JPS60228421A - モノクロ−ナル抗ヒトＩｇＧ抗体およびその製造法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗ヒトＩｇＧ抗体およびその製造法Info
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- JPS60228421A JPS60228421A JP59087190A JP8719084A JPS60228421A JP S60228421 A JPS60228421 A JP S60228421A JP 59087190 A JP59087190 A JP 59087190A JP 8719084 A JP8719084 A JP 8719084A JP S60228421 A JPS60228421 A JP S60228421A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
イ１発明の目的
産業上の利用分野
抗原抗体反応を基盤とするアレルキー疾患は、その原因
物質（アレルゲン）の探索特定により、病状の診断分類
、治療方針の方向づけが可能となってきた。本発明にお
けるモノクローナル抗体は、外因性気管支喘息、アトピ
ー性皮膚炎、免疫複合体疾患などのアレルギー疾患にお
けるアレルゲンの特定用診断薬として、またアレルギー
疾患の発病機作解明に利用することができる。
物質（アレルゲン）の探索特定により、病状の診断分類
、治療方針の方向づけが可能となってきた。本発明にお
けるモノクローナル抗体は、外因性気管支喘息、アトピ
ー性皮膚炎、免疫複合体疾患などのアレルギー疾患にお
けるアレルゲンの特定用診断薬として、またアレルギー
疾患の発病機作解明に利用することができる。
従来技術
ヒト血清中のアレルゲンに対する免疫グロブリンＧ（以
下ＩｇＧという）抗体を定量することの重要性が、こへ
数十年の間に認識きれるようになってきた［Ｊ、Ｗ、ヤ
ングインゲル（Ｙｏｕｎｇｉｎｇｅｒ ）ら、Ｊ、Ｃ１
１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 ５２ 、 １２６８ （１９７
３） ；Ａ、にツボツカ（５ｏｂｏｔｋａ ）ら、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １１７８４（１９７６）］。最近
、ヒト血清中のアレルゲンに特異性を有するＩｇＥ抗体
の測定に、ラジオアレルコ′ソルベントテスト（ｒａｄ
ｉｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔしｅｓｔ） （以下
ＲＡＳＴ法という）が利用されるようになってきている
［Ｎ、Ｆ、アドキンソン・ジュニア−（Ａｄｋｉｎｓｏ
ｎ、 Ｊｒ、 ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，ｐ、 ５９０−６０２（１９７
６）］。しかし、ヒトアレルゲン特異性ＩｇＧ抗体の測
定へのＲＡＳＴ法の応用は、一部の報告［清水ら、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、↓亙、３１７
（１９７Ｂ）］を除いて成功していない。不成功の主な
理由は、ＲＡＳＴ法では正常血清中の非特異的抗体結合
レベルが、特異抗体の結合レベル以上に高いことであっ
たためと推定される。ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
）らは、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の１２５１−プロティンＡを
用いて非特異的結合を低下せしめることに成功した［
Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ上主１．１０７３（１９７９）コ
。
下ＩｇＧという）抗体を定量することの重要性が、こへ
数十年の間に認識きれるようになってきた［Ｊ、Ｗ、ヤ
ングインゲル（Ｙｏｕｎｇｉｎｇｅｒ ）ら、Ｊ、Ｃ１
１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 ５２ 、 １２６８ （１９７
３） ；Ａ、にツボツカ（５ｏｂｏｔｋａ ）ら、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １１７８４（１９７６）］。最近
、ヒト血清中のアレルゲンに特異性を有するＩｇＥ抗体
の測定に、ラジオアレルコ′ソルベントテスト（ｒａｄ
ｉｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔしｅｓｔ） （以下
ＲＡＳＴ法という）が利用されるようになってきている
［Ｎ、Ｆ、アドキンソン・ジュニア−（Ａｄｋｉｎｓｏ
ｎ、 Ｊｒ、 ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，ｐ、 ５９０−６０２（１９７
６）］。しかし、ヒトアレルゲン特異性ＩｇＧ抗体の測
定へのＲＡＳＴ法の応用は、一部の報告［清水ら、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、↓亙、３１７
（１９７Ｂ）］を除いて成功していない。不成功の主な
理由は、ＲＡＳＴ法では正常血清中の非特異的抗体結合
レベルが、特異抗体の結合レベル以上に高いことであっ
たためと推定される。ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
）らは、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の１２５１−プロティンＡを
用いて非特異的結合を低下せしめることに成功した［
Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ上主１．１０７３（１９７９）コ
。
スタフィロコッカス・アウレウスから分離したプロティ
ンＡは、ヒトＩｇＧサブクラス１．２および４のＦｃ部
分に優先的に結合するが、ヒトＩｇＧ ３には結合しな
い。プロティンＡは免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡとい
う）のサブクラスであるＩｇＡ、およびＩｇＡ ２と結
合するが、ＩｇＡサブクラスとプロティンＡの結合能と
の間には、特別な関係はないらしい［ブルンダ（Ｂｒｕ
ｎｄａ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖｏｌ、 １２３．
１４５７（１９７９）］、ヨハンソン（Ｊｏｈａｎｓｓ
ｏｎ）およびインガナス（１ｎｇａｎａｓ ）は、ポリ
クローナル免疫グロブリンＥ（以下ＩｇＥという）を含
有する血清試料から分離したＩｇＥは、プロティンＡと
の高い親和性を示すが、その結合部位はＩｇＧとは異な
ってＦｃ部分ではないとしている［ Ｉｍｍｕｎｏ−１
ｎｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ４↓、２４Ｂ（１９７８）コ
。
ンＡは、ヒトＩｇＧサブクラス１．２および４のＦｃ部
分に優先的に結合するが、ヒトＩｇＧ ３には結合しな
い。プロティンＡは免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡとい
う）のサブクラスであるＩｇＡ、およびＩｇＡ ２と結
合するが、ＩｇＡサブクラスとプロティンＡの結合能と
の間には、特別な関係はないらしい［ブルンダ（Ｂｒｕ
ｎｄａ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖｏｌ、 １２３．
１４５７（１９７９）］、ヨハンソン（Ｊｏｈａｎｓｓ
ｏｎ）およびインガナス（１ｎｇａｎａｓ ）は、ポリ
クローナル免疫グロブリンＥ（以下ＩｇＥという）を含
有する血清試料から分離したＩｇＥは、プロティンＡと
の高い親和性を示すが、その結合部位はＩｇＧとは異な
ってＦｃ部分ではないとしている［ Ｉｍｍｕｎｏ−１
ｎｇｉｃａｌ Ｒｅｖ、 ４↓、２４Ｂ（１９７８）コ
。
以上の現状から見てヒトアレルゲン特異ＩｇＧ抗体の新
たな測定法の開発が強く望まれている。モノクローナル
抗ヒトＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧの特定の抗原決定基に
対して、均一な親和性を持って結合することができる。
たな測定法の開発が強く望まれている。モノクローナル
抗ヒトＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧの特定の抗原決定基に
対して、均一な親和性を持って結合することができる。
又、モノクローナル抗体は、マウスの腹腔内において多
量に作成することができる。従って、アレルゲンに特異
的に結合したヒトＩｇＧに対して選択的に結合し、正常
ヒトＩｇＧによる非特異的結合の低いモノクローナル抗
体を作製することは、アレルゲン特異ヒトＩｇＧ抗体の
測定を可能にするものと思われる。
量に作成することができる。従って、アレルゲンに特異
的に結合したヒトＩｇＧに対して選択的に結合し、正常
ヒトＩｇＧによる非特異的結合の低いモノクローナル抗
体を作製することは、アレルゲン特異ヒトＩｇＧ抗体の
測定を可能にするものと思われる。
明が解決しようとする問題点
本発明が提供するモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体の特
長は、 ■ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインを認識する■しトＩｇＧ
およびそのサブクラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧｚ 、
ＩｇＧ３． Ｉ４Ｇ４に高い結合能を示す。
長は、 ■ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインを認識する■しトＩｇＧ
およびそのサブクラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧｚ 、
ＩｇＧ３． Ｉ４Ｇ４に高い結合能を示す。
■固相化された非特異ＩｇＧと比較して、アレルゲンに
結合した、特異ＩｇＧ抗体に対し選択的に結合する。
結合した、特異ＩｇＧ抗体に対し選択的に結合する。
■溶液状態にある遊離ヒト１ｇＧとの結合性が極めて弱
い。
い。
であり、これらの特長から、ＲＡＳＴ法あるいはＥＬＩ
ＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ）によるアレルゲン特異Ｉｇ
Ｇ抗体、免疫複合体の測定およびアレルギー疾患の発病
機作解明に利用することができる。該モノクローナル抗
体は、正常血清中での非特異的結合性が非常に低く、更
にＩｇＥ抗体測定用に調製した市販のアレルゲンディス
クやアレルゲンを固相化した（例えば、チューブコーテ
ィング、ビーズなど）担体を利用して、アレルゲン特異
ＩｇＧ抗体を測定することもできる。
ＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ）によるアレルゲン特異Ｉｇ
Ｇ抗体、免疫複合体の測定およびアレルギー疾患の発病
機作解明に利用することができる。該モノクローナル抗
体は、正常血清中での非特異的結合性が非常に低く、更
にＩｇＥ抗体測定用に調製した市販のアレルゲンディス
クやアレルゲンを固相化した（例えば、チューブコーテ
ィング、ビーズなど）担体を利用して、アレルゲン特異
ＩｇＧ抗体を測定することもできる。
口１発明の構成
」思孟ｅｓｓしＬＬ（ΔΔ王貝
ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧなど）に対するモノクロー
ナル抗体の調製 （１）抗体産生肺臓細胞の調製 動物、例えばマウス、ラットなどに、ヒト血清由来の免
疫グロブリンをフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ ）完全アン
ユハンドと共に腹腔内投与し免疫する。約３週間後、更
にヒト血清由来免疫グロブリン（追加刺激量）をミョウ
バンアジュバントと共に腹腔内投与する。３日後に肺臓
を摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細胞とする
。
ナル抗体の調製 （１）抗体産生肺臓細胞の調製 動物、例えばマウス、ラットなどに、ヒト血清由来の免
疫グロブリンをフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ ）完全アン
ユハンドと共に腹腔内投与し免疫する。約３週間後、更
にヒト血清由来免疫グロブリン（追加刺激量）をミョウ
バンアジュバントと共に腹腔内投与する。３日後に肺臓
を摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細胞とする
。
（り 骨髄腫細胞の調製
ヒボキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ欠損骨髄腫細胞株、例えばＢＡＬＢＺＣ系マウ
スの骨髄腫細胞Ｐ３・ＭＳ−１／１・Ａｇ４・１（以下
Ｎ５−１／Ａｇという） ［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ。
ェラーゼ欠損骨髄腫細胞株、例えばＢＡＬＢＺＣ系マウ
スの骨髄腫細胞Ｐ３・ＭＳ−１／１・Ａｇ４・１（以下
Ｎ５−１／Ａｇという） ［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ。
゛ Ｌ盃、４０６［：１９７９）コを培地、例えば１５
％ウシ胎児血清（ＦＣ５）を含有するＲＰＭＩ−１６４
０培地中に維持する。ＭＳ−１７Ａｇの生育は、ヒボキ
サンチン・アミノプテリン・チミジン培地（ＨＡｒ培地
）中で阻害される。
％ウシ胎児血清（ＦＣ５）を含有するＲＰＭＩ−１６４
０培地中に維持する。ＭＳ−１７Ａｇの生育は、ヒボキ
サンチン・アミノプテリン・チミジン培地（ＨＡｒ培地
）中で阻害される。
（３） ハイブリドーマの調製
前記（１）で調製される肺臓細胞と（２）で調製される
骨髄腫細胞ＭＳ−１７Ａｇとを、オイ（Ｏｌ）およびヘ
ルゼンベルグ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ）の方法［Ｓｅ
ｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ３５１〜３７２（１９８０
）、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅ
ｍａｎａｎｄ Ｃｏ、コに従って、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）の存在下に融合させる。得られる融合細
胞をＨＡＴ培地中に懸濁し、組織培養プレートの各ウェ
ルに接種する。この際、栄養細胞として少量のＢＡＬＢ
／Ｃ系マウス胸腺細胞または腹腔浸出細胞を共存させて
おくのが好ましい。培養開始後１日、２日、３日、５日
、８日、１１日、後に各つｘ）しのＨＡＴ培地の半量を
新たなＨＡＴ培地と交換し、更に１４日、１５日、１６
日後にその半量をヒボキサンチン・チミジンのみを含む
培地（Ｈす培地）と交換する。
骨髄腫細胞ＭＳ−１７Ａｇとを、オイ（Ｏｌ）およびヘ
ルゼンベルグ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ）の方法［Ｓｅ
ｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ３５１〜３７２（１９８０
）、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅ
ｍａｎａｎｄ Ｃｏ、コに従って、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）の存在下に融合させる。得られる融合細
胞をＨＡＴ培地中に懸濁し、組織培養プレートの各ウェ
ルに接種する。この際、栄養細胞として少量のＢＡＬＢ
／Ｃ系マウス胸腺細胞または腹腔浸出細胞を共存させて
おくのが好ましい。培養開始後１日、２日、３日、５日
、８日、１１日、後に各つｘ）しのＨＡＴ培地の半量を
新たなＨＡＴ培地と交換し、更に１４日、１５日、１６
日後にその半量をヒボキサンチン・チミジンのみを含む
培地（Ｈす培地）と交換する。
（４）抗ヒト免疫グロブリン抗体産生ハイブリドーマの
検定 ■ヒト免疫グロブリン感作ヒツジ赤血球を用いた受身血
球凝集反応による検定 ヒトＩｇＧを塩化クロム法［Ｅ、Ｒ，ゴールド（Ｇｏｌ
ｄ）およびＨ，Ｈフデンベルグ（Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇ
）、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
検定 ■ヒト免疫グロブリン感作ヒツジ赤血球を用いた受身血
球凝集反応による検定 ヒトＩｇＧを塩化クロム法［Ｅ、Ｒ，ゴールド（Ｇｏｌ
ｄ）およびＨ，Ｈフデンベルグ（Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇ
）、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
９９．８５９（１９６７）コにより、三塩化クロムを用
いて洗浄したヒツジ赤血球に感作する。同様に、ヒト免
疫グロブリンのＦｃフラグメント、Ｆ（ａ、ｂ’）ｚお
よびヒト骨髄腫蛋白で感作したヒツジ赤血球を得る。以
上の感作ヒツジ赤血球を用いて、培養上清の抗体産生能
を受身赤血球凝集反応により検定する。
いて洗浄したヒツジ赤血球に感作する。同様に、ヒト免
疫グロブリンのＦｃフラグメント、Ｆ（ａ、ｂ’）ｚお
よびヒト骨髄腫蛋白で感作したヒツジ赤血球を得る。以
上の感作ヒツジ赤血球を用いて、培養上清の抗体産生能
を受身赤血球凝集反応により検定する。
■ＥＬＩＳＡ法を用いた検定
ヒト免疫グロブリンを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，
１＞にて、ポリスチレンプレートに固相化する。ウシ血
清アルブミンにて残りの結合部位を飽和した後、ハイブ
リドーマの培養上清と反応させる。洗浄後ヒト免疫グロ
ブリンと交差結合性をもたないペルオキシダーゼ標識抗
マウス免疫グロブリン抗体と反応させる。洗浄後基質（
過酸化水素）と反応させ、ナトリウムアジドにて反応停
止した後、吸光度を測定する。
１＞にて、ポリスチレンプレートに固相化する。ウシ血
清アルブミンにて残りの結合部位を飽和した後、ハイブ
リドーマの培養上清と反応させる。洗浄後ヒト免疫グロ
ブリンと交差結合性をもたないペルオキシダーゼ標識抗
マウス免疫グロブリン抗体と反応させる。洗浄後基質（
過酸化水素）と反応させ、ナトリウムアジドにて反応停
止した後、吸光度を測定する。
（９ハイプリドーマのクローニング・選択上記（４）の
操作で抗体活性の認められたハイブリドーマをこの技術
分野においてよく知られた限界希釈法によって更にクロ
ーン化する。生育してきたクローンの培養上清は、更に
（４）の方法によって抗体活性を検定し、抗体活性の強
いクローンを選択する。
操作で抗体活性の認められたハイブリドーマをこの技術
分野においてよく知られた限界希釈法によって更にクロ
ーン化する。生育してきたクローンの培養上清は、更に
（４）の方法によって抗体活性を検定し、抗体活性の強
いクローンを選択する。
（ｅ 抗ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧなど）モノクロー
ナル抗体の調製 上記（５）で選択したクローンを適当な培地、例えば１
５％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞濃度が
その上限に達するまで培養するか、あるいは選択したク
ローンをブリステン（ｐｒｉｓｔａｎｅ ）処理したＢ
ＡＬＢ／Ｃ系マウスなどに腹腔内移植し、約３週間後に
貯留腹水を採取することにより行なう。
ナル抗体の調製 上記（５）で選択したクローンを適当な培地、例えば１
５％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞濃度が
その上限に達するまで培養するか、あるいは選択したク
ローンをブリステン（ｐｒｉｓｔａｎｅ ）処理したＢ
ＡＬＢ／Ｃ系マウスなどに腹腔内移植し、約３週間後に
貯留腹水を採取することにより行なう。
（７） モノクローナル抗体の単離精製培養後遠心操作
により細胞を除去した培養上清あるいは腹水からモノク
ローナル抗体を単離精製するには、この技術分野におい
てよく知られた方法、例えばプロティンＡセファロース
によるアフィニティークロマトグラフィーによって容易
に実施することかできる。
により細胞を除去した培養上清あるいは腹水からモノク
ローナル抗体を単離精製するには、この技術分野におい
てよく知られた方法、例えばプロティンＡセファロース
によるアフィニティークロマトグラフィーによって容易
に実施することかできる。
作 用
後記の実験例に示すごとく、本発明に係るモノクローナ
ル抗ヒトＩｇＧ抗体は、その免疫グロブリンとの結合能
を凝集反応により検定したところ、ＩｇＧとそのサブク
ラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３．ＩｇＧ４
には高い親和性を示す。しかし、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡま
たはヒト血清アルブミンで被覆したヒツジ赤血球を凝集
しない。また、ＩｇＧのＦｃ部に結合して、Ｆ（ａｂ’
）部には殆ど結合しない。免疫沈降法で検定したアイソ
タイプはＩｇＧ２ａである。
ル抗ヒトＩｇＧ抗体は、その免疫グロブリンとの結合能
を凝集反応により検定したところ、ＩｇＧとそのサブク
ラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３．ＩｇＧ４
には高い親和性を示す。しかし、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡま
たはヒト血清アルブミンで被覆したヒツジ赤血球を凝集
しない。また、ＩｇＧのＦｃ部に結合して、Ｆ（ａｂ’
）部には殆ど結合しない。免疫沈降法で検定したアイソ
タイプはＩｇＧ２ａである。
該モノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体を放射性ヨウ素（１
２Ｊ）で標識し、ヒト１ｇＧフラグメントノ抑制作用を
利用して、ヒトＩｇＧの抗原決定ドメインを決定したと
ころ、ＨＧ２−２５はＦｃフラグメントによりその結合
を抑制されるが、ｐＦｃ’によっては抑制されない。こ
のことは、ＨＧ２−２５がヒトＩｇＧのＣＨ２ドメイン
を認識することを意味している。
２Ｊ）で標識し、ヒト１ｇＧフラグメントノ抑制作用を
利用して、ヒトＩｇＧの抗原決定ドメインを決定したと
ころ、ＨＧ２−２５はＦｃフラグメントによりその結合
を抑制されるが、ｐＦｃ’によっては抑制されない。こ
のことは、ＨＧ２−２５がヒトＩｇＧのＣＨ２ドメイン
を認識することを意味している。
衷産例
（１）抗ヒトＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマの調製
ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（８〜１０週令）退会ヒト血清由
来のＩｇＧ２００ｕｇ（１００とＱ生理食塩水）をフロ
イント完全アジュバント１００μσと共に腹腔内投与し
て免疫した。２１日後、更にヒト血清由来のＩｇＧ２０
ｕｇをミョウバン沈降物として腹腔内投与した。３日後
に肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調
製し、１０８個の肺臓細胞を含むＲＰＭＩ培地ＩＱＩＩ
Ｑを、予めＲＰＭＩ培地ＩＱｎＱ中に浮遊させた５Ｘ１
０’個のＮ５−１骨髄腫細胞と混合した。この混合物を
４５０ｇで１０分間遠心し、上清液を除去した。次いで
５０％ＰＥＧ ４０００ （メルク社製）を含むＲＰＭ
Ｉ培地（ＲＰＭＩ−１６４０）１ｎＱをゆるやかに攪拌
しながら添加した。更に１分間攪拌した後、ＲＰＭＩ溶
液の追加量１ ｍＱを１分間を要して添加した。同じく
１蛙を追加した後、同溶液７ ｎＱを約３分を要して添
加した後、４００ｇで１０分間遠心分離して上清液を除
去し、得られた細胞を１５％ウシ胎児血清（以下ＦＣ５
という）を含ムＲＰＭＩ−１６４０培地２０ｎＱｌ＝浮
遊サセ、組織培養プレート（コーニング社製９６穴）２
枚の各ウェルに１００ｕｌｌずつ接種し、７％炭酸ガス
の存在下３７°Ｃで培養した。
来のＩｇＧ２００ｕｇ（１００とＱ生理食塩水）をフロ
イント完全アジュバント１００μσと共に腹腔内投与し
て免疫した。２１日後、更にヒト血清由来のＩｇＧ２０
ｕｇをミョウバン沈降物として腹腔内投与した。３日後
に肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調
製し、１０８個の肺臓細胞を含むＲＰＭＩ培地ＩＱＩＩ
Ｑを、予めＲＰＭＩ培地ＩＱｎＱ中に浮遊させた５Ｘ１
０’個のＮ５−１骨髄腫細胞と混合した。この混合物を
４５０ｇで１０分間遠心し、上清液を除去した。次いで
５０％ＰＥＧ ４０００ （メルク社製）を含むＲＰＭ
Ｉ培地（ＲＰＭＩ−１６４０）１ｎＱをゆるやかに攪拌
しながら添加した。更に１分間攪拌した後、ＲＰＭＩ溶
液の追加量１ ｍＱを１分間を要して添加した。同じく
１蛙を追加した後、同溶液７ ｎＱを約３分を要して添
加した後、４００ｇで１０分間遠心分離して上清液を除
去し、得られた細胞を１５％ウシ胎児血清（以下ＦＣ５
という）を含ムＲＰＭＩ−１６４０培地２０ｎＱｌ＝浮
遊サセ、組織培養プレート（コーニング社製９６穴）２
枚の各ウェルに１００ｕｌｌずつ接種し、７％炭酸ガス
の存在下３７°Ｃで培養した。
１０．２日、３日、５日および８日後に各培地ノ半量ヲ
ＨＡＴ 培地（１０％ＦＣ５、４Ｘ １０−７Ｍ７ミノ
プテリン、１．６Ｘ１０’Ｍチミジン、１×１０ Ｍヒ
ボキサンチンを添加したＲＰＭＩ −１６４０培地）と
交換し、更に培養を続けた。培養の１１日、１３日、１
４日目に培地の半量をＨＴ培地（１０％ＦＣ５，１，６
Ｘ １０ Ｍｆ ミジン、ｌＸｌ０’Ｍヒボキサンチン
を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換した。
ＨＡＴ 培地（１０％ＦＣ５、４Ｘ １０−７Ｍ７ミノ
プテリン、１．６Ｘ１０’Ｍチミジン、１×１０ Ｍヒ
ボキサンチンを添加したＲＰＭＩ −１６４０培地）と
交換し、更に培養を続けた。培養の１１日、１３日、１
４日目に培地の半量をＨＴ培地（１０％ＦＣ５，１，６
Ｘ １０ Ｍｆ ミジン、ｌＸｌ０’Ｍヒボキサンチン
を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換した。
融合操作開始から１６日後、全てのウェルからハイブリ
ドーマのコロニーが出現した。このバイブリド−７ヲ１
５％ＦＣ５ヲ含ｕＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、
その培養上清液中の特異抗体産生の有無を次のようにし
て検定した。
ドーマのコロニーが出現した。このバイブリド−７ヲ１
５％ＦＣ５ヲ含ｕＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、
その培養上清液中の特異抗体産生の有無を次のようにし
て検定した。
培養上清を被検液とし、被検液５ｇＱと１０％ＦＣ５を
加えたリン酸塩緩衝食塩水（以下ＰＢＳという）５０八
ＱとをＵ底組織培養用プレートの各ウェルに採る。Ｕ底
プレートの各ウェルにヒトＩｇＧ感作ヒンジ赤血球１％
浮遊液５０ｐＨを加え、静かに攪拌する。２時間室温に
静置後、血球凝集の有無を判定した。結果を第１表に示
す。
加えたリン酸塩緩衝食塩水（以下ＰＢＳという）５０八
ＱとをＵ底組織培養用プレートの各ウェルに採る。Ｕ底
プレートの各ウェルにヒトＩｇＧ感作ヒンジ赤血球１％
浮遊液５０ｐＨを加え、静かに攪拌する。２時間室温に
静置後、血球凝集の有無を判定した。結果を第１表に示
す。
第１表
（２）抗ヒトＩｇＧ抗体産生細胞株のクローニング
（１）により得られた抗ヒトＩｇＧ抗体−生ハイプリド
ーマを、１５％ＦＣ５ヲ含ムＲＰＭＩ−１６４０培地中
↓こ、５ｆ固／ｎρの濃度になるように浮遊きせ、各ウ
ェルが１００７ａＱとなるように組織培養プレート（コ
ーニング社製９６穴）の４０ウエルに接種した。次いで
該浮遊液を１個／ ｍＱ濃度に稀釈して３２ウエルに接
種し、更に０５個／ ｍＱ濃度に稀釈して２４ウエルに
接種した。５日後に１５％ＦＣ５加ＲＰＭＩ−１６４０
培地１００ｓｌｌを各ウェルに追加シタ。例えば、クロ
ーンＨＧ２−２５の場合培養１０日後、０．５個／ ｎ
Ｑ濃度の２４ウエルの中２ウェルに、また１個／ ｎｕ
濃度の３２ウエルの中４ウェルにハイプリドーマクロー
ンが出現した。各クローンの培養上清につき抗体産生能
を検定した。
ーマを、１５％ＦＣ５ヲ含ムＲＰＭＩ−１６４０培地中
↓こ、５ｆ固／ｎρの濃度になるように浮遊きせ、各ウ
ェルが１００７ａＱとなるように組織培養プレート（コ
ーニング社製９６穴）の４０ウエルに接種した。次いで
該浮遊液を１個／ ｍＱ濃度に稀釈して３２ウエルに接
種し、更に０５個／ ｍＱ濃度に稀釈して２４ウエルに
接種した。５日後に１５％ＦＣ５加ＲＰＭＩ−１６４０
培地１００ｓｌｌを各ウェルに追加シタ。例えば、クロ
ーンＨＧ２−２５の場合培養１０日後、０．５個／ ｎ
Ｑ濃度の２４ウエルの中２ウェルに、また１個／ ｎｕ
濃度の３２ウエルの中４ウェルにハイプリドーマクロー
ンが出現した。各クローンの培養上清につき抗体産生能
を検定した。
［試験結果コ
全クローンに抗体産生能が認められた。
０）抗ヒトＩｇＧ抗体の産生
前工程で取得したハイプリドーマクローンを、あらかじ
めブリステンＱ、５ｎｌｌで腹腔内投与処理したＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に、抗ヒトＩｇＧ抗体産生ハイブ
リドーマを５Ｘ１０６個宛Ｑ、５ｎｌｌの生理食塩水に
懸濁し移植した。３週間後、マウスの腹部肥大を確かめ
て、注射器で腹水を採取し、遠心操作により細胞を除去
した。
めブリステンＱ、５ｎｌｌで腹腔内投与処理したＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に、抗ヒトＩｇＧ抗体産生ハイブ
リドーマを５Ｘ１０６個宛Ｑ、５ｎｌｌの生理食塩水に
懸濁し移植した。３週間後、マウスの腹部肥大を確かめ
て、注射器で腹水を採取し、遠心操作により細胞を除去
した。
（４）抗ヒトＩｇＧ抗体の分離精製
前工程で採取した腹水を４５％飽和硫酸アンモニウム水
で塩析し、生じた沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０＞に溶解後、同波にて透析した。腹水より塩析にて
得られたガンマ−分画２０ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０＞ ２ ｎＱにとかし、プロティンＡ−セ
ファローズ［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａ
Ｂ）］のカラム（１，６Ｘ５ｃｍ）に吸着許せた。先ず
、０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）約５ＱｎＱで不
純物を流出し、次いで０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５
，０）約１００ｎＱで溶出してモノクローナル抗ヒトＩ
ｇＧ抗体ＨＧ２−２５を得た。
で塩析し、生じた沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０＞に溶解後、同波にて透析した。腹水より塩析にて
得られたガンマ−分画２０ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０＞ ２ ｎＱにとかし、プロティンＡ−セ
ファローズ［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａ
Ｂ）］のカラム（１，６Ｘ５ｃｍ）に吸着許せた。先ず
、０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）約５ＱｎＱで不
純物を流出し、次いで０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５
，０）約１００ｎＱで溶出してモノクローナル抗ヒトＩ
ｇＧ抗体ＨＧ２−２５を得た。
実験例１
モノクローナル抗体ＨＧ２−２５の特長ＨＧ２−２５産
生ハイブリドーマの培養上清を１０％ＦＣ５含有リン酸
緩衝液にて倍々稀釈し、それぞれの５Ｑ４をＵ底マイク
ロタイタープレートの各ウェルに入れる。次に、ヒトＩ
ｇＧ感作ヒツジ赤血球１％浮遊液５０ｐＱを加え、プレ
ートミキサーで攪拌し、室温で２時間反応させた後、凝
集像を判定した。同様に、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメン
ト、Ｆ（ａｂ’）２およびヒト骨髄腫蛋白（ＩｇＧとそ
のサブクラス、すなわち、ＨＣＤＩ 、１ｇＧ２．）Ｉ
ＣＤ３ 、ＩｇＧ３゜ＩｇＧａ ）で感作したヒツジ赤
血球にて試験し、その凝集像を判定した。その結果、Ｉ
ｇＧとそのサブクラスに属するＨＣＤｌ、ＩｇＧｚ 、
ＨＣＤ３ 、ＩｇＧ３．ＩｇＧａとＦｃフラグメントに
高い抗体活性を示す凝集像を認めた。第２表に赤血球凝
集反応力価を示した。
生ハイブリドーマの培養上清を１０％ＦＣ５含有リン酸
緩衝液にて倍々稀釈し、それぞれの５Ｑ４をＵ底マイク
ロタイタープレートの各ウェルに入れる。次に、ヒトＩ
ｇＧ感作ヒツジ赤血球１％浮遊液５０ｐＱを加え、プレ
ートミキサーで攪拌し、室温で２時間反応させた後、凝
集像を判定した。同様に、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメン
ト、Ｆ（ａｂ’）２およびヒト骨髄腫蛋白（ＩｇＧとそ
のサブクラス、すなわち、ＨＣＤＩ 、１ｇＧ２．）Ｉ
ＣＤ３ 、ＩｇＧ３゜ＩｇＧａ ）で感作したヒツジ赤
血球にて試験し、その凝集像を判定した。その結果、Ｉ
ｇＧとそのサブクラスに属するＨＣＤｌ、ＩｇＧｚ 、
ＨＣＤ３ 、ＩｇＧ３．ＩｇＧａとＦｃフラグメントに
高い抗体活性を示す凝集像を認めた。第２表に赤血球凝
集反応力価を示した。
第２表
なお、各ヒトＩｇＧの由来は以下のとおりである。
ＩｇＧ ：ヒトＩｇＧ （マイルス社製）ＨＣＤｌ：Ｉ
ｇＧ１サブクラスに属する骨髄腫の１亜型としてのＨ鎮
痛の骨髄腫蛋白。
ｇＧ１サブクラスに属する骨髄腫の１亜型としてのＨ鎮
痛の骨髄腫蛋白。
１ｇＧ２ ：ヒトＩｇＧをパパイン限定分解にて１ｇＧ
２とし精製したもの。
２とし精製したもの。
ＨＣＤ３ ： ＩｇＧ３サブクラスに属する骨髄腫の１
亜型としてのＨ鎮痛の骨髄腫蛋白。
亜型としてのＨ鎮痛の骨髄腫蛋白。
ＩｇＧ３ ：ヒトＩｇＧをプロティンＡ・セファロース
カラムを通過精製したもの。
カラムを通過精製したもの。
ＩｇＧ４： ＩｇＧａサブクラスに属する骨髄腫蛋白を
、セファデックスＧ２００および ＤＥＡＥセルロースカラムにて精製してもの。
、セファデックスＧ２００および ＤＥＡＥセルロースカラムにて精製してもの。
Ｆ（ａｂ’）ｚ ：ヒトＩｇＧをペプシン処理精製した
もの。
もの。
ＦＣ：ヒトＩｇＧをパパイン処理精製したもの。
実験例２
４ｏｓｇ／ＩＩＱ濃度の１．３，４．６−テトラクロロ
ー３α、６α−ジフェニルグリコールウリル［ｌ０ＤＯ
−ＧＥＮ （ヨードゲン）としてピアスケミカルネ土（
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、 ）より入手
］ジクロルメタン溶液５０μ痣をガラスチューブに入れ
、窒素気流下室温で風乾した。このチューブに０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ７，４） １５ ＩｔにとかしたＨ
Ｇ２−２５抗体溶液（３０ｓｇ／ １５ｐＱ）を加え、
更に放射性ヨウ化ナトリウム（Ｎａ１２’Ｉ） ０．５
ｍＣ１／ ５ ｐＱを加えて、室温で１５分間静かに振
盪した。得られた反応液をセフアデックスＧ −２５（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ； ７ ｙシフ９フ社）のカラム（１
，６Ｘ ５０ｃｍ）に通して、リン酸緩衝食塩水で溶出
した。最先溶出区分を分取して１２５！標識モノクロー
ナル抗体ＨＧ２−２５を得た。
ー３α、６α−ジフェニルグリコールウリル［ｌ０ＤＯ
−ＧＥＮ （ヨードゲン）としてピアスケミカルネ土（
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、 ）より入手
］ジクロルメタン溶液５０μ痣をガラスチューブに入れ
、窒素気流下室温で風乾した。このチューブに０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ７，４） １５ ＩｔにとかしたＨ
Ｇ２−２５抗体溶液（３０ｓｇ／ １５ｐＱ）を加え、
更に放射性ヨウ化ナトリウム（Ｎａ１２’Ｉ） ０．５
ｍＣ１／ ５ ｐＱを加えて、室温で１５分間静かに振
盪した。得られた反応液をセフアデックスＧ −２５（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ； ７ ｙシフ９フ社）のカラム（１
，６Ｘ ５０ｃｍ）に通して、リン酸緩衝食塩水で溶出
した。最先溶出区分を分取して１２５！標識モノクロー
ナル抗体ＨＧ２−２５を得た。
セフ７りｏ −ス６ Ｂ （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）の
カラム（１，６Ｘ５６ｃｍ）によるクロマトグラム（第
１図）は、氷晶が殆ど凝集物を含まない純品であること
を示している。
カラム（１，６Ｘ５６ｃｍ）によるクロマトグラム（第
１図）は、氷晶が殆ど凝集物を含まない純品であること
を示している。
（以下余白）
実験例３
モノクローナル抗体ＨＧ２−２５の認識部位ポリスチレ
ン製マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ
ｐｌａｔｅ） ［イムロン２プレート（Ｉｍｍｕｌｏ
ｎ ２ ｐｌａｔｅ ）、ダイナチク社（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈＣｏ、））の各ウェルに、ヒトＩｇＧを０．０５Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，１） ｃ： トカＬ タ溶液（２
Ｐｇ／ ｎＱ ） １００ｕｌｌ ヲ入れ、４℃にて一
夜放置した。次いで、０．０５％ツイーン２０および０
．０１％ナトリウムアジドを含有する０、１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）にて３回洗浄した後、ヒト血清アル
ブミン１ ｍｇ／ ＋ｉＱを含む０．１Ｍリン＃緩衝液
にてブロックした。同緩衝液にて洗浄後、ヒトＩｇＧ、
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ｔｌｍＦｃ、およびｐＦ’ｃの
それぞれの溶液（５ｇ／ｄを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
）と１２５１標識したＨＧ２−２５抗体とを同時に上記
プレートに入れ、室温に１６時間保持し、上記同様に洗
浄後、１０％酢酸にて特異的に結合している標識抗体Ｈ
Ｇ２−２５を離脱し、放射能を測定した。第３表に示す
ごとく、モノクローナル抗体ＨＧ２−２５は、未処理ヒ
トＩｇＧにより９６％の高率で特異的結合を抑制される
。また、Ｆｃフラグメントでは９９％が抑制きれ、Ｆ（
ａｂ’）２およびｐＦｃ ’では殆ど抑制を受けなかっ
た。
ン製マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ
ｐｌａｔｅ） ［イムロン２プレート（Ｉｍｍｕｌｏ
ｎ ２ ｐｌａｔｅ ）、ダイナチク社（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈＣｏ、））の各ウェルに、ヒトＩｇＧを０．０５Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，１） ｃ： トカＬ タ溶液（２
Ｐｇ／ ｎＱ ） １００ｕｌｌ ヲ入れ、４℃にて一
夜放置した。次いで、０．０５％ツイーン２０および０
．０１％ナトリウムアジドを含有する０、１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）にて３回洗浄した後、ヒト血清アル
ブミン１ ｍｇ／ ＋ｉＱを含む０．１Ｍリン＃緩衝液
にてブロックした。同緩衝液にて洗浄後、ヒトＩｇＧ、
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ｔｌｍＦｃ、およびｐＦ’ｃの
それぞれの溶液（５ｇ／ｄを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
）と１２５１標識したＨＧ２−２５抗体とを同時に上記
プレートに入れ、室温に１６時間保持し、上記同様に洗
浄後、１０％酢酸にて特異的に結合している標識抗体Ｈ
Ｇ２−２５を離脱し、放射能を測定した。第３表に示す
ごとく、モノクローナル抗体ＨＧ２−２５は、未処理ヒ
トＩｇＧにより９６％の高率で特異的結合を抑制される
。また、Ｆｃフラグメントでは９９％が抑制きれ、Ｆ（
ａｂ’）２およびｐＦｃ ’では殆ど抑制を受けなかっ
た。
第３表
上記のＩｇＧおよび各フラグメントの由来は以下のとお
りである。
りである。
ＩｇＧ ：ヒトＩｇＧ （マイルス社製）Ｆ（ａｂ’）
２：ヒトＩｇＧをペプシン処理したもの。
２：ヒトＩｇＧをペプシン処理したもの。
Ｆｃ’：ヒトＩｇＧをパパイン処理したもの。
ｔｌｍＦｃ ： Ｆｃをサーモライシン処理したもの。
ｐＦｃ ： Ｆｃをペプシン処理したもの。
実験例４
ヒトＩＧに対する特 条件 での 相性（１）溶液状、
のヒトＩＧに対する 相性ヨーｒゲン法にて標識した＋
２Ｊ−ヒトＩｇＧを、０．１％血清アルブミン、０．０
５％ツイーン２０．０．０１％アジ化ナトリウムを含有
する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（Ｂ緩衝液）
にて０．０４鴻／戚となるように調製した。同波５０７
ａｌｌとモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（１６ｇ／
ｎＱになるようにＢ緩衝液にて希釈）溶液５０ｓＱに、
０．１〜５０趨／ ｎＱ濃度のヒトＩｇＧ溶液５０ｐＨ
を加え、ポリスチレンチューブ内で室温１６時間反応さ
せた。
のヒトＩＧに対する 相性ヨーｒゲン法にて標識した＋
２Ｊ−ヒトＩｇＧを、０．１％血清アルブミン、０．０
５％ツイーン２０．０．０１％アジ化ナトリウムを含有
する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（Ｂ緩衝液）
にて０．０４鴻／戚となるように調製した。同波５０７
ａｌｌとモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（１６ｇ／
ｎＱになるようにＢ緩衝液にて希釈）溶液５０ｓＱに、
０．１〜５０趨／ ｎＱ濃度のヒトＩｇＧ溶液５０ｐＨ
を加え、ポリスチレンチューブ内で室温１６時間反応さ
せた。
次いで、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体のアイソタイ
プであるＩｇＧ２ａに高い親和性を示すウサギ抗マウス
ＩｇＧ５ｍｇを臭化シアン活性化セファロース担体（フ
ァルマシア社）ＩＩＩＱに加え反応させて、同相化抗マ
ウスＩｇＧ２ａ抗体を得た。この同相化第２抗体を各ポ
リスチレンチューブにＱ、ｌｄ（用いたモノクローナル
抗ヒトＩｇＧ抗体を全て結合し得る充分量）ずつ加え、
攪拌しながら室温で１時間反応させた。Ｂ緩衝液２ｎＱ
で３回洗浄の後、７−カウンターにて計測した。親和定
数はスキャッチャード（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）法によ
りめた。
プであるＩｇＧ２ａに高い親和性を示すウサギ抗マウス
ＩｇＧ５ｍｇを臭化シアン活性化セファロース担体（フ
ァルマシア社）ＩＩＩＱに加え反応させて、同相化抗マ
ウスＩｇＧ２ａ抗体を得た。この同相化第２抗体を各ポ
リスチレンチューブにＱ、ｌｄ（用いたモノクローナル
抗ヒトＩｇＧ抗体を全て結合し得る充分量）ずつ加え、
攪拌しながら室温で１時間反応させた。Ｂ緩衝液２ｎＱ
で３回洗浄の後、７−カウンターにて計測した。親和定
数はスキャッチャード（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）法によ
りめた。
以上の実験による親和定数は２．７Ｘ １０７であった
。スキャッチャード・プロットは第２図のごとくであっ
た。
。スキャッチャード・プロットは第２図のごとくであっ
た。
（２）アレルゲンディスクに特異的に結合したヒトＩＧ
に対する親和性 ＩｇＧ −ＲＡＳＩのミツバチ毒アレルゲンディスク〔
ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ ） ＩｇＧ−ＲＡＳＴ
、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ）と
ミツバチ毒特興ＩｇＧ抗体を５Ｕ／＋＋１１含む標準溶
液Ａ３０ＰＱとを２５℃で３時間静置した。＋２Ｊ標識
ＨＧ２−２５を０，２μＣ１／ ｎＱ〜１０ＩＩＣｉ／
ａΩの範囲で変化させて５０ＰＱずつ加え、２５℃で１
６〜１８時間靜置した装同洗浄液で３回洗浄した後、７
−カウンタにて計測した。
に対する親和性 ＩｇＧ −ＲＡＳＩのミツバチ毒アレルゲンディスク〔
ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ ） ＩｇＧ−ＲＡＳＴ
、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ）と
ミツバチ毒特興ＩｇＧ抗体を５Ｕ／＋＋１１含む標準溶
液Ａ３０ＰＱとを２５℃で３時間静置した。＋２Ｊ標識
ＨＧ２−２５を０，２μＣ１／ ｎＱ〜１０ＩＩＣｉ／
ａΩの範囲で変化させて５０ＰＱずつ加え、２５℃で１
６〜１８時間靜置した装同洗浄液で３回洗浄した後、７
−カウンタにて計測した。
以上の実験による親和定数は３．５Ｘ １０’であった
。スキャッチャード・プロットは第３図のごとくであっ
た。
。スキャッチャード・プロットは第３図のごとくであっ
た。
（３）マイクロタイタープレートに非特異的に結合した
ヒトＩＧに対する親和性 ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ） （イムロン２プレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎ ２ ｐｌａｔｅ）、ダイナチク社（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈＣＯ，））の各ウェルに、ヒトＩｇＧ ２
ｎ／ ｎＱを含有する０、２５Ｍ炭酸緩衝液ＣｐＨ９
，１） ５０バを入れた。
ヒトＩＧに対する親和性 ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ） （イムロン２プレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎ ２ ｐｌａｔｅ）、ダイナチク社（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈＣＯ，））の各ウェルに、ヒトＩｇＧ ２
ｎ／ ｎＱを含有する０、２５Ｍ炭酸緩衝液ＣｐＨ９
，１） ５０バを入れた。
このプレートを３７℃で２時間放置し、次いで０．１％
血清アルブミン、０．０５％ツイーン２０および０．０
１％ナトリウムアジドを含有する０、１Ｍリン酸４１１
ｉ液（ｐＨ７，４） （Ａ緩衝液）で洗浄し、更にＡ緩
衝液中で３７℃で１時間放置した。次いで、Ａ緩衝液で
２度洗浄した後、＋２５ＩＰ！４識ＨＧ２−２５抗体の
溶液（０，００３〜３μＣｉ／ ｎＱ ） ５０ ｐＱ
量を各ウェルに加えた。このプレートを室温に１６時間
保持した後、Ａ緩衝液で２度洗浄した。プレート上のヒ
トＩｇＧに結合しているｌ２ＳＩｊｌＡ識ＨＧ２−２５
抗体を１０％酢酸でプレートから分離し、測定用チュー
ブに移して放射能を測定した。測定結果よりスキャッチ
ャード（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）の方法にしたがって結
合定数を計算するとＫ −１，５Ｘ １０”Ｍ−１であ
った。
血清アルブミン、０．０５％ツイーン２０および０．０
１％ナトリウムアジドを含有する０、１Ｍリン酸４１１
ｉ液（ｐＨ７，４） （Ａ緩衝液）で洗浄し、更にＡ緩
衝液中で３７℃で１時間放置した。次いで、Ａ緩衝液で
２度洗浄した後、＋２５ＩＰ！４識ＨＧ２−２５抗体の
溶液（０，００３〜３μＣｉ／ ｎＱ ） ５０ ｐＱ
量を各ウェルに加えた。このプレートを室温に１６時間
保持した後、Ａ緩衝液で２度洗浄した。プレート上のヒ
トＩｇＧに結合しているｌ２ＳＩｊｌＡ識ＨＧ２−２５
抗体を１０％酢酸でプレートから分離し、測定用チュー
ブに移して放射能を測定した。測定結果よりスキャッチ
ャード（５ｃａｔｃｈａｒｄ ）の方法にしたがって結
合定数を計算するとＫ −１，５Ｘ １０”Ｍ−１であ
った。
第１図は１２５■標識モノクローナル抗体ＨＧ２−２５
のクロマトグラムを示し、縦軸はカウント（％）、横軸
はフラクション数をぞれぞれ表わす。第２図および第３
図はモノクローナル抗体ＨＧ２−２５のスキ〜ツチャー
ド・プロットを示し、ＦはヒトＩｇＧに結合していない
ＨＧ２−２５のモル濃度、ＢはヒトＩｇＧ／ＨＧ２−２
５複合体のモル濃度をそれぞれ表わす。 特許出願人 塩野義製薬株式会社
のクロマトグラムを示し、縦軸はカウント（％）、横軸
はフラクション数をぞれぞれ表わす。第２図および第３
図はモノクローナル抗体ＨＧ２−２５のスキ〜ツチャー
ド・プロットを示し、ＦはヒトＩｇＧに結合していない
ＨＧ２−２５のモル濃度、ＢはヒトＩｇＧ／ＨＧ２−２
５複合体のモル濃度をそれぞれ表わす。 特許出願人 塩野義製薬株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体ＨＧ２−２５゜ ２、ヒトＩｇＧおよびそのサブクラスに属するＩｇＧ１
．ＩｇＧｚ 、ＩｇＧ３および１ｇＧ４に高い結合能を
示す特許請求の範囲第１項記載のモノクロ−アル抗体Ｈ
Ｇ２−２５゜ ３、ヒＩ−ＩｇＧで免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄
腫細胞との間にハイプリドーマを形成させて抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体を産生するハイプリドーマを選択し、該ハイプリ
ドーマを限界希釈法にてクローン化し、ヒトＩｇＧに対
して強い結合能をもつクローンを得、該クローンの中で
ヒトＩｇＧｘ 、ＩｇＧｚ 、ＩｇＧ３および１ｇＧ４
に同等に結合し、アレルゲンと結合した特異ヒトＩｇＧ
とより選択的に結合するＨＧ２−２５を得ることを特徴
とするモノクローナル抗体ＨＧ２−２５の製造法。 ４、該クローンをあらかしめブリステン処理したマウス
の腹腔内に移植し、増殖させ、腹水中にモノクローナル
抗体ＨＧ２−２５を産生せしめ、これを分離精製するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の製造法。 ５、粗製のモノクローナル抗体ＨＧ２−２５をプロティ
ンＡ結合担体樹脂によるアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製することを特徴とする特許請求の範囲第
３項記載の製造法。 ６、該担体樹脂がセファロースであることを特徴とする
特許請求の範囲第５項記載の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59087190A JPS60228421A (ja) | 1984-04-27 | 1984-04-27 | モノクロ−ナル抗ヒトＩｇＧ抗体およびその製造法 |
| CA000480009A CA1308676C (en) | 1984-04-27 | 1985-04-24 | Anti-human igg (immunoglobulin g) monoclonal antibody and process for preparing the same |
| DE8585105129T DE3583891D1 (de) | 1984-04-27 | 1985-04-26 | Monoklonaler menschlicher anti-igg-koerper und verfahren zu seiner herstellung. |
| EP19850105129 EP0163141B1 (en) | 1984-04-27 | 1985-04-26 | Monoclonal anti-human igg antibody and process for preparing the same |
| DE1985105129 DE163141T1 (de) | 1984-04-27 | 1985-04-26 | Monoklonaler menschlicher anti-igg-koerper und verfahren zu seiner herstellung. |
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