JPH05260967A - 精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物及びその調製法 - Google Patents
精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物及びその調製法Info
- Publication number
- JPH05260967A JPH05260967A JP4348148A JP34814892A JPH05260967A JP H05260967 A JPH05260967 A JP H05260967A JP 4348148 A JP4348148 A JP 4348148A JP 34814892 A JP34814892 A JP 34814892A JP H05260967 A JPH05260967 A JP H05260967A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alkaline protease
- bacillus
- purified
- protease
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/0005—Other compounding ingredients characterised by their effect
- C11D3/0078—Compositions for cleaning contact lenses, spectacles or lenses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アルカリプロテアーゼ製剤中の曇り、着色及
び臭気に関係する色素を除去するアルカリプロテアーゼ
の精製法を提供することにある。 【構成】 醗酵ブロースからの高度に精製されたアルカ
リプロテアーゼ(アルカリプロテアーゼはバチルス・リ
チェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスから
得られる)の調製法であって、細胞からのアルカリプロ
テアーゼと醗酵ブロース中の懸濁固体を分離することに
よりアルカリプロテアーゼ溶液を生成し、アルカリプロ
テアーゼ溶液を濃縮し、濃縮アルカリプロテアーゼに加
水分解酵素及び塩化ナトリウムを添加し、その混合物を
インキュベートして加水分解されたポリマー不純物から
アルカリプロテアーゼを分離し、色素からアルカリプロ
テアーゼを解離し、そして精製されたアルカリプロテア
ーゼ沈殿を回収することを特徴とする高度に精製された
アルカリプロテアーゼの調製法。
び臭気に関係する色素を除去するアルカリプロテアーゼ
の精製法を提供することにある。 【構成】 醗酵ブロースからの高度に精製されたアルカ
リプロテアーゼ(アルカリプロテアーゼはバチルス・リ
チェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスから
得られる)の調製法であって、細胞からのアルカリプロ
テアーゼと醗酵ブロース中の懸濁固体を分離することに
よりアルカリプロテアーゼ溶液を生成し、アルカリプロ
テアーゼ溶液を濃縮し、濃縮アルカリプロテアーゼに加
水分解酵素及び塩化ナトリウムを添加し、その混合物を
インキュベートして加水分解されたポリマー不純物から
アルカリプロテアーゼを分離し、色素からアルカリプロ
テアーゼを解離し、そして精製されたアルカリプロテア
ーゼ沈殿を回収することを特徴とする高度に精製された
アルカリプロテアーゼの調製法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は酵素の回収及び精製、更
に詳しくは、バチルス・リチェニホルミス(Bacillus li
cheniformis)及びバチルス・アルカロフィルス(Bacillu
s alcalophilus) 、またはこれらの遺伝子操作された変
異体からの精製されたアルカリプロテアーゼの回収法、
及びその方法から得られる組成物に関する。
に詳しくは、バチルス・リチェニホルミス(Bacillus li
cheniformis)及びバチルス・アルカロフィルス(Bacillu
s alcalophilus) 、またはこれらの遺伝子操作された変
異体からの精製されたアルカリプロテアーゼの回収法、
及びその方法から得られる組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】洗剤中の酵素の使用は公知である。一般
に、洗剤目的に使用される酵素は、主としてアルカリに
安定なプロテアーゼ、リパーゼ及びα−アミラーゼであ
った。アルカリプロテアーゼのうち、バチルス種、即
ち、枯草菌、バチルス・リチェニホルミス、及び好アル
カリ性バチルス菌から得られるセリンプロテアーゼが洗
剤配合に広く使用されていた[スタレース(STARACE)C.
及びバーフォード(BARFORD),H.C., Encyclopedia Chem.
Technol.9,138-148 頁(1980);ホリコシ・コーキ及びア
キカ・テラヒコ,A New Microbial World,Springer-Verl
ag,N.Y.,93頁(1982)]。
に、洗剤目的に使用される酵素は、主としてアルカリに
安定なプロテアーゼ、リパーゼ及びα−アミラーゼであ
った。アルカリプロテアーゼのうち、バチルス種、即
ち、枯草菌、バチルス・リチェニホルミス、及び好アル
カリ性バチルス菌から得られるセリンプロテアーゼが洗
剤配合に広く使用されていた[スタレース(STARACE)C.
及びバーフォード(BARFORD),H.C., Encyclopedia Chem.
Technol.9,138-148 頁(1980);ホリコシ・コーキ及びア
キカ・テラヒコ,A New Microbial World,Springer-Verl
ag,N.Y.,93頁(1982)]。
【0003】酵素は殆どの液体洗剤配合のほんの小部分
を構成する。こうして、かなり濃縮された酵素製剤を製
造することが必要である。酵素濃厚物は、従来、限外濾
過及び蒸発の如き通常の方法を使用して酵素の水溶液か
ら水を除去することにより調製される。硫酸アンモニウ
ム及び硫酸ナトリウムの如き無機塩が実験室レベル及び
商用レベルで水溶液から酵素を沈殿させるのに広く使用
されていた[ディクソン(DIXON),M.及びウェッブ(WEB
B),E.D.,Enzymes,Academic Press,N.Y.,39-41 頁(196
4),カーリン(CURLINE),Methods of Plasma Protein Fra
ctionation,Academic Press,N.Y.(1980) ]。しかしな
がら、大規模のこれらの塩の広範囲の使用は環境問題を
生じ、廃水処理を複雑にすることがあり、実際に、ヨー
ロッパの多くの国はこれらの塩の大規模な工業上の使用
を既に制限していた。また、エタノール及びアセトンの
如き有機溶剤が沈殿剤として使用される[ディクソン及
びウェッブ,Enzymes, 上記の文献、37-39 頁;バウエル
(BAUER) ら,J.Biol.Chem.,5(3),117-20頁(1967)]。し
かしながら、それらの使用はコスト及び安全上の注意の
ため制限されていた。
を構成する。こうして、かなり濃縮された酵素製剤を製
造することが必要である。酵素濃厚物は、従来、限外濾
過及び蒸発の如き通常の方法を使用して酵素の水溶液か
ら水を除去することにより調製される。硫酸アンモニウ
ム及び硫酸ナトリウムの如き無機塩が実験室レベル及び
商用レベルで水溶液から酵素を沈殿させるのに広く使用
されていた[ディクソン(DIXON),M.及びウェッブ(WEB
B),E.D.,Enzymes,Academic Press,N.Y.,39-41 頁(196
4),カーリン(CURLINE),Methods of Plasma Protein Fra
ctionation,Academic Press,N.Y.(1980) ]。しかしな
がら、大規模のこれらの塩の広範囲の使用は環境問題を
生じ、廃水処理を複雑にすることがあり、実際に、ヨー
ロッパの多くの国はこれらの塩の大規模な工業上の使用
を既に制限していた。また、エタノール及びアセトンの
如き有機溶剤が沈殿剤として使用される[ディクソン及
びウェッブ,Enzymes, 上記の文献、37-39 頁;バウエル
(BAUER) ら,J.Biol.Chem.,5(3),117-20頁(1967)]。し
かしながら、それらの使用はコスト及び安全上の注意の
ため制限されていた。
【0004】環境上安全かつコスト上有効な酵素精製法
が、例えば、ベッカー(BECKER)らの米国特許第5,041,37
7 号に説明されており、この特許は10℃未満の温度及び
5.2〜5.8 のpH範囲でアルカリプロテアーゼ溶液へのハ
ロゲン化物塩の添加による枯草菌及びバチルス・アミロ
リクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)から
得られる結晶性サブチリシンの製造法を記載する。プロ
テアーゼの着色及び臭気は、それらが混入される洗剤配
合の品質に悪影響を及ぼすことがある。これは酵素濃厚
物から色素の除去を必要とし、その色素は酵素−色素複
合体の一部であると考えられる。ディクソン,M及びウェ
ッブ,E.C.,Enzymes,上記の文献は、色素をプロテアーゼ
溶液から除去するための溶剤沈殿法を報告していた。し
かしながら、この方法は不十分な生成物収率を生じた。
水性酵素濃厚物から活性炭による色素の吸着が一般に工
業分野で実施されるが、物質の損失、高いコスト及び廃
棄物処理が重大な欠点を呈する。
が、例えば、ベッカー(BECKER)らの米国特許第5,041,37
7 号に説明されており、この特許は10℃未満の温度及び
5.2〜5.8 のpH範囲でアルカリプロテアーゼ溶液へのハ
ロゲン化物塩の添加による枯草菌及びバチルス・アミロ
リクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)から
得られる結晶性サブチリシンの製造法を記載する。プロ
テアーゼの着色及び臭気は、それらが混入される洗剤配
合の品質に悪影響を及ぼすことがある。これは酵素濃厚
物から色素の除去を必要とし、その色素は酵素−色素複
合体の一部であると考えられる。ディクソン,M及びウェ
ッブ,E.C.,Enzymes,上記の文献は、色素をプロテアーゼ
溶液から除去するための溶剤沈殿法を報告していた。し
かしながら、この方法は不十分な生成物収率を生じた。
水性酵素濃厚物から活性炭による色素の吸着が一般に工
業分野で実施されるが、物質の損失、高いコスト及び廃
棄物処理が重大な欠点を呈する。
【0005】洗剤用途のアルカリプロテアーゼ製剤は、
最終製品中に望ましくない着色、曇り、不安定性及びア
レルギー活性を生じ得る成分を含まないことが望まし
い。これらの成分は微生物そのものまたは残留醗酵原料
から得られることがある。グラム陽性バチルス菌の製剤
中で、細胞壁アニオン性ポリマー、ペプチドグリカン及
びその他の多糖汚染物質は細胞壁回転のために細胞増殖
中に可溶化されるようになる。アルカリプロテアーゼ製
剤中のこれらの細菌細胞壁ポリマーの存在は、アレルゲ
ン性の増加、カチオン、例えば、Ca++を結合することに
よる酵素安定性の低下を含む幾つかの望ましくない作用
を生じることがあり、そして洗剤配合中で曇りの生成を
生じることがある。1989年6月29日に公表された国際特
許出願(“PCT") No.WO 89/05863号明細書は、イオン交
換クロマトグラフィーを使用してプロテアーゼからこれ
らのポリマーを分離する方法を開示している。この方法
は大規模な操作には困難であり、しかも費用がかかる。
アルカリプロテアーゼ製剤から一般には炭水化物汚染物
質、特にガラクトシルポリマーを除去する簡単かつコス
ト上有効な方法に対する要望がある。
最終製品中に望ましくない着色、曇り、不安定性及びア
レルギー活性を生じ得る成分を含まないことが望まし
い。これらの成分は微生物そのものまたは残留醗酵原料
から得られることがある。グラム陽性バチルス菌の製剤
中で、細胞壁アニオン性ポリマー、ペプチドグリカン及
びその他の多糖汚染物質は細胞壁回転のために細胞増殖
中に可溶化されるようになる。アルカリプロテアーゼ製
剤中のこれらの細菌細胞壁ポリマーの存在は、アレルゲ
ン性の増加、カチオン、例えば、Ca++を結合することに
よる酵素安定性の低下を含む幾つかの望ましくない作用
を生じることがあり、そして洗剤配合中で曇りの生成を
生じることがある。1989年6月29日に公表された国際特
許出願(“PCT") No.WO 89/05863号明細書は、イオン交
換クロマトグラフィーを使用してプロテアーゼからこれ
らのポリマーを分離する方法を開示している。この方法
は大規模な操作には困難であり、しかも費用がかかる。
アルカリプロテアーゼ製剤から一般には炭水化物汚染物
質、特にガラクトシルポリマーを除去する簡単かつコス
ト上有効な方法に対する要望がある。
【0006】精製されたアルカリプロテアーゼ生成物を
調製する際に存在する別の問題は、処理または貯蔵中の
自己分解による酵素活性の損失である。アルカリプロテ
アーゼは細菌環境中でタンパク質分子を加水分解すると
いう作用を奏する。それらの触媒活性はタンパク質分子
中のペプチド結合の開裂並びにその結果得られる小さい
ポリペプチド及び個々のアミノ酸へのタンパク質構造の
分解に基く。アルカリプロテアーゼそれ自体はタンパク
質分子であるので、アルカリプロテアーゼは適当な条件
下で溶液中のその他のアルカリプロテアーゼ分子を加水
分解し始める。これはプロテアーゼ製剤に一般的な問題
であるが、アルカリプロテアーゼの自己分解の結果とし
てのタンパク質分解活性の損失は洗剤配合中に存在する
極限条件、例えば、アルカリ性pH下で酵素の性能に悪影
響することがある。何となれば、アルカリプロテアーゼ
はアルカリ性pH範囲で最も触媒活性であるからである。
調製する際に存在する別の問題は、処理または貯蔵中の
自己分解による酵素活性の損失である。アルカリプロテ
アーゼは細菌環境中でタンパク質分子を加水分解すると
いう作用を奏する。それらの触媒活性はタンパク質分子
中のペプチド結合の開裂並びにその結果得られる小さい
ポリペプチド及び個々のアミノ酸へのタンパク質構造の
分解に基く。アルカリプロテアーゼそれ自体はタンパク
質分子であるので、アルカリプロテアーゼは適当な条件
下で溶液中のその他のアルカリプロテアーゼ分子を加水
分解し始める。これはプロテアーゼ製剤に一般的な問題
であるが、アルカリプロテアーゼの自己分解の結果とし
てのタンパク質分解活性の損失は洗剤配合中に存在する
極限条件、例えば、アルカリ性pH下で酵素の性能に悪影
響することがある。何となれば、アルカリプロテアーゼ
はアルカリ性pH範囲で最も触媒活性であるからである。
【0007】上記の特許、特許出願または刊行物のいず
れもが、曇り及び臭気を発する汚染物質、アレルギーを
生じる活性及びその他の醗酵により得られる望ましくな
い不純物を含まないアルカリプロテアーゼ製剤の重要な
利点を与えない。こうして、精製操作中にプロテアーゼ
の自己分解を制限しながらアルカリプロテアーゼを精製
するための簡単且つ有効な方法に対する要望がある。ア
ルカリプロテアーゼ製剤からアレルゲン性及びその他の
望ましくない特性を有効に除去する能力が、有効かつ安
全な商用のプロテアーゼ利用に重要である。
れもが、曇り及び臭気を発する汚染物質、アレルギーを
生じる活性及びその他の醗酵により得られる望ましくな
い不純物を含まないアルカリプロテアーゼ製剤の重要な
利点を与えない。こうして、精製操作中にプロテアーゼ
の自己分解を制限しながらアルカリプロテアーゼを精製
するための簡単且つ有効な方法に対する要望がある。ア
ルカリプロテアーゼ製剤からアレルゲン性及びその他の
望ましくない特性を有効に除去する能力が、有効かつ安
全な商用のプロテアーゼ利用に重要である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、商用
のアルカリプロテアーゼ製剤中の曇り、着色汚染及び臭
気に関係する色素を除去するアルカリプロテアーゼの精
製法を提供することである。本発明の更に別の目的は、
アレルゲン活性に関連する問題の原因である多糖及びオ
リゴ糖を除去するアルカリプロテアーゼの精製のための
簡単かつ新規な方法を提供することである。本発明の更
に別の目的は、自己分解をかなり低下したアルカリプロ
テアーゼの精製法を提供することである。本発明の更に
別の目的は、環境上有害な薬品または高価な薬品を使用
しないで上記の目的を達成することである。本発明の更
に別の目的は、従来技術で認められた操作に較べて、更
に有効であり、かつかなり改良された収率、例えば、90
%を越える収率をもたらすアルカリプロテアーゼ生成物
の精製及び回収の方法を提供することである。
のアルカリプロテアーゼ製剤中の曇り、着色汚染及び臭
気に関係する色素を除去するアルカリプロテアーゼの精
製法を提供することである。本発明の更に別の目的は、
アレルゲン活性に関連する問題の原因である多糖及びオ
リゴ糖を除去するアルカリプロテアーゼの精製のための
簡単かつ新規な方法を提供することである。本発明の更
に別の目的は、自己分解をかなり低下したアルカリプロ
テアーゼの精製法を提供することである。本発明の更に
別の目的は、環境上有害な薬品または高価な薬品を使用
しないで上記の目的を達成することである。本発明の更
に別の目的は、従来技術で認められた操作に較べて、更
に有効であり、かつかなり改良された収率、例えば、90
%を越える収率をもたらすアルカリプロテアーゼ生成物
の精製及び回収の方法を提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、醗酵ブ
ロースからの精製されたアルカリプロテアーゼの調製法
が提供され、そのアルカリプロテアーゼはバチルス・リ
チェニホルミスもしくはバチルス・アルカロフィルス、
またはこれらの遺伝子操作された変異体から得られる。
その方法は、細胞からのアルカリプロテアーゼと醗酵ブ
ロース中の懸濁固体を分離することによりアルカリプロ
テアーゼ溶液を生成し、アルカリプロテアーゼ溶液に加
水分解酵素及び塩化ナトリウムを添加し、その混合物を
インキュベートして加水分解されたポリマー不純物から
アルカリプロテアーゼを分離し、そして色素からアルカ
リプロテアーゼを解離し;そして得られる精製されたア
ルカリプロテアーゼ沈殿を回収することを含む。
ロースからの精製されたアルカリプロテアーゼの調製法
が提供され、そのアルカリプロテアーゼはバチルス・リ
チェニホルミスもしくはバチルス・アルカロフィルス、
またはこれらの遺伝子操作された変異体から得られる。
その方法は、細胞からのアルカリプロテアーゼと醗酵ブ
ロース中の懸濁固体を分離することによりアルカリプロ
テアーゼ溶液を生成し、アルカリプロテアーゼ溶液に加
水分解酵素及び塩化ナトリウムを添加し、その混合物を
インキュベートして加水分解されたポリマー不純物から
アルカリプロテアーゼを分離し、そして色素からアルカ
リプロテアーゼを解離し;そして得られる精製されたア
ルカリプロテアーゼ沈殿を回収することを含む。
【0010】この実施態様は、ほぼ同時に生じるアルカ
リプロテアーゼ溶液への加水分解酵素及び塩化ナトリウ
ムの添加により行われることが好ましい。必要により、
加水分解酵素の添加は塩化ナトリウムの添加に先行して
もよい。アルカリプロテアーゼ溶液は塩化ナトリウムの
添加の前に濃縮されることが好ましい。この実施態様
は、塩化ナトリウムの添加中に攪拌、好ましくは一定の
激しい攪拌の条件下で行われることが更に好ましい。バ
チルス・アルカロフィルスから得られるアルカリプロテ
アーゼの場合、塩化ナトリウムの添加の際の溶液条件は
約4.0 〜7.5 のpH、約28℃〜32℃の温度、及び約8.0 〜
12.5%(重量/容積)の塩化ナトリウム濃度により特定
されることが更に好ましい。バチルス・リチェニホルミ
スの場合、溶液のpH範囲は約4.5 〜9.5 であり、温度及
び塩化ナトリウム濃度は上記とほぼ同じである。
リプロテアーゼ溶液への加水分解酵素及び塩化ナトリウ
ムの添加により行われることが好ましい。必要により、
加水分解酵素の添加は塩化ナトリウムの添加に先行して
もよい。アルカリプロテアーゼ溶液は塩化ナトリウムの
添加の前に濃縮されることが好ましい。この実施態様
は、塩化ナトリウムの添加中に攪拌、好ましくは一定の
激しい攪拌の条件下で行われることが更に好ましい。バ
チルス・アルカロフィルスから得られるアルカリプロテ
アーゼの場合、塩化ナトリウムの添加の際の溶液条件は
約4.0 〜7.5 のpH、約28℃〜32℃の温度、及び約8.0 〜
12.5%(重量/容積)の塩化ナトリウム濃度により特定
されることが更に好ましい。バチルス・リチェニホルミ
スの場合、溶液のpH範囲は約4.5 〜9.5 であり、温度及
び塩化ナトリウム濃度は上記とほぼ同じである。
【0011】本発明によりつくられた組成物は、高水準
の純度、例えば、酵素1g当たり0.65mg未満のガラクトシ
ルポリマー及び470nm で1.3 未満の吸光度により特定さ
れる色素含量の利点を特徴とし、またこれらの利点を有
する。また、これらの組成物は臭気、着色汚染及びアレ
ルゲン性のかなりの低下、並びに安定性の増加を特徴と
する。本発明が、更に別の目的及び付随の利点と一緒
に、下記の説明、図面、実施例、及び本明細書中の表を
参照して最も良く理解される。しかしながら、本発明は
これらに限定されるものではない。
の純度、例えば、酵素1g当たり0.65mg未満のガラクトシ
ルポリマー及び470nm で1.3 未満の吸光度により特定さ
れる色素含量の利点を特徴とし、またこれらの利点を有
する。また、これらの組成物は臭気、着色汚染及びアレ
ルゲン性のかなりの低下、並びに安定性の増加を特徴と
する。本発明が、更に別の目的及び付随の利点と一緒
に、下記の説明、図面、実施例、及び本明細書中の表を
参照して最も良く理解される。しかしながら、本発明は
これらに限定されるものではない。
【0012】本発明の好ましい実施態様によれば、減少
された多糖及びガラクトースポリマー含量を有する精製
されたアルカリプロテアーゼ溶液が調製される。詳細に
は、本発明はバチルス・リチェニホルミスまたはバチル
ス・アルカロフィルスの醗酵混合物を意図している。バ
チルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼの好適
な源は商品名オプチクリーン(OPTICLEAN、登録商標) と
して販売される製品であり、バチルス・リチェニホルミ
スアルカリプロテアーゼの好適な源は商品名オプチメー
ス(OPTIMASE 、登録商標) として販売される製品であ
り、これらの両方がインジアナ州、エルカートにあるソ
ルベイ・エンザイムス(SOLVAY ENZYMES)社から市販され
ている。
された多糖及びガラクトースポリマー含量を有する精製
されたアルカリプロテアーゼ溶液が調製される。詳細に
は、本発明はバチルス・リチェニホルミスまたはバチル
ス・アルカロフィルスの醗酵混合物を意図している。バ
チルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼの好適
な源は商品名オプチクリーン(OPTICLEAN、登録商標) と
して販売される製品であり、バチルス・リチェニホルミ
スアルカリプロテアーゼの好適な源は商品名オプチメー
ス(OPTIMASE 、登録商標) として販売される製品であ
り、これらの両方がインジアナ州、エルカートにあるソ
ルベイ・エンザイムス(SOLVAY ENZYMES)社から市販され
ている。
【0013】バチルス・アルカロフィルス株及びバチル
ス・リチェニホルミス株の培養に関して、通常、固体ま
たは液体の培地が使用され、これはアルカリ性緩衝液を
含むだけでなく、微生物の増殖に必要な成分、即ち、炭
素源、窒素源及び無機塩を含む。緩衝液は培地のpHを7.
0 〜10.0の水準に保つべきである。好適な炭素源は、マ
ンノース、フラクトース、マンニトール、マルトース、
セロビオース、蔗糖、デキストリン、澱粉、糖みつ、グ
ルコース、加水分解澱粉またはこれらの炭素源の二種以
上のブレンドを含む。使用し得る窒素源は、大豆粉、カ
ゼイン、コーンスティープリカー、綿実かす、利用可能
なタンパク質の酵素加水分解産物、乾燥酵母、酵母エキ
ス、魚粉、ジャガイモ粉またはこれらの窒素源の二種以
上のブレンドを含む。リン酸カリウム及び硫酸マグネシ
ウムが好適な塩を代表する。好適なアルカリ性緩衝剤の
例は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム及びテトラホウ酸ナトリウムを含
む。また、自動pH調節機構が、細菌株の増殖及び酵素の
生産に必要な種々のその他の有機または無機の物質の添
加により使用されてもよい。上記の成分を含む培地が通
常の方法で滅菌され、本発明の株の一種で接種される。
培養は振とうしながら、または通気攪拌下で、好ましく
は30℃〜40℃で30〜120 時間にわたって好気的に行われ
て培養液を得ることができる。
ス・リチェニホルミス株の培養に関して、通常、固体ま
たは液体の培地が使用され、これはアルカリ性緩衝液を
含むだけでなく、微生物の増殖に必要な成分、即ち、炭
素源、窒素源及び無機塩を含む。緩衝液は培地のpHを7.
0 〜10.0の水準に保つべきである。好適な炭素源は、マ
ンノース、フラクトース、マンニトール、マルトース、
セロビオース、蔗糖、デキストリン、澱粉、糖みつ、グ
ルコース、加水分解澱粉またはこれらの炭素源の二種以
上のブレンドを含む。使用し得る窒素源は、大豆粉、カ
ゼイン、コーンスティープリカー、綿実かす、利用可能
なタンパク質の酵素加水分解産物、乾燥酵母、酵母エキ
ス、魚粉、ジャガイモ粉またはこれらの窒素源の二種以
上のブレンドを含む。リン酸カリウム及び硫酸マグネシ
ウムが好適な塩を代表する。好適なアルカリ性緩衝剤の
例は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム及びテトラホウ酸ナトリウムを含
む。また、自動pH調節機構が、細菌株の増殖及び酵素の
生産に必要な種々のその他の有機または無機の物質の添
加により使用されてもよい。上記の成分を含む培地が通
常の方法で滅菌され、本発明の株の一種で接種される。
培養は振とうしながら、または通気攪拌下で、好ましく
は30℃〜40℃で30〜120 時間にわたって好気的に行われ
て培養液を得ることができる。
【0014】醗酵後に、微生物細胞と、残留醗酵原料を
含む懸濁固体が通常の分離技術により除去される。アル
カリプロテアーゼ溶液は、所望のプロテアーゼ活性が得
られるまで限外濾過を使用して濃縮アルカリプロテアー
ゼ溶液に濃縮される。好適な濃度はバチルス・リチェニ
ホルミスアルカリプロテアーゼに関して400DAPU/gmであ
り、バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ
に関して1,000,000DELFT単位/gである。
含む懸濁固体が通常の分離技術により除去される。アル
カリプロテアーゼ溶液は、所望のプロテアーゼ活性が得
られるまで限外濾過を使用して濃縮アルカリプロテアー
ゼ溶液に濃縮される。好適な濃度はバチルス・リチェニ
ホルミスアルカリプロテアーゼに関して400DAPU/gmであ
り、バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ
に関して1,000,000DELFT単位/gである。
【0015】限外濾過濃縮溶液はペクチナーゼ及びグル
コアミラーゼの如き加水分解酵素と合わされ、これらの
酵素は多糖不純物を加水分解するように作用する。加水
分解酵素は、オリゴ糖を含む多糖を加水分解する酵素、
例えば、アミラーゼ、αアミラーゼ、プルラナーゼ、ト
ランス−フェラーゼ、多糖ヒドロラーゼ、グリコシルヒ
ドロラーゼ、ガラクトシルヒドロラーゼ、ペクチナーゼ
及びグルコナーゼである。好適なヒドロラーゼの例は、
インジアナ州、エルカートにあるソルベイ・エンザイム
ス社から入手し得るクラレックス( CLAREX、登録商標)
ペクチナーゼ及びジアザイム(DIAZYME、登録商標)L-200
グルコアミラーゼである。
コアミラーゼの如き加水分解酵素と合わされ、これらの
酵素は多糖不純物を加水分解するように作用する。加水
分解酵素は、オリゴ糖を含む多糖を加水分解する酵素、
例えば、アミラーゼ、αアミラーゼ、プルラナーゼ、ト
ランス−フェラーゼ、多糖ヒドロラーゼ、グリコシルヒ
ドロラーゼ、ガラクトシルヒドロラーゼ、ペクチナーゼ
及びグルコナーゼである。好適なヒドロラーゼの例は、
インジアナ州、エルカートにあるソルベイ・エンザイム
ス社から入手し得るクラレックス( CLAREX、登録商標)
ペクチナーゼ及びジアザイム(DIAZYME、登録商標)L-200
グルコアミラーゼである。
【0016】加水分解酵素と同時に、塩化ナトリウムが
10.0%(重量/容積)の濃度まで添加される。その溶液
が約4.5 〜6.5 のpHに調節され、適当な期間にわたって
約28℃〜32℃の温度に保たれる。一般に、約48〜72時間
が種々の多糖及びオリゴ糖汚染物質の加水分解を可能に
するのに充分である。不規則な構造、及び/または種々
の程度の規則構造を有する無定形の沈殿を含む不均一混
合物を含む精製されたアルカリプロテアーゼは、その
後、解離された色素及びその他のガラクトシル不純物か
ら分離され、濾過により回収された。交差膜精密濾過が
この目的に優れた結果で使用された。規則構造または結
晶の程度は、適用される条件に依存する。
10.0%(重量/容積)の濃度まで添加される。その溶液
が約4.5 〜6.5 のpHに調節され、適当な期間にわたって
約28℃〜32℃の温度に保たれる。一般に、約48〜72時間
が種々の多糖及びオリゴ糖汚染物質の加水分解を可能に
するのに充分である。不規則な構造、及び/または種々
の程度の規則構造を有する無定形の沈殿を含む不均一混
合物を含む精製されたアルカリプロテアーゼは、その
後、解離された色素及びその他のガラクトシル不純物か
ら分離され、濾過により回収された。交差膜精密濾過が
この目的に優れた結果で使用された。規則構造または結
晶の程度は、適用される条件に依存する。
【0017】加水分解酵素及び塩化ナトリウムの添加に
続いて混合物を激しく攪拌し、沈殿の回収中に攪拌を続
けることが好ましい。種々の別の実施態様が可能であ
る。例えば、好ましい実施態様では、バチルス・アルカ
ロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼを使用す
る場合、固体の塩化ナトリウムが添加され、塩化ナトリ
ウム濃度は8.0 %〜12.5%(重量/容積)、最も好まし
くは10.0%(重量/容積)であるべきである。温度は一
般に20℃より高く、通常、約25℃より高く、好ましくは
約28℃〜32℃であるべきである。バチルス・リチェニホ
ルミスから得られるアルカリプロテアーゼを用いて処理
する場合、塩化ナトリウム濃度は一般に約2.5 %〜約2
0.0%(重量/容積)、通常、約7.5 %〜約15.0%(重
量/容積)、好ましくは約10.0%〜12.5(重量/容積)
であるべきである。
続いて混合物を激しく攪拌し、沈殿の回収中に攪拌を続
けることが好ましい。種々の別の実施態様が可能であ
る。例えば、好ましい実施態様では、バチルス・アルカ
ロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼを使用す
る場合、固体の塩化ナトリウムが添加され、塩化ナトリ
ウム濃度は8.0 %〜12.5%(重量/容積)、最も好まし
くは10.0%(重量/容積)であるべきである。温度は一
般に20℃より高く、通常、約25℃より高く、好ましくは
約28℃〜32℃であるべきである。バチルス・リチェニホ
ルミスから得られるアルカリプロテアーゼを用いて処理
する場合、塩化ナトリウム濃度は一般に約2.5 %〜約2
0.0%(重量/容積)、通常、約7.5 %〜約15.0%(重
量/容積)、好ましくは約10.0%〜12.5(重量/容積)
であるべきである。
【0018】加水分解中の混合物のpHは一般に6未満、
好ましくは5.5 未満に保たれるべきである。沈殿は、加
水分解とは別の工程で予備生成される場合、バチルス・
アルカロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼに
関して一般に約4.0 〜7.5 のpHに保たれるべきであり、
一方、バチルス・リチェニホルミスに関してpHは一般に
4.5 〜9.5 に保たれるべきである。好ましい実施態様で
は、pHは加水分解操作及び沈殿操作中に4.5 〜6.5 に保
たれる。
好ましくは5.5 未満に保たれるべきである。沈殿は、加
水分解とは別の工程で予備生成される場合、バチルス・
アルカロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼに
関して一般に約4.0 〜7.5 のpHに保たれるべきであり、
一方、バチルス・リチェニホルミスに関してpHは一般に
4.5 〜9.5 に保たれるべきである。好ましい実施態様で
は、pHは加水分解操作及び沈殿操作中に4.5 〜6.5 に保
たれる。
【0019】好適な加水分解酵素は澱粉及びペクチンを
加水分解する酵素を含み、これらの酵素はペクチナー
ゼ、グルコアミラーゼ、及びαアミラーゼを含む。これ
らの酵素は市販されている。一般に、これらの酵素はア
ルカリ性pH範囲では充分に作用せず、そして加水分解中
に比較的酸性のpHを保つことが必要である。望ましくな
いポリマー不純物は、細胞壁アニオン性ポリマー、ペプ
チドグリカン、及びガラクトースポリマー並びにその他
の多糖及びオリゴ糖汚染物質(これらはバチルス生物の
醗酵中に可溶化されるようになる)を含む。
加水分解する酵素を含み、これらの酵素はペクチナー
ゼ、グルコアミラーゼ、及びαアミラーゼを含む。これ
らの酵素は市販されている。一般に、これらの酵素はア
ルカリ性pH範囲では充分に作用せず、そして加水分解中
に比較的酸性のpHを保つことが必要である。望ましくな
いポリマー不純物は、細胞壁アニオン性ポリマー、ペプ
チドグリカン、及びガラクトースポリマー並びにその他
の多糖及びオリゴ糖汚染物質(これらはバチルス生物の
醗酵中に可溶化されるようになる)を含む。
【0020】酵素加水分解及び塩化ナトリウムの添加
は、連続して、または同時に行われてもよい。塩化ナト
リウムが加水分解に続いて添加される場合、その溶液は
加水分解及び沈殿中に一定のpH及び温度に保たれてもよ
い。一般に、加水分解に必要とされる48〜72時間の期間
が酵素−色素複合体の完全な解離及び精製されたアルカ
リプロテアーゼの塩析を可能にするのに充分である。し
かしながら、連続の加水分解−沈殿作用を含む実施態様
では、沈殿は48〜72時間で沈殿されて沈殿反応の完結を
可能にすべきである。色素−酵素複合体は塩化ナトリウ
ムの添加直後に解離されると考えられるが、沈殿反応は
完結するのに48〜72時間を要する。この実施態様は、精
製法中の異なる工程で広いpH範囲を選択する上で融通性
を与える。例えば、酵素加水分解中にpHを酸性範囲に保
つことが望ましいことがある(例えば、バチルス・アル
カロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼに関し
て、4.0 程度に低いpH値に保つことができ、バチルス・
リチェニホルミスからのアルカリプロテアーゼの場合、
pHは失活しないで約4.5 程度に低く保ち得る)が、沈殿
工程は更に高いpHで行われて高い沈殿率(%)の利点を
得ることができる(実施例5を参照のこと)。
は、連続して、または同時に行われてもよい。塩化ナト
リウムが加水分解に続いて添加される場合、その溶液は
加水分解及び沈殿中に一定のpH及び温度に保たれてもよ
い。一般に、加水分解に必要とされる48〜72時間の期間
が酵素−色素複合体の完全な解離及び精製されたアルカ
リプロテアーゼの塩析を可能にするのに充分である。し
かしながら、連続の加水分解−沈殿作用を含む実施態様
では、沈殿は48〜72時間で沈殿されて沈殿反応の完結を
可能にすべきである。色素−酵素複合体は塩化ナトリウ
ムの添加直後に解離されると考えられるが、沈殿反応は
完結するのに48〜72時間を要する。この実施態様は、精
製法中の異なる工程で広いpH範囲を選択する上で融通性
を与える。例えば、酵素加水分解中にpHを酸性範囲に保
つことが望ましいことがある(例えば、バチルス・アル
カロフィルスから得られるアルカリプロテアーゼに関し
て、4.0 程度に低いpH値に保つことができ、バチルス・
リチェニホルミスからのアルカリプロテアーゼの場合、
pHは失活しないで約4.5 程度に低く保ち得る)が、沈殿
工程は更に高いpHで行われて高い沈殿率(%)の利点を
得ることができる(実施例5を参照のこと)。
【0021】それにもかかわらず、加水分解及び塩化ナ
トリウムの添加を低いpHで同時に行うことが更に簡単で
あり、しかも同等に有効であると考えられる。示される
ように、アルカリプロテアーゼの自己分解活性は低いpH
水準、例えば、4.0 〜6.5 で最小であり、そして低いpH
に於ける沈殿率(%)の損失は酸性範囲のアルカリプロ
テアーゼの低下された自己分解活性による自己分解の低
下により補われるようであると考えられる。この方法に
よりつくられた精製されたアルカリプロテアーゼは一般
にかなり減少された量の不純物;例えば、470nm で1.3
未満の吸光度;酵素の1.0mg/g 未満、好ましくは酵素の
0.65mg/g未満のガラクトシルポリマー含量を有し、しか
も実質的に無定形であり、X線結晶学の如き通常の技術
により測定して40%未満、好ましくは20%未満の結晶構
造含量を示す。
トリウムの添加を低いpHで同時に行うことが更に簡単で
あり、しかも同等に有効であると考えられる。示される
ように、アルカリプロテアーゼの自己分解活性は低いpH
水準、例えば、4.0 〜6.5 で最小であり、そして低いpH
に於ける沈殿率(%)の損失は酸性範囲のアルカリプロ
テアーゼの低下された自己分解活性による自己分解の低
下により補われるようであると考えられる。この方法に
よりつくられた精製されたアルカリプロテアーゼは一般
にかなり減少された量の不純物;例えば、470nm で1.3
未満の吸光度;酵素の1.0mg/g 未満、好ましくは酵素の
0.65mg/g未満のガラクトシルポリマー含量を有し、しか
も実質的に無定形であり、X線結晶学の如き通常の技術
により測定して40%未満、好ましくは20%未満の結晶構
造含量を示す。
【0022】本発明の精神から逸脱しないで、別の実施
態様が意図されている。醗酵、分離、及び濃縮は当業界
で公知であり、通常の方法が所望の結果を得るのに使用
し得る。通常の分離技術が微生物細胞成分からのアルカ
リプロテアーゼと醗酵プロセス中に生じる懸濁固体を分
離するのに使用し得る。濾過、遠心分離、精密濾過、回
転真空濾過等が一般に充分である。アルカリプロテアー
ゼ溶液の濃縮は、限外濾過、蒸発、抽出、クロマトグラ
フィーまたは沈殿に続く再溶解を含む種々の通常の技術
のいずれかにより行われてもよい。沈殿後の収率を最適
にするためにプロテアーゼ溶液を濃縮することが望まし
い。未濃縮の溶液の使用は、精製されたアルカリプロテ
アーゼを回収するのに延長された沈殿時間を必要とす
る。アルカリプロテアーゼの回収は、遠心分離、真空ド
ラム濾過、加圧濾過または交差流式の膜精密濾過を含む
当業界で知られているあらゆる方法で行い得る。得られ
る“精製された" 酵素はガラクトシルポリマーを実質的
に含まない。
態様が意図されている。醗酵、分離、及び濃縮は当業界
で公知であり、通常の方法が所望の結果を得るのに使用
し得る。通常の分離技術が微生物細胞成分からのアルカ
リプロテアーゼと醗酵プロセス中に生じる懸濁固体を分
離するのに使用し得る。濾過、遠心分離、精密濾過、回
転真空濾過等が一般に充分である。アルカリプロテアー
ゼ溶液の濃縮は、限外濾過、蒸発、抽出、クロマトグラ
フィーまたは沈殿に続く再溶解を含む種々の通常の技術
のいずれかにより行われてもよい。沈殿後の収率を最適
にするためにプロテアーゼ溶液を濃縮することが望まし
い。未濃縮の溶液の使用は、精製されたアルカリプロテ
アーゼを回収するのに延長された沈殿時間を必要とす
る。アルカリプロテアーゼの回収は、遠心分離、真空ド
ラム濾過、加圧濾過または交差流式の膜精密濾過を含む
当業界で知られているあらゆる方法で行い得る。得られ
る“精製された" 酵素はガラクトシルポリマーを実質的
に含まない。
【0023】本発明の変化に於いて、精製されたアルカ
リプロテアーゼ溶液の調製法が特定される。本発明の一
つの好ましい実施態様は下記の方法により製造された精
製されたアルカリプロテアーゼを伴う。バチルス・リチ
ェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスが好適
な醗酵培地中で培養される。醗酵後に、微生物細胞と、
残留醗酵原料を含む種々の懸濁固体が除去される。残り
のアルカリプロテアーゼ溶液は、所望のプロテアーゼ活
性が得られるまで限外濾過を使用して濃縮アルカリプロ
テアーゼ溶液に更に濃縮される。
リプロテアーゼ溶液の調製法が特定される。本発明の一
つの好ましい実施態様は下記の方法により製造された精
製されたアルカリプロテアーゼを伴う。バチルス・リチ
ェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスが好適
な醗酵培地中で培養される。醗酵後に、微生物細胞と、
残留醗酵原料を含む種々の懸濁固体が除去される。残り
のアルカリプロテアーゼ溶液は、所望のプロテアーゼ活
性が得られるまで限外濾過を使用して濃縮アルカリプロ
テアーゼ溶液に更に濃縮される。
【0024】濃縮アルカリプロテアーゼ溶液は約5.0 の
pH及び約30℃の温度に調節され、そして塩化ナトリウム
が約10.5%(重量/容積)の最終濃度まで添加される。
沈殿反応の完結を可能にするために、得られるインキュ
ベーション混合物が約48〜72時間の期間にわたってイン
キュベートされる。次いで、精製されたアルカリプロテ
アーゼ沈殿が上澄みから分離され、交差流式の膜精密濾
過により回収される。アルカリプロテアーゼはアルカリ
性pH範囲、即ち、約pH8.5 〜11.0で最高の活性を示す。
図1及び実施例10に示されるように、自己分解は更に高
いpHで増加し、低下された収率を生じたことが明らかで
ある。酵素精製回収系の最高の効率を得るためには、タ
ンパク質分解活性、ひいては自己分解活性を調節するい
ずれかの系が可逆性であることが必要である。
pH及び約30℃の温度に調節され、そして塩化ナトリウム
が約10.5%(重量/容積)の最終濃度まで添加される。
沈殿反応の完結を可能にするために、得られるインキュ
ベーション混合物が約48〜72時間の期間にわたってイン
キュベートされる。次いで、精製されたアルカリプロテ
アーゼ沈殿が上澄みから分離され、交差流式の膜精密濾
過により回収される。アルカリプロテアーゼはアルカリ
性pH範囲、即ち、約pH8.5 〜11.0で最高の活性を示す。
図1及び実施例10に示されるように、自己分解は更に高
いpHで増加し、低下された収率を生じたことが明らかで
ある。酵素精製回収系の最高の効率を得るためには、タ
ンパク質分解活性、ひいては自己分解活性を調節するい
ずれかの系が可逆性であることが必要である。
【0025】種々のバチルスアルカリプロテアーゼの沈
殿は当該の特定のタンパク質の等電pH、表面の疎水性、
及び培地中に存在するあらゆる不純物(ポリマー)に関
して変化する。本件出願人は、これらのバチルスから得
られるアルカリプロテアーゼ分子の間の相違が著しいと
考える。例えば、プリースト(PRIEST)らの下記の文献に
よれば、バチルス属は5以上のクラスター群に帰属し得
る推定種ランクのかなり多い80の分類群を包含すること
が現在実証されている。これらは現在の属を再度特定
し、それを幾つかの属に分けるための枠組み構造(frame
work) として使用されるべきである。例えば、クラスタ
ー群B2はクラスター14(バチルス・アミロリクエファシ
エンス)、クラスター15(枯草菌)、クラスター15(バ
チルス・リチェニホルミス)及びクラスター24(バチル
ス・フィルムス(Bacillus firmus))を含む。クラスター
群Cはクラスター25(バチルス・フィルムス)を含み、
一方、クラスター群Eはクラスター44(バチルス・レン
タス(Bacillus lentus))を含む。バチルス・フィルムス
及びバチルス・レンタスは好アルカリ性の種である。プ
リースト,F.G.,グッドフェロー(GOODFELLOW),M. 及びト
ッド(TODD),C.,A Numerical Classification of the Ge
nus Bacillus,Journal of General Microbiology 134,1
847-1882頁(1988)。
殿は当該の特定のタンパク質の等電pH、表面の疎水性、
及び培地中に存在するあらゆる不純物(ポリマー)に関
して変化する。本件出願人は、これらのバチルスから得
られるアルカリプロテアーゼ分子の間の相違が著しいと
考える。例えば、プリースト(PRIEST)らの下記の文献に
よれば、バチルス属は5以上のクラスター群に帰属し得
る推定種ランクのかなり多い80の分類群を包含すること
が現在実証されている。これらは現在の属を再度特定
し、それを幾つかの属に分けるための枠組み構造(frame
work) として使用されるべきである。例えば、クラスタ
ー群B2はクラスター14(バチルス・アミロリクエファシ
エンス)、クラスター15(枯草菌)、クラスター15(バ
チルス・リチェニホルミス)及びクラスター24(バチル
ス・フィルムス(Bacillus firmus))を含む。クラスター
群Cはクラスター25(バチルス・フィルムス)を含み、
一方、クラスター群Eはクラスター44(バチルス・レン
タス(Bacillus lentus))を含む。バチルス・フィルムス
及びバチルス・レンタスは好アルカリ性の種である。プ
リースト,F.G.,グッドフェロー(GOODFELLOW),M. 及びト
ッド(TODD),C.,A Numerical Classification of the Ge
nus Bacillus,Journal of General Microbiology 134,1
847-1882頁(1988)。
【0026】また、種々のアルカリプロテアーゼの性質
の相違がホリコシら著、好アルカリ性微生物、表6.1 、
25頁(1982)に良く説明されている。異なるバチルス種か
らの精製された酵素のHPLCパターンが、これらの種、即
ち、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・
リチェニホルミス及びバチルス・アルカロフィルスの間
の著しい相違を示す。
の相違がホリコシら著、好アルカリ性微生物、表6.1 、
25頁(1982)に良く説明されている。異なるバチルス種か
らの精製された酵素のHPLCパターンが、これらの種、即
ち、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・
リチェニホルミス及びバチルス・アルカロフィルスの間
の著しい相違を示す。
【0027】本発明の実施態様の一つに従って調製され
た濃縮アルカリプロテアーゼ固体または溶液は、アルカ
リプロテアーゼが固体形態または液体形態のいずれかで
使用される全ての用途に有益である。これらの製剤は、
液体溶液、固体、グラニュール、粉末またはスラリーで
ある最終製品にすることができる。特に、それらは洗濯
洗剤及びスポット・リムーバー(spot remover)中に使用
でき、コンタクトレンズ酵素洗浄系として使用でき、な
めし中に脱毛剤として使用でき、タンパク質加水分解産
物の調製のために食品工業で使用でき、そして不完全抗
体の検出のための血清試験操作で使用できる。
た濃縮アルカリプロテアーゼ固体または溶液は、アルカ
リプロテアーゼが固体形態または液体形態のいずれかで
使用される全ての用途に有益である。これらの製剤は、
液体溶液、固体、グラニュール、粉末またはスラリーで
ある最終製品にすることができる。特に、それらは洗濯
洗剤及びスポット・リムーバー(spot remover)中に使用
でき、コンタクトレンズ酵素洗浄系として使用でき、な
めし中に脱毛剤として使用でき、タンパク質加水分解産
物の調製のために食品工業で使用でき、そして不完全抗
体の検出のための血清試験操作で使用できる。
【0028】それは洗剤及びクレンザー中に使用するの
に特に有利である。何となれば、本発明により調製され
たアルカリプロテアーゼは低下された色素含量を有し、
こうして低下されたレベルの曇り形成、臭気及び着色汚
染を有するからである。更に、本発明の実施態様により
調製されたアルカリプロテアーゼ製剤中のガラクトシル
ポリマーのアレルゲン性の除去は、コンタクトレンズ製
品、並びに食品、飼料及び洗剤工業のその他の商業用途
に特に有益である。下記の実施例、関連の表、及び図面
は本発明を更に説明することを目的とする。しかしなが
ら、本発明はこれらの特別な実施例またはその中に示さ
れた実施態様に限定されないことが理解される。
に特に有利である。何となれば、本発明により調製され
たアルカリプロテアーゼは低下された色素含量を有し、
こうして低下されたレベルの曇り形成、臭気及び着色汚
染を有するからである。更に、本発明の実施態様により
調製されたアルカリプロテアーゼ製剤中のガラクトシル
ポリマーのアレルゲン性の除去は、コンタクトレンズ製
品、並びに食品、飼料及び洗剤工業のその他の商業用途
に特に有益である。下記の実施例、関連の表、及び図面
は本発明を更に説明することを目的とする。しかしなが
ら、本発明はこれらの特別な実施例またはその中に示さ
れた実施態様に限定されないことが理解される。
【0029】
【実施例】実施例1 塩化ナトリウムの異なる濃度の効果 アルカリプロテアーゼを適当な培地中でバチルス・リチ
ェニホルミスの液中培養の醗酵ブロースから生成した。
醗酵後に、微生物細胞と懸濁固体を遠心分離及び/また
は真空ドラム濾過の如き通常の手段によりアルカリプロ
テアーゼから分離した。次いで、得られたアルカリプロ
テアーゼ溶液を限外濾過を使用して濃縮した。異なる量
の塩化ナトリウムを、限外濾過で濃縮したアルカリプロ
テアーゼ溶液のアリコート40mlに添加し、活性を550 の
洗剤アルカリ性タンパク質単位/ml(DAPU/ml) に調節し
た。10%の酢酸を使用してpHを5.5 に調節し、処理試料
を蒸留水で50mlに希釈し、37℃で3時間インキュベート
した。対照試料を5℃に保った。特定の時間後に、溶液
を遠心分離して沈殿した酵素を上澄みから分離した。透
明な濾液を全タンパク質及び酵素活性に関して分析した
(表1)。
ェニホルミスの液中培養の醗酵ブロースから生成した。
醗酵後に、微生物細胞と懸濁固体を遠心分離及び/また
は真空ドラム濾過の如き通常の手段によりアルカリプロ
テアーゼから分離した。次いで、得られたアルカリプロ
テアーゼ溶液を限外濾過を使用して濃縮した。異なる量
の塩化ナトリウムを、限外濾過で濃縮したアルカリプロ
テアーゼ溶液のアリコート40mlに添加し、活性を550 の
洗剤アルカリ性タンパク質単位/ml(DAPU/ml) に調節し
た。10%の酢酸を使用してpHを5.5 に調節し、処理試料
を蒸留水で50mlに希釈し、37℃で3時間インキュベート
した。対照試料を5℃に保った。特定の時間後に、溶液
を遠心分離して沈殿した酵素を上澄みから分離した。透
明な濾液を全タンパク質及び酵素活性に関して分析した
(表1)。
【0030】精製されたアルカリプロテアーゼ沈殿中の
全タンパク質の量、ひいては沈殿した全タンパク質の比
率(%)を、タンパク質−色素結合法[ブラッドフォー
ド(BRADFORD),Anal.Biochem,72,248(1976)]を使用して
測定した。タンパク質溶液のアリコート(0.1ml) を試験
管にピペットで入れ、タンパク質−色素(バイオ・ラド
(BIO RAD))試薬5mlをそれに添加し、続いて内容物を渦
流混合した。5分後に、595nm に於ける吸光度を、水0.
1 ml及びタンパク質−色素試薬5mlから調製した試薬ブ
ランクに対して測定した。次いでタンパク質の量をウシ
γグロブリンにより作成した標準曲線から測定した。
全タンパク質の量、ひいては沈殿した全タンパク質の比
率(%)を、タンパク質−色素結合法[ブラッドフォー
ド(BRADFORD),Anal.Biochem,72,248(1976)]を使用して
測定した。タンパク質溶液のアリコート(0.1ml) を試験
管にピペットで入れ、タンパク質−色素(バイオ・ラド
(BIO RAD))試薬5mlをそれに添加し、続いて内容物を渦
流混合した。5分後に、595nm に於ける吸光度を、水0.
1 ml及びタンパク質−色素試薬5mlから調製した試薬ブ
ランクに対して測定した。次いでタンパク質の量をウシ
γグロブリンにより作成した標準曲線から測定した。
【0031】精製されたバチルス・リチェニホルミスア
ルカリプロテアーゼ生成物中に存在するアルカリプロテ
アーゼの比率(%)を40℃、pH8.5(ホウ酸塩緩衝液)に
於けるカゼイン基質の加水分解に基くアッセイにより測
定した。加水分解されなかったカゼインをトリクロロ酢
酸で沈殿させ、遠心分離により除去した。トリクロロ酢
酸塩可溶性のカゼイン−加水分解物の吸光度を275nm で
分光光度計で測定した。洗剤アルカリプロテアーゼ1単
位(DAPU)は、アッセイの条件下で毎分4マイクロモルの
当量のチロシンを遊離する活性である。上澄み液の全ア
ルカリプロテアーゼ活性値(DAPU)を、沈殿しなかった対
照と比較して、溶液から沈殿された精製前の全アルカリ
プロテアーゼの比率(%)を測定した。バチルス・アル
カロフィルスから得られたアルカリプロテアーゼに関し
て、そのアッセイをpH8.7 のホウ酸塩緩衝液中で行っ
た。酵素活性は、下記のように定義されるDELFT に基
く。酵素製剤の2%溶液1mlが試験条件下で0.400 の吸
光度の差を生じる場合、その酵素製剤は1000DELFT 単位
のプロテアーゼ活性を有する。
ルカリプロテアーゼ生成物中に存在するアルカリプロテ
アーゼの比率(%)を40℃、pH8.5(ホウ酸塩緩衝液)に
於けるカゼイン基質の加水分解に基くアッセイにより測
定した。加水分解されなかったカゼインをトリクロロ酢
酸で沈殿させ、遠心分離により除去した。トリクロロ酢
酸塩可溶性のカゼイン−加水分解物の吸光度を275nm で
分光光度計で測定した。洗剤アルカリプロテアーゼ1単
位(DAPU)は、アッセイの条件下で毎分4マイクロモルの
当量のチロシンを遊離する活性である。上澄み液の全ア
ルカリプロテアーゼ活性値(DAPU)を、沈殿しなかった対
照と比較して、溶液から沈殿された精製前の全アルカリ
プロテアーゼの比率(%)を測定した。バチルス・アル
カロフィルスから得られたアルカリプロテアーゼに関し
て、そのアッセイをpH8.7 のホウ酸塩緩衝液中で行っ
た。酵素活性は、下記のように定義されるDELFT に基
く。酵素製剤の2%溶液1mlが試験条件下で0.400 の吸
光度の差を生じる場合、その酵素製剤は1000DELFT 単位
のプロテアーゼ活性を有する。
【0032】
【表1】 塩化ナトリウム濃度の効果 塩化ナトリウム 濃度 タンパク質 酵素活性 w/v mg/ ml沈殿した比率(%)DAPU/ ml沈殿した比率(%) 対照、5℃、3時間 66.0 0 559.5 0 対照、37℃、3時間 66.2 0 560.0 0 2.5 %のNaCl 53.2 19.4 390.5 30.3 5.0 %のNaCl 42.4 35.8 287.8 48.6 7.5 %のNaCl 36.0 45.5 245.8 56.1 10.0%のNaCl 33.6 49.1 218.2 61.0 12.5%のNaCl 27.6 58.2 198.3 64.6 15.0%のNaCl 34.0 48.5 238.7 57.4 20.0%のNaCl 35.6 46.1 258.8 53.8
【0033】pH5.5 、37℃で3時間のアルカリプロテア
ーゼのインキュベーションは酵素の安定性に影響しなか
った。しかしながら、塩化ナトリウムの添加は酵素の沈
殿を生じた。また、塩化ナトリウムの濃度を増すにつれ
て酵素の沈殿が増加し、酵素の最大の沈殿が12.5%(重
量/容積)の塩化ナトリウムの量で起こった。
ーゼのインキュベーションは酵素の安定性に影響しなか
った。しかしながら、塩化ナトリウムの添加は酵素の沈
殿を生じた。また、塩化ナトリウムの濃度を増すにつれ
て酵素の沈殿が増加し、酵素の最大の沈殿が12.5%(重
量/容積)の塩化ナトリウムの量で起こった。
【0034】実施例2 温度の効果 別個の試料を種々の温度(表2)でインキュベートした
以外は実質的に実施例1に従ってこの実施例のプロテア
ーゼ溶液を調製した。
以外は実質的に実施例1に従ってこの実施例のプロテア
ーゼ溶液を調製した。
【0035】
【表2】 温度の効果 タンパク質 酵素活性 試験 mg/ ml沈殿した比率(%)DAPU/ ml沈殿酵素の比率(% ) 対照、NaCl無添加 66.4 0 559.5 0 15%のNaCl、5℃ 66.4 0 559.0 0 15%のNaCl、10℃ 64.8 0 566.6 0 15%のNaCl、23℃ 65.6 0 568.5 0 15%のNaCl、30℃ 66.0 0 541.5 3.2 15%のNaCl、37℃ 59.2 11 467.1 16.5 15%のNaCl、45℃ 36.4 45.2 240.8 57.0
【0036】温度は沈殿の程度に強い影響を明らかに有
する。pH5.5 及び15.0%(重量/容積)の塩化ナトリウ
ムの濃度で、温度が30℃に達するまでアルカリプロテア
ーゼの沈殿は起こらなかった。実質的な沈殿は37℃以上
で起こった。実施例3 低温に於ける塩化ナトリウムの効果 アルカリプロテアーゼの分離に関する塩化ナトリウムの
効果を12日までにわたって5℃及び10℃の温度で研究し
た。バチルス・リチェニホルミスから得られたアルカリ
プロテアーゼ濃厚物の50mlの二種の溶液−300DAPU/g 及
び600DAPU/g 並びにバチルス・アルカロフィルスから得
られたアルカリプロテアーゼの50mlの二種の溶液−500,
000DELFT単位/g及び1,000,000DELFT単位/gに、固体の塩
化ナトリウムを10%(重量/容積)の最終濃度まで添加
し、pHをpH5.5 に調節した。次いで試料を5℃及び10℃
に保ち、毎日の間隔で酵素沈殿について調べた。酵素の
沈殿は12日までいずれの温度でも生じなかった。塩化ナ
トリウムは低温では可溶性の不純物からのバチルス・リ
チェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスから
得られたアルカリプロテアーゼの沈殿/分離を生じるの
に有効ではなく、一方、20℃より高いインキュベーショ
ン温度は実施例2のように数時間でアルカリプロテアー
ゼの分離/沈殿を生じる。
する。pH5.5 及び15.0%(重量/容積)の塩化ナトリウ
ムの濃度で、温度が30℃に達するまでアルカリプロテア
ーゼの沈殿は起こらなかった。実質的な沈殿は37℃以上
で起こった。実施例3 低温に於ける塩化ナトリウムの効果 アルカリプロテアーゼの分離に関する塩化ナトリウムの
効果を12日までにわたって5℃及び10℃の温度で研究し
た。バチルス・リチェニホルミスから得られたアルカリ
プロテアーゼ濃厚物の50mlの二種の溶液−300DAPU/g 及
び600DAPU/g 並びにバチルス・アルカロフィルスから得
られたアルカリプロテアーゼの50mlの二種の溶液−500,
000DELFT単位/g及び1,000,000DELFT単位/gに、固体の塩
化ナトリウムを10%(重量/容積)の最終濃度まで添加
し、pHをpH5.5 に調節した。次いで試料を5℃及び10℃
に保ち、毎日の間隔で酵素沈殿について調べた。酵素の
沈殿は12日までいずれの温度でも生じなかった。塩化ナ
トリウムは低温では可溶性の不純物からのバチルス・リ
チェニホルミスまたはバチルス・アルカロフィルスから
得られたアルカリプロテアーゼの沈殿/分離を生じるの
に有効ではなく、一方、20℃より高いインキュベーショ
ン温度は実施例2のように数時間でアルカリプロテアー
ゼの分離/沈殿を生じる。
【0037】実施例4 酵素分離の速度に関する温度の効果 10%のNaClを含むバチルス・アルカロフィルスアルカリ
プロテアーゼ(オプチクリーン、登録商標)限外濾過濃
厚物(1,043,900DELFT 単位/g),pH5.5 を24℃、30℃また
は40℃でインキュベートした(一定の攪拌)。試料(10
ml) を種々の時間の間隔(6時間、12時間、24時間、32
時間及び48時間) で取り出し、遠心分離して沈殿酵素を
分離した。次いで上澄みを活性に関して分析した(図
2)。
プロテアーゼ(オプチクリーン、登録商標)限外濾過濃
厚物(1,043,900DELFT 単位/g),pH5.5 を24℃、30℃また
は40℃でインキュベートした(一定の攪拌)。試料(10
ml) を種々の時間の間隔(6時間、12時間、24時間、32
時間及び48時間) で取り出し、遠心分離して沈殿酵素を
分離した。次いで上澄みを活性に関して分析した(図
2)。
【0038】実施例5 pHの効果 バチルス・リチェニホルミス アルカリプロテアーゼ(オ
プチメース、商標)濃厚物の活性を、醗酵混合物から細
胞及び懸濁固体を除去し、得られるアルカリプロテアー
ゼ溶液を限外濾過により濃縮することにより研究した。
得られるアルカリプロテアーゼ濃厚物を500DAPU/mlの活
性に調節した。塩化ナトリウムを12.5%(重量/容積)
の濃度まで添加し、10%の酢酸(1+2滴)を使用して
pHを7.5、7.0 、6.5 、6.0 、5.5 及び5.0 に調節し
た。処理した試料を37℃で3時間インキュベートし、遠
心分離した。全タンパク質及び酵素活性を測定した(表
3)。
プチメース、商標)濃厚物の活性を、醗酵混合物から細
胞及び懸濁固体を除去し、得られるアルカリプロテアー
ゼ溶液を限外濾過により濃縮することにより研究した。
得られるアルカリプロテアーゼ濃厚物を500DAPU/mlの活
性に調節した。塩化ナトリウムを12.5%(重量/容積)
の濃度まで添加し、10%の酢酸(1+2滴)を使用して
pHを7.5、7.0 、6.5 、6.0 、5.5 及び5.0 に調節し
た。処理した試料を37℃で3時間インキュベートし、遠
心分離した。全タンパク質及び酵素活性を測定した(表
3)。
【0039】
【表3】 バチルス・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼの沈殿に関するpHの効果 タンパク質 酵素活性 pH mg/ ml沈殿した比率(%)DAPU/ ml沈殿した酵素の比率(%) 対照 64.4 0 507.0 0 pH5.0 43.2 33.0 325.0 36.0 pH5.5 37.5 41.8 251.0 50.5 pH6.0 25.8 60.0 167.0 67.1 pH6.5 21.0 67.4 128.0 74.8 pH7.0 16.4 75.2 104.0 79.5 pH7.5 11.8 81.7 75.0 85.2
【0040】37℃に於ける塩化ナトリウムの存在下のア
ルカリプロテアーゼの沈殿に関するpHの効果は著しかっ
た。酵素沈殿の比率(%)はpHを増加することによりpH
5.0の36%の酵素沈殿に較べてpH7.5 で3時間で85%以
上まで増加した。実施例6 インキュベーション時間の効果 600DAPU/mlの活性のバチルス・リチェニホルミスアルカ
リプロテアーゼ(オプチメース、登録商標)限外濾過濃
厚物の400 mlのアリコートを二つの異なるビーカーに移
し、塩化ナトリウム61.25gを添加した。次いで溶液のpH
を6.0 及び7.5に別々に調節し、500 mlに希釈し、37℃
でインキュベートした。試料(50 ml) を種々の時間の間
隔で取り出した。沈殿したタンパク質を20分間の20,000
rpm に於ける遠心分離により上澄みから分離した。全タ
ンパク質及び酵素活性を測定した(表4)。
ルカリプロテアーゼの沈殿に関するpHの効果は著しかっ
た。酵素沈殿の比率(%)はpHを増加することによりpH
5.0の36%の酵素沈殿に較べてpH7.5 で3時間で85%以
上まで増加した。実施例6 インキュベーション時間の効果 600DAPU/mlの活性のバチルス・リチェニホルミスアルカ
リプロテアーゼ(オプチメース、登録商標)限外濾過濃
厚物の400 mlのアリコートを二つの異なるビーカーに移
し、塩化ナトリウム61.25gを添加した。次いで溶液のpH
を6.0 及び7.5に別々に調節し、500 mlに希釈し、37℃
でインキュベートした。試料(50 ml) を種々の時間の間
隔で取り出した。沈殿したタンパク質を20分間の20,000
rpm に於ける遠心分離により上澄みから分離した。全タ
ンパク質及び酵素活性を測定した(表4)。
【0041】
【表4】 バチルス・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼの沈殿に関するインキュベ ーション時間の効果 試料 タンパク質 酵素活性 pH 明細 mg/ ml沈殿した比率(%)DAPU/ ml沈殿した酵素の比率(%) 6.0 0時間 40.0 0 312.0 0 6.0 1時間 36.0 9.0 232.9 25.4 6.0 2時間 26.0 34.0 168.2 46.1 6.0 4時間 18.6 53.0 120.3 61.4 6.0 6時間 14.4 64.0 93.2 70.1 7.5 0時間 37.0 0 276.0 0 7.5 1時間 11.2 70.0 71.2 74.2 7.5 2時間 7.6 79.0 48.3 82.5 7.5 4時間 5.6 85.0 35.6 87.1 7.5 6時間 4.8 87.0 30.5 89.0
【0042】大きな比率のアルカリプロテアーゼが6時
間後に沈殿中に見られた。アルカリプロテアーゼの沈殿
の程度及び速度はタンパク質溶液のpHに依存した(表
4)。沈殿の速度は酵素の等電点付近で速くなると考え
られ、これはバチルス・リチェニホルミスからのアルカ
リプロテアーゼの場合には約8.2 〜8.5 である。実施例7 アルカリプロテアーゼからの色素の解離に関する塩化ナ
トリウムの効果 バチルス・リチェニホルミス アルカリプロテアーゼ(オ
プチメース、登録商標)限外濾過濃厚物の100 mlのアリ
コートを分離するために、塩化ナトリウムを10%(重量
/容積)の最終濃度まで添加した。10%のNaOHを使用し
て試料のpHを7.5 に調節し、37℃で4時間インキュベー
トした。沈殿したアルカリプロテアーゼを20,000rpm で
20分間遠心分離することにより分離した。次いで沈殿を
50%のプロピレングリコール(100ml) に溶解した。全タ
ンパク質、酵素活性及び470nm に於ける着色(“色
素”)を測定した。比較のため、アルカリプロテアーゼ
を同じ条件下で65%(重量/容積)の硫酸アンモニウム
及び25%(重量/容積)の硫酸ナトリウムで沈殿させた
(表5)。
間後に沈殿中に見られた。アルカリプロテアーゼの沈殿
の程度及び速度はタンパク質溶液のpHに依存した(表
4)。沈殿の速度は酵素の等電点付近で速くなると考え
られ、これはバチルス・リチェニホルミスからのアルカ
リプロテアーゼの場合には約8.2 〜8.5 である。実施例7 アルカリプロテアーゼからの色素の解離に関する塩化ナ
トリウムの効果 バチルス・リチェニホルミス アルカリプロテアーゼ(オ
プチメース、登録商標)限外濾過濃厚物の100 mlのアリ
コートを分離するために、塩化ナトリウムを10%(重量
/容積)の最終濃度まで添加した。10%のNaOHを使用し
て試料のpHを7.5 に調節し、37℃で4時間インキュベー
トした。沈殿したアルカリプロテアーゼを20,000rpm で
20分間遠心分離することにより分離した。次いで沈殿を
50%のプロピレングリコール(100ml) に溶解した。全タ
ンパク質、酵素活性及び470nm に於ける着色(“色
素”)を測定した。比較のため、アルカリプロテアーゼ
を同じ条件下で65%(重量/容積)の硫酸アンモニウム
及び25%(重量/容積)の硫酸ナトリウムで沈殿させた
(表5)。
【0043】
【表5】 アルカリプロテアーゼの沈殿及び色素の除去に関する種々の方法の比較 タンパク質 酵素活性 色素 処理 mg/ ml沈殿した プロテアーゼ 沈殿した酵素 470nm に 除去率 比率(%)DAPU/ ml の比率(%) 於けるOD % 対照 54 0 381 0 2.16 0 硫酸アンモ ニウム 51 94 341 90 2.30 0 (65 %w/v) 硫酸ナトリ ウム 50 93 349 92 1.54 29 (22 %w/v) 塩化ナトリ ウム 49 91 338 89 0.52 76 (10 %w/v)
【0044】表5中のデータは、その他の通常のタンパ
ク質を沈殿させる塩と同様にアルカリプロテアーゼを沈
殿させる塩化ナトリウムの成功した使用を示す。更に、
塩化ナトリウムによる沈殿は硫酸ナトリウム及び硫酸ア
ンモニウムに対して色素を除去する点で優れた効率を達
成した。実施例8 酵素加水分解による多糖の減少 アルカリプロテアーゼは40℃未満の温度で10%のNaClの
存在下で4.5 より高いpHで最大の安定性を示した。澱粉
及びペクチンを加水分解する幾つかの市販の酵素を試験
した。ペクチン加水分解性(pectinolytic)酵素クラレッ
クス(CLAREX 、登録商標)(インジアナ州、エルカート
にあるソルベイ・エンザイムス社からのペクチナーゼ)
及びグルコアミラーゼジアザイム(登録商標)L-200
(インジアナ州、エルカートにあるソルベイ・エンザイ
ムス社からのグルコアミラーゼ)は、30〜40℃でpH4.5
〜5.5 でアルカリプロテアーゼ濃厚物中でガラクトシル
ポリマー及び残留澱粉の加水分解を生じた。
ク質を沈殿させる塩と同様にアルカリプロテアーゼを沈
殿させる塩化ナトリウムの成功した使用を示す。更に、
塩化ナトリウムによる沈殿は硫酸ナトリウム及び硫酸ア
ンモニウムに対して色素を除去する点で優れた効率を達
成した。実施例8 酵素加水分解による多糖の減少 アルカリプロテアーゼは40℃未満の温度で10%のNaClの
存在下で4.5 より高いpHで最大の安定性を示した。澱粉
及びペクチンを加水分解する幾つかの市販の酵素を試験
した。ペクチン加水分解性(pectinolytic)酵素クラレッ
クス(CLAREX 、登録商標)(インジアナ州、エルカート
にあるソルベイ・エンザイムス社からのペクチナーゼ)
及びグルコアミラーゼジアザイム(登録商標)L-200
(インジアナ州、エルカートにあるソルベイ・エンザイ
ムス社からのグルコアミラーゼ)は、30〜40℃でpH4.5
〜5.5 でアルカリプロテアーゼ濃厚物中でガラクトシル
ポリマー及び残留澱粉の加水分解を生じた。
【0045】オプチクリーン(商標)(バチルス・アル
カロフィルスアルカリプロテアーゼ)の限外濾過濃厚物
100gに、ペクチナーゼ2.5g及びグルコアミラーゼ0.25g
を添加した。次いでその溶液をpH5.2 に調節し、30℃に
保った。試料(5g)を種々の時間の間隔で取り出し、ガラ
クトシルポリマー含量を測定した。次いで、遊離したガ
ラクトースをHPLC分析により測定した。上記の実施例か
らのバチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ
5gに、20%(重量/容積)のトリクロロ酢酸5mlを混合
しながら徐々に添加してタンパク質を沈殿させた。氷中
で30分間放置した後、その混合物を遠心分離した(15,0
00rpm,20分間、SS-34 ローター)。上澄みを透明な管に
デカントして除き、試薬等級のアルコール(20 ml) を混
合しながら添加した。室温で30分放置した後、管を遠心
分離し(10,000rpm 、10分間) 、上澄みを捨てた。ペレ
ットを0.1Mの酢酸塩緩衝液、pH4.0(4.95ml) に再度溶解
した。これにクラレックス(登録商標)ペクチナーゼ
(0.25 ml) を添加し、その混合物を60℃で2時間インキ
ュベートした。この時間の後に、4Nの硫酸(25 μl)を添
加して反応を停止した。反応混合物を濾過し(0.45μ)
、下記の遊離ガラクトースの定量のために高性能液体
クロマトグラフィー測定装置に注入した。また、基質ブ
ランク及び酵素ブランクを試験した。含まれる全ガラク
トシルポリマーを酸加水分解法により測定した。
カロフィルスアルカリプロテアーゼ)の限外濾過濃厚物
100gに、ペクチナーゼ2.5g及びグルコアミラーゼ0.25g
を添加した。次いでその溶液をpH5.2 に調節し、30℃に
保った。試料(5g)を種々の時間の間隔で取り出し、ガラ
クトシルポリマー含量を測定した。次いで、遊離したガ
ラクトースをHPLC分析により測定した。上記の実施例か
らのバチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ
5gに、20%(重量/容積)のトリクロロ酢酸5mlを混合
しながら徐々に添加してタンパク質を沈殿させた。氷中
で30分間放置した後、その混合物を遠心分離した(15,0
00rpm,20分間、SS-34 ローター)。上澄みを透明な管に
デカントして除き、試薬等級のアルコール(20 ml) を混
合しながら添加した。室温で30分放置した後、管を遠心
分離し(10,000rpm 、10分間) 、上澄みを捨てた。ペレ
ットを0.1Mの酢酸塩緩衝液、pH4.0(4.95ml) に再度溶解
した。これにクラレックス(登録商標)ペクチナーゼ
(0.25 ml) を添加し、その混合物を60℃で2時間インキ
ュベートした。この時間の後に、4Nの硫酸(25 μl)を添
加して反応を停止した。反応混合物を濾過し(0.45μ)
、下記の遊離ガラクトースの定量のために高性能液体
クロマトグラフィー測定装置に注入した。また、基質ブ
ランク及び酵素ブランクを試験した。含まれる全ガラク
トシルポリマーを酸加水分解法により測定した。
【0046】ガラクトシルポリマー及び残留澱粉は、タ
ンパク質を酸で沈殿させ、上澄みを100 ℃で24時間イン
キュベートして多糖を加水分解し、高性能液体クロマト
グラフィーにより加水分解物のガラクトース及びグルコ
ース含量を測定することにより測定し得る。例えば、バ
チルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ試料
(活性は1,000,000DELFT単位/mlである)5mlに、H2O
5mlを添加し、混合し、次いで濃塩酸1mlを徐々に注意
して添加する。その混合物を遠心分離し(15,000rpm,20
分間、SS-34 ローター)、次いで上澄みをスクリュー・
キャップ試験管にデカントする。100 ℃のオーブンに24
時間入れる。この時間の後に、加水分解物を移動相で1:
1 に希釈し、0.45μのフィルターで濾過し、高性能液体
クロマトグラフィーにより分析する。既知濃度のガラク
トース及びグルコースを使用して検出器を較正する。ガラクトシルポリマー加水分解物のHPLC分析 条件:カラム HPX-87H(バイオ・ラド) 移動相 0.01N のH2SO4 温度 60℃ 流量 0.7 ml/分 試料容積 20μl 検出器 屈折率
ンパク質を酸で沈殿させ、上澄みを100 ℃で24時間イン
キュベートして多糖を加水分解し、高性能液体クロマト
グラフィーにより加水分解物のガラクトース及びグルコ
ース含量を測定することにより測定し得る。例えば、バ
チルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ試料
(活性は1,000,000DELFT単位/mlである)5mlに、H2O
5mlを添加し、混合し、次いで濃塩酸1mlを徐々に注意
して添加する。その混合物を遠心分離し(15,000rpm,20
分間、SS-34 ローター)、次いで上澄みをスクリュー・
キャップ試験管にデカントする。100 ℃のオーブンに24
時間入れる。この時間の後に、加水分解物を移動相で1:
1 に希釈し、0.45μのフィルターで濾過し、高性能液体
クロマトグラフィーにより分析する。既知濃度のガラク
トース及びグルコースを使用して検出器を較正する。ガラクトシルポリマー加水分解物のHPLC分析 条件:カラム HPX-87H(バイオ・ラド) 移動相 0.01N のH2SO4 温度 60℃ 流量 0.7 ml/分 試料容積 20μl 検出器 屈折率
【0047】
【表6】 ガラクトシルポリマー含量の減少に関するペクチナーゼ/グルコアミラーゼの 効果 インキュベーション時間(時間) 減少率(%) 0 6 94.0 12 95.1 24 96.5 48 96.6 72 97.2
【0048】バチルス・アルカロフィルス限外濾過濃厚
物の加水分解酵素処理は、ガラクトースを含むポリマー
のかなりの減少をもたらした。塩化ナトリウムによる加
水分解酵素処理した限外濾過濃厚物のバチルス・アルカ
ロフィルスアルカリプロテアーゼ(オプチクリーン、登
録商標)沈殿は、ガラクトースポリマーを実質的に含ま
ないオプチクリーン(登録商標)を生じた。条件が許す
交差流式の膜濾過によりアルカリプロテアーゼ沈殿を回
収することが好ましい。この操作は、検出可能な量のガ
ラクトシルポリマーを含まず、しかもかなり減少された
色素含量(例えば、470nm に於ける吸光度は1.3 未満で
ある)を有する高度に精製されたアルカリプロテアーゼ
(バチルス・アルカロフィルスから)を生じる。この結
果は1,000,000DELFT単位/g の活性を有する酵素濃厚物
に基く。
物の加水分解酵素処理は、ガラクトースを含むポリマー
のかなりの減少をもたらした。塩化ナトリウムによる加
水分解酵素処理した限外濾過濃厚物のバチルス・アルカ
ロフィルスアルカリプロテアーゼ(オプチクリーン、登
録商標)沈殿は、ガラクトースポリマーを実質的に含ま
ないオプチクリーン(登録商標)を生じた。条件が許す
交差流式の膜濾過によりアルカリプロテアーゼ沈殿を回
収することが好ましい。この操作は、検出可能な量のガ
ラクトシルポリマーを含まず、しかもかなり減少された
色素含量(例えば、470nm に於ける吸光度は1.3 未満で
ある)を有する高度に精製されたアルカリプロテアーゼ
(バチルス・アルカロフィルスから)を生じる。この結
果は1,000,000DELFT単位/g の活性を有する酵素濃厚物
に基く。
【0049】実施例9 種々のハロゲン化ナトリウムの効果 アルカリプロテアーゼ限外濾過濃厚物(403DAPU/ml,48.
3g/l) の100 mlのアリコートを分離するため、フッ化ナ
トリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム及びヨウ化
ナトリウムを0.5Mの最終濃度まで添加した。2NのNaOHを
使用して溶液のpHを7.5 に調節した。次いで、種々の塩
を含むアルカリプロテアーゼ溶液を37℃で4時間インキ
ュベートした。次いで沈殿を5℃で16,000rpm で20分間
遠心分離することにより上澄みから分離し、そのペレッ
トを50%のプロピレングリコール溶液(100ml) に溶解し
た。全タンパク質及びペレットの酵素活性を測定した
(表7)。
3g/l) の100 mlのアリコートを分離するため、フッ化ナ
トリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム及びヨウ化
ナトリウムを0.5Mの最終濃度まで添加した。2NのNaOHを
使用して溶液のpHを7.5 に調節した。次いで、種々の塩
を含むアルカリプロテアーゼ溶液を37℃で4時間インキ
ュベートした。次いで沈殿を5℃で16,000rpm で20分間
遠心分離することにより上澄みから分離し、そのペレッ
トを50%のプロピレングリコール溶液(100ml) に溶解し
た。全タンパク質及びペレットの酵素活性を測定した
(表7)。
【0050】
【表7】 ハロゲン化ナトリウムの効果 ハロゲン化 タンパク質 プロテアーゼ活性 ナトリウム mg/ ml 沈殿した比率(%)DAPU/ ml 沈殿した酵素の比率(%) (0.5M) --- 59.0 0 403.0 0 フッ化ナト リウム 0.8 1.4 3.0 0.7 塩化ナトリ ウム 45.0 76.4 302.5 75.0 臭化ナトリ ウム 8.0 14.0 54.0 13.4 ヨウ化ナトリウム 2.3 3.9 15.6 3.9
【0051】塩化ナトリウムは、試験したハロゲン化物
の中で最良の沈殿剤であることがわかった。また、酵素
の沈殿はハロゲン原子に特有のいずれの性質にも起因し
得ないことが明らかである。実際に、フッ化ナトリウム
及びヨウ化ナトリウムが使用された場合に酵素の沈殿は
実質的に生じなかった。また、塩化マグネシウム及び塩
化カリウムは塩化ナトリウムと同様にアルカリプロテア
ーゼの沈殿を生じ、一方、塩化カルシウムは同じ条件下
でアルカリプロテアーゼ沈殿に効果がなかった。
の中で最良の沈殿剤であることがわかった。また、酵素
の沈殿はハロゲン原子に特有のいずれの性質にも起因し
得ないことが明らかである。実際に、フッ化ナトリウム
及びヨウ化ナトリウムが使用された場合に酵素の沈殿は
実質的に生じなかった。また、塩化マグネシウム及び塩
化カリウムは塩化ナトリウムと同様にアルカリプロテア
ーゼの沈殿を生じ、一方、塩化カルシウムは同じ条件下
でアルカリプロテアーゼ沈殿に効果がなかった。
【0052】実施例10 37℃に於けるアルカリプロテアーゼの水中の安定性に関
するpHの効果 アルカリプロテアーゼ濃厚物100 ml(430DAPU/ ml) を、
20%(重量/容積)の酢酸を使用してpH6.5 、6.0 及び
5.0 に調節した。これらの溶液を0.45μのフィルターに
より濾過した(低温滅菌)。次いで試料を37℃に保ち、
アリコート(10ml) を種々の時間の間隔で取り出し、直
ちに凍結して反応を停止した。溶液のpHを8%の水酸化
ナトリウムの添加により維持した。37℃に於ける酵素の
水中の安定性に関するpHの効果を、試料のプロテアーゼ
活性を測定することにより測定した。酵素のタンパク質
分解の程度を、遊離アミノ基の量の増加を測定すること
により測定した。図1に示されたデータは、酵素の水中
の安定性が溶液の次第に増加するpHにより低下すること
を示す。酵素活性の損失(実線)は遊離アミノ基含量の
増加(点線)と相関関係がある。アルカリプロテアーゼ
のインキュベーション中の遊離アミノ基含量の増加は酵
素のタンパク質分解を強く示唆する。pH6.5で37℃で24
時間にわたるアルカリプロテアーゼのインキュベーショ
ンは酵素活性の約50%の損失を生じ、一方、pH5.0 のイ
ンキュベーションはわずかに20%の酵素活性の損失を生
じた。
するpHの効果 アルカリプロテアーゼ濃厚物100 ml(430DAPU/ ml) を、
20%(重量/容積)の酢酸を使用してpH6.5 、6.0 及び
5.0 に調節した。これらの溶液を0.45μのフィルターに
より濾過した(低温滅菌)。次いで試料を37℃に保ち、
アリコート(10ml) を種々の時間の間隔で取り出し、直
ちに凍結して反応を停止した。溶液のpHを8%の水酸化
ナトリウムの添加により維持した。37℃に於ける酵素の
水中の安定性に関するpHの効果を、試料のプロテアーゼ
活性を測定することにより測定した。酵素のタンパク質
分解の程度を、遊離アミノ基の量の増加を測定すること
により測定した。図1に示されたデータは、酵素の水中
の安定性が溶液の次第に増加するpHにより低下すること
を示す。酵素活性の損失(実線)は遊離アミノ基含量の
増加(点線)と相関関係がある。アルカリプロテアーゼ
のインキュベーション中の遊離アミノ基含量の増加は酵
素のタンパク質分解を強く示唆する。pH6.5で37℃で24
時間にわたるアルカリプロテアーゼのインキュベーショ
ンは酵素活性の約50%の損失を生じ、一方、pH5.0 のイ
ンキュベーションはわずかに20%の酵素活性の損失を生
じた。
【0053】タンパク質試料の合計の遊離アミノ基含量
を、R.フィールズ(FIELDS),Methodsin Enzymology,25
巻,465(1972)に記載された方法に従ってトリニトロベン
ゼンスルホン酸(TNBS)を使用して測定した。アミノ基を
含む試料をホウ酸塩緩衝液(0.1MのNaOH中0.1MのNa2B4O
7 1リットル)0.5 mlに添加し、容積を1.0 mlにした。
次いで1.1MのTNBS溶液0.02mlを添加し、その溶液を迅速
に混合した。5分後に、1.5 mMの亜硫酸塩を含む0.1Mの
Na2H2PO42mlを添加することにより反応を停止し、420n
m に於ける吸光度を測定した。また、ブランクを調製し
た。アミノ基の量を、グリセリンを使用して作成した標
準曲線を基準にして測定した。
を、R.フィールズ(FIELDS),Methodsin Enzymology,25
巻,465(1972)に記載された方法に従ってトリニトロベン
ゼンスルホン酸(TNBS)を使用して測定した。アミノ基を
含む試料をホウ酸塩緩衝液(0.1MのNaOH中0.1MのNa2B4O
7 1リットル)0.5 mlに添加し、容積を1.0 mlにした。
次いで1.1MのTNBS溶液0.02mlを添加し、その溶液を迅速
に混合した。5分後に、1.5 mMの亜硫酸塩を含む0.1Mの
Na2H2PO42mlを添加することにより反応を停止し、420n
m に於ける吸光度を測定した。また、ブランクを調製し
た。アミノ基の量を、グリセリンを使用して作成した標
準曲線を基準にして測定した。
【0054】実施例11 アルカリ性pHに於けるアルカリプロテアーゼの沈殿に関
する塩化ナトリウムの効果 アルカリ性pH領域に於ける塩化ナトリウムによるアルカ
リプロテアーゼの沈殿を試験した(pH<7.0)。バチルス
・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼ(オプチメー
ス、登録商標)(1037DAPU/g) 及びバチルス・アルカロ
フィルスアルカリプロテアーゼ(オプチクリーン、登録
商標)(1,102,000DELFT単位/g) の限外濾過濃厚物各1
リットルに、ペクチナーゼ及びグルコアミラーゼを添加
した。10%の酢酸を使用して溶液のpHを5.0 に調節し、
30℃で6時間インキュベートした。インキュベーション
中に、溶液を絶えず攪拌した。特定の時間後に、試料各
100gを10%の水酸化ナトリウムで種々のpH、即ち、5.5
、6.5 、7.5 、8.5 、及び9.5 に調節し、固体の塩化
ナトリウムを10%(重量/容積)の最終濃度まで添加し
た。次いでその混合物を一定に攪拌しながら30℃で48時
間インキュベートした。沈殿した酵素を遠心分離により
分離した。次いで沈殿をプロピレングリコール(60 %の
プロピレングリコール100g) に溶解し、酵素活性を測定
した(表8)。
する塩化ナトリウムの効果 アルカリ性pH領域に於ける塩化ナトリウムによるアルカ
リプロテアーゼの沈殿を試験した(pH<7.0)。バチルス
・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼ(オプチメー
ス、登録商標)(1037DAPU/g) 及びバチルス・アルカロ
フィルスアルカリプロテアーゼ(オプチクリーン、登録
商標)(1,102,000DELFT単位/g) の限外濾過濃厚物各1
リットルに、ペクチナーゼ及びグルコアミラーゼを添加
した。10%の酢酸を使用して溶液のpHを5.0 に調節し、
30℃で6時間インキュベートした。インキュベーション
中に、溶液を絶えず攪拌した。特定の時間後に、試料各
100gを10%の水酸化ナトリウムで種々のpH、即ち、5.5
、6.5 、7.5 、8.5 、及び9.5 に調節し、固体の塩化
ナトリウムを10%(重量/容積)の最終濃度まで添加し
た。次いでその混合物を一定に攪拌しながら30℃で48時
間インキュベートした。沈殿した酵素を遠心分離により
分離した。次いで沈殿をプロピレングリコール(60 %の
プロピレングリコール100g) に溶解し、酵素活性を測定
した(表8)。
【0055】
【表8】 アルカリ性pHに於けるアルカリプロテアーゼの沈殿に関する塩化ナトリウムの 効果 沈殿率(%) 沈殿のpH バチルス・リチェニホルミス バチルス・アルカロフィルス (オプチメース、登録商標) (オプチクリーン、登録商標) 5.5 98 91 6.5 95 67 7.5 95 14 8.5 100 4 9.5 95 0
【0056】塩化ナトリウムの不在下でpH5.0 、30℃で
6時間にわたる加水分解酵素によるアルカリプロテアー
ゼ限外濾過濃厚物のインキュベーションは酵素活性の約
20〜25の損失(自己分解)を生じた。表8中の結果は、
バチルス・リチェニホルミス(オプチメース、登録商
標)からのアルカリプロテアーゼがアルカリ性pH領域pH
7.5 〜9.5 で塩化ナトリウムにより沈殿され、一方、バ
チルス・アルカロフィリス(オプチクリーン、登録商
標)の場合には酵素の分離が酸性pHのみで起こることを
示した。塩化ナトリウムによる二種のアルカリプロテア
ーゼ間の沈殿挙動の顕著な相違は、異種のバチルス菌か
らのアルカリプロテアーゼがおそらく機能上または構造
上等しくないことを更に実証する。
6時間にわたる加水分解酵素によるアルカリプロテアー
ゼ限外濾過濃厚物のインキュベーションは酵素活性の約
20〜25の損失(自己分解)を生じた。表8中の結果は、
バチルス・リチェニホルミス(オプチメース、登録商
標)からのアルカリプロテアーゼがアルカリ性pH領域pH
7.5 〜9.5 で塩化ナトリウムにより沈殿され、一方、バ
チルス・アルカロフィリス(オプチクリーン、登録商
標)の場合には酵素の分離が酸性pHのみで起こることを
示した。塩化ナトリウムによる二種のアルカリプロテア
ーゼ間の沈殿挙動の顕著な相違は、異種のバチルス菌か
らのアルカリプロテアーゼがおそらく機能上または構造
上等しくないことを更に実証する。
【0057】実施例12 バチルス・リチェニホルミス及びバチルス・アルカロフ
ィルスの酸安定性に関する塩化ナトリウムの効果 バチルス・リチェニホルミス アルカリプロテアーゼ及び
バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ(オ
プチメース、登録商標−1037DAPU/g及びオプチクリー
ン、登録商標−1,217,500DELFT単位/g) 各90g に、塩化
ナトリウムを10%の濃度まで添加し、pHを4.0 、4.5 、
5.0 及びpH5.5 に調節した。クラレックス(登録商標)
Lペクチナーゼ(1.0 %容積/容積)及びジアザイム
(登録商標)L-200 グルコアミラーゼ(0.25 %容積/容
積)を添加し(1.0 %容積/容積)、30℃で48時間イン
キュベートした。特定の時間後に、沈殿したアルカリプ
ロテアーゼを15,000rpm で5℃で45分間にわたって遠心
分離により分離した。次いで沈殿を60%のプロピレング
リコール(pH5.2)に溶解した。酵素活性を測定した(表
9)。
ィルスの酸安定性に関する塩化ナトリウムの効果 バチルス・リチェニホルミス アルカリプロテアーゼ及び
バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ(オ
プチメース、登録商標−1037DAPU/g及びオプチクリー
ン、登録商標−1,217,500DELFT単位/g) 各90g に、塩化
ナトリウムを10%の濃度まで添加し、pHを4.0 、4.5 、
5.0 及びpH5.5 に調節した。クラレックス(登録商標)
Lペクチナーゼ(1.0 %容積/容積)及びジアザイム
(登録商標)L-200 グルコアミラーゼ(0.25 %容積/容
積)を添加し(1.0 %容積/容積)、30℃で48時間イン
キュベートした。特定の時間後に、沈殿したアルカリプ
ロテアーゼを15,000rpm で5℃で45分間にわたって遠心
分離により分離した。次いで沈殿を60%のプロピレング
リコール(pH5.2)に溶解した。酵素活性を測定した(表
9)。
【0058】
【表9】 酸性pHに於ける沈殿中のバチルス・リチェニホルミス及びバチルス・アルカロ フィルスから得られたアルカリプロテアーゼの安定性に関する塩化ナトリウムの 効果 バチルス・リチェニホルミス バチルス・アルカロフィルス アルカリプロテアーゼ アルカリプロテアーゼ pH DAPU/g 沈殿率(%) DELFT 単位/g 沈殿率(%) 4.0 821 88 1,071,000 97.7 4.5 858 92 1,072,000 97.8 5.0 878 94 1,085,000 99.05.5 794 85 915,000 84.0
【0059】上記の表からわかるように、二種の酵素に
よる沈殿挙動は種々のpH水準で異なっていた。詳しく
は、バチルス・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼ
はpH4.5 〜5.0 のpH範囲で最大の沈殿を示し、一方、バ
チルス・アルカロフィルスは4.0 〜5.0 のpHの更に広い
範囲で最大の沈殿を示した。これらの結果の比較は酸性
pH、高温に於ける塩化ナトリウムの添加によるアルカリ
プロテアーゼ安定性の強化を示す。
よる沈殿挙動は種々のpH水準で異なっていた。詳しく
は、バチルス・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼ
はpH4.5 〜5.0 のpH範囲で最大の沈殿を示し、一方、バ
チルス・アルカロフィルスは4.0 〜5.0 のpHの更に広い
範囲で最大の沈殿を示した。これらの結果の比較は酸性
pH、高温に於ける塩化ナトリウムの添加によるアルカリ
プロテアーゼ安定性の強化を示す。
【0060】実施例13 10%の塩化ナトリウムの存在下のバチルス・アルカロフ
ィルスアルカリプロテアーゼの溶解性に関する温度の効
果 5℃のバチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアー
ゼ(オプチクリーン、登録商標)限外濾過濃厚物500g
に、固体の塩化ナトリウムを10%(重量/容積)の最終
濃度まで添加した。pHをpH5.5 に調節した。次いで試料
を30時間にわたって5℃、24℃(室温)、30℃、35℃及
び40℃でインキュベートした。この時間後に、試料(20
g) を取り出し、15,000rpm で遠心分離した。酵素沈殿
に関する温度の効果を、上澄みの酵素活性を測定するこ
とにより測定した。インキュベートした試料の残りの80
g に、プロピレングリコール80g を添加し、室温で16時
間攪拌した。次いでアルカリプロテアーゼの安定性を、
酵素活性を測定することにより測定した。バチルス・ア
ルカロフィルスアルカリプロテアーゼの溶解性及び安定
性に関する温度の効果を表10に示す。
ィルスアルカリプロテアーゼの溶解性に関する温度の効
果 5℃のバチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアー
ゼ(オプチクリーン、登録商標)限外濾過濃厚物500g
に、固体の塩化ナトリウムを10%(重量/容積)の最終
濃度まで添加した。pHをpH5.5 に調節した。次いで試料
を30時間にわたって5℃、24℃(室温)、30℃、35℃及
び40℃でインキュベートした。この時間後に、試料(20
g) を取り出し、15,000rpm で遠心分離した。酵素沈殿
に関する温度の効果を、上澄みの酵素活性を測定するこ
とにより測定した。インキュベートした試料の残りの80
g に、プロピレングリコール80g を添加し、室温で16時
間攪拌した。次いでアルカリプロテアーゼの安定性を、
酵素活性を測定することにより測定した。バチルス・ア
ルカロフィルスアルカリプロテアーゼの溶解性及び安定
性に関する温度の効果を表10に示す。
【0061】
【表10】 バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼの溶解性及び安定性に関す る温度の効果 バチルス・アルカロフィルス 温度 安定性 アルカリプロテアーゼの初期の活性 ℃ DELFT 単位/g 損失、% DELFT 単位/g 上澄み、% 沈殿 5 489,000 0 1,030,800 1,030,800 0 24 465,200 4.3 184,600 82.1 30 472,300 3.5 112,500 89.1 35 467,700 4.4 62,000 94.040 489,000 0.1 78,900 92.4
【0062】上記の表中のデータは、バチルス・アルカ
ロフィルスアルカリプロテアーゼが40℃で30時間にわた
って10%のNaClの存在下でpH5.5 で安定であることを示
した。また、酵素の分離は温度の上昇につれて増大する
ことを注目することが重要である。酵素の90%より多く
が30℃より上で沈殿された。実施例14 バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ沈殿
の交差流式の膜濾過(精密濾過) 精密濾過と普通称される交差流式の膜濾過は、不溶性の
固体を分離するための次第に増加しつつある普通の技術
になってきている。交差流の系の自制操作は一般に遠心
分離に較べて問題が少ないと考えられる。交差流式の濾
過は実質的にケークを生成しない方法である。交差流式
の濾過は適度に遅い回転真空濾過及び/またはフィルタ
ープレスよりも経済的であり得ることが示唆されていた
(ビートン(BEATON),N.C.1980,Appl. of Ultrafiltrati
on to Ferment.Prod.,Polymer Science Technol.Plenu
m,N.Y.13)。高い透過流量、67〜118 リットル/m2/時間
が細菌懸濁液の濃縮中に可能である[ヘンリー(HENRY),
J.D.,Cross Flow Filtration,Recent Dvpts.,Sep.Scien
ce リー(Li),N.M.(編集),CRC Press 2,205(1972) ]。
回転ドラム濾過またはフィルタープレス濾過は、アレル
ギー反応を生じることがある酵素を含むエーロゾルの発
生のためにアルカリプロテアーゼの処理中に不溶性物質
を分離するのに好ましい方法ではない。精密濾過は単位
操作であり得るので、デッドエンド濾過法の固有の問題
は存在しない。こうして、精密濾過はアルカリプロテア
ーゼを大規模の操作で処理する場合に付加的な環境上の
安全をもたらす。
ロフィルスアルカリプロテアーゼが40℃で30時間にわた
って10%のNaClの存在下でpH5.5 で安定であることを示
した。また、酵素の分離は温度の上昇につれて増大する
ことを注目することが重要である。酵素の90%より多く
が30℃より上で沈殿された。実施例14 バチルス・アルカロフィルスアルカリプロテアーゼ沈殿
の交差流式の膜濾過(精密濾過) 精密濾過と普通称される交差流式の膜濾過は、不溶性の
固体を分離するための次第に増加しつつある普通の技術
になってきている。交差流の系の自制操作は一般に遠心
分離に較べて問題が少ないと考えられる。交差流式の濾
過は実質的にケークを生成しない方法である。交差流式
の濾過は適度に遅い回転真空濾過及び/またはフィルタ
ープレスよりも経済的であり得ることが示唆されていた
(ビートン(BEATON),N.C.1980,Appl. of Ultrafiltrati
on to Ferment.Prod.,Polymer Science Technol.Plenu
m,N.Y.13)。高い透過流量、67〜118 リットル/m2/時間
が細菌懸濁液の濃縮中に可能である[ヘンリー(HENRY),
J.D.,Cross Flow Filtration,Recent Dvpts.,Sep.Scien
ce リー(Li),N.M.(編集),CRC Press 2,205(1972) ]。
回転ドラム濾過またはフィルタープレス濾過は、アレル
ギー反応を生じることがある酵素を含むエーロゾルの発
生のためにアルカリプロテアーゼの処理中に不溶性物質
を分離するのに好ましい方法ではない。精密濾過は単位
操作であり得るので、デッドエンド濾過法の固有の問題
は存在しない。こうして、精密濾過はアルカリプロテア
ーゼを大規模の操作で処理する場合に付加的な環境上の
安全をもたらす。
【0063】濾過助剤(ケイソウ土)の添加がデッドエ
ンド濾過中に必要とされ、これが固体の廃棄物となる。
精密濾過は穏やかな技術であり、化学添加剤または濾過
助剤を必要としない。バチルス・アルカロフィルスアル
カリプロテアーゼ限外濾過濃厚物(1,086,000DELFT単位
/g)200リットルに、塩化ナトリウムを10%(重量/容
積)の最終濃度まで添加した。グルコアミラーゼ(クレ
ラックス(登録商標)1.0 %(容積/容積))及びペクチ
ナーゼ(ジアザイム(登録商標)L-200 0.25%(容積/
容積))を添加した。pHをpH5.2 に調節し、30℃で48時間
インキュベートした。沈殿した酵素を、精密濾過(コー
チ(KOCH)#603,-4"カートリッジ、0.1 μの細孔サイズ;
米国、マサチューセッツ01887-3388、ウィルミントン、
メインストリート850 にあるコーチ・メンブラン・シス
テムズ(KOCH MEMBRANE SYSTEMS) 社)を使用して母液か
ら分離した。濃縮スラリーを10%の塩化ナトリウム溶液
で2回充分に濾過して色素及びその他の可溶性不純物を
除去した。充分に濾過した後に、10%の塩化カルシウム
を含む70%のプロピレングリコールを循環することによ
り酵素をプロピレングリコールに溶解した。その方法は
低着色(98%の減少)でガラクトシルポリマーを実質的
に含まないアルカリプロテアーゼの80%以上の回収をも
たらした。
ンド濾過中に必要とされ、これが固体の廃棄物となる。
精密濾過は穏やかな技術であり、化学添加剤または濾過
助剤を必要としない。バチルス・アルカロフィルスアル
カリプロテアーゼ限外濾過濃厚物(1,086,000DELFT単位
/g)200リットルに、塩化ナトリウムを10%(重量/容
積)の最終濃度まで添加した。グルコアミラーゼ(クレ
ラックス(登録商標)1.0 %(容積/容積))及びペクチ
ナーゼ(ジアザイム(登録商標)L-200 0.25%(容積/
容積))を添加した。pHをpH5.2 に調節し、30℃で48時間
インキュベートした。沈殿した酵素を、精密濾過(コー
チ(KOCH)#603,-4"カートリッジ、0.1 μの細孔サイズ;
米国、マサチューセッツ01887-3388、ウィルミントン、
メインストリート850 にあるコーチ・メンブラン・シス
テムズ(KOCH MEMBRANE SYSTEMS) 社)を使用して母液か
ら分離した。濃縮スラリーを10%の塩化ナトリウム溶液
で2回充分に濾過して色素及びその他の可溶性不純物を
除去した。充分に濾過した後に、10%の塩化カルシウム
を含む70%のプロピレングリコールを循環することによ
り酵素をプロピレングリコールに溶解した。その方法は
低着色(98%の減少)でガラクトシルポリマーを実質的
に含まないアルカリプロテアーゼの80%以上の回収をも
たらした。
【0064】実施例15 実施例14の精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物をグ
ラニュールにした。使用した方法はグッドらの“Dust f
ree Particulate Enzyme Formulation" と題する米国特
許第4,689,297 号(1987 年、8月25日)(これは参考とし
て含まれる)に記載された方法である。典型的な実験で
は、下記の組成物を使用した。精製されたバチルス・ア
ルカロフィルスアルカリプロテアーゼ濃厚物、43.6%の
DS、5.5X106DU/g 、100 %のDSB 酵素配合。物質 乾燥固体ベース、% 操作 酵素沈殿 67.1 酵素溶液を26%DSまで希釈し (5,500,000 DU/g) 、ウースター(WURSTER) イン イコノール 15.4 サートを使用してユニ・グラ ポリビニルアルコール 7.7 ット(UNI GLATT) 中でNaCl アトゲル(atgel) 9.8 1000g に噴霧被覆した。
ラニュールにした。使用した方法はグッドらの“Dust f
ree Particulate Enzyme Formulation" と題する米国特
許第4,689,297 号(1987 年、8月25日)(これは参考とし
て含まれる)に記載された方法である。典型的な実験で
は、下記の組成物を使用した。精製されたバチルス・ア
ルカロフィルスアルカリプロテアーゼ濃厚物、43.6%の
DS、5.5X106DU/g 、100 %のDSB 酵素配合。物質 乾燥固体ベース、% 操作 酵素沈殿 67.1 酵素溶液を26%DSまで希釈し (5,500,000 DU/g) 、ウースター(WURSTER) イン イコノール 15.4 サートを使用してユニ・グラ ポリビニルアルコール 7.7 ット(UNI GLATT) 中でNaCl アトゲル(atgel) 9.8 1000g に噴霧被覆した。
【0065】 化粧用配合 物質 乾燥固体ベース、% 操作 TiO2 60 化粧用スラリーを30%DSまで タルク 15 希釈し、ウースターインサー ポリビニルアルコール 11 トを使用してユニ・グラット イコノール 14 中で酵素被覆NaClに噴霧被覆 した。化粧用固体17%w/w(最 終製品基準) で被覆した後、 グラニュールを篩分けた(-20 +60)。 この配合は、粒状洗剤配合中の使用、及びその他の使用
に望ましい性質を有する許容できる噴霧被覆された製品
を生じた。
に望ましい性質を有する許容できる噴霧被覆された製品
を生じた。
【0066】実施例16 実施例14の精製された沈殿濃厚物を使用して下記の配合
に従って、かつ記載された操作に従ってマラムス(marum
s)をつくった。精製されたバチルス・アルカロフィルス
アルカリプロテアーゼ濃厚物、49.6%の乾燥固形分、3.
1X106DELFT単位/g、81.7%の乾燥固体ベースの酵素結晶
/19 %の乾燥固体ベースのFW2 。 マラムス配合 物質 乾燥固体ベース、% 操作 ベントナイト 27.6 全ての不溶性物質を乾式混 BW-300 24.7 合した。可溶性物質をスラ ポリエチレングリコール 15.3 リーに混合した。スラリー (PEG-3350) と不溶性物質を23%の含水 カオリン 5.2 量で一緒にブレンドした。 Na2SO4 1.8 その混合物を0.7mm のダイ ポリエチレングリコール 0.9 で押出し、ユニ・グラット (PEG-8000) 流動床乾燥機中で乾燥した プロピレングリコール 0.9 酵素結晶 19.1 ケイソウ土 4.5 (FW2) 添加したH2O 5
に従って、かつ記載された操作に従ってマラムス(marum
s)をつくった。精製されたバチルス・アルカロフィルス
アルカリプロテアーゼ濃厚物、49.6%の乾燥固形分、3.
1X106DELFT単位/g、81.7%の乾燥固体ベースの酵素結晶
/19 %の乾燥固体ベースのFW2 。 マラムス配合 物質 乾燥固体ベース、% 操作 ベントナイト 27.6 全ての不溶性物質を乾式混 BW-300 24.7 合した。可溶性物質をスラ ポリエチレングリコール 15.3 リーに混合した。スラリー (PEG-3350) と不溶性物質を23%の含水 カオリン 5.2 量で一緒にブレンドした。 Na2SO4 1.8 その混合物を0.7mm のダイ ポリエチレングリコール 0.9 で押出し、ユニ・グラット (PEG-8000) 流動床乾燥機中で乾燥した プロピレングリコール 0.9 酵素結晶 19.1 ケイソウ土 4.5 (FW2) 添加したH2O 5
【0067】実施例17 バチルス・リチェニホルミスアルカリプロテアーゼの沈
殿に関するpHの効果 表11に示されるように、優れた収率(%)が4.0 〜4.5
のpH範囲で得られた。これらの値は5.3 〜5.5 のpH範囲
の沈殿収率に対してかなりの改良である。
殿に関するpHの効果 表11に示されるように、優れた収率(%)が4.0 〜4.5
のpH範囲で得られた。これらの値は5.3 〜5.5 のpH範囲
の沈殿収率に対してかなりの改良である。
【0068】
【表11】 バチルス・リチェニホルミスから得られたアルカリプロテアーゼの沈殿に関す るpHの効果 試験 沈殿した際のpH 沈殿した酵素の比率(%) 1 5.3-5.5 87.8 2 5.3-5.5 89.6 3 5.3-5.5 86.9 4 5.3-5.5 88.0 平均88.08 5 4.5 97.9 6 4.5 95.3 7 4.0 98.5 平均97.2
【図1】37℃に於けるバチルス・リチェニホルミスから
のアルカリプロテアーゼの自己分解に関するpHの効果の
グラフ図である。横軸は37℃の温度に於けるインキュベ
ーション時間(時間)を表す。左側の縦軸はAP-L(プロ
テアーゼ)活性の損失(%)を表し、それは実線で表さ
れる。右側の縦軸は遊離アミノ基含量の増加(%)を表
し、それは点線で表される。
のアルカリプロテアーゼの自己分解に関するpHの効果の
グラフ図である。横軸は37℃の温度に於けるインキュベ
ーション時間(時間)を表す。左側の縦軸はAP-L(プロ
テアーゼ)活性の損失(%)を表し、それは実線で表さ
れる。右側の縦軸は遊離アミノ基含量の増加(%)を表
し、それは点線で表される。
【図2】pH5.5 、10%の塩化ナトリウム(重量/容積)
に於けるバチルス・アルカロフィルスから得られたアル
カリプロテアーゼの溶解性に関する温度の効果のグラフ
図である。横軸はインキュベーション時間(時間)を表
す。縦軸は酵素の沈殿率(%)を表す。
に於けるバチルス・アルカロフィルスから得られたアル
カリプロテアーゼの溶解性に関する温度の効果のグラフ
図である。横軸はインキュベーション時間(時間)を表
す。縦軸は酵素の沈殿率(%)を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 9/56 C12R 1:10) (72)発明者 チーマンブハイ ピー パテル アメリカ合衆国 インディアナ州 46545 ミシャウォーカー オールド ベッドフ ォード トレイル (番地なし) (72)発明者 マリー エイ ニコルソン アメリカ合衆国 ミシガン州 49001 カ ラマズー ローズランド アベニュー 1303
Claims (17)
- 【請求項1】 醗酵ブロースからの高度に精製されたア
ルカリプロテアーゼ(前記のアルカリプロテアーゼはバ
チルス・リチェニホルミスまたはバチルス・アルカロフ
ィルスから得られる)の調製法であって、 (i) 細胞からのアルカリプロテアーゼと前記の醗酵ブロ
ース中の懸濁固体を分離することによりアルカリプロテ
アーゼ溶液を生成し; (ii)前記のアルカリプロテアーゼ溶液を濃縮し; (iii) 前記の濃縮アルカリプロテアーゼに加水分解酵素
及び塩化ナトリウムを添加し; (iv)その混合物をインキュベートして加水分解されたポ
リマー不純物から前記のアルカリプロテアーゼを分離
し、色素からアルカリプロテアーゼを解離し;そして (v) 精製されたアルカリプロテアーゼ沈殿を回収する ことを特徴とする高度に精製されたアルカリプロテアー
ゼの調製法。 - 【請求項2】 工程(iii) 〜(v) が攪拌を含む条件下で
行われる請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 工程(iii) 〜(v) が約20℃より高い温度
で行われる請求項1または請求項2に従って製造された
組成物。 - 【請求項4】 工程(iii) 〜(v) が約28℃〜32℃の温度
で行われる請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記のアルカリプロテアーゼがバチルス
・リチェニホルミスから得られ、工程(iii) 〜(v) が約
4.5 〜9.5 のpHで行われる請求項1〜4のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項6】 前記のアルカリプロテアーゼがバチルス
・アルカロフィルスから得られ、工程(iii) 〜(v) が約
4.0 〜7.5 のpHで行われる請求項1〜4のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項7】 前記の濃縮アルカリプロテアーゼ溶液が
前記の加水分解酵素の添加中に約3.5 〜5.5 のpHであ
り、そして塩化ナトリウムの添加により約6.0〜9.0 のp
H値に高められる請求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 工程(v) が、実質的に無定形であり、か
つ20%未満の結晶構造含量を示す精製されたアルカリプ
ロテアーゼ沈殿を回収する工程を含む請求項6に記載の
方法。 - 【請求項9】 工程(v) が、実質的に無定形であり、か
つ40%未満の結晶構造含量を示す精製されたアルカリプ
ロテアーゼ沈殿を回収する工程を含む請求項5または7
に記載の方法。 - 【請求項10】 醗酵ブロースからの高度に精製された
アルカリプロテアーゼを含む組成物であって、 前記のアルカリプロテアーゼが請求項1〜9のいずれか
一項に従って生成されることを特徴とする組成物。 - 【請求項11】 請求項1〜9のいずれか一項に従って
生成された高度に精製されたアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項12】 粒子上の高度に精製されたアルカリプ
ロテアーゼ被覆物を含む粒状組成物であって、 前記の高度に精製されたアルカリプロテアーゼが請求項
1〜9のいずれか一項に従って生成されることを特徴と
する粒状組成物。 - 【請求項13】 色素の除去により実質的に低下された
着色を有するバチルス・アルカロフィルスまたはバチル
ス・リチェニホルミスから得られた精製されたアルカリ
プロテアーゼであって、 前記のアルカリプロテアーゼが470nm で1.3 未満の吸光
度を有することを特徴とする精製されたアルカリプロテ
アーゼ。 - 【請求項14】 ガラクトシルポリマーの実質的に減少
された含量を有するバチルス・アルカロフィルスまたは
バチルス・リチェニホルミスから得られた精製されたア
ルカリプロテアーゼであって、 前記のガラクトシルポリマー含量が酵素タンパク質の1.
00mg/g未満であることを特徴とする精製されたアルカリ
プロテアーゼ。 - 【請求項15】 バチルス・アルカロフィルスまたはバ
チルス・リチェニホルミスから得られた精製されたアル
カリプロテアーゼであって、 前記のアルカリプロテアーゼが実質的に無定形であり、
かつ40%未満の結晶構造含量を示すことを特徴とする精
製されたアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項16】 バチルス・アルカロフィルスまたはバ
チルス・リチェニホルミスから得られた精製されたアル
カリプロテアーゼであって、 前記のアルカリプロテアーゼが実質的に無定形であり、
かつ20%未満の結晶構造含量を示すことを特徴とする精
製されたアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項17】 バチルス・アルカロフィルスまたはバ
チルス・リチェニホルミスから得られた精製されたアル
カリプロテアーゼであって、 前記のアルカリプロテアーゼが470nm で1.3 未満の吸光
度、酵素の1.00mg/g未満のガラクトシルポリマー含量を
有し、かつ実質的に無定形であり、40%未満の結晶構造
を示すことを特徴とする精製されたアルカリプロテアー
ゼ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/813705 | 1991-12-27 | ||
US07/813,705 US5256557A (en) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Purified alkaline protease concentrate and method of preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05260967A true JPH05260967A (ja) | 1993-10-12 |
JP2898158B2 JP2898158B2 (ja) | 1999-05-31 |
Family
ID=25213132
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4348148A Expired - Lifetime JP2898158B2 (ja) | 1991-12-27 | 1992-12-28 | 精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物及びその調製法 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5256557A (ja) |
EP (1) | EP0549048B1 (ja) |
JP (1) | JP2898158B2 (ja) |
AR (1) | AR247244A1 (ja) |
AT (1) | ATE191929T1 (ja) |
BR (1) | BR9205163A (ja) |
CA (1) | CA2086294C (ja) |
DE (1) | DE69230929T2 (ja) |
DK (1) | DK0549048T3 (ja) |
ES (1) | ES2147181T3 (ja) |
FI (1) | FI111551B (ja) |
MX (1) | MX9207309A (ja) |
PT (1) | PT549048E (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010021375A1 (ja) * | 2008-08-22 | 2010-02-25 | 国立大学法人大阪大学 | プロテアーゼの製造方法、並びにプロテアーゼ溶液およびプロテアーゼのプロ体溶液 |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5256557A (en) * | 1991-12-27 | 1993-10-26 | Solvay Enzymes, Inc. | Purified alkaline protease concentrate and method of preparation |
US5705469A (en) * | 1992-10-28 | 1998-01-06 | The Procter & Gamble Company | Process for the manufacture of a liquid detergent composition comprising a sulphiting agent and an enzyme system |
JPH10511549A (ja) * | 1994-12-28 | 1998-11-10 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 酵素の安定化 |
US5723421A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-03 | Alcon Laboratories, Inc. | Stable liquid enzyme compositions and methods of use in contact lens cleaning and disinfecting systems |
US5604190A (en) * | 1995-06-07 | 1997-02-18 | Alcon Laboratories, Inc. | Stable liquid enzyme compositions and methods of use in contact lens cleaning and disinfecting systems |
US5981235A (en) * | 1996-07-29 | 1999-11-09 | Promega Corporation | Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease |
US6045588A (en) | 1997-04-29 | 2000-04-04 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing apparatus and method |
US7534304B2 (en) | 1997-04-29 | 2009-05-19 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing machine and methods |
US7513132B2 (en) | 2003-10-31 | 2009-04-07 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing machine with modular construction |
FR2847256B1 (fr) * | 2002-11-15 | 2005-04-08 | Biochimie Appliquee Soc | Nouveau procede d'obtention d'acide chondroitine sulfurique et ses utilisations |
US7739891B2 (en) | 2003-10-31 | 2010-06-22 | Whirlpool Corporation | Fabric laundering apparatus adapted for using a select rinse fluid |
US7300468B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-11-27 | Whirlpool Patents Company | Multifunctioning method utilizing a two phase non-aqueous extraction process |
US7513004B2 (en) | 2003-10-31 | 2009-04-07 | Whirlpool Corporation | Method for fluid recovery in a semi-aqueous wash process |
US7695524B2 (en) | 2003-10-31 | 2010-04-13 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing machine and methods |
WO2005106105A1 (en) | 2004-04-29 | 2005-11-10 | Unilever N.V. | Dry cleaning method |
US7966684B2 (en) | 2005-05-23 | 2011-06-28 | Whirlpool Corporation | Methods and apparatus to accelerate the drying of aqueous working fluids |
WO2009024574A1 (en) * | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Novozymes A/S | Nuclease reduction |
US8241624B2 (en) * | 2008-04-18 | 2012-08-14 | Ecolab Usa Inc. | Method of disinfecting packages with composition containing peracid and catalase |
US8226939B2 (en) | 2008-04-18 | 2012-07-24 | Ecolab Usa Inc. | Antimicrobial peracid compositions with selected catalase enzymes and methods of use in aseptic packaging |
KR20110100874A (ko) * | 2010-03-05 | 2011-09-15 | 박해성 | 보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법 |
SG191089A1 (en) * | 2010-12-10 | 2013-07-31 | Tracy Thompson | Compositions for separation methods |
WO2016205118A1 (en) * | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Novus International Inc. | Methods and kits for measuring protease activity in feed |
WO2017205750A1 (en) * | 2016-05-26 | 2017-11-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for microbial co-culture |
CN110564709B (zh) * | 2019-09-30 | 2022-12-09 | 上海开鸿环保科技有限公司 | 一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶的方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3616232A (en) * | 1968-08-14 | 1971-10-26 | Monsanto Co | Purification and fractionation of enzyme mixture from aqueous solution |
US3592738A (en) * | 1968-08-14 | 1971-07-13 | Monsanto Co | Purification and recovery of neutral and alkaline protease using cationic sulfonated phenol-formaldehyde resin |
US3623957A (en) * | 1970-01-21 | 1971-11-30 | Baxter Laboratories Inc | Preparation of microbial alkaline protease by fermentation with bacillus subtilis, variety licheniformis |
AU1629383A (en) * | 1982-10-02 | 1984-04-05 | Amano Seiyaku K.K. | Earthworm tissue protease thrombolytic agents |
US4689297A (en) * | 1985-03-05 | 1987-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Dust free particulate enzyme formulation |
WO1989005863A1 (en) * | 1987-12-23 | 1989-06-29 | Gist-Brocades N.V. | Purified industrial enzyme and process for the preparation thereof |
US5041377A (en) * | 1988-03-18 | 1991-08-20 | Genencor International Inc. | Subtilisin crystallization process |
DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
ATE96167T1 (de) * | 1989-12-21 | 1993-11-15 | Novo Nordisk As | Verfahren zur kristallisation von enzymen. |
US5256557A (en) * | 1991-12-27 | 1993-10-26 | Solvay Enzymes, Inc. | Purified alkaline protease concentrate and method of preparation |
-
1991
- 1991-12-27 US US07/813,705 patent/US5256557A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-12-16 DK DK92203938T patent/DK0549048T3/da active
- 1992-12-16 ES ES92203938T patent/ES2147181T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-16 EP EP92203938A patent/EP0549048B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-16 PT PT92203938T patent/PT549048E/pt unknown
- 1992-12-16 DE DE69230929T patent/DE69230929T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-16 MX MX9207309A patent/MX9207309A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-12-16 AT AT92203938T patent/ATE191929T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-12-22 AR AR92323974A patent/AR247244A1/es active
- 1992-12-23 FI FI925867A patent/FI111551B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-12-23 BR BR9205163A patent/BR9205163A/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-12-24 CA CA002086294A patent/CA2086294C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-28 JP JP4348148A patent/JP2898158B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-21 US US08/006,484 patent/US5439817A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010021375A1 (ja) * | 2008-08-22 | 2010-02-25 | 国立大学法人大阪大学 | プロテアーゼの製造方法、並びにプロテアーゼ溶液およびプロテアーゼのプロ体溶液 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5439817A (en) | 1995-08-08 |
DE69230929T2 (de) | 2000-10-19 |
AR247244A1 (es) | 1994-11-30 |
DE69230929D1 (de) | 2000-05-25 |
EP0549048A1 (en) | 1993-06-30 |
EP0549048B1 (en) | 2000-04-19 |
US5256557A (en) | 1993-10-26 |
DK0549048T3 (da) | 2000-08-28 |
FI925867A0 (fi) | 1992-12-23 |
CA2086294C (en) | 2000-05-16 |
CA2086294A1 (en) | 1993-06-28 |
BR9205163A (pt) | 1993-07-20 |
MX9207309A (es) | 1993-07-01 |
JP2898158B2 (ja) | 1999-05-31 |
FI925867A (fi) | 1993-06-28 |
ATE191929T1 (de) | 2000-05-15 |
PT549048E (pt) | 2000-09-29 |
ES2147181T3 (es) | 2000-09-01 |
FI111551B (fi) | 2003-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2898158B2 (ja) | 精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物及びその調製法 | |
US5281526A (en) | Method of purification of amylase by precipitation with a metal halide and 4-hydroxybenzic acid or a derivative thereof | |
FI109808B (fi) | Puhdistettu entsyymikonsentraatti ja menetelmä sen valmistamiseksi | |
EP0828753B1 (en) | Al/Fe-TREATMENT OF A PROTEIN SOLUTION, FOLLOWED BY MEMBRANE CONCENTRATION | |
AU688312B2 (en) | Liquid enzyme formulations | |
AU624968B2 (en) | Processes for the recovery of microbially produced chymosin | |
US3909358A (en) | Insolubilized enzymes | |
US3386888A (en) | Resolution of racemic amino acids | |
US4724208A (en) | Process for the production of solution stable alpha-amylase and liquid alpha-amylase produced thereby | |
JP3152826B2 (ja) | 酵素含有組成物の製造法 | |
JPH04222593A (ja) | 多糖類の抽出法 | |
US7892805B2 (en) | Method of enhancing enzyme activity and enzyme solution having enhanced activity | |
US3623955A (en) | Purification and recovery of alkaline protease using cationic-exchange resin | |
WO1989005863A1 (en) | Purified industrial enzyme and process for the preparation thereof | |
JP3083554B2 (ja) | 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 | |
JP2863607B2 (ja) | アミラーゼ及びその製造法 | |
JP2676453B2 (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
JPS61219393A (ja) | 高分子有機物の酵素による加水分解方法 | |
JP2000060547A (ja) | 新規アルカリプロテア―ゼおよびその製造法 | |
JPH01168284A (ja) | 全発酵ブロスから細胞外酵素を回収する方法 | |
AU7166200A (en) | Process for the preparation of gluconic acid and gluconic acid produced thereby | |
JPS61249386A (ja) | 高分子加水分解酵素の精製方法 | |
JPS6222590A (ja) | 高分子加水分解酵素含有乾燥組成物及びその製造方法 |