PT549048E

PT549048E - Concentrado de protease alcalina purificada e metodo de preparacao

Info

Publication number: PT549048E
Application number: PT92203938T
Authority: PT
Inventors: Jayarama K Shetty; Chimanbhai P Patel; Mary A Nicholson
Original assignee: Genencor Internat Indiana Inc
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 2000-09-29
Also published as: US5439817A; DE69230929T2; AR247244A1; DE69230929D1; EP0549048A1; EP0549048B1; US5256557A; DK0549048T3; FI925867A0; CA2086294C; CA2086294A1; BR9205163A; JPH05260967A; MX9207309A; JP2898158B2; FI925867A; ATE191929T1; ES2147181T3; FI111551B

Description

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ΕΡ 0 549 048/PT DESCRIÇÃO "Concentrado de protease alcalina purificada e método de preparação"

Antecedentes do invento O presente invento refere-se à recuperação e purificação de enzimas e, mais particularmente, a um processo para a recuperação de uma protease alcalina purificada de Bacillus licheniformis e Bacillus alcalophilus. ou suas variantes geneticamente manipuladas, e à composição que resulta desse processo. A utilização de enzimas em detergentes é bem conhecida. Geralmente, as enzimas utilizadas para fins de detergente eram principalmente proteases alcalinas estáveis, lipases e alfa-amilases. De entre as proteases alcalinas, as serina-proteases derivadas de espécies de Bacillus. nomeadamente Bacillus subtilis. Bacillus licheniformis e bactérias alcalofílicas de Bacillus têm sido muito utilizadas em formulações de detergentes [STARACE C. e BARFORD, H.C., Encvclopedia Chem. Technol. 9, pp. 138-148 (1980); Kohi HORIKOSHI e Terahiko AKIKA, A new Microbia! World. Springer-Verlag, N.Y., p. 93 (1982)].

As enzimas constituem apenas uma pequena porção da maioria das formulações de detergentes líquidos. Assim, é necessário produzir preparações enzimáticas razoavelmente concentradas. Os concentrados enzimáticos são tradicionalmente preparados por remoção de água das soluções aquosas das enzimas, utilizando métodos convencionais, como a ultrafiltração e a evaporação.

Os sais inorgânicos como o sulfato de amónio e o sulfato de sódio têm sido amplamente utilizados para precipitar enzimas em soluções aquosas, a níveis laboratoriais e comerciais [DIXON, M. e WEBB, E.D., Enzvmes, Academic Press, N.Y., pp. 39-41 (1964), CURLINE, Methods of Plasma Protein

Fractionation. Academic Press, N.Y. (1980)]. A vasta utilização destes sais em grande escala, no entanto, pode colocar problemas ambientais e complicar o tratamento de águas residuais, de facto, muitos países da Europa já restringiram a utilização destes sais em grande escala industrial. Os solventes orgânicos

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 2 como ο etanol e a acetona são também utilizados como precipitantes [DIXON e \ WEBB, Enzvmes. suora. pp. 37-39; BAUER et al. J. Biol. Chem.. 5 (3), pp. 11 7-20 (1967)], no entanto a sua utilização tem sido limitada devido aos custos e por motivos de segurança. Métodos de purificação de enzimas seguros para o ambiente e com eficácia económica são discutidos, por exemplo, em BECKER et a!., Patente U.S. No. 5 041 377, que descreve um método para produzir subtilisina cristalina derivada de Bacillus subtilis e Bacillus amvloliauefaciens pela adição de um sal de halogeneto a uma solução de protease alcalina a temperaturas inferiores a 1 0°C e numa gama de pH entre 5,2 a 5,8. A cor e o odor da protease pode afectar de forma adversa a qualidade das formulações de detergente nas quais são incorporadas. Isto implica a remoção de pigmentos do concentrado enzimático, que se pensa fazerem parte de um complexo enzima-pigmento. DIXON, M. e WEBB, E.C., Enzvmes. supra, referem métodos de precipitação do solvente para remover o pigmento de soluções de protease. Este método, no entanto, resultou num baixo rendimento de produto. A absorção de pigmentos com carbono activado a partir de um concentrado de enzima aquoso é geralmente praticada em aplicações industriais, no entanto, a perda de material, custo elevado e eliminação de resíduos apresenta desvantagens consideráveis. É desejável que as preparações de protease alcalina para aplicações de detergentes sejam isentas de componentes que possam causar uma cor, nebulização, instabilidade e actividade alérgica indesejáveis no produto final. Estes componentes podem ser derivados a partir dos próprios microorganismos, ou de matérias-primas residuais da fermentação. Em preparações de Bacilli gram-positivos, os polímeros aniónicos da parede celular, os peptidoglicanos e outros contaminantes polissacarídeos, solubilizam durante o crescimento celular, devido à renovação da parede celular. A presença destes polímeros da parede celular bacteriana em preparações de protease alcalina pode originar vários efeitos indesejáveis incluindo um aumento na alergenicidade, um decréscimo na estabilidade da enzima por ligação de catiões, e.g. Ca++ e podem causar a formação de nebulização em formulações de detergentes. O pedido de patente Patent Cooperation Treaty ("PCT") No. WO 89/05863 publicado em 29 de

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Junho, 1989, descreve um método para separar estes polímeros de preparações de protease, utilizando cromatografia de permuta iónica. Este método é de difícil execução numa operação em grande escala e dispendioso. Há a necessidade de um método simples e economicamente eficaz, para remover os hidratos de carbono contaminantes em geral e os polímeros de galactosilo, em particular, das preparações de protease alcalina.

Um outro problema que existe na preparação do produto de protease alcalina purificada é uma perda de actividade enzimática devido à degradação autolítica, quer durante o processamento, quer durante o armazenamento. As proteases alcalinas desempenham a função de hidrolisar moléculas de proteína no meio ambiente bacteriano. A sua actividade catalítica é baseada na clivagem da ligação peptídica em moléculas de proteína e numa quebra resultante da estrutura proteica em polipéptidos pequenos e aminoácidos individuais. Uma vez que a protease alcalina é ela própria uma molécula de proteína, as proteases alcalinas irão começar por hidrolisar outras moléculas de protease alcalina em solução, sob as condições adequadas. Enquanto que este é um problema geral com as preparações de protease, a perda de actividade proteolítica como resultado da degradação autolítica da protease alcalina pode afectar de forma adversa o desempenho da enzima, sob condições extremas presentes nas formulações de detergentes, e.g., pH alcalino, pois a protease alcalina é cataliticamente mais activa nas gamas de pH alcalino.

Nenhuma das patentes, pedidos de patente ou publicações acima referidos proporcionam as vantagens importantes de uma preparação de protease alcalina isenta de nebulização e de contaminantes que formam odores, de actividade que provoque alergias e outras impurezas indesejadas derivadas da fermentação. Assim, existe a necessidade de um processo simples e eficiente para purificar a protease alcalina, limitando ao mesmo tempo a

degradação autolítica da protease, durante o processo de purificação. A capacidade de remover eficazmente as propriedades alergénicas e outras características indesejáveis, das preparações de protease alcalina é crítica para uma utilização comercial eficaz e segura da protease. A US 3 592 738 descreve a purificação de proteases a partir de soluções aquosas, utilizando uma resina de permuta catiónica de fenol-formaldeído

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 4 sulfonado. A US 3 61 6 232 descreve a purificação de enzimas amilase ou protease a partir de soluções aquosas, por precipitação com um solvente orgânico miscível com água. A EP 415 296 descreve a produção de proteases altamente alcalinas utilizando microorganismos transformados com sequências de ADN mutadas.

Sumário do invento

Num aspecto, o presente invento proporciona um método para a purificação de protease alcalina, que remove os pigmentos associados com a nebulização, contaminação por cor e odor, em preparações comerciais de protease alcalina.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona um método simples e inovador para a purificação de protease alcalina, que remove polissacáridos e oligossacáridos que são responsáveis por problemas associados com a actividade alergénica.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona um método para a purificação de protease alcalina com uma redução significativa da degradação autolítica.

Num outro aspecto, o presente invento ajuda a reduzir a necessidade de utilizar químicos perigosos para o meio ambiente ou dispendiosos. Num outro aspecto, o presente invento proporciona um método para a purificação e recuperação de um produto de protease alcalina que é mais eficiente e resulta num rendimento substancialmente melhorado, e.g. superior a 90%, quando comparado com os processos reconhecidos na arte anterior.

De acordo com o invento, proporciona-se um método para a preparação de uma protease alcalina purificada a partir de um caldo de fermentação, sendo a protease alcalina derivada quer de Bacillus licheniformis. quer de Bacillus alcaloohilus. ou de um seu mutante geneticamente manipulado. 0 método

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 5 compreende a formação de uma solução de protease alcalina por separação da protease alcalina das células e sólidos em suspensão no caldo de fermentação, adicionando enzimas hidrolíticas à solução de protease alcalina, que actuam para hidrolisar as impurezas polissacarídeas e cloreto de sódio, incubando a mistura para separar a protease alcalina das impurezas poliméricas hidrolisadas e dissociar a protease alcalina dos pigmentos e recolher o precipitado de protease alcalina purificado resultante.

De preferência, esta concretização é realizada com a adição de enzimas hidrolíticas e cloreto de sódio à solução de protease alcalina, ocorrendo praticamente ao mesmo tempo. Opcionalmente, a adição de enzimas hidrolíticas pode preceder a adição de cloreto de sódio.

De preferência, a solução de protease alcalina é concentrada antes da adição de cloreto de sódio. Mais preferencialmente, esta concretização é realizada sob condições de agitação, de preferência uma agitação constante e vigorosa, durante a adição do cloreto de sódio. Ainda mais preferencialmente, para a protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus. as condições da solução, aquando da adição de cloreto de sódio são definidas por um pH entre cerca de 4,0 e 7,5, uma temperatura entre cerca de 28°C e 32°C e uma concentração de cloreto de sódio de cerca de 8,0-12,5 % peso/volume. Para o Bacillus licheniformis, a gama de pH da solução é entre cerca de 4,5 e 9,5, sendo a temperatura e a concentração de cloreto de sódio aproximadamente as mesmas que acima.

As composições produzidas de acordo com o presente invento são caracterizadas por, e têm as vantagens, de possuir um nível elevado de pureza, e.g. menos de 0,65 mg de polímero de galactosilo por grama de enzima e um teor de pigmento definido por uma absorvância inferior a 1,3 a 470 nm. Estas composições são também caracterizadas por um decréscimo substancial no odor, cor, contaminação e alergenicidade e um aumento na estabilidade. O invento, juntamente com outros objectos e vantagens inerentes, será melhor entendido com referência à descrição, desenhos, exemplos e tabelas seguintes. O invento não é, no entanto, a estes limitado.

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Descricão sumária dos desenhos A FIGURA 1 é uma representação gráfica do efeito do pH na degradação autolítica da protease alcalina de Bacillus licheniformis a 37°C. A abcissa representa o tempo de incubação em horas a uma temperatura de 37°C. A ordenada da esquerda representa a percentagem de perda de actividade de AP-L (protease), representada por uma linha contínua. A ordenada da direita representa a percentagem de aumento do teor de aminoácido livre, representado por uma linha a tracejado. A FIGURA 2 é uma representação gráfica do efeito da temperatura na solubilidade da protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus a pH 5,5, 10% de cloreto de sódio peso/volume. A abcissa representa o tempo de incubação em horas. A ordenada representa a percentagem de precipitação da enzima.

Descricão pormenorizada do invento

De acordo com uma concretização preferida do presente invento, prepara-se uma solução de protease alcalina purificada com um teor reduzido de polissacárido e polímero de galactose. O presente invento contempla especificamente misturas de fermentação, quer de Bacillus licheniformis. quer de Bacillus alcalophilus. Um fonte adequada de protease alcalina de Bacillus alcalophilus é o produto comercializado com a marca registada OPTICLEAN®, e uma fonte adequada de protease alcalina de Bacillus licheniformis é o produto comercializado com a marca registada OPTIMASE®, estando ambos disponíveis na SOLVAY ENZYMES, INC., de Elkhart, Indiana.

Para a cultura de estirpes de Bacillus alcalophilus e Bacillus licheniformis. utiliza-se normalmente um meio de cultura sólido ou líquido, que contém um tampão alcalino, bem como componentes necessários para o crescimento do microorganismo, i.e. uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos. O tampão deverá manter o pH do meio a um nível entre 7,0 e 10,0. As fontes de carbono adequadas incluem manose, fructose, manitol, maltose, celobiose, sacarose, dextrina, amido, melaços, glucose, amido hidrolisado ou uma mistura de duas ou mais destas fontes de carbono. As fontes de azoto que podem ser utilizadas incluem farinha de soja, caseína,

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ΕΡ 0 549 048/PT 7 extracto solúvel da maceração do milho, farinha de semente de algodão, hidrolisados enzimáticos de proteínas disponíveis, levedura seca, extracto de levedura, farinha de peixe, farinha de batata, ou uma mistura de duas ou mais destas fontes de azoto. O fosfato de potássio e sulfato de magnésio representam sais adequados. Exemplos de tampões alcalinos adequados incluem carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio e tetraborato de sódio. Alternativamente, pode-se utilizar um esquema automático de controlo do pH, através da adição de várias outras substâncias orgânicas ou inorgânicas necessárias para o crescimento das estirpes bacterianas e para a produção de enzimas. O meio que contém os componentes acima é esterilizado de um modo convencional e inoculado com uma das estirpes do presente invento. A cultura pode ser realizada aerobicamente com agitação ou sob agitação com arejamento, de preferência de 30°C a 40°C, durante 30 a 120 horas, para obter um fluido de cultura.

Após a fermentação, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo matérias-primas residuais da fermentação, são removidos por técnicas de separação convencionais. A solução de protease alcalina é concentrada numa solução de protease alcalina concentrada utilizando ultrafiltração até se obter a actividade de protease desejada. Uma concentração adequada é 400 DAPU/mg para a protease alcalina de Bacillus licheniformis. e 1 000 000 unidades DELFT/g para a protease alcalina de Bacillus alcalophilus. A solução concentrada por ultrafiltração é combinada com enzimas hidrolíticas, como a pectinase e a glucoamilase, as quais actuam para hidrolisar impurezas polissacarídeas. As enzimas hidrolíticas são enzimas que hidrolisam polissacáridos incluindo oligossacáridos, amilases, alfa-amilases, pululanases, transferases, polissacárido-hidrolases, glicosil-hidrolases, galactosil-hidrolases, pectinases e gluconases. Exemplos de hidrolases adequadas são a pectinase CLAREX® e a glucoamilase DIAZYME® L-200, disponíveis da SOLVAY ENZYMES, INC, Elkhart, Indiana.

Em simultâneo com as enzimas hidrolíticas, adiciona-se cloreto de sódio numa concentração de 10,0% peso/volume. A solução é ajustada para um pH entre cerca de 4,5 e 6,5 e mantida a uma temperatura entre cerca de 28°C e 32°C durante um período de tempo adequado. Em geral, serão suficientes cerca 8 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ de 48 e 72 horas para permitir a hidrólise dos vários contaminantes polissacarídeos e oligossacarídeos. A protease alcalina purificada que contém uma mistura heterogénea que compreende um precipitante amorfo com estruturas irregulares e/ou vários graus de estruturas ordenadas, foi em seguida separada do pigmento dissociado e outras impurezas de galactosilo e recolhido por filtração. Utilizou-se a microfiltração tangencial em membrana para este fim com resultados excelentes. O grau de estruturas ordenadas ou cristais depende das condições aplicadas. É preferido agitar vigorosamente a mistura subsequentemente à adição de enzimas hidrolíticas e cloreto de sódio e continuar a agitação até à recolha do precipitado. São possíveis várias concretizações alternativas. Por exemplo, numa concretização preferida, o cloreto de sódio sólido ,é adicionado quando se utiliza a protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus, a concentração de cloreto de sódio deverá ser entre 8,0% a 12,5% peso/volume e mais preferencialmente de 10,0% peso/volume. A temperatura deverá ser geralmente acima de 20°C, normalmente acima de cerca de 25°C e de preferência entre cerca de 28°C e 32°C. Quando se trabalha com a protease alcalina derivada de Bacillus licheniformis, a concentração de cloreto de sódio deverá ser geralmente entre cerca de 2,5% e cerca de 20,0% peso/volume, normalmente entre cerca de 7,5% e cerca de 15,0% peso/volume e de preferência entre cerca de 10,0% e 1 2,5% peso/volume. O pH da mistura durante a hidrólise deverá ser mantido geralmente abaixo de 6, e de preferência abaixo de 5,5. A precipitação, se realizada como um passo separado da hidrólise, deverá manter-se geralmente entre um pH de cerca de 4,0 e 7,5 para a protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus. enquanto que para o Bacillus licheniformis, o pH deverá manter-se geralmente entre 4,5 e 9,5. Numa concretização preferida, o pH é mantido entre 4,5 e 6,5 tanto durante o processo de hidrólise, como na precipitação.

Exemplos de enzimas hidrolíticas adequadas incluem enzimas que

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 9 hidrolisam amido e pectinas, incluindo as pectinases, glucoamilases e alfa-amilases. Estas enzimas estão comercialmente disponíveis. Em geral, estas enzimas não funcionam de forma eficiente na gama de pH alcalino e é necessário manter um pH relativamente ácido durante a hidrólise. As impurezas poliméricas que são indesejáveis incluem polímeros aniónicos da parede celular, peptidoglicanos e polímero de galactose e outros contaminantes poli- e oligossacarídeos que solubilizam durante a fermentação dos organismos Bacilli. A hidrólise enzímática e a adição de cloreto de sódio podem ser realizadas sequencial ou simultaneamente. Se o cloreto de sódio é adicionado subsequentemente à hidrólise, a solução pode ser mantida a um pH e temperatura constantes ao longo da hidrólise e da precipitação. Geralmente, o período de 48 a 72 horas necessário para a hidrólise será suficiente para permitir também a dissociação completa do complexo enzima-pigmento e a precipitação pelo sal da protease alcalina purificada; no entanto, na concretização que inclui as funções sequenciais de hidrólise-precipitação, deve deixar-se a precipitação ocorrer durante 48 a 72 horas, para permitir que a reacção de precipitação seja completa. Embora se pense que o complexo pigmento-enzima se dissocia imediatamente por adição de cloreto de sódio, a reacção de precipitação leva entre 48 e 72 horas até estar completa. Esta concretização permite flexibilidade na escolha de gamas alargadas de pH para os diferentes passos, no processo de purificação. Por exemplo, poderá ser desejável manter o pH durante a hidrólise enzimática na gama ácida (e.g., para a protease alcalina derivada de Bacillus alcaloohilus. podem-se manter valores de pH tão baixos como 4,0, e com a protease alcalina de Bacillus licheniformis. o pH pode ser mantido tão baixo como cerca de 4,5, sem inactivação), enquanto que o passo de precipitação pode ser realizado a um pH mais elevado, tomando vantagem das maiores percentagens de precipitação (veja-se exemplo 5).

Apesar disto, pensa-se que é mais simples e igualmente eficaz realizar a hidrólise e a adição de cloreto de sódio em simultâneo, a um pH baixo. Tal como indicado, a actividade autolítica de uma protease alcalina é mínima a níveis baixos de pH, e.g., de 4,0 a 6,5 e pensa-se que qualquer perda na percentagem de precipitação a um pH baixo é provavelmente resultante de um decréscimo na degradação autolítica, devido a uma actividade autolítica diminuída das proteases alcalinas em gamas ácidas.

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ΕΡ 0 549 048/PT 10 A protease alcalina purificada produzida de acordo com este método terá geralmente um nível substancialmente reduzido de impurezas; e.g. absorvância inferior a 1,3 a 470 nm; um teor de polímero de galactosilo inferior a 1,0 mg/g de enzima e preferencialmente inferior a 0,65 mg/g de enzima; e sendo essencialmente amorfo e apresentando um teor de estrutura alcalina inferior a 40% e de preferência inferior a 20%, tal como medido por técnicas convencionais, como a cristalografia de raios-X.

Estão contempladas concretizações alternativas que não se afastem do espírito do presente invento. A fermentação, a separação e a concentração são bem conhecidas na arte e podem-se utilizar métodos convencionais para alcançar os resultados desejados. Podem-se utilizar técnicas de separação convencionais para separar a protease alcalina dos componentes celulares microbianos e sólidos suspensos, que ocorrem durante o processo de fermentação. A filtração, a centrifugação, a microfiltração, a filtração rotativa sob vácuo, ou semelhantes serão geralmente suficientes. A concentração da solução de protease alcalina pode ser conseguida por qualquer de uma variedade de técnicas convencionais, incluindo a ultrafiltração, a evaporação, a extracção, a cromatografia ou a precipitação, seguido de redissolução. E desejável concentrar a solução de protease de forma a optimizar o rendimento após a precipitação. A utilização de soluções não concentradas irá necessitar de um tempo de precipitação maior para recolher a protease alcalina purificada. A recolha da protease alcalina pode ser realizada por qualquer método conhecido na arte, incluindo centrifugação, filtração em tambor de vácuo, filtração por prensa, ou microfiltração tangencial em membrana. A enzima "purificada” resultante é essencialmente isenta de polímeros de galactosilo.

Numa variação deste invento, define-se um método para preparar uma solução purificada de protease alcalina. Uma concretização preferida do presente invento envolve uma protease alcalina purificada, produzida através do método seguinte. Faz-se a cultura de Bacillus Licheniformis ou Bacillus alcalophilus num meio de fermentação adequado. Após a fermentação, removem-se as células microbianas e vários sólidos suspensos incluindo as matérias-primas residuais da fermentação. A solução de protease alcalina remanescente é ainda concentrada numa solução de protease alcalina

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 1 1 concentrada utilizando ultrafiltração, até se obter a actividade de protease desejada. A solução concentrada de protease alcalina é ajustada para um pH de cerca de 5,0 e a uma temperatura de cerca de 30°C e adiciona-se cloreto de sódio até uma concentração final de cerca de 10,5% peso/volume. A mistura de incubação resultante é deixada a incubar durante um período entre cerca de 48 e 72 horas, de modo a permitir que a reacção de precipitação se complete. O precipitado de protease alcalina purificado é então separado do sobrenadante e recolhido por microfiltração tangencial em membrana.

As proteases alcalinas exibem uma actividade máxima na região de pH alcalino, i.e. cerca de pH 8,5-11,0. Como indicado, na FIGURA 1 e exemolo 10. é aparente que a degradação autolítica aumenta a um pH mais elevado, resultando num rendimento menor. É necessário, de forma a obter a eficiência óptima de um sistema de recuperação de purificação de enzimas, que qualquer sistema para controlo da actividade proteolítica e, portanto autolítica seja reversível. O precipitado de várias proteases alcalinas de Bacillus irá variar relativamente ao pH isoeléctrico da proteína específica em questão, hidrofobicidade de superfície e quaisquer impurezas (poliméricas) que estejam presentes no meio. Os requerentes pensam que a diferença entre estas moléculas de protease alcalina derivadas de Bacillus é marcada. Por exemplo, de acordo com PRIEST et al., infra, há agora evidência de que o género Bacillus inclui 80 espécies taxonómicas aproximadas que podem ser atribuídas a cinco ou mais grupos de agrupamentos (”duster"). Estes deverão ser utilizados como uma estrutura para redefinir o género actual e cindi-lo em vários géneros. Por exemplo, o grupo agrupamento B2 contém o agrupamento 14 (Bacillus amvloliauefaciens). agrupamento 15 (Bacillus subtilis). agrupamento 20 (Bacillus licheniformis) e agrupamento 24 (Bacillus firmus). O grupo de agrupamentos C contém o agrupamento 25 (Bacillus firmus). enquanto que o grupo de agrupamentos E contém o agrupamento 44 (Bacillus lentus). O Bacillus firmus e Bacillus lentus são espécies alcalofílicas. PRIEST, F.G. GOODFELLOW, M. e TODD, C., A numerical Classification of the Genus Bacillus. Journal of

General Microbiology 134, pp. 1847-1882 (1988).

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 12 A diferença nas propriedades das várias proteases alcalinas é também bem ilustrada nos microorganismos alcalofílicos, HORIKOSHI et a!., tabela 6.1, p. 25 (1982). Os padrões de HPLC das enzimas purificadas de diferentes espécies de Bacillus ilustram as diferenças drásticas entre as espécies, i.e. Bacillus amvloliauefaciens. Bacillus licheniformis e Bacillus alcalophilus.

Os sólidos ou soluções de protease alcalina concentrada preparados de acordo com uma das concretizações do presente invento, são úteis para todas as aplicações em que se utilizam proteases alcalinas, quer na forma sólida, quer na forma líquida. Estas preparações podem ser transformados num produto final, que ou é uma solução líquida, um sólido, grânulos, pó ou uma pasta. Em particular, podem ser utilizadas em detergentes para a roupa e removedores de nódoas, como sistemas de limpeza enzimática de lentes de contacto, como depiladores no bronzeamento, na indústria alimentar para a preparação de hidrolisados proteicos e nos processos de teste do soro sanguíneo, para a detecção de anticorpos incompletos. É particularmente vantajoso para utilização em detergentes e agentes de limpeza, pois as proteases alcalinas preparadas de acordo com este invento têm um menor teor de pigmentos e têm assim um nível reduzido de formação de nebulização, contaminação pelo odor e cor. Para além disso, a remoção das propriedades alergénicas dos polímeros de galactosilo em preparações de protease alcalina preparadas de acordo com as concretizações do presente invento são especialmente úteis em produtos para lentes de contacto e outras aplicações comerciais, para a indústria alimentar, de rações e de detergentes.

Os exemplos seguintes, tabelas relacionadas e desenhos pretendem ilustrar adicionalmente o invento. Deve entender-se, no entanto, que o invento não se limita a estes exemplos ou concretizações específicos aqui expressos.

Exemplo 1

Efeito de diferentes concentrações de cloreto de sódio

Produziu-se protease alcalina a partir de um caldo de fermentação de uma cultura submersa de Bacillus licheniformis num meio adequado. Após a 13 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ fermentação, as células microbianas e os sólidos suspensos foram separados da protease alcalina por meios convencionais, como a centrifugação e/ou filtração em tambor de vácuo. A solução de protease alcalina resultante foi então concentrada utilizando ultrafiltração. Adicionaram-se diferentes quantidades de cloreto de sódio a alíquotas de 40 ml da solução de protease alcalina concentrada por ultrafiltração e a actividade foi ajustada para 550 unidades de proteína alcalina detergente/ml (DAPU/ml). O pH foi ajustado para 5,5 utilizando ácido acético a 10% e as amostras tratadas foram diluídas para 50 ml com água destilada e incubadas a 37°C durante 3 horas. Manteve-se uma amostra de controlo a 5°C. Após o tempo especificado, as soluções foram centrifugadas para separar a enzima precipitada do sobrenadante. Os filtrados límpidos foram analisados quanto à proteína total e à actividade enzimática (tabela 1). O nível de proteína total no precipitado de protease alcalina purificado e portanto a percentagem total de proteínas precipitadas foi determinada utilizando um método de coloração proteína-corante [BRADFORD, Anal. Biochem, 72, 248 (1976)]. Pipetou-se uma alíquota da solução de proteína (0,1 ml) para um tubo de ensaio e adicionaram-se a este 5 ml do reagente proteína-corante (BIO RAD) seguido de mistura do conteúdo num vórtex. Mediu-se a absorvância a 595 nm após 5 minutos contra um branco de reagente, preparado a partir de 0,1 ml de água e 5 ml de reagente proteína-corante. A quantidade de proteína foi então determinada a partir de uma curva padrão preparada a partir de gama-globulina bovina. A percentagem de protease alcalina presente no produto purificado de protease alcalina de Bacillus licheniformis foi determinada através de um ensaio baseado na hidrólise do substracto de caseína, a 40°C, a pH 8,5 (tampão borato). A caseína não hidrolisada foi precipitada com ácido tricloroacético e removida por centrifugação. Mediu-se a absorvância do hidrolisado de caseína solúvel em tricloroacetato, num espectrofotómetro a 275 nm. Uma unidade de protease alcalina detergente (DAPU) é a actividade que irá libertar o equivalente a quatro micromoles de tirosina por minuto, nas condições do teste. O valor da actividade total de protease alcalina (DAPU) da solução sobrenadante foi comparado com o controlo não precipitado, para determinar a percentagem da protease alcalina total antes da purificação, que foi precipitada a partir da solução. Para a protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus. o teste é

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 14 realizado num tampão borato a pH 8,7. A actividade enzimática baseia-se na unidade DELFT que é definida como se segue. Se 1 ml de uma solução a 2% de uma preparação enzimática origina uma diferença na absorvância de 0,400 nas condições do teste, então a preparação enzimática tem uma actividade de protease de 1000 unidades DELFT. TABELA 1

Efeito da concentração de cloreto de sódio concentração de cloreto de Proteínas Actividade enzimática sódio p/v mq/ml %DreciDitada DAPU/ml % DreciDitada controlo, 5°C, 3 h 66,0 0 559,5 0 controlo, 37°C, 3 h 66,2 0 560,0 0 2,5% de NaCI 53,2 19,4 390,5 30,3 5,0% de NaCI 42,4 35,8 287,8 48,6 7,5% de NaCI 36,0 45,5 245,8 56,1 10,0% de NaCI 33,6 49,1 218,2 61,0 12,5% de NaCI 27,6 58,2 198,3 64,6 15,0% de NaCI 34,0 48,5 238,7 57,4 20,0% de NaCI 35,6 46,1 258,8 53,8 A incubação da protease alcalina a pH 5,5, 37°C durante 3 horas não teve nenhum efeito na estabilidade da enzima. No entanto, a adição de cloreto de sódio originou a precipitação da enzima. A precipitação da enzima também aumentou com o aumento da concentração de cloreto de sódio e a precipitação máxima da enzima ocorreu a 1 2,5% peso/volume do nível de cloreto de sódio

Exemplo 2

Efeito da Temperatura A solução de protease neste exemplo foi preparada substancialmente de acordo com o exemplo 1. excepto incubando amostras separadas a várias temperaturas (tabela 2).

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 15 TABELA 2

Efeito da temperatura Ensaio Proteínas Actividade de protease ma/ml %DreciDitada PAPU/ml % de enzima oreciDitada controlo, sem NaCI 66,4 0 559,5 0 15% de NaCI, 5°C 66,4 0 559,0 0 15% de NaCI, 10°C 64,8 0 566,6 0 15% de NaCI, 23°C 65,6 0 568,5 0 15% de NaCI 30°C 66,0 0 541,5 3,2 15% de NaCI, 37°C 59,2 11 467,1 16,5 15% de NaCI, 45°C 36,4 45,2 240,8 57,0

A temperatura tem claramente um forte impacto no grau de precipitação. A pH 5,5 e a uma concentração de cloreto de sódio de 15,0% peso/volume, não ocorreu nenhuma precipitação de protease alcalina até a temperatura atingir 30°C. Ocorreu uma precipitação substancial acima de 37°C

Exemplo 3

Efeito do cloreto de sódio a baixa temperatura O efeito do cloreto de sódio na separação de proteases alcalinas foi estudado a temperaturas de 5°C e 10°C durante até doze dias. Adicionou-se cloreto de sódio sólido a duas soluções de 50 ml de concentrado de protease alcalina derivadas de Bacillus licheniformis 300 DAPU/g e 600 DAPU/g - e a duas soluções de 50 ml de protease alcalina derivada de Bacillus alcalophilus -500 000 unidades DELFT/g e 1 000 000 unidades DELFT/g, até uma concentração final de 10% peso/volume e o pH foi ajustado para pH 5,5. As amostras foram então mantidas a 5°C e 10°C e analisadas quanto à precipitação de enzima a intervalos diários. Não ocorreu nenhuma precipitação de enzimas a nenhuma das temperaturas, mesmo após 12 dias. O cloreto de sódio é ineficaz em originar a precipitação/separação da protease alcalina derivada de Bacillus licheniformis ou Bacillus alcalophilus das impurezas solúveis a baixas temperaturas, enquanto que a incubação a temperaturas superiores a 20°C origina a separação/precipitação das proteases alcalinas numa questão de

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 16 horas, como no exemplo 2

Exemplo 4

Efeito da temperatura na taxa de separação de enzima. Incubou-se a protease alcalina de Bacillus alcalophilus (OPTICLEAN®) concentrada por ultrafiltração (1 043 900 unidades DELFT/g) contendo NaCI a 10%, pH 5,5 a 24°C, 30°C ou 40°C (agitação constante). Recolheram-se amostras (10 ml) a diferentes intervalos de tempo (6, 1 2, 24, 32 e 48 horas) e centrifugou-se para separar a enzima precipitada. O sobrenadante foi então analisado quanto à actividade (FIGURA 2).

Exemplo 5 Efeito do pH

Estudou-se a actividade do concentrado de protease alcalina de Bacillus licheniformis (OPTIMASE®), removendo as células e os sólidos suspensos de uma mistura de fermentação e concentrando a solução de protease alcalina resultante por ultrafiltração. O concentrado de fosfatase alcalina resultante foi ajustado para uma actividade de 500 DAPU/ml. Adicionou-se cloreto de sódio a uma concentração de 12,5% peso/volume e o pH foi ajustado para 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5 e 5,0 utilizando ácido acético a 10% (1 +2 gotas). As amostras tratadas foram incubadas a 37°C durante 3 horas e centrifugadas. Determinou-se a proteína total e a actividade enzimática (tabela 3). TABELA 3

Efeito do pH na precioitacão da protease alcalina de Bacillus licheniformis PH Proteínas Actividade enzimática ma/ml % precipitado DAPU/ml % de enzima precipitada controlo 64,4 0 507,0 0 pH 5,0 43,2 33,0 325,0 36,0 pH 5,5 37,5 41,8 251,0 50,5 pH 6,0 25,8 60,0 167,0 67,1 pH 6,5 21,0 67,4 128,0 74,8 pH 7,0 16,4 75,2 104,0 79,5 pH 7,5 1 1,8 81,7 75,0 85,2 O efeito do pH na precipitação da protease alcalina na presença de cloreto

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 17 de sódio a 37°C foi marcado. A percentagem de precipitação de enzima aumentou com o aumento do pH para mais de 85% em 3 horas a pH 7,5, comparado com 36% de precipitação de enzima a pH 5,0.

Exemplo 6

Efeito do tempo de incubação

Transferiram-se alíquotas de 400 ml de protease alcalina de Bacillus licheniformis (OPTIMASE®) concentrada por ultrafiltração com uma actividade de 600 DAPU/ml, para dois copos diferentes e adicionou-se 61,25 g de cloreto de sódio. O pH das soluções foi então ajustado para 6,0 e 7,5 separadamente, diluiu-se para 500 ml e incubou-se a 37°C. Recolheram-se amostras (50 ml) a diferentes intervalos de tempo. A proteína precipitada foi separada do sobrenadante por centrifugação a 20 000 rpm durante 20 minutos. Determinou-se a proteína total e a actividade enzimática (tabela 4). TABELA 4

Efeito do tempo de incubacão na precipitação da protease alcalina de Bacillus licheniformis pH Especificação da Proteína total Actividade enzimática amostra ma/ml %orecÍDÍtada DAPU/ml % enzima DreciDitada 6,0 tempo 0 40,0 0 312,0 0 6,0 1 h 36,0 9,0 323,9 25,4 6,0 2 h 26,0 34,0 168,2 46,1 6,0 4 h 18,6 53,0 120,3 61,4 6,0 6 h 14,4 64,0 93,2 70,1 7,5 tempo 0 37,0 0 276,0 0 7,5 1 h 11,2 70,0 71,2 74,2 7,5 2 h 7,6 79,0 48,3 82,5 7,5 4 h 5,6 85,0 35,6 87,1 7,5 6 h 4,8 87,0 30,5 89,0

Foi encontrada uma grande percentagem da protease alcalina no precipitado após 6 horas. A extensão e a taxa de precipitação da protease alcalina eram dependentes do pH da solução de proteína (tabela 4). Pensa-se que a taxa de precipitação se torna maior próxima do ponto isoeléctrico da enzima, que no caso da protease alcalina de Bacillus licheniformis é de cerca de 8,2 a 8,5.

85 061

ΕΡ 0 549 048/PT 18

Exemplo 7

Efeito do cloreto de sódio na dissociação de pigmentos da protease alcalina

Para separar alíquotas de 100 ml de protease alcalina de Bacillus licheniformis (OPTIMASE®) concentrada por ultrafiltração, adicionou-se cloreto de sódio até uma concentração final de 10% peso/volume. O pH da amostra foi ajustado para 7,5 utilizando NaOH a 10% e incubando a 37°C, durante 4 horas. Separou-se a protease alcalina precipitada centrifugando a 20 000 rpm durante 20 minutos. 0 precipitado foi em seguida solubilizado em propilenoglicol a 50% (100 ml). Determinou-se a proteína total, actividade enzimática e cor ("pigmentos") a 470 nm. Para comparação, precipitou-se a protease alcalina com 65% (peso/volume) de sulfato de amónio e 25% (peso/volume) de sulfato de sódio, sob condições idênticas (tabela 5). TABELA 5

Comparação de diferentes métodos na precipitação da protease alcalina e na remoção de pigmentos Tratamento Proteína Actividade enzimática Pigmentos ma/ml % DreciDitada Protease DAPU/ml % enzima orecioitada D.O. a 470 nm % removida controlo 54 0 381 0 2,16 0 sulfato de amónio (65% p/v) 51 94 341 90 2,30 0 sulfato de sódio (22% p/v) 50 93 349 92 1,54 29 cloreto de sódio (10% p/v) 49 91 338 89 0,52 76

Os dados da tabela 5 demonstram a utilização com sucesso do cloreto de sódio para precipitar a protease alcalina, semelhante a outros sais convencionais que precipitam proteínas. Para além disso, a precipitação com cloreto de sódio atingiu uma eficiência superior na remoção de pigmento, ao contrário do sulfato de sódio e de sulfato de amónio.

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 19

Exemplo 8

Redução de polissacáridos por hidrólise enzimática

As proteases alcalinas exibiam uma estabilidade máxima a um pH superior a 4,5, na presença de 10% de NaCI, a temperaturas inferiores a 40°C. Testaram-se várias enzimas comerciais que hidrolisam amido e pectinas. A enzima pectinolítica CLAREX® (pectinase da SOLVAY ENZYMES, INC., ELkhart, IN) e a glucoamilase DIAZYME® L-200 (glucoamilase da SOLVAY ENZYMES, INC., Elkhart, IN), originaram a hidrólise do polímero de galactosilo e amido residual no concentrado de, protease a um pH de 4,5-5,5 a 30-40°C.

Adicionaram-se 2,5 g de pectinase e 0,25 g de glucoamilase a 100 g de OPTICLEAN® (protease alcalina de Bacillus alcalophilus) concentrado por ultrafiltração. A solução foi em seguida ajustada para pH 5,2 e mantida a 30°C. Recolheram-se amostras (5 g) a diferentes intervalos de tempo e determinou-se o teor em polímero galactosilo. A galactose libertada foi então determinada por análise de HPLC.

Adicionaram-se lentamente 5 ml de ácido tricloroacético a 20% (peso/volume) a 5 g de amostras de protease alcalina de Bacillus alcalophilus do exemplo acima, misturando ao mesmo tempo, para precipitar a proteína. Após repouso em gelo durante 30 minutos, a mistura foi centrifugada (15 000 rpm, 20 minutos, rotor SS-34). Removeu-se o sobrenadante por decantação para um tubo limpo e adicionou-se álcool de grau de reagente (20 ml), com mistura. Após repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente, centrifugou-se o tubo (10 000 rpm, 10 minutos) e desprezou-se o sobrenadante. A pelete foi redissolvida em tampão acetato 0,1M, pH 4,0 (4,95 ml). Adicionou-se a isto pectinase CLAREX® (0,25 ml) e incubou-se a mistura a 60°C durante 2 horas. Após este tempo, adicionou-se ácido sulfúrico 4 N (25 μΙ) para parar a reacção. A mistura reaccional foi filtrada (0,45 μΙ) e injectada num dispositivo de medida de cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação de galactose livre, como a seguir descrito. Também se correu um branco de substrato e um branco de enzima. Determinou-se o polímero de galactosilo total contido, pelo método de hidrólise ácida.

O polímero de galactosilo e o amido residual podem ser determinados por precipitação da proteína com ácido, incubação do sobrenadante a 100°C 20 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ durante 24 horas para hidrolisar os polissacáridos e determinação do teor, no hidrolisado, de galactose e glucose, por cromatografia líquida de alta eficiência. Por exemplo, a 5 ml de amostras de protease alcalina de Bacillus alcalophilus (a actividade - é 1 000 000 unidades DELFT/ml) adicionam-se 5 ml H20, mistura-se e em seguida adiciona-se lenta e cuidadosamente 1 ml de ácido clorídrico concentrado. Centrifuga-se a mistura (15 000 rpm, 20 minutos, rotor SS-34) e em seguida decanta-se o sobrenadante para um tubo de ensaio com tampa de rosca. Coloca-se num forno a 100°C, durante 24 horas. Após este tempo, dilui-se o hidrolisado a 1:1 com fase móvel, filtra-se através de um filtro de 0,45 μ e analisa-se por cromatografia líquida de alta eficiência. Utilizam-se concentrações conhecidas de galactose e glucose para calibrar o detector.

Análise de HPLC do hidrolisado de polímero de qalactosilo

Condições: Coluna HPX-87 Η (BIO RAD) Fase móvel H2S04 0,01 n Temperatura 60°C Caudal 0,7 ml/minuto Volume de amostra 20 μΙ Detector índice de refracção TABELA 6

Efeito do tratamento de pectinase/glucoamilase na redução do teor de polímero de galactosilo TemDO de incubacão, horas Percentaoem de redução 0 6 94,0 12 95,1 24 96,5 48 96,6 72 97,2 O tratamento do concentrado ultrafiltrado de Bacillus alcalophilus com enzimas hidrolíticas resultou numa redução significativa de polímero contendo galactose. O precipitado de protease alcalina de Bacillus alcalophilus

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 21 (OPTICLEAN®) do concentrado ultrafiltrado tratado com enzima hidrolítica, com cloreto de sódio, resultou num OPTICLEAN® essencialmente isento de polímero de galactose.

Prefere-se recolher o precipitado de protease alcalina por filtração tangencial em membrana, quando as condições o permitem. Esta operação resulta numa protease alcalina de Bacillus alcalophilus altamente purificada, sem níveis detectáveis de polímero galactosilo e com um teor de pigmento significativamente reduzido, e.g. a absorção a 470 nm é inferior a 1,3. Este resultado baseia-se num concentrado de enzima com uma actividade de 1 000 000 unidades DELFT/g.

Exemplo 9

Efeito de vários haloaenetos de sódio A fim de separar alíquotas de 100 ml do concentrado de ultrafiltração, de protease alcalina (403 DAPU/ml, 48,3 g/l), adicionou-se fluoreto de sódio, cloreto de sódio, brometo de sódio e iodeto de sódio, nas concentrações finais de 0,5 Μ. O pH da solução foi ajustado para 7,5 utilizando NaOH 2N. As soluções de protease alcalina que contêm os diferentes sais foram então incubadas a 37°C, durante 4 horas. 0 precipitado foi em seguida separado do sobrenadante por centrifugação a 16 000 rpm a 5°C, durante 20 minutos e a pelete foi dissolvida numa solução de propilenoglicol a 50% (100 ml). Determinou-se a proteína total e a actividade enzimática da pelete (tabela 7). TABELA 7

Efeito dos halogenetos de sódio Halogeneto de sódio (0,5 M) Proteína Actividade de protease ma/ml %orecÍDitado DAPU/ml %enzima precipitada - 59,0 0 403,0 0 Fluoreto de sódio 0,8 1,4 3,0 0,7 Cloreto de sódio 45,0 76,4 302,5 75,0 Brometo de sódio 8,0 14,0 54,0 13,4 Iodeto de sódio 2,3 3,9 15,6 3,9

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 22

Verificou-se que ο cloreto de sódio era o melhor precipitante entre os halogenetos testados. Também é claro que a precipitação da enzima não poderia ser atribuída a qualquer propriedade genérica dos átomos de halogéneo. De facto, não ocorreu essencialmente nenhuma precipitação da enzima quando se utilizaram o fluoreto de sódio e o iodeto de sódio. O cloreto de magnésio e o cloreto de potássio também causaram a precipitação da protease alcalina, de modo semelhante ao cloreto de sódio, enquanto que o cloreto de cálcio não teve nenhum efeito na precipitação de protease alcalina, nas mesmas condições.

Exemplo 10

Efeito do pH na estabilidade aquosa da protease alcalina a 37°C

Ajustou-se o concentrado de protease alcalina, 100 ml (430 DAPU/ml) para pH 6,5, 6,0 e 5,0, utilizando ácido acético a 20% (peso/volume). As soluções foram filtradas através de filtros de 0,45 μ (esterilização a frio). As amostras foram então mantidas a 37°C e recolheram-se alíquotas (10 ml) a diferentes intervalos de tempo e congelaram-se imediatamente para parar a reacção. O pH das soluções foi mantido pela adição de hidróxido de sódio a 8%. O efeito do pH na estabilidade aquosa da enzima a 37°C foi determinado medindo a actividade de protease na amostra. A extensão de degradação proteolítica da enzima foi medida determinando o aumento na quantidade de grupos amino livres. Os dados apresentados na FIGURA 1 mostram que a estabilidade aquosa da enzima decresce com o aumento de pH da solução. A perda de actividade enzimática (linha contínua) correlaciona-se com o aumento no teor de grupos amino livres (linha a tracejado). O aumento no teor de grupos amino livres durante a incubação da protease alcalina sugere fortemente uma degradação proteolítica da enzima. A incubação da protease alcalina a pH 6,5 a 37°C, durante 24 horas, resultou numa perda de aproximadamente 50% da actividade enzimática, enquanto que a incubação a pH 5,0 resultou numa perda de apenas 20% da actividade da enzima. O teor total de grupos amino livres das amostras de proteína foi determinado seguindo o método descrito em R. FIELDS, Methods in Enzvmoloav. vol. 25, 465 (1972) utilizando ácido trinitrobenzenossulfónico 23 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ (TNBS). Adicionou-se a amostra que contém os grupos amino a 0,5 ml de tampão borato (1 litro de Na2B407 0,1 M em NaOH 0,1 M) e perfez-se o volume até 1,0 ml. Em seguida, adicionaram-se 0,02 ml de solução TNBS 1,1 M e a solução foi rapidamente misturada. Após 5 minutos, a reacção foi parada por adição de 2 ml de NaH2P04 0,1 M que continha sulfito 1,5 M e determinou-se a absorvância a 420 nm. Preparou-se também um branco. A quantidade de grupos amino foi determinada a partir de um gráfico padrão construído utilizando glicina.

Exemplo 11

Efeito do cloreto de sódio na precipitação de proteases alcalinas a pH alcalinos.

Testou-se a precipitação de proteases alcalinas por cloreto de sódio nas regiões de pH alcalino (pH < 7,0). Adicionou-se, a um litro cada de concentrado por ultrafiltração de protease alcalina de Bacillus licheniformis (OPTIMASE® (1037 DAPU/g) e protease alcalina de Bacillus alcaloohilus (OPTICLEAN®) (1 102 000 unidades DELFT/g), pectinase e glucoamilase. O pH das soluções foi ajustado para 5,0 utilizando ácido acético a 10% e incubando a 30°C durante 6 horas. Durante a incubação, as soluções foram constantemente agitadas. Após o tempo especificado, ajustaram-se 100 g cada da amostra a diferentes pH, i.e. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5 e 9,5 com hidróxido de sódio a 10% e adicionou-se cloreto de sódio sólido, até uma concentração final de 10% peso/volume. A mistura foi em seguida incubada a 30°C durante 48 horas com agitação constante. Separou-se a enzima precipitada por centrifugação. 0 precipitado foi então dissolvido em propilenoglicol (100 g de propilenoglicol a 60%) e determinou-se a actividade enzimática (tabela 8). (Segue Tabela 8)

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 24 TABELA 8

Efeito do cloreto de sódio na precipitação de proteases alcalinas a pH alcalino pH da precipitação PERCENTAGEM DE PRECIPITAÇÃO B. licheniformis (OPTIMASE®) B. alcalophilus (OPTICLEAN®) 5,5 98 91 6,5 95 67 7,5 95 14 8,5 100 4 9,5 95 0 A incubação do concentrado ultrafiltrado de protease alcalina com enzimas hidrolíticas, a pH 5,0; 30°C, durante 6 horas na ausência de cloreto de sódio resultou numa perda de aproximadamente 20-25 da actividade enzimática (degradação autolítica). Os resultados da tabela 8 mostram que a protease alcalina de Bacillus licheniformis (OPTIMASE®) foi precipitada por cloreto de sódio na região de pH alcalino, pH 7,5-9,5, enquanto que no caso do Bacillus alcalophilus (OPTICLEAN®), a separação das enzimas ocorreu apenas a pH ácido. A diferença marcada no comportamento de precipitação entre as duas proteases alcalinas por cloreto de sódio, demonstra ainda-que as proteases alcalinas de diferentes espécies de Bacilli não são provavelmente funcional ou estruturalmente equivalentes.

Exemplo 1 2

Efeito do cloreto de sódio na estabilidade aos ácidos de Bacillus licheniformis e Bacillus alcalophilus

Adicionou-se cloreto de sódio a noventa gramas cada de concentrado ultrafiltrado de protease alcalina de Bacillus licheniformis e protease alcalina de Bacillus alcalophilus (OPTIMASE®-1037 DAPU/g e OPTICLEAN®-1 217 500 unidades DELFT/g), a uma concentração de 10% e ajustou-se o pH para 4,0, 4,5 5,0 e pH 5,5. Adicionou-se pectinase CLAREX® L (1,0% volume/volume) e glucoamilase DIAZIME® L-200 (0,25% volume/volume), (1,0% volume/volume) e incubou-se durante 48 horas a 30°C. Após o tempo especificado, a protease alcalina precipitada foi separada por centrifugação a 1 5 000 rpm durante 45 minutos, 5°C. O precipitado foi em seguida solubilizado em propilenoglicol a 60% (pH 5,2). Mediu-se a actividade enzimática (tabela 9) 25 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ TABELA 9

Efeito do cloreto de sódio na estabilidade da protease alcalina derivada de Bacillus licheniformis e Bacillus alcalophilus durante a precipitação a pH ácido pH protease alcalina de protease alcalina de Bacillus licheniformis Bacillus alcaloDhilus DAPU/a % orecioitacão Unidades DELFT/a % orecioitacão 4,0 821 88 1 071 000 97,7 4,5 858 92 1 072 000 97,8 5,0 878 94 1 085 000 99,0 5,5 794 85 915 000 84,0

Como se pode ver pela tabela acima, o comportamento de precipitação com as duas enzimas diferentes foi distinto a diferentes níveis de pH. Especificamente, a protease alcalina de Bacillus licheniformis apresentou uma precipitação máxima na gama de pH entre pH 4,5-5,0, enquanto que a protease alcalina de Bacillus alcalophilus mostrou um máximo de precipitação na gama mais alargada de pH, de 4,0 a 5,0. A comparação destes resultados indica a melhor estabilidade da protease alcalina por adição de cloreto de sódio a gamas de pH ácido e a temperaturas mais elevadas.

Exemplo 13

Efeito da temperatura na solubilidade da protease alcalina de Bacillus alcalophilus na presença de cloreto de sódio a 10%

Adicionou-se cloreto de sódio sólido a 500 g de protease alcalina de Bacillus alcalophilus (OPTICLEAN®) concentrada por ultrafiltração a 5°C, até uma concentração final de 10% peso/volume. Ajustou-se o pH para 5,5. As amostras foram então incubadas a 5°C, 24°C (temperatura ambiente), 30°C, 35°C e 40°C durante 30 horas. Após este tempo, as amostras (20 g) foram recolhidas e centrifugadas a 15 000 rpm. Determinou-se o efeito da temperatura na precipitação da enzima medindo a actividade enzimática do sobrenadante. Aos restantes 80 g das amostras incubadas, adicionaram-se 80 g de propilenoglicol e agitou-se durante 16 horas à temperatura ambiente. A 26 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ estabilidade da protease alcalina foi então determinada medindo a actividade enzimática. O efeito da temperatura na solubilidade e estabilidade da protease alcalina de Bacillus alcalophilus é apresentado na Tabela 10 TABELA 10

Efeito da temperatura na solubilidade e estabilidade da protease alcalina de Bacillus alcaloohilus Temperatura °C Estabilidade Actividade inicial de protease alcalina de Bacillus alcaloohilus unidades DELFT/g % perda unidades DELFT/g % Sobrenadante Precipitação 5 489 000 0 1 030 800 1 030 800 0 24 465 200 4,3 184 600 82,1 30 472 300 3,5 11 2 500 89,1 35 467 700 4,4 62 000 94,0 40 489 000 0,1 78 900 92,4

Os dados da tabela anterior mostram que a protease alcalina de Bacillus alcalophilus é estável a pH 5,5, na presença de NaCI 10%, mesmo a 40°C, durante 30 horas. É também interessante notar que a separação da enzima aumentou com o aumento da temperatura. Mais de 90% da enzima precipitaram acima de 30°C.

Exemplo 14

Filtração tangencial em membrana (Microfiltracão) de precipitados de protease alcalina de Bacillus alcalophilus A filtração tangencial em membrana designada vulgarmente por microfiltracão está a tornar-se uma técnica cada vez mais comum para separar sólidos insolúveis. A operação controlada de sistemas tangenciais é considerada geralmente menos problemática relativamente à centrifugação. A filtração de tangencial é essencialmente um método sem formação de bolo. Foi sugerido que a filtração tangencial pode ser mais económica do que uma filtração rotativa sob vácuo moderadamente lenta e/ou em prensa de filtros (BEATON, N.C 1980, Appl. of Ultrafiltration to Ferment Prod. Polymer Science Tecnhol. Plenum, N.Y. 13). São possíveis fluxos de permeado elevados, 67-118 litros/m2/hora durante a concentração de suspensões de bactérias [HENRY, J.D. Cross Flow filtration. Recent Dvpts. Sep. 27 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ

Science Li, Ν.Μ. (ed), CRC Press 2,205 (1972)]. A filtração em tambor rotativo ou a filtração em prensa de filtros não são um método preferido para separar materiais insolúveis durante o processamento de proteases alcalinas, devido à produção de aerossóis que contêm enzimas, que podem originar reacções alérgicas. Uma vez que a microfiltração pode ser uma operação unitária, os problemas inerentes aos métodos de filtração "sem saída" não existem. Assim, a microfiltração oferece uma segurança ambiental adicional quando se processam proteases alcalinas em operações em grande escala.

Durante a filtração "sem saída" é necessária a adição do auxiliar de filtração (terra de diatomáceas), que mais tarde se torna um desperdício sólido. A microfiltração é uma técnica suave e não requer aditivos químicos, ou auxiliares de filtração. Adicionou-se cloreto de sódio a 200 litros de protease alcalina de Bacillus alcalophilus concentrada por ultrafiltração (1 086 000 unidades DELFT/g), até uma concentração final de 10% (peso/volume). Adicionaram-se glucoamilase (CLAREX®) a 1,0% volume/volume) e pectinase (DIAZYME® L-200 a 0,25% volume/volume). Ajustou-se o pH para pH 5,2 e incubou-se a 30°C durante 48 horas. A enzima precipitada foi separada das águas-mães utilizando microfiltração (KOCH #603, cartucho de 4", 0,1 μ de tamanho de poro; KOCH MEMBRANE SYSTEMS, INC., 850 Main Street, Wilmington, MA 01887-3388, EUA). A lama concentrada foi em seguida diafiltrada duas vezes com solução de cloreto de sódio a 10% para remover pigmentos e outras impurezas solúveis. Após a diafiltração, solubilizou-se a enzima em propilenoglicol, fazendo circular propilenoglicol a 70% contendo cloreto de cálcio a 10%. O processo resultou em mais de 80% de recuperação de protease alcalina com uma cor fraca (98% de redução) e essencialmente isento de polímero de galactosilo.

Exemplo 1 5 O concentrado de protease alcalina purificado do exemplo 14 foi granulado. O processo utilizado é o descrito na patente U.S. 4 689 297 de GOOD et al. intitulada "Dust free Particulate enzyme formulation" (25 de Agosto, 1987) que é aqui incorporada para referência.

Numa experiência típica, utilizou-se a seguinte composição: concentrado «Γ 9 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 28

de protease alcalina de Bacillus alcalophilus purificada a 43.6% SS, 5.5 x 10-DU/g. DSB formulação enzimática a 100%.

Materiais % em base de sólidos secos Procedimento Precipitado de enzima 67,1 A solução de enzima foi diluída para (5 500 000 DU/g) 26% SS e pulverizada para Iconol revestimento de 1000 g de NaCI num Poliíálcool vinílico) 15,4 UNI GLATT utilizando um inserto Atgel 7,7 WURSTER 9,8

Formulação de cosméticos

Materiais % em base de sólidos secos Procedimento Ti02 60 A lama cosmética foi diluída para 30% Talco 15 SS e pulverizada para revestimento de Poli(álcool vinílico) 11 NaCI revestido com enzima num UNI Iconol 14 GLATT utilizando um inserto WURSTER. Após revestimento com 17% p/p (produto final básico) dos sólidos cosméticos, os grânulos foram crivados -20 + 60.

Esta formulação resultou num produto revestido por pulverização aceitável, com propriedades desejáveis para utilização em formulações de detergentes granulares e outras utilizações adequadas.

Exemplo 1 6

Utilizou-se o concentrado precipitado purificado do exemplo 14 para produzir "marums" de acordo com a seguinte fórmula e de acordo com o processo estabelecido:

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 29

Concentrado purificado de protease alcalina de Bacillus alcalophilus a 49,6% em sólidos secos, 3,1 x 10- unidades DELFT/q, 81,7 % de cristais enzimáticos em base de sólidos secos/19% FW2 em base de sólidos secos

Formulações de "marums"

Materiais % em base de sólidos secos Procedimento Bentonite 27,6 Todos os materiais não solúveis foram BW-3000 24,7 misturados a seco. Misturaram-se os polietilenoglicol 15,3 materiais solúveis formando uma lama. (PEG-3350) A lama e os materiais não solúveis Caulino 5,2 foram misturados em conjunto numa Na2S04 1,8 mistura com um teor de 23% de água. Polietilenoglicol 0,9 A mistura foi extrudida numa matriz de (PEG-8000) 0,7 mm, seca num secador de leito Propilenoglicol 0,9 fluídizado UNI GLATT. Cristais de enzima 19,1 Terra de diatomáceas 4,5 (FW2) H20 adicionada 5

Exemplo 1 7

Efeito do pH na precipitação da protease alcalina de Bacillus licheniformis

Tal como é apresentado na tabela 11, obtiveram-se rendimentos percentuais excelentes na gama de pH de 4,0 a 4,5. Estes valores são uma melhoria significativa em relação ao rendimento de precipitação na gama de pH de 5,3 a 5,5. (Segue Tabela 11) 30 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ TABELA 11

Efeito do dH na orecioitacão da orotease alcalina derivada de Bacillus licheniformis Ensaio dH do precipitado % enzima precipitada 1 5,3-5,5 87,8 2 5,3-5,5 89,6 3 5,3-5,5 86,9 4 5,3-5,5 88,0 MED = 88,08 5 4,5 97,9 6 4,5 95,3 7 4,0 98,5 MED = 97,2

Lisboa, jijl 2000

Por GENENCOR INTERNATIONAL INDIANA, INC. - O AGENTE OFICIAL -

ANTÓNIO J0A0 IA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ree de5 Flores, 74 4.® 1ΕΘΟ LISBOA

Claims

85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de protease alcalina altamente purificada, a partir de um caldo de fermentação, em que a referida protease alcalina deriva, ou de Bacillus licheniformis ou de Bacillus alcalophilus ou de um seu mutante geneticamente manipulado, compreendendo: (i) formação de uma solução de protease alcalina por separação da protease alcalina das células e dos sólidos suspensos no referido caldo de fermentação; (ii) adição de enzimas hidrolíticas à referida protease alcalina, que actuam para hidrolisar as impurezas polissacarídeas e cloreto de sódio; (iii) incubação da mistura para separar a referida protease alcalina de impurezas poliméricas hidrolisadas e dissociar a referida protease alcalina dos pigmentos; e (iv) recolha de um precipitado de protease alcalina purificada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreende adicionalmente o passo de concentração da solução de protease alcalina antes do passo (ii).
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os passos (ii) a (iv) são realizados sob condições que incluem agitação.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que os passos (ii) a (iv) são realizados a uma temperatura acima de cerca de 20°C.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que os passos (ii) a (iv) são realizados a uma temperatura entre cerca de 28°C e 32°C.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida protease alcalina é derivada de Bacillus licheniformis e os passos (ii) a (iv) são realizados a um pH entre cerca de 4,5 e 9,5.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que 85 061 ΕΡ 0 549 048/ΡΤ 2/2 a referida protease alcalina é derivada de Bacillus alcalophilus e os passos (ii) a (iv) são realizados a um pH entre cerca de 4,0 e 7,5.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a referida solução concentrada de protease alcalina está a um pH entre cerca de 4,5 e 5,5 durante a adição das referidas enzimas hidrolíticas e o seu pH é elevado para um pH entre 6,0 e 9,0 com a adição de cloreto de sódio.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o passo (iv) compreende o passo de recolha de um precipitado de protease alcalina purificada, essencialmente amorfo e apresentando um teor de estrutura cristalina inferior a 20%.
10. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 8, em que o passo (iv) compreende o passo de recolha de um precipitado de protease alcalina purificada, essencialmente amorfo e que apresenta um teor de estrutura cristalina inferior a 40%. Lisboa- -3. JUL 2000 Por GENENCOR INTERNATIONAL INDIANA, INC. - O AGENTE OFICIAL - O ADJUbJTO