JPH06505875A - 組換え宿主によるエタノール生産 - Google Patents

組換え宿主によるエタノール生産

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え宿主によるエタノール生産 ｌ乳ｆｌ遣 本発明は、ＵＳＤＡ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｆｕｅｌｓ　Ｐｊｏｇｒａｍ補助金第８ ６ＣＲＣＲ１２１３４号、第８８−３７２３３−３９８７号及び第９０−３７２ ３３−５３７２号並びにＤＯＥ　０ｆｆｉｃｅ　ｏｆ　ＢａｓｉｃＥｎｅｒｇｙ 補助金第ＦＧＯ５−８６ＥＲ１３５７４号のもとにフロリダ農業試験場（ｔｈｅ 　Ｆｌｏｒｉｄａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａ ｔｉｏｎ）を経て与えられた政府補助によりなされたものである。連邦政府は本 発明に所定の権利を有する。
この出願は、１９９２年３月６日出願第０７／８４６゜３４４号、１９９１年３ 月１８日出願第０７／６７０．８２１号及び１９９０年１２月７日出願第０７／ ６２４，２７７号の一部係属出願であり、これらの出願は更に１９８９年５月１ ５日出願第０７／３５２，０６２号（現時点で米国特許第５　、ＯＯＯ，０００ 号）の一部係属出願であり、更にこの特許出願第０７／３５２，０６２号自体は １９８８年８月３１日出願第０７／２３９，０９９号（現時点で放棄）の一部係 属出願である。上記特許明細書の内容は参照により本明細書の一部を構成するも のとする。
解糖の際、細胞はグルコースのような単純な糖をピルビン酸に変換し、それに伴 ってＡＴＰ及びＮＡＤＨが正味生産される。酸化的リン酸化において機能する電 子伝達系が不在であると、解糖及びＡＴＰ生成を続行するには絶対に必要なＮ　 Ａ　Ｄ　’ｅ再再生る短経路において９５％以上のピルビン酸が消費される。が がるＮＡＤ”再生系の不用産物は一般に発酵産物と称されている。
微生物は、属によって実に多様な発酵産物を産生ずる。
かかる産物としては、乳酸、酢酸、コハク酸及び酪酸のような有機酸、並びにエ タノール、ブタノール、アセトン及びブタンジオールのような中性生成物を挙げ ることができる。実際、細菌由来の発酵産物の多様性は、分類学における一次決 定因子として使用される０例えばＢＥＲＧＥＹ’Ｓ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＳＹ ＳＴＥＭＡＴＩＣＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、Ｗｉ　Ｉ　ｌ　ｉ　ａｍｓ　＆　 Ｗｉ　ｌｋ　ｉ　ｎｓ　Ｃｏ、、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８４）（以降“バー ジエイのマニュアル”と記す）参照。
発酵の最終産物は幾つかの基本的な特性を共通に有する。
それらは、最初に産生された条件下では比較的無毒性であるが、蓄積するとより 毒性となる。最終産物の直前の前駆体は解糖過程の末端電子受容体（ｔｅｒｍｉ ｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ａｃｃｅｐｔｏｒｓ）として作用するので、最終産 物はピルビン酸よりも還元され易い、微生物が産生ずる発酵産物は、最初の最も 成功したバイオテクノロジーの実用的利用の基礎をなしており、乳製品、肉類、 飲料及び燃料がこれに含まれる。最近では、研究者がある種の微生物の遺伝子構 造を選択的に変性し得る新技術の結果、バイオテクノロジー分野で大きな進歩が なされている。
細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉは、バイオテクノロジーにおいて遺伝子 をクローニング及び修飾するための重要なビヒクルであると共に、組換え産物の 生産に最も重要な宿主である。最近では、組換えＤＮＡ研究に使用される宿主域 が、種々の細菌、酵母、菌類及び真核細胞を含むまでに拡張されている１本発明 は、変性宿主による特に有効な産物の生産を誘発するための組換えＤＮＡ技術の 使用に係わる。
本発明の宿主を変性するために使用されるＤＮＡは、一般に植物樹液及び蜂蜜中 に認められる細菌Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓから単離することができ る。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓは、パーム酒や、メキシコ産アルコール飲料であるプル ヶ（ｐｕｌｑｕｅ）を製造するためにリュウゼッラン（Ａ　ｇ　ａ　ｖ　ｅ　） の樹液発酵のための接種材料として長い間使用されている。この微生物は燃料エ タノールの生産にも使用されており、酵母よりも実質的に高い生産率でエタノー ルを生産し得ると報告されている。
Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓの栄養摂取は単純であり、アミノ酸、ヌクレオチド 及びビタミンを合成することができるが、この微生物によって代謝される糖の範 囲は極めて限定されており、通常はグルコース、フルクトース及びスクロースか らなる。これらの糖の発酵に由来する基質レベルのリン酸化は、生合成及びホメ オスタシスの唯一のエネルギー源である。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ は、発酵性糖なしでは栄養ブロスのようなリッチ培地中でさえ増殖できない。
Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓは、酸化的リン酸化のための機能系を欠く絶対発酵 性細菌である。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同様 に、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓは主要発酵産物としてエタノール及び二酸化炭素を産生 する。Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓは、２種の酵素活性物質、ビルピン酸デカル ボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼしか必要としない短経路によって エタノールを産生ずる。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、この経路においてピ ルビン酸からエタノールへの流れを制する鍵酵素である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸の非酸化的脱炭酸を触媒してアセ トアルデヒド及び二酸化炭素を生産する。この微生物中には２種のアルコールデ ヒドロゲナーゼアイソザイムが存在し、発酵の際にアセトアルデヒドをエタノー ルに還元する反応を触媒し、それに伴ってＮＡＤＨがＮＡＤ”に酸化される。細 菌アルコールデヒドロゲナーゼは多くの微生物に一般的に存在するが、ピルビン 酸デカルボキシラーゼは幾つかの細菌しか持っていない。エタノール生産者とし ての工業的有用性を増強すべ（Ｚ、ｍ。
ｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓを変性しようという試みは、極めて制限された範囲でしか成 功していない。
現在、はとんどの燃料エタノールは、コーンスターチまたはショ糖シロップのヘ キソース環からＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＺ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓを 使用して製造されている。しかしながら、かかる糖は比較的高価なバイオマス糖 源であり、食品としても比肩の価値を有している。澱粉及び糖は、植物における 全炭水化物の一部を占めるにすぎない。幹、葉、外皮、殻、穂軸などの植物炭水 化物の主形態は、構造壁ポリマー、即ちセルロース及びヘミセルロースである。
かかるポリマーが加水分解されると、グルコース、キシロース、マンノース、ガ ラクトース及びアラビノースを含む中性糖の混合物が放出される。これらの糖の 全てをエタノールまたは他の価値ある単一生成物に迅速に且つ効率的に代謝し得 る単一生物は見つかっていない。
Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓにおいてアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ及びピル ビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が別々にクローニングされ、特性 分析され、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現されている。Ｂｒ１ｕ　＆　Ｓａｈｍ［１９８ ６ａ］Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４４：２９６−３０１、［１９８６ｂ ］Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４６：１０５−１０；Ｃｏｎｗａｙ　ｅｔ 　ａｌ、［１９８７ａ］　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：９４９−５４；Ｃ ｏｎｗａｙ　ｅｔ　ａｌ、［１９８７ｂ］Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：２ ５９１−９７；Ｎｅａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、［１９８７］Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄ、Ｒｅｓ、１５　：１７５３−６１　；　Ｉｎｇｒａｍ　＆　Ｃｏｎｗａｙ　 ［１９８８］Ａｐｐ　１．Ｅｎｖ　ｉ　ｒｏｎ、Ｍｉ　ｃｒｏｂｉｏｌ、５４＋ ３９７−４０４；Ｉｎｇｒａｍ　ｅｔ　ａｌ、［１９８７］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、Ｍｉｃｒ。
ｂ　ｉ　ｏ　１．５３　：　２４２０−２５参照。
Ｂｒａｕ及びＳａｈｍ　［１９８６ａ］　（上掲）は、組換えＥ、ｃｏｌｉにお いてＺ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓピルビン酸デカルボキシラーゼの過剰発現によ ってエタノール生産が増加し得るが、その濃度は極めて低いことを示した。後の 研究で他の２種の腸内細菌Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ及びＫｌ ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａを使用することにより上記研究が拡張 され、ヘキソース、ペントース及び糖混合物からより多量のエタノールを得るこ とができた。Ｔｏｌａｎ　＆　Ｆｉｎｎ　［１９８７］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏ ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３：２０３３−３８．２０３９−４４参照。
単純な糖の原料が入手可能であれば、上述の微生物は通常有用である。しかしな がら、世界的に安価で且つ再生可能なバイオマス源の大部分は、単糖としてでは なく、主にセルロース、ヘミセルロース及びリグニ〉・の混合物であるリグノセ ルロースの形態で見い出されている。セルロースはグルコースのホモポリマーで あり、ヘミセルロースは、−次構成成分であるキシロースだけでなく有意な量の アラビノース、マンノース、グルコース及びガラクトースをも含むより複雑なヘ テロポリマーである。米国ごみ処理場由来の紙廃棄物及びヤードトラッシュ（ｙ 　ａ　ｒ　ｄ　ｔ　ｒ　ａ　ｓｈ）中に存在する糖残基の微生物変換によって千 億ガロン以上のエタノールが提供されると推定されている。上述のごとき微生物 は、リグノセルロース中に存在するセルロース及びヘミセルロースポリマーを構 成するモノマー糖を効率的に発酵するが、リグノセルロースの優れた糖化方法の 開発は依然として研究対象である。
リグノセルロースを糖化する現行方法は、酸及び酵素による加水分解を含む。酸 加水分解は通常は熱を必要とし、エネルギー使用、酸性廃棄物の生成、あとに続 く微生物発酵を妨害し得る毒性化合物の形成を含む幾つかの欠点を与える。酵素 による加水分解は望ましい代替法を与える。例えば酵素は、リグノセルロース材 料を含む培地に直接加えることができる。
エタノールまたは乳酸生産のために微生物に糖化性を付加する遺伝子工学的方法 は、培地中に高レベルの酵素を分泌させる方向で行われている。即ち該方法は、 多糖基質に作用して単糖及びオリゴ環を与える、細胞内で産生された酵素を発酵 培地中に輸送するのに必要なタンパク質を既に所有する微生物を変性することに 係わる。かかるタンパク質を輸送するのに必要な能力を欠く微生物をうまく変性 することは困難と認識されていることから、上記方法が採られている。
免肌二叉七 本発明の目的は、好気及び嫌気の両条件下で増殖する間にピルビン酸をエタノー ルに効率的に変換し得る微生物を提供することである。
本発明の別の目的は、組換え宿主の増殖を増大し、且つ、かかる宿主の増殖培地 における望ましくない代謝産物の蓄積を低下させることである。
本発明の更に別の目的は、グルコースまたはキシロースオリゴマーを、該宿主が エタノールに発酵し得る生成物に分解するポリサッカラーゼ酵素を十分な細胞内 レベルで産生ずる組換え宿主を提供することである。
■−記目的及び他の目的を達成するため、本発明の第１主要ドメインにおいては 、宿主内でのアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼの 産生をコードする異種ＤＮＡを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｔｉ以外の 組換え宿主を提供する。宿主は、宿主の一次発酵産物としてのエタノールの産生 を容易にすべく、該ＤＮＡを十分な機能レベルで発現する。
１つの有利な実施態様は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボ キシラーゼをコードするＺ、ｍ。
ｂｉｌｉｓ遺伝子を組換え宿主に使用する。第１ドメインの他の態様は、アルコ ールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を 含むプラスミドを含み、該プラスミドは、本発明の組換え宿主を提供する上で有 用である。
本発明の第２主要ドメインにおいては組換え宿主は、アルコールデヒドロゲナー ゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含む上に、宿主がオ リゴ環を輸送及び代謝し得るようにするタンパク質をコードするＤＮＡをも含む 。宿主は該ＤＮＡを、宿主がオリゴ糖代謝がら一次発酵産物としてエタノールを 産生ずるようなレベルで発現する。このドメインの好ましい宿主としては、Ｅｒ ｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのような腸内細菌を挙げることができる。
他の好ましい宿主は、グルコース、キシロース及びマルトースのようなＣ５及び ／またはＣ５糖モノマーを含む三糖及び／または三糖を代謝する。
本発明の第３主要ドメインにおいては、上述のごとき組換え宿主は、１種以上の ポリサッカラーゼを産生ずるのに必要なりＮＡを含む。宿主によるポリサッカラ ーゼの産生及びこれに続くポリサッカラーゼの培地中への放出によって、原料を 発酵性単糖及びオリゴ環に分解するのに必要な市販酵素の量が低減される。
ポリサッカラーゼＤＮＡは宿主に生来のものとし得るが、ＤＮＡは外来、即ち異 種であることが多い。有利なポリサッカラーゼとしては、セルロース分解酵素、 キシラン分解酵素及び澱粉分解酵素を挙げることができる。ボリサ・ンカラーゼ は少なくとも一部分は宿主によって分泌されてもよいし、後で放出されるよう実 質的に細胞内に蓄積されてもよい。熱安定性である細胞内に蓄積された酵素が、 熱誘導溶解によって所望のときに放出されるのが有利である。一部は分泌され、 一部は蓄積される酵素の組合せを、異種ＤＮＡによってコードすることができる 。
上記宿主のエタノール産生を増強すべく他の変性を行なうこともできる０例えば 宿主は更に、その発現産物が単糖及び／またはオリゴ環を組換え宿主中に輸送す ることに開学するタンパク質である別の異種ＤＮＡを含むことができる。同様に 、解糖系由来の別の遺伝子を宿主に組込むこともできる。このような方法で、エ タノール生産量を増強することができる。
更に、上記全ての宿主を使用するエタノール生産方法が提供される。また、オリ ゴ環をエタノール並びにより単純なオリゴ環及び／または糖モノマーに変換する ためにオリゴ糖原料を処理する方法をも提供される。更に別の態様は、本発明の 形質転宿主を使用して培地中にエタノールを生産することにより、増殖培地にお ける酸性代謝産物の蓄積を低減する方法を提供する。更に別の態様は、Ｚ、ｍｏ ｂｉｉｔｓ中に見られるようなａｄｈＢ遺伝子を宿主中で過剰発現させることか らなる、組換え宿主における機能タンパク質の産生を増強する方法を提供する。
本発明の別の態様は、オリゴ糖含有バイオマスをエタノールに発酵する方法設計 を含む。
本発明の他の目的、特性及び利点は後述の詳細説明から明らかとなろう、しかし ながら、詳細説明から本発明の主旨及び範囲内での種々の変更及び改良が当業者 には明らがであり、詳細説明及び特定の実施例は本発明の好ましい実施態様を示 すものであって、例示のためにのみ与えられていることを理解されたい６ 図面の簡単な説明 図１は、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及び アルコールデヒドロゲナーゼＩＩをコードする遺伝子を含むｐＬＯＩ２９５の構 築を示す、省略記号：ＲＩ、ＥｃｏＲＩ　；　Ｈ，Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ；　Ｂ、Ｂ ａｍＨＩ　；ｔ、ターミネータ−；　ａｄｈ、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓアル コールデヒドロゲナーゼＩＩ；ｐｄｃ、Ｚ、ｍｏｂｉ　ｌ　ｉｓピルビン酸デカ ルボキシラーゼ；　ｃａｔ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ； ＡＰ、β−ラクタマーゼ：Ｚｍ　Ｐｒｏ　ｆｒａｇｓ、プロモーター活性を示す Ｚ。
ｍｏｂｉｌｉｓ　ＤＮＡのフラグメント；Ｃｏ１Ｅ１．ｐＢＲ３２２由来の複製 開始点；ｏｒｉＶ、Ｒ８ＦＩＯＩＯ由来の複製開始点：　Ｐ　ＩＭｅ＋　ｌ　ａ 　Ｃプロモーター；Ｐ　２１１１の潜在プロモーター；　Ｋｂ、キロベース。
図２は、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及び アルコールデヒドロゲナーゼ■！をコードする遺伝子を含む幾つかの１ラスミド を示す。
図３は、株ＴＣ４及びエタノール産生酵素をコードするプラスミドを含む組換え 体による増殖及び酸生成を示す。
図４は、組換え体におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性と増殖度の相関を 示す。２４時間増殖させた後の細胞質量を、５５０　ｎｍ（０，Ｄ、５５０）に おける光学密度として表しである。
図５は、ｐＬＯＩ５１０の構築を示す。
図６は、Ｅ　ｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのエタノール産 生組換え体によるセロビオースの発酵から生成されたエタノール濃度を示す。
１］７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、ｘｙｎＺ及びｘｙｌＢを含む組換えプラスミドの構 築を示す。
１１］８Ａ及び８Ｂは、４％カンパ材キシランを含むルリアブロス（ｐＨ６，０ ）中で４５℃（図８Ａ）または６０℃（図８Ｂ）でインキュベートしたＥ、ｃｏ ｌｉ株ＫＯＩＩ（ＰＬ○Ｉ２００３）を使用したキシラン加水分解の薄層クロマ トグラフィー分析の結果を示す。
図９Ａ及び９Ｂは、組換えＥ、ｃｏ　ｌ　１ａＫＯ１１＜図９Ａ）及びに、ｏｘ ｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（図９Ｂ）による増殖時キシロオリゴ糖消費を示す。
図１０Ａ及びＩＯＢは、組換えに、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１によるキシロース 及びキシラン加水分解物のエタノールへの変換を示す。図１０Ａは増殖を示して おり、図１０Ｂはエタノール生成を示している。
１’１Ｑ１１Ａ及び１１Ｂは、Ｋ、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１の組換え株による エタノール産生番示す。図１１Ａは、株Ｍ５Δ１（ｐＬＯＴ５５５）、ｐｅｔ３ ｆｌ伝子が組み込まれた株Ｐ２、及びｐｅｔ遺伝子が組み込まれた株Ｂ１による グルコース（１００ｇ／リットル）からのエタノール生成を示す。
図１１Ｂは、株Ｐ２によるセロビオース（１００ｇ／リットル）発酵からのエタ ノール産生を示す。
図１２は、１２０時間後の、５０ｇの５ＯＬＫＡ　ＦＬＱＣ５Ｗ４０／リツトル からのエタノール収量に及ぼす市販セルラーゼ添加の影響を示す。
図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、酸膨潤セルロース（図１３Ａ）、塩基膨潤セル ロース（図１３Ｂ）及び結晶セルロース（図１３０）のＰ２（ｐｃ７６０３Ｔ） によるセルロース加水分解及び発酵の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す 。
１１１４は、５％ＣＹＴＯＬＡＳＥに等価ｃｙ＞ｘタノール収量を与える、ｃｅ ｌＤ遺伝子産物による前処理及び１％セルラーゼ使用のエタノール産生に及ぼす 増強作用を示す。
図１５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα −アミラーゼ遺伝子及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉ由 来のプルラナーゼ遺伝子を含む、プラスミドｐＬＯ１１４０及びＩ）ＬＯ１１４ １の構築を示す。
図１６Ａ及び１６Ｂはそれぞれ、Ｋｏｌｌによるグルコース及びマルトースの発 酵におけるエタノール産生及び細胞質量を示す。
１Ｚ１７は、組換えＥ、ｃｏｌｉ株ＫＯＩ　１（ｐＬＯＩ　１４０）及びに○１ １（ＰＬＯｒ１４１）による澱粉発酵の結果を示す（両様における結果は実質的 に同一であるので、Ｋｏｌ　１（ＰＬＯＩ　１４１）における結果のみを示す） 。
図１８は、発酵（７２時甫）中のＫＯＩ　１（ｐＬＯＩ　１４１）によるコーン スターチ発酵の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す。
図１９は、本発明の発酵方法の概略装置を示す。
■１Ｆと１１］」ｌ朋 ■１通常の炭水化物代謝 はとんどの動植物並びに細菌、酵母及び真菌類において、グルコースはまず嫌気 経路によって分解されてから、酸化的または発酵的に代謝される。解糖と称され る最も一般的なこの経路は、６炭素グルコ一ス分子が複数の中間物質を経て２分 子の３炭素化合物、ピルビン酸に分解される一連の酵素反応ステップを指す。こ の過程で、２分子のＮＡＤ゛が還元されてＮＡＤＨを形成する。このグルコース からピルビン酸への変換の正味反応は。
グルコース＋２Ｐ、＋２ＡＤＰ＋２ＮＡＤ”→２ピルビン酸＋２ＡＴＰ＋２ＮＡ ＤＨ＋２Ｈ’と表される。
解糖が継続するためには、解糖によって消費されるＮＡＤｏが、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ が酸化されることにより再生される必要がある。酸化的代謝の間、ＮＡＤＨは通 常、水素等個物を一連のステップを経て酸素に与え、水を形成することにより酸 化される。しかしながらほとんどの生物は、酸素のような化合物の不在下でも解 糖を続行し得る別の嫌気経路を含んでいる。かかる嫌気過程は発酵と称され、恐 らくはホモ乳酸発酵が、多くの細菌及び動物に存在するががる経路の最も一般的 なものである。ホモ乳酸発酵において、グルコースは最終的に２分子の３炭素酸 、乳酸に変換される。
ＮＡＤＨは、水素等価物をピルビン酸に与えることにより酸化され、乳酸を生成 する。乳酸発酵によるＮＡＤ’の再生の正味反応は、 ２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ→２乳酸＋２ＮＡＤ”で表される。
前述したように、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓ及びＳ、ｃｅｒｅｖｉ　ｓ　ｉ　 ａｅのごときエタノール産生生物は、グルコースを２分子のエタノールと２分子 のＣ０２とに代謝する第２のタイプの発酵（アルコール発酵）をし得る。アルコ ール発酵は、ＮＡＤ”の再生に使用されるステップが乳酸発酵とは異なる。アル コール発酵には２種類の酵素ステップが必要である。ピルビン酸デカルボキシラ ーゼはピルビン酸をアセトアルデヒドと二酸化炭素に切断する。アルコール発酵 は、水素等価物をＮＡＤＨがらアセトアルデヒドに移行させてエタノールを生成 することにより、ＮＡＤ’を再生するよう作用する。アルコール発酵によるＮＡ Ｄ”再生反応は、 ２ピルビン酸→２アセトアルデヒド＋２ＣＯ２２アセトアルデヒド＋２ＮＡＤＨ −＞２エタノール＋２ＮＡＤ”によって表される。アルコール発酵の正味反応は 、２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ →２エタノール＋２ＣＯ，＋２ＮＡＤ”で表される。
上記各酵素をコードするＤＮＡはそれぞれクローニングされており、Ｚ、ｍｏｂ 　ｉ　ｌ　ｉ　ｓピルビン酸デカルボキシラーゼは組換え発現されている０例え ばＢｒｕｕ＆Ｓａｈｍ　［１９８６ａ］　（上掲）参照、しかしながら、−次代 謝物としてエタノールを産生じない生物（“非エタノール産生生物”）をアルコ ール発酵に必要な両酵素を発現するよう幾分変性できたとしても、かかる生物の 解糖系がピルビン酸段階で大きく経路変更し得るかは全く不確定である。
これに反して、このような経路変更によって組換え宿主においてピルビン酸及び その正常産物が欠乏することが推定された。Ｂｒ：Ａｕ　＆　Ｓａｈｍ［１９８ ６ａ、ｂ］（上掲）参照。非エタノール産生生物における解糖由来の炭素をエタ ノール産生へ向ける経路変更は、相関エネルギー生成及び生合成経路に重要なＮ ＡＤ／ＮＡＤＨ比を乱す可能性もあった。
Ｉｆ、良見肌Ａ１１ しかしながら、解糖を実施する生物またはその変種を、本発明に従って、ピルビ ン酸段階で解糖由来の炭素の流れの９５％はどを、実質的に、異種ピルビン酸デ カルボキシラーゼ（ｐｄｃ）遺伝子及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ） 遺伝子によってコードされる酵素からなる合成経路に経路変更すべく遺伝子操作 （ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｌ得ることが判明した。得られたものは、−次発酵産 物としてエタノールを産生ずる遺伝子操作生物である。即ち、産生されるエタノ ールは全発酵産物の５０％を超える。
オリゴ糖を輸送及び代謝する生来能力によってより複雑な原料を発酵し得る異種 発現について宿主を選択し得ることが判明した（この点で“オリゴ糖”とは２つ 以上の糖モノマーからなる分子を指し、例えば、限定的ではないが、セロビオー ス、マルトビオース及びキシロビオースのような三糖、セロトリオース及びキシ ロトリオースのような三糖、並びに、セルロース、ヘミセルロース、澱粉、グリ コーゲン、ペクチン及びイヌリンのような長鎖多糖などがこれに含まれる）。選 択及び形質転換した桐生の能力は、ボリサッカラーゼ、即ち複合オリゴ糖をより 小さなオリゴ糖及び／または糖モノマーに分解する反応を触媒する酵素をコード する１つ以上の遺伝子を同じ宿主中で発現させることにより更に増強し得る。
（Ａ）遺伝子操作による人工エタノール産生経路の構築；本発明の重要な態様は 、細胞にエタノールを産生させるオペロンである。かかるオペロンの例は、それ ぞれアルコールデヒドロゲナーゼ活性活性及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活 性をコードするＺ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓの遺伝子と、適当な調節配列、例え ばプロモーター、インデューサー、オペレーター、リポソーム結合部位及び転写 ターミネータ−とを含む、“ｐｅｔオペロン”と称される本発明の構築物である 。従って、先の組換え系においてエタノール産生が天然アルコールデヒドロゲナ ーゼ活性に依存することは、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ及びピルビン酸デ カルボキシラーゼをコードするＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を結合してｐｅｔオペ ロンを形成することにより回避される。更に、ｐｅｔオペロンを含む組換え体に おいては、好気及び嫌気の両条件下で有意な量のエタノールが産生され得る。
微生物に、キシラナーゼ及びセルラーゼのようなポリサッカラーゼを産生ずる能 力を付与するため、本発明のエタノール産生オペロンを、所望の酵素をコードす る遺伝子を付加することにより変性することができる。或いは、１つ以上のポリ サッカラーゼをコードする遺伝子を、上述のごときエタノール産生を誘導するオ ペロンで既に操作した宿主生物を形質転換するために使用されるプラスミド中に 組込むこともできる（本発明のこの態様は後記セクションＩＩ（Ｅ　）において 詳述する）、更に別の方法によって、エタノール産生オペロンを用いて形質転換 すべき宿主を、ポリサッカラーゼを発現する天然能力について選択する。更に別 の方法では、ポリサッカラーゼ遺伝子を染色体中に組込むことによって付加する 。
単一構築物において代謝経路をコードする遺伝子を組合わせる方法は、種々の遺 伝子座由来の遺伝子を合わせて人工的なオペロンを作製する多様な状況に容易に 一般化される。従って、ｐｅｔオペロンの作製は、本発明が意図する用途の一例 にすぎない。例えば、所望の経路をコードするオペロンを作製するために、種々 の生物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子を、ピルビン 酸デカルボキシラーゼ活性をコードする他の遺伝子と組み合わせることかできる ６他の経路をコードするオペロンを作製することもできる。上述のエタノール産 生経路において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性及びピルビン酸デカルボキシ ラーゼ活性をコードする遺伝子が共通制御下にある必要はなく、別個の制御下に あってもよいし、場合によっては異なるプラスミドまたは染色体上の異なる位置 にあってもよいことは明らかである。同様に、ポリサッカラーゼをコードする遺 伝子も共通または別個の制御下にあってもよいし、異なるプラスミドまたは異な る染色***置にあってもよい。
本発明の別の態様は、組換えペプチドまたはタンパク質を効率的に産生ずるため に組換えエタノール産生宿主を使用することに係わる。即ち、ポリサッカラーゼ 以外の有効産物をコードする遺伝子を更に用いて組換え細胞を形質転換すること ができる（かかる追加遺伝子は、プラスミドに担持させるかまたは染色体内に組 込むことができる）、特に、必要なエタノール産生酵素をコードする遺伝子は通 常は高レベルで発現され、嫌気的増殖過程でピルビン酸及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｈｉ！ ｕ化からの炭素の流れを支配する。かかる条件下で、ピルビン酸炭素骨格の流れ は、有機酸の生成から一次発酵産物としてのエタノールの産生に変更され得る。
このようにして、細胞タンパク質１単位当たりの酸性化の程度は、有機酸よりは むしろエタノールの産生によって最小化される。微生物の高密度培養体の増殖の 際、酸素移動は主要制限要因となることが多く、増殖培地における酸生成及びＰ Ｈ変動をもたらすのはこの制限要因である。これに対して本発明のエタノール産 生オペロンを発現する組換え体においては、エタノール産生酵素が解糖由来のピ ルビン酸の一部をアセトアルデヒドに導き、ＮＡＤＨを再度酸化して、害の少な い代謝産物エタノールを産生ずる。酸化的リン酸化酵素及びエタノール産生酵素 のための両機能的呼吸鎖を含む株は、ＮＡＤ”の再生及び酸性不用産物の還元の 際の両経路の作用過程の故に、より高い細胞密度にまで増殖し得る。かかる固有 の融通性によってプロセス制御要件は緩和され、組換え産物の容量収量が増大す る結果となる。
通常起こる有機酸の蓄積は、嫌気増殖の際の発酵の結果と見なされている。しか しながら、好気条件下、例えば迅速に撹拌してさえ、十分量の酢酸が産生され得 る。即ち、細胞密度が高く且つ嫌気条件が優勢である場合は、酢酸生或は増殖の 初期段階から進行するものであり、後期段階に限定されない、リン酸ｖＩ衝液を 補充した培地において最終細胞密度が増加することによって示されるように、グ ルコースからの酸生成は、好気条件下でさえ、プロス及び固体培地での増殖を制 限するよう作用する。
従って、本発明のエタノール産生形質転換体は、嫌気条件下でさえ酸生成が最小 の、組換え産物の産生に優れた宿主である。多くの組換えタンパク質及びペプチ ドはシスティンまたはジスルフィド架橋を含み、これらの適正な折り畳み（ｆｏ ｌｄｉｎｇ）または反応は、活性酵素を形成するのに必須の特性である。ジスル フィド結合の形成は酸素によって促進されることから、嫌気条件下でかかるタン パク質が合成されると、制御条件下で単離及び折畳みする前に不適正な折り畳み の起こる可能性が小さくなり、生物学的活性産物をより多く回収し得る。
上記構築物におけるａｄｈＢの使用は特に有利となり得る。ａｄｈＢは５ｔｒｅ ｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎをコードする（Ａｎ　ｅｔ　ａｔ、ｒ１９９１］ＦＥＢＳ 　ＬＥＴＴＥＲ３２８２：２０５−２０８）。５ｔｒｅｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎは 、生物学的機能の保持を可能にする異種タンパク質の適正な折り畳みを支援する ことが判っている。Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、［１９９２］Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。
２６７　＋　２８４９−２８５２．従って、ａｄｈＢを使用すると組換え生物に おける機能タンパク質の産生を増強し得る。
Ｅ、ｃｏｌｉにおける好気条件下で、解糖由来のピルビン酸は主にピルビン酸デ ヒドロゲナーゼ複合体及び乳酸デヒドロゲナーゼによって代謝され、このとき過 剰量のアセチル補酵素Ａが酢酸に変換される。Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ。
ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＭＥＴＡＢＯＬＴＳＭ、ｐｐ、２１０−８０（Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　１９８６）参照、上記２種の酵素の見掛けのに、値はそ れぞれ０，４及び７．２ｍＭである。Ｚ、ｍｏｂｉｌＬｓピルビン酸デカルボキ シラーゼの見掛けのに、は、２種のＥ、ｃｏｌｉ酵素に等しい（ピルビン酸デヒ ドロゲナーゼ）がまたはそれより低く（乳酸デヒドロゲナーゼ）、従ってアセト アルデヒド生成を容易にしている。好気条件下でのＮＡＤ’再生は主に、生合成 及び見掛けのに、が５０μＭの（電子伝達系に結合した）ＮＡＤＨオキシダーゼ から生じる。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼＴＩの見掛けのに 、は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＡＤ”オキシダーゼの４分の１以下であり、アセトアル デヒドをエタノールに還元するために、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ酵素は内因性ＮＡＤ Ｈプールに対し効果的に競合し得る。従って、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓエタ ノール産生酵素の特性及びそれらの相対的に高い発現レベルは、好気条件下で炭 素の流れをエタノールへ導くのによく適している。
Ｅ、ｃｏｌｉにおける嫌気条件下で、解糖由来のピルビン酸は主に乳酸デヒドロ ゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼによって代謝される。これら２種の酵素の 見掛けのに１値はＺ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓピルビン酸デカルボキシラーゼの それぞれ１８倍及び５倍高い、同様に、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＮＡＤ’再生に関 与する主要酵素の見掛けのに、は、Ｚ。
ｍｏｂｉｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼＩＩより著しく高い、従って、Ｅ、 ｃｏｌｉにおいてＺ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓ由来のエタノール産生酵素は、炭 素（ピルビン酸）及び還元可能性（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ”）を正常発酵酵素及び酸化 的リン酸と競合し、解糖産物をエタノールに有効に導き得る。
セルロース及びヘミセルロース中に存在するラクトース及び全ての主要な糖（即 ち、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース及びマンノース）は 、本発明によれば、エタノール産生酵素をコードする遺伝子、例えばＺ、ｍｏｂ 　ｉ　ｌ　ｉ　ｓの上記エタノール経路を含むものを発現する組換え宿主によっ てエタノールに変換し得ることが見い出された。
本発明のエタノール産生に適した宿主株を選択する際には種々の因子を考慮する 必要がある。ががる因子としては、基質範囲、並びに耐糖性、耐塩性、耐エタノ ール性、耐低ｐＨ性、及び耐熱性といった環境耐性（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ ｌ　ｈａｒｄｉｎｅｓｓ）を挙げることができる。
後述するように、例えばＥ、ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ９６３７（Ｗａｋｓｍａｎ株Ｗ ）は、グルコースからのエタノール生産は他の株よりも低いが、環境耐性の点で 優れた特性を示す。
主にスクロースを利用する固有の能力のために株ＡＴＣＣ９６３７を選択した。
有利なことに、ＡＴＣＣ９６３７のこの特性によって、該株はテンサイ糖、ショ 糖、及びスクロースを含む他の原料の発酵に有用となる。ｐＬＯＩ２９７を含む ＡＴＣＣ１１３０３（ルリア株Ｂ）及びＡＴＣＣｌ５２４４（Ｋｅｐｅｓ株ＭＬ ３００）は最高レベルのエタノールを産生すると共に、容認可能なレベルの環境 耐性を示した。これら２つの構築物中でプラスミドは全く安定であリ、エタノー ル生成の更なる開発に最高の候補物質として選択した０両構築物は、十分なエタ ノール生成に要求されるＺ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓピルビン酸デカルボキシラ ーゼを高レベルで発現した。Ｉｎｇｒａｍ　ｅｔ　ａｌ、［１９８７］参照。
植物バイオマスの全ての主要な糖成分は、Ｚ、ｍｏｂｉＩｉｓ由来のエタノール 経路を含む組換えＥ、ｃｏｌｉによってエタノールに変換された。グルコース及 びキシロースからエタノールへの変換効率は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｌｏ ｖｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ、［１９８８］ＣＲＣＣｒｉｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、７：１０７−１８６参＠）及びペントース発酵酵母系について報告され ている値を超えていた。Ｂｅｃｋ　［１９８９］　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂ ｉｏｅｎｇ、　Ｓｙｍｐ、　１７：６１７−６２７；Ｊｅｆｆｒｉｅｓ　ｅｔ　 ａｌ、［１９８８］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ　１．Ｂｉ　ｏｅｎｇ、３１　：　５０ ２−５０６；Ｓｋｏｏｇ　ｅｔ　ａｌ、［１９８８］ＥｎｚｙｍｅＭｉ　ｃ　ｒ ｏｂ　ｉ　ｏ　１．Ｔｅｃｈｎｏ　１．１０　：　６６−７９；Ｓｌｉｎｉｎｇ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、［１９８５］Ｂｉ。
しｅｃｈｒｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、７：４３１−４３６参照。Ｌｏｖｉｔｔ　ｅｔ　 ａｌ、（上掲）によって報告されたところでは、グルコースがＳ、ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅによって変換されるより高い効率で、キシロースが組換えＥ、ｃ。
Ｉｔによってエタノール変換された。キシロースにおける異常に高いエタノール 収率（理論値の１００％以上）は、複合栄養物質の異化作用から誘導されるエタ ノールに起因し得る。多くのアミノ酸及び複合培地成分が、解糖中間物質または 直接ピルビン酸に異化される０次いでこのピルビン酸がエタノールに変換され得 る。
本発明によれば、ｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を種々の宿主中に形質転換し、種々の プロモーターを使用して発現することができる。かかる形質転換を行なうべく本 明細書の記述を使用することは当業者の能力内である。例えば、ｐｄＣ及びａｄ ｈ遺伝子は、異なる宿主域を有するプラスミド中に容易に挿入することができる 。Ｅ、ｃｏｌｉまたは他の標的生物中で複製すべく構築されたプラスミドは、２ 種以上の宿主中で複製し得ることから、−ｍに゛シャトルベクター”と称されて いる。かかるプラスミドは容易に入手可能であり且つ容易に使用される。最も多 く使用される組合せとしては、Ｅ、ｃｏｌｔと他の細菌、Ｅ、ｃｏｌｉと酵母、 及びＥ、ｃｏｌｉと動物細胞間のシャトルを挙げることができる。かかるベクタ ーはカタログから入手可能であり、当業者にはよく知られている。
Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を、Ｘａｎｔ、ｈｏｍｏｎａｓ、 Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ及びＥｒｗｉｎｉａ中に挿入し、発現させた。他の生物 においても同様の成果が容易に得られるであろう。最適な構築物を作製するため には例えばプロモーターの直接的な変性が必要となり得るが、可溶性細胞質タン パク質の生化学的特性及び現段階の発現の知識に基づき、うまく行くことは十分 に見込まれる０本発明によれば、ピルビン酸代謝を再誘導するのに必要な酵素活 性を発現する外来遺伝子を染色体中に組込み、プラスミドを必要とせずに発現す ることができる。後記セクションＩＩ（Ｃ，）参照０例えば、プロモーターを欠 くｐｅｔ楕築物をＥ、ｃ　ｏ　Ｉ　ｉ染色体の、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子 用のプロモーターの直後に組み込むことができる。はとんどの生物においてｐｆ ｌまたは他の遺伝子中に同様の組込みが可能であり、この場合標的遺伝子フラグ メントが相同的組換えによる組込み部位を指示しさえすればよい、ｐｆｌ以外の 標的遺伝子を組込みに使用することもできる。ｐｅｔ発現構築物は指示プレート 上で容易に同定されるので、この方法は、エタノール産生のために他の生物を迅 速に且つ効率的に構築するために広範に使用し得る。
外来遺伝子を発現させる方法を記述している文献はかなり多数ある。更にカタロ グは、種々の生物に使用し得るベクターを列挙している。グラム陰性菌、ダラム 陽性菌用のクローニングベクター、広範な宿主域が見込まれるベクター、真菌類 クローニングベクター、昆虫クローニングベクター、動物細胞クローニングベク ター、及び植物細胞クローニングベクターも当業者にはよく知られている。これ らのクローニングベクターを注文し得るカタログは容易に入手可能であり、当業 者にはよく知られている。例えばＭａｒｉｎｏ［１９８９］ＢｉｏＰｈａｒｍ　 ２：１８−３３；ＶＥＣＴＯＲ３：Ａ　５ＵＲＶＥＹ　ＯＦ　ＭＯＬＥＣＵＬＡ ＲＣＬＯＮＩＮＧ　ＶＥＣＴＯＲ３ＡＮＤ　ＴＨＥＩＲＵＳＥＳ（Ｂｕｔｔｅｒ ｗｏｒｔｈｓ　１９８８）参照。
熟練者は、別のｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を使用することもできるし、上述のＺ、 ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓ遺伝子をプローブとして用いるかまたはより好ましくは 指示プレートにおいて活性を観察することにより同定し得る他の遺伝子を使用す ることもできる９本発明においては、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、ウマ 、酵母、ヒト、昆虫、または他の細菌遺伝子のどれから単離された遺伝子から提 供されたかは問題ではない、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現はアルデヒ ド指示プレート上で直接観察し得るので、この酵素活性を示すタンパク質をコー ドする追加遺伝子を単離するために、配列情報は必要でない、実際、１９９１年 ３月現在でＧｅｎｂａｎｋデータベースに２５２のａｄｈ遺伝子が詳述されてい ることからも判るように、多数のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が当業者に は既によく知られている（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、、７００ 　Ｅ、ＥＩ　ＣａｍＬｎｏ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、ＣＡ　 ９４０４０）。
Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓは、機能的アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコ ードする２つの遺伝子を含んでおり、そのうちの一方（ａｄｈＢ）は、Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌ　ｉｃｕｍ由来のブタノールデヒドロゲ ナーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼ、及びＳａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来のＡＤＨＩＶアルコールデヒドロゲナーゼに進化的 に関連している。
これら全てはクローニングにされ、配列決定されている。
Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　Ｌ　ｓ由来の第２のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａ ｄｈＡは亜鉛アルコールデヒドロゲナーゼであり、これもまたクローニング及び 配列決定がなされている。容易に入手可能な配列から推定される一次構造を比敦 すると、ａｄｈＡ遺伝子は、動物及び植物において記載されている典型的なアル コールデヒドロゲナーゼ並びに酵母において優勢なａｄｈ遺伝子に進化的に関連 していると考えられる。ａｄｈＡ遺伝子及び他のアルコールデヒドロゲナーゼ遺 伝子は、本明細書において例示した原型のａｄｈＢ遺伝子に代えて使用すること ができる。
同様にして、本発明においては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性がＺ、ｍｏ ｂ　ｉ　１　ｉ　ｓ由来の遺伝子によって与えられるか、必要な酵素活性はコー ドするがトウモロコシ、酵母または他の生物に由来する遺伝子によって与えられ るかは問題ではない、共通系統からの生活形の進化は今や十分に容認されており 、分子遺伝学的方法によって驚くほど詳細に示されている。生物を巨視的特性に 基づく系統耐に整理分類し得るだけでなく、特定の機能のために進化した先祖遺 伝子は進化の過程で保持され、かかる機能に必要な特性は保存されている。高レ ベルの保存によって当業者は、酵素ファミリーの１つ以上のメンバーから得られ る基礎情報を使用し、機能的に等価であり遺伝的に関係する他の生物由来の酵素 を単離することができる。解糖酵素は十分に研究されているので、この最も良い 例である。
実際、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ及びＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｐｄｃにお ける情報を使用してＤＮＡプローブを設計し、上記方法によりトウモロコシ由来 のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子がうまくクローニングされている。Ｋｅ ｌｌｙ［１９８９］Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３： ２１３−２２９照、別の方法では遺伝子全体をプローブとして使用することがで きる。
配列情報を使用してトウモロコシ遺伝子が単離されてはいるが、ピルビン酸デカ ルボキシラーゼ活性を有するタンパク質の合成（ピルビン酸はアセトアルデヒド と二酸化炭素とに変換される）は、アルデヒド指示プレート上で直接観察するこ とができることから、他の遺伝子の位置決定に配列情報は必要ではない１機能的 等価物を与える多くの他のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を他の生物から 単離することもできる。かかる他の遺伝子は、数種のアルコールデヒドロゲナー ゼが適当であると立証されているように、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃに代替し 得るものとして適当である。更にこの点に関して言えば、１９９１年３月現在で ＧｅｎＢａｎｋデータベースは５種以上のｐｄｃ遺伝子を列挙している。
更なる改善として、本発明の組換え宿主は、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓにおけるグルコ ース輸送のキー成分をコードする遺伝子、即ち、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓグ ルコキナーゼ（ｇｌｋ）及びグルコース支援拡散タンパク質（ｇｌｕｃｏｓｅ− ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｇｌｆ）をコ ードする遺伝子を用いて形質転換することができる。特に、ｇｌｋ及びｇｌｆは 、ｐｅｔのごときエタノール産生オペロンに対して上述したように、人工オペロ ン内に併存させ、エタノール産生オペロンを既に含む組換え体中に形質転換する ことができる０ｇ１ｋ／ｇｌｆオペロンの発現によって、膜貫通グルコースフラ ・ンクスが増大し、従ってエタノール産生量が増加する。同様に、他の宿主にお いてオリゴ糖輸送のキー成分をコードする遺伝子または解糖系のキー成分をコー ドする遺伝子を使用し、本発明の宿主を形質転換することもできる。フラックス の律速段階をコードする遺伝子による形質転換は、エタノール産生量を高め、且 つ生合成の骨格源としての解糖中間体のレベルを増大することが期待される。
（Ｂ）発酵パラメーター：本発明によれば、異種エタノール産生遺伝子は、組換 え宿主による発酵産物としてエタノールの産生を容易にするレベルで発現される 。上述したように、かかる遺伝子を適当な非エタノール産生生物中に挿入するこ とにより、形質転換宿主は、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース及 びキシロトリオースといったオリゴ糖から有意な量のエタノールを産生ずること ができる。後述するように、本発明の組換え宿主からは約ＩＭ〜１．５Ｍのエタ ノール濃度を得ることができる。
（Ｃ）外来遺伝子の染色体組込み：外来遺伝子の染色体組込みは、プラスミドベ ースの構築物が工業処理に多くの制限を有するのに対して幾つかの利点を与える 。プラスミドベースの構築物は、染色体遺伝子よりも本質的に安定性が低く、環 境有害物質、即ち異種形質伝達の保有体（ｒｅｓｅｖｏｉｒ　ｆｏｒ　ｔｒａｎ ｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｆｈｅｔ、ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｒａｉｔ、ｓ）として 作用する。複数プラスミドを付加すると不安定性が悪化することが多い。しかし ながらプラスミドベースの構築物は、これらを使用して宿主細胞を容易に形質転 換し得るので、セルラーゼをコードする遺伝子のような異種遺伝子の発現を含む 初期実験に有効となり得る。得られたタンパク質（例えばセルラーゼ）のスクリ ーニングを容易にするためには、本発明の染色体組込みにより、エタノール産生 遺伝子を担うプラスミドは必要としないことが望ましい。
エタノール産生遺伝子はＥ、ｃｏｌｉＢにおいて染色体に組み込まれている。０ ｈｔａ　ｅｔ　ａｌ、［１９９１１Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、５７：８９３−９００参照。一般にこれは、（１）クロラムフェニコール 遺伝子の上流に位置する所望の遺伝子、及び（２）標的生物由来の同種ＤＮＡの フラグメントを含むＤＮＡフラグメントを精製することにより行われる。このＤ ＮＡを連結してレプリコンを含まない環を形成し、形質転換に使用することがで きる。Ｅ、ｃｏｌｉのケースではＰｆｌ遺伝子を標的とし、短くランダムなＳ　 ａ　１１３　ＡフラグメントをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ中で連結し、相同的組換え を促進することができる。
組換え体の一次選択は、単一コピー組込み後に増殖させた２０ｍｇクロラムフェ ニコール（“Ｃｍ”）／リットルプレートにおいて行なうことができる。かかる 構築物は、極めて低い頻度で得ることができる。エタノール産生遺伝子は最初は 、効率的にエタノール発酵するには不十分な低いレベルで発現する。６００〜１ ０００ｍｇ　Ｃｍ／リットルを含むプレートにおいて選択することにより、より 高度の発現が単一ステップで実現され得る。かかる株は極めて安定であることが 立証され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＥｒｗｉｎｉａのより最適な株において同 じ方法が成功するであろうことが推定される。幾つかの野生株の予備試験から、 エレクトロボーレーションによってプラスミド送達が向上され、組込みに必要な 労力が軽減され得ることが示されたく後記実施例１６参照）。
（Ｄ）宿主選択：上述のごとき異種ｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を発現すべく変性に 適した生物としては、特に、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、及び生来的にはエ タノール産生性でない酵母のごとき真核細胞、並びに非エタノール産生細菌を挙 げることができる。Ｅ、ｃｏｌｉに加え、Ｅｒｗｉｎｉａ属（例えばＥ、ｃｈｒ ｙｓａｎｔｈｅｍｉ）並びにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属（例えばに、ｐｌａｎｔｉ ｃ。
ｌａ及びに、ｏｘｙｔｏｃａ）の他の腸内細菌は、ペントースを含む種々の糖を 代謝できるので特に重要な宿主である。有利な宿主は、広範なグラム陰性菌（例 えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属）及びダラム陽性菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ及びＣｅｌｌｕｌｏｍ。
ｎａｓ属）から選択することができる。これら種々の宿主の各々に対して適当な 形質転換法が可能である。
上記微生物のうち所定の生物が、本発明に従ってオリゴ糖をエタノールに発酵す る宿主の選択基準を満足している。
この点で特に、（１）オリゴ糖を細胞中に輸送するのに必要なタンパク質、及び （２）かかるオリゴ糖を代謝する細胞内（原形質）レベルの酵素を産生ずること から、宿主を選択することができる。上記基準を満足する前述の微生物とじては 、Ｅ、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ及び他のＥｒｗｉｎｉａ、β−キシロシダーゼ を生来的に産生するに、ｏｘｙｔｏｃａ並びにに、ｐｌａｎｔｉｃｏｌａといっ たＫｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ種のごとき腸内細菌を挙げることができる。
所定のＥ、ｃｏｌｉもセロビオース、マルトース及び／またはマルトトリオース を輸送及び代謝するので、上記基準を満足する０例えばＨａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、 ［１９８７］Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：２７１３−１７参照。
宿主は、上記基準（１）及び（２）を満足した上で、広範なグラム陰性菌〔例え ばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種〕及びダラム陽性菌〔例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属 （例えばＢ、ｐｕｍｉ　Ｉｕｓ、Ｂ、５ｕｂｔｉ　Ｉ　ｉｓ及びＢ、ｃｏａｇｕ ｌａ　ｎ　ｓ　）　；　ＣＩ　ｏ　ｓ　ｔ　ｒ　ｉ　ｄ　ｉ　ｕ　ｍ属（例えば Ｃ１，ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌ　ｉｃｕｍ、Ｃ１，ａｅｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃ １，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、ＣＩ　、　シｂ　ｅ　ｒ　ｎｌｏｈｙｄｒｏｓ ｕｌｆｕｒｉｃｕｍ及びＣ１，ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏ　ｌｙｔｉｃｕｍ ）；Ｃｅ　Ｉ　ｌｕｔｏｍｏｎａｓ種（例えばＣ，ｕｄａ）；及びｂｕｔｙｒｉ ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）から選択することができる１例えば Ｃｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えばＣｒ。
ａｌｂｉｄｕｓ）のごとき種々の酵母、Ｍｏｎ１ｌｉａ、Ｐｉｃｈｉａ　５ｔｉ ｐｉｔｉｓ及びＰｕ１ｌｕｌａｒｉａ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種；並びに、限定的 ではないがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えばＴ、ｅｔｈａｎｏ　Ｉ　ｉ　ｃｕｓ）、Ｔ ｈｅ　ｒｍｏａｎａｅ　ｒｏｂ　ｉ　ｕｍ種（例えばＴ、ｂｒｏｃｋｉｉ）、Ｔ ｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（例えばＴ、ａｃｅｔｏｅｔｈｙ　１　ｉ 　ｃｕｓ）、及びＲｕｍ１　ｎｏｃｏｃｃｕｓ属（例えばＲ，ｆｌａｖｅｆａｃ ｉｅｎｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ属（例えばＴ。
ｆ　ｕ　ｓ　ｃ　ａ）及びＡｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ属（例えばＡ、ｃｅｌｌｕｌ ｏｌｙｔｉｃｕｓ）を含む他のオリゴ糖代謝細菌もまた容認し得る。ここでも、 かかる種々の宿主に対して適当な形質転換法が可能である。
上記基準を満足する微生物に間する文献は、例えば、Ｂｉｅｌｙ［１９８５］Ｔ ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、３　：　２８６−９０、Ｒｏｂｓｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、［１９８９］Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ。
１１　：　６２６−４４．及びＢ６ｇｕ　ｉ　ｎ　［１９９０］　Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、ＭＬｃｒｏｂｉｏｔ、４４：２１９−４８に見られ、これらの文献の内容は 参照により本明細書の一部を構成するものとする。当業者は、多くの他の宿主が 本発明に使用するのに適していることを理解しよう、適当な宿主は、被試験微生 物がオリゴ糖を輸送及び代謝するか評価すべくスクリーニングすることにより同 定し得る。このようなスクリーニングは種々の方法で行なうことができる。
例えば、適当なオリゴ糖基質上でどれが増殖するか評価すべく微生物をスクリー ニングすることができるが、この場合のスクリーニングは、モノマーのみを細胞 内に輸送するのでない微生物を選択するように設計される０例えばＨａＩＩ　ｅ ｔ　ａｌ、［１９８７］（上掲）参照、或いは、微生物の適正な細胞内酵素活性 、例えばβ−キシロシダーゼ活性をアッセイすることもできる。
本発明に使用するのに適した選択方法の例は、ペクチンを含む最少培地を使用し て、軟腐病Ｅｒｗｉｎｉａ株を腐敗Ｍ物材料から単離することからなる。５ｔａ ｒｒ、“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｅｒｗｉｎｉａ”　ｉｎ　Ｖｏｌ、ＩＩＴＨＥ　 ＰＲＯＫＡＲＹＯＴＥＳ　１２６０−７１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　 １９８１）参照、カルシウム安定化ペクチン中に孔紋を生じる単離体を特性分析 してアイデンティティを確認することができる。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａ ｌ、Ｖｏｌｕｍｅ　１．ｐｐ４６９−７６参照。
バルブ及び紙廃棄物中に豊富な適当なＫｌｅｂｓｉｅｌＩａ候補株（Ｈｕｎｔｌ ｅｙ　ｅｔ　ａｌ、［１９７６］Ｊ、Ｗａｔｅｒ　Ｐｏ１ｌｕｔｉｏｎ　Ｃｏｎ ｔｒｏｌＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ　４８：１７６６−１７７１；Ｋｎｔｔｔｅｌ　 ｅｔ　ａｌ、［１９７７］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３ ４：５５７−６３）　は、例えばＰｅｒｒｙ　ａｎｄ　Ｐａ１ａｔｋａ、Ｆｌｏ ｒｉｄａにおける植物を処理する廃棄物流から得ることができる。このような廃 棄物中の多数のｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの存在は、毒性化学物質に対する耐性及び オリゴ糖を利用する能力のごとき最適特性を有する特に有効な株の選択を促進し 得る。まず、大腸菌特異的培地（ｃｏｌｉｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｄ ｉｕｍ）において増殖させることにより株を選択しく５ｅｉｄｌｅｒ、“Ｔｈｅ 　ＧｅｎｕＳ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（Ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｐｅｓｔｓ ）”　ｉｎ　ｎ　ＴＨＥ　ＰＲＯＫＡＲＹＯＴＥＳ　１１６６−７２参照〕、更 に、インドール産生、フオゲスープロスカウエル反応、シトレートなどによって 同定する（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌｕｍｅ　１．ｐｐ４６１− ６５参照〕。
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＥｒｗｉｎｉａの単離体を、それぞれエンドグルカン ス、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシロシダー ゼ及びアラビノシダーゼに対するモデル基質として、カルボキシメチルセルロー ス、キシラン−ブルー、メチル−ウンベリフェリル　β−Ｄ−グルコピラノシド 、メチル−ウンベリフェリル　セロピロシト、メチル−ウンベリフェリル　キシ ロシド及びメチル−ウンベリフェリル　アラビノシトを分解する能力について、 ｐＨ６，０にＭ街したプレート（３０℃）上で比較することができる。単糖（ヘ キソース及びペントース）並びにセロビオース、七ロトリオース、キシロビオー ス及びキシロトリオースを代謝する能力について株をスクリーニングすることも できる。三糖及び三糖レベルは、−晩、試験管培養し、’１ｊＭ１Ｄマトグラフ ィーによって一晩インキユベートしたときの糖の消費をモニターすることで評価 し得る。キシロシダーゼは、カンパ材キシラン（Ｓｉｇｍａ）をＣｌｈｅｒｍｏ ｃｅ　Ｉ　Ｉｕｍキシラナーゼで処理することにより生成することができる。
更に有望株の増殖の耐エタノール性、耐塩性、耐熱性は、Ｅ、ｃｏｌｉＢの選択 に使用したのと実質的に同じ方法でスクリーニングすることができる。Ａｌｔｅ ｒｈｕｍ　ｅｔ　ａｌ、、［１９８９］Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、５５：１９４３−４８；Ｂｅａｌｌｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ、＆　Ｂｉｏｅｎｇ。
［１９９１１３８：２９６−３０３参照。はとんどの単離体は、保存のために液 体窒素中で凍結することができるが、各グループから得られた３種の最も有望な 株を、別の開発のために選択することができる。保存株は、新規の多糖遺伝子源 として将来の研究に有用となろう。
最適株は、リグノセルロースの全ての構成成分（三糖、三糖及び単糖）を効率的 に代謝し得る能力、４４０ｇ／リットル以上のエタノール濃度中で増殖し得る能 力、塩レベル０．３モルに耐性である能力、酢酸レベル０．２モルに耐性である 能力、温度４０℃に耐性である能力、そして、最少のプロテアーゼ活性で、セル ロース、ヘミセルロース及びペクチンの脱型台に有効な酵素を高レベルで産生ず る能力を保持すべきである。ある種の株は天然キシラナーゼまたはセルラーゼを も含む、アルコール産生用の外来遺伝子を組込んだ後、最適構築物は、理論的収 量の９０％以上の収量で、また上記有効特性を保持しつつ、試験した全ての糖か らエタノールを産生ずべきである。
分泌されたセルラーゼの全ｐＨ及び最適温度を測定すると共に熱安定性を評価す べく別の実験を行なってもよい。
この情報は、加水分解及び発酵の併存過程に最適な条件を設計する上で助けとな り得る。
（Ｅ）異種多糖の発現：前述したように、本発明の好ましい実施態様は、異種ポ リサッカラーゼを発現する組換え体を製造し、それによってオリゴ糖を発酵する 際の市販酵素の必要性を小さくしようとするものである。ポリサッカラーゼの例 としては、セルロース分解酵素、ヘミセルロース分解酵素、キシラン分解酵素及 び澱粉分解酵素を挙げることができる。
１つの有利な実施Ｒａ！においてはポリサッカラーゼは熱安定性である。この点 において、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（ｃｅｌ Ａ＋Ｂ＋Ｃ及びＤ）由来の好熱タンパク質をコードする遺伝子は、個々に細胞質 産物として高レベルで発現される。組換え再生された酵素は、発酵終了時点で細 胞を収集し、酵素がほぼ最高の活性及び優れた安定性を示す温度、例えば６０℃ に加熱することで熱安定性酵素を細胞から放出することにより回収される１次い で、酵素を複合多糖基質に所定時間、例えば約１２時間作用させる。選択した遺 伝子のシグナル部分を排除する変性は、Ｅ、ｃｏｌｉ中で産生される活性物質を 大幅に増強し、これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ及びＥｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ においても同様の効果を有する。
ｃｅ　ＩＤ遺伝子は上記のごとく使用するのに特に好ましく、本発明のｃｅｌＤ 形質転換組換え体は、精製木材バルブの機械粉砕によって誘導される粉末化セル ロース製品である５ＯＬＫＡ−ＦＬＯＣごとき基質の発酵に適している。
後記実施例１８及び図１４に示すように、ｃｅ　ＩＤによってコードされる酵素 を用いて基質を前加水分解すると、Ｃｅ１Ｄが欠失した組換え体と比較して市販 セルラーゼの必要Ｉを約１１５に減らすことができる。異種発現し細胞内に蓄積 した酵素を使用する、複合基質の“ジャンプスター）（ｊ　ｕｍｐ−ｓ　ｔａｒ ｔ）”糖化方法は、本発明によれば、複合オ゛リゴ糖（セルロース、ヘミセルロ ース、澱粉、グリコーゲン、ペクチン、イヌリンなど）を分解するためにその発 現産物が回収されるポリサッカラーゼコーディング遺伝子を用いて更に形質転換 される任意のエタノール産生組換え体にまで一般化され得る。後記実施例１７〜 １９参照。
例えば、先行の発酵で得た細胞を各後続の発酵の酵素源として使用することがで きる。また、酵素分泌は必要ではなく、代わりに該方法は、酵素の回収を容易に する細胞内蓄積を利用する。増殖及び発酵の間にゆっくり蓄積するのではなくて 、最高レベルの組換え酵素が最初に存在する。
更に、微生物においてオリゴ糖が使用されるのは珍しく、かかる糖に対し競合す る夾雑微生物はより少数であるが故に、微生物汚染の危険性が低減される。
別の好ましい実施態様においては、上述のエタノール産生組換え体がポリサッカ ラーゼを発現し、それが少なくとも一部は宿主から分泌され、細胞の外での複合 オリゴ糖の加水分解を触媒する。かかる遺伝子産物は、糖化及びエタノール産生 の間に慣用的に供給される１種以上の市販酵素、例えばｃ　ｅ　ｎＡ（エンドグ ルカナーゼ）及びｃｅｘ（エキソグルカナーゼ）製品の活性を補助し得る。この ように使用されるポリサッカラーゼコーディング遺伝子の例としては、Ｋｌｅｂ ｓｉｅｌｌａまたはＥ　ｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ中に形質転換されると一部（約 ５０％〜６０％）が分泌される、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉのセルラ ーゼ遺伝子を挙げることができる６例えばｃｅｘ遺伝子で形質転換した実験用Ｅ ｒｗｉｎｉａ株においては、異種発現産物の５０％以上がブロス中に分泌される 。
かかる分泌率は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａにおいてはプルナラーゼ用、またＥｒｗ ｉｎｉａにおいてはペクテートリアーゼ用のシグナル配列にそれぞれ融合するこ とにより増大される。Ｍｕｒｏｏｋａ　［１９９０１Ｆｅｒｍｅｎｔ。
Ｔｅｃｈｎｏ　１．Ｉ　ｎｄ、Ａｐｐ　１．４０〜４５　；　Ｐｕｇｓｌｅｙ　 ｅｔ　ａｌ、［１９９０］Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４：６７−９ ０；Ｈｅ　ｅｔ　ａｌ。
［１９９１］Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　８８：１０７９−８３；５ａａｒｉｌａｈｔｉｅｔ　ａｌ、［１９９０ ］Ｇｅｎｅ　９０：９−１４参照。
特に重要なのは、熱安定性遺伝子産物及び分泌される遺伝子産物の両方を発現す る本発明のエタノール産生形質転換体である。かがる形質転換体は、（１）溶解 によって、セルロースまたは別の複合基質をより単純なオリゴ糖及び単糖に分解 する前処理に使用するため酵素活性を提供し、（２）分泌によって、発酵の間膜 重合が継続されるための酵素を提供する。
天然特性を過剰発現する突然変異または遺伝子修飾と組み合わせた異種遺伝子は 、特定の環境下で有効となる１例えば、Ｅ　ｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ株において 天然エンドグルカナーゼの発現レベルを増大すべく、突然変異誘発及び選択を実 施することができる。場合によっては、かかる突然変異誘発及び選択は高濃度の グルコースによって抑制される。グルコース−ＣＭＣプレートにおいて抑制され た突然変異株を選択し、この制御を失い、場合によってはかかる酵素を過剰産生 じ得る株を同定することができる。
当業者には、本発明のこの態様において種々のポリサッカラーゼを使用し得るこ とが理解されよう、同様に、広範な形質転換ベクターが本発明のこの態様に使用 し得る。宿主とベクターを最適に適合させるには、ある種の慣用実験が必要とな り得る１例えばＲ３ＦＩＯＩＯベースのベクターを構築することができる［Ｃｏ ｎｗａｙ　ｅｔ　ａｌ。
［１９８７ｃ］Ａｐｐ　１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３：２３ ５　４１参照］。該ベクターは宿主域が広く、全てのＥｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅ ｂｓｉｅｌｌａ単離体を含む多くのグラム陰性菌宿主中に異種遺伝子を導入する ことができるし、テトラサイクリン耐性に関しても選択できるので好ましい。こ れに反して、ｐＵｃベースのプラスミドはある種のＥｒｗｉｎｉａ株において不 安定となり、このためにあまり好ましくない。
本発明に適当に使用される他のポリサッカラーゼ遺伝子のうち、セルロース分解 活性のいずれかをコードするものを以下に挙げる。
エンドグルカナーゼはβ−１，４−グリコシド結合をランダムに加水分解する。
これは、セロビオースを攻撃することはないが、七ロデキストリン、リン酸膨潤 セルロース、ＣＭＣ及びＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）のような置換セ ルロースを加水分解する。ある種のエンドグルカナーゼは結晶セルロースにも作 用する。
これに反して、セロビオしドロラーゼはセルロースに作用し、特にセルビオース 単位を鎖の非還元端部から分離する。セロビオヒドロラーゼは、七ロデキストリ ンは加水分解するが、セロビオースは加水分解しない、β−グルコシダーゼはセ ロビオース及びセロオリゴ糖をグルコースに加水分解するが、セルロースまたは 高級セロデキストリンを攻撃しない。
上述のＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　１１ｕｍ由来のセルラーゼコーディング遺伝子の ほかに、セルロース分解活性をコードする他の遺伝子の特性も分析されている０ 例えばＢａｇｕｉｎ　［１９９０］Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋。
４４：２１９−４８参照。この文献の内容は参照により本明細書の一部を構成す るものとする。更にかかる遺伝子は、例えば１９９１年３月現在で特に１３種の エンドグルカナーゼ、３種のセロビオヒドロラーゼ、及び３種のβ−グルコシダ ーゼを含むＧ　ｅ　ｎ　Ｂ　ａ　ｒ＋　ｋデータベー人によって容易に入手し得 る。
同様に、キシラン分解酵素をコードする遺伝子を、本発明に従って上述のごとく 使用することができる。この点で特に重要なものは、エンド−１，４−β−キシ ラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−し一アラビノフラ ノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びアセチルキシランエステラーゼからなる 群から選択されるキシラン分解酵素をコードする遺伝子である。後述するエタノ ール産生形質転換体において発現させたＣ、ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　ｘｙｎ Ｚ遺伝子及びＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ　ｘｙｌＢ 遺伝子の発現産物もこの群に含まれる（実施例１７参照）、キシラナーゼをコー ドする遺伝子もまた、１９９１年３月現在で７種のエンド−１，４−β−キシラ ナーゼ、５種のβ−キシロシダーゼ、及び１種のα−Ｌ−アラビノフラノシダー ゼがＧｅｎＢａｎｋに登録されていることがら判るように、容易に入手可能であ る。
同様に、澱粉の分解に関与する酵素をコードする遺伝子を本発明に使用すること もできる。この種の酵素の例を、生物源及び他の特性情報と一緒に下記に挙げる 。
澱粉分解に関与する酵素の例としては、Ｂ、５ｔｅａｒｏ　ｔ　ｈ　ｅ　ｒ　ｍ 　ｏ　ｐ　ｈ　ｉ　Ｉ　ｕ　ｓ　ａ−アミラーゼ及びＴ、ｂｒｎｃｋ　ｉ　ｉプ ルラナーゼを挙げることができる。かがる遺伝子は、１９９９１年３月現在で１ ９０種のα−アミラーゼ、３種のβ−アミラーゼ、８種のグルコアミラーゼ、及 び３種のプルラナーゼがＧｅｎＢａｎｋに登録されていることから判るように容 易に入手可能である。β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペ クチンヒドロラーゼ、及びベクテートリアーゼのごとき他のポリサッカラーゼも 、ＧｅｎＢａｎｋ及びこれらの遺伝子のクローニ〉′グを教示している文献がら 容易に入手可能である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓポリサッカラーゼ遺伝子はＥ、ｃｏｌｉ中で十分に発現し、本 発明に従って一般に腸内細菌に使用するのに適している。実際、Ｂａｃ　ｉ　Ｉ 　１　ａｃｅａｅのメンバーは、アミラーゼ、β−グｌレカナーゼ及びヘミセル ラーゼを含む広範な酵素を分泌し、Ｂ、５ｕｂｔ　ｉ　１１　ｉＳ株、Ｂ、ｐｏ 　Ｉ　ｙｍｙｘａ株、Ｂ、Ｉ　ｉ　ｃｈｅｎ　ｉ　ｆ　ｏｒｍｉｓ株及びＢ、ｃ ｅｒｅｕｓ株を含む多数の種がセルラーゼを分泌する。Ｂａｇｕｉｎ［１９９０ ］（上掲）及びＲｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、［１９８９］Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉ　 ｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏ　１．１１　：　６２６−４４参照。
これらの文献の内容は参照により本明細書の一部を構成するものとする。異種ポ リサッカラーゼ遺伝子に付随するシグナル配列が選択した宿主、例えばＫｌｅｂ ｓｉｅｌｌａまたはＥ　ｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ中で非機能的である場合、上述 のごとく異種酵素の分泌が所望されるならばこのシグナルを宿主由来のシグナル 配列に融合した遺伝子で置き換えるのが常套手段である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、熱安定性ヒド ロラーゼ及び本発明に効果的に使用され得る他の活性物質、例えばエンドグルカ ナーゼ（ＣＭＣａｓｅ及びニトロフェニルーセロビオシダーゼ活性）をコードす る遺伝子源である。このタイプの多くの遺伝子が特性分析されており、ＧｅｎＢ ａｎｋまたは関連文献がら入手可能である。Ｂａｇｕｉｎ　［１９９０］（１掲 ）参照。
（Ｆ）宿主の選択及び形質転換：異種ポリサッカラーゼ遺伝子に使用し得る宿主 として株を選択するため、アルコール産生用遺伝子が組み込まれた本発明の組換 え株を、セルロース基質として５ＯＬＫＡ−ＦＬＯＣ及び市販のセルロース加水 分解用セルラーゼを使用して発酵させて試験することができる。エタノール産生 及び変換率を市販酵素製剤の希釈度の関数として表した用量応答曲線を作成し得 る。
工業用セルラーゼ製剤（例えばＳＰＥＺＹＭＥ、ＭＵＬＴｒＦＥｃＴ　ＡＮＤ　 ＣＹＴＯＬＡＳＥ［Ｇｅｎｅｎｃ。
ｒ］）を、例えば３５℃、ｐＨ６，０のｐＨ制御発酵を使用する実験に使用する ことができる。
次いで、実施例１７〜１９に記載の方法で異種ポリサッカラーゼを添加すること ができる０例えば特に有利であるとして選択したポリサッカラーゼ遺伝子を同種 組換えを使用して組込むことができる。−次組換え体の選択にはテトラサイクリ ン（５ｍｇ／リットル）を使用し、有効遺伝子がより多く発現した突然変異株を 選択するには、より多くの量を使用することができる。同じ手順で複数の酵素を 順次添加し得るよう、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）遺伝子を失活させるには 、フザリン酸選択を使用することができる。
単一段階及び複数段階のセルロース発酵過程におけるかかる構築体の有用性を評 価することができる。
エタノール産生ダラム陽性菌、例えばＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓまたはＣｅｌｌｕｌ ｏｍｏｎａｓ株を作出する好ましい経路は、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓピルビ ン酸デカルボキシラーゼに対する抗体を使用するコロニーのスクリーニングと組 み合わせた化学的突然変異誘発を含み、それによって発現の増加を検出する。よ り高度の発現を示すとして同定されたクローンを、表現型のもとになる機構を決 定すべく試験する。かかる突然変異株はそれ自体有用であり、更に、一般に安全 と見なされる生物（ＧＲＡＳ）における他の異種タンパク質の発現には十分に有 用である。
異種セルラーゼ遺伝子を用いてエタノール産生宿主を形質転換し、活性酵素の細 胞内濃度を高くする際、選択した宿主及びセルラーゼに従って、別の慣用の遺伝 子操作またはスクリーニングが必要となり得る。例えば、宿主が分泌するプロテ アーゼが、本発明の異種発現に対して障壁となり得る。プロテイナーゼ活性用指 示プレート及びより高度のレベルの標的酵素の選択など、幾つかの方法を使用し て、この問題が最小化された突然変異株を得ることができる。
更に、ポリサッカラーゼを含む任意の異種タンパク質の製造において、増殖速度 及び効率の点で代価を払うことも多い、この”遺伝子負荷（ｇｅｎｅ　ｂｕｒｄ ｅｎ）’は、特に有効な遺伝子の複数の構築物を試験することにより最小化する ことができる１組込み部位は見掛けの“遺伝子負荷”に影響を及ぼし、従って本 発明の試験において可変因子となり得る。
このように製造された構築物は、実施例１８に記載するように、市販酵素と併用 した場合の有効性及び発酵効率を評価するセルロース発酵試験に使用することが できる。即ち、エタノール産生セルラーゼ分泌組換え体を接種した時点で市販セ ルラーゼを加える単一ステップ方法において、形質転換宿主によって分泌される セルラーゼの、市販セルラーゼに代讐する能力を試験することができる。好熱セ ルラーゼの有用性は、先行の発酵で得られた酵素を含むエタノール産生細胞を６ ０℃のセルロース懸濁液に加えることにより試験することができる。インキュベ ーションは、特定の酵素に対して最適化された条件下で一定時間、例えば１２時 間継続する。温度及びｐＨを低くしても、はとんどのケースで、ＳＰＥＺＹＭＥ 、ＭＵＬＴＩ　ＦＥＣＴ及びＣＹＴＯＬＡＳＥのような市販酵素及び１２時間の インキュベーションに最適な条件を与えることができる。温度を３５℃に低下さ せ且つｐＨを６．０に上昇させた後、ブロスを組換えエタノール源を用いて接種 することができる。エタノール収量及び収率を測定することができる１個々の酵 素の最適活性に特定の必要条件に適用するには、この方法の多数の変形方法を使 用し得る。
使用すべき分子遺伝学的方法は十分に文書化されている。
例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ＭＯＬＥｃＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ 　ＬＡＢＯＲＡＴＯＬＹ　ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）；Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＣＵ ＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＧＥＮＥＴＩＣ ３（Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、１９８７）参照０発酵は、前記説 明及び実施例に記載したＰＨレベルで行なうことができる。
エタノールは、Ｇｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ、［１９８４コＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｌ ｅｔｔ、３：１７７−１８２及びＤｏｍｂｅｋ　ｅｔ　ａｌ、［１９８５］Ａｐ ｐｌ　Ｅｎｖｉ　ｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５１　：１９７−２００に記載 のごとき気−液クロマトグラフイーによって測定し得る。モノマー糖は、比色分 析及びＨＰＬＣによって測定し得る。Ａｓｈｗｅｌｌ［１９６６］Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、８：９３−９５；Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、［１９８８］Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、１６０参照。
オリゴ糖は、ＨＰＬＣ及び薄層クロマトグラフィーによって分析することができ る。培養体は、ルリアブロスのような複合培地または鉱物塩中で増殖させ得る。
５ｔａｒｒ。
Ｖｏｌ、ｒＩ　ＴＨＥ　ＰＲＯＫＡＲＹＯＴＥＳ　１１６６−１１７２．１２６ ０−１２７１（Ｓｐｒｉｎｇｃｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８１）；Ｍｉｚｕｔａｎ ｉ　ｅｔ　ａｌ。
［１９８６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．Ｂｉｏｅｎｇ、２８：２０４−０９参照。
生物は１．５％寒天を含む固形培地上に維持し、ストックはグリセロール中−７ ０”Ｃで保存し得る。
セルラーゼ酵素は実質的に、Ｃｕｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ・［１９８８コ　Ａｐｐｌ 、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　１．５４　：　４７６−４８４及びＧｒ ｉｐｅｎｅｔ　ｅｔａｔ、［１９８８］Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０：４５ ７６−４５８１に記載のごとくアッセイすることができる。エキソグルカナーゼ 活性は、モデル基質としてｐ　−ニトロフェニルセロビオシドを使用して評価し 得る。カルボキシメチルセルラーゼ（エンドグルコナーゼ）活性は還元糖の放出 によって評価することができる。セルラーゼ活性は、濾紙からの還元糖の放出と して測定する慣用方法によってアッセイすることができる。メチル−ウンベリフ ェリル誘導体、ＣＭＣ及びベクテートを使用して定性比較分析用指示プレートを 準備することができ、任意の基質を加水分解する酵素の高レベル生産体である株 を同定することができる。
（Ｇ）耐アルコール性及び形質転換体生産の向上：本発明のエタノール産生組換 え体を用いて生産されるエタノールの最高レベルは例えばＩＭを超え得る。エタ ノール生産は、ＡＴＣＣ５５１２４で寄託されているＥ、ｃｏｌｉ形質転換体に ０１１によるラクトースの発酵においては１．５Ｍを超え得る。本発明のエタノ ール産生組換え体において耐アルコール性が増強されていることは特に有効であ る。膜脂質及び／または５ｔｒｅｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎに影響する変化が、かか る向上の基礎となっている。本発明の好ましいエタノール産生オペロン＜ｐｅｔ ）の成分であるＺ、ｍｏｂｔｌｉｓ　ａｄｈＢも、温度及びアルコールの両方に 応答可能な優れたＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ　５ｔｒｅｓｓ　ｐｒｏｔｅ　ｉ　ｎとし て同定されている。Ｈａｅｊｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、［１９９１］Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、１７３：　５９７５−８２参照、５ｔｒｅｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎをコ ードする他のＺ、ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓ遺伝子は同様に有効である。かかる遺 伝子を得るためには、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、［１９８９］Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１７１：１５９０−９６；Ａｒ＋ｇ　ｅｔ　ａｔ、［１９８９］ Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１：２７４８−５５；Ｌｉｐｉｎｓｋａ　ｅｔ　 ａｌ、［１９８８］ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６：７５４５−６１ ；及びＦａｙｅｔ　ｅｔ　ａｌ、［１９８６］Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ　ｔ、 ２０２　：　４３５−４５によって報告されているように、主要な５ｔｒｅ、ｓ ｓ　ｐｒｏｔｅｉｎを発現するＥ。
ｃｏｌｉ中で認められるような遺伝子が、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ由来の対応遺伝子 を単離するためのプローブとして使用し得る。
脂質合成遺伝子は耐エタノール性に有効であることも考えられる。耐エタノール 性に有効な他の遺伝子は、ライブレベルが初期接種体の耐エタノールレベルを超 えたあとも耐エタノール性生物が増殖し得るよう過剰な環レベルを維持した発酵 ブロス中で継代培養することで富有化することにより選択し得る。ががる選択に はクモスタット（ｃｈｅｍ　ｏ　ｓ　ｔａ　ｔ　）方法が特によい。
高度の耐エタノール性を示すＬａｃｔｏｂａｃ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｂｏｍｏｈｉ ｏｃｈｉｉ及びり、ｈｅｔｅｒｏｈｉ。
ｃｈｉｉ（Ｉｎｇｒａｍ［１９９０］Ｃｒ１ｔｉｃａｌＲｅｖ、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、９：３０５−１９参照）の遺伝子ライブラリーを上記富有物において試 験した。かかる微生物は酒中で腐敗（ｓｐｏｉｌａｇｅ）をもたらすことから、 約１５％ｖ／ｖ（２，５Ｍ以上）のアルコールレベルに耐性である。この方法に よると、１リツトル当たり８０ｇ以上のエタノールレベルを常に生成し得る組換 え株を作出することができる。
更に、Ｚ、ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｓの解糖酵素を使用し、本発明のエタノール産 生組換え体を増強することができる。即ち、解糖酵素をコードする１３の遺伝子 のうち１つ以上を発現させると、解糖フラックスを増大し、従ってエタノール産 生量を増大する。
（Ｈ）方法設計：本発明を実施するため、本明細書に従って多数の発酵プロセス を構築することができる。かがるプロセスは一般に２つ以上の段階を有する。バ イオマスをポリサッカラーゼと接触させ、それに含まれるオリゴ環をより単純な オリゴ環及び／または単糖に分解する゛糖化”段階と、より単純なオリゴ環及び ／または単糖をエタノールに発酵する“発酵”段階とである。各段階を実施する 最適条件は著しく異なるので、２つの段階は別々に実施するのが有利である。糖 化段階の最適条件は、温度が約５０”Ｃ〜約６０℃、ＰＨが約４．５〜約５．０ である０発酵段階の最適条件は、温度が約３０”Ｃ〜約３５℃、ｐＨが約６．０ である。
゛　該プロセスの効率を高めるため、発酵段階がら糖化段階へ材料を一部再使用 してもよい。更に、再使用材料は約り０℃〜約３５℃の発酵段階の温度であるの で、ががる材料は熱交換器において糖化段階から来るより高温の流出液を、発酵 段階に導入する前に冷却するために使用することができる。処理例を以下に述べ ると共に図１９に示す。
図１９を参照すると、ポリサッカラーゼと前処理されたバイオマスとが酵素反応 炉１ｏに供給され、そこでバイオマス中の出発オリゴ環がより単純なオリゴ環及 び単糖に分解される。酵素反応炉１ｏは、温度約５０”Ｃ〜約６０”Ｃ及びｐＨ 約４．５〜約５．０に維持されている。固体及び液体の混合物が酵素反応炉１０ から導管１２を通して固体／液体分離器１４中に取り込まれ、そこで固体と液体 とが例えば遠心機によって分離される。
分離された固体は、導管１６を通して酵素反応炉１ｏに戻される。分離器からの 流出液は導管１８を通って熱交換器２０に至り、そこで約り０℃〜約３５℃に冷 却される。
流出液は導管２２を通って膜分離器２４に至り、分離器２４は高分子量多糖を分 離する０次いで高分子量多糖は導管２６を通って酵素反応炉１０に戻される。膜 分離器は例えば、約１０−３〜約１０−４ミクロンの分離等級を有するＤｕＰｏ ｎｔ（登録商標）製ＣＡＲＲＥフィルターのような限外ｒ過フィルターとし得る 。或いは、膜分離器２４は省略し、流出液を発酵器３ｏに直接導入することもで きる。オリゴ環及び／または単糖を含む残りの糖溶液は導管２８を通して発酵器 ３０に移送される。しがしながら発酵器に入る前に、例えば塩基を加えることに より糖溶液のｐＨを高めるよう調整する。
二酸化炭素は、導管３２を通して発酵器がら排出される。
流出液は発酵器からライン３４を通して、エタノール留出用の蒸留塔（図示なし ）に導かれる。マツシュは発酵器から取り出され、ライン３６を通して固体液体 分離器４０（例えば遠心機）中に導かれる０分離器４０内で分離された微生物は 導管４２を通して発酵器に戻される。分離器４０から出た流出液は熱交換器２０ に供給され、固体／液体分離器１４から出た流出液を冷却する。熱交換器２０を 出た後、例えば酸を加えることにより流出液のｐＨを約４．５〜約５．０まで下 げるよう調整され、次いで流出液は酵素反応炉１０に導入される。酵素反応炉１ ０及び発酵３０には、通常タイプのミキサー４８及び５０を備えることができる 。
必要によっては、連続方法においては、約０．５％〜約５？６、典型的には約１ ％〜約２％のエタノール濃度を有する液体（ビール）を導管５２を通して発酵器 ３ｏがら取り出し、蒸発容器５４内に供給し、そこでエタノールと水とを蒸発さ せ、ライン５６を通して別の蒸留段階（図示なし）に導くことができる。ライン ５６内のエタノール濃度は約２０％〜約２５％とし得る。蒸発器５４がら出てラ イン５８を通して発酵器３０に戻されるビールは、約０．５％未満、即ち一般に 約０．３％のエタノール濃度を有する。このようにして、発酵器内のエタノール 濃度は比較的低いレベルに維持され、それによって発酵器において高いエタノー ル生成速度が維持される。
同様に、導管３６．４４及び４６を通して反応炉１ｏに戻される流出液はより低 いエタノール濃度を有し、反応炉内の反応を妨害することがより少ない。このよ うな連続方法は、バイオマスを反応炉１０に連続的に添加することにより運転さ れ得る。しかしながら、堆積固形物を排出し、汚染の可能性を低減するため、反 応炉１０及び発酵器３０の内容物を定期的に排出することが望ましい。
上記発酵プロセスは、バイオマスをエタノールに発酵する効率的な方法を提供す る。当業者には、該発酵プロセスに多くの他の追加ステップ及び／または段階を 付加し得ることが理解されるであろう０例えば、バイオマスを細断し、（水蒸気 及び／または酸を用いてまたは用いずに）加水分解し、ポリサッカラーゼ及び／ または他の酵素で処理するなど、バイオマスの前処理段階を含めることができる 。更に、ポリサッカラーゼを発現し細胞内に蓄積する組換え宿主細胞を加熱し、 細胞を溶解してポリサッカラーゼを放出させる初期段階もあり得る。工程に沿っ て固体及び流出液の分離及再使用段階を追加し、複数の発酵段階を含めることも できる。
ＩＩｌ、　害」１例 以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。
特に記載しない限り、全百分率は重量に基づき、全溶剤混合物の割合は客員に基 づく、実施例の他の方法論的特徴を以下に述べる。
１腹及で成長条ｉ！：　大腸菌ＴＣ４（Ｃｏｎｗａｙら１１９８７ａｌ１Ｍ）及 びプラスミドを會むその誘導体を使用した。Ｚ、ｍｏｂｉ　Ｉｔｓピルビン酸デ カルボキシラーゼ遺伝子（ｐＬＯＩ２７６）及びアルコールデヒドロゲナーゼＢ 遺伝子（ｐＬＯＩ２８４＞を含むプラスミドは、Ｃ。
ｎ　ｗ　ａ　ｙら１１９８７ｂｌにより記載されている。
株棟で成長秀作：　１ラスミドｐＵｃ１８及びＰｔＪＣ１９はｐＬＯＩ２０４及 びｐＬＯＩ　２９５　（Ｃｏｎｗａｙら［，１９８７ｂｌ、Ｉｎｇｒａｍら＋１ ９８７１９照）と同機に従来記載されている（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら １１９８５１　Ｇｅｎｅ　３３：　１０３−１９＠照）。
ｐＬＯＩ２９２．１）ＬＯ１２９１ｐＬＯＩ２９７．ｐＬ０１３０８、ｐＬＯ１ ３０８−２，ｐＬＯＩ３０８−５及びｐＬＯＩ３０８−１０の横築及び特性を以 下に述べる、（Ｌｕｒｉａ　＆　Ｍ、Ｄｅｌｂｒｕｃｋ［１９４３ＪＧｅｎｅｔ ｉｃｓ　２８：　４９１−５１１参照）中で培養物を３７℃で成長させた、３７ ℃のブロス３ｍｌを収容する管（１３Ｘ１００ｍｍｌを管口−チーターに入れ、 この管内で酵素分析用細胞及び発酵試験用接種材料を成長させた。−晩培ｌＩ物 を新鮮な培地で１００倍に希釈した。好気性培ｅｅｌ（２５０ｍｌ容フラスコ中 プロス５０ｍ１）を往復運動水浴（１２０回／分）中で振盪した。ジャイレータ −による撹拌機能（１５０ｒｐｍ＞を備える栓付き血清びん（１３０ｍｌ容びん 中ブロス１００ｍ１）をインキュベーターに入れ、３７℃で嫌気性培ｇＩ！物を 成長させた６嫌気性培ｌｌＩ物に２５ゲージ針を刺し、気体発酵産物を逃がした 。
５ｐｅｃｔｒｏｎｊｃ　７０スペクトロフオトメーター（Ｂａｕｓｃｈ　＆　Ｌ ｏｍｂ、Ｉｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）ｔ’使用してスペクトロフォトメ トリーにより５５０　ｎ　ｍで成長をモニターした。使い捨て培養管（１０Ｘ７ ５ｍｍｌをキュベツトとして使用した。本発明の条件下の１吸光度羊位は約０． ２５ｍｇ／ｍｌの細胞タンパ本発明のプラスミドを含む大腸菌宿主は、１２３０ １Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２ ０８５２、米国に所在のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。培１ＩＩＩ＋は寄託機関により以下の 受託番号を付された。
培養−物　受叱１遣　４抵」 大腸菌ｐＬ（１１３０８−１０ＡＴＣＣ６７９８３１９８９年５月１５日ＴＣ４ （ｐＬＯＩ２９２）　ＡＴＣＣ６８２３７１９９０年２月２３日１’Ｃ４（ｐｔ 、０１３０８−１１）　ＡＴＣＣ８８２３８１９９０年２月２３Ｆ−ＩＴＣ４（ ｐＬＯＩ２９７）　＾ｒｃｃ　６８２３９　１９９０年２月２３日ＴＣ４（ｐＬ ＯＩ２９５＞　ＡＴＣＣＢ８２４０　１９９０年２月２３日大＠ＩＩｐＬＯＩ５ １０　ＡＴＣＣ６８４１（４に、ｏｘｙｔｏｅａ　Ｍ５＾１　ＡＴＣＣ６８５Ｂ ４　１９９１年３月１４日（ｏＬＯ１５５５） 本発明の培養物は、３７　ＣＦＲ１，１４及び３５ＵＳＣＩ２２の規定により米 国特許商標庁長官によりその資格を有すると判断された者が本願の係属中に培養 物を入手できるような条件下で寄託された。寄託物は本−の対応用−Ｘはその子 係出願が提出される外国の特許法の規定に従って入手可能である。しかしながら 、寄託物の入手可能性は政府決定により付与された特許権の価値を落として本発 明を実施するためのライセンスを構成するものではないものと理解されたい。
更に１本発明の寄託培養物は微生物寄託のためのブダペスト条約の規定に従って 保管及び分譲可能な状態に１＃持される６即ち、寄託物の試料の分譲のｆｉ＃要 求から起重して少なくとも５年間、又は寄託日から起Ｉして少なくとも３０年間 、又は培養物の開示を含み得る特許の実施可能ＩＥＩＩＩｆｌｌの間、生存可能 目つ非汚染状態に＃ＩＮ持するように細心の注意をもって保管される、寄託者は 、寄託機関が寄託物の状態により要求時に試料を分譲することができない場合に 寄託物を交換する義務を認める。本発明の寄託培養物の分縮ａｒ熊性に関する全 制限は、これらを開示する特許の付与擾は最終的に取り除かれる。
遺イ元子操作方−法：　形質転換、プラスミド横築、ＤＮＡ消化及び分析は従来 記載されているように実績した、グルコース２ｇ／ｌ及び適当な抗生物質を含有 する同体培地（１５％実大）上で組換体を選択した、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓからの ＃Ｉ能的エタノール産生遺伝子を含む組換体を−グルコースを含むルリア寒天プ レート上で成長する過剰寸法コロニーとして同定し、グルコースを含まないルリ ア実天プレート上での低成長とアルデヒド指示培地上のアルコールデヒドロゲナ ーゼ発現との観察により同定を！Ｉ認した。
＃−！ｊ−ヱニζイ、：　細胞を破墳、熱失活させ、従来記載されているように ピルビン酸デヵルボキシラーセ活性（熱安定）についてアッセイした。ｃｏｎｗ ａｖら１１９８７ｂ１参照。固体硫酸アンモニウム第１＃Ｃ（最終濃度０．５ｍ Ｍ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を新たに加えておいた３０ｍＭリ ン酸カリウムＩｌ衝液中で細胞を洗浄及び破墳した以外は、従来記載されている ように細胞をｍ製し。
エタノール酸化の方向でアルコールデヒドロゲナーゼ活性活性についてア・ソセ イした。Ｎｅａｌｅら　＋　１９８６１Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５４ ：　１１９−２４９照、保存なしのアルコールデヒドロゲナーゼ活性直接アッセ イにこの変法を組み合わせた結果、従来報告されているよりも著しく高い比活性 が得られた。エタノール産生効率を計算するために、Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｖら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、１９３：２６５−７５のＦｏｌｉｎフェノール試薬法を使用してａ＠ 量を培５Ｉ物当たりのタンパク質含有景として測定した。
製州析：　屈折率モニター及び電子積分器を備えるＭｉ　Ｉ　１１ｐｏｒｅ／Ｗ ａｔｅｒｓ高性Ｗａ体クロマトグラフ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎＢｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して透明プロス中で発酵産物を定量した。
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ＣＡに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓか ら購入したＡｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ−８７Ｈカラム＋３００Ｘ７．８ｍｍ）上、６ ５℃、流速０．２５ｍ１／分（１００μ＋注入容量）で分譲を行った６信頼でき る操車を使用してピークを同定した。グルコースの前に溶出する２つのピークと 、４５゜４〜４５．８分に溶出する後期未知ピークは非接梓培地の成分である。
実開１−−株ノ町箒 ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩをコードす る横這遺伝子のサイズは夫々１゜７及び１．１キロベースであり、これらの遺伝 子は６００００及び４０１００の分子葉を有するタンパク質をコードする。これ らの遺伝子は各々１ａｃＴロモーターの制御下ｔ’ｐ　ＵＣ１８ノ１ｌｊｆｉ体 上４．：（ｉ７？ｔｔル（ＩＸＩ　ｌ’ｌ　−ｐ　ＬＯＩ　２８４（アルコール デヒドロゲナーゼ）から制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及び５ａｌＩにより 生成されたプロモーターなしの１．４キロベースフラグメントをｐＬＯＩ２７６ 中のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子から下流のＢａｍ８１部位に挿入する ことにより２つの遺伝子を結合した。これらのクローンをアンピシリン耐性につ いて選択する共に、アルデヒドの産生を検出する新規に１１Ｍ発されたバラロー ザニリン−エタノール指示プレートヒのアルコールデヒドロゲナーゼ活性の存在 及び発現について選択した。
指定した構築物ｐＬＯＩ２９５を倉むクローンはグルコースを添加しない場合に はルリア冥天プレート（好気性）の表面上で十分に成長しなかったが、２％グル コースを含有する寒天プレート上ではプラスミドを含まない株及びｐＬ０１２７ ６又はｐＬＯＩ２８４を含む株よりも著しく高密度に成長した。
ｐｅｔオペロンを含む組換体はグルコースを會むルリア寒天プレート（好気性） 上でより広くより不透明なコロニーとして容易に検出されたうコロニーサイズ反 ひ不透明度のこの差は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキ シラーゼ遺伝子の両方を発現するプラスミドを含む組換体の同定のために有用な マーカーとなることが立証された。
ｐＬＯＩ２９５の完全塩基配列は知られている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームはｌａｃプロモーターがら １６３堪基下流で開始し、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩをコードする遺伝子 のオープンリーディングフレームから８５塩基上流で２つの終止コドンにより終 結する。どちらの遺伝子も各オープンリーディングフレームからすぐ上演のリポ ソーム結合部位に似た配列を含む。アルコールデヒドロゲナーゼＩＩをコードす る遺伝子は、単一の終止コドンを含み、転写ターミネータ−として機能する１３ 塩基対のパリンドローム配列が後続する。
実−施例一？−−−−木−腸１に−おける一Ｚ　、−ｒｐ、ｏ　ｂ　ｉ　−ｊ− ｊ　ｓ−遺伝子の発現 ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子の両 方ともｌａｃプロモーターの制御下で葦独（ｐＬＯＩ２７６及びｐＬＯＩ２８４ 夫々）及び共同して大＠菌中で高レベルで発現された。ピルビン酸デカルボキシ ラーゼは野生型大腸菌中には存在しないが、誘導性アルコールデヒドロゲナーゼ は低濃度で存在する、グルコースの存在下で大腸菌の成長中にＺ、ｍｏｂｉｌｉ ｓ酵素の比活性は約５０％低下し、これはｌａｃプロモーターのグルコース抑制 に一致する。ｐｅｔオペロン中で近位遺伝子によりコードされるピルビン酸デカ ルボキシラーゼの比活性は、ＰＬＯＩ２９５ではｐＬＯＩ２７６の３倍であった 。ｐｅｔオペロン中の遠位遺伝子であるアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子 の産物の比活性はｐＬＯＩ２９５ではＰＬＯＩ２８４の２倍であった、！」１倒 ３　ｍｌ灸株−に。よる−グＩレーフースの一発酵大Ｓ＊におけるｐｅｔオペロ ンの発現の結果、横気性成長中に一次発＃ｌ＃物としてエタノールか産生された 。親株はコハク酸（１，５ｍＭ）、乳酸（１８ｍＭ１及び酢酸（７ｍＭ）を主！ ＊Ｍｊｌ物として産生した＜＋５ｉｊ３Ａ）、アルコールデヒドロゲナーゼＩｆ 遺伝子を担持するｐＬＯＩ２８４を含む細胞において同一の発酵曲線が観察され た（図３Ｃ１，ピルビン峻デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を担持するｐ ＬＯＩ２７６では、蓄槽された発酵産物の３分の１に等価のエタノールビーク（ １８ｍＭ）か明瞭に出現している。この高レベルのエタノールは、Ｚ、ｍｏｂｉ ｌｉｓからのピルビン酸デカルボキシラーゼと天然大腸菌アルコールデヒドロゲ ナーゼの活性が結合した結果である。
ｐｅｔオペロンを含むｐＬＯＩ２９５　（Ｚ、ｍｏｂｉ　ｌ　ｉＳからのピルビ ン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子の両方）で は５大腸菌は発酵産物の９５％を上回る大量のエタノール（７５０ｍＭ：　４゜ ３％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を産生した。
ｐｅｔオペロンを含む細胞中で産生された高レベルのアルコールデヒドロゲナー ゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼは大腸菌中のＮＡＤＨＩ！ｉ！化を支配し た。即ち、この生物の発酵はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ の発酵に転化された６正常な発酵成長中に、ピルビン酸はピルビン酸デヒドロゲ ナーゼ複合体によりアセチル補＃素Ａに９ｆｉされ、ホスホエノールピルビン酸 カルポキシラーセによりオキサロ酢酸（及びコハク酸）に変換され、ピルビン峻 ギ酸リアーゼによりギ酸及びアセチル補＃素に変換され、乳酸デヒドロゲナーゼ により乳酸に９樽される、この１４１擾の峠路は大＠菌の非修飾様におけるＮＡ Ｄ”の再生のための主要経路である、一方、細菌性乳酸子ヒドロゲナーゼのに、 ｓは極めて高く、１　ｆｌ　〜１　（Ｍ３０ｍＭである（Ｇａｒｖｉｅ、Ｅ、Ｉ 　ｊ１９８０１　”Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１ａｃｔａｔｅ　ｄｅｂ、ｙｄｒｏｇ ｅｎａｓｅｓ。
”　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　４４：１０６−１３９：　Ｔａｒｍｖ、Ｅ 、Ｍ、、及びＮ、Ｏ，Ｋａｐｌａｎ＋１９６８１　“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　Ｂ　Ｄ−１ａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏ ｇｅｎａｓｅ　ａｎｄ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃｏｎ ｔｒｏｌｌｅｄ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、”　Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２４３：２５８７−２５９６）、Ｚ。
ｍｏｂｉｌｉｓからのピルビン酸デカルボキシラーゼのに宵は０．４ｍＭ１″あ る（Ｂｒｉｎｇｅｒ−Ｍｅｙｅｒ、Ｓ。
、Ｋ、−Ｌ、Ｓｃｈｉｍｚ及びＨ，Ｓａｈｍ　１１９８６１　＋Ｐｙｒｕｖａｔ ｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｆｒｏｍ　Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉ ｓ：　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ ａｔｉｏｎ、”　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４６：１０５−１１０１ ．低いＫｍに結び付けられるｉｔのこの酵素はピルビン酸の流れを解糖からエタ ノールに転換する。
ガス交換が制限されない培養槽の中度かきまぜ又は撹拌による混合成長条件中に も高細胞密度が達せられる、これらの東件下では曝気の程度に依存して６．３以 上の最終ｐＨが観察された。
暫１ｋ　プラスミド！濃疎−び一大腸声に−わＭ−る−Ｚ−９−恵０−φｔ−＋ −ｉ　−苧−円−ｔ／−二ノに雫−生岬−！ノと発揖プラスミドｐＬＯＩ２９５ はｌａｃプロモーターの制御下でピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール デヒドロゲナーゼＩｆをコードするＺ、ｍｏｂｉ　１　ｉｓ遺伝子を含む、この 横築物はｐｅｔオペロンと呼称され、代替プロモーターをπする付加的アラスミ ドの横築のためのエタノール生成遺伝子瀝と１．て使用される。エタノール産生 遺伝子を含むｐＬＯｌ２（Ｊ５からのＥｃｏＲｌ−８ａｔ　１７ラグメントをＤ ＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで処理し、平滑末端を生成した。この 平滑末端ＤＮＡフラグメントを、Ｉａｃプロモーターからすぐ下流のｐｄｃ遺伝 子を育するｐＵｃｔ９のＳｍａＩ部（ｆｆに挿入した６合成プラスミドｐＬＯＩ ２９３はＢａｍＨＩ部位を両側に有するｐｅｔ遺伝子を含んでいた。エタノール 産生酵素をコードする遺伝子を含むＢａｍＨＩフラグメントを発現ベクターｐＬ ＯＩ２０４に挿入することにより、プラスミドｐＬ。
１２９１及びｐＬＯＩ２９２（逆方向）を構築した。ＢａｍＨＩフラグメントは リポソーム結合部位と、両方の遺伝子の完全配列と、ａｄｈＢに対して遠位の転 写ターミネータ−とを含む、ＰＬＯＩ２９２において２つの遺伝子は元の発現ベ クターに含まれるＺ、ｍｏｂｉｌｉｓプロモーターの制御下に発現される、 ｐｅｔ遺伝子をｌａｃプロモーターの制御からｗ６放し１つ代替プロモーターの 挿入のためにヒ渭ＨａｍＨ１ｆ１６位を維持するようにプラスミドｐＬＯ１３０ ８を横築し７’：ｒ−ｐし０１２９３をＢａｍＨｌで部分的に消化し、クレノー 処理を使用してａｄｈＢａ伝子から遠位のＢａｍＨ１部位を除去した。（ｐｄｃ にすぐ近位の）プロモーターなしＢａｍＨＩ−（ａｄｈＢから遠位の）ＥｃｏＲ Ｉフラグメントとしてこのプラスミドからエタノール産生遺伝子を除去し、ｐＵ ｃ１８のＢａｍＨＩ′ＨＬびＥｃｏＲ１部位に指向的に挿入し、ｐＬＯｌ３（１ ８を生成した、このプラスミドはアルデヒド指示プレートドで低レベルのａｄｈ Ｈを姥増したが、他の機能的ｐｅｔプラスミドｐＬＯＩ２９５．ｐＬＯＩ２９１ ７ｔひｐＬＯｌ２（Ｊ２に関連する大コロニー表現型を示さなかった。
ＤＮＡの大部分が４キロベ一ス未満の長さとなるようにＺ、ｍｏｂｉｌｉｓから の染色体ＤＮＡを５ａｕ３Ａ″′ｃＭ分的に消化したにの非分−化ＤＮＡをプロ モーターフラグメント譚として使用し、ｐＬＯ１３０８の脱リン酸化ＢａｍＨ１ 部位に連結した９十分に発現されたｐ　ｅ　ｔ、オペロンを有するアンピシリン 耐性ＩＩ４換体か、クルコースを含有するルリア寒天プレート上で大コロニーと して同定された、組横株の３種ｐＬＯ１３（１８−２，ｐＬＯＩ　３０８−’５ ＨＬびｐＬＯＩ３０８−１０を調査のために選択した。これらのプラスミド中で プロモーター活性を有するＺ、ｍｏｂｉＩｔｓ　ＤＮＡフラグメントは夫々６． ２及び２キロベース長であった。
表１は、組撓大Ｉｌｌ菌の一晩培脣物中のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びア ルコールデヒドロゲナーゼの活性を要約したものであるうピルモノ峻テヒドロゲ ナーゼの活性は株ＴＣ４（ｐＬＯ［２９１）中の０．３７ＩＵ／ｍｓｒｍｔｌｌ ｉＪタンパク質から’ｒ”ｃ４　（ｐＬＯｌ　２９５１中の８．２３１Ｕであっ た。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性についてはＴｅ３の絹換株は（最高から 最低の方向で）ｐＬＯＩ２９５＞ｐＬｏ　Ｉ　３０８−１０＞ｐＬｏ　Ｉ　３０ ８−２＞ｐＬＯＩ　３０８−５＞ｐＬＯＩ　２９２＞ｐＬＯＩ２９１の順に並べ ることができる、 表１　大腸菌におけるＺ、ａｏｂｉｌｉｓからのエタノール産生酵素の発現１合 計細胞タンパク１ｉ１当たりに毎分使用された基質のμモルとして表す７０綽＃ 素の比活性を１００と仮定して計算した。
０天然アルコールデヒドロゲナーゼ活性を差し引いた後の輛＃素の比活性を７１ ０と仮定して計算したう ａｍ株におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は異なるプラスミドからの発現 に関してピルビン酸デカルボキシラーゼと同一の傾向に従った。測定したアルコ ールデヒドロゲナーゼ活性は大腸菌からの天然酵素及びＺ、ｍｏｂｉ１ｉｓ＃素 の組み合わせを示す９プラスミドを欠損する株Ｔｅ３で観察されたレベルはＺ、 ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を有するプラスミドを担持する株で観察されるレベルより も相対的に低かった。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ酵素の活性（天然大腸菌アルコールデ ヒドロゲナーゼに補正）は株ＴＣ４（ｐＬＯＩ２９１＞の０．１３１０／ｍｇ細 胞タンパク質からＴｅ３　（ｐＬ０１２９５）の９．６１Ｕであった。
グルコースの異化作用をエタノールの産生に利用すると、成長収量及び成長培地 のｐＨＴ化にも影響した。発酵産物昧比較的非毒性であるが、姥酵中に毒性レベ ルまで蓄槽し得る。１０％グルコースを含有するルリアブロスを収容するびんで 嫌気性成長中に１ラスミドを含まない株及び（アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ をコードする遺伝子を担持する）ｐＬＯＩ２８４を担持する株は４８時間後に０ ．２５ｍｇＭ胞タンパクＷ／ｍｌの最終密度、４．４の最終ｐＨに達した。　５ ＷＡｓ度は（ピルビン岬テカルボキシラーゼをコードする遺伝子を担持する）ｐ ＬＯＩ２７６を担持する株では２倍に増加し、最終ｐＨは４．５であった。ｏＬ ０１２９５　（ｐｅｔオペロン）を担持する株の最終ＩＨＩＦＪ密度は２．５ｍ ｇ／ｍｌであり、対照株の１０倍であった。
最終ｐＨは４．７であった。２．５ｍｇ細胞タンパク質／ｍｌの密度ではマグネ シウムが限定的であるように思われ、０．５ｍＭ硫酸マグネシウムの添加により 細＠密度は更に１．５倍の増加に容易に達せられる。
組換株の成長を好気性及び橙気性鍋件下で試ｗＩＬな（図３）、ｖ気性条件下（ 図３Ａ及び表２）では株ＴＣ４は最も迅速な成長段階の間に約３０分間の世代時 間で成長した７ｐＬＯＩ３０８の誘導体を担持する株′ｒＣ４は同等の最大成長 速度を示し、世代時間は２６〜３０分間であった。株’ｒ’ｃ４　（ｐＬＯＩ　 ２９５）はこれらの条件下では十分に成長せず（世代時間７１分間）、部分的溶 解を伴った７株ＴＣ４（ｐＬｏ　Ｉ　２９１　）及びＴｅ３　（ｐＬＯＩ　２９ ２）は中間Ｍ度で成長し、各々成長時間は４６分間であった８表２　好気性及び 嫌気性成長中の散大世代時間、最終細胞密度及びブロスの最終ｐＨ ０２４時ｒｉｆｌ成長後に測定した７ 横気性条件下（図３Ｂ及び表２）ではプラスミドを欠損する株’Ｔ’　Ｃ４の世 代時間は３２分間であり、エタノール産生＃素を含む絹換株よりも著しく短かっ た。Ｔｅ３　（ｐＬ０１２９２）を除く全組換体は同様の最大成長速度を示し、 世代時間は３８〜４１分間であり、１’Ｃ４（ｐＬＯＩ　２９２）はややゆっく りと成長し、世代時間は４８時間であつた。
Ｔｅ３　（ｐＬＯＩ　２９５１を除く全組換体はプラスミドを欠損する株ＴＣ４ と同等以上の細胞密度まで嫌気性又は好気性成長条件下で１２時ｒｌＩ後に成長 した（図３Ａ及びＢ）。表２は、２４時間成長後の株ＴＣ４及び組換体の最終細 胞密度を要約したものである７好気性条件下では、ｐＬＯＩ３０８−１０を含む 株ＴＣ４は最高の細胞密度に達し、以下、ｐＬ０１３０８−２、ｐＬＯＩ２９２ 、ｐＬＯＩ２９５（多少の溶解か出現）及びｐＬＯＩ３（１８−５を禽む１゛Ｃ ４の呻であった、 橙気性粂件ドではｐＬｏ　ｌ　３０ｓ−１０及びｐＬＯＩ２９５を含む株ＴＣ４ の最終細胞密度は概ね同等であり、以下、ｐＬ０１２９２、ｐＬＯＩ３０Ｍ−２ 、ｐＬＯＩ３０８−５及びｐＬＯＩ２９１を含むＴｅ３の順であった、図４は細 胞中のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のレベルと２４時間成長後の最終細胞 密度との関係を示す６ビルビン峻デカルボキシラーセの合成はこれらの組換体中 のアルコールデヒドロゲナーゼＩＩの合成に結ひ付けられるので、このプロ・ソ トはＮＡＤ”再生のための代替Ｚ、ｍ。
ｂｉｌｉｓ糸が煙路細胞密度に及ぼす＠ＩＩＩを示す−これらのデータから明ら かなように、エタノール産生のためのＺ。
ｍｏｂｉｌｉｓ経路の発現は嫌気性及び好気性条件の両方で最終細胞密度を増加 させる０株ＴＣ４（ｐＬＯＩ　３０８−１０）においてピルビン酸デカルボキシ ラーゼ（６，５ＩＵ）及びアルコールデヒドロゲナーゼＩ　Ｉ　（２，５１Ｕ） の発現レベルは嫌気性及び好気性医長の両方でほぼＩ！に遺であった０株ＴＣ４ （ｐＬＯＩ　２９５）におけるエタノール産生酵素の発現レベルは過剰であると 思われ、その結果、好気性条件下では細胞成長が低下すると共に部分的溶解が生 じ、嫌気性条件下では成長がやや低下する。
迅速振盪下のフラスコ中で成長中には成長が不良及び溶解かおきるが、これとは 対照的に嫌気性条件下での株ＴＣ４（ｐＬＯＩ２９５）の成長は高く且つほとん ど溶解が出現しないことから、高度に好気性の環境はこの構築に有害であり得る と考えられる。＊勢速度を３分の１に減らすと、このｉ１４横体における溶解は 著しく減少し、最終細胞密度は指環フラスコ中で成長中に増加した７ 実繞−６−隊長中に；りＺ−：少産中酵素が−１−ｐ−スの酸性化に棟＆工す影 ！ ＋１３　Ｃは嫌気性成長中のブロスのＰＨの変化の７０ツトを示すｌ）Ｈはプラ スミドを欠損する株ＴＣ４の最初の６時間成長中に迅速に低下したが、エタノー ル産生酵素を含有する誘導体におけるｐＨ低下はもっとゆっくりであった、最初 の１２時閏における酸性化はｐＬＯＩ２９５を含む株ＴＣ４で最大程度まで減少 し、以下、ｐＬＯＩ３０８−１０、ｐＬ０１３０８−２及びｐＬＯＩ３０８−５ を含むＴｅ３の順であった１株ＴＣ４（ｐＬｏ　Ｉ　２９１　）及びＴｅ３　（ ｐＬＯＩ２９２）のデータは示さないが、夫々ＴＣ４（ｐＬＯＩ３０８−５）の 下及び上に位置する。組換体はより高い最終細胞密度に達したが、嫌気性及び好 気性−条件下で２４時間成長した組換体からのブロスのｐＨは、エタノール産生 ＃素を欠損する株ＴＣ４からのブロスよりも酸性度が低かった（表２）、 組換体ではｔＩＩＩ性化速開化速度性化のＮ序の低下に伴って細胞成長が増加し たことから、ｐＨの低下は高膚に好気性の条件下であっても成長を制限する主臀 な因子であると予想された、この仮定は、１Ｍリン酸ナトリウム締ｔ＃Ｉ液（ｐ Ｈ７，０１の１／１０容量を補充しｆｒ培地で成長させた（プラスミドを欠損す る）株ＴＣ４の最終細胞密度の８５％増加により裏付けられた。低レベルの＊＊ ＊を加えると、成長は中間レベルになった。
実施例７　エタノール産生酵素か會−岬＃−侵及ぼす効果表３は、好気性及び嫌 気性条件下で２４時間成長後に株ＴＣ４及び組換体により形成された発＃産物の 分析を要約したものである。好気性条件下ではプラスミドを欠損する株ＴＣ４の 成長中に酢酸が一次発酵産物として高濃度培地中に蓄槽し、エタノールは検出さ れなかった。産生された酢酸の景は７．、　ｍ□ｂｉ　ｌ　ｉｓからのエタノー ル産生＃素を含む株では著しく低下し、主Ｉ＃発＃菫糊としてエタノールが出現 した。ｐＬＯＩ３０８−１（１を含む株ＴＣ４は敢大量のエタノールを産生し、 以上、ｐＬ０１２９５、ｐＬ０１３０８−２、ｐ１０１２９２、ｐＬＯＩ３（１ ８−５及びｐＬＯＩ２９１を含むＴｅ３の呻であった。これらの好気性条件下で は少量の乳＃（０，６〜１．２ｍＭ＋もこれらの株のすべてにより産生された。
ｐＬＯＩ３０８−１０を含む株ＴＣ４のみがかなりの量のコハク酸を蓄槽したが 、この産物は全売＃産物の僅か１％に止まり、９４％はエタノールであった。
表３　好気性及び嫌気性成長中の発＃産物の比較嫌気性条件下では乳酸が主要発 ＃４！：物であり、プラスミドを欠損する株ＴＣ４の２４時間成長中にグルコー スを含有する高濃度培地中に蓄槽し、生板の＃酸、コハク酸が存在し、エタノー ルも存在した。エタノール屋牛＃素を含む株で乳酸産生は劇的に減少し、実質的 な量のエタノールの産生を伴った０株ＴＣ４（ｐＬＯ１３０８−１０１は最大筆 のエタノールを産生し、この産物凰独で合計可溶性発酵産物の９７％に相当した 。試験生物間のエタノール産生の傾向は好気性成長中のそれと同一であった。Ｔ ｅ３　（ｐＬＯｆ　３０８−１０）を除く全生物は２４時間後に好気性条件下よ りも嫌気性条件下のほうが少量の合計エタノールを実際に産生じた７エタノール 蓄Ｎ１１かこのように低レベルとなったのは、これらの嫌気４′！条件下で産生 される合計細胞量が減少し、こうしてエタノール産生の容量速度か減少したため であると考えられる。
嫌気性及び好気性条件下のエタノール産生度（表３）はＺ、ｍｏｂｉｌｉｓエタ ノール庸生遺伝子の発生遺伝子（表１）に直接関係していた。エタノール産生は 株ＴＣ４（ｐし０１３０８−１０１で最適であると思われ、ピルビン酸デカルボ キシラーセ活性６１Ｌｌ及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ活性２．’ｌｌＵ であった、Ｚ、ｍｏｂｉ　ｌ　ｉｓからのエタノール産生＃素を発現するプラス ミドを含む大腸１ｔＴｃ４の１ｌＨＩ体はプラスミドを欠損する組生物よりも高 細胞密度にｖｉ、長した。最終細胞密度の増加、エタノールが培地中に蓄槽した 程度及び成長中の培脣ブロスの酸性化速度の減少はいずれもＺ、ｍｏｂｉＩｔｓ エタノール産生酵素の発現レベルに関連していた。
転写調節に関連する潜在的な間鵜を最小限にするようにｐＬＯＩ　２９５　（ｌ 　ａｃ）を除く全構築物で遺伝子を発現させるために異種プロモーターを使用し た。成長及びエタノール産生に最適なレベルに最も近い発現レベルはｐｔ、、ｏ ｘ３０８−１０により楊供されたく合計＃ｌＩ胞タンパク質ｍｇ当たりピルビン 酸デカルボキシラーゼ６．５１Ｕ及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ２．５Ｉ Ｕ）、大腸菌におけるこの発現レベルは、ＮＡＤ”″の再生のためにエタノール 経路のみを含むＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ＣＦ２中に存在するレベルよりも著しく高 かった。
エタノール産生酵素の発現レベルは株ＴＣ４（ｐＬＯＩ２９５）では高すぎるよ ってあった（町溶性細鴫タンパク質の約１７％）、この高い発現レベルは、好気 性条件下では部分的な１ＩＩＩｉ１溶解、低い成長速度及びエタノール産生の低 下を伴った。これらの効果は、撹拌速度を低下させ、嫌気性条件下でｖｉ長させ ることによりＩＩＮした。高度に好気性の成長中に生じた明白な損害及び部分的 溶解は、高レベルのＺ、ｍｏｂｉｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼＩＩと（電 子伝達系に結びつけられる）天然ＮＡＤＨオキシダーセとが相俟って生にたＮＡ ＤＨの消耗に関連（７ていると考えられる。
主＃産物としてのエタノールの産生け、大腸１１７Ｃ４の成長速度に悪影響を与 えないと考えられる。ｐｅｔオペロンを発現し且つエタノールを産生するＰＬＯ Ｉ３０８の誘導体（ＣｏｌＥルプリーコン）を含む株はグルコースを含む好気性 条件下で組生物か成長したと同様に迅速に成長し、組生物よりも高い最終細胞密 度に達した。Ｒ８ＦＩＯＩＯレアリコンを有するｐＬＯＩ２９＋又はｐＬＯＩ２ ９２ご含む株は好気性条件下でゆっくりと成長した、これらの２樺の１１Ｉ簗物 はより低レベルのエタノール産生＃素を発現し、ｐＬＯＩ３０８−１０よりも低 レベルのエタノールを産生じたので、低い成長の理由はｐｅｔオペロンの発現よ りもむしろベクターの特性によると考えられる。
実繞例８−Ｊ」加重の一調−弊 エタノール産生微生物として使用するための帰れた特徴を有する細菌を１＠定す るために、追加大腸菌株を試験した５以トの大＠菌株：ＡＴＣＣ８６７７、ＡＴ ＣＣ８７３９゜ＡＴＣＣ８７３９，ＡＴＣＣＩ　１３０３、ＡＴＣＣ１１７７５ 、ＡＴＣＣ１４９４８，ＡＴＣＣＩ　５２４４及びＡＴＣＣ２３２２７を評価し た。トリ７トン（’　１　（１ｇ　／リットル）、酵母エキス（５ｇ／リットル ）、塩化ナトリウム（５ｇ／リットル）及び発酵性糖を含有するルリアブロス（ ルリア、Ｓ、Ｅ、及びＭ、Ｄｅｌｂｒｕｃｈ　１１９４３１Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 ２８：４９１−５１１）中、３０℃の搬盪水浴中でこれらの株を成長させた。特 に指定しない限り、グルコース及びラクトースを濃１ｔｌｌｌＯｇ／リットルで 加え、キシロースを濃度８０ｇ／リットルで加えた。糖を別々に蒸留水中２倍１ ｆ４度でオートクレーブ処理した（１２１℃、１５分間）。キシロース（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯｌｆｆｉＭは酸性で あったので、オートクレーブ処理前に水酸化ナトリウムで中和した。中和しない 場合にはかなりの褐色化及び分解を生じた。オートクレーブ処理又はｒ過滅菌し た糖を使用して同様の発酵結果を得た６エタノール経路の酵素をコードする遺伝 子を含む絹換株がプロス中及びプレートーヒで生存するためには発酵性糖の存在 が必幣であった。指定した場合には、最終濃度１０ｍｇ／リットルのテトラサイ クリンを加えた。
害織例ターーー退加濃−の１１獣性 エタノール産生のためにプラスミドを纏入する前に、予め同定した８種の異なる 大腸菌株の成長の環境耐性を比較した。塩化ナトリウム　ｍ、低ｐＨ＆びエタノ ールに対する耐性について株を試験した０表４の塩化ナトリウム及び１１１濃度 は、元の培地中の？＃ＩｎＩを含む５培地の最初のｐＨは６．８であり、指定し た場合にはこれをＨＣＩでより低い値に調節した。、６！性化した培地を一過滅 菌した。冷却後、オートクレーブ処理した培地にエタノールを加えた。糖を別々 にオートクレーブ処理した。試験物質の不在下で各糠中で成長した一晩培養物を 、試験培地３ｍｌを収容する１３Ｘ７５ｍｍｍｌＩ管で６０倍に希釈した６４８ 時ｒｔｌ後に５５０ｎｍの０．Ｄ、としてｖｉ、ＰＫを測定した。１．０のＯｏ Ｄ、は０．２５ｍｇ／ｍｌのｍ［タンパク質及び０．３３ｍｇの細胞乾燥京葉に 等価である、環境耐性試帥では、０゜２未満の最終０．Ｄ、は２未満の倍加に相 当するので、鉦視できるとみなした。
表４はグルコースを含有する培地中におけるこれらの結果を要約したものである 、ラクトース又はキシロースを含有する培地で同様の結果を得た、株ＡＴＣＣ８ ６７７、Ａ’「ｃｃ８７３９及びＡＴＣＣ１１７７５は低？＃１度のエタノール による阻害に対して特に感受性であった１株Ａ　Ｔ　ＣＣ９６３７及びＡＴＣＣ １］７７５は低ｐＨに対して最も耐性であったが、Ａ’ｌ’ＣＣ２３２２７以外 の全裸はｐＨ４゜０で少なくとも２〜４の倍加で成長した。全裸はより４５℃で 成長し、それ以上の温度では成長は制限された。４５℃を鎗えると継代培養する ことはできなかった。全裸は２０％グルコース、２０％ラクトース又は１２％キ シロースを含有する培地中で成長した。
表４　化学的及び物理的ストレス下におけるグルコース１００ｇ／　ｌを含有す るルウアブロス中の大腸菌の成長 ０＝０．０．５５０ｎ−で２未満の倍加実棒廻１０　貴、ｍ−殊Ｑ−倶 糖料用を２樟類の方法で試験した。２％炭水化物を補充したＭａｃＣｏｎｋｅｙ 蚕天上で赤色のコロニーを生じた株を、糖料用に関して陽性であるとして評点し た（Ｓｉｔｈａｖｙ、Ｔ、Ｊ、及びＪ、Ｒ，Ｂｅｃｋｗｉ　ｔｈ　ｌ　１９８５ １　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４９：３９８−４１８）、更にＢｉｏｌｏｇ 　ＥＣプレート（Ｂｉｏｌｏｇ。
Ｉｎｃ、、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を使用して製造業者の指示に従って細胞を試 験した。、Ｂｉｏｌｏｇプレートは迅速且つ便利であり、基質利用の尺度として ＮＡＤＨ岸生（テトラゾリウム塩から不溶性ホルマザンへの９樽）を検出する。
どちらの方法も試験した１３柿の糖で完全に一致した。
試験した全裸はグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビ ノース、ラクトース、グルクロン酸及びガラクツロン酸を利用した１株１１７７ ５はキシロースを利用しなかった７マルトース及びマルトトリオースはＡＴＣＣ １１３０３及びＡＴＣＣ２３２２７により使用されなかった。全裸はセロビオー スに対して弱い陽性反応を示した６株ＡＴＣＣ９６３７のみかスクロースを利用 した、糖料用のｇｗ１結果を表５にホす。
邑５　ｐＬＯＩ２９７及びｐＬＯＩ３０８−１１を生息させる大腸菌株の成長− はデータが得られなかったことを示す。
り例１１　」成員９１旦ｆ改５ ｗｍ方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ　ｔ１９８２１　Ｍ。
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ　Ｍａｎｕａｌ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｃ＋ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を使用して、アンピシリン及びテト ラサイクリン耐性遺伝子を選択マーカーとして含む２種の新規プラスミドを構築 した。潜在型Ｚ、ｍｏｂｉ１ｉｓプロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼ 、アルコールデヒドロゲナーゼ及び転軍ターミネータ−を含むエタノール産生オ ペロン（ｐｅｔ−オペロン）を５．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＬ ＯＩ　３０８−１０（）ｎｇｒａｍ及びＣｏｎｗａｙ　ｔ１９８８１．　前出） から取り出し、ｐＢＲ３２２のＥＣｏＲＩ部位に挿入し、ｐＬＯＩ　３０８−１ １を生成した。テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐｃＯ８２ＥＭＢＬ　（Ｐｏ ｕｓｔｋａ、Ａ、。
Ｈ，Ｒ，Ｒａｃｋｗｉ　ｔｚ、Ａ、−Ｍ、Ｆ　ｉ　ｒｓｃｈａｕｆ及びＨ，Ｌｅ ｈｒａｃｈ　１１９８４］　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８１：４１２９−４１３３＞からの２ ．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＬＯＩ　２９５　（Ｉ　ｎｇｒａｍら　 １１９８７１．前出）の５ａ１１部位に挿入することにより７ラスミドｐｔ、、 ｏｒ２９７を構築した７連結前に大腸ｆｌｌＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラ グメントで処理することにより付着末端を除去した（Ｍａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ ら、　前出）、Ｍａｎｄｅ　Ｉ及びＨｉｇａ　（Ｍａｎｄｅ’１．Ｍ、及びＡ。
Ｈｉｇａ　［１９７０１Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５３＋１５９−１６２１の塩 化カルシウム手順を使用する形質転換により種々の大腸菌株にプラスミドを導入 した２２％グルコース及びテトラサイクリンを含有する固体培地で選択を行った 。抗生−Ｗ選択の不在下で２５世代成長後に抗生物質マーカーを維持する細胞の 百分率としてアラスミド安定性を表した。
エタノール産生遺伝子を有するプラスミドを生息させる組撓株は異常に大きいコ ロニーとして成長し、発酵性糖を含む固体培地上で２４〜４８時間後に黄変した 。液体培地中では、これらの組換体の煙路細砲密度はプラスミドを欠損する対照 の２〜３倍であった。Ａ’ｌ”ＣＣｌ４９４ＨとｐしくＪ　Ｉ　２９７又はＡＴ ＣＣｔ　１７７５とｐＬＯＩ３（１８−１１で数同試みたか、形質に樽細明は得 られなかつｆ：２株１１７７５はキシロースを利用せず、この株の組換体は発酵 性糖としてキシロースの存在下では対照よりも１ｌｌｌｉ密度には成長しなかっ たが、ラクトース及びグルコースの存在下では高い成長が観察された。
グルコースを含有する培地で２５世代成長後にプラスミのレプリコンを含んでお り、ＡＴＣＣ８６７７及びＡＴＣＣ８７３９以外の令妹で良好に維持された。
表」　抗生物質選択の不在下でグルコースの存在下に２５世代成長後のｐＬＯＩ ２９７７ｔびｐＬＯＩ３０８−１１の安定性−ｍ−はデータが得られなかったこ とを示す。
＊ＱＰＡ１　２ｆｆｉ−（ｉ＋ｉ’に２１？ｔＨｔ吋ｔ（Ｇ＋４−ｔ？４し　ビ ンｒ−ｉ　ｔＩｙボｊ！シラーゼ活性の１ 約半分の最大成長であるＯ、Ｄ、＝４．０で細胞を回収した以外は従来の記載（ Ｃｏ　ｎ　ｗ　ａ　ｙら１．１９８７１゜前出：　Ｎｅａｌｅらｌ’　１９８７ １前出）に従ってピルビン酸デカルボキシラーセ活性を測ｖ１．た、。
テトラサイクリンの存在下で成長後にＺ、＋ｎｏｂｉｌｉＳピルビン酸デカルボ キシラーゼ活性の発現を試験した（表７）、ｐＬＯＩ２９７では、Ｚ、ｍｏｂｉ ｌｉｓ遺伝子は大１１ｆｌｌｌａｃプロモーターの制御下で発現され、ｐＬＯＩ ３０８−１１はｐｅｔ−オペロンの発現のために潜在型Ｚ。
ｍｏｂｉｌｉｓプロモーターを使用する６株Ａ’ｌ”ＣＣ１１３０３（ｐＬＯｌ 　２９７）、ＡＴＣＣ１１７７５（ｐＬ。
１２９７）及びＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７）は最高レベルの活性を含 んでいた。
表７−　グルコースノ存在）で成長中＋７）　Ｄｌ、０１２９７及ヒｐＬＯＩ３ ０８−１１を生息させる大腸菌株におけるＺ、隋ｏｂｉｌｉｓピルビン酸子カル ボキシラーゼの発現 ”　Ｉ　、Ｕ、＃＋ｇＭＩ胞タンパク質として表した活性。
５−ｍ−はデータが得られながったことを示す、実−總一例−１−３−渇Ｊ云汗 玄涜、に一◆ζ、［し円）−ノール産生最終濃度０．２Ｍのリン酸カリウム＆１ ！衝液（ｐＨ７，０）を加えることによりルリアブロスを発酵実験用に修正した 。
リン酸緩衝液、複合培地成分及び糖を別々にオートクレーブ処理し、冷却後混合 した。濃度１０ｒｒｚ＋：／リットルのテトラサイクリンを加えた。新たにｍ離 したコロニーから接種材料を２４時間成長させ、被験発酵培地で洗浄し、約１゜ ０の初期０．Ｄ、５５０ｎｍまで加えた６１０ス８０ｍ１を収容し、ゴム隔膜と ガスを逃がすための２５ゲージ針とを備える１００ｍ１容フラスコ内で３０又は ３７℃で発酵を行った。発酵フラスコを温度調節水浴に浸漬させ、磁気撹拌機に より１００　ｒｐｍで撹拌した７従来記載されているように（Ｄｏｍｂｅｋ、に 、Ｍ、及びり、Ｏ，Ｉｎｇｒａｍ　ｆ１９８５１　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉ　ｒｏｎ 、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　１．”ｉｌ　：１９７−２００１ガスクロマトグラフイー によりエタノール濃度を測定し、容量百分率として表した。１００％効率かグル コース又はキシロース２０ｇ当たりエタノール１２．７５ｍ１　（１０゜２ｇ） 及びラクトース２０ｇ当たりエタノール１．３．５ｍｌ　（１０，８ｇ）を産生 ずると仮定して、添加される糖に基づいて変換効率を計算した。
遺伝子組換による全大腸菌株は糖がら実質的量のエタノールを産生じた（表８） ６株ＡＴＣＣ１，５２４４（ｐＬ。
１２９７）を用いる予備実験によると、０．２Ｍリン酸カリウム［１Ｎ液（ｐＨ ７，Ｏ）を含有する培地でより高レベルのエタノールが産生された。この緩衝液 の代わりに自動ｐＨ１ｉ１節を使用すると同等以上の結果が得られると予想され る６１５％グルコースを使用すると、４８時間後に３７℃よりも３０℃で高レベ ルのエタノールが産生された、低いほうの温度である３０℃のみでラクトース及 びキシロースの発酵を試験した。一般に、ｐＬＯＩ　３０８−１１よりもｐＬＯ Ｉ２９７を生息する株により高レベルのエタノールが産生された０株ＡＴＣＣ１ １３０３（ｐＬＯＩ２９７）、ＡＴＣＣＩ　１７７５　（ｐＬＯＩ２９７）及び ＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ　２９７）は１５％グルコースがら４８時Ｍ後に ５．８〜６．９容量％という最高レベルのエタノールを産生じた。はとんどの株 は初期実験でキシロース耐性が低かったので、８％キシロースを使用して発酵の 比較を行った０株ＡＴＣＣ９６３７（ｐＬＯＩ　２９７）　、ＡＴＣＣ１］３０ ３（ｐＬＯＩ２９７１ＨｔびＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７）は８％キシ ロースがら７２時間後に最高レベル（４，８〜５．２％）のエタノールを産生じ た。
令妹は１５％ラクトース中で良好に成長した。株ＡＴＣＣ］　１３０３　（ｐＬ ＯＩ２９７＞及びＡＴＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７）は４８時間後にラクト ースから最高レベル（夫々６．１％及び５．６％）のエタノールを産生じた。
嚢多　ＤＬ０１２９７及びｐＬ０１３０８（１と生息させる大腸菌株によりグル コース（４８時間）、キシロース（７２時間）及びラクトース（４８時間）がら ハツチ発酵で産生きれたエタノール −はデータか得られなかったことを示す。
１は３７℃でインキュベートした。
ゝは３０℃でインキュベートした６ これらの比較試験によると、株ＡＴＣＣ１１３０３（ＰＬＯＩ２９７）及びＡＴ ＣＣ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７）はエタノール産生の最良の構築物であると思 われた。どちらの株も１２％グルコース、１２％ラクトース及び８％キシロース 中で成長時間経過及びエタノール産生をＦ＆験した（図１）。細胞量は約１０倍 増加し、３．６ｇ乾燥稟量／リットルの最終密度に達した。キシロースでは細胞 量はグルコース又はラクトースで観察される速度の２分の１の速度で増加した。
エタノール濃度が５％に達するまでエタノール産生及び成長は３檜の糖でほぼ直 線的であった。
糖からエタノールへの変換効率を計算するために、１２０時間後の最終エタノー ル濃度を３＠の実験から平均した（表６１，１２％グルコースの存在下で成長し た培養物中のエタノールの最終濃度は７．２容量％であり、これはグルコースか らの理論収量の９４％に相当する、１２％ラクトースの存在下では、煙路エタノ ール′ａ度は６．５％であり、ラクトースからの理論収量の８０％に相当する。
８％キシロースの存在下では一貫してｌ　Ｏ（１％以上の収率Ｐ得た。キシロー スの存在下での低速成長中のこれらの高い収率は、グルコースからビルヒン酸以 外に複合栄養の異化作用からのピルビン酸からエタノールへの変換を示している と考えられる、 Ｉ２！ｆｆ１のグラフからエタノール産生率を計算し、表９に要約する。エタノ ールの容量産生率はグルコースでは１．４ｇ／リットル／時であり、キシロース では０．６４ｇ／リットル／時である。エタノールの比産生率は３棟の糖の各々 で初期成長時間中に最高であった６グルコースでは２．１ｇエタノール／ｇ細胞 乾燥重量／時の最高産生率が得られた。１１１１ｇ当たりの最高のエタノール収 量はキシロースで得られ、糖単独の最大理論収量を上回った。
表９　ＡＴＣＣ１１３０３（ｏＬ０１２９７１及び＾１ｃｃ１５２２４（ｎＬＯ １２９７）によるエタノール産生の平均動的パラメーター ”Ｒエタノール７リツトル／時 ｈ　Ｒエタノール／ｇ細胞乾爆重策／時２ｇエタノール／ｇ糖 ４産生されたエタノール／糖基質からの理論的殻大値×１００＠最終エタノール 濃度幀／リットル） ＡＴＣＣＩ　１３０３　（ｐＬＯＩ２９７）を使用して実−を行い、アラビノー ス、カラクトース及びマンノースからのエタノール産生を試験した。４８時間後 に３０℃で３％〜４％のエタノール濃度を得たが、それ以上は調べなかった。こ れらの糖はグルコース及びキシロースに類似の経路により代謝され、同様の収量 を産生ずると予想された（Ｌｉｎ、Ｅ、Ｃ，Ｃ，１１９８７１°°Ｄｉｓｓｉｍ ｉｌａｔｏｒｙ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｆｏｒ　ｓｕｇａｒｓ。
ｐｏｌｙｏｌｓ、ａｎｄ　ｃａｒｂｏｘｖｌａｔｅｓ、”Ｉｎ　Ｆ、Ｃ，Ｎｅ１ ｄｈａｒｄｔ、、Ｊ、Ｌ、Ｉｎｇｒａｈａｍ、Ｋ、Ｂ、Ｌｏｗ、Ｂ、Ｍａｇａｓ ａｎｉｋ及びＭ、５ｃｈａｅｃｈｔｅｒ　１＠］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｏｌ、１ ．　ｐｐ、２４４−２８４．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｖ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ。
檜々の生物間で経路か非常に詰供１７ていることから、発酵産物としてエタノー ルを産生ずる能力を形質転ｍ宿主に与える遺伝子で種々の宿主を形質転換できる と予想できる。
本明細書に記載するようにａｄｈ及びｐｄｃ遺伝子で宿主を形質転換すると、適 当な発現ベクターを発現のために使用できることが十分に予想可能である６一旦 発現が達せられると、棟々の可能な宿主間のこの経路の一貫性により、エタノー ルの産生は十分に予想可能である。
害−劃Ｍ−ｊ５−　％−’１ｉｋｔｌ１４１＠　Ｉ　ｅ−ｂ　ｓ　ｉ　ｅ　Ｉ　 Ｉ　ａにおけるエクＺ−−１川 この試験で使用したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株は従来に１ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｍ５Ａ１と命名されている株である（Ｍａｈｌ、Ｍ、Ｃ，、 Ｐ、Ｗ。
Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ、Ａ、Ｆｉｆｅ、Ｗ、Ｈ，Ｅｗｉｎｇ　１１９６５１　Ｊ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、８９：１４８２−１４８７１゜２９素固定生物であるこの株 は凡々Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓとして同定されたか、抗原性 に基づいて命名しｉＭされた、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの 新規分類学的基準はＢｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌの第８版に定義されているの で、この新規株の種分化を更に調査した、株Ｍ５Ａ１は１０℃でグルコース最小 培地中で成長したが、４４．５℃ではラクトースからガスを発生しなかった７こ の株はインドール陽性であり、３０℃及び３７℃の両方で成長１ｌ１４基独炭素 纜としてｍ−ヒドロキシ安息香酸及びゲンチシン酸の両方を利用した。これらの 試験に基つき、Ｍ５Ａ１をに、。
ｘｙｔｏｃａと命名した。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子をコードするプラスミドを 生息させない場合には、糖を付加しないルリア寒天プレート上で株を継代培養し た。ａｄｈＢ及びｐｄｃを含むｌｌ１４１１１体は生存のために発酵性炭水化物 を必要とし、２％グルコース及びキシロースを含むプレート上に維持された。抗 生−ｗ濃度は、アンピシリン５０μｇ／ｍ１．クロラムフェニコール４０μｇ／ ｍ＋及びテトラサイクリン１２．５μｇ／ｍ＋であった、アルデヒド指示プレー トを使用して組換体におけるＺ、ｍｏｂｉｌｉｓａｄｈｌＩの発現をスクリーニ ングした。大腸菌株Ｔ　Ｃ４を全プラスミド構築のための宿主として使用した。
Ｍ’５Ａ１はペニシリン流びそのＩｌＩｍ体に対して比較的耐性であるので、ｃ ａｔ　（Ｃｍ’）又はｔ　ｅ　ｔ　（Ｔｃ’）　’１１４伝子を担持する大＠菌 シャトルベクターを横築した。ｐｃ。
ｓ２ＥＭＢＬ（Ｐｏｕｓｔｋａ、Ａ、、Ｈ，Ｒ，Ｒａｃｋｗｉｔ、ｚ、Ａ、−Ｍ 、Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ、Ｂ、Ｈｏｈｎ、　Ｈ，Ｌｅｈｒａｃｈ　１１９８４Ｊ　 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：４１２９−４１３３）からの２． ６ｋｂｐＥｃｏＲＩフラグメントをｐＬＯＩ２７６の５ａｌＩ部位に挿入するこ とによりＺ。
ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃを含むｐＬＯＩ２７６にｔｅｔ遺伝子を付加した。連結 前に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで処理することにより付 着末端を除去した。得られた構築物を制限分析により確認し、ｐＬＯＩ５６０と 命名した。
予備試験の結果、大腸１ｌｒＢ　（ＡＴＣＣ１１３０３１４，を潜在的な低コピ ー数のプラスミドを生息させることが判明した。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ及 びａｄｈＢをｃａｔと共にこれらのプラスミドに組み込むことにより、新規且つ 有用なベクターをｉｎ　ｖｉｖｏ横築した。これは、ｐし０Ｉ５１０からのｐｄ ｃ、ａｄｈＢ及びｃａｔを含むプロモーターなしのＰｓｔＩフラグメントである ４、６ｋｂｐをＪＩＬＩｌすることにより行った。このフラグメント上に複製ｌ Ｉ能は存在しない、自己連結による環化後、２％ゲルコートをＣｍ’選択性によ り大＠菌Ｂに形質転換した。アルデヒド指示プレート上で形質転換細胞を試験し 、濃赤色のクローンをａｄｈＢ遺伝子の高レベル発現として選択した。
抗生物質耐性及びＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を形質転換により大腸菌ＴＣ４に伝 達する能力についてこれらの株からのプラスミド調製物を試験した。全組換体は アンピシリンに対して感受性であり、ｂｌａ及びｃｏ　ＩＥｌレアリコンを含む ｐＵｃ１８フラグメントの欠損を示した９これらのうちの１つであるｐＬＯｌ　 ５５５　（８，４ｋｂｐ）はアルデヒド指示プレート上で最も濃赤色のコロニー を生成し、優れたエタノール産生能力を大腸菌に与え、小規模プラスミド単離か らの収量から判断すると低コピー数で存在すると思われた。このプラスミド並び にｐＬＯＩ２９７及びｐＬＯＩ５６０を使用してＣｍｒ１１１択性でに、ｏｘｙ ｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１を形質転換した、 ＰＤＣをコードするＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を含む３樺の１ラスミド横築物を Ｍ５Ａ１に形Ｗ転換した（表１０）、ＰＤＣのレベルはｐＵｃをベースとする２ 種の楕＠物（ｐＬＯＩ２９７及びｐＬＯＩ５６０）でｐＬＯＩ５５５の８倍であ った。純ＰＤＣの鰻大比活性を１００Ｕであると仮定すると、この酵素はＭ５Ａ １　（ｐＬＯＩ’２９７）及びＭ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５６０）中に２５％以上、 Ｍ５Ａ１　（ｐＬ、０Ｉ５５５）中に３．６％の細胞質タンパク質を含有し表１ ０　８５＾１の組換株におけるプラスミド安定性及びｐｄｅ発現 １細胞を培養中に２回サンプリングした。
１アルデヒド形質及び抗生物質耐性の両方が同時に失われた。
Ｍ５Ａ１におけるＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子の発現を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で 更に確認した。ＰＤＣ及びＡＤＨＩＩを含むバンドは天然様との比較により容易 に同定された。ＰＤＣを含むバンドはＭ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）よりもｐＵ ｃをベースとする組換体のほうが著しく大きく、酵素活性の測定値に一致してい た。ＡＤＨＩＩはＰＤＣよりも少漱であるが、このＺ、　ｍｏｂ　ｉ　ｌ　Ｌ、 ｓ遺伝子の相対発現はＭ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）よりもＭ５Ａ１　（ｐＬ０ １２９７）のほうが高い、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ遺伝子のみを含むＭ５Ａ １　（ｐＬＯＩ５６０）ではＡＤＨＩＩに対応するバンドは検出されなかった。
小規模プラスミド調製の収量から、ｐＬＯＩ５５５のコピー数は他の２種の楕輪 物の１／１０であると推算された。
この推算値は近似値に過ぎないが、ｐＵＣをベースとする構嫡物中に存在する高 レベルのＰＤＣは高いコピー数に一部では依存することが明らかである２ ３０℃で６０世代以上抗生物質の不在下で１０％グルコースを含むルリアブロス にｐＬＯ１５５５、ｐＬＯＩ２９７又はｐＬＯＩ５６０を生息させる細胞を順次 移した。抗生物質を含まず２％グルコースを含有するルリア寒天上で培ｌＩ物の 適当な希釈液をプレート培養した。Ｚ、ｍｏｂｉＩｔｓからのエタノール産生遺 伝子の維持及び適当な抗生物質に対する耐性についてアルデヒド指示プレート上 でコロニーを試験した。
Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子はｐＢＲ３２２をベースとするベクターにおいて非常 に不安定性であることはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａについて 従来報告されており（Ｔｏｌａｎ、Ｊ、Ｓ、、　Ｒ，に、Ｆｉｎｎ［１９８７］ 　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ。
１、　５３：２０３９−２０４４）、工業プロセスに許容できなかった。ｐＬＯ Ｉ５５５を生息させる組換体は非常に安定であり、無印の９８％が抗生物質耐性 遺伝子及びＺ。
ｍｏｂｉｌｉｓからの遺伝子の両方を維持した。ａｄｈＢ発現のみがアルデヒド 指示プレートにより検出されるが、これらの組換体は同様に、ｐｄｃ及びａｄｈ Ｂの両方の発現を示す大きいコロニー表現型を維持した。
３０℃、ｐＨ６，０、撹拌速度１１００ｒｐで１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース又は キシロースを含むルリアブロス中で発酵を行った。非振盪下のフラスコ中で単離 したコロニーから接種材料を３０℃で一晩成長させた０発酵物を１．０の初期０ ．Ｄ、ｓｓａｎｍ（３３０ｍｇｉｌ鞄乾燥重量／リットル）まで接種した。Ｂａ ｕｓｃｈ　ａｎｄ　Ｌｏｍｂ　５ｐｅｃｔｒｏｎｉｃ　７０スペクトロフオトメ ーターを使用して成長をモニターした。
ガス液体クロマトグラフィーによりエタノール濃度を決定した。塩基を添加する ことにより生じた容量変化に関して変換効率を補正し、全糖は代謝されなど仮定 した。キシロース及びグルコースからの最大理論収電は０．５１ｇエタノール／ ｇｌｌｌとして計算され、残余は二酸化炭素であった。最大活性時閉から容儀産 生率を計１した処、最大値を表した０表及び図面に示す全発酵テークは２個以上 のハツチ発酵物からの平均である、 表１１は、Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ＰＤＣ＋ＡＤＨＩＩが天然様Ｍ５Ａ１で夫々グ ルコース及びキシロースからのエタノール産生に及ぼす効果を示す。Ｍ５Ａ１　 （ｐＬＯＩ５５５）は明らかにエタノール産生のための最良構築物であり、最大 容量産生率はグルコース及びキシロースの両方について２．１ｇ／リットル／時 であった。どちらの糖も、この組換体は３０時間後に約３７ｇのエタノール／リ ットルを産生した。これらの糖の発酵は４８時に後に４５ｇエタノール／リット ルでほぼ実子した。
エタノール産生と同様に、Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）の成長は明らかに優れ ていた。この組換体の成長は親株の成長とほぼ同等であった。一方、履株と異な り、細胞密度は１５時閏で最大に達した後に漸進的に低下した。溶解は現れなか ったので、この低下は蓄積したエタノールとしての耐性の低下を表し得る。ｐＨ を調節するために塩基を加えないと、ｐｄｃ＋ａｄｈＢを含む組換体は大腸菌で 従来観察されたように低い酸生成遠度（ａｉｉい割合の中性４１！！＃産物）に より組生物の密度の２倍以上までｖｉ、長した、最大容量産生率（２，１ｇエタ ノール／リットル／時）は、同様に高い効率及び最終エタノール濃度を維持しな がら大腸菌組換体のほぼ２倍である。大腸菌と異なり、Ｍ５Ａｔ　（ｐＬＯＩ５ ５５）は同等の速度でキシロース及びグルコースを発酵する。プラスミドｐＬＯ Ｉ５５５は抗生物質選択の不在下でＭ５Ａ１中で安定的に維持された。Ｍ５Ａ１ の基質範囲は大ｌｌＩ菌と同等であるので、Ｍ５Ａ１組換体はエタノール産生に ′＃ａ１１ＦＩ：１つ予想外の利点を提供する、害−隼−例−！（−Ｆ、、７　 ｗ−ｊ　ｎ　ｉ−ａ　＄Ｕ　Ｋ−ｊ−ｅ−ｂ−ｓ−ｉ　ｅ　ｌ　ｌ　ａのｘ９／ ７ｔＩＬ／１ｉＪｌｐＪ４轡体一に−１るー（ロビオースーからエタノール本実 施例はＥｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのエタノール産生組換体を使用 してオリゴ糖セロビオースの発酵を説明する。
本実施例で使用したＥｒｗｉｎｉａはＥｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａの典 型的株であった。上記実開１５に記載したプラスミドｐＬＯＩ５５５を使用して Ｅｒｗｉｎｉａを形質転換した。Ｂｉｏｒａｄ　Ｅｌｅｃｔｒ。
ｐｏｒａｔｉｏｎユニツトを使用してＩｔｏら　１１９８８］　Ａｇ、ａｎｄ　 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５２（Ｌ）：　２９３−４の手順に従ってプラスミドｐＬ ＯＩ５５５をＥｒ　ｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａに挿入した（電圧＝２．０ｋＶ、容量＝ ２５μＦ及び抵抗＝　１００Ω）、４＆数の形質転換細胞、即ちプラスミドＤＮ Ａμに当たり１　〔ｌ　００００個を剛力る形質転換細胞を回収しな８ 本実施例で使用したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａは、実開１８に後述するようにして得 たＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１株Ｐ２であった。
ルリアブロス（ｐＨ６，３０℃）中１０％セロビオース及び１１００ｒｐ撹拌を 使用して実施例１５と同様に発酵を行った。Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓ’１ ｅｌｌａ　。
ｘｙｔｏｃａにより産生きれるエタノールの濃度は夫々１゜１１３モル及び１． ０６５モルであった、産生きれたエタノールｇ／Ｌとして結果を図６に承す６記 号は、−：　Ｅ　ｒｗ　ｉ　ｎ　ｉ　ａ、口：Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａを示す。
ｐ３　Ｍ　！　７　単一の遺伝子５ｔｔｎａ４４物によるポリマーフィ二ｙジ（ ドックからエタノールへゆ應−岬実１例の要約：　本実施例は、−次発酵産物と してエタノールを産生じ、細胞内でキシラナーゼを産生ずるように遺伝子組換し た単一微生物によりポリマーフィードストックをエタノールに発酵するための２ 股階プロセスを示す。
具体的には、好熱菌Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　Ｉ　ＩｕｍがらのＲ１ｌ１ｉキシラ ナーゼ遺伝子（ｘｙｎＺｌをｌ　ａｃＺのＮ末端に融合し、分泌シグナルを除去 した。このハイブリッド遺伝子は玉述の大腸＠ＫＯＩＩ及びに、ｏｘｙｔｏｃａ 　Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）中で高レベルで発現された。大葉のキシラナー ゼがエタノール産生中に細胞内産物として蓄槽した７発酵の終わりにキシラナー ゼを含む細胞を回収し、高温でキシラン溶液に加え、こうして糖化のためにキシ ラナーゼを放出した。冷却後、氷解物はエタノールに発酵され、こうして同−生 物はその後の糖化のためにキシラナーゼの供給を補充した７ 生物及び成長条−汗：　本５１！施例で使用した細菌株及びプラスミドを表１２ にリストする。
Ｑ１２　使用した細菌株及びプラスミド”　Ｉｐｅｔは染色体へのＺ、ｍｏｂｉ ｌｉｓ　ｐｄｅ及びａｄｈＢ遺伝子の組み込みを意味する。
”　ｐｅｔはプラスミドｐＬＯＩ５５５上のＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｏｄｃ及びａ ｄｈＢ遺伝子の存在を意味する。
ｃＯｈｔａら＋　１９９１１＾１１０１　、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｎ１ｅｒｏｂｉｏ ｌ　、　５７：　８９３−９００゜’　Ｇｒｅｏｉｎｅｔら１１９８８１　Ｊ、 ＢａｅＬｅｒｉｏｌ、　１７０：　４５８２−４５８８゜＠ｕｔｔら＋１９９１ １＾ｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　５７：　１２２７−１２ ３４゜５０ｇ／リットルのキシロースを補充したルリアブロスで株を成長させた ９５０ｍｇ／リットルのアンピシリンスルリア寒天プレート上で大腸菌の形質転 換細胞を選択した。
１０００ｍｇ／リットルのアンピシリン又は４０ｍｇ／リットルのクロラムフェ ニコールを含有するルリア寒天上でＫ。
ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１の形質に撓細飽を選択した。
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−セロビオピラノシド（１００ｍｇ／リッ トル）を含む微量滴定プレートを使用することにより組換クローンをキシラナー ゼ活性についてスクリーニングした（Ｍｉｌｌｅｔ　ｒ１９８５１ＦＥＭＳ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、２９：　１４５−１４９）、同様に、４−メチル ウンベリフェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（２０ｍｇ／リットル）を固体 培地に配合することにより、キシロシダーゼ及びアラビノシダーゼの両方の活性 をコードするＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｂｒｊｓｏｌｖｅｎｓ　ｘｖｌＢ 遺伝子の発現をスクリーニングした、＋Ｕｔｔら　１１９９１１　Ａｐｐｌｎ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５７：　１２２７−１２３４＋、これら の基質を陽性クローンにより加水分解することにより蛍光産物（ウンベリフェロ ン）が生成され、３４０ｎｍ紫外線Ｆで容易に検出された９組云子操作手順髪囚 輯鼾−法：　７ラスミド調製、制限酵素による消化、連結、形質転換及びゲル電 気泳動は標準手順を使用して実施した。大腸菌株ＤＨ５αを全プラスミド構築の 宿主として使用した。ＴｅｍｐＣｙｃｌｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　５０（Ｃｏｙ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ。
ｄｕｃｔ　Ｉｎｃｌ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）及びＴａｑポリメラーゼを含 むＧｅｎｅＡｍｐキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａ ｌｋ。
ＣＴ）を使用してポリメラーゼ鎖反応を行った。増幅反応物は１００ｕｌ総容量 中に各２ｍＭｄＮＴＰ、各１０１００ｐ　ｌプライマー、鏝ｍ　２０　ｎ　ｇ及 びＴ　ａ　ｑポリメラーゼ２．５Ｕを含有していた。３０サイクル増幅（９４℃ で１分間、４７℃で２分間及び７２℃で１分間、７２℃で３分ｍ最終延長）後に 生成物を単離した。
＃！、１！Ｌ乳愕Ω吠ヌ：　３０℃で一晩成長させておいた組換体中でキシラナ ーゼ、キシロピラノシダーゼ及びアラビノフラノシダーゼ活性を測定した。細胞 を遠心分＃（７０００Ｘｇ、１０分間）により回収し、キシラナーゼ活性を決定 するためにホスホクエンｌ！［衝液（５０ｍＭリン酸カリウム及び１２．５ｍＭ クエン酸、ｐＨ６，３１又はキシロシダーゼ及びアラビノシダーゼ活性の測定の なめにリン酸綺衝液（１０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含有する５ｍＭリ ン酸ナトリウム［１１１液、ｐＨ６，８）で２回洗浄した。２００００ｐｓｉの フレンチ加圧セルに２回通すことにより細胞を破壊した。得られた溶解物を遠心 分離（４℃、１３０００ｘにで３０分間）し、細胞破片を除去した。
従来記載されている（Ｕｔｔ、前出）ようにキシロシダーゼ及びアラビノフラノ シダーゼ活性をアッセイした７基質としてｐ−ニトロ−β−Ｄ−セロビオシドを 使用した以外は同一手順によりキシラナーゼをｌｌ４ｖ１．た７Ｔ１！に、カン パ材キシラン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕ ｉｓ、ＭＯ）の加水分解から放出される還元糖を測定することによりキシラナー ゼ活性を推定した（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（ＩＩ）［１９８３１Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｏｆ　ｅｎｚｙｍ’ａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｔｓ、Ｖｏｌ、Ｉｌ、第３版、ｐ１ ５１−：２．　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎ ｙ）、全活性は毎分放出された生ＦＭ、物のミリマイクロモルとして報告する。
タンパク質濶度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄｌ１９７６１　Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２：　２４８−２’）４）により決定したう薄層ク ロマトグラフィーによ４−±ｐｒｙオリゴ糖の分１：０．５％カンパ材キシラン をトリフルオロ酢酸により部分的に加水分解することによりキシロオリゴ環の混 合物を調製した（Ｄｏｍｅｒ　［１９８８１Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１６０ ：　１７６−１８０）、溶液を真空下に室温で１０倍に濃縮し、１μｍサンプル を榛準として使用した。アセトン、酢酸工千ル及びｍｍ＜夫々２：１＝１）から なる溶剤を使用して未活化Ｗ　ｈ　ａ　ｔ　ｍ　ａ　ｎシリカゲル１５０Ａプレ ート（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、、Ｃ１１ｆｔｏｎ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）上 で１回展開することにより、キシロオリゴ環を室温で分離した。乾ＩＩ後、Ｂｏ ｕｎｉａｓ（Ｂｏｕｎｉａｓ［１９８０１Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０６：２９１−２９５）により記載されているようにオリゴ 環をナフチルエチレンジアミン試薬で可視化した。
東岬実＠：　非麺盪フラスコ（３０℃）中で一晩成長させることにより新たにＪ ｌｌＬｌｌシたコロニーがら姥酵用接檀材料をｉＩＩ製した０発酵物を５５０ｎ ｍ″ｃＯ，１又は０．３（１）初期０．Ｄ、まで接棟し、撹拌下のｐＨスタット （３５０ｍｌ操作容量、ｐＨ６，０）で３０℃でイ゛ンキュベートした、（Ｂｅ ａｌｌら　［１９９１１Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。
１．Ｂｌｏｅｎ　ｇｉｎ、３８：　２９６−３０３．：　０ｈｔａら［１９９１ １Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５７：　８９３−９００： 　及びｏｈｔａら　［１９９１１Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、５７：２８１０−２８１５）、クロラムフェニコール又はクロラムフェニコ ール及びアンピシリンを発酵ブロスに配合した。
高温でキシラン分解を行った後、３０℃で発酵させる２段階プロセスによりキシ ランを発酵させた、キシランの分解のために、３５０ｍ１Ｑ酵物からのｍＫを４ ８時言後に遠心分Ｎ　（７００（ｌ　ｘ　ｇ　、　１０分間）により同数し、４ ％キシラン（ｐＨ６，０１を含有する等量の新鮮なルリアブロスに再懸濁させ、 ６０℃で６５時間インキュベート１゜た、３０℃まで冷却後、５５０ｎｍで初期 ０．Ｄ、＝（１゜３となるようにの氷解−に＠換生物を接種した。
サンプルを檀々の時刻に取り出し、キシロオリゴＮ（薄層クロマトグラフィー） 、細＋ｗｒｉ長（５５０ｎｍの０．Ｄ。
）及びエタノールをモニターした６ガス液体クロマトグラフィー　（Ｄ　ｏ　ｍ 　ｂ　ｅ　ｋら１１９８’５１　Ａ’ｐｐ１．Ｅｎｖｉ　ｒｏｎ、Ｍｌｃｒｏｂ ｉｏｌ、５１　：１９７−２００）により測定した。
キシランの加水分解のための粧撓ブｊス多上−ａｐｊｌｊ：非置換キシランの加 水分解のためには少なくとも２Ｎの活性即ち内部溶解キシラナーゼ及びキシロシ ダーゼが必要である。好熱菌ＣＩｏｓｔｒＬｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕ ｍ（Ｇｒｅｐｉｎｅｔら　［１９８８１Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７０：　 ４５８２−４５８８１からのｘｙｎＺ　（キシラナーゼ）遺伝子及びＢｕｔｙｒ ｉｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（Ｕｔｔ、前出）からのｘｙｌＢ（ キシロシダーゼ及びアラビノシダーセ）遺伝子が嵐独及びオペロンとして組み今 わせて発現されたキシラン発＃物で使用するために３ＩＩのプラスミドを槽簗し た（図７Ａ、７１１ｔび７ｃ）９ 図７Ａ、７Ｂ及び７ｃは、ｘ　、ｖ　ｎ　Ｚ及びｘｙｌＢを含む組換プラスミド の構築を示す７コーディングｗ域を四角で囲んだ、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　ｌ　 Ｉｕｍ及びＢ、ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ　ＤＮＡを細線により表す。太線はベ クターＤＮＡを示す。平滑末端連結部位をＸにより示す。Ｆは枠内ｌ　ａｃＺ　 ：　：　ｘｙｎＺＭ合のコーディング領域を承ｐＬＯ１１００１がらの２つのフ ラグメント、即ちリポソーム結合部位を有するアミノ末端を含む０．３ｋｂｐＸ ｂａｌ−ＰｓｔＩフラグメントと、コーディング領域の残部及び翻訳ターミネー タ−を含む２．４ｋｂｐ　Ｐｓｔ■フラグメントとを挿入することにより、ｘｙ ｌＢ遺伝子をｐＵＣ１８のポリリンカーのＸｂａ　Ｉ−Ｐｓｔ　ＩＮ域にサブク ローニングした。合成プラスミドｐＬＯＩ２（１００はＩａｃプロモーターがら ｘ　ｙ　Ｉ　Ｂ遺伝子を発現した。
Ｇｒｅｐｉｎｅｔら、前出による従来の研究は、１０セッシング済みのキシラナ ーゼの分泌シグナル配列及びアミン末端をコードする大セグメントが除去された ＩａｃＺＭ合でキシラナーゼ発現が高いことを示している、アミノ截頭ｘｙｎＺ 遺伝子を含むｐｃＴｌ　２０２がらのクレノー処理しｆ、：２．４ｋｂｐ　５ｔ ｙＩ７ラグメントをｐＵｃ１８のクレノー処理したＰｓｔ１部位に平滑末端連結 することにより非常に類似したＩａｃＺ：　：ｘｖｎＺ１４合物を構築した。合 成プラスミドｐＬＯＩ２００１で２つの読み枠を整合させた。
１ａｃＺ：　：ｘｖｎＺのコーディング領域がら３０　ｂ　ｐ下流の推定転写タ ーミネータ−を除去し、キシラナーゼ及びキシロシダーゼの両方をコードする遺 伝子が純理されるプラスミドの構築前に触合遺伝子の３′末端に新しい５ｓｔＩ 部位を加えることが必要であった。これらの修飾はポリメラーゼ頌反応を使用す ることにより行った。プラスミドｐＬＯＩ２００１を鋳型として使用し、５’− ＧＡＡ’ｌ”ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ−３″を５°末端のプライマーとして 、５’　−ＧＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧ−３’を３゛末端 （新しい５ｓｔＩ部位を含む）のプライマーとして使用した。５ｓｔｌ消化後、 このフラグメントをｐＵｃ１８及びｐＬＯＩ２０００の５ｓｔＩポリリン力一部 位に挿入し、夫々ｐＬＯＩ２００１ＮＬびｐｔ−ＯＩ２００３を構築した。
千−ンラン死−ｐＩＬ仁−関昂を五舅岑の発酵：　構築に使…しｔ：宿主＃１Ｉ ）Ｉである株ＤＨ５αの定常相細胞でキシラナーゼ、キシロシダーゼ及びアラビ ノシダーセ活件の発現をます殻初に試駿した（表１３）６キシラナーゼ（ｘｙｎ Ｚｌ活性は、ｘｙｎＺ単独を含むｐＬＯＩ２００１に比較して下流にｘｙｌＢを 含むｐＬＯＩ２００３を生息させるクローンビノシダーゼ（ｘｙｌＢ＋活性はｘ ｙｌＢ車独を含むｐＬｏｌ　２０００及び上流のｘｙｎＺ遺伝子を含むｐＬＯＩ ２００３を生息させるクローンで同様であった。
」１　キシラン分解のための組櫓岬素の比活性特に指定しない限り、細胞は５％ キシロースを含有するルリアブロスを収容する振盪フラスコ内で＋ｌｉ、長させ 、２０時間後（定常相）に回収した。キシロシダーゼ及びアラビノシダーゼ活性 は３０℃で決定し、キシラナーゼ活性は４５℃で測定した。
１　キシラナーゼ活性はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とし て使用して測定した。
１　キシラナーゼ活性は０．５％カンパ材キシランを基質として使用して測定し た。
０　細胞は発酵の終わりにｐＨスタット（ルリアブロス、ｐＨ６，０中８％キシ ロース）から回収した。
１　キシラナーゼ活性は６０℃で測定した。
プラスミドｐＬＯＩ２００１及びｐＬＯＩ２００３を大腸菌に０１１のエタノー ル産生株に形質転換させ、エタノール産生用遺伝子を染色体に組み込んだ。ｆｉ 盪フラスコからの定常相細胞と、発酵の終わりにｐＨスタットから採取した細胞 とで発現を比較した（表１３）９キシロシダーゼ、アラビノシダーゼ及びキシラ ナーゼ活性はＤＨ５αで観察される活性と同等であった。また、ｘｙｌＢが下流 に存在するｐＬＯＩ２００３ではキシラナーゼ活性は低下した。
Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓエタノール経路からの遺伝子を含むｐＬＯＩ５５５を生息さ せるに、ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５Ａ１で同様に発現を試験した。ｐＬＯＩ５５５に 存在するレプリコンの型は未知であるが、ｐＵｃ１８から横築されたれた。アラ ビノシダーゼ及びキシロシダーゼ活性の発現は大腸菌で観察される発現と概ね同 等であった。多葉の天然キシロシダーゼがＭ５Ａ１で発見された、キシロシダー ゼ活性はｐＨスタットからのｍｌに比較して４ＩＩｆ盪フラスコからの細胞のほ うがやや高かったが、キシラナーゼ活性は逆の傾向に従った。
使用したアッセイ条件下でアラビノシダーゼ活性はキシロシダーゼ活性の１．５ 〜１．７倍であり、従来の報告（Ｕｌｌら、前出）に一致した。４７℃で測定し たキシラナーゼ活性は天然酵素の最適温度である６０℃で測定した活性の約２分 の１であった（Ｇｒｅｐ　ｉ　ｎｅｔら、前出）。呈示データによると、キシラ ナーゼ融合のための還元糖アッセイから計算した比活性は、天然基質に強い選択 を示すｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロヒオシドの加水分解に基つく推定値の 約１００倍である。
絹−撓りｑ二−ンー仁よる高温で一＠チシランの加水分解：　８％キシロースを 収容するｐＨスタットで株ＫＯＩＩ（ｐＬｏ　１２００３１をｌ１ｌｃ長させ、 キシラン加水分解の酵素源として試験した。４％キシランを含有する等電の新鮮 なルリアブロスに細胞を再＠濁させ、Ｂ、ｆｉｂ’ｒｉｓｏｌｖｅｎｓキシロシ ダーゼが安定状態にある最高温度である４５℃と、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　ｌ　 ｌｕｍキシラナーゼの最適ン墨度６０℃とでインキュベートした、キシラナーゼ 及びキシロシダーゼが細胞内産物として産生されたが、初期実験は、これらの酵 素が４５℃及び６０℃でのインキュベーションにより培地中に容易に放出される ことを示した。神々の時刻にサンプルを抽出し、消化産物を薄層クロマトグラフ ィーにより分析した（図８Ａ及び８Ｂ）。
図８Ａ及び８Ｂは、４％カンパ材キシランを含有するルリアブｏＸ　（ｐＨ６， ０１中で４５℃ｌ？１８Ａ）又ハロ０℃ｃ図８Ｂ）でインキュベートした大腸菌 株ＫＯＩＩ（ｐし０１２００３）を使用したキシラン加水分解の薄層クロマトグ ラフィー分析を示す、１μｌのサンプルサイズを各レーンに加えた。各レーンの 下にインキュベーション時間（時間）を表す、キシランの酸水解物を第ル−ン（ Ｓ）で標准として使用した６ キシロース、キシロビオース、キシロトリオース及びキシロシダ−ゼが明白に分 離し、キシロビオースが主要産物であった。モノマーキシロースはゆっくりと蓄 槽した、２４時間後と４８時間後の消化の桿度を比較すると、６゜℃でキシロシ ダーゼは不安定であるにも拘わらず、６０℃よりも４５℃のほうが加水分解が起 こりにくいことを明示している。
キシラン消化は６０℃で６５時ｒｇＩ後も不完全であったが、キシラナーゼは非 常に活性に維持され、基質として４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−セロ ビオシドで容易に検出された。キシロシダーゼはこの温度で迅速に不活化された ０両方の酵素を含有する細Ｗ７４ｓ解物の添加及び６０℃で更に２４時間インキ ュベーション後に、キシラン氷解物の薄層プロフィルにそれ以上の変化は観察さ れなかった、従って、キシロオリゴ糖産物はＳ　ｉ　ｇｍａカンパ材キジキシラ ン＠消化産物に近似すると思われる。ｍ化産物又は置換物はこの市販調製物の完 全な消化を阻止し得る。
大１１町凍ユ（Ｋ−０７０耳ニーｔ、　ｃ２．−免ｙの州樽−株によ４−充之− 久ン本−！！！負の月−＃Ｕ：　キシロオリゴ環が大腸菌ＫＯＩＩ（ｐＬ０１２ ００３）及びに、ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５Ａ１　（ｐＬ０１５５５）により代謝可 能な桿震を評債するために小規模ＩＩ！−を行った９これらの株をキシラン水解 ｅ＋　１　ｍ　ｌに接樺しく６０℃で６５時間、遠心分離による＃ｗＡ破片の除 去擾の上清）、撹拌せずに４８時間３（）℃で゛インキュベートした。サンプル を取り出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した（図９Ａ及び９Ｂ）。
図９Ａ及び９Ｂは組構大腸菌ＫＯＩＩ（図９Ａ）及びＫ。
ｏｘｙｔｏｘａ　Ｎ５＾ｌ（図９Ｂ＞による成長のためのキシロオリゴ環の利用 を示す、ルリアブロス（ｐＨ６，０）中で大腸菌株ＫＯＩ　１　（ｐＬＯＩ　２ ００３）と共にインキュベートすることによりキシラン（４９ｉｌｌ）を６５時 間加水分解し、遠心分離し、−過滅菌した。サンプルをＩＩＩＭ及び３０℃でイ ンキュベートし、成長させた。サンプルを各レーンの下に示すように２４時間間 隔で取り出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。キシロオリゴ環の混合 物を第１のレーン（Ｓｌでｍａｔとして使用した。
活性なり、ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓキシロシダーゼの存在にも拘わらずキシロ ースのみが＠換大腸菌株により代謝された。キシロース、キシロヒオース及びキ シロトリオースはいずれもエタノール産生に、ｏｘｙｔｏｃａにより完全に消費 された。これらの結果に基づき、キシランのエタノール変換を更に検討するため にすぐれているとしてＫ。
ｏ　ｘ　ｙ　ｔ　ｏ　ｃ’ａの誘導体を選択した。
Ｋ、ｏｘｙｔｏｃａｐＭ５Ａ１（７υ１４ｍｍｋ：Ｌ、ｊ４’＜Ｅｉｏニス−及 −ｖ〕Ｌン５７ｆす１酔：　従来の発酵から回収した細胞を糖化のために４％キ シランを含有するルリアブロスに再懸濁させる２段階プロセスとしてキシランの 発酵を行った（６０℃で６５時間）、糖化したキシランを接種及び３０　’Ｃ（ ｐＨ６，０１で発酵させた。　［１１ｉｌ？１に細胞破片を遠心分離により除去 する千行実駿を行った。更に比較のために４．４７％キシロース（４％キシラン のキシロース含有量に等価）を使用して発酵を行った（図１ＯＡ及びｌ０Ｂ）、 発酵物からのデータを下記表１４に示す７ ＆１０Ａ及びＩＯＢは、組換に、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｎ５＾ｌによるキシロース及 びキシラン氷解物からエタノールへの変換を示す、酵素源として従来の発酵から の糾明を使用して６５時１Ｗ１６０℃でキシランを加水分解した、図１ＯＡは細 胞量の増加を示し、［３１１１０Ｂはエタノール産生を示すう記号はＡ：Ｎ５＾ ｌ　（ｐＬＯＩ　５５５）による４、４７％キシロースの発酵、Ｏ：Ｎ５＾ｌ　 （ｐＬＯＩ５５５及びｐＬ０１２００１）による４、４７％キシロースの発酵、 −ｍ化からの細胞破片を含む４％キシラン水解物のＮ５＾ｌ　（ｐＬＯＩ５５５ 及びＰＬＯＩ２００１）による発酵、氷解物（７）Ｎ５＾ｌ　（ｐＬＯＩ５５５ 及びｐＬＯＩ２００１）による発酵を表す。
表ｕ　に、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｎ５＾ｌの組撓株（ρＬＯＩ５５５）によるキシロ ース及びキシランのエラ８計算は総基質添加量に基づく。
１発酵中にｐＨ６，０を維持するために消費された塩基量。
偕最大エタノール濃度に達するために必要な時間。
１重漱に基づく理論収量はキシロース０．５１及びキシラン０．５６である。
０ｖＰはバッチ発酵中の最大容量産生率である。
１糖化からの破片を遠心分離により除去した後の氷解物。
１糖化からの破片を含む氷解物。
Ｎ５＾ｌ　（ｐＬＯＩ５５５）は非常にＴｎ効率でエタノールを産生じたことが 明らかである。キシロース発酵は２４時間後にほぼ完了し、最大理論収量の９３ ％であった。成長及びキシロースからのエタノール産生はいずれも第２のプラス ミドであるｐＬＯＩ２００１又はｐＬＯＩ２００３の併存により減少した。ｐＬ ＯＩ２００１で必要な発＃時間は約３６時間まで増加し、理論収量の９１％であ った。
モノマー糖からのエタノール産生率のこの減少は、組撓岬素により加えられる付 加的な負世を反映している。
ハイブリッドキシラナーゼ遺伝子（ｐＬＯＩ　２００１　）又はキシロシダーゼ 及びハネブリッドキシラナーゼ遺伝子（ｐＬＯＩ２００３）のいずれがを含むＭ ５Ａ１　（ｐＬ。
ｌ５５５）を使用してキシラン加水分解（６０’Ｃで６５時間）を行った。これ らの氷解物の薄層プロフィルは図９Ａ及び９Ｂに示すＫＯＩ　１　（ｐＬＯｌ　 ２００３）（７）薄１７０フィルと同一であることが判明した７２樟のＭ５Ａ１ 誘導体間にキシラン加水分解程度の差は認められながった。
糖化に使用した夫々の生物を接樗後にこれらの氷解物で成長及びエタノール産生 を測定した（１聞１０Ａ及びｌ０ＢＩ。
透明水解物の成長は等価レベルのキシロースモノマーで観察される成長の僅か２ 分の１であった。発酵は２４時ＩＷｌ後にほぼ完了し、透明氷解物中でやや迅速 に現れた。キシランからのエタノール収量は７．７〜７．９ｇ／ｌと、最大理論 値の約１／３であった。
発酵１０ス中のキシロオリゴ環を薄層クロマトグラフィーによりモニターした。
！ｅ＃の終わりのプロフィルは図９Ｂに承すプロフィル（４８時間）と１−一で あった。キシロース、キシロビオース及びキシロトリオースは完全に代謝され、 キシロシダ−ゼ及びそれ以上の長さのオリゴマーが残った。
！−塞：　こうしてポリマー加水分解及びキシランからのエタノール産生のため の酵素源の両方としてに、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１の高度絹換株を使用できる ことが明らかである。天然の細胞内キシロシダーゼの存在並びにキシロオリゴ環 を輸送及び代謝する能力はこの生物では従来報告されていない、天然起源の大腸 菌単離物としては、セロビオースのためのホスホトランスフェラーゼ系及び細胞 内ホスホセロビアーゼを利用するものが従来記載されている（Ｈａｌｌら　［１ ９８７］　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：　２７１３−２７１７：　Ｋｒ１ ｃｋｅｒら　１】９８７１　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１５：　４１９−４２９）、 類似の系かに、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１でキシロビオース及びキシロトリオー ス代謝のために機能し得る。Ｋ。
ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１におけるキシロースモノマー、ダイマー及びトリマー の代謝のための輸送系及び酵素の存在は、バイオマスの一層の発展のために大腸 菌に基づく系又はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅに基づく系にまさる顕著な利点を エタノールプロセスに提供する。
ポリマー分解及びエタノール産生のための単一生物の遺伝子組換における従来の 問題の多くは、発酵中に細胞内産物として熱安定酵素が生成される２段階プロセ スを使用することにより解消される。高レベルでの分泌を目的とするタンパク質 の合成は、正常な細胞プロセスに悪影響を与えることが多い、この問題は、細胞 内発現のために分泌シグナルを除去したＮｌ１頭酵素を使用することにより最小 限にすべきである。加水分解時間は変換の制限因子であるので、迅速発酵のため に糖の初期放出を最大にするように、変換プロセスの掻く初期に加水分解酵素の レベルを高くすると最も有利である。分泌に基づくプロセスでは、酵素レベル、 は初期には低く、発酵の終わりに近い最大レベルに達するまで蓄槽する。しかし ながら、酵素源として従来の４！！鉾からの細胞を使用することにより、初期に ほぼ最大レベルに達することができる。加水分解のために熱安定性酵素を使用す ると、汚染を最小限にするための付加的なプロセス利点となり、より高い加水分 解率を実現することができるが、−次的な利点は回収された細胞からの細胞内酵 素の放出の単純さにある。
エタノール耐性はセルロース及びキシランを分解する天然の生物でしばしば問題 となる。このような生物は典製的には２０　ｇ／　１未満のエタノールを産生ず る。（Ｔａｉｌｌｅｚら　Ｌ１９８９１　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖ、１ｒｏｎ、Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、５５：　２０３−０６＞、このようにキシランからの高レベルの エタノール産生は達せられていないが、Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）は１００ ｇ／１（７）キシロースから少なくとも４８ｇ／Ｉのエタノールを産生ずること が可能である（最大理論収量の約９５％）、カンパ材キシランからの合計エタノ ール収量は予想されるよりも低く、主に不完全なキシラン加水分解に起因すると 考えられる。６５時ｍ０糖化時ｒｉｆｌ後も未分解のキシロオリゴ環が残った。
本発明の構築物により産生されるキシラナーゼのレベルはＧｒｅｐ　ｉ　ｎｅｔ らの前出の文献により報告された最適キシラナーゼ融合構築物により産生される レベルよりも低かったが、酵素レベル自体は非制限的であるように思われた６キ シラン（４０ｇ／Ｉ、約０．３モルのアンヒドロキシロース〉は１０５μモル／ 分の速度で加水分解により２４時間後にキシロビオース等価物に完全に分解され る筈である。発酵からのａ＋ｉ収筆は約４，５ｇ細細胞タンパ雪質／リットルあ り、１４４μモル／分／ｇ細胞タンパク質のキシラナーゼ活性は６４８μモル／ 分の総括性を提供した。一方、活性キシラナーゼの残存にも拘わらず６５時間後 にもキシロオリゴ環が残存した。これらのキシロオリゴ環のレベルは新鮮な酵素 の添加及び更に２４時ｍ４ンキュベーションしても変わらなかった。キシロオリ ゴ環による加水分解の競合的阻害は不完全な消化に起因すると思われ、キシロー ス、キシロビオース及びキシロトリオースを代謝するＭ５Ａ１における天然酵素 と同様にキシラナーゼが活性状態に維持された温度である４５℃で加水分解によ り部分的に試験した。これらの条件下のオリゴ糖プロフィルはＭ５Ａ１株による 発＃Ｓ後に観察されるプロフィルと同一であり、同等レベルのキシロトリース及 びそれ以上の長さのオリゴ環が未消化のまま残った（データは示さず）。消化を 制限するｆ換基の種類はわかっていないが、これらのオリゴ環は制限消化ｉｊ＃ 物であると考えられる。製造業者によると、カンパ材キシランは９９％キシロー スである。特定の理論に拘束する意図はないが、本尭明者らはこの産物は保存中 に発生した酸化残基又は塩基抽出及び精製に耐えたｆｆ換物を含有し得ると推察 している（Ｃｈｅｓｓｏｎら　ｔ１９８３Ｊ　Ｊ、Ｓｃｉ、ＦｏｏｄＡｇｒｉｃ 、３４：　１３３０−１３４０１゜米国における発酵エタノール製造は年間約１ ０億ガロン（３８億リツトル）である（　Ｌ　ｙ　ｎ　ｄら、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２５１：１３１８−１３２３）、遺伝子組構に、ｏｘｖｔｏｃａ、大腸菌、Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ又はＺ。
ｍｏｂｉｌｉｓのような微生物を使用してエタノールとの副産物として種々の酵 素を製造することができた６ビール２リツトル当たりタンパク質２ｇの最小細胞 収量では、細胞タンパク質の５％の転用により副産物として少なくとも３．８０ ０．０００ｋｇの酵素を製造することかできる７これらの酵素は発酵用基質の解 重合に制限する必要はないが、洗剤産業、食品１！＃業、木材パルプ化及び新規 化学！ｔｌｌＩｉｉのための新規生物触媒利用産業の＃１４発のような他の大市 場…酵素を含み得る。大市場が発展するならば、このような酵素の価値はエタノ ール目体の現状の価値を優に剛え得る。
実ｗＬ例しβ−−；ノノール怠進〃犬カーに染匂Ｃ杢−（こ−組−み込専れた一 Ｚ、−ｎｚｏｂｊ上ｉｓｉ伝１シ１−ｐｑ−ｊ−ｏ　ｓ　ｔ　ｒ　ｉ　ｄ−ｉ　 ｕ　ｍｔ　ｈ−ｅ　−ｒ　ｍ　ｏ　ｃ−ｇ、　ｊ　ｊｕ　ｍ　ｈ’　ｅ＞−の艷 安定−七！レラーーーゼ遺伝子を裏層するプラスミー１−奇象む組換Ｋ　１．ｅ −ｂ　ｓ　ｉ　ｅ　ｌ　Ｉ−、ａＯ耳−ｙ−ｔ、、−ｐ　ｑ　ａ寥Ｊ」−ロビオ ース、アモルファスセルロース及び荀−晶１沈沙−ｐ−スからのモタノニル産生 火亀例の要約：　この実験では、エタノール産生のためのＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺 伝子をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　。
ｘｙｔｏｃａ株Ｍ５Ａ１の染色体に組み込んだ、これらの構築物の最良の株であ る株Ｐ２はモノマー糖以外にセロビオースから有効にエタノールを産生じた、こ の株によるセロビオース及び七ロトリオースの利用により、外部β−グルコシダ ーゼの要求がなくなり、５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ８Ｗ４０（主に結晶質のセルロー ス）を発酵するために必要な市販のセルラーゼの量を減らすことができた。Ｃ１ ゜ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからのエンドグルカナーゼをコ ードするプラスミドを加えた結果、発酵中にエタノールとの副産物として熱安定 性酵素の細胞内蓄槽が生じた。これらのうちの最良の株であるｃｅｌＤを含む株 Ｐ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）を使用してアモルファスセルロースをセロビオースに 加水分解し、２段階プロセスでエタノールを産生させた。市販セルラーゼとの組 み合わせでも株Ｐ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）を試験した。５ＯＬＫＡＦＬＯＣ５Ｗ ４０を６０℃でエンドグルカナーゼＤで前処理することにより、５ＯＬＫＡ　Ｆ ＬＯＣを４＠酵させるために必要な市販セルラーゼの蝋を８０％まで減らすこと ができた、エンドグルカナーゼＤ前処理の刺激効果は真菌セルラーゼによる攻撃 のための付加的部位を１ｋｖＬするアモルファス領域の加水分解に起因し得る。
エンドグルカナーゼＤはＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　Ｉ　Ｉｕｍで複合体の一部とし て１１Ｉ＠ｉするので、この＃素は真８１１８＠と複合又はセルロースと結合し て加水分解のためのより解放された構造を提供することが可能である。
実施例１７はエタノールとの副産物としてに、ｏｘｙｔ。
ｏｃａ　Ｍ５Ａ１中でＣｌｏｓｔｒＬｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅ　ｌ　Ｓｕｍ キシラナーゼを細胞内に蓄積する利点を立証した、この実施例では本発明者らは エタノール産生用遺伝子をに、ｏｘｙｔｏｃａａＭ５Ａ１に組み込み、合成生物 がセロビオースをエタノールに有効に変換し得ることを立証した７この生物はセ ロビオース及びセロトリオースの両方を輸送及び代謝し、異柿β−グルコシダー ゼの必要をなくすことかできると思われる５この組み込み槽＠物に加えたプラス ミドはエタノールとの副産物として熱安定性エンドグルカナーゼを産生ずること ができ、セルロースの発酵中に市販のセルラーゼの必要が減った。
生物及−び成長令件：　表１５はこの試験で使用した新規生物及びプラスミドを 示す、２％グルコースを含有するルリア寒天上にエタノール産生遺伝子を生息さ せる株を維持しく３）、糖を加えないルリア寒天上に他の株を維持した。
特に指定しない限り、クロラムフェノコール（２０μｇ／ｍｌ）、テトラサイク リン（６μｇ／ｍ　ｌ　＞　、及びアンピシリン（５０μｇ／ｍ　１　＞を選択 のために使用した。典型的には、大腸菌株を３７℃で成長させ、Ｋ、ｏｘｙｔｏ ｃａ株を３０℃で成長させた。Ｚ、ｍｏｂｉ　ｌｉｓからのエタノール産生オペ ロンの４＠現をアルデヒド指示プレート上の色形成速度によりモニターした＋　 Ｃｏ　ｎ　ｗ　ａ　ｙら　１１９８７１　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９： ２５９１−２５９７）、カルボキシメチルセルロースを含ｉするルリア寒天上で １〜２時間５５℃でインキュベートした後、Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄで染色すること によりコロニーをセルラーゼ活性についてスクリーニングした（Ｗｏｏｄら　（ １９８８１Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１６０：５９−７４）。
表１ラ　この試験で使用した細菌株及びプラスミド’　Ｉｐｅｔは染色体へのＺ 、鯵ｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｅ及びａｄｈＢ遺伝子の組み込みを意味する。
’　ｇｅｔはプラスミドｐＬＯ１５５５Ｊ：のＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ及び ａｄｈＢ遺伝子の存在を意味する。
’　Ｐｏｕｓｔｋａら１１９８４１　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、 　ＵＳ＾８１：４１２９−４１３：１１゜’　０ｈｔｉら＋　１９９１　Ｊ＾ａ ｏＩ　、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　、　り７：２８１０−２８１５ ．。
”　Ｃｏｒｎｅｔら１１９８３１　Ｂｉｏ／Ｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　１：５８９ −５９４゜’　Ｊｅｆｆｒｉｅｓ、　ｉｎ　Ｊ、Ｆ、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｍ）、 　Ｈｏｏｄ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ、１ｏｓｉｃｓ：　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ≠戟@ｕ ｔｉｌ ｉｚａｔｉｏｎ、　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎ ｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｊｏｈｎ　１ｌｉｌｅｙ　＆@５ｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ　（１９８８）。
”　Ｐｅｔｒｅら　１°１９８６１　Ｂｉｏｅｈｉｍｉｅ　６８：６８フー６９ ５゜”　Ｊｏｌｉｆｆら［１９８８１８ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：８９ ６−９００゜遺順迂操　゛　びプラ入主１樽遺：　標準遺伝子操作手順を使用し た０株Ｍ５Ａ１へのｐｅｔ遺伝子の組み込みは、３檜の必須脣素：１）大腸１１ １ｐｆｌ遺伝子又はＭ５ＡＩ　ＤＮＡ、２）Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｅｔ遺伝子 、３）選択１４ｃａｔ遺伝子を含む（全複製機能を欠損する）環化ＤＮＡで細胞 を形質転換することにより得た。ます飲初にクロラムフェニコール２０μｇ／ｍ ｌを使用して組換体を選択した処、低レベルのＺ、ｍｏｂｉｌｉｓ＃［素を発現 した。大腸菌（Ｏｈｔａら　１．１９９１１　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、’５７：　８９３−９００）の場合と同様に、６００μｇクロ ラムフェニコール／ｍｌに対する耐性を有する突然変異株のＷ接選択により発現 を助長した。各組み込み毎に高レベルの耐性を発現する単一クローンを維持した 。
ｃｅ　ＩＡ　（ｐｃＴｌ　０５）　、ｃｅ　ＩＢ　（ｐｃＴ２０７）及びｃｅ　 ＩＤ　（ｐｃＴ６０３）を含むプラスミドにテトラサイクリン耐性を加えた。プ ラスミドｐＣＴ１０５及びｐＣＴ２Ｏ７をＢａｍＨＩで消化した後、大腸１１Ｄ ＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、平滑末端を生成しな、 プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩで消化し、同様に処理して平滑末端を生成 した、次に３１１の全プラスミドを５ａｌＩで消化した６得られたｔｅｔのｔ゛ 末端含むｐＢＲ３２２からの小さいフラグメントをｐＣＴ１０５及びＰＣＴ２０ ７からのより大きいフラグメントに連結し、（Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　 ＤＮＡの挿入により予め失活させておいた）機能的ｔｅｔ遺伝子を改変し、夫々 ｐｃＴ］０５Ｔ及びｐｃＴ２０７Ｔと命名した。
完全遺伝子を含むｐｃＯ９２ＥＭＢＬ　ｔＰｏｕｓｔｋａら、１旧からの２．５ ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＴ６０３のユニークＥｃｏＲＩに挿入し 、ｐｃ７６０３Ｔを生成した。このプラスミドはｃｅ　ＩＣに加えて機能的ｔｅ ｔ遺伝子を含んでいたので、ｐｃＴ３０１をそれ以上修−する必要はなかった。
全セルラーゼ含有プラスミドをテトラサイクリン耐性選択で組Ｎ１１Ｋ、ｏｘｙ ｔｏｃａに形質転撓した。
ヤルｉ＝−Ｗｍ’ｎ：　ｐ−二トロフェニルーβ−Ｄ−セロビオシドを基質とし て使用して、細胞＋ブロス中及びブロス隼独中で６０℃でエンドグルカナーゼ活 性を決定したくＰｅｔｒｅら、前出）、更に、アモルファスセルロースからの還 元糖の放出としてエンドグルカナーゼＤ活性を推算した。アモルファスセルロー ス（酸膨潤及び塩基膨潤）はＡｖｉｃｅｌについて従来記載されているように５ ＯＬＫＡＦＬＯＣ５Ｗ４０から調製した（Ｗｏｏｄ　１１９８８Ｊ　Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１６０：１９−２５）、還元糖は、Ｎｅ　Ｉｓｏｎ−３ｏｍ ｏｇｙｉ法（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら　１１９８３１　ｐｐ　１５１−１５２゜ｉ ｎ　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　Ｈ，Ｌｌ、（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｎｚ、 ｙｍａｔｉｃ　ａｎａｌ、ｖｓｉｓ。
ｖｏｌ、ＩＩ、　＠３＃ｉ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｔｅ。
Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより測定した。アモルフ ァスセルロースの初期＊ｒｔはフェノール−硫酸法（Ｗｏｏｄｌ１９８８１　Ｍ ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１６０：８７−１１６１により合計炭水化物として推 算した、 １（）％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、）で凝固させたルリアブロス約１５ｍ １を収容する１　８ｍｍＸ　１５０ｍｍ培養管を定常相培養物２ｍｌで被覆する ことにより、エタノール屋生ｃｅ　１”組換体間のエンドグルカナーゼ活性を更 に比較した。５５℃で４８時間インキュベーション後、液化の桿度を反転により 決定した。
キシロシド及びキシラン消化について従来記載されているように薄層クロマトグ ラフィーによりセルロース消化産物を分析した（Ｄｏｍｅ　ｒら　１１９８８Ｊ 　Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、１６０：３５５−３６２）、グルコース、セロビオース及びセ ロトリオースをオリゴマーから分陣した６セロビオース及びグルコースを標準と して使用した６角潰＄Ｔｌｌ１．：　従来の記載とほぼ同様に１Ｂｅａｌｌら、 前出）ｐＨスタット（３５０ｍｌ操作容漱）として５００ｍ１　Ｆｌｅａｋｅｒ 中で発酵を打った。１０％グルコース又は１０％セロビオースを含有するルリア ブロスを３０℃、ｐＨ６００，１１００ｒｐで試験した。ルリアブロスく４％グ ルコース１５０ｍ１を収容する２５０ｍ１容フラスコ中で振盪せずに発酵用接種 材料を３０℃で一晩成長させた。混合後、５５０　ｎ　ｍで細胞密度を測定し、 ０．３２ｍｇ細胞乾燥重量／ｍｌ　（０，Ｄ、５５（１’ｎｍ＝１．０１の初期 密度を提供するために必要な昇竜を計算するために使用した。細胞を遠心分離に よりこの容置から回収し、各ｐＨスタットからのブロスの一部に再懸濁し、発酵 を開始した。
糖を別々に濾過滅菌した。セルロース発酵は５０ｇ／ｌの５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ ＳＷ４０（Ｊａｍｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５ａｄｄｌｅ　 Ｂｒ。
ｏｋ、ＮＪ）を含有しており、３５℃で行った。セルロースを乾燥粉末としてオ ートクレーブ処理することにより滅菌した６市１１ｊｉｌ業を使用してセルロー ス発酵を試験するために、ＣＹＴＯＬＡＳＥ又はＭＵＬＴＩＦＥＣＴを接種時に 加えた。
＃ＩＩＩＰＪ量（０，Ｄ、５５０ｎｍ）＆びエタノール（７’７２液体クロマト グラフィー、Ｂｅａｌｌら、前出）を決定するためにサンプルを取出した。エタ ノール濃度をｇ／ｌとして表した。発酵中に塩基を加えることによりエタノール 駅員を希釈に関して補正し、糖又はセルロースの初期総量に基づいて計算した６ 残貿炭水化物については補正を行わなかった。解糖及び発酵からの最大理論収量 は０．５１ｇエタノール／ｇグルコース、０．５３６ｇエタノール／ｇセロビオ ース、及び０．５６ｇエタノール／ｇセルロースである。指示した以外は、結果 は２回以上の発酵の平均である。
ｉ豚セルラーゼ＝　２種の市販セルラーゼ、ＣＹＴＯＬＡＳＥ　Ｍ２Ｏ３及びＭ ＵＬＴＩＦＥＣＴ　ＣＬ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒ ｏｌｌｉｎｇ　Ｍｅａｄｏｗｓ、　ＩＬ）を試験した。いずれも液体、恐らく適 切な修正を加えた突然変異Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｉｏｎｇｉｂｒａｎｃｈｉ ａｔｕｍからのブロスとして市販されている。いずれもベク千ナーゼ、セルラー ゼ及びヘミセルラーゼの混合物を含有するとして記載されている。これらの酵素 調製物は現在食品加工に最も広く利用されている。
Ｍ５＾１へのΔユ１．り−上ｉ−上ｉ−ｓ　ｐ東↓」検子−の一東色体組＝み込 ヨみ二　３棟のアプローチを使用してｐｅｔ遺伝子（Ｍ５Ａ１の染色体に組み込 んた（Ｏｒｓｄｏｖ　１１９８４１　ｐ、４６１−４６５．　ｉｎ　Ｎ、Ｒ，Ｋ ｒｅｉｇＰＩＬびＪ、Ｇ、Ｈｏ１ｔ（＠）、　Ｂｅｒｇｅｖ’ｓ　ｍａｎｕａｌ 　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、１．　Ｔ ｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、　Ｂａｌｔｉｍ。
ｒｅ　）、に、ｏｘ、ｖｔｏｃａと大腸菌は密接に関連しているので、大腸菌ｐ ｆｌ遺伝子を同ＪＩＤＮＡの主要源として使用し、大腸菌に使用した方法に類似 の組換を行った（Ｏｈｔａら、　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、５７：８９３−９００）、大腸菌のｐｒ＋遺伝子と共にｐｅｔ遺伝子及びｃ ａｔを含むｐＬＯＩ５１０から８．６ｋｂｐの５ａｉｌフラグメントを精製した 。（複製に関与する遺伝子を欠失する）このフラグメントを連結により環化し、 組み込みを直接選択できるようにＭ５Ａ１に形質転換した。少量のフランキング 大腸菌ｐｆｌＬか含まないより短い５ｋｂｐ　Ｐｓｔｌフラクメントを１一様に 使用した。第３のアプローチでは、ｐｅｔ遺伝子とｃａｔのみ（大腸菌ＤＮＡな し）を含む４．６ｋｂｐ　ＢａｍＨＩフラグメントに連結し、形質転換に使用し た６２％グルコース及び２０μｇＣｍ／ｍ　ｌを含有するルリアプロスプレート 上で選択することにより、全３樺のアプローチから組み込み株を回収した。回収 した３つの組み込みクローンは５ａｌｌフラグメントを有しており、２つはＰｓ ｔＩフラ液体培養で一晩成長後、６００ｎｇＣｍ／ｍｌ及び２％グルコースを含 有するプレート上に定常相線１１１１０．１ｍｌを塗抹し、高レベル発現につい て選択した。各組み込みから単一の大きいコロニーを維持し、構築に使用した制 限部位に従って、ＳＬ、Ｂ２．Ｂ３．ＰＩ、Ｐ２及びＢ１と命名した。これらの クローンをミニスクリーンＤＮＡの形質転換によりプラスミドの存在について試 験すると共に、アルデヒド指示プレート上でｐｅｔ遺伝子の発現について試験し た（表１６）、プラスミドに担持されたｃａｔ遺伝子を含むことが判明した推定 組み込み株をミニスクリーンＤＮＡの消化後に廃棄し、ｐＬＯＩ５１０（恐らく ゲル精製フラグメントの低レベル汚染物質）の存在を確認した。＠生物及び優れ たエタノール屋生物質であるＭ５Ａ１　（ｐＬ０１５５５）を夫々陰性及び陽性 対唄として使用した６２樗のクローンは、Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ　５５５）　、 株Ｂ１及びＰ２とほぼ同等レベルのエタノール遺伝子を発現した。
表１９　組み込みｐｅｔ遺伝子を含むＭ５＾１の株による１０％グルコースの発 ＃（４８時１＠報告値は単−実駿からの値であるが、多くの値が再現され、その 後の試験で平均した。
’ｍ飽量は５５０ｎ−の最大０．０．（約０．３２．乾燥重量＃１０．Ｄ．ｊｌ １位）から計算した。
′３０℃でアルデヒド指示プレート上の発色の相対速度をｇｅｔオペロンからの 相対発現尺度として使用した。
’　ＤＭＡの小規模調製物をアガロースサブマリンゲル上で試験し、形質転換中 に抗生物質耐性を大腸菌ＤＨ５αに伝達する能力について試験した。
輯ＡｉＡＡａ圭人４グルコース発博−仁莢ΣＡｌー工ｐーレｐｉ乳ΣラーＬＯ北 −Ｍ：　４８時間後、ｐｅｔ組み込みを含む４種の株によりＭ５Ａ１　（ｐＬＯ Ｉ５５５１と同等の高レベルのエタノールが産生された（表１６）、最低レベル の酸性ＩＩｌ産物を産生した２．樟もＩ＠様に最高密度まで成長した。
これらの株Ｐ２及びＢ１を更に試験するために選択した。
生！３及びＢ１に、（邊グルコース及びセロビオースの発−：　１０％グルコー ス及び１０％セロビオースを発酵する能力について株Ｐ２及びＢ１を試峻した（ 表１７）、グルコース発酵（図１１Ａｌ中、どちらの組み込み株も親牛糊Ｍ５Ａ １の３倍のエタノールを学生したが、Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ５５５）（プラスミ ドに担持したｐｅｔ遺伝子）よりは収量及び容量産生率でやや劣っていた。意外 にも、株Ｂｌ中のｐｅｔ遺伝子の組み込み及び高レベル４＠埋は、セロビオース を発酵する能力の損失を伴った。一方、株Ｐ２は良好に成長し、セロビオースか らエタノールを産生しく１５１１１Ｂ）、最大理論収量の９６％であった９株Ｐ ２をＡＴＣＣ５５３０７として１９９２年３月１１日付けで寄託した。
従って、ＩＮＩＩＡ及びＩＩＢはに、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１の組撓株による エタノール産生を示す６図１１Ａはグルコース（１００ｇ／Ｉ）からの産生を示 す。記号は、・：株Ｍ５Ａ１　（ｐＬＯＩ　５５５）、ム：組み込みｐｅｔ遺伝 子を含む株Ｐ２．■：組み込みｐｅｔ遺伝子を含む株Ｂ１．○：Ｍ５Ａ１対照を 表す、Ｌ！ＩＩＩＩＢは株Ｐ２によるセロビオース（１００ｇ／ｌ）発酵からの 産生を示す。記号はム：エタノール、Δ：細胞量を表す９青！７　Ｋ、ｏｘｙｔ ｏｅａ　１４５＾１の組換株及び大腸菌に０１１によるエタノール産生１グルコ ース及びセロビオース発酵は３０℃で実施した。他の発酵は３５℃で実施した。
ｈ接種時に酵素を加えた。
ｃ６〜２４時間の閘に計算した。
４尭酵中に塩基を加えることにより希釈の補正をした。Ｓ（基質）はグルコース 、セロビオース又はＳＱＬに＾ＦＬＯＣ５ｉ１４０を意味する。
＠５１Ｒエタノール／ｉｏ軸グルコース、５３．５．エタノール／１００ｇセロ ビオース及び２〜エタノール１５０Ｒセルロースの最大理論収量に基づいて換算 した。値は残留基質について補正しなかった。
’　Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｅｅｌｌｕｍ　ｅｅｌＤの起源として従来の発酵から回収 した細胞を使用することにより、５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｈ４０を６０℃で１２ 時言予め消化した。３５℃に冷却後、ブロスを接種し、市販のセルラーゼ１ｍｌ ／１００＋ａ１発岬容鰍を加え、発酵を開始しな。
グルコースしか利用しないエタノール産生大腸菌とは対照的に、絹ｌ１ｋＫ、ｏ ｘｙｔｏｃａ　Ｐ２はセロビオースを発酵することができ、セルロース発酵中に 外因性β−グルコシダーゼを必要としない、市販の酵素を使用してセロビオース 利用がセルロースからのエタノール産生をどの桿１！まで改善するかを試験する ために、濃度０〜１０％のＣＹＴＯＬＡＳＥ又はＭＵＬＴＩＦＥＣＴの存在下で ５０ｇの５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０を基質として使用して発酵を行った（図 １２、表１７）、これらの調製物は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ 及びβ−グルコシダーゼを含む真菌酵素の混合物を含有している。
従って、図１２は市販セルラーゼの添加が１２０時間後に５０ｇ／ｌの５ＯＬＫ Ａ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０からのエタノール収量に及ぼす効果を示す、破線は、添加 したセルロースのみから形ｖｉ、０［［なエタノールの量大量を示す、エタノー ルのレベルか高イノは、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ　ＣＬＩＩＩＩｌ物中に適切な補正 として加えた付加的基質に主に起因する。記号は、ム＋に、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｐ ２及びＭＵＬＴＩＦＥＣＴ４．：Ｊ：４％岬、−：大腸菌株ＫＯ１１ａびＭＵＬ Ｔ　Ｉ　ＦＥＣＴによる発酵、八Ｈ１（，０）（ｙｔｏｃａ　Ｐ２及びＣＹＴＯ ＬＡＳＥによる発酵、し］１：大腸菌ＫＯ１１及びＣＹＴＯＬＡＳＥによる発酵 を表す。
低濃度ではＣＹＴＯＬＡＳＥはより効率的であることが判明したが、多少の毒性 はこの酵素調製物の高濃度に関連していた。いずれの場合もに、ｏｘｙｔｏｃａ の組換株の性能はセルラーゼの市販調製物中のβ−グルコシダーゼの存在にも拘 わらず、大腸菌Ｋｏｌｌよりも優れていた７また、これらの結果は、β−グルコ シダーゼ活性市販セルラーゼ調製物が他のセルラーゼ活性に比較して非飽和性で あることを示唆している。
ＭＵＬＴＩ　ＦＥＣＴ濃度が最高の場合、５０ｇセルセルロース消化の理論的最 大値を上回る収量が観察された。炭水化物又は酵素を加えないルリアブロス及び １０％ＣＹＴＯＬＡＳＥ又は１０％ＭＵＬＴＩ　ＦＥＣＴを含有し１つ炭水化物 を加えないルリアブロスで発酵を行うことにより、この付加的エタノールの起源 を調べた。ルリアブロス単独からは約１ｇ／Ｉのエタノールが産生され、１０％ のセルラーゼを添加したルリアブロスからは５ｇ／Ｉのエタノールが産生された 。即ちｌＯ％ＭＵＬＴＩＦＥＣＴを含有する発酵では、約４ｇ／ｌのエタノール が市販添加剤又は酵素安定剤の発酵に起因し得る。より低２１１度のセルラーゼ からも比例最のエタノールが産生されると予想される。ルリアプロス成分及び１ ０％　ＭＵＬＴＩＦＥＣ′ｒから産生され得るエタノールを補正すると、エタノ ール収量は理論的最大値の約９４％である。
！！Ｐ２におけ４−ｑ、ｔｈｅｒｍ、ｏｃｅ　ｌ　ｌｕｍ＋４：５ニーｔ’Ｑ＊ −良：　セロビオースは株Ｐ２から発酵され得、エンドグルカナーゼ及びエキソ グルカナーゼによるセルロース消化からの主要産物である９本発明の生物により 酵素は形成されないが、ｐｅｔ遺伝子を染色体に組み込むことにより、発酵中の 副ｌＩ物としてこれらの酵素を提供するために異種遺伝子をコードするプラスミ ドを加え易くなる６選択のためにテトラサイクリン耐性を加えた後、好熱菌であ るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍから４種のエンドグルカ ナーゼの発現をｇ験した（表１８）９ｃｅｌＤ遺伝子は大腸菌中で非常に高レベ ルで発現され、株Ｐ２で高レベルで発現された。これらの遺伝子から産生された エンドグルカナーゼ活性の大部分は細胞内に緋特されたが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ株はタンパク質分泌系を有することか知られており、部分的分泌の可能性はな くなった。
５５℃で４８時間インキュベーション中に培養管でＣＭＣの液化における効力の 品質比較を行った。活性測定値によると、ｃｅ　ＩＤを生息させる組換体（ｐｃ Ｔ６０３Ｔ）が最も有効であり、ｃｅｌｃ（ｐｃＴ３０１）がこれに続いた。ｃ ｅｌＢを生息させる株Ｐ２　（ｐｃＴ２０７Ｔ）はほとんど成長しなかったので 、それ以上試験しなかった。
Ｃｅ１Ａ（ｐＣＴ１０５Ｔ）組換体はほとんど液化を生じなかった。
更に産生異種遺伝子産物が発酵性能に及ぼす効果を調べた。ｃｅｌ遺伝子のいず れか１種を発現するプラスミドを加えると、１０％グルコース発酵中の最終細胞 密度は１０〜３０％減少し、エタノール収量は減少した（表１８）。
ｃｅｌＤ遺伝子の発現は最も悪影響が少なく、エタノール収量は０．３２ｇエタ ノール／ｇグルコースであり、兼大理１１１−の６２％であった。ｐ−ニトロフ ェニル−８−Ｄ−セロビシドを基質として使用して６０℃でアッセイを行った。
ｍ位は、細胞を含む発酵ブロス又はＭｌ飽を遠心性−により除去した後のブロス ｍ１当たりの氷解物μモル／分である、 表１−８　株Ｐ２におけるＣ、ｔｈｅｒｓｏｃｅｌｌｕ−エンドグルカナーセ遺 伝子の発現 ロースを加水分解しないが、この酵素はアモルファスセルロースを加水分解する ことが従来示されている（Ｂａｇｕｉｎら、Ｊｏｌｉｆｆら、前出）。この遺伝 子をＱｔｌする株Ｐ２　（ｐｃＴ６０３Ｔｌがアモルファスセルロースをエタノ ールに変換する能力を試験した６エンドグルカナーゼＤｆｉとして前のグルコー ス発酵からのＰ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）の細胞及びエタノールを産生ずるために 同一生物を使用する２ｉ［バッチプロセスでリン＃膨潤及び塩基膨潤（水酸化ナ トリウム）ＳＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０を試験した。
第１投階では、以前のグルコース発酵からの等容量から回収した細胞を使用して 、７６ｍｇ／ｍｌのｆＩｉ膨潤セルロース又は３２ｍｇ／ｍｌの塩基膨潤セルロ ースを含有するルリアブ０ス３ｍｌを６０’Ｃ（ｐＨ６，０）ｒ７２時間インキ ュベートした。６０℃に加熱すると、細胞は失活してエンドグルカナーゼＤを放 出したので、この温度が活性のほぼ最適な温度であった。加水分解中に還元等の 放出を測定した。基質濃度は異なるが、酸ｍ潤セルロースは塩基膨潤セルロース の２倍の速度で加水分解され、２４時間後に夫々２４０μモル及び６０μモル当 量のセロビオースを産生じた。ｍｔｇｓ潤セルロースは非常に粘性になり、サン プリングが困難になった。７２時間後、塩基１ｍ潤セルロースの消化物中には１ １０μモル当量のセロビオースが存在していた。これらの収量は線膨潤及び塩基 膨潤セルロースの両方のほぼ完全な加水分解を反映している。
図１３Ａ、Ｂ及びＣはＰ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）によるセルロース加水分解及び ４＠岬の薄層クロマトグラフィー分析を示す、ｔＩＩＩＩ＃ｌセルロース（図１ ３Ａｌ　、塩基１１＃Ｉセルロース（図１３Ｂ）及び結愚質セルｏ−４（１ｍｌ 　３Ｃ，Ｓ。
ＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０）を試験した、セロビオース及びグルコースを各クロ マトグラムのレーン１でｗ準として使用した０図１３Ａ及びＢ中、レーン２〜６ はアモルファスセルロースの加水分解中に種々の時刻（夫々０．６．１２．２４ ．４８及び７２時間）に取り出したサンプルを表し、レーン７は株Ｐ２（ｐｃＴ ６０３Ｔ）で２４時１Ｗ１３０℃で４＠＃後にレーン６で分析したブロスを表す ７１１１３Ｃは、１％　ＭＵＬＴＩ　ＦＥＣＴ及びＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕ ｍ　ｃｅｌＤを発現するＰ２　（ｐＣＴ６０３Ｔ）による結晶質セルロース（Ｓ ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ３Ｗ４０　）発酵の薄層クロマトグラフ分析を示す。レーン 構成は、２が消化直前の５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣＱｆｆｉ液、３が従来の発酵から のＰ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）により供給されるエンドグルカナーゼＤで６０℃で ２４時間消化後の７０ス、４かＰ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）により３５℃で２４時 間発発情後レーン３に承されるブロス、５か３５℃でＰ２（ｐｃ′ｒ”６０３Ｔ ）により更に２４時間発発情後合計発酵、４８時間）のブロスを示す。
即ち１図１３Ａ及び１３Ｂのレーン２〜６は夫々ｔ１１ｍｌ′ＩＲ及び塩基膨潤 セルロースからの神々の時刻におけるセルロース消化産物を示す７セロピオース はどちらにおいても少蓋のクルコースと共に主要な産物である。酸膨潤セロヒオ ースの消化物中には低レベルのセロトリオースか存在していた。３５℃に冷却後 、これらのブロスに５０μｌのＰ２（ｐｃＴ６０３Ｔ）を接種し、撹拌又はｐＨ 制御せずに２４時間発酵させた。グルコース、セロビオース及びセロトリオース はこの間に完全に除去され（図１３Ａ＆Ｂ、レーン７）、約５ｇ／Ｉのエタノー ルが産生された。塩基膨潤セルロースでは０．１６ｇエタノール／ｇセルロース が産生された。ｉ）Ｈの低下は恐らくエタノール産生の程度を制限するのに役立 ったと思われるが、このエタノール収量は理論的最大値の２７％に等価である。
Ｃ−、％　ｈ、−ｅｒｍｏ　ｃ　ｅ　ｌ　Ｉ　ｕ　ｍエンドグルカナーゼの内− 性産生に−よ一４ＷＩｋ＋ニルロースの部分的置換：　Ｐ２（ｐＣＴ６０３Ｔ） は外部から付加されたβ−グルコシダーゼを必要とせず、アモルファスセルロー スを加水分解するエンドグルカナーゼＤを提供し得るが、結晶質セルロースを加 水分解するためには付加的活性が必要である７この株が市販セルラーゼの要求を 部分的にＷ摸する能力を２投発酵プロセスで試験した。従来のグルコース発酵が ら回収した細胞を、５０ｇ／ｌの５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０を含有する等漱 のルリアブロスに再＠渇し、６０　Ｙ’で２４時閏インキュベートした。３５℃ に冷却後、これらの発酵物に１％市販セルロースと共に同一生物を接種した。Ｃ ＹＴＯＬＡＳＥ及びＭＵＬＴｉＦＥＣＴの両方で同様の結果が得られ、１７．４ ｇ／ｌのエタノールが産生され、最大理論収緻の６５％であった（表１７）。
ＣＹＴＯＬＡＳＥについて図１４に示すように、ｅｅｌＤ遺伝子産物で前処理す ると、１％セルラーゼを使用したエタノール産生量は著しく増加し、５％ＣＹＴ ＯＬＡＳＥと同等のエタノール収量が得られた。図１４中、セルロース（５０ｇ 　５ＯＬＫＡ　ＦＬＯＣ５Ｗ４０／リツトル）はＣＹＴＯＬＡＳＥ及びエンドグ ルカナーゼＤでは十分に糖化されず、株Ｐ２及びＰ２　（ｐＣＴ６（１３Ｔ）に より発酵された。記号はΔ：接種時にブロス１００ｍ１当たり５ｍｌのＣＹＴＯ ＬＡＳＥを加え、Ｐ２で発酵させた場合、ロ：接種時にブロス１００ｍ１当たり １ｍｌのＣＹＴＯＬＡＳＥを加え、Ｐ２で発酵させた場合、０：接種時にブロス １００ｍ１当なり（１，１ｍｌのＣＹ　Ｔ　ＯＬ　Ａ　Ｓ　Ｅを加え、Ｐ２でｔ Ｓさせた場合、−：　Ｃ，ｔｈｅ　ｒｍｏｃｅ　Ｉ　Ｉ　ｕｍエンドグルカナー ゼＤｆｉとして以前の発酵から回収したＰ　２　（ｐ　ＣＴ　６０３　Ｔ　）を 使用することにより５ＯＬＫ人ＦＬＯＣを６０℃で１２時間予備消化し、発酵さ せた場合を表す。３５℃まで冷却後、１ｍｌ市販セルラーゼ／１００ｍ１発酵ブ ロスとＰ２　（ｐｃＴ６０３Ｔ）とを加え、発酵を開始した。
１ｓ１１１３ｃは、Ｍ　Ｕ　Ｌ　’ｒ　Ｉ　ト”　Ｅ　Ｃ′ｒでの平行２　Ｎ１ １ｉｌ岬の異なる役階からのサンプルの薄層クロマトグラムを示す。
この場合も同様に、グルコース、セロビオース及びセロトリオースは完全に代謝 された。　ＩＩｕち、糖化に必要な市販セルラーゼの量は、以前の発酵でエタノ ールとの副産物として産生された組換エンドグルカナーゼＤで予備処理後に８０ ％まで減少した。
！！１：　β−グルコシダーゼによるセロビオースからモノマー糖への加水分解 は真菌ブロスによるセルロース消化をしばしは制限することが知られている７β −グルコシダーゼの粘性は典型的には、効率的なセルロース加水分解に必要な酵 素のうちで最少につ最も低安定性である。セルラーセ作用の産物としてのセロビ オースの蓄槽は、その後の解重合の競合的阻害剤としてｔＩ＆能する（Ｅｒｉｋ ｓｓｏｎら　１１９９０１　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　ｅｎｚｖｍａｔｉｃ 　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｏｏｄａｎｄ　ＶＶＯＯｄ　ＣＯｍｐＯｎ ｅｎｊＳ、　Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｊｅ ｆｆｒｉｅｓ、１旧、に、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｐ２はセロビオースを高レベルのエ タノールに迅速月つ効率的に変換することが報告された最初の生物である、この 生物はセロビオース及びセロトリオースを１１ｉ極的に輸送する能力を有してお り、セロビオース蓄積を最小限にし、外部酵素によるその後の解重合の必要をな くすと考えられる。セロビオースの輸送系はに、ｏｘｙｔｏｃａ　（Ａｌ　１１ ’Ｊ８９１　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１２ニア９−８６）では１！ｌｌｌ １Ｉｆｔされていないが、密接に関連する生−である大腸菌は、はとんどの＆ｌ ＋蜜室株でまｔｔ不明であるが、天然にｓｉｎするセロビオース代謝のためのホ スホトランスフェラーセ成分及びホスホグルコシダーゼをコードする遺伝子を含 んでいる（Ｈａｌｌら　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｆ、　１６９：２７１３−２７１ ７：　Ｋｒ１ｃｋｅｒら　１１９８７Ｊ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１５：４１９　 −４２９）、に、ｏｘｙｔｏｃａでも麹漬の遺伝子かｓ婬すると予想される（Ａ １．前出）、 エタノール産生のためのｐｅｔ遺伝子を染色体に糾み込むことにより、エタノー ルとの副産物としてプラスミドに担持された組換タンパク質を容易に製造するこ とができた。
Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　Ｉ　ｌｕｓからのセルラーゼ遺伝子を１例として使用し たが、リパーゼ、プロテイナーゼ、グリコヒドラーゼ、動物ホルモン及び生物医 学産物のような他のより有益な組換産物も使用できる。副産物としての株Ｐ２に よるＣ、ｔｈｅｒｍｏｃｅ　ｌ　ｌｕｓセルラーゼの産生は１発酵効率の予期せ ぬ低下を伴った。この効率の低下の根拠はわかっていないが、本発明者らは′Ｉ ″ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉからのプルラナーセ遺伝子 を含むエタノール産生大腸菌及びＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍキシラナーセ遺 伝子を発現するに、ｏｘｖｔ。
Ｃａの多重プラスミドエタノール産生構築物で同機の観測をしている。
に、ｏｘｙｔｏｃａを用いた以上の実施例は、セルロースをエタノールに変換す るための改善方法の基本を形成するものである。セロビオース及びセロトリオー スはエンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの阻害剤であり、β−グルコシ ダーゼはオリゴマーをグルコースモノマーに変換するのに関与することが知られ ている６一方、株Ｐ２のようなエタノール産生組換体は代謝のために糖の解重合 を８善とせず、β−グルコシダーゼを８＃とせず、セロビオース及びセロトリオ ースによるセルラーゼの終産物阻害が低下する。更に、モノマーグルコースに比 較して少数の生物しかセロビオース又はセロトリオースを代謝することができな いので、主要汚染物質が減少するという利点もある６セロビオース利用を欠損す る大腸菌ＫＯ１１に比較すると、Ｋ、ｏｘｙｔｏｃａ　Ｐ２によりホされるセロ ビオースの輸送及び代謝は、セルロース４＠酵中の市１に酵素の４＃１束を減少 させた。
市販セルラーゼの要求は、発酵中に副産物として産生きれる付加的なエンドグル カナーゼを使用することにより史に減少した。この点で、熱安定酵素は発＃後に Ｉ＠胞内で容易に回収することができ、最良に機能する温度に加熱するだけで活 性形態で放出され得るので、特に有用であると考えられる。５ＯＬＫＡ　ＦＬＯ Ｃ５Ｗ４０を以前ノ４１Ｘ＃からのエンドグルカナーゼＤで前処理すると、Ｇｅ ｎｅｎｃｏｒセルラーセの効力は著しく増加した。エンドグルカナーゼＤはセル ロースのアモルファス領域のみで活性であるので（ＢＡｇｕ　ｉ　ｎら、前出） 、この前処理の有益な効果は市販セルラーゼによる新しい攻撃部位の形成に起因 し得る。Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅ　Ｉ　Ｉｕｓにおいて、エンドグルカナーゼＤは セルラーゼ複合体の一部である（Ｂａｇｕｉｎら、前出）、この酵素は同様に真 菌＃素と複合又はセルロースと結合し、加水分解のためのセルロース構造の開放 を容易にすると子息される。
エタノールへのセルロース発酵のｆ：めの最良の構築物であるＰ２　（ｐｃＴ６ ０３”ｒ）は天然のＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍはど有効ではない（Ｔａｉｌ ｌｉｅｚら　＋１９８９１　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ。
１、　５５：２０３−２１１＞、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍと異なり、Ｋ、 ｏｘｙｔｏｃａ　Ｐ２（ｐｃＴ６０３Ｔ）は完全なセルラーゼ系を欠損する７一 方、１％市販ＣＹＴＯＬＡＳＥ又はＭＵＬＴＩＦＥＣＴと組み合わせると、Ｐ２ 　（ｐｃＴ６０３）は６５℃のエタノール耐性Ｃ１ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ突 然変異株よりも３５℃で高収量及び高最終濃度のエタノールを産生じた。更に遺 伝子改善又はプロセス改善が望ましい。
実施−例１９　エタノール産土ｉｋ！すｑ−榊−進１４」ノリ配末れなヌー、ｍ ｏｂｉｌｉｓ遺伝＋＆囚−イヒの々−咋９濃宥定遺−伝子を今月するプ文ノーえ 上−（裳ぶ潮換−木腸１１ζよ邊−澱粉からのエタノ−−１に！迭 要職例の要約：　＃１ＩＩｌＪ内産物として澱粉糖化のための熱安定＃素を発現 し得る大腸菌のエタノール産生株かｍ発された、これらの酵素は発酵の終わりに 細胞内でｔｉ１１収することができ、最大活性を示す温度（６０〜７０℃）に加 鎮することにより遊離され得る。このような生物は副産物として少量のエタノー ルを産生じながら＃母をベースとする発酵のための酵素を供給するために使用す ることかできた。
本実施例では、熱安定α−アミラーゼ及びアルナラーゼをコードする遺伝子を発 現するエタノール産生株を１ｉＩＢ胞内産−としてｆｌｐ！発することにより、 大ＩＩＫ閑におけるタンパク雪分泌系の不在を利用する、＊Ｉ！安定＃素は発酵 の終わりに＊＃ｉ４内で回収され、単にこれらの酵素かほぼ量適な活性を示す温 度に加熱するだけで澱粉糖化のために放出される。
４３ｇ−碧成長条件：　全エタノール発酵は大腸菌株ＫＯ１１を使用して炭水化 物を加えたルリアブロス中で実施した（Ｏｈｔａら　１９９１）、この株に指定 遺りにプラスミドを７１０えた。
７プースーξ−トー樽箒：ＩＩ準方法を使…１．てＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｅｌｅｎｚら　１１９８５Ｊ　米国特許第 ４４９３８９３号）からのα−アミラーゼ遺伝子及び’Ｉ’ｈｅ　ｒｍｏａｎａ ｅ　ｒ。
ｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉ（Ｃｏｌｅｍａｎら　［１９８６１米国特許第４６１ ２２８７号、Ｃｏ　ｌ　ｅｍａｎら１１９８７１　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　 １６９：４３０２−４３０７）からのプラナーゼ遺伝子を含む２棟のブラスミＦ ｐＬＯＩ　１４０７ｉびｐＬＯＩ　１４１　（ｒ５？！１５Ａ７ｔびＢ）を横築 した９部分的消化後、アミラーセ遺伝子を含むｐＷＬ６２’５Ａｍｙ　（ＡＴＣ Ｃ３１，７９１＋　からの５゜４ｋｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌ＋７ラグメントをｐｃＰ ｃ９０２（Ｃｏｌｅｍａｎら　１１９８６１　前出）のＨｉｎｄｌＩＩ部位に挿 入した。＃粉及びブルランレ・ソドを含むルリア案天上で横築物を比較した処、 どちらの遺伝子もただｌつの部位に挿入した場合に高レベルの発現を維持できる ことが判−した（ｐＬＯＩ　５６８）、ＥｃｏＲＩで部分的消化後、テトラサイ タリン遺伝子を含むｐｃＯ８２ＥＭＢＬ（Ｐｏｕｓｔｋａら　１１９８４１　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：４１２９−４１３３）からの２．５ｋｂｐ　 ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＬＯＩ５６８に加え、ｐＬＯ１１４０及びｐＬＯ１ １４１を生成した。最終プラスミドはｐＢ）１３２２レプリコンを含んでおり、 株に０１１中で非常に安定しており、抗生物質選択なしに４８世代後にａｍの９ ６％により維持された。
図１５Ａ及びＢは以下の略号を使用している。ａｍｙ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕＳα−アミラーゼをコードする遺伝子、ｐｕｔ ：Ｔ’ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉプルラナーセをコード する遺伝子、ｔｅｔ　：テトラサイクリン耐性遺伝子、ａｍｐ　：アンビシリン 耐性遺伝子、ｏｒｉ：ｃｏｌＥルプリコンである。
発酵及−シ次逝：　はぼ従来の記載（Ｂｅａｌｌら、前出）に従ってＰＨスタッ ト（３５０ｍｌ操作容量）として５００ｍ１容Ｆｌｅａｋｅｒ中で発酵を実施し た。培地は、１０％グルコース、５％グルコース、１０％マルトース、５％マル トース又は４．５％澱粉を含有するルリアブロス（３０℃、ｐＨ６，０，１１０ ０ｒｐ＞から構成した７発酵物を初期細胞密度０．０３ｍｇ乾燥重量／ｍｌまで 接種した。
糖を別々にｒ過滅菌した。澱粉は滅菌しなかった。
＃ｌ胞質量を０．Ｄ、５５０ｎｍ（１０，Ｄ、で約０゜３２ｇ細胞乾燥重量／リ ットル）として測定した０合計糖化活性は還元糖の放出として６０℃で測定した （Ｂｅｒｇｍｅｖｅｒら、前出）、エタノールはガス液体クロマトグラフィーに より決定した（Ｄｏｍｂｅｋら、前出）。エタノール濃度はｇ／リットルとして 表した。エタノール収量は発酵中に塩基を前足ることにより希釈に関して補正し 、未使用炭水化物について補正なしの合計糖又は澱粉に基づいて計算した０発酵 からの最大理論収景は約０．５１ｇエタノール／ｇグルコース、０．５３ｇエタ ノール／ｇマルトース、及びＯ，’５６ｇエタノール／ｇ＃粉であった。結果は ２回以上の発酵の平均を使用した７＃？ｆｌｔｉＦ：　＃粉姥岬のために、ＫＯ Ｉ　１　（ｐＬＯ１１４０）又はＫＯＩ　１　（ｐＬＯＩ　１４１　）ｍ砲を７ ２時Ｍ後に１０％グルコースｌｌ１１尭靜から１０１収し、凍結保存した。
これらの細胞をｐＨ６，０に調整したルリアブロス２５ｍ１に再懸濁した。＃粉 （１５，７５ｇ）ｔｐＨ６，０に：調整したルリアブロス３２５ｍ１に懸濁した 。細胞懸濁液の２分の１を澱粉＠？ｖＩ液に加え、７０℃に達するまで撹拌下に 煮沸水浴中でインキュベートし、７０℃に５分間保持した、この簿合物を６０℃ に冷却した９残りの細胞を加え、２４時ｒａ１６０℃でインキュベーションを続 けた、加熱により＃樽大Ｉｌ１％菌は失活し、＃粉加水分解のための？安定酵素 を放出した。糖化澱粉を３０℃に冷却し２、滅菌＠清水で容１３５０ｍｌに！ｌ Ｉｌ移した。
接種材料を５％グルコース中で一晩成長させ、遠心分離により回収し、発酵を開 始するために使用した（０．０３ｇ　＃！ｌ　＠乾燥重電の生存細胞／リットル ）７サンプルを取り出し、エタノール決定及び薄層クロマトグラフィー分析した 。
未活化Ｗ　ｈ　ａ　ｔ　ｍ　ａ　ｎシリカゲル１５０Ａプレート（Ｗｈａｔｍａ ｎ　Ｉｎｃ、、Ｃ１１ｆｔｏｎ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を使用することにより、 グルコース、マルトース、マルトトリオース及びマルトトリースを分離した、５ 〜５０μａｌｌｌｌを含有する１μ夏のサンプルを加え、アセトン、酢酸エチル 及び酢酸（夫々２：　１　：　１）に使用直前に２％水を加えて１回展開させる ことにより室温で分離した。乾燥プレートをＢｏｕｎｉａｓｌ１９８０１　Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０６：２９１−２９５により記載されているように 染色した。澱粉及び糖はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｖ、Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、から入手した。
大腸菌の組換株によるグルコース及びマルトースの４＠酵：　ＫＯＩＩによるグ ルコース及びマルトースの発酵を試織した０図１６Ａ及びＢは結果をグラフによ り示すものであり、夫々エタノール産生及び細１ＩｌＩｌｋを表している７１５ ４向で使用した記号は、・：株ＫＯＩＩと１０％グルコース、Δ：株ＫＯＩ　１ 　（ｐＬＯｌ　１４０）と１【）％クルコース、ロ：株ＫＯＩＩ　（ｐＬ０１１ ４１１と１０％グルコース、Ｏ：株に０１１と５％マルトースの組み合わせを表 す（５％及び１０％マルトースの結果は四−であった）。
大腸菌によるマルトースの利用は好気性培養で十分に研究されているが、マルト ースからの成長及びエタノール産生はグルコースからよりも著しく時閏がかかり 、１０％マルトースからの最大理論収ｊｌ（５３，５ｇエタノール／す・ソトル ）の２５％未満、５％マルトースからの最大リットル収量（２６，８ｇエタノー ル／す・ソトル）の５０％未満である。２種の濃度のマルトースで類似の結果が 得られたので、成長及び発酵が遅いのは直接マルトース毒性に起因するとは考え られない、グルコースに比較してマルトース発酵が遅いのは、糖輸送、グルコー スリン酸化等のような他の制約によるものと考えられる。
図１６Ａ及びＢから明らかなように、α−アミラーゼ及びプルラナーゼをコード するプラスミドｐＬＯ１１４０及びｐＬＯ１１４１を大ＩＩＩ菌ＫＯ１１に７１ ０えると、成長及びグルコースからのエタノール産生速度は減少した。７２時１ ＷｌｔＩ＆の最終細胞収量及びエタノール収量は約１／３Ａｉ少した７ 糖化のな一框！！２＃−亀へ（摺：　ルリアブロス（ｐＨ６，（１）中のジャカ イモ澱粉の懸濁液を基質（７０’Ｃ）として使用して還元糖の放出として発酵の 終わり（７２時間）にＫＯｌ　１　（ｐＬＯｌ　１４０）及びＫＯＩ　１　（ｐ ＬＯＩ　１４１１により産生される合計糖化活性を測定した。両方の株で類似の 活性が観察され、３０μモル還元ＩＩ／ｍｌ培ｌＩ！＄ＩＪｌ／分であった。こ の活性の９０％以上か細胞内であったが２７０℃に加熱すると容易に放出された 。
澱粉の発酵：　糖化及びエタノール産生のための酵素が単一生物を必要とする２ 段階プロセスでＫＯＩ　１　（ｐＬ０１１４０）及びＫＯＩＩ　（ｐＬＯ１１４ １）を試験した。
１０％グルコースの存在下でのｗｔｒ＊ｓから細胞を回収し、再＠漏し、酵素源 として使用し、等筆の冷温４．５％澱粉懸濁液（ルリアブロス、ｐＨ６，０１を 加水分解した７回収した細胞の２分の１を加え、混合物を約５分間水浴中で迅速 に７０℃にｔｆａ熱した。この混合物を６０’Ｃにし、細胞の桟りを加えて加水 分解し易くした。トウモロコシ、ジャガイモ、コメ及びコムギ澱粉を試験し、い ずれも（ロ）様の結果を得た。澱粉遺伝子を欠失するＫＯＩＩを使用した対照は ３分閏以内の加熱で完全に＃同したが、澱粉懸濁液は加熱及び加水分解しても液 体のままであった。
２４時間６０℃でインキュベーション後、加水分解した澱粉を含有するルリアブ ロスを３０℃に冷却し、従来の記載（Ｂｅａ　Ｉら、１９９１．　ｉｊｒ出）に 従って接檜し。
発酵を開始した（ｐＨ６，０，１１００ｒｐ、ｔｌ柿ＢｔＪＯ，０３ｇ１ｌＮＮ 乾燥東量／１ルソトル）う全種の＃粉から類似の速度でエタノールが産生され、 鰻初の２４時間の間、０．２６〜０．２８ｇエタノール／リットルであった６０ ゜５６ｇエタノール／ｇ＃粉の理論的最大値に比較して、最終エタノール収量は ０．３５〜０．３７工タノール／ｇｉｉｌｉ粉であった。＃粉発酵の結果をＵ３ ４１７に示す。
ＫＯＩ　１　（ｐＬＯＩ　１４０）及びＫＯＩ　ｌ　（ｐＬＯＩ　１４１）のデ ータはほぼ同一であったので、ＫＯＩ　１　（ｐＬＯ１１４１）のデータのみを 図１７に示す。図１７で使用した記号は、Δ：トウモロコシ澱粉（Ｓ−４１２６ ）、ロ：ジャガイモ澱粉（Ｓ−２００４）、Ｑ：コメ澱粉（Ｓ−７２６０）　、 ム：コムギ澱粉（Ｓ−５１２７１、■：トウモロコシ澱粉＋２　ｍ　Ｍ　Ｃａ　 ＣＩ　２、・：対照としてＫＯ１１＋５％グルコースを表す。
トウモロコシ澱粉を使用したこの２ｙ＆＋１１１プロセスの梓々の段階でサンプ ルを取り出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した（図１８）。２４時間後 に、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトトリース及びそれ以上 の長さのオリゴ糖か加水分解産物として出現した。グルコース、マルトース及び マルトトリオースは発酵中（７２時間）にに０１１（ｐＬＯ１１４１３により利 用された。
１Ｍ１８は、トウモロコシ澱粉発酵の薄層クロマトグラフィー分析を示す、マル トース及びグルコースを標準として使用した。グルコース〜マルトテトロースを 夫々０１〜Ｇ４で示す、レーンは、１：標準としてのグルコース及びマルトース 、２：６０℃で２４時間糖化後のブロス、３ニア２時間発酵後のレーン２のブロ スを表す。
澱粉分解酵素はカルシウムイオンの存在により安定化されることが多い、２ｍＭ 塩化カルシウムを含有するルリアブロス中でトウモロコシ澱粉を使用して発酵実 験を行った処、やや速い発酵と高収量が得られ、夫々０．２９工タノール／リツ トル／時及び０．４０ｇエタノール／ｇ＃粉であった。酵母及び酵素を使用する 従来の澱粉４！酵に比較すると、組構大腸菌発酵は時間がかかり、産生きれる最 終エタノール濃度は低かった。単一生物でこの２段階プロセスを使用した際に得 られる澱粉からの全体エタノール収量は、酵母と付加的な酵素を使用する現行の 商用プロセスの８５％（約０．４７ｇエタノール／ｇｉｌ粉）であった。
０：　更に改善することが望ましいが、本実施例は組換大腸菌によるエタノール 産生発酵を使用して澱粉糖化に必要な酵素の一部を製造できることを立証してい る。＃素製造は極めて間車であり、曝気の必要がない、熱安定細菌酵素は大腸菌 に基づく発酵と同一のｐＨ（約６．０）で最適にＩｌ能する。これらの生物を使 用すると、トウモロコシ皮のような低価値材料中の残留澱粉を基質として使用し 、コーンステイープリカーを複合栄ｅｘとして使用することができる。このよう なプロセスは糖化に必要な酵素のコストを削減し、トウモロコシからのエタノー ル収斂を増加することができる。
ＰＤＣ活性 ＦＩＧ、５ 時間（ｈ） ｅ　番　・・　℃ 時間（ｈ） 時間（ｈ） 時間（ｈ） ＦＩＧ、１２ 時間（ｈ） ＦＩＧ、Ｉ４ 時間（ｈ） 時間（ｈ） ＦＩＧ、　１７ 、−１′も一６四−１覧 補正書の写しく諺民幻提出書（特許法第１８４条の８）特許庁長官麻　生　波膜 　平成５年９月１７日Ａ１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０１８０７ 　’２、発明の名称　組換え宿主によるエタノール生産３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国、フロリダ弓２６１１、ゲインズビル、グリンター・ホー ル・２２３ 名称　ユニバーシティ・オブ・フロリダ　（ほか１名）４、代　理　人　東京都 新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル６、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 譚」！ＩＥ朋 １、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす る第１の異１１ＤＮＡを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ以外の組換え 単細胞宿主であって、前記異種ＤＮＡを、該宿主の一次発酵産物としてのエタノ ール産生を促進するのに十分なＩｌｌリレベル発現する組換え宿主。
２、細菌、真菌類、酵母及び真核細胞からなる群から選択されている請求項１に 記載の組換え宿主。
３、グラム陰性菌からなる群から選択されている請求項２に記載の組換え宿主。
４、ＩＭ内細菌からなる群から選択されている請求項３に記載の組換え宿主。
５、Ｅｒｗｌｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＸａｎｔｈ　ｏ　ｍ　ｏ　ｎ　 ａ　ｓからなる群から選択されている請求項３に記載の組損え宿主。
６、Ｅｒｗｉ　ｎ　ｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからなる群から選択されてい る請求項５に記載の組換え宿主。
７．１９９１年３月１４日付は寄託のＡＴＣＣ６８５６４のＫｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ　ｏｘｙｔｏｃａ　、Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタノール産生特性を有 する請求項６に記載の組換え宿主。
８、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす る遺伝子を含むプラスミドであって、宿主細胞を、該宿主の一次発酵産物として のエタノール産生を促進するのに十分な機能レベルでアルコールデヒドロゲナー ゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを産生させるべく誘導し得るプラスミド。
９、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす るＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を含む請求項８に記載のプラスミ ド。
１０、更に、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを コードする前記遺伝子の発現を誘導するＩａｃプロモーターを含む請求項８に記 載のプラスミド。
１１、ｐＬＯＩ　５５５と称されている請求項８に記載の１ラスミド。
１２、請求項８に記載の１ラスミドを含む請求項１に記載の組換え宿主。
１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ以外の適当な単細胞宿主を、ピルビン 酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子 を用いて形質転換することを包含するエタノールの製造方法であって、前記宿主 が前記遺伝子を、該宿主の一次発酵産物としてのエタノールの産生を促進するの に十分な機能レベルで発現する方法。
１４、前記宿主が、細菌、真菌類、酵母及び真核細胞からなる群から選択される 請求項１３に記載の方法。
１５、前記宿主がグラム陰性菌である請求項１３に記載の方法６ １６、前記宿主が腸内細菌である請求項１３に記載の方法。
１７、前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＸａｎｔｈｏｍ ｏｎａｓからなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
１８、前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからなる群から選 択される請求項１３に記載の方法。
１９、前記組換え宿主が、１９９１年３月１４日付は寄託のＡＴＣＣ６８５６４ のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタ ノール産生特性を有する請求項１７に記載の方法。
２０．１胞増殖培地中の酸性代謝産物の蓄積を低下させる方法であって、前記細 胞を、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコード する異種遺伝子を用いて形質転換することを包含し、前記細胞が前記遺伝子を、 該宿主の一次発酵産物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能ラベ ルで発現する方法。
２１、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをそれぞ れコードする第１の異種ＤＮＡを含む組換え単細胞宿主であって、 （八）更に、該宿主が、セロビオース、マルトビオース、キシロビオース、三糖 及び長鎖多糖からなる群から選択されるオリゴ環を代謝し得るようにするタンパ ク質をコードする遺伝子を含み、 （Ｂ）前記遺伝子及び前記異種ＤＮＡを、前記オリゴ環の代謝からエタノールが 該宿主の一次発酵産物として産生されるようなレベルで発現する 組換え宿主。
２２、前記宿主が、細菌及び酵母からなる群から選択されている請求項２１に記 載の組換え宿主。
２３、前記宿主が、グラム陰性菌である請求項２２に記載の組換え宿主。
２４、前記宿主が腸内細菌である請求項２２に記載の組換え宿主。
２５、前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌＩａからなる群から選 択されている請求項２４に記載の組換え宿主。
２６．１９９１年３月１４日付は寄託のＡＴＣＣ６８５６４のＫｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタノール産生特性を有 する請求項２５に記載の組換え宿主。
２７、前記オリゴ環が、Ｃ１及びＣ１糖モノマーからなる群から選択されている 糖モノマーを含む請求項２１に記載の組換え宿主。
２８、前記オリゴ環が、グルコース及びキシロースからなる群から選択されてい る糖モノマーを含む請求項２７に記載の組換え宿主。
２９、前記オリゴ環が、ダイマー及びトリマーからなる群３０、ポリサッカラー ゼを産生ずる請求項２１に記載の組換え宿主。
３１、その発現産物が前記ポリサッカラーゼである第２の異種ＤＮＡセグメント を含む請求項３０に記載の組換え宿主。
３２、前記ポリサッカラーゼが、セルロース分解酵素、キシラン分解酵素及び澱 粉分解酵素からなる群から選択されている請求項３０に記載の組換え宿主。
３３、前記ポリサッカラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、 β−グルコシダーゼ、エンド−１゜４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ 、α−グルクロニダーゼ、α−し一アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラ ーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル コアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシ ダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ及びペクテートリアーゼからなる 群から選択されている請求項３１に記載の組換え宿主。
３４、前記ポリサッカラーゼが、ｃｅ　ＩＤ、ｘｙｎＺ、ｘｙｌＢ、α−アミラ ーゼ遺伝子及びプルラナーゼ遺伝子からなる群から選択されている遺伝子の発現 産物である請求項３３に記載の組換え宿主。
３５、前記ｃｅ　ＩＤ及びｘｙｎＺ遺伝子がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒ ｍｏｃｅｌｌｕｍから誘導されており、前記ｘｙｌＢ遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ 　ｆｉｂｒｉｓ。
１ｖｅｎｓから誘導されており、前記α−アミラーゼ遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ 　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌ」ｓから誘導されており、前記プルラナ ーゼ遺伝子がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉから誘導され ている請求項３４に記載の組換え宿主。
３６、前記ポリサッカラーゼが、Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　ｕ　Ｉ　ｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍ ｉのセルラーゼ遺伝子の発現産物を含み、前記宿主が前記ポリサッカラーゼの少 なくとも一部を分泌する請求項３２に記載の組１負え宿主。
３７、その発現産物が、グルコースを該宿主中に輸送することに関与するタンパ ク質である第３の異種ＤＮＡセグメントを含む請求項３１から３５のいずれか一 項に記載の組換え宿主。
３８、前記ポリサッカラーゼが前記宿主によって少なくとも一部は分泌される請 求項３１から３５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
３つ、前記ポリサッカラーゼが該宿主中に実質的に蓄積される請求項３１から３ ５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
４０、前記ポリサッカラーゼが熱安定性酵素である請求項３９に記載の組換え宿 主。
４１、その発現産物が、該宿主によって少なくとも一部は分泌される別のポリサ ッカラーゼである別の異種ＤＮＡセグメントを更に含む請求項３９に記載の組換 え宿主。
４２、前記別のポリサッカラーゼが、Ｃｅｌｌｕｌｏｍ。
ｎａｓ　ｆｉｍｉのセルラーゼ遺伝子の発現産物を含む請求項４１に記載の組換 え宿主。
４３、更にポリサッカラーゼを産生する請求項１に記載の組換え宿主。
４４、更に、その発現産物が前記ポリサッカラーゼである第２の異種ＤＮＡセグ メントを含む請求項４３に記載の組換え宿主。
・１５．前記ポリサッカラーゼが、セルロース分解酵素、キシラン分解酵素、ヘ ミセルロース分解酵素及び澱粉分解酵素からなる群から選択されている請求項４ ４に記載の組換え宿主。
４６、前記ポリサッカラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、 β−グルコシダーゼ、エンド−１゜４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ 、α−グルクロニダーゼ、α−し一アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラ ーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル コアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナ ーゼ、ペクチンヒドロラーゼ及びベクテートリアーゼからなる群から選択されて いる請求項４５に記載の組換え宿主。
４７、前記ポリサッカラーゼが、ｃｅ　ＩＤ、ｘｙｎＺ、ｘｙＩＢ、α−アミラ ーゼ遺伝子及びプルラナーゼ遺伝子からなる群から選択されている！！伝子の発 現産物である請求項４６に記載の組換え宿主。
４８、前記ｃｅ　ＩＤ、ｘｙｎＺ及びｘｙｌＢ遺伝子がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ 　ｔｂｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍから誘導されており、前記α−アミラーゼ遺伝子が Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導されており 、前記プルラナーゼ遺伝子がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉ ｉから誘導されている請求項４７に記載の組換え宿主。
４９、前記ポリサッカラーゼが該宿主によって少なくとも一部は分泌される請求 項４６に記載の組換え宿主。
５０、前記ポリサッカラーゼが該宿主中に実質的に蓄積される請求項４６に記載 の組換え宿主。
５１、オリゴ糖原料を処理する方法であって、（Ａ）出発オリゴ環を含む原料を 提供するステップ、及び（Ｂ）前記原料を、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピ ルビン酸デカルボキシラーゼをそれぞれコードする第１の異種ＤＮＡを含む組換 え単細胞宿主によって生成されており、前記宿主が、 （Ａ）該宿主が、セロビオース、マルトビオース、キシロビオース、三糖及び長 鎖多糖からなる群から選択される出発オリゴ環を代謝し得るようにする前記酵素 をコードする遺伝子を更に含み、且つ、 （Ｂ）前記遺伝子及び前記異種ＤＮＡを、前記オリゴ環の代謝からエタノールが 該宿主の一次発酵産物として産生されるようなレベルで発現する酵素と、前記出 発オリゴ環が前記酵素の作用を受けるよう接触させるステップ を包含する方法。
５２、前記出発オリゴ環がエタノールに発酵される請求項５１に記載の方法。
５３、前記出発オリゴ環が三糖または三糖を含む請求項５２に記載の方法。
５４、前記宿主が、細菌及び酵母からなる群から選択される請求項５３に記載の 方法。
５５、前記酵素がポリサッカラーゼであり、前記出発オリゴ環が、前記ポリサッ カラーゼによってより単純なオリゴ環及び／または糖モノマーに変換される請求 項５１に記載の方法。
５６、前記出発オリゴ環が三糖または三糖を含む請求項５５に記載の方法。
５７、前記出発オリゴ環が、セルロース、ヘミセルロース及び澱粉からなる群か ら選択される不溶性オリゴ環である請求項５５に記載の方法。
５８、前記組換え宿主が請求項３０から３６のいずれか一項に記載のものである 請求項５７に記載の方法。
５９、前記組換え宿主が請求項３０から３６のいずれか一項に記載のものである 請求項５５に記載の方法。
６０、前記ステップＢが、前記細胞を加熱して溶解し、前記ポリサッカラーゼの 放出を誘導することを含む請求項５５に記載の方法。
６１．前記出発オリゴ糖及び／または前記より単純なオリゴ糖がエタノールに発 酵される請求項６０に記載の方法。
６２、組換え宿主中でａｄｈＢ遺伝子を過剰発現させることからなる、組換え宿 主における機能タンパク質の産生を増強する方法。
６３、前記アルコールデヒドロゲナーゼコーディングＤＮＡが、Ｚｙｍｏｍｏｎ ａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓから誘導されたａｄｈＢ遺伝子である請求項６２に記載の 方法。
６４、オリゴ糖含有バイオマスからエタノールを製造する方法であって、 Ａ、第１反応器において、前記バイオマスをポリサッカラーゼと温度約５０℃〜 約６０℃及びｐＨ約４，５〜約５゜０で接触させ、該バイオマス中のオリゴ糖を より単純なオリゴ糖及び／または単糖に分解するステップ、Ｂ、前記第１反応器 から、前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖を含む糖溶液を製造するステッ プ、ｃ、ｉ配糖溶液を、前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖をエタノール に発酵し得る組換え宿主微生物を含む発酵器内に導入するステップ、及び り、前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖をエタノールに、温度約３０℃〜 約３５℃及びｐ）（約６．０で発酵させるステップ を包含する方法。
６５、前記発酵器から第１の流れを取り出し、それを、前記第１反応器から取り 出した前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖を含む第２の流れを冷却するた めに使用する請求項６４に記載の方法。
６６、前記第２の流れを冷却した後に、前記第１の流れを前記第１反応器に導入 する請求項６５に記載の方法。
６７、マルトビオース、キシロビオース、三糖及び長鎖多糖を代謝する請求項２ １に記載の組換え宿主。
６８、前記宿主が、マルトビオース、キシロビオース、三糖及び長鎖多糖を代謝 する請求項５１に記載の方法。
６９、前記宿主が、その発現産物がグルコースを該宿主中に輸送することに関与 するタンパク質である第３の異種ＤＮＡセグメントを含む請求項５１に記載の方 法。
７０、前記宿主が、その発現産物が前記ポリサッカラーゼである第２の異種ＤＮ Ａセグメントを含む請求項５５に記載の方法。
７１、前記宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉでない請求項２１に記載の 組換え宿主。
７２、前記宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉでない請求項５１に記載の 方法。
国際調査報告 誇瞠劇啼−一・−Ａ−１軸１１ｅＩＩ抛Φ、ｐｃＴ／口諺１２／口１−ロフー特 −−−〜−−−−−ベゴル劇１層１詩７ＩｆＩＩ＠ｆｌＩ＃ＩＩ＃１１１＄　Ｎ ｅ、　ｐｅｒ〜１１１ｍ１Ｍ？フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｐ　７１０６　７ ４３２−４Ｂ ／／Ｃｌ２Ｍ　１１００　Ｄ　９０５０−４Ｂ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、　ＥＳ、　Ｆ、Ｒ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３ ，ＤＥ。
ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＲＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　イングラム、ロニー・オーアメリカ合衆国、フロリダ・３２６ ０６、ゲインズビル、ノース・ウェスト・フイフテイセブンス・テラス・３１３ ２ （７２）発明者　ビール、ディピッド・ニスアメリカ合衆国、フロリダ・３２６ ０１、ゲインズビル、サウス・ウェスト・トウニンティース・ブレイス・１１０ １ ＦＩ （７２）発明者　パーチャート、ガーハード・エフ・エイチアメリカ合衆国、フ ロリダ・３２６０５、ゲインズビル、ノース・ウェスト・トウニンティサード・ ブールバード・２７０１、アパートメント・７８ （７２）発明者　ギマレイアス、ワルター・ブイアメリカ合衆国、フロリダ・３ ２６１１、ゲインズビル、グリンター・ホール・２２３（７２）発明者　オオタ 、カズヨシ アメリカ合衆国、フロリダ・３２６１１、ゲインズビル、グリンター・ホール・ ２２３（７２）発明者　ウッド、ブレンド・イーアメリカ合衆国、フロリダ・３ ２６０１、ゲインズビル、ノース・ウェスト・１３・アベニュー・３０１、アパ ートメント・５ （７２）発明者　シャンムガム、キールネイサム・ティーアメリカ合衆国、フロ リダ・３２６０５、ゲインズビル、ノース・ウェスト・フオーテイセブンス・ブ レイス・３２１５ （７２）発明者　フオウラー、ディピッド・イーアメリカ合衆国、フロリダ・３ ２６０８、ゲインズビル、サウス・ウェスト・フイフテイシックスス・レイン・ １７０８ （７２）発明者　へンーバツサト、アリーアメリカ合衆国、フロリダ・３２６０ ６、ゲインズビル、ノース・ウェスト　シックステイセブンス・ブレイス・１９ ０１

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. １．アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす る第１の異種ＤＮＡを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ以外の組換え宿 主であって、前記異種ＤＮＡを、該宿主の一次発酵産物としてのエタノール産生 を促進するのに十分な機能レベルで発現する組換え宿主。
  2. ２．細菌、真菌類、酵母及び真核細胞からなる群から選択されている請求項１に 記載の組換え宿主。
  3. ３．グラム陰性菌からなる群から選択されている請求項２に記載の組換え宿主。
  4. ４．腸内細菌からなる群から選択されている請求項３に記載の組換え宿主。
  5. ５．Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓからな る群から選択されている請求項３に記載の組換え宿主。
  6. ６．Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからなる群から選択されている請 求項５に記載の組換え宿主。
  7. ７．１９９１年３月１４日付け寄託のＡＴＣＣ６８５６４のＫｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタノール産生特性を有す る請求項６に記載の組換え宿主。
  8. ８．アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす る遺伝子を含むプラスミドであって、宿主細胞を、該宿主の一次発酵産物として のエタノール産生を促進するのに十分な機能レベルでアルコールデヒドロゲナー ゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを産生させるべく誘導し得るプラスミド。
  9. ９．アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす るＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子を含む請求項８に記載のプラスミ ド。
  10. １０．更に、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを コードする前記遺伝子の発現を誘導するｌａｃプロモーターを含む請求項８に記 載のプラスミド。
  11. １１．ｐＬＯＩ５５５と称されている請求項８に記載のプラスミド。
  12. １２．請求項８に記載のプラスミドを含む請求項１に記載の組換え宿主。
  13. １３．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ以外の適当な宿主を、ピルビン酸デカ ルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子を用い て形質転換することを包含するエタノールの製造方法であって、前記宿主が前記 遺伝子を、該宿主の一次発酵産物としてのエタノールの産生を促進するのに十分 な機能レベルで発現する方法。
  14. １４．前記宿主が、細菌、真菌類、酵母及び真核細胞からなる群から選択される 請求項１３に記載の方法。
  15. １５．前記宿主が、グラム陰性菌からなる群から選択される請求項１３に記載の 方法。
  16. １６．前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＸａｎｔｈｏｍ ｏｎａｓからなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
  17. １７．前記宿主が、腸内細菌からなる群から選択される請求項１３に記載の方法 。
  18. １８．前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからなる群から選 択される請求項１３に記載の方法。
  19. １９．前記組換え宿主が、１９９１年３月１４日付け寄託のＡＴＣＣ６８５６４ のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタ ノール産生特性を有する請求項１７に記載の方法。
  20. ２０．細胞増殖培地中の酸性代謝産物の蓄積を低下させる方法であって、前記細 胞を、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコード する異種遺伝子を用いて形質転換することを包含し、前記細胞が前記遺伝子を、 該宿主の一次発酵産物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能ラベ ルで発現する方法。
  21. ２１．アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをそれぞ れコードする第１の異種ＤＮＡを含む組換え宿主であって、 （Ａ）更に、該宿主がオリゴ糖を輸送及び代謝し得るようにするタンパク質をコ ードする遺伝子を含み、（Ｂ）前記遺伝子及び前記異趣ＤＮＡを、前記オリゴ糖 の代謝からエタノールが該宿主の一次発酵産物として産生されるようなレベルで 発現する 組換え宿主。
  22. ２２．前記宿主が、細菌及び酵母からなる群から選択されている請求項２１に記 載の組換え宿主。
  23. ２３．前記宿主が、グラム陰性菌である請求項２３に記載の組換え宿主。
  24. ２４．前記宿主が、腸内細菌からなる群から選択されている請求項２２に記載の 組換え宿主。
  25. ２５．前記宿主が、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＫｌｅｂｓｉｅ１１ａからなる群から選 択されている請求項２４に記載の組換え宿主。
  26. ２６．１９９１年３月１４日付け寄託のＡＴＣＣ６８５６４のＫｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　Ｍ５Ａ１（ｐＬＯＩ５５５）のエタノール産生特性を有 する請求項２５に記載の組換え宿主。
  27. ２７．前記オリゴ糖が、Ｃ５及びＣ６糖モノマーからなる群から選択されている 糖モノマーを含む請求項２１に記載の組換え宿主。
  28. ２８．前記オリゴ糖が、グルコース及びキシロースからなる群から選択されてい る糖モノマーを含む請求項２７に記載の組換え宿主。
  29. ２９．前記オリゴ糖が、ダイマー及びトリマーからなる群から選択されている請 求項２８に記載の組換え宿主。
  30. ３０．更にポリサッカラーゼを産生する請求項２１に記載の組換え宿主。
  31. ３１．更に、その発現産物が前記ポリサッカラーゼである第２の異種ＤＮＡセグ メントを含む請求項３０に記載の組換え宿主。
  32. ３２．前記ポリサッカラーゼが、セルロース分解酵素、キシラン分解酸素及び澱 粉分解酵素からなる群から選択されている請求項３１に記載の組換え宿主。
  33. ３３．前記ポリサッカラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、 β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ 、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラ ーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル コアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシ ダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ及びペクテートリアーゼからなる 群から選択されている請求項３２に記載の組換え宿主。
  34. ３４．前記ポリサッカラーゼが、ｃｅｌＤ、ｘｙｎＺ、ｘｙｌＢ、α−アミラー ゼ遺伝子及びプルラナーゼ遺伝子からなる群から選択されている遺伝子の発現産 物である請求項３３に記載の組換え宿主。
  35. ３５．前記ｃｅｌＤ及びｘｙｎＺ遺伝子がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍ ｏｃｅｌｌｕｍから誘導されており、前記ｘｙｌＢ遺伝子がＢ．ｆｉｂｒｉｓｏ ｌｖｅｎｓから誘導されており、前記α−アミラーゼ遺伝子がＢ．ｓｔｅａｒｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導されており、前記プルラナーゼ遺伝子がＴ． ｂｒｏｃｋｉｉから誘導されている請求項３４に記載の組換え宿主。
  36. ３６．前記ポリサッカラーゼが、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉのセルラ ーゼ遺伝子の発現産物を含み、前記宿主が前記ポリサッカラーゼの少なくとも一 部を分泌する請求項３２に記載の組換え宿主。
  37. ３７．更に、その発現産物が、単糖及び／またはオリゴ糖を該組換え宿主中に輸 送することに関与するタンパク質である別の異種ＤＮＡセグメントを含む請求項 ３１から３５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
  38. ３８．前記ポリサッカラーゼが前記宿主によって少なくとも一部は分泌される請 求項３１から３５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
  39. ３９．前記ポリサッカラーゼが該宿主中に実質的に蓄積される請求項３１から３ ５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
  40. ４０．前記ポリサッカラーゼが熱安定性酵素である請求項３９に記載の組換え宿 主。
  41. ４１．その発現産物が、該宿主によって少なくとも一部は分泌される別のポリサ ッカラーゼである別の異種ＤＮＡセグメントを更に含む請求項３９に記載の組換 え宿主。
  42. ４２．前記別のポリサッカラーゼが、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉのセ ルラーゼ遺伝子の発現産物を含む請求項４１に記載の組換え宿主。
  43. ４３．更にポリサッカラーゼを産生する請求項１に記載の組換え宿主。
  44. ４４．更に、その発現産物が前記ポリサッカラーゼである第２の異種ＤＮＡセグ メントを含む請求項４３に記載の組換え宿主。
  45. ４５．前記ポリサッカラーゼが、セルロース分解酵素、キシラン分解酸素、ヘミ セルロース分解酵素及び澱粉分解酵素からなる群から選択されている請求項４４ に記載の組換え宿主。
  46. ４６．前記ポリサッカラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、 β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ 、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラ ーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グル コアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナ ーゼ、ペクチンヒドロラーゼ及びペクテートリアーゼからなる群から選択されて いる請求項４５に記載の組換え宿主。
  47. ４７．前記ポリサッカラーゼが、ｃｅｌＤ、ｘｙｎＺ、ｘｙｌＢ、α−アミラー ゼ遺伝子及びプルラナーゼ遺伝子からなる群から選択されている遺伝子の発現産 物である請求項４６に記載の組換え宿主。
  48. ４８．前記ｃｅｌＤ、ｘｙｎＺ及びｘｙｌＢ遺伝子がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　 ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍから誘導されており、前記α−アミラーゼ遺伝子がＢ ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導されており、前記プルラナー ゼ遺伝子がＴ．ｂｒｏｃｋｉｉから誘導されている請求項４７に記載の組換え宿 主。
  49. ４９．前記ポリサッカラーゼが該宿主によって少なくとも一部は分泌される請求 項４６に記載の組換え宿主。
  50. ５０．前記ポリサッカラーゼが該宿主中に実質的に蓄積される請求項４６に記載 の組換え宿主。
  51. ５１．オリゴ糖原料を処理する方法であって、Ａ．出発オリゴ糖を含む原料を提 供するステップ、及びＢ．前記原料を、請求項２１に記載の組換え宿主の細胞に よって生成された酵素と、前記出発オリゴ糖が該酵素の作用を受けるよう接触さ せるステップ からなる方法。
  52. ５２．前記出発オリゴ糖がエタノールに発酵される請求項５１に記載の方法。
  53. ５３．前記出発オリゴ糖が二糖または三糖を含む請求項５２に記載の方法。
  54. ５４．前記組換え宿主が請求項２２から２６のいずれか一項に記載のものである 請求項５３に記載の方法。
  55. ５５．前記酵素がポリサッカラーゼであり、前記出発オリゴ糖が、前記ポリサッ カラーゼによってより単純なオリゴ糖及び／または糖モノマーに変換される請求 項５１に記載の方法。
  56. ５６．前記出発オリゴ糖が二糖または三糖を含む請求項５５に記載の方法。
  57. ５７．前記出発オリゴ糖が、セルロース、ヘミセルロース及び澱粉からなる群か ら選択される不溶性オリゴ糖である請求項５５に記載の方法。
  58. ５８．前記組換え宿主が請求項３０から３６のいずれか一項に記載のものである 請求項５７に記載の方法。
  59. ５９．前記組換え宿主が請求項３０かち３６のいずれか一項に記載のものである 請求項５５に記載の方法。
  60. ６０．前記ステップＢが、前記細胞を加熱して溶解し、前記ポリサッカラーゼの 放出を誘導することを含む請求項５５に記載の方法。
  61. ６１．前記出発オリゴ糖及び／または前記より単純なオリゴ糖がエタノールに発 酵される請求項６０に記載の方法。
  62. ６２．組換え宿主中でａｄｈＢ遺伝子を過剰発現させることからなる、組換え宿 主における機能タンパク質の産生を増強する方法。
  63. ６３．前記ａｄｈＢ遺伝子がＺ．ｍｏｂｉｌｉｓから誘導される請求項６２に記 載の方法。
  64. ６４．オリゴ糖含有バイオマスからエタノールを製造する方法であって、 Ａ．第１反応器において、前記バイオマスをポリサッカラーゼと、温度約５０℃ 〜約６０℃及びｐＨ約４．５〜約５．０で接触させ、該バイオマス中のオリゴ糖 をより単純なオリゴ糖及び／または単糖に分解するステップ、Ｂ．前記第１反応 器から、前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖を含む糖溶液を得るステップ 、Ｃ．前記糖溶液を、前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖をエタノールに 発酵し得る組換え宿主微生物を含む発酵器内に導入するステップ、及び Ｄ．前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖をエタノールに、温度約３０℃〜 約３５℃及びｐＨ約６．０で発酵させるステップ を包含する方法。
  65. ６５．前記発酵器から第１の流れを取り出し、それを、前記第１反応器から取り 出した前記より単純なオリゴ糖及び／または単糖を含む第２の流れを冷却するた めに使用する請求項６４に記載の方法。
  66. ６６．前記第２の流れを冷却した後に、前記第１の流れを前記第１反応器に導入 する請求項６５に記載の方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009526531A (ja) * 2006-02-13 2009-07-23 ロンザ・アーゲー 光学活性キラルアミンの調製方法
JP2010524473A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 マスコマ コーポレイション リグノセルロースバイオマスの熱化学的前処理と精砕の組合せ
US8715977B2 (en) 2009-08-28 2014-05-06 Kyoto University Ethanol production from ocean biomass

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5482846A (en) * 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5270175A (en) * 1991-07-12 1993-12-14 Dna Plant Technology Corporation Methods and compositions for producing metabolic products for algae
US5677154A (en) * 1995-06-07 1997-10-14 Ingram-Howell, L.L.C. Production of ethanol from biomass
US5932456A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Ingram-Howell, L.L.C. Production of ethanol and other fermentation products from biomass
WO1997007228A1 (fr) * 1995-08-21 1997-02-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de reaction enzymatique immobilisee
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
AU6875298A (en) * 1997-04-07 1998-10-30 University Of Florida Research Foundation, Inc. Development of high-ethanol resistant (escherichia coli)
US6102690A (en) * 1997-04-07 2000-08-15 Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant organisms capable of fermenting cellobiose
US6280986B1 (en) 1997-12-01 2001-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Stabilization of pet operon plasmids and ethanol production in bacterial strains lacking lactate dehydrogenase and pyruvate formate lyase activities
FI980551A (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia
JP4615126B2 (ja) 1999-03-11 2011-01-19 ジーケム インコーポレイテッド エタノール生産方法
US7074603B2 (en) * 1999-03-11 2006-07-11 Zeachem, Inc. Process for producing ethanol from corn dry milling
AU783260B2 (en) * 1999-05-26 2005-10-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant hosts suitable for simultaneous saccharification and fermentation
JP4927297B2 (ja) 2000-06-16 2012-05-09 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 組換え型コリネ型細菌を用いるエタノールの製造方法
KR100643817B1 (ko) * 2000-06-26 2006-11-10 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨. 당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물
US7115385B2 (en) * 2001-08-02 2006-10-03 North Carolina State University Media and methods for cultivation of microorganisms
US20030203454A1 (en) * 2002-02-08 2003-10-30 Chotani Gopal K. Methods for producing end-products from carbon substrates
AU2003217338A1 (en) * 2002-02-08 2003-09-02 Genencor International, Inc. Methods for producing ethanol from carbon substrates
ES2382333T3 (es) * 2003-11-21 2012-06-07 Danisco Us Inc. Expresión de enzimas hidrolizantes de almidón granular en trichoderma y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidón granular
US7601865B2 (en) * 2004-01-29 2009-10-13 Zeachem, Inc. Recovery of organic acids
MXPA06013599A (es) * 2004-05-27 2007-03-15 Genencor Int Expresion heterologa de una alfa amilasa estable en condiciones acidas de aspergillus kawachi y aplicaciones en la hidrolisis del almidon granular.
EP1749092A2 (en) * 2004-05-27 2007-02-07 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
US7708214B2 (en) 2005-08-24 2010-05-04 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US9297028B2 (en) * 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
WO2008100251A1 (en) 2007-02-13 2008-08-21 Ls9, Inc. Modified microorganism uses therefor
US8828704B2 (en) 2006-05-02 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8962298B2 (en) * 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
MX2008014603A (es) 2006-05-19 2009-02-06 Ls9 Inc Produccion de acidos grasos y derivados de los mismos.
WO2008119082A2 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US7968318B2 (en) * 2006-06-06 2011-06-28 Genencor International, Inc. Process for conversion of granular starch to ethanol
CA2658483A1 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Xyleco, Inc. Conversion systems for biomass
US7815876B2 (en) * 2006-11-03 2010-10-19 Olson David A Reactor pump for catalyzed hydrolytic splitting of cellulose
US7815741B2 (en) 2006-11-03 2010-10-19 Olson David A Reactor pump for catalyzed hydrolytic splitting of cellulose
WO2008133742A2 (en) * 2006-12-06 2008-11-06 Musc Foundation For Research Development Apparatus and methods for the production of ethanol, hydrogen and electricity
BRPI0806417A2 (pt) * 2007-02-09 2011-09-06 Zeachem Inc métodos de energia eficiente para produzir produtos
WO2008112282A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Danisco Us, Inc., Genencor Division Production of ethanol from barley and ddgs containing reduced beta-glucan and phytic acid
US8426174B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
US8426173B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 1-butanol
CL2008002961A1 (es) * 2007-10-04 2009-05-08 Bio Arch Lab Inc Metodo para convertir un monosacarido u oligosacarido apropiado en un quimico generico que comprende contactar dichos moleculas con un sistema microbiano que comprende uno o mas genes que codifican y expresan una via de biosintesis.
EP2201108B1 (en) * 2007-10-18 2014-10-08 Danisco US Inc. Enzyme blends for fermentation
WO2009055454A2 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 University Of Florida Research Foundation, Inc. Xylan-utilization regulon for efficient bioprocessing of hemicellulose and uses thereof
CN101970665A (zh) * 2008-01-28 2011-02-09 生物结构实验室公司 分离的醇脱氢酶酶类及其用途
WO2009100434A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Zeachem Inc. Indirect production of butanol and hexanol
EP2265720B1 (en) 2008-03-11 2017-06-21 Danisco US Inc. Use of glucoamylase and buttiauxella phytase during saccharification
WO2009134964A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Danisco Us Inc. Enhanced fermentation process using molasses
US8143444B2 (en) * 2008-05-07 2012-03-27 Zeachem, Inc. Recovery of organic acids
BRPI0912690A2 (pt) 2008-05-16 2012-04-17 Ls9 Inc método para produzir um aldeìdo, microorganismo geneticamente modificado, aldeìdo, método para produzir um álcool graxo, ácido nucleico isolado e polipeptìdeo isolado
AU2009276720A1 (en) * 2008-07-28 2010-02-04 Qteros, Inc. Methods and compositions for improving the production of products in microorganisms
EP2329029B1 (en) * 2008-09-24 2016-06-08 Sanofi Pasteur Biologics, LLC Methods and compositions for increasing toxin production
KR101840354B1 (ko) 2008-10-07 2018-03-20 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방족 알데히드를 생산하기 위한 방법과 조성물들
KR101636403B1 (ko) 2008-10-28 2016-07-05 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방족 알코올들을 생산하기 위한 방법들과 조성물들
US20120107892A1 (en) * 2008-12-22 2012-05-03 Frank Agbogbo Production of ethanol from lignocellulosic biomass
ES2730713T3 (es) 2008-12-23 2019-11-12 Reg Life Sciences Llc Métodos y composiciones relacionados con enzimas tioesterasas
CN111808892A (zh) 2009-04-27 2020-10-23 基因组股份公司 脂肪酸酯的产生
ES2707747T3 (es) 2009-09-25 2019-04-04 Reg Life Sciences Llc Producción de derivados de ácidos grasos
US20110137088A1 (en) * 2009-12-03 2011-06-09 Bp Corporation North America Inc. Methods and Apparatuses for Producing Renewable Materials From Inhibiting Compounds
US8617856B2 (en) * 2010-01-07 2013-12-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Fatty acid-producing hosts
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
US20110250663A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Ls9, Inc. Methods and compositions related to fatty alcohol biosynthetic enzymes
US20120172281A1 (en) 2010-07-15 2012-07-05 Jeffrey John Scheibel Detergent compositions comprising microbially produced fatty alcohols and derivatives thereof
CN102094046A (zh) * 2010-11-26 2011-06-15 黄虹寓 利用多酶体系细胞培养液制造生物质燃料乙醇的方法
US20140215904A1 (en) 2011-03-30 2014-08-07 Ls9, Inc. Compositions comprising and methods for producing beta-hydroxy fatty acid esters
ES2808287T3 (es) 2011-04-01 2021-02-26 Genomatica Inc Métodos y composiciones para la producción mejorada de ácidos grasos y derivados de los mismos
JP2014516581A (ja) 2011-06-17 2014-07-17 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー バイオ燃料製造工程からの共産物及びその製造方法
WO2013015770A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Myriant Corporation Fermentation of glycerol to organic acids
US20150125933A1 (en) 2011-08-03 2015-05-07 Ls9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof having improved aliphatic chain length and saturation characteristics
US9580729B2 (en) * 2012-03-26 2017-02-28 Kansai Chemical Engineering Co., Ltd. Method for producing ethanol
MY181688A (en) 2012-04-02 2021-01-01 Genomatica Inc Improved production of fatty acid derivatives
KR101831331B1 (ko) 2012-04-02 2018-02-23 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 Ｃａｒ 효소들 및 지방족 알코올들의 개선된 생산
CN104379735A (zh) 2012-04-13 2015-02-25 Reg生命科学有限责任公司 烷醇酰胺及酰胺胺的微生物生产及其用途
US20160002681A1 (en) 2012-12-12 2016-01-07 REG Life Sciences, LLC Acp-mediated production of fatty acid derivatives
EP3103867B1 (en) 2013-01-16 2018-05-16 REG Life Sciences, LLC Acyl-acp reductase with improved properties
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
EP2984490B1 (en) 2013-06-14 2020-05-20 Genomatica, Inc. Methods of producing omega-hydroxylated fatty acid derivatives
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
MX2016013240A (es) 2014-04-10 2017-05-03 Reg Life Sciences Llc Rutas semi-sinteticas para compuestos organicos.
ES2803560T3 (es) 2014-06-16 2021-01-27 Genomatica Inc Polipéptidos de fusión relacionados con omega-hidroxilasa con propiedades mejoradas
EP3137614B1 (en) 2014-07-18 2018-09-19 REG Life Sciences, LLC Microbial production of 1,3 diols
BR112017013025A2 (pt) 2014-12-19 2018-01-02 Dupont Nutrition Biosci Aps recuperação de óleo da lama de palma
EP3328997B1 (en) 2015-07-27 2020-12-23 Institut National Des Sciences Appliquees New polypeptide having ferredoxin-nadp+ reductase activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof
WO2017101987A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
MX2019007335A (es) 2016-12-21 2019-09-09 Dupont Nutrition Biosci Aps Métodos para usar serina proteasas termoestables.
CN110603323A (zh) 2017-03-15 2019-12-20 杜邦营养生物科学有限公司 使用古细菌丝氨酸蛋白酶的方法
US10364417B2 (en) * 2017-08-15 2019-07-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Increased alcohol tolerance using the PntAB gene
CN113025506B (zh) * 2019-12-24 2022-12-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用
WO2023062542A2 (en) 2021-10-11 2023-04-20 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Recombinant yeast cell having increased pyruvate decarboxylase activity

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4493893A (en) * 1981-01-15 1985-01-15 Cpc International Inc. Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into Escherichia coli and Bacillus subtilis
US4839286A (en) * 1983-10-07 1989-06-13 Biotechnica International, Inc. Method of biosynthesis and cells therefor
US4612287A (en) * 1985-05-23 1986-09-16 Cpc International Inc. Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids
US5000000A (en) * 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
ES2132116T3 (es) * 1990-12-07 1999-08-16 Univ Florida Celulas recombinantes que expresan altamente genes heterologos cromosomicamente integrados.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009526531A (ja) * 2006-02-13 2009-07-23 ロンザ・アーゲー 光学活性キラルアミンの調製方法
JP2013188217A (ja) * 2006-02-13 2013-09-26 Lonza Ag 光学活性キラルアミンの調製方法
US9074228B2 (en) 2006-02-13 2015-07-07 Lonza Ag Process for the preparation of optically active chiral amines
JP2010524473A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 マスコマ コーポレイション リグノセルロースバイオマスの熱化学的前処理と精砕の組合せ
US8715977B2 (en) 2009-08-28 2014-05-06 Kyoto University Ethanol production from ocean biomass

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