の好ましい調製方法では、固体活性成分を 水に溶解して水溶液を形成し、密封アンプルまたはバイアルのごとき単位用量ま たは複数用量の容器に充填して該溶液を滅菌する０局所適用に適した製剤は治療 有効量のｒＰＤＧＦを薬剤上許容される局所アジュバントと共に含む。 本発明を更に十分に理解するために本発明を実施例に基づいて以下に説明する０ 本発明の範囲は請求の範囲の記載によって限定され、本発明の範囲内で実施例に 記載の手順の変更が可能であることは理解されよう、温度はすべて、補正しない ℃で示す０ミクロンまたはマイクロの記号はｒμ」で示し、例えばマイクロリッ トル、マイクロモル等はμｌ、μｌ等で示す。 本発明で使用したｖ−ｓｉｓ遺伝子は、サル肉腫ウィルスのレトロウィルスゲノ ムのクローンたるプラスミドｐｃ６０（Ｉｌｏｎｇ−Ｓｔａａｌ等、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２１３：２２ｆ５−８（１９８１））に由来した（Ｒ。 Ｃａ１ｌｏ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ 、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ、）。 ヌクレオチド３５０５の’ＪｕＩ部位（Ｄｅｖａｒｅ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０ニア３１〜５（１９８３）の番号系を使用）とヌクレオチ ド４８１７のＸｂａ　１部位との間の領域にわたるｐｃ６０の制限フラグメント を、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングした。５μりのｐｃ ６０　ＤＮＡを’ＪＡＩ及び砂土■で消化し、１３１２塩基対のフラグメントを Ｎａｏｉａｔｉｓ等の手順（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、１９８２）に従って低融点アガロースゲル中で電気泳動分離後、 ゲルから抽出することによって精製した。 また１μｉのＭ１３ｍｐ１８　ＤＮＡを石Ｉ及びＸｂａ　ｌで消化し、フェノー ル／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。　３０ｎｇのｖ−ｓｉｓ　Ｋｉ ！ＬＩから独１１までのフラグメントと５０ｎ３の石Ｉ及びＸｂｔで切断したＨ １３ｍｐ１８　ＤＮＡフラグメントとをＴ４　ＤＮＡリガーゼで２０μ！中で１ ４℃で１６時間結合した。結合したＤＮＡを使用し、５−ブロモ、４−クロロ、 ３−インドール−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ｘ−ｇａｌ）及びイソプロピルβ −Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴｆ；）の存在下に大腸菌に１２株ＪＭ１０ ３（Ｍｅｓｓｉｎｇ等、Ｈｕｅｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９（１９８ １）＞を形質転換した。透明なプラークを選択し、液体培地中で増殖させた。複 数のファージから単離されたＤＮＡをジブオキチェーンターミネーション法によ って配列決定し、クローンフラグメントの同一性を確認した。これらのファージ クローンの１つを８１３鋤ｐ１８／ｖ−ｓｉｓ（Ｋｐｎ−Ｘｂａ）と命名した。 １（ｂ）　ｃ−１１： Ｕ２−ＯＳ５６．１と命名されヒトＰＤＧＦ　Ｂｇをコードするｃ−ｓｉｓ遺伝 子は、３０．４ｋｂのヒトＤＮＡを含み、ヒト骨肉腫細胞系［２−ＯＳ（＾ＴＣ ＣＮｏ、ＢＴＢ９６）に由来のＤＮＡによって構築されたライブラリィから単離 された。このライブラリィは、コスミドベクターｐＴＬ５（Ｌｕｎｄ等−Ｐｒｏ ｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ　２９：５２０〜５２４（１９８２ ））を使用し、　Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ等、Ｃｅ１ｌ　２８：４８９〜４９Ｂ（１ ９８２）に記載の手順で作成された。　Ｄｅｖａｒｅ等、Ｊ、ｖｉｒｏｌ、　４ ２：１１０８（１９８２）から得られたサル肉腫ウィルスのクローンから１（ａ ）の手順を用いてサブクローニングしたｖ−ｓｉｓプローブによってライブラリ ィをスクリーニングした。 クローンｔ１２−ＯＳ５６．１の地図を第３図に示す、第３図の矩形の部分は、 エキソン配列（Ｊｏｓｅｐｈｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：４８７（１９８４ ）及びＧａｚｉｔ等、Ｃｅ１ｌ　３９：８９（１９８４））を示す、エキソン２ 〜７はｖ−ｓｉｓに相同であり、非相同領域との接合部がエキソンの境界を示す 、エキソン１は、この遺伝子（Ｇａｚｉｔ等、Ｃｅ１ｌ　３９：８９（１９８４ ）から転写されたＲＮＡの翻訳開始に必要であるかにみえるが、最終処理された タンパク（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等、Ｅｍｂｏ　Ｊ、　３：９２１（１９８４））中 に存在するペプチド配列をコードしない。 エキソン２〜６を含む制限フラグメントをバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８に サブクローニングし、Ｓａｎｇｅｔ等、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。 ＾ｅａｄ、ｓｃｉ、（ＩＳＡ　７４：５４６３（１９７〕）の手順に従ってジデ オキシチェーンターミネーション法によって配列決定した。成熟ｒＰＤＧＦＢタ ンパク（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等、Ｅｍｂｏ　Ｊ、　ｉ：９２１（１９８４））をコ ードする全領域を含むこれらのエキソン配列は、ヒト胎児肝臓染色体ライブラリ ィから単離されたｃ−ｓｉｓ遺伝子としてこれまでに発表された配列と正確に同 じであった（Ｊｏｓｅｐｈｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：４８７（１９８４） ）、エキソン２〜６の完全配列を第４図に示す。 え４匠１ ｒＰＤＧＦ　Ｂ　む　ベクターの ２（ａ）　ＩＳｌへ１呈上 チャイニーズハムスター卵巣ＤＨＦＲ−細胞中のｒＰＤｃＦ　Ｂ遺伝子の発現に 選択されたベクターをｐＤＳＶＥと命名した。このベクターは、４つのベーシッ クＤＮＡ配列エレメントを使用して構築された。これらのエレメントの１つは、 細菌細胞中での選択及び自律複製に必要なりＮＡ配列を提供した。これらの特徴 は、複製起点、及び、プラスミドｐＢＲ３２２のヌクレオチド２４４８から４３ ６２　（標準番号系）にわたる領域のアンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ配列によっ て与えられる。　ｐＢＲ３２２誘導ｐｓＶＯ８（Ｄｒ、Ｒ，Ｔｊｉａｎ、Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に由来のこ の１９１８塩基対のＤＮＡフラグメントを構造的に変性するために、ヌクレオチ ド２４４８の直後に配列５゛−＾＾ＧＣＴＴＧ−３′ をもつＨｉｎｄｌｌリンカ−を付加した。 第２のエレメントは、哺乳類及びその他のを椎動物細胞−□　中で機能するウィ ルスプロモーターを構成するＤＮＡ配列を提供した。サルウィルス４０（ＳＶ４ ０）初期プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを作成するために、ＳＶ４０　 ＤＮＡをまず制限エンドヌクレアーゼ酵素Ｐｖｕ　１１で消化し、異なるサイズ の３つのＰｖｕ　ＩＩ　／Ｐｖｕ　ＩＩｌフラグメント作成した。これらのフラ グメントの１つは、左回りの「初期遺伝子」プロモーターをコードする配列（５ １７１位のＢｉｎｄｌｌｌから２７０位のＰｖｕ　Ｉｆまで）とＳＶ４０ウィル スの複製起点とを含んでいた。３つのフラグメントの各々の５°末端及び３°末 端にＥｅｏＲ■リンカーを付加し、異なるサイズの３つのＥｅｏＲＩ　／Ｅｃｏ Ｒｌフラグメントを作成した。これらのフラグメントをＨｉｎｄＩ［［で消化し 、得られた３４０ｂｐのＢｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲｌフラグメントをポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で単離した。 第３のエレメントは、ベクターに挿入された遺伝子の転写終了シグナルを提供し た。初期ＳＶ４０遺伝子のターミネータ−配列を含むＤＮＡフラグメントを得る ために、まず完全ＳＶ４０ゲノムを制限エンドヌクレアーゼ”ｆｌＩで消化し、 次に５ａｌＩリンカ−を付着させるプラント末端を陸土１認識部位に変換した０ 次にこの非結合む工１　／Ｓａ上１　ＳＶ４０配列をＥｃｏＲｌで消化し、２０ ３０ｂｐのＳａｌ　Ｉ　／ＥｃｏＲＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動に よって単離した。 ｐＤＳＶＥに含まれる第４のエレメントは、ベクターを含む哺乳類細胞の選択手 段を提供した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は、チミジン及び ヒポキサンチンの欠失した培地中で細胞を増殖させまたある程度のレベルの薬剤 メトトレキセートを含む培地中で細胞を増殖させ得る酵素をコードする。この遺 伝子は、Ｇａ５５ｅｒ等、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。 むｊ工匹盈υ−υ−：６５２２〜６５２Ｂ（１９８２）に記載の手順でプラスミ ドｐＭＧ−１から単離されたＥｃｏＲｌ及びＨｉｎｄｌｌ制限エンドヌクレアー ゼ付着末端をもつ約２．５００ｂｐのマウスＤＩＩＦＲミニ遺伝子を含んでいた 。 これらのエレメントを含む４つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮ＾リガーゼで結 合し、ベクターｐＤＳＶＥを産生じた。第５図はこのベクターの概略図である。 ２（ｂ）　ＤＳＶＥ　ｃ−ｓｉｓの　：Ｎｌト３Ｔ３細胞の形質転換に必要な配 列全部を含むｃ−ｓｉｓコスミドクローンＵ２−ＯＳ５６．１の領域を、プラス ミドｐＤＳＶＬｄ（Ｌｉｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｅｉ、ＵｓＡ 　８２ニア５８０（１９８５））のむ土１部位にサブクローニングした。この領 域は、第３図のＵ２−ＯＳ５６．１地図の３．９ｋｂ及び２６．８５ｋｂのＥｃ ｏＲ１部位にわたる領域である。 ｃ−ｓｉｓフラグメントをｐＤＳＶＬｄにクローニングする前に、ｃ−ｓｉｓフ ラグメントの旺ｏＲＩ末端をむ土■末端に変換した。 ３μｉのコスミドＵ２−ＯＳ５６．１　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで制限し、フェノー ル／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。Ｎａｎ１ａｔｉｓ等、ＩＬ、に 記載の手順を用い、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントと ４つのデオキシヌクレオシド三リン酸全部とを含む１５μ！中で単鎖領域を埋め 戻すことによって、二重鎖ＤＮＡのフラグメント末端を形成した０反応混合物を ７０℃で５分間加熱することによって反応を終了させた。制限エンドヌクレアー ビジ１工■の認識部位を含む合成りＮＡリンカ−を、１μｇのキナーゼ化リンカ −とＴ４　ＤＮ＾Ｎｉ−ゼとを含む２１μＩの反応中で平滑末端をもつｅ−ｓｉ ｓフラグメントに付加した。１４℃で１晩インキユベートし、フェノール／クロ ロホルム抽出とエタノール沈殿とを行なって、リンカ−で結合したＤＮＡを２６ 単位の５ａｌ（と共に１００μｌの反応中で３時間制限した。制限したＤＮＡを エタノール沈殿させ、少量のバッファに溶解し、１％の低融点アガロースゲルで 電気泳動にかけた。ゲルから２３ｋｂのバンドを切り出し、Ｍａｎｉａｔｉｓ等 、【雌、に記載の手順で精製した。　Ｔ４　ＤＮ＾Ｎｉ−ゼを含む２０μｌの反 応中で２３ｋｂのバンドとガ土■で直線化したｐｏｓｖｔｄＤＮ＾とを結合した 。結合したＩＩＮ八で大腸菌に１２株Ｄｏｌｌ　（＾ＴＣＣ１３３８４９）を形 質転換した。　Ｎｉｎ１ａｔｉｓ等、【雌、に記載の手順を用い、！！ｐ−標識 ｖ−ｓｉｓプローブとのハイブリダイゼーションによってアンピシリン耐性コロ ニーをスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンを選択し、クローンか らプラスミドＤＮＡを調製した。５ｉｌｌで制限することによってこのクローン ｐＤＳＶＬｄ／ｃ−ｓｉｓからインサートを切除することが可能であった。制限 地図の作成によって、このクローンが、予想された２３ｋｂのｅ−ｓｉｓ　ＤＮ Ａフラグメントを含むことを確認した。 意外にも、ｐＤＳＶＬｄ／ｅ−ｓｉｓはＮＩＢ−３Ｔ３細胞を容易に形質転換し なかった。　ｐＤＳＶＬｄ／ｅ−ｓｉｓはまた、ＣＯ５−１細胞またはチャイニ ーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）細胞に導入後に、検出可能レベルのＦＤＣＦ活性 をもつ産物を産生じなかった。　Ｃａｚｉｔ等（前出）によって構築された関連 プラスミドはＮｌト３Ｔ３細胞を形質転換し得ることが判明した。　ｐＤｓＶＬ ｄ／ｃ−ｓｉｓが推定エキジン１領域とエキジン２領域との間にＧａｚｉｔ等の 構築において存在しなかった６、７ｋｂのＤＮＡ領域を含むので、この領域があ る種の哺乳類細胞型においてｅ−ｓｉｓの発現を阻害する配列を含むという可能 性が推測される。従って新しい呻乳顕ｅ−ｓｉｓ発現ベクターを構築した。この ベクターにおいてはｃ−ｓｉｓ地図の５．２ｋｂ及び１１．９ｋｂのＨｉｎｄｌ １部位間の６．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを欠失させた。この新しいベクター の構築には、前項２（ａ）で記載した哺乳類発現ベクターｐＤＳＶＥを使用した 。　ｐＤＳＶＥは、ＣＢＯ細胞中の挿入遺伝子を通常はｐＤｓＶＬｄよりも高い 発現レベルで発現させることが知見された。１μｓのｐＤＳＶＥを５ａｌｌで制 限し、フェノール／クロロホルム抽出しエタノール沈殿し後述する結合で使用し た。 ｃ−ｓｉｓの推定エキジン１領域を含むフラグメントを作成スルタメニ、３μｇ ｔ７）　ｐＤＳＶＬｄ／ｅ−ｓｉｓをＢａｗｌ　ｌ及び１リエＩによって制限し た。０．７％低融点アガロースゲル電気泳動でＤＮＡフラグメントを分離した。 第３図のｃ−ｓｉｓ地図の４．６ｋｂのＢａｍＨ１部位と５．８５ｋｂの石１部 位との間の領域を示す１．２５ｋｂのフラグメントをゲルから切り出し、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ等、１此、に記載の方法で抽出した。７５Ｂのこのフラグメントを、 ２０μｌの反応中で、ＫＬ！ＬＩ及びム見ＩＩＩで予め制限しておいた７５Ｂの ８１３霞ｐｌＢ　ＤＮＡにＴ４　ＤＮＡリガーゼで結合した。結合したＤＮＡで 大腸菌に１２株ＪＭ１０３を前記のごとく形質転換した。複数の透明プラークを 選択し、液体培養で増殖させた。複製型分子（ＲＦ）の二重鎖ＤＮＡを感染細胞 から単離し、Ｂａｗｌ　Ｉ　、　ＬＬＬ　Ｉ及びＨｉａｄ　Ｉ［［を用いた制限 地図作成によって観察した。正しいパターンを示す１つのクローンを選択し、こ れを使用してｃ−ｓｉｓｌＱ　＠フラグメントを単離した。 ４μｇのＭ１３ｍｐ１８／ｃ−ｓｉｓ（Ｂｉｇ−Ｋｐ’ｎ）ＲＦ　ＤＮＡをガ土 ■及びＵ二１ｎｄ−■で制限した。鉤±１制限の結果、ｃ−ｓｉｓ（Ｂａｇ−Ｋ ｐｎ）フラグメントが挿入されたＢｉｍＨ１部位から１３塩基対を隔てる８１３ Ｂ１８のポリリンカー領域の部位で切断が生じた。　Ｂｉｎｄ［［制限の結果、 ８１３ｗ＋ｐ１ＢのＢｉｎｄｍ部位で切断が生じた０重要なことは、Ｌη■で制 限した結果、第３図のＵＺ−０５５６，１地図のｃ−ｓｉｓ（Ｂａｓｉ−Ｋｐｎ ）フラグメント内部の５．２ｋｂに対応する位置でＢｉｎｄｌｆ１部位が切断さ れることである。従って、この手順の効果は、第３図の０２−０５５６．１の地 区の３．９ｋｂのＢａｍＨ■部位の近傍に５ｉｌｌ部位が付加されることである 。１．０％低融点アガロースゲルで電気泳動にかけ抽出することによって反応混 合物から０．６ｋｂのガ土１−Ｈｉｎｄｉ［フラグメントを単離した。このフラ グメントを以後エキラン１フラグメントと推移する。 適当な制限部位付着末端をもつｃ−ｓｉｓエキソン２〜７を含むＤＮＡフラグメ ントを得るために、４μ２のｐＤｓＶＬｄ／ｃ−ｓｉｓをＢｉｎｄＮ及びガ±１ で制限した。制御！ＤＮＡを０．７％低融点ゲルの電気泳動にかけ、第３図の０ ２−ＯＳ５６．１地図の１１．９ｋｂと２６．８５ｋｂとの間の領域を示す１４ ．７５ｋｂのフラグメントを単離した。 最終２０μｌ中の結合において、５０ｎｇのむ土Ｉ制限ｐＤＳＶＥを５ｎｇのエ キソン１のフラグメント及び８０ｎｆＩのエキソン２〜７のフラグメントと混合 した。　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に１４℃で１晩反応させ、この反応混合 物を用いて大腸菌に１２株Ｄ）１１を形質転換した。アンピシリン耐性コロニー から２つのレプリカフィルターを作成した。１つのフィルターは、エキソン２〜 ７の存在を検出するためにｖ−ｓｉｓプローブにハイブリダイズさせ、もう１つ のフィルターはｃ−ｓｉｓ　ＤＮＡクローン（Ｊｏｓｅｐｈｓ等、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２５：６３６（１９８４））の上流領域に含まれる配列に相補的な合成オ リゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。このオリゴヌクレオチドは、前記エ キジン１フラグメントにハイブリダイズすることが予め判明していた。双方のプ ローブにハイブリダイズしたクローンを選択し増殖させてプラスミドを単離した 。制限分析の結果、ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓｉｓと命名されたこのプラスミドが第６ 図に示すような配置のエレメントを含むことが判明した。 ２（ｃ）　ＤＳＶＥ　ｖ−ｓｉｓの　：サル肉腫ウィルスによって使用される翻 訳開始シグナルを利用するｖ−ｓｉｓ遺伝子を含む哺乳類の発現ベクターを構築 するために、ｖ−ｓｉｓ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとその上流の１７８ｂ ｐのＳＳＶ　ＤＮＡとをｐＤｓＩＥに挿入した。このベクターの転写によって得 られた初期翻訳産物は、ＳＳｖエンベロープ糖タンパクとｒＰＤｃＦ　Ｂｖ−ｓ ｉｔとの融合産物である（Ｒｏｂ−ｂｉｎｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０５：６０５ （１９８３））、融合産物のアミノ末端部分を処理すると、ＳＳＶエンベロー１ タンパク配列が欠失した成熟ｒＰＤにＦ　Ｂタンパクが産生ずる。実施例１に記 載の２μｅのＲＦ型分子のＭ１３ｍｐ１８／ｖ−ｓｉｓ（Ｋｐｎ−Ｘｂａ）のサ ブクローンを５ｉｌｌで制限した。この結果、ｓｓｙの３６３３位（Ｄｅｖａｒ ｅ等、ｉＬＬ、の番号系）のむ土！部位と１４１３論ｐ１Ｂのポリリンカーの５ μ１１部位との間の領域にわたる１１９１塩基対のフラグメントが遊離した。後 者の部位は、ｖ−ｓｉｓ遺伝子が挿入されたＸｂａ　１部位からフ塩基対を隔て る。このフラグメントを０．７％低融点アガロースゲル電気泳動にかけ、バンド を切り出し、抽出することによって精製した。２Ｏｔｔｌ中１４℃で１６時間の 反応で３５ｎｆのフラグメントと５０ｎｙの５ａｌｌ切断ｐＤｓＶＥＤＮ＾とを Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで結合した０反応産物で大腸菌に１２株ＤＨＩを形質転換 した。　ＮｔｎｉｉＬｉｓ等、旺、に記載の手順で’　”　Ｐ　Ｉｆ　識ｖ　− ｓ　ｉ　ｓプローブとのハイブリダイゼーションを行なうことによってアンピシ リン耐性コロニーをスクリーニングした。ハイブリダイズした複数のクローンを 選択し、液体培養で増殖させ、標準法でプラスミドを単離した。制限酵素Ｂｉｎ ｄｌ［［、Ｘｂ見■及びＰｓｔｌでプラスミドの地図を作成し、ｐｔｌｓＶＥ中 のＳＶ４０早期プロモーターによって転写される正しい配向のインサートを含む クローンを同定した。ががるクローンの１つをｐＤｓＶＥ／ｖ−ｓｉｓと命名し 、以後の実施例で使用した。このクローンの構造を第７図に示す。 ２（ｄ）　ＤＳＶＥ　ｅｖ−ｓｉｓの　：成熟ｒＰＤｆ：Ｆ　Ｂタンパク領域が ｖ−ｓｉｓ遺伝子によってコードされており翻訳開始シグナル及びｒＰＤｃＦ　 Ｂのプレタンパクのアミノ末端領域がｃ−ｓｉｓ遺伝子によってコードされてい る哺乳頂発現ベクターを構築するために以下の手順を使用し得る。 １μｆノｐＤｓＶＥをガ土■で直線化し、フェノール／クロロホルム抽出し、エ タノール沈殿した。実施例１に記載の３μｍのＲＦ型分子の８１３ｅ＋ｐ１８／ ｖ−ｓｉｓ（Ｋｐｎ−Ｘｂａ）サブクローンを達１１及びシｈｌｌで制限した。 この結果、ＳＳＶの３８３３位（Ｄｅｖａｒｅ等、賎、の番号系）のむ１１部位 と８１３ｍｐ１８のポリリンカーの鉢土■部位との間の領域にわたる９９１ｂｐ のフラグメントが遊離しな、後者の部位は、ｖ−ｓｉｓ遺伝子が挿入された独１ １部位から７ｂ、を隔てる。０．５％低融点アガロースゲル電気泳動にかけて精 製し、以下の手順でフラグメントを結合した。 推定ｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓタンパク前駆体のアミノ末端領域に対応するＤＮ Ａフラグメントを、公知の手Ｊｉ［（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕ−ｔｈ ｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２４：２４５（１９８３））に 従って合成した。第８図に示す配列をもつこのフラグメントは、Ｊｏｓｅｐｈｓ 等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６３６（１９８４）に記載のｒＰＤｃＦ　Ｂタン パクｃＤＮ＾クローンのヌクレオチド１１１からヌク、レオチド２０３にわたる 領域に対応する。　ｐＤｓＶＥベクターに結合できるように上流末端に５ａ１１ 部位を付加した。　ｃ−ｓｉｓ及びｖ−ｓｉｓの双方において下流末端のＳｓｔ 　１部位がこの位置に自然発生した。 １００ｎｙのむ土Ｉ切断、ＤＳＶＥと、２．６Ｂの合成Ｓａｌ　Ｉ　／Ｓｓｔ　 Ｉｃ−５ｉｓフラグメントと、２５ＢのＳｓｔ　Ｉ　／Ｓａ上１　ｖ−ｓｉｓフ ラグメントとを含む３方向結合反応で最終発現ベクターを結合した。　Ｔ４　Ｄ Ｎ＾リガーゼの存在下に１４℃で１晩インキユベート後、反応産物で大腸菌に１ ２株ＤＨＩを形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから重複レプリカフィル ターを作成した。 フィルターの１つを前記のごとく放射性標１１ｖ−ｓｉｓプローブにハイブリダ イズさせた。別のフィルターを放射性標識した合成む土１　／Ｓｓｔ　Ｉ　ｃ− ｓｉｓフラグメントにハイブリダイズさせた。双方のプローブにハイブリダイズ したクローンを液体培養で増殖させ、該クローンを保有するプラスミドを標準法 で単離した。独工Ｉ；駐針■、旺１１及びＰｓｔｌによって制限地図を作成する と、ｐＤｓＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓと命名されたこの１ラスミドが第９図に示すごと く配置されたエレメントを含むことが確認された。この遺伝子の初期翻訳産物と 推定されるタンパクのアミノ酸配列を第１０図に示す。 え４九り 多　ローン 生物学的に活性のｒＰＤＧＦ　Ｂを高レベル産生ずるために、実施例２に記載の 発現プラスミドを哺乳頚細胞系に導入した。使用した手順は実質的に、ＰＣＴ特 許出ＮＮｏ　、ＵＳ８４１０２０２１．５８６３に記載の手順である。該文献の 記載内容は本明細書に含まれるものとする。 Ｕｒｌａｕｂ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：４ ４６１（１９８０）に記載のＣＦＩＯＤＨＦＲ−（Ｄｕｘ−８１１）細胞は、構 造遺伝子の突然変異によって酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）が欠失 しており、従ってその培養培地中にはグリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを 存在させる必要がある。プラスミドｐＤＳＶＥ／ｅ−ｓｉｓ、　ｐＤｓＶＥ／ｖ −ｓｉｓまたはｐＤｓＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓをキャリヤーＤＮＡと共に、６０ｍｍ 培養プレートでヒポキサンチン、チミジン及びグリシンを含む培地で増殖するＣ ＨＯＤＨＦＲ−細胞にトランスフェクトした。プラスミド及びキャリヤーＤＮＡ の混合物がＣＨＯＤＨＦＲ−細胞にトランスフェクトした。 ３日後、ヒポキサンチン及びチミジンの欠失した培地中で１００ｍｍの培養プレ ートにｔｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎによって細胞を分散させた。Ｄ肝Ｒ遺伝子、 従ってｒＰＤにＦ　Ｂ遺伝子によって確実に形質転換された細胞だけがこの培地 で生存する。 ７〜２１日後に生存細胞コロニーが明らかになった。これらの形質転換コロニー はｔｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎによる分散後、ヒポキサンチン及びチミジンの欠 失した培地中で混合集団として連続的に増殖し、新しい細胞株（例えばＣ０Ｏ− ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓまたはＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓ）を形成する 。または、各コロニーをトリプシン処理（ｔｒｉｐｓｉｎｉｚｅ）　シ、マイク ロタイタープレートのウェルに転移して、新しいクローン細胞系（例えばＣｌ０ −ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓｉｓ）を形成させる。細胞系ＣｔｌＯ−ｐＤＳＶＥ／ｖ− ｓｉｓ、　Ｃｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓ及びＣ１１Ｏ−ｐＤＳＶＥ／ｅ− ｓｉｓは夫々、１９８７年３月１３日に＾ｍｅｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に＾ＴＣＣＮｏ　。 ＣＲＬ９３５９、ＣＲＬ９３６０及びＣＲＬ９３５８で寄託された。 マイクロタイターウェルにおけるＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓｉｓクローンの増 殖によって得られた前記細胞株から培養流体を採取し、実施例４に記載のごとき バイオアッセイ及びラジオイムノアッセイ（Ｒ１＾）でｒＰＤＧＦ　Ｂの存在を 検定した。　Ｃｌｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ及びＣＲＯ−ｐＤＳＶＥ／ｅｖ −ｓｉｓの代表的な５日間培養流体は、双方のアッセイで定量した結果、約１０ ０〜２００ｎｇ／ｘｊ！のｒＰＤＣＦ　Ｂを含有していた。　ＣＨＯ−ｐＤｓＶ Ｅ／ｃ−ｓｉｓクローンの１つから得られた培養流体は約２０Ｏｒ＋９／ｚ１の ｒＰＤＧＦ　Ｂを含有していた。このクローンを以後の試験で使用した。　ｐＤ ｓＶＥだけで形質転換された細胞の培養流体は検出可能量のｒＰＤＧＦＢを含有 していなかった。 前記細胞系で産生される組換えｒＰＤＧＦ　Ｂの量は、遺伝子増幅によって増加 し、より大きい産生能をもつ新しい細胞系を形成する。　ＤＢＦＲ遺伝子によっ てコードされる産物たる酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼは、薬剤メトトレキセー ト（ＮＴＸ）によって阻害され得る。より特定的には、ヒボキサンチン及びチミ ジンの欠失した培地中で増殖する細胞は、ＭＴＸによって阻害または殺害される 。適当な条件（例えばＭＴＸ最小濃度）下にＭＴＸに耐性でＭＴＸ中で増殖し得 る細胞が得られる。　ＤＩＩＦＲ遺伝子の数が増幅することから、これらの細胞 は通常はＭＴＸ耐性でありその結果としてＤＨＦＲ酵素の産生が促進されること が知見されている０次に漸増濃度のＭＴＸで生存細胞を処理すると、より多数の ＤｎＦＲ３を分子を含む細胞株が得られる。　ＤＩＩＦＲ遺伝子と共に発現ベク ターに担持された「パラセンジャー遺伝子」（例えばｒＰＤＧＦ　Ｂ）も遺伝子 コピー数の増加をしばしば示すことが知見された。 この増幅系の代表、細胞株Ｃｌ０−ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓｉｓ、　ＣＨＯ−ｐＤＳ ＶＥ／ｖ−ｓｉｓ及びＣｆ１Ｏ−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓを漸増濃度のＭＴＸ （ＯｎＭ、３０ｎＭ及び１００ｎＮ）で処理した。ＣＨＯ−ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓ ｉｓの各増幅段階から代表的な５日間培養培地標本をＲ１＾アッセイで検定し、 夫々０．２．２．０及びＺ、Ｏｕ　５ｌＮ１のｒＰＤＧＦ　Ｂが定量された。　 ＣＢＯ−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ及びＣＢＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓの各増 幅段階の代表的５日間培養培地標本は夫ｔｚ　、０．１５．１．０及び１．０μ ｇ７ｍｌのｒＰＤＧＦＢを含有していた。これらの手順ではｌＸｌ０’細胞を６ ０−一培養皿の５ｚ１培地にプレートした。２４時間後に培地を除去し、５ｚｆ の無血清培地（０，１ｍＭの非必須アミノ酸と２ｍＭのし一グルタミンとを添加 した高ブドウ糖ＤＭＥＭ）で交換した。　ｒＰＤｃＦ　Ｂを無血清培地中で５日 間蓄積させた。培地を収集してＲＩ＾アッセイで検定し、細胞をトリプシン化し て計数した。　３０ｎＭのＭＴＸ中で増殖したＣＨＯ−ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓｉｓ 及びＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ（またはＣＦｌｏ−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉ ｓ）細胞のＲ１＾平均値は夫々、２，０μｆＩ１１１１及び１．０．ｇ　２７ｍ Ｍであり、実際の収量は１０μｇ／プレート及び５μｇ／プレートであった。プ レート当たりの細胞数は２．５×１０１であった。従ってこれらの培養条件下の 有効産生率は０．８及び０．４μ＃／１０’細胞７２４時間であった。 上記のＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ及びＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓ 培養物中の細胞は、遺伝的に不均一な気団であった。これらの細胞及びｐＤＳＶ Ｅ／ｖ−ｓｉｓ細胞を標準スクリーニング手順で処理し、最大産生能をもつ遺伝 的に均一なりローンを単離した。 ’Ｐｏ１ｎｔｓ　ｔｏ　Ｃｏｎ５ｉｃｌｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓυｓｅａ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃｅ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」の５ｅｃｔｉｏｎｌ、Ｐａｒｔ２．１９８４．６．１． ０ｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅｖｉｅｗ、 Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　Ｕ、Ｓ、Ｆｏ ｏｄ　Ｄｒａｇ　ａｎｄ　Ａｄｍｉｎｉｓｔ−ｒａｔｉｏｎ参照。 上記のｒＰＤＧＦ　Ｂ産生Ｃｌ０細胞系の産生効率は適当な細胞培養技術によっ て改良され得る。一般に培養哺乳類ｍｍの増殖では、増殖培地中に血清を存在さ せる必要がある。血清を含まない培地中でＣＢＯ細胞からｒＰＤＧＦ　Ｂを産生 する方法が開発されれば、標準タンパク精製技術を使用して培地からｒＰＤＧＦ 　Ｂを精製する処理が極めて容易になるであろうと予想される。後述の本発明の 方法によれば、十分に多い量の無血清培地中でｒＰＤｃＦ　Ｂを経済的に産生ず ることが可能である。 標準細胞培養条件で増殖したｒＰＤＧＦ　Ｂ産生ＣＯＯ細胞を使用し、これを細 胞攪拌培養フラスコに接種する。ｍ胞は、５％のウシ胎児血清と２ａＨのし一グ ルタミンと０．０５ｍＭの非必須アミノ酸と適当濃度のメトトレキセートとを添 加した高ブドウ糖ＤＭＥＳ及びＨａｍ　Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）の５０−５Ｏ混合 物から成る培地中で細胞攪拌培養フラスコ内の浮遊細胞系として増殖する。浮遊 細胞培養物はｒＰＤＧＦ　Ｂ産生ＣＩ＋０ＩＩＩ胞を容易に大容量まで膨張させ る。 浮遊液中で増殖したＣｌｌ０細胞を使用し、これを２００ｉ１の培地中で８５０ ｃｍ”の回転瓶当たり生存細患数１．５Ｘ　１０’の初期接種密度で回転瓶に接 種する。３日間にわたり付着性単層の形態の気密的細胞単層が形成されるまで即 ちコンフルエンシイまで細胞を増殖させる。この増殖期に使用した培地は浮遊液 増殖に使用した培地と同じである。３日間の増殖期間の経過後、血清含有培地を 除去し、　１００ｚ１の無血清培地で交換する。この培地は、０．０５ｍＭの非 必須アミノ酸と２１のし一グルタミンとを添加した高ブドウ糖Ｄ）ＩＥＭ及びＨ ａｓ＋　Ｆ１２の５０−５Ｏ混合物である０回転瓶を回転瓶インキュベータに戻 して１〜３時間維持し、培地を再度除去して１００ｚｆの新しい無血清培地と交 換する。無血清培地を１〜３時間インキュベートすると、血清の夾雑タンパクの 濃度が減少する。 回転瓶をインキュベータに戻して７日間維持する。この期間にｒＰＤにＦ　Ｂが 無血清培地に蓄積される。７日間の産生期間の終了後、ならし培地を除去し、新 しい無血清培地で交換して第２の産生サイクルを開始する。この産生システムの 代表例では、Ｒ１＾及び***誘発アッセイで定量すると、７日間血清培地標本が １　、ｕ　６７ｍＭのｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓを含んでいた。 ０．９〜１．８ｘ　１０’細胞／ｃ−２の推定細胞密度に基づくと、８５０ｃｍ ”の回転瓶の各々が０．７５〜１．５Ｘ１０”細胞を含み、従って７日間培養物 １００ｚｆのｒＰＤにＦ　Ｂｅ−５ｉｓ産生効率は０．１０〜０．１９μｙ／１ ０’細胞７２４時間であった。 アフィニティクロマトグラフィーのごとき好ましいｒＰＤＧＦ　Ｂ精製方法（実 施例６及び１０で記載）を使用すると、ならし培地中の低レベル血清の存在は精 製を難しくしないことが知見された。これらの低レベル血清は、Ｃｌ０−ｐＤＳ ＶＥ／ｃ−ｓｉｓまたはＣＨＯ−ｐＤｓＶＥ／ｖ−ｓｉｓ細胞によって培地中に 分泌されるｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓのレベルを向上させる。従って、大規模組 織培養のために上記手順のいずれかを修正して使用し得る。 細胞を攪拌フラスコで増殖させ前記と全く同様に回転瓶に接種する。３日間でコ ンフルエンシイまで増殖させ、培地を除去して１％の血清を含む１００ｉ１の同 じ培地で交換する。 瓶をインキュベータに戻し、７日後に培地を除去する。細胞に更に１００ｉ１を 添加し、培地中で更に７日間のｒＰＤＧＦ　Ｂ蓄積サイクルを続行する。産生レ ベルが有意に低下するまでこのサイクルを複数回反復してもよい０代表的な７日 間標本は３μｙｈｌのｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓを含有していた。 外来ｒＰＤｌｌ：Ｆ　Ｂ遺伝・字を含むＣＩＯ細胞による活性ｒＰＤｃＦ　Ｂの 高レベル産生は予想外であった。この産生レベルは、ｒＰＤＧＦＢ遺伝子を予め 導入した別の種々の細胞型（Ｈｕａｎｇ等、Ｃｅ１１３９ニア９（１９８４）、 Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃｔｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８２： １７２１　（１９８５）、Ｋｅｌｌｙ等、　ＥＭＢＯＪ、　４：３３９９（１９ ８５））、または内因性遺伝子を発現させる細胞（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：４４１８、Ｍａｒｔｉｎｅｔ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１９ ：１５Ｂ（１９８６）、Ｇｏｕｓｔｉｎ等、Ｃｅ１ｌ　４１：３０１（１９８５ ）、Ｒｉｚｚｉｎｏ等、Ｄｅｖ、Ｂｉｏ！。 １１０：１５（１９８５）、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ等、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾：８３ニア１９７（１９８６）、Ｆｏｘ　ａｎｄ　Ｄｉ Ｃｏｒｌｅｔｏ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｕｓ＾：眩：４７７４（１９ ８６）、Ｈｅ１ｄｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：５１１（１９８６））で報告 された産生レベルの２０〜１０倍であった。従来報告された結果と対照的に本発 明によって産生されるＰＤＧＦのレベルは実用化するに十分なレベルである。 Ｃｌｌ０及びその他のを椎動物細胞によって培養培地中に分泌される活性ｒＰＤ ｃＦ　Ｂのレベルは、°成熟分泌形タンパクの「上流」即ちアミノ末端に存在す る前駆体タンパクのアミノ酸配列を変性することによって増加する０例えば、第 ２図のアミノ酸番号８２の上流のｒＰＤｌｌ：Ｆ　Ｂｅ−５ｉｓの領域をコード するｒＰＤＧＦ　Ｂ［遺伝子の部分を欠失させ、別のタンパクのアミノ末端領域 をコードするＤＮＡ配列で置換してもよい、このタンパクはＣＨＯまたはその他 のを椎動物細胞によって多量に分泌されることが知られている。より特定的には 、上流ＤＮＡ配列をエリトロポエチンタンパクのアミノ末端領域をコードするＤ ＮＡ配列によって置換し得る。該タンパクはＣＨＯ細胞から多量に分泌され得る 。 えＩ１先 ＣＩ’ｌＯびｔ　し声　のＲＤ［；Ｆ　連タンパクの４（ａ）　オシ稗　の　・ 　アッセイ：ｒＰＤＧＦ　Ｂ標本の生物学的活性を***誘発アッセイで試験した 。２４ウエルのプレート（面積的２ｃｍ’）にＮ１ｔｌ　３Ｔ３細胞をウェル当 たり３Ｘ１０’細胞の密度でプレートし、ペニシリン（１００単位／１１）及び ストレプトマイシン（１００μｔｔ＃１’）を添加し、１０％の熱不活性化子ウ シ血清を含むダルベツコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）から成る最小増殖培地で３ ７℃でコンフルエンシイまで増殖させた。コンフルエンシイに達すると、培地を ５％のヒト血小板欠乏血漿（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ、ム販旦 」ｂ士！ＪＬＬ　６９：１９６（１９７６））を含み上記と同じ抗生物質を添加 したＤＭＥＮに交換した。培地交換の４８時間後、ＰＤにＦの標準及びアッセイ 標本をウェルに添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。培地を除去し、 細胞を５％の熱不活性化子ウシ血清と２μＣニアｍｌのＭｅ−３Ｈ−チミジン（ Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、２０Ｃｉ／ｍモル）とを含み抗生物質 を添加した１ｍｌの新しいＤＭＥＭ中で３７℃で正確に１時間標識した。１時間 後、細胞を冷却し、培地を除去し、細胞シートを冷たいリン酸バッファ生理食塩 水（ＰＢＳ）及び５分間水中に維持した５％トリクロロ酢Ｍ　（ＴＣ＾）で順次 洗浄した。　ＴＣ＾を除去し、細胞を新しい冷５％ＴＣ＾で再度洗浄し、洗浄液 を吸引除去して細胞シートを乾燥した。各ウェルの内容物を１．Ｏｉｌ’の０． ２５Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し、１０１１の＾ｑｕａｓｏｌ　ｎ　（登録商標 ）シンチレーションカクテル（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｂｏ ｓｔｏｎ、Ｍ＾）を入れたガラスバイアルに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ液体シンチレ ーションカウンタで計数した。２〜１２０ｎ１Ｆ／ｉ１の濃度範囲にわたるＰＤ にＦ標準曲線を作成し、標準曲線からアッセイ標本のＰＤ（：Ｆ活性を計算した 。 ｒＰＤＧＦ　Ｂの検出及び定量を行なうために、ヒト血小板から精製したＰＤに Ｆと該ＰＤにＦに対して誘発されたウサギポリクローナル抗体とを使用して特異 的ラジオイムノアッセイを行なった。　Ｆｒａｎｋｅｒ　ａｎｄ　５ｐｅｃｋ、 　Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉ幻７Ｃｏ＋ｍｗｉｕｎ、　８０：４８９（１９）８）の 手順を使用し、［ｌｔ％ｌ］ｌａ及びｌｏｄ。 −Ｃｅｎ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ、ＩＩｌ、）を使用してヒト血小板ＰＤにＦ（０，５μｇ）をヨード化し た　［１２ｉｌ］−ＰＤＣＦ（３０、ＯＯＯｅｐｍ）をある量の抗血清とインキ ュベートした結果、Ｒ１＾バ＝ｔ　７　ｙ　（１０ｍＨＴｒｉｓ−ＢＣｌ、ｐｕ ｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，４％Ｎｏｎ１ｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（Ｓ ｉｇｍａ、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）及び０．１％ＢＳ＾）を含む６０μ！ 中で４℃で１６時間反応後、標識ＰＤＧＦの沈降最大値の半値が得られた。　” ’Ｉ−ＰＤ（：を添加する前に、抗血清を種々の量の非標識ヒト血小板ＰＤＧＦ と室温で１時間ブレインキュベートして標準曲線を作成した０反応期闇が終了す ると、Ｓｔａ且むユ幻四！す１−リエ犯＋ｓ（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）死菌の洗浄１ ０％懸濁液５０μｌを添加し、混合物を室温で４５分間インキュベートした。　 Ｂｅｅｋｍａｎ　Ｍｉｅｒｏｆｕｇｅで２分間遠心してＳ、ａｕｒｅｕｓを結合 抗体及び抗体−抗原複合体と共にペレット化した。ペレットをＲＩ＾バッファで ３回洗浄し、沈降した放射能をガンマ放射線カウンタで定量した。血小板ＰＤＧ Ｆ競合物質の添加量に対する抗体の”’Ｉ−ＰＤＣＦ反応阻害の量をプロットし た。未知の標本中のＰＤにＦ免疫反応物質の量を標準曲線に対する競合活性との 比較によって検定した。 ４（ｃ）　ｆ細　内　゛ＰＤＧＦ関連タンパクのｓｉｓベクターを含むＣＨＯ細 胞中で合成され分泌されたｒＰＤＧＦ　Ｂタンパクのサイズを決定するために、 細胞をまず５ｓ５−システィンと共に２０時間インキュベートしてシスティン含 有タンパクを標識した。タンパクに取り込まれたラベルは、この期間の定常状態 分布に近いと考えられる。標識ＰＤＧＦ関連タンパクをヒト血小板ＰＤにＦに対 する抗血清と共に免疫沈降させ特異的に検出し、５ＯＳ−ＰＡ（：Ｅ及びフルオ ログラフィーによって分析した。Ｃｌ０−ｐＤｓＶＥ／ｃ−ｓｉｓ、Ｃｌ０−ｐ ＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ、　Ｃｌ０−ｐＤｓＶＥ／ａｙ−ｓｉｓまたはＣｌ０−ｐ ＤｓＶＥ（対照）細胞を、１０ｃ−培養プレートで約８０％コンフルエンシイま で増殖させた。細胞をシスティン欠失培地で２０洗浄した。　０．６２５ｍＣ１ の５ｓ５−システィンを含有する４Ｍ１のシスティン欠失培地を各プレートに添 加した。３７℃で２０時間インキュベーション後、培地を収集し、プロテアーゼ 作用及び細菌増殖を阻害するために１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び０．０２５％ナトリウ ムアジドとした。 １．４ｍ１（１）破壊バッフ　７　（０，０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ！、ｐ ｎｓ、ｏ、０．０５ＭＮａＣ１’、０．５％デオキシコリン酸ナトリウム、０． ５％Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ−４０及びＩＪ　ＰＭＳＦ）を添加して各プレートの細胞 を溶解した。Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｈｉｅすｆｕｇｅで１分間遠心して不溶物質を除 去した０等量のＴＣ＾不溶標識物質を含む培地または細胞抽出物のアリコートを ウサギ非免疫血清と共にプレインキュベートした。　Ｐｒｏｔｅｉｎ＾−５ｅｐ ｂａｒｏｓｅ（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉ−ｆｏｒｎｉａ ）を添加し、上記のごとく遠心し、非特異的に反応したタンパクを除去した。各 上清に抗ＰＤにＦ血清を添加した。 ４℃で１６時間インキュベーション後、Ｐｒｏｔｅｉｎ＾−５ｅｐｈｉｒｏｓｅ を室温で１時間添加し上記のごとく遠心して特異的に反応したタンパクを除去し た。　Ｐｒｏｔｅｉｎ＾−５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）／免疫複合体をＲ１ ＾バッファで６回洗浄した。結合した免疫複合体を破壊し、１％ＳＯＳ中で５分 間沸騰させることによってＰｒｏｔｅｉｎ＾−５ｅｐｈａｒｏｓｅから分離した 。各上清を等量の２つの部分に分け、遷元剤（３％の２−メルカプトエタノール ）を任意に添加したゲルローディングバッファ（１％ＳＯＳ、２０％グリセロー ル、０．１％ブロモフェノールブルー）を各アリコートに添加した。標本を再度 沸騰させ、１８％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをＥ ａ’Ｈａｎｃｅ（登録商標＞（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂ ｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾）で処理し、乾燥し、χ！フィルムに２〜１０日間露光した 。 ｓｉｓ含有ベクターによって形質転換された細胞中の細胞びフｋｄの３つの種に 変換された。 これらの細胞によって分泌された細胞外ｒＰＤ（：Ｆ　Ｂの主要種は不均一であ った。オートラジオグラムに最も鮮明に現れる２つの種は２）、５ｋｄ及び２５ ｋｄに対応する移動度を有していた。　３０．５ｋｄの種は上記の２つの種より やや不鮮明である。 更に不鮮明な第４の種は細胞内主要安定種と同様のサイズ即ち２３ｋｄであった 。細胞外ｒＰＤＧＦ　Ｂの還元種も不均一であった。最も鮮明なバンドは１３． ５ｋｄに対応する移動度を有していた。　１７ｋｄ、１６ｋｄ及び１２ｋｄにも やや不鮮明なバンドが存在する。細胞内ｒＰＤＧＦ　Ｂ還元種のレーンで観察さ れたバンドと同様のサイズの８．５ｋｄ、７．５ｋｄ及び７ｋｄに更に不鮮明な バンドが存在する。注目すべきは、これらのオートラジオグラムのバンドの鮮明 度が、異なる分子種間の実際の質量（ｍａｓｓ）分布を必ずしも反映せず、各々 の種のシスティン含量に左右されることである。 上記のどの種も、対照Ｃｌ０−ｐＶｓＤＥ細胞抽出物または培地中では観察され ない、また、対照非免疫血清との反応後にも観察されなかった。ｓｉｓベクター によって形質転換されたＣＨＯ細胞の細胞産物から免疫沈降後に観察されたｒＰ ＤＧＦ　Ｂタンパクのサイズ及び不均一性は、ヒト血小板がち精製されたＰＤｆ ：Ｆに関する従来の観察結果とほぼ一致する。 え１１Σ 二ワト１　ホルモンＰＤＧＦムタンパクに　る　ｒＰＤｃＦ　Ｂの分析及び精製 を容易にするようにｒＰＤＧＦ　Ｂと反応する抗血清の大量供給源を得るために 、大腸菌に導入される発現プラスミドを構築した。プラスミドは、ニワトリ成長 ホルモン（Ｃ（Ｈ）のアミノ末端の１２０個のアミノ酸（Ｓｏｕｚａ等、Ｊ、Ｅ ｘ、Ｚｏｏｌｏ　２３２：４６５（１９８４））とｖ−ｓｉｓ遺伝子によってコ ードされタンパクのカルボキシ末端の１３６個のアミノ酸とから成る融合タンパ クをコードするように設計された。 得られたタンパクをＣにＰｉと命名しその完全配列を第１１図に示す。 ２μ２のＭ１３ｍｐ１８／ｖ−ｓｉｓ（Ｋｐｎ−Ｘｂａ）　ＲＦ　ＤＮＡをむ土 ■及びＢａｗｌ■で制限した。　ｓｓｖの４０６１位（Ｄｅｖａｒｅ等、麟、の 番号系）の１■部位とＭ１３ｇ＋ｐ１８のポリリンカー領域のＢａｍＨ１部位と の間の領域にわたる７６０塩基対のフラグメントを低融点アガロースゲルで精製 した。　７５ｒ＋ｇのフラグメントを、ＣＧＩＩ遺伝子のアミノ酸１２０の後方 を切断するＢｉｍＨＩで制限した９゜ａｙのｌ）ＣにＢＴＩ／ＣＦＭ４１４　Ｄ ＮＡ（Ｓｏｕｚａ等、肢）に結合した。結合ＤＮＡで大腸菌に１２株ＪＭ１０３ を形質転換した。 ｖ−ｓｉｓを含有するアンピシリン耐性コロニーをｖ−ｓｉｓプローブとのハイ ブリダイゼーションによって同定した。複数の該コロニーからプラスミドＤＮＡ を単離し、Ｘｂａ　Ｉ　、ｈｍＨＩ及びＥｃｏＲｌで制限地図を作成することに よって分析した。 ｐｃＧＰｌと推移される１つのクローンにおいては発現に適した正確な配向でｖ −ｓｉｓＤＮ＾が挿入されていた。このクローンを以後の使用のために選択した 。 ５（ｂ）　ＣにＰｉ　ムアンパ　の　：大腸菌に１２株の形質転換に用いること によってｐＣ（：Ｐｉ　ＤＮＡを発現させた。　ｐｃＧＰｌで形質転換された大 腸菌に１２株八へ７の細胞は、１９８７年３月１３日に＾−ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗ ｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に受託番 号６７３５２で寄託された。　２０ｘｌの培養物をＬｕｒｉａブイヨン中で２８ ℃で１晩増殖させた。１１１のこの培養物を１１のＬｕｒｉａブイヨンに接種し 、この１１培養物を回転プラットフォームで２８℃でインキュベートした。培養 物の吸光度をモ二りし、Ｂｏｏｎｓの吸光度が０．５になると培養物を３７℃に シフトして１３．５時間維持し、融合タンパクの発現を誘発した。細胞を遠心に よってペレット化し、１２１１の１０ａＮ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）及 び１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再度浮遊させた。ｉ！ＩＩ胞をＦｒｅｎｃｈ圧力室で破 壊し不溶物質を低速遠心によってペレット化した。 ５Ｏ５−ＰＡＧＥによって分析すると、ペレット化分画から約２８ｋｄのタンパ クが検出された。このタンパクは非誘発細胞またはベクター単独によって形質転 換された。細胞中には存在しなかった。この段階のタンパクは純度的６０％であ った。 この不溶ペレットを２０１１の２０＋ｅＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、 ５ｔＭＥＤＴ＾及び０．２ｚｇ７ｍｌのリゾチームに懸濁させ、室温で３０分間 インキュベートした。　Ｎｏｎ１ｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０を濃度０．５％ま で添加し、インキュベーションを更に３０分間続行した。 不溶物質を遠心（５公開、１０．ＯＯＯｘｇ）によってペレット化し、ペレット を１０１１の水で洗浄した。遠心後、ペレットを４ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｆ（ｐｌ’１８．５）、５％エタノ−１し及び１％のラウリン酸ナトリウム と共に室温で３０分間攪拌した。上記の遠心後、ラウリン酸ナトリウムによる洗 浄を反復した。最終ペレットを４ｗｌの１％ＳＤＳ及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ７，４）中で室温で１晩攪拌することによって溶解した。　５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析によればこの調製物は純度的８０％であった。 以下の日程でウサギにＣＧＰＩを注射し採血した。プレ免疫種を選び、０８目に 、ＰＢＳ中にＤＩＦＣＯｌＤｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｅｈｉｇａｎ製の５０％乳化 ＢＡＣＴＯ−フロイント完全アジュバントＨ３７Ｒａ（ＤＩＦＣＯ３１１３−６ ０）を含む混合物１．Ｏｘｌ中のＣＧＰＩを各ウサギの背中の複数部位に合計２ ５０μｇ皮内注射した。２週間後に５０％フロインド不完全アジュバント（ＤＩ ＦＣＯ１ＢＡＣ７００６３９−６０−６）と前記のごとく混合した２５０μ２の ＣにＰｉをウサギに皮肉注射した。 ３０日目に第２注射と同じブースターを与え、４２日目にウサギから試験採血し た。得られた血清の抗ＣＧＰＩ抗体の産生を試験した。 次に、ＣＧＰＩ抗体陽性のウサギに対し、５０％フロインド不完全アジュバント 中の２５０Ａ１．のＣにＰｉタンパクを３０日毎に注射した。投与量の１７２を 皮肉注射し１／２を腹腔的注射した。 注射ｆ＆１４日目及び２１日目にウサギから採血した。得られた血清の抗ＣＧＰ Ｉ活性をＥＬＩＳ＾−プレート結合アッセイで試験した。炭酸−炭酸水素バッフ −ｒ　（０，０１５Ｍ　Ｎａ、ＣＯ３及び０．０３５ＭＮａＪＣ０３、ｐＨ９， ５）中に５μｇ／ｍｌのＣＧＰＩタンパクを含む混合物各５０μｌと共に室温で １６時間インキュベートすることによって、９６ウエルのＩｍｍｕｌｏｎｌ［（ 登録商標）（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）ウ ェルをＣにＰｌ＠合タンパクで被覆した。混合物を除去し、ウェルを２００μｌ のＰＢＳ中の５％子ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）で室温で１時間ブロックした 。プレ免疫ウサギ血清及び免疫ウサギ血清をＰＢＳ及び１％ＢＳ＾中で種々の希 釈度に希釈し各ウェルに５０μｌずつ使用した。 室温で３時間インキュベーション後、溶液を除去しＰＢＳで３回洗浄した。各ウ ェルをｌｘ　１０’ｅｐ−の”’Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ＾（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ 　Ｎｕｅｌｅａｒ、カタログＮｏ、ＮＥＸ　１４６Ｌ）を含む５０μｍのＰＢＳ ７０．１％ＢＳ＾と共に１時間インキュベートすることによって結合ウサギ抗体 を検出した。放射性溶液を除去し、各ウェルをＰＢＳで５回洗浄した０個々のウ ェルを分離し、Ｂｅｅｋｍａｎ５０００ガンマカウンタで計数した。 結合”’Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−＾の毎分カウント数に対するウサギ血清希釈倍数 （１０−１〜１０ツ）をプロットすることによって活性曲線を作成した。各血清 の力価は、最大カウント数の５０％が結合した希釈倍数の逆数で示される。３つ のウサギのうちの２つがＣにＰｉタンパク（１３０４及び１１３０５）に強陽性 で、５．６Ｘ１０コ及び１．５Ｘ１０’の初期値から２．６Ｘ　１０’及び４Ｘ １０３までの範囲の力価を生じた。 え克匠Ｌ ＣＧＰ１ア　ロースアフィニーイ　−ムの　び′ら　ｔｌｏｚｌのウサギ血清＃ ３０４（抗ＣＧＰＩ力価＞　１０’）を４０，０ＯＯＸｙで２０分間遠心した。 透明上清を、０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１４Ｍ塩化ナト リウム及び０．０２％ナトリウムアジド（ＰＢＳ）で予め平衡させたＰｒｏｔｅ ｉｎ＾−アガロースの１．５Ｘ６ｃｓ＋カラムの上部に入れた。血清をカラムに 流し、２８０ｎ−の溶出液のＵ、Ｖ、吸光度が０．０２単位未満になるまでカラ ムをＰＢＳで洗浄した。 カラムに吸収された免疫グロブリンを０．１５Ｍの塩化ナトリウム中の０．５８ ％の酢酸で溶出し、得られた分画の所在をＵ、Ｖ、吸光度によって検出した。免 疫グロブリンを含む分画を１．ＯＮのＴｒｉｓバッフｙ　（ｐＨ８，０）で中和 した。４℃で４１の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウム（ ｐＨ８，５）を３回交換して透析し、消衰係数１．４６を使用し２８０ｎＮのＵ 、Ｖ、吸光度によって免疫グロブリン濃度を測定した。ウサギ免疫グロブリンの 収量は４２．９ｍｇであった。 ３ｇのシアノゲンプロミド活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標＞４Ｂ（Ｐｂａ ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｂｅｓ＋１ｅａｌｓ、　υｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄ ｅｎ）をＯ，ＯＯＩＭＨＣｆ中で膨潤させ、ガラス漏斗を用い６００ｘＮの同じ 溶液で洗浄した。湿潤ゲルを５０１１の遠心管に移し、２０ｍ１の結合バッファ （０，ＩＮ炭酸水素ナトリウム及び０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８，５）で 洗浄した。６００Ｘｙで４分間遠心後、上清流体を除去し、９．７ｍｌの結合バ ッファ中の４２．９ｔｙのウサギ免疫グロブリンを５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商 標）４Ｂに添加した。混合物を４℃で１晩十分にひっくり返して撹拌し、上記の ごとく遠心し上滑の残留免疫グロブリンの存在を試験した。上清中の残存量は出 発免疫グロブリンの０．３％未満であった。従って、結合効率は９９．７％を上 回った。 免疫グロブリン結合５ｅｐｂａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂに対し、０．１Ｈの酢 酸ナトリウム（ｐＨ４，０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び結合バッファを順次 用いた洗浄サイクルを４回繰り返した。ゲルを１．５Ｘ１０ｅ−のガラスカラム 番二注いだバッファＥ（０，００２６ＭＫＣｔ、　０．１３６９Ｍ　ＮａＣｆ　 Ｏ，００１４Ｍ　ＫＢａＰＯ＜及び０．００８Ｍ　ＮａＪＰＯ４）で平衡させ、 ４℃の１００ｉ＋ＺのバッファＥで洗浄した。 ６（ｂ）ｔｉ”−れｔ−ｒＰＤＧＦ　Ｂの　フィニーイＣｌ０−ｐＤｓＶＥ／ｃ −ｓｉｓ、Ｃｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓまたはＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｅｖ− ｓｉｓの回転瓶培養物から４〜７日後に収集した培養流体を１０．０ＯＯＸｙで ２０分間遠心し、上清流体を０．４５μフイルターに通した。１００〜４００ｘ ｌのヂ過培地を流速３０〜４０ｍ１７時で４℃の１０ｚｉ’の抗ＣＧＰＩ−Ｓｅ ｐｈａｒｏｓｅアフィニティ力ラムに吸着させた。カラムを、カラムの２００倍 容バッファＦ（０，５８ＮａＣｆ、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＢＣｌ、ｐＨ７， ５及び０．１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０）、及び、カラムの５倍容 以上のバッフｙＧ（０，１５Ｎ　ＮａＣ４，０，０１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４ ０）で順次洗浄した。結合ｒＰＤＧＦ　Ｂを流速３０ｍ１／時のバッファ　Ｈ（ ０，２Ｍ酢酸、０．１５Ｎ　ＮａＣｌ及び０．０１％ＮＰ４０）で溶出した。１ １１の分画を収集し、５０μｌのアリコートをＢｉｏ−Ｒａｄタンパクアッセイ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾）で試験し、前記のごときウサ ギ抗ＣＧＰＩ抗血清を使用するドツト結合イムノアッセイで免疫学的アッセイを 行なうことによってｒＰＤｃＦ　Ｂ含有分画の所在を検出した。タンパク含有分 画をプールし、４℃の０．１Ｍ酢酸及び０．０１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０に 透析し、凍結乾燥した。 ６（ｃ）　ウ　ロブ１ンアフイニーイカームにのｒＰＤＧＦ　Ｂのドツトトムイ ムノアッセイによる。 １凡Ｌ： 抗Ｃ（１；ＰＩアガロースアフィニティ力ラムから回収した分画のｒＰＤＧＦ　 Ｂを、（Ｔｏｗｂｉｎｄ等、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｂｏｄｓ　７２：３１ ３（１９８４））に記載の手順のドツト結合イムノアッセイによって検定した。 ９６ウエルのマニホルド装置（ＳＲＣ−９６，５ｃｈｌｅｉ−ｅｈｅｒ　ａｎｄ 　５ｃｈｕｅｌｌ）で２５〜１００μＺの試験分画をニトロセルロース紙（０， ２μ、＃Ｂ＾−８３，５ｅｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅ ｎｅ、Ｎ、Ｈ，）に吸着させた。別に、１（１−４００ｎｙのｒＰＤｃＦ　Ｂｖ −ｓｉｓを含む種々の量のＣｌｌ０−ｐＤＳＶＥ／シーｓｉｓを吸着させて標準 を作成した。　ＰＳＢ（ｐＨ７，４）（０，１５８ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｎ１２ １１ＰＯ４（ｐ）１７．４））中の１０％の乾燥脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ 、Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　Ｃ＾）溶液中で震盪させることによってニトロセ ルロース紙を「ブロック」し、ＰＢＳ−１％乾燥粉乳中の１：５０希釈のウサギ 抗ＣにＰｉ血清と共にインキュベートし、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０含有のＰＢＳで３回洗浄した。ＶｅｅｔａＳｔｉｉｎ（登録商標＞（Ｖｅｃ ｔｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃ＾）を使用 説明書道りに使用して、結合抗体の検出を行なった。カラム分画中のｒＰＤｃＦ 　Ｂの濃度の概数を、カラム分画の「ドツト」の色の鮮明度を標準「ドツト」と 比較することによって推定した。 ６（ｄ）　５ＤＳ−ＰＡにＥ　クーマシーブルー　染　びイムノブロッーイング によるウ　ギ　グロブリンアフイニーイ　−ムに　のｒＰＤｃＦ　Ｂの、゛：ウ サギ免疫グロブリンアフィニティカラムから得られた凍結乾燥ｒＰＤＣＦ　Ｂ分 画を１０Ｍ１の酢酸中で液体に戻した。アリコート（０，２〜２μＩ？）を、（ 任意に５％の２−メルカプトエタノールで還元し）、１．５ｎｍ厚さの１５％ま たは１８％のポリアクリルアミドゲルのウェルに充填した。０．１％のＳＤＳを 含むＴｒｉｓ−グリシンバッファ　（０，０２５８Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｍグリ シン）申で８０〜９０Ｖで１０〜１２時間の電気泳動を行なった３ク一マシーブ ルー染色または銀染色（ＲＡＰＩＤ−＾ｙ−ＳＴＡＩＮ、　ｒｃｓ　Ｒａｄｉｏ −ｅｈｅｍｉｅａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ　Ｃ＾）で発色させてタンパクバンドを可 視化するか、または、分解された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）バンドをゲルから紙の表 面に駆動する電流を使用する電気泳動トランスファー技術（ＢｉｏＲａｄ　Ｔｒ ａｎｓ−Ｂｌｏｔ　Ｃｅ１ｌ、カタログＮｏ、１７０〜３９１０）によって現像 ゲルからニトロセルロース紙にタンパクを転移させた。転移は、０．１５Ｍグリ シン、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基及び２０％メタノール（容積／容積％）を含む バッファ中で室温で６０Ｖで６時間行なった。クーマシーブルー及び銀染色ゲル は、非還元標本では２５，４００＋＊ｗのマーカーの領域に生じる２つの主要タ ンパクバンドを示し、還元標本では１４，４００−のマーカーの近傍の２つのバ ンドを示した。銀染色ゲルからｒＰＤＧＦ　Ｂが９５％以上の純度をもつことが 推定された。 ニトロセルロースプロットをＰＢＳ中の１０％ヤギ血清及び２％ＢＳ＾で１時間 ブロックし、−次抗体と共に２〜３時間インキュベートし、ＫＰ（Ｋｉｒｋｅｇ ａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｙ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ％Ｍａｒｙ−１ａｎ ｄ）洗浄溶液で洗浄し、ＰＢＳ中の二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ血清と共に１． ５時間インキュベートし、ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ（登録商標）キットで上記（実 施例６（ｃ））のごとく抗体検出を行なった。イムノプロットに使用した一次抗 体は１：５０に希釈したウサギ抗ＣにＰｌ　（１３０５）血清であった。 非還元ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓからのプロットでは、同じゲルに流しニトロセ ルロースに移した予染色分子量マーカーに基づいて約２６，０００ｍｍ及び３０ ．ＯＯＯｍ−に２つの主要バンドが観察された。やや高い分子量に上記バンドは ど鮮明でないｒＰＤＧＦＢ特異的バンドが観察された。還元ゲルからのプロット では、主要な２つのｒＰＤＧＦ　Ｂ特異的バンドが１４，４００ｍ−マーカーと １８，３００ｍ−マーカーとの間に検出された。更に、１４，４００をやや下回 る分子量及び約ｔｓ、ｏｏｏにさらに不鮮明なバンドが観察された。 叉１」１Ｌ ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓに・　るボ１クローナル　びモノ　ロー実施例５（ｃ ）に記載のＣＧＰＩタンパク融合とほぼ同じ手順で、（実施例６に記載のごとく 精製した）ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓでウサギを免疫した。マイクロタイタープ レートウェルに結合したｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓを使用し、実施例５（Ｃ）に 記載の手順で血清の力価を測定した。一般に力価は）１ｘｌＯ’であった。 これらの抗血清は、（実施例６（Ｃ）に記載のごとき）ドツト結合イムノアッセ イで、１：１００の希釈度のヒト血小板から精製したｒＰＤにＦ　ＢまたはＰＤ にＦを夫々１ｎｇ及びＳｎｇという少量でも特異的に検出することが可能であっ た。抗血清は更に、実施例４（ｂ）に記載のごとく行なったラジオイムノアッセ イにおいて、実施例４（ｂ）に記載のごとく放射性ヨウ素標識したヒト血小板Ｐ ＤＧＦ、またはＢｏｌｔｏｎ−１１ｕｎｔｅｒ技術（Ｂｏｌｔｏｎ等、Ｂｉｏｃ ｂｅｍ、Ｊ、　１３３：５２９（１９７３）によって放射性ヨウ素標識したｒＰ ＤＧＦ　Ｂと特異的に反応した。 フ（ｂ）　モノクローナル　の　マウスの　び血潰！口：ム曳Ａ−： 超ｆ　波処理ニＪ、　ッテ乳濁すせりｏ、１５ｘｌｆ）ＰＢＳ［０，１５ＨＮａ Ｃ１及び０．０ＩＮのＮａＪＰ０４（ｐ１１７．４）］と０．１５ｚ／の７０イ ンド不完全アジユバント（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　ｍｏｄｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ、　Ｃａ１ｂｉ。 ｃｈｅｗ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａ）とから成る約０．３ｘｌの溶液中の実施例６に記載のごとく 精製した１０ＨｇのｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓを、５匹のＢａ１ｂ／ｃ株の雌マ ウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＾ｎｎ　Ａｒｂｏｒ＋Ｍａ ｉｎｅ）に夫々注射した。マウスの背中の複数箇所に皮下注射した。１０日後、 ＭＰＬ／ＴＤＭ特殊エマルジョンＲ−７００（ＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍ ｉｅａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｍｏｎｔａｎａ ）中に乳濁させた０、３ｚｌＰＢｓ中の１０μｙのｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓが ら成るブースター免疫を各マウスの腹腔内に注射した。前記と同様にマウスの背 中の複数部位に０．１５ｚｊ！を注射し腹腔内に０．１５ｚ１を注射した。 ２０日後、マウスから採血し、血清中の抗ｒＰＤ（：Ｆ　Ｂｖ−ｓｉｓ抗体を検 定した。 プレート結合イムノアッセイを使用してマウス血清を試験した。５０μｌの抗原 溶液を室温で１晩インキユベートするコトニヨッテ、０．０３５Ｎ　ＮａＨＣＯ ｓト０．０１５Ｎ　Ｎａ２ＣＯ１中）ｒＰＤＧＦＢｙ−ｓｉｓ（７００μｇ／ｚ ｌ）を、血清学的９６ウエルプレートのウェルに結合させた。非結合抗原を除去 し、５％子ウシ血清アルブミンを含むウェル当たり２５０μｌのＰＢＳで非結合 部位を室温で１時間ブロックした。 希釈度１０−Ｉ〜１０−５でＰＢＳに希釈した５０μｌのマウス血清を、ブロッ クした抗原含有ウェルに添加し、室温で３時間インキュベートして除去した０次 にウェルをＫＰ洗浄液で３回洗浄した。　ＩＸ　１０’ｅｐ論の＋　２５■−ウ サギ抗マウス免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）（ＮＥχ１６１０、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を０．１％の子ウシ血清アルブミンと共に含む５０μ ｌのＰＢＳを各ウェルに添加した。ウェルを９０分間インキュベートし、ＫＰ洗 浄溶液で５回洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ５５００ガンマカウンタで計数した。３匹 のマウスは抗体価１０３以上の抗ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓ抗体を産生じた。 これらの３匹のマウスに対し、第一ブースターと同様のブースター免疫を採血の １週後及び採血の１０日後に各１回ずつ注射した。 ７（ｃ）　モノクローナル　体の産生：ハイブリドーマの産びスクリーニング： ｒＰＤｌｌ：Ｆ　Ｂによる最終ブースター免疫の３日後に頴管脱臼によって３匹 のマウスを殺し、７０％エタノールで洗浄した。 膵臓を無菌的に摘出し、２００単位７ｍｌのペニシリンＧと２００μ２７ｘｉの ストレプトマイシンとを添加したダルベツコ改質イーグル培地（ｔｌ：１ｂｅｏ ）を入れた（氷上の）へトリ皿に入れた。 ＩＸ臓から脂肪及び結合組織を除去し、新しい（前記の）培地で２回洗い、１０ Ｍ１の同じ培地と共に無菌ｓｔｏ■ａｃｈｅｒバッグに入れた。ｓｔｏｍａｅｈ ｅｒ装置（Ｓｔｍａｔｃｈｅｒ　Ｌａｂ−Ｂｌｅｎｄｅｒ　８０、Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）でＩＩｌ！！ｍ を９０秒間粉砕し、４層滅菌ガーゼで沢過し、得られた膵臓細胞をｌＥＣ−１１ Ｎ−ＳＩＩ遠心機で１０００ｒｐ−で１０分間遠心してペレット化した。ペニシ リン−ストレプトマイシンを含む（前記の）培地で細胞ベレットを２回洗浄し、 抗生物質を含まない培地で１回洗浄した。細胞ベレットを新しい培地に再度浮遊 させ、０．２％トリバンプルーの存在下に血球計数器で計数して細胞濃度を測定 した。 Ｂａｌｂｈ株に由来のマウス骨髄腫細胞５Ｐ２１０を、１％の熱不活性化ウシ胎 児血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＩＯＩ培地（ＮＣ−２００、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ 　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で増殖させた。Ｉ ｆｆ！臓細胞と同様に、１１０００ｒｐで１０分間遠心して細胞をペレット化し 、抗生物質を含まないダルベツコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で洗浄した。同 じ培地に再度浮遊させた後に、０．２％トリバンブルーを含む血球計数器で計数 して細胞濃度を測定した。 膵臓細胞と５Ｐ２１０細胞とを３：１の比で混合し、１０００ｒｐ−で１０分間 前記のごとく遠心した。上清流体を吸引除去し、分子量５００〜６００のポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）１５００を使用して３７℃で細胞融合を生起した。 この処理中に穏やがな撹拌を不断に維持しつつ、以下の物質を以下に指定した時 間で添加した。　ＤＭＥＭ中の１．ｏｗｌの５０％ＰＥＧを１分間にわたって添 加し１分間攪拌、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１．０ｚ１のＤＭＥＭ を１分間にわたって添加、１０％のＦＢＳを含む１．０ｘｌのＤＭＥＭを１分間 にわたって添加、１０％のＦＢＳを含む８１１のＦＢＳを１分間にわたって添加 。 得られた融合細胞を前記のごと（１１０００ｒｐで１０分間遠心し、１０％）Ｆ ＢＳト１００単位ｈｌノ’＜　ニジ’）　：／　Ｇ及ヒ１００μｇ／ｘ１のスト レプトマイシンとを含む約４５１１のＤＭＥＭに再度浮遊させた。細胞を９％の ＣＯ□で、予め平衡させた９６ウエルプレートに０．１ｗｌ／ウェルの割合で接 種し、プレートを９％のＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。 ２日目に１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のＯ，ｂ＋ｌのＨＡＴ培地（１３，６ μｇ／ｘｉのヒボキサンチン、０．１７６μｍ７ｘｌのアミノプテリン及び３． ８８μｇ７ｍｌのチミジン）を各ウェルに添加した。この培地は膵臓細胞−５Ｐ ２１０ハイブリッドを選択的に生存させ、非融合ＳＰ２１０ｍ　胞まｌｉ別ノ５ Ｐ２１０１１　ｍ　ニ敵合した５Ｐ２１０細胞をスクリーニングによって除去す る。成熟マウスに由来の非融合−次牌臓細胞は培養中に数日以上は生存しない。 ３．４．６．９及び１２日目に各ウェルから０．１ｚｌの培地を除去し、１０％ 　ＥＢＳを含ｔｒ　ＤＭＥＭ中の新しイＨＡ７０．１ｍｌを補充した。１５．１ ９．２３及び２７日目に各ウェルがら０．１ｚｌの培地を除去し、１０％のＦＢ Ｓと上記と同じ濃度のしホキサンチンとチミジンとだけを含む０．１ｚｌのＤＭ ＥＮを補充した。１８日目に、ｒＰＤＧＦ　Ｂ特異的抗体を検出するＥＬＩＳ＾ アッセイを行なって、全部のウェルの培養上清をスクリーニングした。 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＴＳ＾）を使用して抗ｒＰＤにＦ　Ｂ ｖ−ｓｉｓ抗体を産生ずるハイブリドーマを検出した。 ９６ウエルプレートのウェルを、実施例５（ｃ）のごと（，０，７ｔｔ　ｙ／ｘ ｉのｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓを含む５０μｌの炭酸−炭酸水素溶液で室温で１ 晩被覆した。抗原を除去しＦＢＳ中の５％Ｂ５Ａ２００μｌでウェルを室温で１ 時間ブロックした。各ハイブリドーマウェルから得られた５０μｌの培養流体の アリコートを、ｒＰＤＧＦＢｖ−ｓｉｓ被覆ウェル中で室温で３時間インキュベ ートして取り出し、０．０２５％のＴｗｅｅｎ　（登録商標）２０を含むＰＢＳ （洗浄液）で１回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ ｌｌ：（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍｉｎｎｂｅｉｍ　Ｂｉｏｅｈｍｉｃｉｌｓ、 　Ｉｎｄｉａｎａ−ｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）をＰＢＳで１：３００に希釈 し、各ウェルで５０ＡＬＮを室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄溶 液で５回洗浄し、脱水乾燥し、１００μｌのへＢＴＳ呈色試薬（Ｋｉｒｋｅｇａ ｉｒｄａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ％Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ＋Ｍａｒｙｌａｎｄ）で呈色反応を行なわせた。　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｎｕ ｌｔｉｓｃａｎ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅ ｌｄ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を使用し、４１４ｎ−でウェルを走査した。 スクリーニングされた４３２個のマスタープレートウェル中の１７３個のウェル が、ｒＰＤｔｌ；Ｆ　Ｂｖ−ｓｉｓ反応で有意な陽性を示した。陽性ウェルから ２２個のウェルの細胞を選択し、更に増殖させクローニングした８選択された各 ウェルに由来の細胞を夫々、３Ｘ９６ウエルに希釈し、ウェル当たり１種のクロ ーンまたはいくつかの場合にはウェル当たり少数種のクローンを産生させた。１ ０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で更に１７日間培養後、１つ以上の細胞クロ ーンを含む全部のウェルから得られた培養流体を前記のごときＥＬＩＳＡアッセ イで試験した。２２個の出発マスタープレートウェルのうちの１５個のウェルに 相当するプレートウェルにおいて抗ｒＰＤＧＦＢｖ−ｓｉｓ抗体が検出され、対 応する細胞を更にクローニングした。これらの１５個のウェルのうちで最大力価 をもつウェルに対応する細胞を選択し、単個細胞クローンを得るために再クロー ニングした。 単個細胞クローンを更にＥＬＩＳＡアッセイで試験し、出発マスタープレートの 異なる１２個のウェルに対応する培養物を最大力価をもつ産生培養物として選択 した０選択された水中で産生させた。 ７（ｄ）　モノ　ローナル　の産生　び　：選択された陽性単個細胞ハイブリド ーマクローンを培養で増殖させ、細胞を回収し、ｌＥＣ−１！Ｎ５ＩＩ遠心機で ７００ｒｐ鵬で５分間遠心し、ＤＭＥＭ（無血清）で１回洗浄し、ＰＢＳで１回 洗浄した。洗浄したハイブリドーマ細胞を、２ｘ　１０’ｌＢ胞／ｗｌの割合で ＰＢＳに浮遊させ、５Ｘ１０＠細胞を６〜８週齢の雌Ｂａ１ｂ／ｅマウス（Ｊａ ｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ％Ｍａｉｎｅ ）または同じ種の雌ＣＤＦＩハイブリッドマウスに腹腔的注射した。 注射マウスの腹水を８〜１４日増殖させた。腹水を採取し、２０００ｒｐｍ（Ｉ ＥＣ−ＵＮ−Ｓｌｌ）で１０分間遠心し、透明上清流体をモノクローナル抗体の ソースとして利用した。 実質的に実施例５（ｃ）の記載と同様のプレート結合アッセイによって腹水中の 抗ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓモノクローナル抗体の反応性及び力価を検定した。 このアッセイでは０．７μｇｏａｌのｒＰＤ（：Ｆ　Ｂｖ−ｓｉｓでプレートを 被覆し、１％ＢＳ＾を含むＰＢＳで腹水を１０倍系列希釈した。この場合、ｌ２ ｓＩウサギ抗マウスＩｇＣ抗体（ＮＥＸ　１６１、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｅｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｎ＾）を用いてウェル当たり約１０’ｃｐｍ （Ｂｅｃｋｍａｎ５５００ガンマカウンタ）のマウスモノクローナル抗体を検出 した０個々の腹水の力価を、最大結合の５０％が生じた希釈倍数の逆数で示す、 異なる１２のモノクローナル抗体産生クローンに由来の腹水の力価は１．５ｘ　 １０’〜７．５Ｘ　１０’の範囲であった。結果を表■に示す。 ハイブリドーマ腹水から得られた免疫グロブリンを２段階精製手順で精製した。 即ち、まず透明腹水を、主としてアルブミン及びプロテアーゼと結合するが免疫 グロブリンを通過させるＣｍ−＾ｆｆ１−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ）に通す。 この段階ではＰＢＳを洗浄バッファとして使用した。実施例フ（ｂ）に記載のご とく、非吸着物質を等容の結合バッファ（Ｍ＾ＰＳＩ［、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で希 釈し、１．５Ｘ６ｅｍの＾ｆｆ１−（：ｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ＾カラム（Ｍ＾Ｐ ＳＩＩ　、Ｂｉｏ−Ｒｉｄ）に吸着させた。得られた精製免疫グロブリン分画を ＰＢＳに透析し、消衰係数１．４６を用いて２８０ｎ−の吸光度から免疫グロブ リン濃度を計算した。 ７（ｅ）　ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓモノクローナル　の、性ゝヒト　ハ　由　 ＰＤＩＩ：Ｆとの　応：（実施例６（ｃ）に記載のごとき）ドツト結合イムノア ッセイの修正方法を使用し、個々のモノクローナル抗体の天然ヒト血小板ＰＤＧ Ｆ認識能を検定した。矩形ニトロセルロース紙片（２，５ａｍ”）を５つの区分 に分割した。各区分に以下の物質１種類を含む１μｌのＰＢＳ溶液を所定のパタ ーンでドツトした。 １０ｎｇのｒＰＤＧＦ　Ｂｙ−ｓｉｓ、５０ｎｌ？のｒＰＤｃＦ　Ｂｖ−ｓｉｓ 、１０ｎｇの血小板ＰＤＧＦ、５０ｎｇの血小板ＰＤ（：Ｆまたは５０ｎｙの非 関連成長因子（Ｅ［；Ｆ）。 ＰＢＳ中の１０％のウマ血清、２％のＢＳ八と共に１時間震盪してニトロセルロ ースプロットをブロックした。ブロック溶液を除去し、プロットを９個の一次抗 体（８個のｒＰＤｃＦ　Ｂモノクローナル抗体及び１つのウサギ抗血小板Ｐ［ｌ ＣＦ血清）の１つと共に３時間反応させ、ＫＰ洗浄液で洗浄した。結合した一次 抗体を二次ビオチン化つマ抗マウスＩｇＣ抗体、アビジン−西洋ワサビペルオキ シダーゼ複合体、及び、４−クロロ−１−ナフトールを含む基質呈色試薬ＨＲＰ （ＢｉｏＲａｄ　１．７Ｏ−６５３４）と反応させた。最後の試薬は、６０腫ｙ を２０ｚｌのエタノールに溶解し、６０μｍの３０％過酸化水素を含む１００ｉ ｆのＴＢＳ＜０．２Ｍ　ＮａＣｆ、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４）に希釈 して用いた。 試験した８つのモノクローナル抗体全部が１０及び５０ｎｇのｒＰＤ（：Ｆ　Ｂ ｖ−ｓｉｓの双方と顕著に反応した。８つの内の６つのモノクローナル抗体（１ ６２，３０，２０，２１９，１９１及び５２）が５０ｎｙの血小板ＰＤＣＦと反 応し、これらの６つの内の１つのモノクローナル抗体が１０ｎｇの血小板ＰＤＧ Ｆと反応した。ウサギ抗血小板ＰＤＧＦ血清は１０ｎｙの血小板由来物質を容易 に検出した。抗体と非関連タンパク成長因子との間の反応は検出されなかった。 また、還元及び非還元ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓの双方を試験した実施例６（ｃ ）に記載のごときウェスターンイムノプロットフォーマットでモノクローナル抗 体の反応性及び特異性を検定した。１２のモノクローナル抗体の全部が、１５％ の非還元ポリアクリルアミドゲル中で２５，０００及び２フ、５００ｍ−のタン パクとして泳動する非還元ｒＰＤｃＦ　Ｂｖ−ｓｉｓの主要な２つのバンドを容 易に検出したが、同じゲルを用い同じ条件下にニトロセルロースに移した還元ｒ ＰＤｃＦ　Ｂとの反応は観察されなかった。 ７（ｆ）　ｒＰＤにＦ　Ｂｙ−ｓｉｓモノ　ローナル　の、　Ｓ　、ｉプＬＩＬ ス」ＩＬ： マウス免疫グロブリンサブタイプ同定キット（カタログｎｏ、１０００３６、Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍｉｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を 使用し、選択された１２のモノクローナル抗体クローンを免疫グロブリンサブタ イプに基づいてスクリーニングした。 被検抗体の各々毎に、９６ウエルトレーの９個のウェルを（実施例５に記載のご とく）炭酸−炭酸水素バッファ中０．７μｇ／ｌｐのｒＰＤＧＦ　Ｂシーｓｉｓ を含む溶液５０μｌで１晩被覆した。ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ中の２％ ＢＳＡと共に室温で２時間インキュベートし、残存するタンパク結合部位をブロ ックした。各ウェルに、５０μｌのモノクローナル抗体１種（約０．５μｇの免 疫グロブリン）を添加し、室温でインキュベーションを３時間続行した。２００ μｍの洗浄バッファ　（１０ｍＨのＴｒｉｓ−１１Ｃ１、ｐＨ７，０，０，０５ ％のＴｗｅｅｎ　２０．０．０１％のチメリゾル（ｔｈｉｍｅｒｉｓｏｌ））で ウェルを４回洗浄した。使用説明書道りに液体に戻した５０μｐのウサギ抗マウ スサブクラス特異的免疫グロブリンの各々を、モノクローナル抗体当たり各８個 のウェルに夫々添加した。９番目のウェルには対照として正常ウサギ血清を添加 した。室温で２時間インキュベート後、前記と同様にして４回洗浄した。５０μ ｐのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを各ウェルに添加し、室温で１時 間インキュベートした。更に４回洗浄し、１００μｌの新しく調製した八ＢＴＳ −ｕ２０．（０，０３％のＨ２Ｏ２中に１ｍＭの八ＢＴＳ）を各ウェルに添加し て発色反応を行なわせた。２０〜３０分間インキュベーション後、（２，５％の ＳＤＳで）発色反応を停止させ、この色に基づいてＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔ ｉｓｅａｎ中のプレートを４１４ｎｍで読み取って定量した。その結果を表Ｉに 示す、６つのハイブリドーマがＩｇＧ１サブタイプの抗体を産生じたが、３つは Ｉｇｌｌ：２ａと分類され２つは１ｇＣ２ｂと分類された０表１における抗体価 は、最大ｅｐＨ結合の５０％が得られた希釈倍数の逆数で示す。 ７（ｇ）　ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓ　−’　の　アッセイよ（実施例４に記載 のごとき）マウスＮ１ｔｌ細胞の３トチミジン取り込みに基づく***誘発アッセ イを用い、ｒＰＤＣＦ　Ｂｖ−ｓｉｓで感作したモノクローナル抗体がｒＰＤｌ ；Ｆ　Ｂｖ−ｓｉｓの生物学的活性を中和する能力を試験した。プロティン＾− アガロースゲルカラムクロマトグラフィーを用い、異なる６つのバイプリドーマ から得られた６つの腹水の各々から免疫グロブリン分画を単離した。使用した特 殊技術は、Ｂｉｏ−Ｒａｄの＾ｆｆ１−Ｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｍ＾ＰＳ ｌ［モノクローナル抗体精製システムである。結合バッファで１＝１に希釈した ２〜５ｘ１の清澄化した腹水を、交差結合アガロースピーズに結合し、同じ会社 の結合バッファで予め平衡させた精製プロティン＾の５ｍｌのカラムに吸着させ た。約１０倍容の結合バッファで非結合タンパクをカラムから洗い落とし、結合 した免疫グロブリンをｐＨ３で溶出し、２８０ｎａの吸光度を読み取ることによ って免疫グロブリン分画の所在を検出した。プールした分画を３、ＯＮのＴｒｉ ｓバッフｙ　（ｐＨ９，５）で中和し、ＰＢＳに透析した。免疫グロブリン濃度 を測定した。 精製したモノクローナル免疫グロブリンの系列希釈液を８日ｇのｒＰＤＧＦ　Ｂ ｖ−ｓｉｓと共に４℃で１２時間インキュベートし、各混合物を実施例４に記載 のごとき標準***誘発アッセイのバイオアッセイウェルの各々で使用した。クロ ーン＃１６２に由来の抗体は３日−チミジン取り込みに対するｒＰＤＧＦ　Ｂの 作用を最も有効に中和し、１００ｎｙ未満で活性を示した。クローン１５５．１ ３３．５２及び３０に由来の抗体は中程度の活性を示１　したが中和効果は維持 していた。クローン２３２は活性を全く示さなかった。 ７（ｈ）　モノ　ローナル　の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　：モノクローナル抗体腹水の 免疫グロブリン分画を１２．５％ゲルの５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。約２μｇ の各免疫グロブリンを非分別腹水に由来の同量の免疫グロブリンと比較した。ゲ ルで使用する前に、５％の２−メルカプトエタノール中で１００℃で５分間処理 することによって標本全部を還元した。実施例６（ｄ）に記載のごとくゲルの電 気泳動及び銀染色を行なった。染色されたゲルは、全部の免疫グロブリン分画が 高純度であることを証明し、また充填された量から予想された量のＨ鎖及びＬＨ のＩｇＧが存在していた。検定した免疫グロブリン標本の各々は、ゲル上で夫々 ｓｏ、ｏｏｏ及び２５，０００の予想分子量の位置に泳動したＨ鎖成分及びＬＭ 酸成分含んでいた。 夾１」Ｌも ｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓモノ　ローナル　ポ１　ローナルたＰＤＧＦイムノア ッセイの 本発明のｒＰＤｃＦ　Ｂモノクローナル及びポリクローナル抗体を種々の組み合 わせ及び変形で使用しまた種々の検出手順を使用することによって、感度が高く 特異性に優れたイムノアッセイを行なうことが可能である０本発明は、本文中に 記載の特定実施例に限定されることなく、本発明の天然非還元二量体ＰＤＧＦに 対するモノクローナルの°可能な組み合わせ及び変形による使用をすべて包含す る。かかるアッセイはいくつかの病理状態、例えばある種の形態の癌の診断及び 予後の予想に使用され得る。 Ｎｕｎｃ　９６ウエルマイクロタイタープレートのウェルで０．０５Ｍの炭酸ナ トリウム（ｐＨ９，２）中に５μｇｌｌｌの精製モノクローナル抗体１６２（５ ０μりを室温で１晩インキユベートすることによって吸着させた。溶液を吸引し 、残りのタンパク吸着部位を１５０μｌの２％ゼラチンで室温で４５分間ブロッ クした。溶液を吸引し、ウェルを０．０２５％Ｔｗｅｅｎ　８０（登録商標）含 有のＰＢＳで１回洗浄した。　０．０２５％のＴｗｅｅｎ　８０と０．２％のゼ ラチンとを含むＰＢＳ中の５０μｌの抗原を各ウェルに添加し、室温で１．５〜 ２時間インキュベートした。 抗原溶液を除去し、ウェルを０．０２５％丁ｗｅｅｎ　８０含有のＰＢＳで１回 洗浄した。　ｒＰＤＧＦ　Ｂで感作したウサギポリクローナル抗血清を、０．０ ２５％丁ｗｅｅｎ　８０と０．２％ゼラチンとを含むＰＢＳ中で１：１０００に 希釈し、各ウェルに５０μｌずっ添加した。室温で１〜１．５時間インキュベー ション後、溶液を除去した。 ウェルを０．０２５％丁ｗｅｅｎ　８０含有のＰＢＳで１回洗浄した。西洋ワサ ビペルオキシダーゼに結合した市販のヤギ抗ウサギ免疫グロブリン製剤を、０． ０２５％丁ｗｅｅｎ　８０と０．２％のゼラチンとを含有するＰＢＳで１：４０ ００に希釈し、各ウェルに５ｏμｌずっ添加した。１〜１．５時間インキュ−ベ ーション後、溶液を除去し、０．０２５％丁−ｅｅｎ　８０含有のＰＢＳでウェ ルを４回洗浄した。 ＾ＢＴＳ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ＾ 及びＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ％Ｍａｒｙｌａｎｄ）を新しく１：１比で混合し 、１００μｌを各プレートに添加した。基質添加の５〜２０分後にＴｉｔｅｒｔ ｅｃｋ　Ｍｕｌｔｉｓｅａｎ　ＥＬＩＳ＾プレートリーダーで４１４１−の各ウ ェルの吸光度を測定した。このアッセイで作成された代表的標準曲線を第１２図 に示す。 えＬＡＬ モノクローナル　−ア　ロースアフィニーイ力ラムの構築　びｔらし　がらｒＰ ＩＨ：Ｆ　Ｂｙ−ｓｉｓを　るための・精製したモノクローナル抗体免疫グロブ リン５２及び１６２を、ＣｎＢｒ活性化５ｅｐｂａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂに 結合してアフィニティカラムを作成した。実施例６（ｄ）に記載の手順で結合を 行なわせる。　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂに対する免疫グロブリンの比は、モノ クローナル抗体５２ではＩＭｌの５ｅｐｈａｒｏｓｅ当たり３．５Ｈ、モノクロ ーナル抗体１６２では３．Ｏｗｇ／ｍｌであった。 ｒＰＤＧＦ　Ｂ産生細胞（例えばＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓｉｓ、　Ｃｌ０− ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓまたはＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｃｖ−ｓｉｓ）培養培地か らｒＰＤＧＦ　Ｂをアフィニティ精製するために、モノクローナル抗体５２及び １６２のカラム（ｒｓｅＪ）ｈ５２Ｊ及びｒｓｅｐｈ１６２」）を使用するとよ い、２つのモノクローナルアフィニティ力ラムの操作は、実施例６のウサギ抗Ｃ ＧＰＩ免疫グロブリンアフィニティカラムと実質的に同じである。０．１〜３゜ ０１のＣＩＯｒＰＤＧＦ　Ｂ培養流体をアフィニティ力ラム（１０ｚｆｆｉ）に 吸着させ、流速３０〜４０ｘｌ／時のバッフｙＦ及びＧで洗浄し、１．ＯＮの酢 酸、０．１５ＨのＭａｃｌで溶出した。 Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパクアッセイ、２トチミジン取り込みに基づく***誘発ア ッセイ、またはいくつかの場合にはドツト結合イムノアッセイによってタンパク 含有（ＰＤにＦ）分画の所在を検出した。　ｒＰＤｃＦ　Ｂ含有分画をプールし 保存して、後述するごとき分析に使用した。 え１燵徨 ｒＰＤ（：Ｆ　Ｂの、　′ １０（Ａ）　−び　−ｒＰＤＧＦ　Ｂの５ｆｌＳ−ＰＡＧＥ　：５ｅｐｈ５２ま たは５ｅｐｂ１６２アフイニテイ力ラムでクロマトグラフ精製したｒＰＤｃＦ　 Ｂの純度を評価するために、これを５ＤＳ−ＦＡにＥで分析した。少量のタンパ クを検出できる技術である銀染色、またはクーマシーブリリアントプルー染色に よって非標１１ｒＰＤＧＦ　Ｂはを検出した。一般には銀染色のほうが感受性が 高いが、ある種のタンパクはクーマシー染色のほうがよく検出できる。典型的な 結果によれば、ｒＰＤＧＦ　Ｂポリペプチドのみの存在が判明した。これらのペ プチドのサイズは、ｉｎ　ｖｉｖｏｌ［ｍタンパクをＣｌ０−ｐＤＳＶＥ／ｅ− ｓｉｓ培地（実施例４）に由来の抗ＰＤにＦ血清によって免疫沈降させたときに 検出されるペプチドのサイズと同じであった。かがる高純度調製物中でその他の タンパクは全く観察されなかった。 ２μｇのタンパクをこのゲルに充填したので、これらの条件下の感度は２０〜５ ０ｎｇであり、ｒＰＤｃＦ　Ｂの純度は９５％を上回ると評価できる。　ＣにＰ Ｉニワトリ成長ホルモン／ＰＤ［；ＦＢ合タンパク（実施例５）に対するウサギ ポリクローナル抗血清を使用してこのｒＰＤｌｌ：Ｆ　Ｂ調製物のイムノプロッ ト分析（実施例６ｃ参照）を行なった結果、銀染色によって観察された全部のタ ンパク種がＰＤＣＦ関連であることが判明した。 アフイニティ力ラム精製ｒＰＤＧＦ　ＢをＢｏｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ の方法、１雌、によってヨウ素標識した。標識ｒＰＤｃＦ　Ｂ（２ｘ１０’ｅｐ ｍ）を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、乾燥し、Ｘ線フィルム に１６時間露光した。オートラジオグラムで検出されたバンドだけがｒＰＤ（： Ｆ　Ｂポリペプチドに対応した。これらの条件下でバンド内の５０ｅｐｍまで検 出可能であったので、この分析は、これらの方法で精製されたこの特定のｒＰＤ ＧＦ　Ｂバッチの純度が９９％を上回ることを証明ウサギ免疫グロブリンアフィ ニティ力ラムから回収したｒＰＤｃＦ　Ｂ分画とプールされた分画標本とに対し 、実施例４＆に記載のごとき***誘発アッセイによって生物学的活性を試験した 。　ｒＰＤｔｌ：Ｆ　Ｂ含有アフィニティ力ラム分画の全部が***誘発アッセイ に活性であり、バイオアッセイ標準曲線から計算した濃度は、ＢｉｏＲｉｄタン パクアッセイ及びドツト結合イムノアッセイによって測定された濃度と十分な相 関間係を示した。ｒＰＤＧＦ　Ｂの特異的活性は、ヒト血小板がら精製されたい くつかのＰＤＧＦバッチと同様であった。 １０（ｃ）　Ｎ−アミノ　”　： 実施例１０に記載のごとく精製したｒＰＤＧＦ　ＢをＮ−末端配列解析し、ｒＰ ＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓの最初の１４個のアミノ酸を５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓ ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−＾１ｔ−Ｎｅｔ−１ １ｅ−＾１ａと同定した。これらはヒト血小板がら精製されたＰＤ［：Ｆ　Ｂｊ ＩのＮ−末端の１４個のアミノ酸（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等、１雌）と同じである。 少ない割合ではあるがある程度のアミノ末端がアミノ酸３３（Ｔｈｒ−Ａｓｎ− ＾！ａ−＾５ｎ−Ｐｈｅ）及びアミノ酸８０（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ −Ｐｈｅ）で開始する。これも血小板がら精製したＰＤＧＦにおいて観察された 結果（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等、前出）と同じであった。ｒＰＤＧＦＢｖ−ｓｉｓの アミノ末端配列解析の結果も同様であったが、アミノ酸６及び７はＴｂｒ−１１ ｅでなく　５ｅｒ−Ｖａｌであり、これはこれまでに発表された結果（Ｄｅｖａ ｒｅ等、前出）と一致した。これらの結果は、ｒＰＤＧＦ　ＢがＣＯＯ細胞中で はヒト血小板中と同様にアミノ末端でプロセスされることを示す。 アミノａ３３及び８０で開始する少量のアミノ末端は、ＣＩＯ細胞及び血小板の 内部で検出された特異的タンパク分解酵素の作用の結果生じたと推定される。あ る種の目的のためには、これらの内部開裂を含まないｒＰＤＧＦ　Ｂ産物を得る ことが望ましい、そのためには、関与する特異的タンパク分解酵素による認識を 阻止するようにアミノ酸配列を開裂部位で変性するとよい、従って、特定アミノ 酸残基３２．３３．７９及び／または８０とこれらに直ぐ隣接の残基に関しては 、該残基をコードするＤＮＡ配列を変更することによって変性し別のアミノ酸に してもよい。 １０（ｄ）　・　量の　。 タンパクのグリコシレージョンには２つのタイプがある。 一般的なタイプはＮ−結合型であり、糖残基が配列ａｓｎ−Ｘ−ｔｈｒ／ｓｅｒ をもつ部位でアスパラギンに結合している。いま１つのタイプは〇−−合型であ り、糖残基がセリンまたはトレオニンに結合している。このタイプのグリコシレ ージョンにはその他のコンセンサス配列は全く同定されなかった。 ヒト血小板から精製されたＰＤＧＦは約７重量％の炭水化物を含有する（Ｄｅｕ ｅｌ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６：８８９６（１９８１））、へ鎖と ＢＭとの間の糖残基の分布は未だ解明されていない。 しかしながら、配列ａｓｎ−Ｘ−ｔｈｒ／ｓｅｒがＢ［の内部で発生しないので Ｂ鎖がト結合炭水化物を含まないことは推定できる。 従って、血小板ＰＤ（：Ｆの８Ｍ中の〇−結結合グリコリレーション有無を判断 するだけでよい。 Ｃｌｌ０細胞によって産生されたｒＰＤＧＦ　Ｂｙ−ｓｉｓが炭水化物を含有す るか否かを判定するために、２つのタイプの分析を実施した。第１タイプの分析 では、グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦまたは０− グリカナーゼと共にインキュベートした後に５ＯＳ−ＰＡＧＥ中のタンパクの電 気泳動移動度の変化をモニタした。これらの実験の結果は、タンパクの微量成分 だけがこれらの酵素処理によって変性されることを示した。 タンパク中の炭水化物を分析する第２タイプの方法では、酸メタノール分解によ って糖残基を遊離させ、Ｚａｎｅｔｔａ等、Ｊ、Ｃ上ユ、４１え、工６９：２９ １（１９７２）の手順でガスクロマトグラフ分析することによって定量する。こ の分析の結果は、フコース０．０２５％、ガラクトース０．１２５％ｗｔ／ｗｔ 、マンノース０．０７５％、Ｎ−７セチルグルコサミン０．０３８％、シアル酸 Ｏ，０Ｓ２５％であった。 これらのデータから、ＣＨＯ細胞によって産生されたｒＰＤｌ：ＦＢｙ−ｓｉｓ が１重量％未満の炭水化物を含有するという結論が得られた。 １ｏ（ｅ）　Ｌ仁１： ヒト血小板から精製されたＰＤＧＦは線維芽細胞、平滑筋細胞、顆粒球及び単球 に対して走化性であることが証明されている（Ｄｅｕｅｌ等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉ ｎｖｅｓｔ、　６９：１０４６（１９８２）、Ｓｅｐｐｍ等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、　９２：５８４（１９８２）、にｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ等、Ｐｒｏｅ　 。 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ″７８：３６６９（１９８１））、　ｒＰ ＤＧＦ　Ｂがこの特性を共有するか否かを判断するために、Ｄｅｕｅｌ等、旺、 に記載の走化性アッセイで試験した。　ｒＰＤにＦ　Ｂは上記のすべての細胞型 に対して、ヒト血小板から精製されたＰＤＧＦと等しい程度の走化性をもつこと が判明した。 １０（ｆ）　ｒＰＤＧＦ　Ｂの１ｎｖｉｖｏ′３、ＱＸ３．５ｃｍのステンレス スチーｌレワイヤクロス片（４０メツシユ、メツシュワイヤ０．０１０）によっ て開腔を作成した。このワイヤクロスを棒の周囲に巻き付けて長さ３．５ｃ−及 び直径０．９５ｃｍの円筒を形成した０円筒の一端を圧縮してとがっていない末 端を形成し、開放末端にシリコーンゴム隔膜を取り付けた。完成した開腔を熱殺 菌（１２０℃で３０分間）した後に埋め込んだ。 雄スプリーグ・ドーリーネズミ（３５０〜４００ｇ）の背中の皮下の筋肉層のレ ベルまで２ｃｍナイフで切開し鈍的！ＩＩＷによって形成したポケットに開腔を 埋め込んだ、開腔の埋め込み後にステンレススチールクリップで創傷を閉鎖した 。このようにして各試験動物毎に、肩に２つ、後房に２つの開腔を埋め込んだ。 開腔埋め込み後３日目から毎日０．１ｚｌの対照ベヒクルまたは０．１ｚ１の試 験製品を、シリコーンゴムプラグを貫通する皮下注射針によって開腔に注入した 。開腔の解剖学的位置が結果に影響を与えることを避けるために注射パターンを 動物毎に系統的に変更した。９回目の注射の２４時間後に開腔を取り出し、風袋 計測した計量ボートに開腔の中味を掻き出して正味重量を計量した。更に、Ｂｉ ｏＲａｄタンパクアッセイによって総タンパク、　Ｖｙｔａｓｅｋ、＾ｎａ１． Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１２０：２４３（１９８２）によって総ＤＮＡ及びＢｅｒｇ 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　８２：３７２（１９８２）の方法によっ て総ヒドロキシプロリンを定量した。 表■は、毎日５．０．ｇ　、のｒＰＤＣＦ　Ｂｅ−５ｉｓの投与が開腔内部の肉 芽組織の蓄積に与える効果を示す、これらのデータは、蓄積組織の総正味重量が 対照ベヒクルを注射した開腔から得られた重量の約３倍になることを示す、開腔 内部に蓄積したタンパク、ＤＮＡ及びヒドロキシプロリンの総量についても同様 の増加が観察された。 」Ｌ の　−組　の−に　るｒＰＤＧＦ　Ｂｅ−５ｉｓの　果ｌＬｍタンパク　公人　 ヒドロ　シブロリン（ｚｙ）　（ｚｙ）　（ｙ）　Ｃｘｙ’）ベヒクル　９２± ２３　４．２±０．８　１２５±３１　２５４±８７ｒＰＤにＦ　Ｂ　２４４ｆ ３０　８．７＋０．８　４４４±５６　６９７１２５０（５，０μＦＩ） 本平均上Ｓ、Ｅ、Ｍ。 ３００〜３５０．の若い雄スプリーグ・ドーリーネズミ（Ｓａｓｃｏ、Ｉｎｃ、 、Ｏｍａｈａ、　ＮＥ）をペンタバルビトール（１６１ｆＩ）で麻酔し、中央線 の両側で皮Ｊｉ１．５ｃｍの深さまで６ｃｍ切開した。　ｒＰＤにＦＢ添加また は不添加の１０ｘｇ／ｘ１のウシコラーゲン懸濁液（χ１ｄｅｒｅｉＩ［（登録 商標）、ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、Ｃ ＾）を傷口の縁端に塗布した（０．１ｗｌ／創傷）、３つの外科クリップで創傷 を癒合した。採取のときにラットの青中の皮膚全部を切開した。平行外科ナイフ を備えた型板を使用し。 各切開毎にクリップ間で８鵬醜の細片標本を２つ採取した。 創傷皮膚によって許容される最大負荷をＴｅｎｓｏｍｅｔｅｒｌＯによって測定 した。ａ片標本を毎分１０ｍ−ずつ伸ばしながら測定値を得、最大負荷をグラフ に記録した。感染、過度の出血または癒合不良（全部の創傷の５％未満）を示し た創傷では破壊強さを測定しなかった。 この試験の結果を表■に要約する０表■は、ｒＰＤｔｌ、Ｆ　Ｂが記載の方法で ≧５μｙ／ｎ傷の投与量で投与されたときに治癒創傷皮膚の引張強さの増加を有 意に促進することを証明する。 宍」Ｌ ｒＰＤＧＦ　Ｂに　る５　ａ　’　ｆ）　’成長乱Ｌ　ＬｄＬｎｌＩｉＬ札皿１ μｍ　区ＱＬ］０−−ん０−− ｒＰＤｌｌ：ＦＢｖ−ｓｉｓ　２０　８　２２８±８１　１９２　０．００５１ １９＋６１ ｒＰＤｃＦＢｃ−ｓｉｓ　１０　１３　２４９±９０　１９３　０．０２５１２ ９±３３ ５　１０　２２１±７２　１４３　０．０２５１　１５　１６６±５０　１０８ 　Ｎ５１５３±６１ 犬光」１１ 創傷治癒の遅れは多くの疾患においてその病気に関連する特徴として現れる。従 来の例として、インシュリン依存性糖尿病では循環障害と単球／マクロファージ 機能が創傷治癒の遅れと関連する。これらの疾患では創傷部位に対する成長因子 の配給量が減る０組換えヒトＰＤＧＦｂ−ｓｉｓを直接配給することによって上 記状態が改善できるか否かを確認することが重要である。このために、ラットを 計量し、開腔の皮下埋め込みと同時にストレプトシトシン（７０ｍｇ７Ｋｆ１体 重）を−回靜注して糖尿病にする。開腔は実施例１０（ｆ）と同様に形成する。 埋め込みの３日後から開腔に０．１ａｌの対照ベヒクルまたは１．０μｇの組換 えＰＤＩＩ：Ｆｂ−ｓｉｓを含むベヒクルを毎日注射する。この処置を連続９日 間継続し、ここでラットを再度計量し、血液標本を採取し、血漿ブドウ糖を分析 し、開腔を取り出して肉芽組織形成を観察する０次に、これらの観察によって得 られた結果を開腔に対照ベヒクルを注射した非糖尿病ラット群で得られた結果と 比較する。 表■に示すごとく、ストレプトシトシンで予め処置したラットでは謬著な体重減 と開腔肉芽組織の有意な減少とを伴う重症の高血糖症が観察された。従って、糖 尿病ラットの血漿ブドウ糖は非糖尿病群に比較して約４倍に上昇していた。更に 、糖尿病動物は試験中に３０〜４０ｇの体重減を示したが、非糖尿病群は同量の 体重増加を示した。開腔にＰＤＧＦｂ−ｓｉｓを注射してもこれらの糖尿病的結 果は変化しなかった。対照的に、組換えＰＤＧＦｖ−ｓｉｓの局部投与は、糖尿 病に起因する総タンパク、ＤＮＡ及びヒドロキシプロリンの開腔内蓄積量の減少 を完全に覆した。これらの結果は、この組換え成長因子の局部投与によって、関 連疾患の全身性病理生理を変化させずに疾患例えば糖尿病に伴う創傷治癒の遅れ を改善できることを示す。 え１１■ ウ　ち　、　の　療にお番　るｒＰＤｃＦ　Ｂの予備実験でｒＰＤＧＦ　Ｂがウ サギ耳打ち抜き標本の創傷の治癒を促進することが証明された。この実験では、 軟骨まで達する直径６１のＭ１ｍプラグを摘出した０組織の再成長は肉芽組織及 び上皮の双方を含んだ、第１３図に示すごとく、創傷形成後の種々の時点で各創 傷の中央断面の３箇所で測定を行なった。２つの測定値、即ち、八−の　庁及び 八−組　の〒進　日の　は肉芽組織の成長と関連する。　３　ヤップを示す第３ の測定値は、創傷の上皮の再生と関連する。 これらの実験の予備結果は、創傷形成直後にコラーゲンベヒクルに入れたｒＰＤ ＧＦ　Ｂを１回適用することによって３つのパラメータ全部に効果が生じること を示す、７日後に対照創傷の肉芽組織の最大深度は０．７６±０．３１であった が、ｒＰＤＧＦ　Ｂ処置創傷では深度が１．０２±０．０６ｍｍ（Ｐ＜　０．０ ００１）であつた、対照の肉芽組織では前進端間の間隔が４．６８±０．１２ｍ −であり、ｒＰＤＧＦ　Ｂ処置創傷ではこの間隔は４．０５±０．１７ｍｍ（Ｐ ＜０．００４）であった、対照創傷の上皮再生ギャップの平均間隔は１゜７８± ０．２１ｍ−であり、ｒＰＤＧＦ　Ｂ処置創傷では平均間隔は１．１０±２２■ であった。処置創傷の多くが７日目に完全に上皮再生したので同種の統計学的分 析は無用であった。測定の変形例として、完全に上皮再生した創傷の数（ｎ＝　 １８）を測定した。対照では２４％が完全に上皮再生し、ｒＰＤＧＦ　Ｂ処置創 傷では５６％が完全に上皮再生した。これらの結果は、肉芽組織及び上皮組織の 双方の再生が望まれる非治癒腫瘍のごとき創傷の治療にｒＰＤＧＦ　Ｂが有用で あることを示唆する。 本発明を特定実施例に基づいて上記に説明した０本文の開示に基づいてその修正 及び改良が可能であることは当業者に明らかであろう。 例えば、（ｖ−ｓｉｓ、　ｃ−ｓｉｓまたはその他の変種及び類似体を問わず） ＰＤにＦの＾及び／またはＢｆｉに存在するエピトープを認識するモノクローナ ル抗体をＰＤＣＦの精製に使用することも可能である。更に、ＰＤにＦは結合組 繊細胞に対する主要マイトジェンであるから、本発明の高度に精製されたＦＤＣ Ｆを創傷治癒の刺激に使用することも可能である。　ＰＤＧＦは創傷の部位での み血小板から遊離され、結合組繊細胞に対する***誘発性及び走化性を示す、１ つの試験では、複数の別のホルモンの１種を使用したときよりもＰＤＧＦ処置し たほうが創傷におけるコラーゲン合成が進行することが証明された。 従って本発明は、請求の範囲で規定された本発明の範囲に包含されるすべての変 更及び改良を包含すると理解されたい。 ：ＣＣＡＡＧＧＧＣ コｒｏＬｙｓＧ１ｙ ：’！ＴＧＧＡＧＣＣ −＠ｕＧｌｙＡｌａ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ 国際調査報告 ＰＣＴ／（ＪＳｌ＝１８１００７Ｌ）１１ＰＣＣｏｎｔｚｎｕｅｄ ＵＳ、　ＣＬ：　３ｔＪ／４１３；　４３５／６８；　４３５／９１；　４３５ ／１７２．ｉ、　４３５八７２．３゜４３５／２４０．上、４３５７３２０ Ｉ工、　ＦｌｅＬｄｓ　５ｅａｒｃｈ　ｃｏｎｔ。 ９３５／２２．　２３．　２４．　３２．　４７．　５９．　６０．　７０．　 １０２．　１０６−−畷ｗ−ａ＋、ｗａｅａｓ□ａ−ｗ、ｆ’ｃＴ／ｌＪｓ８８ １０ｏ７０１

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．ＰＤＧＦのＢ鎖に検出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結 合するエピトープを与えるためのｒＰＤＧＦＢの構造的コンホーメーションの十 分な部分を有し、天然ＰＤＣＦの生物学的特性を１つ以上有し、還元ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＦによる測定において９５％を上回る純度をもつことを特徴とする精製単離 ポリペプチド。
2. ２．ポリペプチドが、自律複製ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに担持 された外来ＤＨＡ配列が原核細胞または真核細胞によって発現された産物である ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．ポリペプチドが、第１図に示すｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓまたはその任意の 変種の構造的コンホーメーションをもつことを特徴とする請求項１に記載のポリ ペプチド。
4. ４．ポリペプチドが、第２図に示すｒＰＤＧＦ　Ｂｃ−ｓｉｓまたはその任意の 変種の構造的コンホーメーションをもつことを特徴とする請求項１に記載のポリ ペプチド。
5. ５．有効量の請求項３のポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促 進方法。
6. ６．有効量の請求項４のポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促 進方法。
7. ７．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９３５７として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
8. ８．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９３５４として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
9. ９．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９３６１として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
10. １０．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９３５５として寄託されたハイブリドーマによって 発現されるモノクローナル抗体。
11. １１．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９３５６として寄託されたハイブリドーマによって 発現されるモノクローナル抗体。
12. １２．ＰＤＧＦのＢ鎖に検出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に 結合するエピトープを与えるためのｒＰＤＧＦＢの構造的コンホーメーションの 十分な部分を有するポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定において９５％を上回 る純度まで精製するために、−ｒＰＤＧＦ　Ｂｃ−ｓｉｓまたはｒＰＤＧＦ　Ｂ ｖ−ｓｉｓ中で検出されるエピトープを少なくとも１つ有するポリペプチドの合 有溶液と基質結合モノクローナル抗体とを接触させ、一基質結合モノクローナル 抗体からポリペプチドを溶出する段階を含むことを特徴とする前記ポリペプチド 精製方法。
13. １３．前記接触段階が、請求項７〜１８のいずれか一つの抗体を結合したカラム にポリペプチド含有溶液を通す段階から成ることを特徴とする請求項１９に記載 の方法。
14. １４．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３５９として寄託されたｒＰＤＧＦ　Ｂｖ−ｓｉｓ産 生細胞系［ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｖ−ｓｉｓ］。
15. １５．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３５８として寄託されたｒＰＤＧＦ　Ｂｃ−ｓｉｓ産 生細胞系［ＣＨＯ−ｐＤｓＶＥ／ｃ−Ｓｉｓ］。
16. １６．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３６０として寄託されたｒＰＤＧＦ　Ｂｃｖ−ｓｉｓ 産生細胞系［ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓｉｓ］。
17. １７．第１０図のアミノ酸配列を有するｒＰＤＧＦ　Ｂｃ−ｓｉｓ／ｒＰＤＧＦ Ｂｖ−ｓｉｓ融合ポリペプチド。
18. １８．請求項１７の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント。
19. １９．請求項１７のＤＮＡセグメントを含む形質転換ベクター。
20. ２０．請求項１９のベクターによって形質転換された細胞系。
21. ２１．細胞がＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３６０として寄託されていることを特徴とする 請求項２０に記載の細胞系。
22. ２２．第１１図のアミノ酸配列をもつｒＰＤＧＦ　Ｂ／ＣｇＨ融合ポリペプチド 。
23. ２３．請求項２２に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント。
24. ２４．請求項２３のＤＮＡセグメントを含む形質転換ベクター。
25. ２５．請求項２４のベクターによって形質転換された原核または真核細胞。
26. ２６．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．６７３５２で寄託された請求項２５に記載の細胞。
27. ２７．０．４μｇ／１０６細胞／２４時を上回る量でｒＰＤＧＦ　Ｂを産生する ことを特徴とするＣＨＯ細胞系。
28. ２８．ｒＰＤＧＦ　Ｂ遺伝子を含むＣＨＯ細胞系からｒＰＤＧＦ　Ｂポリペプチ ドを発現させることを特徴とするｒＰＤＧＦＢの産生方法。
29. ２９．非グリコシル化ｒＰＤＧＦ　Ｂ。