JPH05502366A - 遺伝子工学処理した大腸菌菌株によるエタノール製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願に対するクロスリファレンス 本発明は１９８８年８月３１日に出願された継続中の米国出願第２３９．０９９ 号の一部継続出願である。

発明の背景 解糖の間に、纏＃＠はグルコースなどの単純な糖をピルビン酸に転換し１．Ａ　 Ｔ　ＰとＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの正味の製造を伴う。

酸化的燐酸化のための、機能する電子伝達系の非存在下では、続けて解糖及びＡ ＴＰ生産を行なうための絶対要求であるところの、ＮへＤ゛を再生する短い経路 で少なくとも９５％のピルビン酸が消費される。これらのＮ　Ａ　Ｄ゛再生系の 廃物は一般に発酵生産物と呼ばれている。

異なる族によって生産される種々の発酵生産物について、微生物は特に幡々多擾 である（にｒｉｅｇ、Ｎ、Ｒ，及び、１．ｃ。

Ｈｏ１ｔ＆Ｉ　Ｃ１９８４１系統的微生物学のバーギーのマニュアルＣＢｅｒｇ ｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ ｇｙ）ボルチモアのウィリアム　アントウィルキンスカンパニー、）。

これらの生産物には有機酸、例えば、ラクテート、アセテート、サクシネート及 びアチレート並びに中性生成物、例えばエタノール、アタノール、アセトン及び ブタンジオールが含まれる。実際、細菌からの発酵生産物の多種多様の物は、分 類学に於ける主要な決定因子としての用途につながっている（上記にｒｉｅｇ及 びＨｏ１ｔ　［１９８４］　）。

発酵の最終生産物は、いくつかの基本的な特徴を共通して有している。これらは 最初に製造された条件下では、比較的無毒であるが、蓄積してくるとより毒性と なる。

これらの直前の前駆体が解糖の間、一時的な電子受容体として役目をしたので、 これらはピルベートよりも還元されている。これらの発酵生栄物の微生物的生産 は、生物工学の最も古く、そし・て最も経済的に成功を収めた用途の基礎をなし 、それには乳製品、肉、飲料及び燃料が含まれる。近年、いくつかの微生物の遺 伝子的な構成を選択的に変更する研究を可能とする新しい技術の結果として、生 物工学の分野で多くの進歩がなされた。

大曙菌は生物工学に対する遺伝子のクローニング及び修飾のための重要なビヒク ルであり、そして組替え製品のａ造の為の最も重要な宿主である。近年組替えＤ ＮＡ研究のために使用された宿主の範囲は、種々の細菌、酵母、真菌類およびい くつかの真核細胞を含むように拡大されている。ここに記載される本発明は、修 飾された宿主によって特定の有用な生産物を製造することを促進するための朝替 えＤ　Ｎ　Ａ技術の使用に間している。

本発明の宿主を修飾するのに使用されたＤＮＡは、スイモモナス　モビリス（Ｚ ｙｍｏｍｏｎａｓ　ｗ＋ｏｂｉｌｉｓ）から単離されたものである。Ｚ、モビリ スは樹液及び蜜の中に一般に見出される通常の代謝特性を有する微生物である。

Ｚ。

モビリスはバルキ（ｐｕｌｑｕｅ）　（メキシコのアルコール含有飲料）を製造 するための７ガバ（竜舌蘭頌の植物）の樹液の発酵のための天然の接種菌及びし ゅろ酒の接種菌として長い間部用されてきた。またこの生物は、燃料のエタノー ル製造に使用され、そして酵母よりも実質的に高いエタノール生産率が可能であ ると報告されてきた。

Ｚ、モビリスは栄養的に単純で、アミノ酸ヌクレオチド及びビタミンを合成する ことができるが、この生物によって代謝されろ塘の範囲は非常に限られており、 通常はグルコース、フラクトース及びシュークロースからなる。これらの糖の発 酵からの基質レヘルの燐酸イヒは、生合成及び恒常性（ホメオスタシス）のため の唯一のエネルギー源である。Ｚ、モビリスは発酵可能な糖なしではニュートリ エンドブロスなとの栄養に冨んだ培地の中でさえも生育できない。

Ｚ、モビリスはｍｌＬ的燐酸化の為の作用系を欠いている絶対的な発酵細菌であ る。この生物はサツ力ロミセスセレビンアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のように、主要発酵生産物としてエタノール及び二酸化炭 素を！！遺する。Ｚ、モビリスはエタノールを二つの酵素活性しか必要としない 短い経路によフて生産する。すなわち、ピルベートデカルボキシラーゼとアルコ ールデヒドロゲナーゼである。ヒルＪ＼−トデカルボキシラーゼはこの経路で鍵 となる＠素であり、ヒル・＼−トの流れをエタノールに転換する。ピルベートデ カルボキシラーゼはビルｌベートの非酸化的なデカルボキシラーシヨンを触媒し 、アセトアルデヒドと二酸化炭素を生産する。二つのアルコールデヒドロゲナー ゼのアイソザイムがこの生物中に存在し、発酵のフにアセトアルデヒドのエタノ ールへの還元を触媒し、これにＮＡＤ　ＨのＮＡＤ＝への酸化が伴う。

細菌のアルコールデヒドロゲナーゼは多くの生物に共通しているが、ピルベート デカルボキシラーゼは少しの細菌しか有していない。エタノール生産者としての 商業的なそれの用途を補強するためのＺ、モビリスを修飾する試みは、わずかの 成功しか達成していない。

多くの燃料エタノールはトウモロコシ澱粉又はさとうきびのシロップ中のヘキソ ース糖から現在製造されており、サツカロミセス　セレビシアエ又はズイモモナ ス　モビリスの何れかを利用している。しかし、これらはバイオマス糖として比 較的高価な供給源であり、食料としての競走的な価値を有している。澱粉と糖は 植物中の全炭水化物のわずかの部分でしかない。茎、葉、外皮、さや、穂髄なと の中の植物の炭水化物の主要な形態は、ｍ造壁の重合体であるセルロール及びセ ミセルロースである。

これらの重合体の加水分解は、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクト ール及びアラビノールを含めた天然の糖の潰合物を放出する。これらの糖を任意 の他の単一の価値ある生産物のエタノールに迅速かつ効率的に代謝できるとんな 一つの生物も天然に見出されていない。

Ｚ、モビリス中のアルコールデヒドロゲナーゼ１１及びビルヘートデカルボキン ラ〜ゼに対しコートしている遺伝子は、大腸菌中て別個にりＣ−ン化され、特性 が調べられ、そして表現されている（ブロワ、６．及びＨ，シャーム［１９８６ ］Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ　、１４６：＋０５−１１０ニブロウ、Ｂ、及 びＩ。

シャーム［＋　９８６コＡｒｒｈ、Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ、＋４４：２９６−３０ １：コンウニ（、Ｔ、、Ｙ、Ａ、ｔ　スマン、、１．１．コｆ　ン、Ｅ、Ｍ、ホ フマン及びり、０゜イングラム［１９８７］Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋６９： ９４９−９５４：コンウェイ。

Ｔ、Ｇ、Ｗ、スウ、　ル、ｖ、ｚ、オスマン及びＬ　、　Ｏ、イングラム［：１ ９Ｂ？］Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、１６９：２５９＋−２５９７＋ネール、Ａ 、Ｄ、、Ｒ，に、スコープ。

Ｒ，Ｅ、Ｈ，ウニラテンホール及びＮ、Ｊ、ホーゲンラドＣ１９８７］Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、＋５：＋７５３−１７６１：イングラムし、０．及 びＴ、コンウェイ［１９８８］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、５４：３９７−４０４：イングラム、Ｌ、Ｏ，、Ｔ、コンウェイ、Ｄ、Ｐ、ク ラーク、Ｇ、Ｗ、スウェル及びＪ、Ｆ、ブレストン［１９８７］Ａｐｐｌ　、Ｅ ｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３：２４ブロー及びシャーム（ブロー、 ８．及びＨ，シャーム［：　１９８６］Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　＋４ ４：２９６−３０１）は、エタノール生産がＺ。

モビリスのピルベートデカルボキシラーゼのオバーエクスプレッション（過剰表 現）によって絡替え大ｌｌＩ菌中て増加てきたことを最初に実証したが、非常に 少ないエタノール濃度しかできなかった。トラン及びフィンのその後の研究は二 つの他の腸内Ｉｌ菌を使用することにより（エルウィニア　クリサンセミ（εｒ ｗｉｒ＋ｉａ　ｃｈｒｙｓａｎ　ｔｈｅ＋ｓｉ）、）ラン、ｊ、ｓ、及びＲ１に 、フィン［１９８７コＡｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１．５３：２０３３−２０３８：クレブシェラ　ブランティコラ（に１ｅｂｓｉ ｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）　）ラン、　、１　、　Ｓ　、及びＲ，に、 フィン［１９８７］ＡＩ］１１１．Ｅｎｖｌｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂ＋ｏｌ　、５ ３：２０３９−２０４４）この研究を広げ、そしてヘキソース、ペントース及び 糖７π合物からより高いエタノール水準を＋！成している。本発明は効率的なエ タノール生産系に対しコードしている新規なオペロンの製造および表現に関する ものであるａ新規なオペロンは、形質転換微生物が、有用な量でエタノールをＩ ！造することができるようにするために、微生物を形質転換するのに使用できる 。本発明者は、共通した制御系のもとて異なる生物からの遺伝子を異なる制御系 のもとて一つのオペロンにうまく絹合せろことを開示している先行技術をここに 記載された本発明は、エタノール発生経路のアルコールデヒドロゲナーゼ１１及 びピルベートデカルボキシラーゼ活性の両方を含んでいるエタノール生産に対す る独特の可能性のあるオペロンの構築に間するものである。この独特のオペロン は、ｐｅｔオペロンと命名されるが、エタノール生産に必要とされる二つの遺伝 子を含有している。この系は好ス的及び嫌気的な条件の両方のもとで、生育の間 にビルＪ＼−トをエタノールに効率的に転換することができる。

またここにはエタノール生産オペロンを含有する大腸菌の新規な菌株も記載され る。これらのｆｉｌｌ替え菌株は、糖を含有する平板培地上で大量のコロニーを 形成する有益なそして警くべき特徴を示す、またこれらのＮＩＩｖえ菌株は、バ ッチ培養基中で７倍より高い纏＠密度に生育する。従ってここに述べられろ発明 は、とんな部品にせよ生成物を造る組替え微生物の生育及び収率を増加させるの に使用することができる。

区画の簡単な記載 ′！ｓ１図はズイモモナスモビリスからのピルベートデカルボキシラーゼ及びア ルコールデヒドロゲナーゼ１１をコートする遺伝子を含有しているｐｔ、ｏ　ｌ 　２９５を製造する略図を示し、 襖２図はズイモモナスモビリスからのピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコ ールデヒドロゲナーゼ１１をコードする遺伝子を含有する幾つかのプラスミドを 示す略図であり、 第３図は菌株ＴＣ４及びエタノール発生酵素をコードしているプラスミドを含有 している絹替え菌の生育を示しており、 第４１！ｌは組替え菌中に於けるビルヘートデカルボキンラーゼ活性と生育の程 度の間の間係を示す。

本発明の詳細な記載 ある種の細菌及び他の単純な生物はヘキソース、ペントース及びラクトースを含 めた多種多用の基質を盛んに代謝することができる。このことは大％Ｉ　ｍ　ｔ ）ｉ　絹替えＤＮＡの製造面として、魅力的な宿主である理由である。ここに記 載される本発明は、木材及び食べられない植物の部分の主要部を占めるヘミセル ロース（キシロース、アラビノース等）及びホエイ（乳糖）等の、利用が充分て ないバイオマス源、ならびに他のバイオマス源からエタノールをＩｌ造する単純 な生物の磁替え菌株の使用を可能にする。また、複雑な重合体の分解のための細 胞外酵素などの特別な能力を有する生物は、本発明を用いてエタノール生産者に 転換できる。

ここに記載した新規な発明は、多くの異なる宿主に間違して使用することができ る。例えば、大ｖＡＭに加えて、腸内細菌、例えば、エルウィニア　クリサンセ ミ（Ｅｒ讐１ｎＩａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）及びクレブシェラ　ブランテ ィコラ（Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）はペントース及びラ クトースを含めた広範囲な糖の利用を可能にするので、特に魅力的な宿主である 。追加的な可能性のある宿主には、他の細菌、酵母、真菌１および真核細胞が含 まれる。適当な表現系が間違する特定の宿主に対し使用される。適当な表現系を 確認することは、この分野で訓練を受けた科学技術者の技能の範囲内である。

本明細書に記載されるのは、エタノールを製造するように細胞をしむける新規な オペロンである。このオペロンは、ｐｅｔオペロンと命名されている。ｐｅｔオ ペロンは適当な制御配列と一緒にアルコールデヒドロゲナーゼ１１及びピルベー トデカルボキシラーゼに対しコードしているＺ、モビリス遺伝子からなる。制御 配列は、プロモーター、インデューサー、オペレーター、リポソーム結合位置、 ターミネーダー役び／又は他の制御配列からなりつる。以前の組替え系における エタノールａ造は宿主生物の元来の活性に依存し・でいた。有益なことに、ｐ　 ｅ　ｔ、オペロンを形成するためのアルコールデヒドロゲナーゼ１１及びピルベ ートデカルボキシラーゼをコートしているＺ。

モビリス遺伝子を組合せることによって、宿主のアルコールデヒドロゲナーゼ活 性に依存することが取除かれた。

本明細書に記載される材料及び方法を使用して、好気的、嫌気的条件下でｐｅｔ オペロンを含有している組替え菌中てＶ意義な量のエタノールが製造出来る。

前記の議論から、本明細書に開示した概念、すなわち代ｒｌ１Ｍ路に対しコード している遺伝子を単一のオペロンと組合せることは極めて新規、かつ有用な方法 であることが当業者には明白となるはずである。有用なオペロンを造り出すため に異なる遺伝子座からの遺伝子が組合される種々の状況に、この概念を２用する ことは、本発明の一部をなすものとみなされろ。ｐｅｔオペロンの創造は、この 新規な発明性の単に一つの例である。従って、ここに記載の原理を用いて、アル コールデヒドロゲナーゼ活性に対するコートを有ずろ種々の生物からの遺伝子は 、所望の経路をコートするオペロンを造り出すために、ビルベートデヒトロゲナ ーゼ活性に対しコードする他の遺伝子と組合せることができる。他の経路に対し コードしているオペロンも造り出す事が出来る。当業者には、不明＊＊に記載し たエタノール生産者 ルデヒドロゲナーゼに対しコードする遺伝子及びビルベートデヒトロゲナーセ活 性に対しコートする遺伝子が共通の制御下にある必要がないことが明らかである はずである。これらは、別個の制御下にあり得、そして異なるプラスミド中のも のであるか、または異なる遺伝子上に置かれることができる。

好気的な条件下では、大ｖａＮの中て解糖からのビルヘートは、単にピルベート デヒドロケナーゼ複合体及びラクテートデヒドロゲナーゼによって主として代謝 され、（ゴットシャーク、Ｇ、［：１９８６］Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｔａｂ ｏｌｉｓｓ＋、ｐｐ、２１０−２８０５ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（λブリ ングーヴエルラーグ）、ニューヨーク）そして過剰のアセチルＣｏ　Ａ　（Ａｃ ｅｔｙｌ　ｃｏｅｎｚｙ＋ｓｅ　Ａ）がアセテートに転換される。これらの二つ の酵素に対する見掛けのに４はそれぞれ０．４＋ｔび７．２ｎ＋Ｍである。

Ｚ、モビリスのピルベートデカルボキシラーゼに対する見掛けのに一１二つの大 ＨＭの酵素のものに等しいか（ビルベートデヒトロゲナーゼ）又はより小さい（ ラクテートデヒドロゲナーゼ）のでアルデヒドの生産を促進する。好気的な条件 下でのＮＡＤＨ“の再生は、主として生合成から、及び（電子伝達系に結合され ている）ＮＡＤＨオキシダーセから見掛けのＫ　、５０μ門て生しる。Ｚ、モビ リスのアルコールデヒドロゲナーゼ１ｊに対する見掛けのに、は、大囁菌ＮＡＤ “オキシダーセに対するものよりも、４倍以上低く、Ｚ、モビリス酵素が有効に アセトアルデヒドのエタノールへの還元に対するＮＡＤＨの内部的のプールと競 走することを可能とする。従って、Ｚ。

モビ１ノスのエタノール発生＃Ｗの性質及びそれらの比較的高い表現水準は、好 χ的な条件下で炭素の流れをエタノールに転換するのに良く適している。

大ｌＩＩ菌の中の嫌気的な条件下で、解糖がら生じるピルベートは主としてラク テートデヒドロゲナーゼ及びビル・＼−トホルメートリアーゼによって代謝され る。これらの二つの＠素に対する見掛けのに、Ｉｌは、それぞれＺ、モビリスの ビルヘートデカルボキンラーゼに対するものよりも１８倍及び５＠高い。同様に 大ｌｌ１ｌ！菌におけるＮＡＤゝ再主において関与する主要な酵素に対する見掛 けのにカもＺ、モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼ１１に対するものよりも かなり高い。このようにＺ、モビリスからのエタノール発生酵素は、大腸菌の正 常な発酵酵素に対して、炭素（ピルベート）に対し、及び還元の能力（ＮＡＤＨ ）について、きわめて競走的であり、解糖の生産物をエタノールに効果的に切換 えることを可能とする。

ｐｅｔオペロンとして命名される二つのエタノール発生酵素をコートしている遺 伝子は、高水準で表現され、そして嫌気的な生育の間にピルベートからの炭素の 流れ、及びＮＡＤＨの酸化を支配する。これらの条件下で、とルベートの炭素骨 格の流れは、大腸菌における主要な発酵生産物としては、有軸酸の製造からエタ ノールの生産に転換される。

槍の代謝からの有機酸の蓄積は、一般に嫌気的な生育の閏の発酵の結果としてみ なされる。しかし、アセテートのかなりの量が好気的な条件下の急激な攪拌の間 でさえも大腸菌ＴＣ４の親菌株によって製造される。菌株ＴＣ４によるアセテー トの製造は、生育の初期段階から累進的であり、寝１１１ａ度が高いときに後の 段階に限られるものではない。燐酸塩緩衝液を補充した培地における増加した最 終菌体密度によって実証されるように、このゲルコールからの酸の製造は、好気 的な条件下でさえも、ブロスにおける生育及び固体培地に於ける生育を制限する 働きをする。

宿主生物のエタノール発酵への転換は、宿主の表現系を用いて種々の組替え生成 物の生産を強めるのに使用できる。これらの生成物に於ける機能の維持は、濃厚 な培養基中ての生育の間のブロスのｐＨと関連している。菌体蛋白質の単位あた りのこの酸性化の程度は、有機酸よりもエタノールの！！道によって最小となる 。ｔｌＩｇの移動はしばしば微生物の濃厚な培養基での生育の間、主要な限定要 因であり、酸の生産を生じそして生育培地のｐＨのドリフトを生しるのはこの制 限である。ｐｅｔオペロンを表現している組替え菌においてＺ、モとリスのエタ ノール発生酵素は、解糖からのピルベートの一部を７セトアルデヒドに転換し、 Ｎ４へＤＨを再酸化し、エタノール、即ち代謝に少ないダメージしか与えない生 成物を生しる。

酸化的燗１ヒに対する機能できる呼吸の連鎖、およびエタノール生産酵素、の両 方を含有している菌株は、ＮＡＤ″″の再生の間の両方の系の作用及び酸性の廃 棄物の減少のために、より高い菌体密度にさえも生育てきる。この様な固有の柔 軟性は、より小さい厳格なプロセスの制御要求並びに組替え生産物の増（支）し た収率を生じる。

特定して言えば本発明はさらに、ラクトース及びセルロースとへミセルロール中 に存在する全ての主要な糖（グルコース、キンコース、アラビノース、ガラクト ース、及びマンノース）がズイモモナス　モビリスからのエタノール経路に対す る酵素をコードしているプラスミドにある遺伝子を含有している胡替え大腸菌に よってエタノールに転換できたことに間する。環境的な許容度、プラスミドの安 定性、Ｚ、モビリスビルベートデカルボキシラーゼの表現、基質範囲、及びエタ ノール生産（グルコース、ラクトース及びキシａ−ス）は、大ＩＩ菌の８つの菌 株の閑で比較された。これらの８つの菌株から大ＩＩＩ　ｊＩ　ＡＴＣＣ９６３ ７（ｐｉ、Ｉ）１２９７）、ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯ１２９７）及ＵＡＴＣ ＣＩ５２４４（ｐＬ０１２９７）が環境的な耐久性及びエタノール生産に基つい てさらに、開発するために選択された。バッチ培養基中の時間当りのエタノール 生電性容量は、グルコース（１２工）に対し、およそ１．４ｇエタノール／ｌ、 ラクトース（１２ｍ）ニ対し、、　１．３ｇ／ｌ、ソシテキ’ｉロース（８％） ニ対し、０．６４ｇ／ｊであることが分った。Ｗｆ間当りのエタノール生産性は 、１２％のグルコースて菌体乾燥重量ｇ当り２．１ｇエタノールから８％キシロ ースで、菌体乾燥重量ｇ当り１．３ｇのエタノールの範囲である。キシロースｇ 当りのエタノール収率は、グルコースに於いてサツ力ロミセスセルビシアエにつ いて一般的に報告されているよりも、組替え大腸菌がより高かった。グルコース （１２り、ラクトース（１２１）、及びキシロース（８ｔ）は、それぞれ７．２ ｚエタノール（容ｔ）、６．５χエタノール、及び５．２ｚエタノールに転換さ れた。

基質の範囲及び環境的な耐久性（Ｗ許容度、塩許容度、エタノール許容度、低ｐ Ｈに対する許容度及び熱許容度）を含めた種々の要因がエタノール生産に適した 大ｍＷ菌株を選択するのに考唯される必要がある。ここに記敏されるように、菌 株ＡＴＣＣ９６３７（ワックスマン菌株Ｗ）は、環境的な耐久性の点て優れな特 性を示しなか、グルコースからのエタノール生産は他の菌株よりも低かった。菌 株ＡＴＣＣ９６３７は主としてシュークロースを利用する独特の能力のために選 択された。有益なことに、このＡＴＣＣ９６３７の特性は、甜菜糖、砂糖きび糖 、及び他のシュークロースを有する試料の発酵にこの菌株を有用なものとしてい る。ｐＬＯ１２９７を含有しているＡＴＣＣ１１３０３（、ルリア菌株Ｂ）及び ＡＴＣＣ１５２４４（ケベス菌株Ｍ　Ｌ　３００）は高水準のエタノールを生し 、許される水準の環境的耐久性を示した。

プラスミドはこれらの二つの構築物中で非常に安定であり、これらはエタノール 生産のそれ以後の開発に最良の候補者として選択された。これらの両方の構築物 は、効率的なエタノール生産に必要とするＺ７モビリスビルヘートデカルポキシ ラーセの高水準を表現した（イングラム等［１９８７］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏ ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３．上記）。

Ｍｓｓバイオマスの全ての主要な糖成分は、Ｚ、モビリスからのエタノール経路 を含有している線替え大腸菌によって、エタノールに転換された。グルコース及 びキシロースのエタノールへの転換効率は、Ｓ、セレビシアエについて以前に報 告されたものを越えており（ロビットＲ。

Ｗ、、Ｂ、Ｈ，キン、Ｇ、−ｊ、ジエン、及びＪ、Ｇ、ゼイカス［１９８８コＣ ＲＣＣｒｉｔ、Ｒｅｖ、ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７：１０７１８６）、そしてペ ントース発酵酵母系について以前に報告されたものを越えていた（へ゛ツクＭ、 Ｊ　、［：　１９８９　ＩＢ　１ｏｔｅｃｈｎｏｌ　、Ｂ　ｉ　ｏｅｎｇ　ｉ　 ｎ　、Ｓｙｍｐ　、　１７　：６１７−６２７：ジエレリスＴ、Ｗ、、及びＨｌ に、スリーナス［＋９８８コＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、３１：５０ ２−５０６：スクーグに、及びＢ、ハーノーハゲルダルｊ：１９８８コＥｎｚｙ ｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、ＩＯ：６６−７９ニスリンガ−Ｐ 、Ｊ、、Ｒ，Ｊ、ボサスト、Ｍ、Ｒ，オコス及び吋、Ｒ，ラディッシュ［１９８ ５］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．Ｌｅｔｔ、７：４３１−４３６）、キシロースはＳ 、セルビシアエによってグルコースが転換されるよりもより高い効率で組替え大 ＰＩＡ薗によってエタノールに転換された（Ｌｏｖｉｔｔ　ｅｔ、　ａｌ、上記 ）。キシロースでの異密に高いエタノール収率（論率の１００羞を越える）は１ １９ｔな栄養物の分解に由来するエタノールを含むかもしれない。多くのアミノ 酸及び１１雑な培地の成分は、ビルへ一トに転換される解糖中間体に分解される 。このビルへ一トは次にエタノールに転換されつる。

この研究は、商業的なエタノール製造に対し、組替え菌が開発てきることを実証 し、微生物からの新規な生成物の未来における開発のための代謝の流れにおける 劇的な変化の可能性を説明する。さらに嫌気的な条件下で親生物が行なうよりも 、より高い菌体密度にｐｅｔオペロンを含有する菌株がグルコースで生育し、そ して酸の生産と関連する複雑化を減少する一方で、微生物における絹替え生産物 の１１造の増加の可能性を提供している。

材料と方法 生物及び生育条件　大１１１［Ｔｃ４（コンウェイ、Ｔ、、Ｙ。

Ａ、オスマン、Ｊ、１．コナン、Ｅ、Ｍ、ホフマン、及びし、０．イングラム［ １９８７］ｒズイモモナスモビリス　ビルヘートデカルボキシラーゼのプロモー ターとヌクレオチド配列Ｊ　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：９４９−９５４ ）及びプラスミド含有誘導体をこの実験で使用した。ビルヘートデカルポキシラ ーゼ遺伝子（、ｐＬ　ＯＩ　２７６）及びアルコールデヒドロゲナーゼＢ遺伝子 （ｐ　Ｌ　ＯＩ　２８４）を含有するプラスミドは以前に記載した（コンウェイ 及びオスマン　等口９８７］、上記の「・・・のプロモーターとヌクレオチド配 列」コンウニ（、Ｔ、、Ｇ。

讐、スウェル、’／、Ａ、オスマン及びし、０．イングラム［１９８７］ｒズイ モモナスモビリスからのアルコールデヒドロゲナーゼ１１遺伝子のクローニング と配列決定Ｊ　、１．８ａｃｔｅｒｉｏ１．１６９：２５９　＋−２５９７）。

菌株及び生育条件　ブラスミＦｐＵＣ１８及びｐ　Ｕ　Ｃ１９くヤニッシューベ ロン、Ｃ，ｊ、ヴイエイラ及び、１．メツシンプロ９８５］ｒ改良されたＭ＋３ ファージクローニングヘクター及び宿主菌株：　Ｍ　＋３ｗｐ１８及びｐ　Ｕ　 Ｃ１９ベクターのヌクレオチド配列Ｊ　Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１９）、ｐＬ ＯＩ２０４（コンウェイ、Ｔ、、Ｍ、Ｏ，−に、バインクー及びし、０．イング ラム［１９８７］「ズイモモナスモビリス用の表現ベクターＪ　Ａｐｌ、Ｅｎν １ｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３：２３５−２４１）、及びｐ　Ｌ　Ｏｒ　 ２９５　（イングラム等［１９８７］、上記）は以前に記載されている。ｐＬＯ ■２９２、ｐＬｏ　Ｉ２９１．　ｐＬｏ　１２９７、ｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８、ｐ Ｌｏ　＋　３０８−２、ｐ　Ｌ　Ｏ＋　３０８−５及びｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８− １０の構築及び性質は以下に記載される。

培養基を３７℃で５０ｇのグルコースをリットル当り含有しているシリアブロス 中で生育させ（ルリア、Ｓ、Ｅ、及び門。

デルプルツク［１９８４１ｒウイルス抵抗性に対するウィルス感受性からの１１ Ｍの突然変異化Ｊ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２８：４９１−５１１）。

酵素分析用の菌体及び発酵研究用の接種菌は、３１のブロスを含有している試験 管（＋３Ｘ　１００ｍ１１）中で３７℃で試験管回転器（チューブローチーター ）中で生育させた。

−夜培養基を新たな培地中に１００倍に希釈した。好気的な培養基（２５０ｍｌ フラスコ中の５０１のブロス〉を往復する水浴中で［盪させた（分当り１２０回 の揺動）。嫌気的な培養基は、３７℃のインキュベーター中て簀回攪拌（、１５ ０ｒｐｍ）をさせながら、栓をした血清ビン（１３（１ｍｌのビン中の１００ｍ １のブロス）中で生育させた。嫌気的な培養基は２５ゲイジの針で排気口を設け 、ガス上の発酵生産物が逃げられるようにした。

生育はスペクトロニラクツ０分光光度計により（ボウシュ　アンド　ローム　イ ンコーホレイテッド、ニューヨーク州ロチェスター）　５５０ｎｍでモニターし た。使い捨て可能な培養基試験管（ＩＯＸ　７５ｍ階）をキュベツトとして使用 した。我々の条件下での一つの吸光度単位は１当りおよそ０．２５Ｂの菌体蛋白 質を含有していた。生育はＡｓ２゜で瀾定し、１．０吸光度単位は１当りの０． ２５Ｂの合計菌体蛋白質に等しい。

プラスミドｐ　Ｌ　Ｏ＋　３０８−１０を含有する大ｍｉ宿主を１９８９年５月 １５日にアメリカ合衆国メリーランド州２０８５２０ツクウィル　バークロウノ ドライプ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に 寄託した。培養基には、寄託機関によって次の寄託番号が付与された。

培養基　寄託番号　寄託日 大腸菌ｐＬｏ１３ｏｓ−１０ＡＴＣＣ６７９８３１９８９年５月１５日この培養 基は、特許商標庁長官によって３７ＣＦ　Ｒ１，１４及び３５Ｕ　Ｓ　ＣＩ２２ のもとて権限があると決定されたものに特許出願が継続している間、培養基を入 手可能にすることを保証するという条件下で寄託されている。Ｗ託物は、この出 願の対応物が出醸されている国の外国特許法によって、要求に従って入手可能で ある。しかしながら寄託物を入手可能であることは、行政行為によって付与され た特許ｆｉｌｅ浸害１ノでこの特許を実施する実施権を構成するものではないこ とが理解されるべきである。

ざらにこの培養基寄託物は、微生物の寄託に対するブタベスト条約の条項に従っ て、保存され、かつ一般に入手可能とされるであろう。すなわち寄託物は、これ が生きたままモして、汚染されずに最も最近の寄託試料の提供の要求がされたの ち、少なくとも５年間のＫＦ４　Ｍ、そしてとんな場合にも寄託の日ののち少な くとも３０年荀の期間、又は培養基を開示している発酵されるとんな特許の権利 行使可能な期間（呆たれるように、必要なあらゆる注意を払って（呆存される。

寄託者は、寄託所が寄託菌の状態のために、要求された時に試料を提供すること が出来ないことがある場合には、寄託物を置き換える義務があることを認める。

全ての培養基寄託物の一般への入手可能性に対する全ての制限は、開示している 特許が付与されると永久に除かれる。

遺伝技術　杉質転換、プラスミド構築、ＤＮＡ消ｆヒ、及び分析は前に記載の通 り実施された。！替え菌は２ｇのグルコース及び適当な抗生物質を含有している 固体培地（１，５＄寒天〉上で選択された。Ｚ、モビリスからの機能的にエタノ ール発生する遺伝子を含有している絹替え菌は、グルコースを含有しているルリ ア寒天平板培地上で、大きさが大きすぎるコロニーとしてのそれらの生育によっ て同定され、そしてグルコースを欠いているルリア寒天平板培地上での生育が悪 いこと及びアルデヒド指示薬培地上でのアルコールデヒドロゲナーゼの表現によ って確認された。

酵素検定　菌体を破壊し、加熱不活性化し、そして前に記載されたようにピルベ ートデカルボキシラーゼ活性（！ｌｌ！ｌ安定）に対し検定した。（コンウヱイ 及びオスマン等［１９８７］上記「・・・プロモーター及びヌクレオチド配列」 ＞、８体を調製し、そして前に記載したようにエタノール酸化の方向でのアルコ ールデヒドロゲナーゼ１１活性について検定したが、ただしニール等によって記 載されるように、新たに固体の硫酸アンモニウム第一鉄（ｊ！終濃度０．５１Ｉ Ｍ）及びアスコルビン酸ナトリウム（ｌｏ＋ｗＭ）が加えられている３０ｍＭ燐 酸カリウム緩衝液中で菌体をｆｃ浄し、破壊したに−ル、Ａ、［１，ＪＪ、スク ープ、）０Ｍ、ケリー及びＲ２Ｅ、Ｈ，ウラテンホール［：１９８６］ｒズイモ モナスモビリスの二つのアルコールデヒドロゲナーゼ、ディフ７デンンヤル染料 す−ガントクロマトグラフィによる精製、分子特性決定および整理的役割Ｊ　Ｅ ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋５４：１１９−１２４）。

貯蔵なしのアルコールデヒドロゲナーゼ活性の即時検定と共に、この條飾は前に 報告されたものよりも、ずっと高い特異的活性を生した。蛋白質をフォリン（Ｆ ｏｌｉｎ）フェノール試薬で測定した（ローリ−１θ、　Ｈ、、Ｎ　、　、１　 、ローズボコー、Ａ、Ｌ、ファール及びＲ、ｊ　、ラントール［１９５１：Ｉｒ フォリンフェノール試薬での蛋白ｉｆ　＋１１定」ｊ、Ｂｉｏｌ、イ：ｈｅｍ、 　１９３：２６５−発酵生産物の分析　発酵生産物は、屈折率モニター及び電子 インチグレーターを鴫えているミリボア／ウォータース高性能液体クロマトグラ フィー（ミリボアコーホ１ノージヨン　マサチュウセッツ州へットフート）で、 透明なブロス中で測定した。分離は流速０．２５ｍ１／分（１００μｍ注入容量 ）の流速で６５℃で、カリフォルニア州すッチモントのバイオラットラボラトリ −から購入したアミネックスＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００Ｘ　７．８＋＊ｍ） 土で実施した。ピークは本物の標準を用いて同定した。グルコースより前に溶Ｉ Ｈする二つのピーク及び４５．４〜４５．８分で溶離する後の未知のピークは接 種していない培地の成分であ以下は本発明を実施するための最良の杉態を含めた 手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定的に解釈されるべきてはな い。他に示されていなければ、全てのパーセントは重量により、全ての溶媒混合 物割合は容量による。

実施ｆ９１１１　菌株の構築 ビルヘートデカルポキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ１１に対しコート する構造遺伝子の大きさはそれぞれ１．７Ｆ！？、ひ１．１キロへ−スであり、 これらの遺伝子は分子量６０，０００及び４０．１００の蛋白質に対しコードし ている。

これらの遺伝子はそれぞれｌａｃプロモーターの制御下でｐ　Ｕ　Ｃ１８の誘導 菌上に位置している。（第１図）。二つの遺伝子はｐＬＯ＋２８４（アルコール デヒドロゲナーゼ）からの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及び５ａｉｌによ って生したプロモーターなしの１．４キロヘースの断片をｐ　Ｌ　０１２７６の とルヘートデカルボキシラーゼ遺伝子から下流のＢａｒｎ　Ｈ位置に挿入するこ とによって結合された。これらのクローンはアシビシリシに対する抵抗性に対し 、そしてアルデヒドの生産を検出する新たに開発されたパラロブニリン−エタノ ール指示薬プレート上のアルコールデヒドロゲナーゼ活性の存在及び表現に対し 選択された。示された構築物を含有しているクローンｐＬ　０１２９５は添加さ れたグルコースの非存在下で、ルリア寒天プレート（好気性）の表面でうまく生 育しなかったが、２％グルコースを含有している寒天平板培地上でプラスミドの ないＭ株及びｐＬ　ＯＩ　２７６又はｐ　Ｌ　ＯＩ　２８４を含有する菌株より もずっと高い密度に生育した。

ｐｅｔオペロンを含有している絹替え菌は、グルコースを含有しているルリア寒 天平板培地（好気性）上でずつと大きな、より不透明なコロニーとして容易に検 出された。このコロニーの大きざの違い及び透明性の違いはアルコールデヒドロ ゲナーゼとピルベートデカルボキシラーゼの遺伝子の両方を表現するプラスミド を含有している絹替え菌の同定に対し、有用な目印であることが証明された。

ｐ　Ｌ　Ｏｌ　２９５の完全な塩基配列は知られている。ピルベートデカルボキ シラーゼに対しコードする遺伝子の転写解読枠は、Ｉａｃプロモーターから下流 １６３塩基であり、アルコールデヒドロゲナーゼ１１に対してコードしている遺 伝子の転写解読枠から上流の８５塩基の二つのストップコドンで終っている。両 方の遺伝子が各転写解読枠からすぐ上流にリポソーム結合位置と類似している配 列を含んでいる。アルコールデヒドロゲナーゼ１１に対しコードする遺伝子は、 単一のストップコドンに続いて転写ターミネータ−としての役目をする１３個の 塩基対のパリンドローム配列を含んでいる。

実施例２　大勝菌中のＺ、モビリス遺伝子の表現ピルベートデカルボキシラーゼ 及びアルコールデヒトコゲナーセＩ］遺伝子の両方ともが、単独で（ｐ　Ｌ　Ｏ Ｉ　２７６及びｐＬ　ＯＩ　２８４のそれぞれ）及び−緒にｌａｃプロモーター の制御下で大腸菌中て高水準に表現された。ピルベートデカルボキシラーゼは野 性型の大ＨＭ中には存在しないが、低い１度で誘導可能なアルコールデヒドロゲ ナーゼが存在する。グルコースの存在下での大１１１菌の生育の間２．モヒリス 酵素の特異的な活性はおよそ５０％だけ下がり、このことはｌａｃプロモーター のグルコースによるリブレッンヨン（抑制）と一致している。ｐｅｔオペロン申 の近い方の遺伝子（ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｇｅｎｅ）によりコートされるピルベー トデカルボキシラーゼの特異的な活性は、ｐ　Ｌ　Ｏ［２７６におけるよりもｐ ＬＯＩ２９５において３倍高い。アルコールデヒドロゲナーゼ１１遺伝子、即ち 茜ｔオペロンに於ける遠い方の遺伝子の生成物の特異的な活性は、ｐ　Ｌ　ＯＩ 　２９５ではｐ　Ｌ　Ｏ＋　２８４における水準の２倍表現された。

実施例３　ＭＷえ菌株によるグルコースの発酵大腸菌に於けるｐｅｔオペロンの 表現は、嫌気性の生育の間主要な発酵生産物として、エタノールの生壷を生じた 。親菌株は主要な発酵生産物としてサクシネートク１゜５＋ｗＭ）　、ラクテー ト（１８１１Ｍ）及びアセテート（７１Ｍ）を生した（第３Ａ図）。同し発酵プ ロフィールがアルコールデヒドロゲナーゼ１１遺伝子を持っているｐ　Ｌ　ＯＩ 　２８４を含有する菌体中で観測されたく第３Ｃ図〉。ピルベートデカルボキシ ラーゼに対しコートする遺伝子を持っているｐ　Ｌ○■２７６の場合は、エタノ ールのピークが明らかてあり（１８ｍＭ）、蓄積した発酵生産物の３分の１に等 しい。このより高いエタノール水準は、Ｚ、モビリスからのピルベートデカルボ キシラーゼ及び元来の大ｉ１１菌アルコールデヒトロケナーセの組合された活性 から生しるものである。ｐｅｔオペロンを含有するｐ　Ｌ　ＯＩ　２９５の場合 （Ｚ、モビリスからのピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲ ナーゼ１１遺伝子の両方）、大腸菌は多量のエタノールを生産しく　７５０＋１ Ｍ、４．３％容量／容量）、これは発酵生産物の９５％を越えるのちを表してい る。

ｐｅｔオペロンを含有している菌体中で、製造されたアルコールデヒドロゲナー ゼ及びピルベートデカルボキシラーゼの高水準は、大腸菌のＮへＤＨ酸化を支配 した。

従ってこの生物の発酵は、Ｓ、セレビシアエ及びＺ、モビリスの発酵と同等のも のに転換された。正常な発酵的生育の閑、ピルベートはピルベートデカルボキシ ラーゼ複合体によってアセチルコエンザイムに、ホスホエノールビルヘートカル ボキシラーゼによってオキザロアセテート（及びサクシネート）に、ビリベート ホルメートリアーゼによってホルメートとアセチルコエンザイムにそして、ラク テートデヒドロゲナーゼによってラクテートに転換される。この最後の経路は、 修飾されていない大腸菌菌株中のＮ、へＤ“の再生のための優勢な経路である。

しかじなが仁細菌のラクテートデヒドロゲナーゼに対するに１はきわめて高く、 ｌＯ〜１．０００ｍＭの範囲である（ガルビ、Ｅ、１．［：＋９８０１「細菌ラ クテートデヒドロゲナーゼ」Ｍｉｃｒｏｂｌｌｏ、Ｒｅｖ、４４：＋０６−１３ ９：ターミー、Ｅ、Ｍ、及び＾、０．カブラン［１９６８］ｒ大ｌＩＩ薗ＢＤ− ラクテートデヒドロゲナーゼの反応速度論及び立体配位に於けるピルベート制御 の変化に対する証拠（，１，８ｉｏ１．　ＣｈｅＱｌ、２４３：　２５８７−２ ５９６）、　Ｚ　、モビリスからのピルベートデカルボキシラーゼのに＋ｗは０ ．４ｍＭである（ブリンガーーマイヤー等、Ｓ、に、−Ｌ、シムス及びＨ，ジャ ム［１９８６］　ｒズイモモナス　モビリスからのピルベートデカルボキシラー ゼ、単離及び部分的な特性決定」Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４６： 　１０５−１１０）　、この酵素が豊富にあることと、より低いＫＩｗであるこ とが組合わされて効果的に解糖からのピルベートの流れをエタノールに転換する 。

ガス交換が制限されていない培養容器を橿やかに攪拌しながら混合生育する条件 の間に、高い菌体密度が達成される。これらの条件下で最終ｐＨ６，３以上が観 測されるが、これは通気の程度に依存する。

実彬例４　プラスミドの構築及び大腸菌中でのＺ、モビリスエタノール発生酵素 の表現 ブラスミＮ’ｐＬＯＴ２９５は、Ｉａｃプロモーター制御下にありピルベートデ カルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ１１をコートしているＺ、モ ビリス遺伝子を含有している。この構造物はｐｅｔオペロンと呼ばれ、別のプロ モーターを有する追加的なプラスミドの構築のためのエタノール発生遺伝子様と して使用される。エタノール発生遺伝子を含有するｐ　Ｌ　ＯＩ　２９５からの ＥｃｏＲｌ−３ａｉｌ断片をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で処理し、プラ ント末端を遺った。このプラント末端のＤＮＡ断片をｌａｃプロモーターからす ぐ下流に、ｐｄＣ遺伝子を有しているｐＵｃ＋９のＳｍａ１位置に挿入した。生 しるプラスミドはｐＬＯ１２９３と呼ばれ、これはＢａｍＨ１位置によってフラ ンクされているｐｅｔ遺伝子を含有していた。プラスミドｐＬＯＩ２９１及びｐ ＬＯｒ２９２（逆の方向性）はエタノール発生＃索をコートしている遺伝子を含 有するＢａｍＨ［断片を表現・＼クターｐＬＯｒ２９４に挿入することによって 構築した。ＢａｍＨＩ断片はリポソーム結合位置、両方の遺伝子に対する完全な 配列、及びａｄｈＢに遠い方のステム・ループターミネータ−（ｓｔｅｍ−１ｏ ｏｐ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を含んでいる。ｐＬＯ＋２９２に於いて、二つの 遺伝子は元々の表現ベクター中に含有されるＺ、モビリスプロモーターの制御下 で表現される。

プラスミドｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８はｌａｃプロモーターの制御からρｅｔ遺伝子 を除去するが、別のプロモーターの挿入の為の上流のＢａｍＨ１位置を保持する ように構築された。

ＢａｍＨＩでのｐ　Ｌ　Ｏｌ　２９３の部分消化及びフレノウ処理をａ　ｄ　ｌ ＩＢ　＋！伝子に対し遠い方のＢ　ａ　ｍ　Ｈ１位置を除去するのに使用した。

エタノール発生遺伝子は、プロモーターのないＢａｍＨＴ（ｐｄｃに対しすぐ隣 ）−ＥｃｏＲＩ　（ａｄｈＢに対し遠い）断片としてこのプラスミドから除かれ ｐＬＯ［３０８を造る為に、ｐ［ＪｃＩ８のＢ　ａｍＨＩ及びＥｃｏＲ１位菫に 方向的に挿入された。このプラスミドはアルデヒド指示薬プレート上でａｄｈＢ の低い水準を表現したが、他の機能的なｐｅｔブラスミＦ’　ｐ　Ｌ　０ｆ２９ ５、ｐ　Ｌ　Ｏ＋　２９１及Ｕ　ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９２と関連シタ大コロニーの 表現型を示さなかった。

Ｚ、モビリスからの染色体ＤＮＡは、殆どのＤＮＡが４キロヘースの長さ未満に 見えるように、Ｓ　ａ　ｕ　３Ａで部分的に消化した。この分画していないＤＮ Ａをプロモーター断片の源として使用し、そしてｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８の脱ホス ホリル化したＢａｍＨ１位置に連結した。よく表現されたｐｅｔオペロンを有す るアンピシリン抵抗性の纏み替え菌はグルコースを含有するルリア寒大平板培養 基上で、大コロニーとして同定された。鞘み替え菌株の三つ、即ちｐ　Ｌ　Ｏ１ ３０８−２、ｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−５及びｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−１０を試験 用に選択した。これらのプラスミド中のプロモーター活性を有するＺ、モビリス ＤＮＡ断片はそれぞれ、６．２、及び２キロヘースの長さであった。

表１は組み替え大１ｌＩＩ！ｒの一夜培養基中のピルベートデカルボキシラーゼ とアルコールデヒドロゲナーゼの活性をまとめている。ピルベートデカルボキシ ラーゼの活性の範囲は菌株Ｔ　Ｃ４（ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９１）の菌体蛋白ｍｇあ たり０．３７１ＵからＴｅ３（ｐＬ０１２９５）中の８．２３１Ｕの範囲である 。ヒルヘートデカルポキシラーセ活性についていえは、Ｔｅ３の組み替え菌株は 以下の順序でありうる（最高から最低へ）　：　ｐＬｏ　１２９５＞ｐＬｏ　＋ ３０８−１０＞ｐＬｏ　１３０８−２＞　ｐ　Ｌ　Ｏ１３０Ｂ−５＞　ｐ　Ｌ　 Ｏ＋　２９２＞　ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９１゜表１　大關菌中てのＺ、モビリスから のエタノール発生酵素の表現 ｐＬＯ１２９１０，３７０，４０，２１０，０２ｐＬ＋）１２９２　０．４８　 ０．５　０．３０　０．０３ｐＬＯＩ３０８−２　２．２６　２．３　＋、５４ 　０．２１ｐＬＯ１３０８−５１１］　１．１　０．７６　０．１０ｐＬＯ１３ ０Ｆｌ−１０６，５６，５２，５１０，３４８合計薗体蛋白質ｍｇあたりの分あ たり利用された基質のミクロモルとして表示。

ｂ純粋な酵素に対し特異的活性＋００を仮定して計算。

０元来のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を引いた後の純粋な酵素に対し特異的 な活性？１０を仮定して計算。

組み替え菌株中のアルコールデヒドロゲナーゼ活性はピルベートデカルボキシラ ーゼがそうであるように、異なるプラスミドからの表現の意味に於いて同し傾向 に従っている。測定されたアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、大ｌＩＩ画元来 の酵素及びＺ、モビリス酵素からのの組合わせを表わしている。プラスミドを欠 いている菌株ＴＣ４て観潮された水準は、Ｚ、モビリス遺伝子を有するプラスミ ドを有している菌株で測定されたものと比較して相対的に小さい。Ｚ、モビリス 酵素の活性〈元来の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼに対１．／補正されてい る）は菌株ＴＣ４（＋）ＬＯＩ２９１）からの菌体蛋白質ｍｇあたり０．１３１ ＬＩからＴ　Ｃ４（ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９５）中の９．６１υの範囲てあ実施例５ 　Ｚ、モビリスからのエタノール発生酵素を含有している絹み替え菌株の生育 グルコースの分解からエタノールの生産へのシフトも・生育の収率及び生育培地 のｐＨドリフトに影響する。醗酵生産物は比較的無毒であるが、これらは蓄積し て毒性水準になり得る。ＩＯＸグルコースを含有するルリアブロスを含有するビ ン中での嫌ス的な生育の間に、プラスミドを含有しない菌株及びｐＬＯＩ２８４ を有している菌株（アルコールデヒドロゲナーゼ１１に対しコートする遺伝子を 有している）は４８時荀後渭１あたり０，２５聯ｇの菌体蛋白質の最終密度を達 成し、最終ｐｎは４１．４であった６ｐＬＯ■２７６を有している菌株（ピルベ ートデカルボキシラーゼに対しコードする遺伝子を含有する）中で菌体密度は二 倍増加し、最終ｐＨ４，５であった。　ｐ　Ｌ　０１２９５（ｐｅｔオペロン） を有する菌株の最終菌体密度は２　、５Ｂ／ｓ　ｌであり、対照菌株よりも１０ 倍高かった。最終ｐ）ｌは４．７であった。１あたり画体蛋白質２．５ｍｇの密 度では、マグネシウムが臨界的であるようであり、０゜５１１Ｍ硫酸マグネシウ ムの添加によって更に１．５倍菌体密度の増加が容易に達成された。

組み替え菌株の生育を好気的及び嫌気的条件の両方で試験したく第３図）。好気 的条件下ぐ第３Ａ図及び表２）では、２株ＴＣ４は最も急速な成長期の間におよ そ３０分の発生時間で生育したｅｐＬＯ１３０８の誘導体を有している菌株ＴＣ ４は匹敵する最大生育速度を示し、発生時間４２６分と３０分の間テアッた。菌 株ＴＣ４（ｐ　Ｌ　Ｏ１２９５）はこれらの条件下でうまく生育せず（発生時間 ７１分）そして部分的な溶菌を伴った６菌株Ｔ　Ｃ４（ｌ　Ｌ　ＯＩ　２９１） 及びＴ　Ｃ４（１）　Ｌ　Ｏ＋　２９２＞は中間的な速度で生育し、各々発生時 間４６分であった。

表２　好気的及び嫌気的生育の間に於ける最大発生時間、最終菌体密度、及びプ ロスの最終ｐＨ 薗菌体度均　発生時 生育条件　プラスミド　（ｆ臼ｌＩＩｇ／ｍ１）ｔｆｆｉ（分）　最終ｐｊ４ａ 好気的　なし　０．７　２９　４．４ ｐＬＯ１２９１０，７４６５，３ ｐＬＯ１２９２１，３４６５，１ ｐＬＯ＋２９５　１．１　７１　５．７ｐＬＯＩ３０８−２　ｌ　、７　２７　 ５．５ｐＬＯ１３０８−５０，８３０５，０ ｐＬＯ１３０８−１０２，５２６５，０嫌気的　なし　０．３　３２　４．４ ｐＬＯ１２９１０，４４０４，５ ｐし旧２９２　１．０　４８　５．０ ｐＬＯ１２９５２，１３９４，７ ｐＬＯ１３０８−２０，８４２５，７ １］ＬＯ１３０８−５０，４３８４，９ｐＬＯ１３０８−１ｏ　２．２　４１　 ５．２０生！２４時閘後に瀾定。

好気的条件下（第３Ｂ図及び表２）では、プラスミドを欠いている菌株ＴＣ４に 対する発生時間は３２分てあり、エタノール発生酵素を含有する組み替え菌株に 対するものよりもかなり短い。全ての絹み替え菌は類似の生育最大速度を示し、 発生時間は３８分と４１分の間であるが、例外的にＴ　Ｃ４（ｐ　Ｌ　０１２９ ２）は幾らかよりゆっくりと生育し発生時間４８分である。

Ｔ　Ｃ４（ｐ　Ｌ　Ｏｒ　２９５）を除いて全ての絹み替え菌は１２時閏後嫌気 的及び好気的生育条件ｒでプラスミドを欠いている菌株ＴＣ４と等しいかより高 い菌体密度に生育したく第３Ａ及びＢ図）。表２は生！２４時間後の菌株ＴＣ４ と絡み替え菌のＭｔ終菌体密度をまとめている。好気的な条件下てｐ　Ｌ　ＯＩ 　３０８−１ｏを含有する菌株ＴＣ４は最も高い菌体密度に達し、これにｐ　＋ −０１３０８−２、Ｉ）　Ｌ　Ｏ１２９２、ｐＬ　ＯＩ　２９５（幾らか溶菌が 見られる）及びｐ　Ｌ　Ｏ＋　３０８−５を含有するＴｅ３が続く。

嫌気的条件下テＩｔ　ｐ　Ｌ　Ｏ［３０８−１０及びｐ　Ｌ　ＯＩ　２９５を含 有する菌株ＴＣ４の最終菌体密度はおよそ等しく、これにｐＬＯＩ２９２、ｐ　 Ｌ　Ｏ１３０Ｂ−２、ｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−５及びｐＬＯｉ２９１を含有する Ｔｅ３が統く。

ｉ１！４図は生ｗ２４時間後の菌体中のピルベートデカルボキシラーゼ活性の水 準とＩ！に＄＃薗菌体度の間の関係を示している。ピルベートデカルボキシラー ゼの合成は、これらの組み替え菌中てはアルコールデヒドロゲナーゼ１１のもと の組合わされているので、このプロットはＩｋ終菌体密度に対するＮＡＩ）”再 生に対する代替Ｚ、モビリス系の効果を表わしている。これらの賃料から、Ｚ、 モビリスのエタノール生学に対する経路の表現が嫌気的及び好気的条件の両方の 下で最終菌体密度を増加することが明らかである。菌株Ｔ　Ｃ４（ｐ　Ｌ　０１ ３０８−１’ｏ）中でピルベートデカルボキシラーゼ（６，５＋１Ｊ）及びアル コールデヒドロゲナーゼ１１（２，５１Ｕ）の表現の水準は嫌気的及び好気的生 育の両方に対し殆と最適である。菌株Ｔｃ４（ｐＬＯＴ２９５）中のエタノール 発生酵素の表現水準は、過剰のよってあり、好気的条件下で部分的な溶菌を伴う 減少した菌体生育を生し、嫌気的条件下で僅かに減少した生育を生している。

生育の悪さと対称的に（蓋かな見掛けの溶菌を、そして急速に振盪したフラスコ に於ける生育の間の溶菌を伴う嫌気的条件下での菌株ＴＣ４（ｐＬＯＩ２９５） の生育の増加は、高度に好気的な環境がこの構築にはダメージを与えるものであ り得ることを示唆している。！！フラスコ中での生育の間に揺動の速度を１７３ に減少したときにこの組み替え菌の溶菌は劇的に減少し、最終菌体密度は増加し た。

実施例６　生育の間のプロスの酸性化に対するエタノール発生酵素の影響 第３Ｃ図は嫌気的な生育の間のプロスのｐＨの変化のプロットを示す。プラスミ ドを欠いているＴｅ３の菌株の最初の６時間の生育の間はｐＨは急速に落ちるが 、エタノール発生Ｗｓ紫を含有する誘導菌ではよりゆっくりと減少するゆ最初の １２時間の間の酸性化は、ｐＬ　ＯＩ　２９５を含有している菌株ＴＣＡ中では 非常に減少し、ｌ）　Ｌ　ＯＩ　３０８−１０、ｐ　Ｌ　Ｏ１３０８−２及びｐ 　Ｌ　Ｏ＋　３０８−５を含有するＴＣ４がこれに続く。菌株ＴＣ４（ｐＬＯＩ ２９＋＞及びＴＣ４（ｐＬＯ［２９２）の菌株のデータは示されていないがそれ ぞれＴＣ４（ｐ　Ｌ　Ｏ＋　３０８−５）の下及び上にくる。、組み替え菌は、 より高い最終菌体密度に達するが、嫌気的及び好気的な条件下のもとて２４時間 生育された絹み替え菌からのブロスのｐＨはエタノール発生酵素を欠いている菌 株ＴＣ４からのブロスのものよりも酸性度が小さい（表２）。

増加した画体生育を伴った絹み替え菌中の酸性化の減少した速度及び程度は、ｐ Ｈの落ち込みが非常に好気的な条件下でさえも生育を制限する主要な因子であっ たことを示唆した。この仮説は、１／１０容量の１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ７，０）を補充した培地中で生育した菌株ＴＣ４（プラスミドを欠いている） の最終菌体密度の８５Ｘ増加によって支持される。緩衝液の添加のより低い水準 は中間の生育の水準を生した。

実施例７１１Ｇ酵生産物に対するエタノール発生酵素の影響 表３は好気的及び嫌気的条件下で２４時間生育させた後の菌株ＴＣ４及び組み替 え菌によって造られた１１Ｂ酵生産物の分析をまとめたものである。好気的条件 下ては、検出されるエタノールはなく、アセテートが、栄養に冨んだ培地中でプ ラスミドを欠いている菌株ＴＣ４の生育の間１Ｅ積した主要な醗酵生産物である 。製造されたアセテートの置はＺ、モビリスからのエタノール発生酵素を含有し ている菌株中で廟的に減少し、エタノールが主要な醗酵生産物に見えた。ｐ　Ｌ 　ＯＩ　３０８−１．０を含有するＴＣ４の菌株は、殆とエタノールを生労し、 ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９５、ｐＬ　Ｏｌ　３０Ｂ−２、ｐ　Ｌ　Ｏｌ　２９２、ｐ　 Ｌ　Ｏｒ　３０８−５及びｐＬＯ■２９１を含有するＴＣ４がこれに続いた。こ れらの好気的な条件下で少量のラクテートも全てのこれらの菌株によって生産さ れた（０．６〜１，２頂Ｍ）。ｐ　Ｌ　Ｏ［３０８−１０を含有している菌株Ｔ Ｃ４のみが認められる量のサクシネートを蓄積したが、この生成物はそれても醗 酵生産物の［６’１１ｚにすぎず、９４ｚがエタノールである。

表３　好気的及び嫌気的生育の蘭の醗酵生産物の比較生育　醗酵生産物［ｗＭぐ ＳＤ）］ ］灸上−エユ昼上二一−コエユ−一上巨」−−ｎ区」−一μソ」−ｐＬＯ１３０ ８−２Ｔｒ　１．２（０，３）　２２（２）　９８（３）ｐＬＯ１３０８−５７ ｒ　０．９（０，２）　４３（３）・　１５（２）ｐＬＯ１３０Ｈ−１ｏ　４． ９（０，５）　１．０（０，２）　１７（２）　３３７（２１）ｐＬＯ１２９５ Ｔｒ　１．１（０，４）　１３（１）　１１４（１０）ｐＬｔ）１２９１　Ｔｒ 　Ｏ，６（０，２）　３４（３）　？（１）ｐＬＯ１２９２Ｔｒ　１．３（０， ２）　３０（１，５）　２４（１）ｐＬＯ１３０Ｂ−２０，８（０，１）　？（ ０，５）　４（０，３）　Ｈ（５）１１１月３０８−５　０．３（０，１）　＋ ８（２）　６（１）　１６（２）ｐＬＯ１３０８−１０５，０（０，４）　１０ （＋）　１．２（０，２）　４８２（２３）ｐＬＯ１２９５２，２（０，２０） 　６（１）　３（０，３）　９０（２）ｐＬＯ１２９１１，０（０，１）　＋５ （０，５）　？（０，２）　４（０，５）ｐＬＯ１２９２２，３（０，２）　９ （０，７）　７．２（０，３）　２１（１）嫌菌株的な条件下でラクテートはグ ルコースを含有している栄養に冨んだ培地に於いてプラスミドを欠く菌株ＴＣ４ の２４時閏の生育の間に蓄積する主要なＷａ！Ｓ１生産物であり、より少ない量 のアセテート、サクシネート及びエタノールが存在する。ラクテートの生産は、 エタノール発生酵素を含有する菌株中で劇的に減少し、実質的な量のエタノール の生産が伴う、Ｍ株ＴＣ４（ｐＬＯＩ３０８−１０）は最大量のエタノールを生 し、この生成物のみが全体の可溶性のｉｓ＊生産物の９７ｚを占める。試験され た生物の間でのエタノール生産の傾向は、好気的な生育の間に於けるものと同し てあった。Ｔ　Ｃ４＜ｐＬ　ＯＩ　３０８−１０）を除いて、全ての生物が実際 に嫌気的な条件下で２４時間後、好気的な条件下よりも少ない合計のエタノール を生産した。このより低い水準の蓄積したエタノールは、これらの嫌菌株的な条 件下で造られる全体の菌体マスの減少によって生したよってあり、従ってエタノ ール容量生産の速度が減少した。

嫌気的及び好気的条件下でのエタノール生産の程度（表３）はＺ、モとリスエタ ノール発生遺伝子の表現の水準と比例している（表１）。エタノール生産は菌株 ＴＣ４（ｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−１０）中で最適であるよってあり、ピルベート デカルボキシラーゼ活性が６１［Ｊでアルコールデヒドロゲナーゼ１１活性が２ ．５１１Ｊである。

Ｚ、モビリスからのエタノール発生酵素を表現するプラスミドを含有している大 腸菌ＴＣ４の誘導菌はプラスミドを欠いた親生物よりもより高い画体密度に生育 する。

最終菌体密度の増加、培地中にエタノールが蓄積する程度、及び生育の賞の培養 基ブロスの酸性化の速度の減少は全てＺ、モビリスのエタノール発生酵素の表現 水準と相関している。外来のプロモーターが転写制御と関連する潜在的な問題を 最少にする為にｐ　Ｌ　Ｏ＋　２９５（ｌａｃ）を除く全ての構築物に於いて遺 伝子を表現するのに使用した。

生育及びエタノール生産の為の最適に最も近い表現の水準はｐ　Ｌ　ＯＩ　３０ ８−１０によって提供されたく全菌体蛋白質のｍｇあたりビルヘートデカルボキ ンラーゼ６．５目ノ及びアルコールデヒトコケナーゼ２．５ＮＪ）　、大ＩＩｍ 菌の表現のこの水準が常にＮＡＤ”の再生の為のエタノール経路のみを含有する Ｚ、モビｌ／スＣＰ４中に存在するものよりも高かった。

エタノール発生酵素の表現水準は菌株ＴＣ４（ｐＬＯ＋２９５）で過剰であるよ うに見えた（可溶２体蛋白質の１７％）。

この表現の高水準（よ、好気的条件下で、部分的な溶菌、より遅い生育、及びエ タノール生産の減少を伴った。これらの効果はより遅い攪拌、嫌ス的条件下での 生育によって減少した６高度に好気的な生育の間に生した見掛けの損傷及び部分 的な溶菌はＺ、モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼ１１及び元来のＮＡＤＨ オキシダーゼ（電子伝達系と結合している）の高水準の組合わせによるＮＡＤＨ の涸渇に開運していたかもしれない。

主要生成物としてのエタノールの生産は、犬囁菌ＴＣ４の生育速度に影響しない ようにみえる。ｐｅｔオペロンを表現し、エタノールを生産するｐＬｏ　＋３０ ８（Ｃｏ　ｌ　Ｅｌレプリコン）の誘導体を含有している菌株はグルコースを有 する好気的条件下での親生物と同し様に急速に生育して親生物よりも高い最終光 学密度に達した。ＲＳ　Ｆ　＋０ＩＬ、プｌ／　ｊ　ン？　有ｆるｐＬＯ＋２９ １又はＩ）　Ｌ　ＯＪ　２９２を含有する菌株は好気的な条件下でよりゆっくり と生育した。

これらの二つの構築物はより低い水準のエタノール発生酵素を表現し、ｐ　Ｌ　 ＯＩ　３０８−１０よりもより少ないエタノールを生産したのでより遅い生育の 理由はｐｅｔオペロンの表現より毛ヘクターの性質に起因ずろ。

実施ｆｆｑ８　添加菌株のｙ４製 エタノール生産微生物として使用する為のよりすぐれた特性を有するｍ菌を得る 試みをし、かつ同定する為に、追加的な大ＨＭＭ株を試験した６次の大１１１１ 菌薗株が使用された。ＡＴＣＣ８６７７、Ａ　Ｔ　ＣＣ８７３９、Ａ　Ｔ　ＣＣ ９６３７、Ａ　Ｔ　ＣＣ＋１３０３、Ａ　Ｔ　ＣＣ＋１７７５、Ａ　Ｔ　ＣＣ＋ ４９４８、ＡＴＣＣ１５２４４、及びＡ　Ｔ　ＣＣ２３２２７，これらはトリプ トン（ｌｏｇ／ｌ）　、酵母抽出物（５呂／１）、塩化ナトリウム（５ｇ／ｌ） 及Ｕ醗酵可能なＷを含有するルリアブロス（ルリア。

５、八、及び門、デルプル 中て３０℃てｔｆｔｉｊｉする水浴中で生育された。別途示されない限り、グル コースとラクトースは１００ｇ／ｌの濃度で添加され、キシロースは８０ｇだの 濃度で加えられた。糖は別々に、蒸留水中でダブルストレンスのオートクレーブ にかけられたく１２１℃１５分）。キシロースくシグマケミカルカンパニー、ミ スリー州セントルイス）の溶液は酸性であり、オートクレーブ前に水酸化ナトリ ウムで中相され、この中和を失敗すると非常に褐色化し、分解する。類似の醗酵 結果かオートクレーブか瀘１１！！滅菌した糖で得られた。エタノール経路の酵 素に対しコートする遺伝子を含有する組み習え菌株が、アロス中及び平板培地上 で生延びることは、醗酵可能な糖の存在を必要とする。示される場合にはテトラ サイクリンが最終濃度１０ｍｇ／ｌて加えられた。

実施例９　追加的菌株の環境的な耐久性エタノール生産の為のプラスミドの導入 の前に大Ｉｌ＃１Ｍの以前に同定した８つの異なる菌株を環境的な耐久性につい て比較した。菌株をそれらの塩化ナトリウムと低いｐＨ及びエタノールに対する 抵抗性につき試験した。塩化ナトリウム及び表４の糖の濃度はもともとの培地に 存在するものを含んでいる。培地の最初のｐＨは６．８であり、示されている場 合にはＨＣＩでより低い値に調節した。

酸性化した培地を濾過で滅菌した。エタノールを冷却の後オートクレーブした培 地に加えた。糖は別にオートクレーブした．試験試薬の非存在下で各々の糖中て 生育した一夜培養基を３１の試験培地を含有している１３χ７５−培養試験官中 に６０倍に希釈した。生育は４８時間後に５５００■に於ける光学密度（　Ｑ　 、　Ｄ　、　）として測定した。１．０の光′＄密度は０．２５ｍｇ／ｍｌの菌 体蛋白質に等し・く、そして０．３３℃ｇの菌体乾燥重電に等しい。環境的な耐 久性の試験に於いて、０、２以下の最終光学密度は二つのダアリング未満である ことを反映しており、−視てきるものと考えられろ。

表４はグルコースを含有ずろ培地に於けるこれらの結果をまとめたものである。

同様の結果がラクトース又はキシロースを含有している培地に於いて得られた。

菌株Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　８　６　７　７、Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　８　７　３　９及びＡ ＴＣＣ１１．７７５はエタノールの低い濃度による阻害に対し特に感受性であっ た。菌株ＡＴＣＣ９６３７及びＡＴＣＣｌ１７７５は低いｐＨに最も抵抗性であ ったが、ＡＴＣＣ２３２２７を除く全ての菌株はｐＨ４．０で少なくとも２〜４ のダブリングて生育した。全ての菌株は４５℃で生育し、より高い温度で生育は 限られており、４５℃以上ではとれもサブｔＳ　＊基にすることが出来なかった 。全ての菌株は２０％グルコース、２０％ラクトース又は１２％キシロースを含 有する培地で生育した。

表４　化学的及び物理的なストレスの下でｌｏＯｇ／ｌグルコースを含有するシ リアプロス中での大膓菌の生育ＮａＣｌ（ｇ／１） ５０　＋　＋＋　＋＋　＋＋＋＋　＋＋　＋＋　＋＋６０　０　＋　＋＋　＋＋ ＋＋＋　÷　十＋７０　０　０　＋　＋　Ｏ÷　＋　＋ エタノール（容ｊｌ＄ン ３．３　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋＋＋　＋＋　＋＋　＋＋５、Ｑ　＋＋　＋＋　 ＋　＋　÷　＋　＋　＋６．３　０　＋＋　＋　＋　＋　＋　４　０７．５　０ 　＋　＋　０　０　＋　０　０８．８　０　０　０　０　０　０　０　０酸度 ｐＨ４，５０＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋ｐＨ４，２５＋ ＋　＋＋　＋＋　＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋ｐＨ４，ｏｏ＋＋　＋＋＋　＋＋　 ＋　＋　。

ｐＨ３，７５００＋ｏ　＋　ＯＯＯ 温度（’Ｃ） ４５　＋＋　＋＋　十＋　＋＋＋　十＋　＋＋＋＋０　＝Ｏ，Ｄ、５５０に於い て２未満のダブリング＋＝２〜４のダブリング ＋＋＝４を越えるダブリング 実施ｆＭ１０　追加の菌株の糖の利用 二つの方法で塘の利用を試験した。菌株は２χの炭水化物を補充したマツコンキ ー（ＭａＣｏｎｋｅｙ）寒天上に赤いコロニーを発達させた菌株を糖の利用あり と記録した（シルハビー、　Ｔ　、　ｊ　、及びｊ、Ｒ，ヘラフライズ［１９８ ５］　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４９：３９Ｌ４１８）　ａ菌体は、製 造業社の指示に従い、バイオログ（Ｂｉｏｌｏｇ）　ＥＣ平板培養基（カリフォ ルニア州へイワートのバイオログインコーボレーテット１りを用いても試験した 。バイオログ平板培養基は迅速で都合がよく、基質の利用の目安としてＮＡＤＨ 生産を検出する（テトラゾニウム塩の不溶性ホルマザンへの転換）。両方の方法 は１３個の試験した糖につき完全に一致するものであった。

全ての試験した菌株は、グルコース、プラクドース、ガラクトース、マンノース 、アラビノース、ラクトースグルクロン酸およびガラクツロン酸を利用した。菌 株１１７７５はキシコースを利用しなかった。マルトースと、マルトトリオース はＡＴＣＣ１１３０３とＡ　Ｔ　＋：　（：　２３２２７によって使用されなか った。全ての菌株はセロヒオースで弱い正の反応を示した。菌株ＡＴＣＣ９６３ ７のみがシュークロースを利用した。徳利用試験の結果を表５に示す。

表５　ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９７及Ｕ’　ｐ　Ｌ　Ｏ＋　３０８−１１：Ｅ有シテイ ルクールコース　無　４．０　３．７　６．１　６．０り゛ル］−１　ｐＬ１１ １２９７　１０．０　＋０．５　１０．５　１０．０り″ＩＩコース　ｐＬＯ１ ３０８−１１９，８９，５１１，４１１，２ラクトース　無　４．３　３．８　 ７．５　６．０ラクト−２ｐＬＯ１２９７１３，０６，８１１，６１０，８ラク トース　ｐＬＯ１３０８−１１１０，０１０，０１＋、５　１１．０キＪロース 　輝　４．１　３．７　７．７　７．３キノＯ−２ｐＬＯＩ２９７　８．１　１ ０．６　１０．８　１０．６−１ＩＪロース　ｐＬＯ１３０８−１１１０，０６ ，８＋１．４　８．５クールコース　＝　４．７　５．６　７．０　６．６クー ルコース　ｐＬＯ＋２９７　９．５　９．５　１０．２り勺■コース　ｐＬＯ１ ３０８−１１９，３１０，８１１，４ラクトース　＠　４．５　６．１　？、８ 　６．４ラクトース　ｐＬＯＩ２９７　７．６　−　１０．５　７．０ラクトー ス　ρＬＯＩ３０８−１１　−　７．３　１０．０　＋０．０キノロース　＄　 ４．９　５．９　７．２　７．０キＪＯ−ス　ｐＬＯ１２９７４，？　−１１， ０１１，ＯＮＮａ−ス　ｐＬＯ１３０８−１ｔ　−１１，４＋０．６　１２．０ 横棒はデーターが人手出来なかったことを示す。

実施例１１　追加の菌株の遺伝的な変更標準の方法を用いて二つの新たなプラス ミドを構築したくマニアティス、Ｔ１、Ｅ、Ｆ、フィッシュ及びＪ、サンプルツ ク［＋９８２コＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｒｎｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ　、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、ニューヨーク州 コールトスプリングハーハー）、これらは、選択可能なマーカーとして、アンビ シｌ／ンとテトラサイクリンに対する抵抗性の遺伝子を含有している。クリプテ イック（ｃｒｉｐｔｉｃ）なＺ、モビｌ／スのプロモーター、ビルヘートデカル ポキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び転写ターミネータ−を含有して いるエタノール生産オペコン（ｐｅｔ−オペコン）は、ｐ　Ｌ　Ｏｒ　３０８− １０　（イングラハム及びコンウェイ［１９８８］上記のもの）からの５．２ｋ ｂのＥｃｏＲＩ断片として取除き、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＥｃｏＲ１位置へ挿入し 、Ｉ）　Ｌ　Ｏ１３０８−１１を遣った。プラスミドｐＬＯ■２９７はテトラサ イクリン抵抗遺伝子を含有するｐＣＯ５２ＥＭＢＬ　（ボーストカ＾、、Ｈ，Ｒ ，ラックウィズ、Ａ、−門。

フィッシャラフ及びＨ，レイラッチ［１９８４］Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、ｔＪＳＡ　８１：４１２９−４１３３）からの２．８ｋｂＥ　ｃｏＲＩ 断片をｐＬＯＩ２９５（イングラム等［＋９８７］上記のもの）のＳ　ａｌ　１ 位置に挿入することによって構築した。粘着末端を連結前に大ｌＩＩ菌ＤＮＡポ リメラーゼ（マニアティス等上記）のフレノウ断片で処理することによって除去 した。

プラスミドをマントル及びヒガー（マントル、Ｍ、及びＡ。

ヒガ−Ｃ１９７０］Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５３：１５９−１６２）の塩化カル シウム手順を用いて形質転換により、大腸菌の異なる菌株中に導入した。選択は ２％グルコース及びテトラサイクリンを含有する固体培地上でなされた。プラス ミド安定性は、抗生物Ｘ選択の非存在下で、２５世代の生育の後に抗生物質マー カーを保持している面体の％とじて表現される。

エタノール生産のための遺伝子を有するプラスミドを持っている組替え菌株は、 通掌大きなコロニーとして生育し、このコロニーは発酵可能な糖を含有している 固体培地上で、２４〜４８時間後に黄色に変る。液体培地では、これらの＠替え 萌のＩ！ｌ終萌体密度ζよ、プラスミドを欠いている対照よりも２倍〜３Ｍ高か った。形質転換は、数回の試みの後に、Ａ　Ｔ　ＣＣ１４９４８カラｐ　Ｌ　Ｏ ｒ　２９７で、又はＡ　Ｔ　ＣＣ＋１７７５カラｐ　Ｌ　Ｏｒ　３０８−ＩＩて 行なわれた。菌株Ａ　Ｔ　ＣＣ１１７７５ζよキンロースを利用せずこの菌株の 絹替え菌は、発酵可能な糖としてのキシロースで、対照よりもより高い密度に生 育しなかったが、ラクトースとグルコースでは増加した生育が認められた。

プラスミドの安定性は、２５世代についてグルコースを含有する培地中で、生育 させた後に調べたく表６）。両方のプラスミドか同し、レプリコンを含有してお り、ＡＴＣＣ８６７７とへＴ　ＣＣ８７３９を除いて全ての菌株でよく保持され た。

表６　抗生物質選択の非存在下でのグルコースでの匹ｐＬ　Ｏｌ　２９７　Ｌ　 ＯＩ　３０８−ＩＩ９６３７　ｔｏｏ　９０ ＋１３０３　９８　９８ ＋５２２４　９９　１００ ２３２２７　９＋　ｔｏ。

横棒はデーターが人手出来なかったことを示す。

実施例１２　遺伝的に変更された菌株におけるピルベートデカルボキシラーゼ活 性の表現 ピルベートデカルボキシラーゼ活性は、およそ最大生育の半分である光学密度４ ．０で菌体が収穫されたことを除いて前に記載したように測定した（コンウェイ 等［１９８７コ上記、ニール等［，１９８７］上記）。Ｚモビリスのピルベート デカルボキシラーゼの活性の表現は、テトラサイクリンの存在下での生育の後に 調べた（表７）。ｐ　Ｌ　０１２９７の場合、Ｚモとリス遺伝子は大腸菌１ａｃ プロモーターの制御下で表現された。ｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−１１はｐｅｔオペ ロンの表現のためではクリプテイック（ｃｒｉｐｔｉｃ）Ｚ　、モビリスプロモ ーターを利用した。菌株ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬ　ＯＩ　２９７）　、Ａ　Ｔ 　ＣＣ＋１７７５　（ｐ　Ｌ　ＯＴ　２９７）及ヒＡＴＣＣ１５２２４（ｐ　Ｌ 　ＯＩ　２９７）は最高の水準の活性を有した。

表７　グルコースでの生育の閘ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９７とｐＬＯｌ　３０８−１１ を持っている大ｌＩＩｉｍｒ株中のＺモビリスビルベートデカルボキシラーゼの 表現 ＡＴＣＣ菌株　ピルベートデカルボキシラーゼ活性８ｐ　Ｌ　ＯＴ　２９７　Ｌ 　ＯＩ　３０８−ＩＩ８６７７　５．７　６．０ ８７３９　０．８　１．４ ９６３７　１．１　１．４ ＋１３０３　１６．７　２．１ １１７７５　１７．１ １４９４８　２．５ ＋５２２４　１８．３　１．８ ２３２２７　２．３　１．７ １菌体蛋白１当りの１．Ｕ、ての活性 ｂダッシュはデーターが人手出来なかったことを示す。

実施例１３　遺伝的に変更された菌株のエタノール生産ルリアブロスを最＆ｆＪ 度０．２Ｍの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を含めることによって発酵実験 に対し修正した。燐酸緩衝液、複合培地成分及び糖を別個にオートクレイプにか け、冷却後混合した。テトラサイクリンを１０ｍｇだの濃度で含めた。接種菌は ２４時閏新たに単離したコロニーから生育させ、試験されるべき発酵培地中で洗 浄し、そしておよそ１．０の５５０ｎｍ初期光学密度に加えた０発酵は３０℃又 は３７℃で８０１のブロスを含有し、ゴム隔壁を備え、そしてガスが逃げられる ように２５ゲージの針を備えた１００１の容積測定フラスコ中で３０℃で又は３ ７℃で実施した。！酵フラスコを温度制御水浴中に浸漬し、１１００ｒｐで磁器 攪拌機で攪拌した。

前記のように、ガスクロマトグラフィーでエタノール濃度を測定しくゾンデツク 、ＬＭ、及びり、０．イングラム［＋９８５］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、５１：１９７−２００）そして容積％として表現した。転換効 率は、１００％効率が２０８のグルコース又はキシロース当り１２．７５ｍ１の エタノール（Ｉｏ、２ｇ）の生産を、そして２０ｇ当りのラクトース１３．５ｍ ｌのエタノール（１０，８ｇ）を生じると仮定して加えた糖に基づいて計算した 。

全ての遺伝子工学的に処理した大腸菌の菌株は、有意幌な量のエタノールを糖か ら製造した（表８）。菌株Ａカリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を含有する培地中で より高い水準のエタノールが造られることが示された。同様の又はより優れた結 果がこの緩衝液の代りに自動化したｐＨ調節を用いて得られることが予測される 。１５％グルコスでは、より高いエタノール水準が４８時間後３７℃よりも■℃ で造られる。ラクトースとキシコースの発酵は、低温即ち３０℃のみで調べられ た。一般に、高水準のエタノールがｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−１１よりもｐＬＯＩ ２９７を持っている菌株によって造られた。菌株へＴＣＣＩ＋３０３（＋）ＬＯ ＋２９７）、ＡＴＣＣ１ｔ７７５（ｐＬｏ　１２９７）及びＡ　Ｔ　ＣＣ１５２ ２４（ｐＬ　０１２９７）は、４８時間後１５％のゲルコールから最高水準のエ タノール即ち容量で５．８％〜６．９％を造った。はとんどの菌株は、最初の実 験でキシロースに対し許容度が小さく、発酵の比較は８％キシロースを用いて実 施された。Ａ　Ｔ　ＣＣ９６３７（ｐ　Ｌ　Ｏ＋　２９７）　、Ａ　Ｔ　ＣＣ１ １３０３（ｐＬ　０１２９７）及びＡ　Ｔ　ＣＣ１５２２４（ｐ　Ｌ　Ｏ１２９ ７）は、７２時間後８％のキシロースから最高水準のエタノール（４゜８％〜５ ．２％）を造った。全ての菌株は１５％ラクトース中でよく生育した。菌株へＴ 　ＣＣ１１３０３（１）　Ｌ　ＯＩ　２９７＞及びＡ　Ｔ　ＣＣ１５２２４（ｐ 　Ｌ　Ｏ＋　２９７）は４８時間後ラクトースから最高水準のエタノール即ちそ れぞれ６．１％と５．６％を遣った。

表８　ｐ　Ｌ　ＯＩ　２９７とｐ　Ｌ　ＯＩ　３０８−１１を持っている大１１ １ＩＩ菌株によるグルコース（４８時間〉、キシロース（７２時間）及びラクト ース（４８時ｒｆりからのバッチ発酵に於いて製造されたエタノール １５％クールコース　ｐＬＯ＋２９７８　２．４　４．７　４．２　４．３１５ ＄り−ａ］−２ｐＬＯ１３０８−１１”　３．６　１．４　２．１　１．３１５ Ｘり−Ａ１４　ｐＬｌ）１２９７”　３．２　４．７　４．１　５．８１５１り 一１１コ−２ｐＬＯＩ３０８−１１”　５．８　５．０　３．５　１．．５１５ Ｘ５クト−２ｐＬＯ１２９７”　２．３　４．４　５．３　６．＋１５ＨＨ−２ ｐＬ０１３０８−１１１）　２．３　２．１　３．４　０．９ＥＨＥＪＯ−２ｐ ＬＯＩ２９７ｂ　Ｏ，９４，１４，８５，２８ＨノＧ−２ｐＬＯ１３０８−１１ ’　２．０　２．８　２．８　１．２１１７７５　１４９４８　＋５２２４　２ ３２２７１５χり”ルコース　ｐＬＯ１２９７１１４，８−４，８０，９１５ｚ り″ルコース　ｐＬＯ１３０８−１１’　−３，４２，８１，３１５１−Ａ］− ２ｐＬ旧２９７ｂ　６．９　−　６．１　３．１１５％り一！１ｍ−２ｐＬＯ１ ３０８−１１ｂ　−３，８３，０３，２１５１ラク１２　ｐＬＯ１２９Ｔ′）　 ４．５　−　５．６　３．７１５％５クト−２ｐＬＯ１３０８−１１ｂ　−２， ９２，７３，０８［）０−ス　ｐＬｌ）１２９７ｔ１　−　４．８　１．２８１ すｏ−１ｐＬ０１３０８−１１０　−　２．０　３．５　１．０横棒はデーター が入手出来なかったことを示す’３７℃でｔｆ！養 Ｉ）３０℃で培養 これらの比較実験に基づいてＡ　Ｔ　ＣＣ＋１３０３　（ｐ　Ｌ　０１２９７） とへＴ　ＣＣ１５２２４（ｐＬ　ＯＩ　２９７）は、エタノール生産に対する最 良のｌｌＩ築物であるように見えろ。生育の時間コース及びエタノール生産は１ ２％のグルコース、１２％ラクトース及び８％のキンロース中で両方の菌株にお いて試験された（第１図）。菌体マスはおよそ１０倍増加し、リットル当り最終 畜度３．６ｇ乾燥重量に達した。キシロースでは菌体マスは、グルコースまたは ラクトースで観測されたものの半分の速度で増加した。エタノールの生産と生育 はエタノールの濃度が５％に達するまで、３つの糖についておよそ線形であった 。

糖のエタノールへの転換効率を計算するために、１２０時閏後の最終エタノール 濃度を３つの実験のセ・ソトから平形したく表６）。１２％グルコースと生育し た培養基における最終エタノールａ度は、７．２％（容量）であり、グルコース からの理論収率の９４％を表してしる。１２％ラクトースでは最終エタノール濃 度は６．５％であり、ラクトースからの理論収率の８０％である。８％キシロー スではつねに１００％の収率またはそれ以上を得た。キシロースでのより遅い生 育の間におけるこれらの高い収率は、グルコースからのヒルへ−トのほかにエタ ノール中の複合栄ｌＩｓの分解からのビルヘートの転換を反映しているかもしれ ない。

エタノール生産の速度は、第１図のグラフから計算され、表９にまとめられてい る。エタノールの容量における生産性は、グルコースに対する時間当りの１．４ ｇ／ｌからキシロースに対する時間当り０．６４３／ｌの範囲である。エタノー ルの特異的生産性は、３つの糖の各々に対し、初期生育期間の間に最も高かった 。最高の生産性は、グツしコースで得られ、時間当り２．１ｇのエタノール／ｇ 乾燥菌体重量であった。糖のｇ当りのエタノールの最高収率はキシロースで得ら れ、糖単独に対する最大理論収率を越えていた。

表９　ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬ０１２９７）とＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ ２９７）によるエタノール生産に対する平均された反発速度論ハラメーター １２２５クト−２１，３２，００，４３８０１５２ＥＨ４１−ス　０．６　＋、 ３　０．５２　１０２１　４２１　時間当りのエタノール／リットル ６　時間当りのエタノールｇ１Ｍ体乾燥重量ｇアラビノース、ガラクトース及び マンノースからエタノール生産をすることを調べる為に、実験をＡ　Ｔ　ＣＣ１ １３０３（、ｐＬ　ＯＩ　２９７）で実施した。エタノール１度３％〜４％を３ ０℃で４８時間後得々が、ざらに調べなかった。これらの糖をグルコースとキシ ロースに対するのと類似の経路によって代謝し、類似の収率を生しると干潮した くリン、　Ｅ、Ｃ，Ｃ，［：＋９８７コ「糖、ポリオール及びカルボキシレート に対する類似しない経路Ｊ　Ｆ、Ｃ，ニートバー１”、、ｌ。

し、イングラハム、に、Ｂ、ロウ、Ｂ、マガサニク及び門、シャエチター編、大 腸菌とサルモネラティフィムリウム、１巻２４４〜２８４頁、アメリカンソサエ ティオブマイクロバイオロジー、ワイントンＤ、Ｃ，）。

本明細書に記載した実物例と具体例は、例示目的のみのためであって、種々の変 更または修正が当業者に示唆されうることてあり、そして本発明の精禅及び範囲 に含まれ、添付の特許請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇ、　３Ａ、　Ｆｉｇ、　３Ｂ。

檀気的条う午下で゛９百贅つ主ル ご＠Ｉし〜−１−〒°栖ル不涛シラーゼ゛ミ古ｆＬＦｉ詳τｅ４ 国際調査報告 ｍ＋ｓｍ噛＋１＠Ｎｍｌ＾ＨＩＩｔｌ−噛−””ＩＩＩｃＴ／ＵＳＢ９１０３７ ５３国際調査報告 ＰＣ丁／ＵＳ　ｔ３９１０３７Ｓ３

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．エタノールを生じるように細胞にしむけ、一方がアルコールデヒドロゲナー ゼ活性に対しコードし、他方がビルベートデカルボキシラーゼ活性に対しコード する、ズィモモナスモビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）に由来する 二つの遺伝子を含んでいる、新規なオベロン。
2. ２．該オベロンが適当な制御配列と共に該ズィモモナスモビリス遺伝子を含んで いる、請求項１に記載の新規なオベロン。
3. ３．該制御配列がプロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結 合位置、ターミネーター、及び／又は他の制御配列を含んでいる、請求項２に記 載の新規なオベロン。
4. ４．該遺伝子がｌａｃプロモーターの制御下にある請求項３に記載の新規なオベ ロン。
5. ５．請求項１に記載のオベロンを含む組替えプラスミド。
6. ６．アルコールデヒドロゲナーゼ及びビルベートデカルボキシラーゼ活性に対し てコードしており、ｐＬＯＩ２９５、ｐＬＯＩ３０８−１０、ｐＬＯＩ３０８− ２、ｐＬＯＩ３０８−５、ｐＬＯＩ２９２、ｐＬＯＩ２９１、ｐＬＯＩ２９７、 及びｐＬＯＩ３０８−１１からなる群から選ばれる組替えプラスミド。
7. ７．請求項１に記載のオベロンを含む組替え宿主。
8. ８．該宿主が細菌、真菌類、酵母、及び原真核細胞からなる群から選ばれる請求 項７に記載の組替え宿主。
9. ９．該宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である請求項７に記 載の組替え宿主。
10. １０．請求項６に記載のプラスミドを含む組替え宿主。
11. １１．該組替え宿主が大腸菌である請求項１０に記載の組替え宿主。
12. １２．ビルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性に対 しコードする遺伝子を導入することによって宿主の代謝を変更することからなる 、エタノールの製造方法。
13. １３．該遺伝子が宿主に導入されるプラスミド上に含まれている請求項１２に記 載の方法。
14. １４．該宿主が細菌、真菌類、酵母、及び真核細胞からなる群から選ばれる請求 項１２に記載の方法。
15. １５．該宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏｌｉ）である請求項１２に 記載の方法。
16. １６．プラスミドが、ｐＬＯＩ２９５、ｐＬＯＩ３０８−１０、ｐＬＯＩ３０８ −２、ｐＬＯＩ３０８−５、ｐＬＯＩ２９２、ｐＬＯＩ２９１、ｐＬＯＩ２９７ 、及びｐＬＯＩ３０８−１１からなる群から選ばれる請求項１３に記載の方法。
17. １７．微生物又は真核細胞にズィモモナスモビリスのアルコールデヒドロゲナー ゼ及びビルベートデカルボキシラーゼ活性に対しコードする遺伝子を導入するこ とからなる、該微生物又は該真核細胞の成育を改良する方法。
18. １８．微生物又は真核細胞にズィモモナスモビリスのアルコールデヒドロゲナー ゼ及びビルベートデカルボキシラーゼ活性に対しコードする遺伝子を導入するこ とからなる、該微生物又は該真核細胞の成育培地中の望ましくない代謝生産物の 蓄積を防止又は減少する方法。
19. １９．成育培地にマグネシウムを添加することによって菌体（細胞）密度の増加 が達成される請求項１７に記載の方法。
20. ２０．ビルベートデカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼの活性の表 現水準が約１．５ＩＵと約１０ＩＵの間である請求項１２に記載の方法。
21. ２１．大腸菌にアルコールデヒドロゲナーゼ活性とビルベートデカルボキシラー ゼ活性を与えるプラスミドで形質転換された大腸菌。
22. ２２．形質転換前の大腸菌がＡＴＣＣ８６７７、ＡＴＣＣ８７３９、ＡＴＣＣ９ ６３７、ＡＴＣＣ１１３０３、ＡＴＣＣ１１７７５、ＡＴＣＣ１４９４８、ＡＴ ＣＣ１５２２４、及びＡＴＣＣ２３２２７からなる群から選ばれる請求項２１に 記載の大腸菌。
23. ２３．ｐＬＯＩ２９５、ｐＬＯＩ３０８−１０、ｐＬＯＩ３０８−１、ｐＬＯＩ ３０８−５、ｐＬＯＩ２９２、ｐＬＯＩ２９７、及びｐＬＯＩ３０８−１１から なる群から選ばれるプラスミドで形質転換された請求項２１に記載の大腸菌。
24. ２４．ｐＬＯＩ２９７で形質転換された請求項２３に記載の大腸菌。
25. ２５．形質転換前の大腸菌が、ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ１１３０３、及びＡ ＴＣＣ１５２２４からなる群から選ばれる請求項２４に記載の大腸菌。
26. ２６．ＡＴＣＣ９６３７（ｐＬＯＩ２９７）の特性を有する請求項２５に記載の 大腸菌。
27. ２７．ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７）の特性を有する請求項２５に記載 の大腸菌。
28. ２８．ＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７）の特性を有する請求項２５に記載 の大腸菌。
29. ２９．アルコールデヒドロゲナーゼとビルベートデカルボキシラーゼの活性が与 えられるように遺伝物質で形質転換されている微生物。
30. ３０．代謝経路が機能するのに必要な活性に対しコードする遺伝子で適当な宿主 を形質転換することからなる、該宿主に機能し得る代謝経路を導入及び確立する 方法。
31. ３１．該遺伝子が天然に存在する場合に、該遺伝子が核生物中で同じ制御支配下 にはない請求項３０に記載の方法。
32. ３２．該経路が酪酵経路である請求項３０に記載の方法。
33. ３３．宿主中に天然では存在しない代謝経路を該宿主中に確立する外来遺伝子に よって形質転換されている組替え宿主。
34. ３４．代謝経路が酪酵経路である請求項３３に記載の組替え宿主。