JPH05180845A - 標識複合体、及びそれを用いる分析法 - Google Patents
標識複合体、及びそれを用いる分析法Info
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- JPH05180845A JPH05180845A JP4150665A JP15066592A JPH05180845A JP H05180845 A JPH05180845 A JP H05180845A JP 4150665 A JP4150665 A JP 4150665A JP 15066592 A JP15066592 A JP 15066592A JP H05180845 A JPH05180845 A JP H05180845A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 貯蔵安定性に優れ、測定対象化合物を特異的
かつ高感度に検出する試薬を得る。 【構成】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ1 〜Ｒ7 は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1 〜
Ｒ7 は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1 は２価の有機残基を示す。 【外１】 はアニオンを示す。）で示される化合物等と免疫グロブ
リン等との複合体を形成する。
かつ高感度に検出する試薬を得る。 【構成】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ1 〜Ｒ7 は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1 〜
Ｒ7 は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1 は２価の有機残基を示す。 【外１】 はアニオンを示す。）で示される化合物等と免疫グロブ
リン等との複合体を形成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は近赤外光を用いた微量分
析用に供する標識複合体に関し、更に詳細には複雑な混
合物中の特定成分を特異的に、かつ高感度に検出し得る
標識複合体に関する。
析用に供する標識複合体に関し、更に詳細には複雑な混
合物中の特定成分を特異的に、かつ高感度に検出し得る
標識複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】色素等で標識された微少物質にレーザー
光を照射すると、その物質に起因して、散乱光、吸光、
蛍光、さらには光音響などの情報が得られる。こうした
情報を検出し、高精度かつ高速に微量分析を行なうこと
は、レーザー光を利用した分析法の分野において、広く
知られている。
光を照射すると、その物質に起因して、散乱光、吸光、
蛍光、さらには光音響などの情報が得られる。こうした
情報を検出し、高精度かつ高速に微量分析を行なうこと
は、レーザー光を利用した分析法の分野において、広く
知られている。
【０００３】従来レーザー光源としては、アルゴンレー
ザーやヘリウムネオンレーザーに代表されるガスレーザ
ーがもっぱら利用されてきた。しかし、近年半導体レー
ザーが開発され、その安価でありかつ小型で、出力制御
が容易な特徴から、光源としての利用が期待されてい
る。
ザーやヘリウムネオンレーザーに代表されるガスレーザ
ーがもっぱら利用されてきた。しかし、近年半導体レー
ザーが開発され、その安価でありかつ小型で、出力制御
が容易な特徴から、光源としての利用が期待されてい
る。
【０００４】一方、臨床診断学的に有用な生体由来の物
質を、従来のように紫外および可視領域の波長を利用し
て定量する場合は、通常検体に含まれるフラビン、ピリ
ジン補酵素、および血清蛋白質などの天然物の固有蛍光
（３００〜５００ｎｍ）に基づく、バックグラウンド
（ブランク）が高くなる傾向にある。しかし、近赤外領
域の光源を利用できれば、こうした天然物由来のバック
グラウンドを排除することができ、結果的に被測定物質
の感度を高くすることができる。
質を、従来のように紫外および可視領域の波長を利用し
て定量する場合は、通常検体に含まれるフラビン、ピリ
ジン補酵素、および血清蛋白質などの天然物の固有蛍光
（３００〜５００ｎｍ）に基づく、バックグラウンド
（ブランク）が高くなる傾向にある。しかし、近赤外領
域の光源を利用できれば、こうした天然物由来のバック
グラウンドを排除することができ、結果的に被測定物質
の感度を高くすることができる。
【０００５】しかし、半導体レーザーの発振波長は一般
的には赤色、近赤外領域（６７０〜８３０ｎｍ）であ
り、その波長領域で吸光、もしくは励起により蛍光を発
する色素はそれほど多くなく、共役鎖の長いポリメチン
系色素が代表とされる。ポリメチン系色素を生体由来物
質に標識し、これを用いて微量分析をした例としては、
ケー．サウダ，テー．イマサカ（Ｋ．Sauda, T. Imasak
a ）らは、アナル．ケム（Anal. Chem. ）（１９８６）
５８，２６４９−２６５３の論文でスルホネート基をも
つシアニン色素（例えばインドシアニングリーン）を用
いて、血しょう蛋白質を標識し、高速液体クロマトグラ
フィーで分析したことを報告している。
的には赤色、近赤外領域（６７０〜８３０ｎｍ）であ
り、その波長領域で吸光、もしくは励起により蛍光を発
する色素はそれほど多くなく、共役鎖の長いポリメチン
系色素が代表とされる。ポリメチン系色素を生体由来物
質に標識し、これを用いて微量分析をした例としては、
ケー．サウダ，テー．イマサカ（Ｋ．Sauda, T. Imasak
a ）らは、アナル．ケム（Anal. Chem. ）（１９８６）
５８，２６４９−２６５３の論文でスルホネート基をも
つシアニン色素（例えばインドシアニングリーン）を用
いて、血しょう蛋白質を標識し、高速液体クロマトグラ
フィーで分析したことを報告している。
【０００６】また、特開平２−１９１６７４には、生体
由来物質に種々のスルホン酸基もしくはスルホネート基
をもつシアニン系色素を標識して、蛍光検出することが
開示されている。
由来物質に種々のスルホン酸基もしくはスルホネート基
をもつシアニン系色素を標識して、蛍光検出することが
開示されている。
【０００７】しかし、これらの近赤外領域で吸光もしく
は、励起して蛍光を発する公知のシアニン系色素は、通
常光や熱に対してそれ程安定ではない。
は、励起して蛍光を発する公知のシアニン系色素は、通
常光や熱に対してそれ程安定ではない。
【０００８】また、該色素を標識材として抗体などの生
体由来物質などに結合させて複合化した場合、その複合
体はさらに光、熱、湿度、空気中の酸素などの環境因子
により酸化されたり、架橋などの変性が生じやすい。ま
た、特に水中では、加水分解などの変性がさらに加速さ
れるという欠点があった。従って、生体成分の微量分析
を行う際の検出試薬として、これら複合体を利用しよう
としても、貯蔵安定性が悪いことを理由として実用化が
難しい場合があった。
体由来物質などに結合させて複合化した場合、その複合
体はさらに光、熱、湿度、空気中の酸素などの環境因子
により酸化されたり、架橋などの変性が生じやすい。ま
た、特に水中では、加水分解などの変性がさらに加速さ
れるという欠点があった。従って、生体成分の微量分析
を行う際の検出試薬として、これら複合体を利用しよう
としても、貯蔵安定性が悪いことを理由として実用化が
難しい場合があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記問題
を解決するために種々検討した結果、ある特定の構造の
色素、具体的には特定のポリメチン色素、その内でもア
ズレン系色素が、生体由来物質に標識材として担持させ
ても極めて安定であることを見いだし、本発明を完成す
るに至ったもので、本発明の目的とするところは、上述
の問題点を解決した、貯蔵安定性の優れた標識複合体を
提供することにある。
を解決するために種々検討した結果、ある特定の構造の
色素、具体的には特定のポリメチン色素、その内でもア
ズレン系色素が、生体由来物質に標識材として担持させ
ても極めて安定であることを見いだし、本発明を完成す
るに至ったもので、本発明の目的とするところは、上述
の問題点を解決した、貯蔵安定性の優れた標識複合体を
提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明は、生体由来物質に標識材を担持させてなり、
分析対象化合物と結合させて分析対象化合物を近赤外光
を用いた光学的手段で検出するための標識複合体におい
て、標識材を下記一般式（Ｉ），（II）、又は（III ）
で示される化合物で構成するものである。
に本発明は、生体由来物質に標識材を担持させてなり、
分析対象化合物と結合させて分析対象化合物を近赤外光
を用いた光学的手段で検出するための標識複合体におい
て、標識材を下記一般式（Ｉ），（II）、又は（III ）
で示される化合物で構成するものである。
【００１１】
【化９】 （式中Ｒ1 〜Ｒ7 は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1 〜
Ｒ7 は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1 は２価の有機残基を示す。
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1 〜
Ｒ7 は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1 は２価の有機残基を示す。
【００１２】
【外７】 はアニオンを示す。）、
【００１３】
【化１０】 （式中Ｒ8 〜Ｒ14は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、スルホネート基、アリール基、アラルキル基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ8 〜
Ｒ14は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ2 は２価の有機残基を示
す。）、
基、スルホネート基、アリール基、アラルキル基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ8 〜
Ｒ14は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ2 は２価の有機残基を示
す。）、
【００１４】
【化１１】 （式中Ｒ15〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子、スルホネ
ート基、アルキル基、アリール基、置換もしくは未置換
のアラルキル基、置換もしくは未置換のアミノ基、置換
もしくは未置換のスチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。
ート基、アルキル基、アリール基、置換もしくは未置換
のアラルキル基、置換もしくは未置換のアミノ基、置換
もしくは未置換のスチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。
【００１５】
【外８】 はアニオンを示す。）。
【００１６】また本発明は標識材が下記一般式（IV）
【００１７】
【化１２】 （式中Ａ，Ｂ，Ｄ及びＥは水素原子、それぞれ置換又は
未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、ア
ラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基か
ら選ばれる基を示す。ｒ１'，ｒ２'は水素原子、それぞ
れ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、アルケ
ニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれる基
を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で
未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、ア
ラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基か
ら選ばれる基を示す。ｒ１'，ｒ２'は水素原子、それぞ
れ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、アルケ
ニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれる基
を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で
【００１８】
【外９】 はアニオンを意味する。）で示される化合物とするもの
である。
である。
【００１９】また本発明は、生体由来物質に下記一般式
（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される標識材を担
持させてなる標識複合体を用い、該標識複合体と分析対
象化合物とを結合させて分析対象化合物を光学的手段で
検出する分析法、
（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される標識材を担
持させてなる標識複合体を用い、該標識複合体と分析対
象化合物とを結合させて分析対象化合物を光学的手段で
検出する分析法、
【００２０】
【化１３】 （式中Ｒ１ 〜Ｒ７ は水素原子、ハロゲン原子、アル
キル基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、
アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カル
ボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ
１ 〜Ｒ７ は互いに結合して、置換または未置換の縮
合環を形成するものでもよい。Ｆ１ は２価の有機残基
を示す。
キル基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、
アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カル
ボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ
１ 〜Ｒ７ は互いに結合して、置換または未置換の縮
合環を形成するものでもよい。Ｆ１ は２価の有機残基
を示す。
【００２１】
【外１０】 はアニオンを示す。）、
【００２２】
【化１４】 （式中Ｒ８〜Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子、アルキ
ル基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、ア
ミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボ
キシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ８
〜Ｒ１４は互いに結合して、置換または未置換の縮合環
を形成するものでもよい。Ｆ２は２価の有機残基を示
す。）、
ル基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、ア
ミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボ
キシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ８
〜Ｒ１４は互いに結合して、置換または未置換の縮合環
を形成するものでもよい。Ｆ２は２価の有機残基を示
す。）、
【００２３】
【化１５】 （式中Ｒ15〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基、
置換もしくは未置換のアミノ基、置換もしくは未置換の
スチリル基、ニトロ基、スルホネート基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。
基、アリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基、
置換もしくは未置換のアミノ基、置換もしくは未置換の
スチリル基、ニトロ基、スルホネート基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。
【００２４】
【外１１】 はアニオンを示す。）である。
【００２５】更に前記生体由来物質が、抗体又は抗原で
あること、前記生体由来物質が、核酸であること、分析
対象化合物を近赤外光を用いた光学的手段で検出するこ
とを含む。
あること、前記生体由来物質が、核酸であること、分析
対象化合物を近赤外光を用いた光学的手段で検出するこ
とを含む。
【００２６】また本発明は、生体由来物質に下記一般式
（IV）で示される標識材を担持させてなる標識複合体を
用い、該標識複合体と分析対象化合物とを結合させて分
析対象化合物を光学的手段で検出する分析法。
（IV）で示される標識材を担持させてなる標識複合体を
用い、該標識複合体と分析対象化合物とを結合させて分
析対象化合物を光学的手段で検出する分析法。
【００２７】
【化１６】 （式中Ａ，Ｂ，Ｄ及びＥは水素原子、それぞれ置換また
は未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、
アラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基
から選ばれる基を示す。ｒ１’，ｒ２’は水素原子、そ
れぞれ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、ア
ルケニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれ
る基を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で
は未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、
アラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基
から選ばれる基を示す。ｒ１’，ｒ２’は水素原子、そ
れぞれ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、ア
ルケニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれ
る基を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で
【００２８】
【外１２】 はアニオンを意味する。）であり、前記生体由来物質
が、抗体又は抗原であること、前記生体由来物質が、核
酸であること、分析対象化合物を近赤外光を用いた光学
的手段で検出することを含む。
が、抗体又は抗原であること、前記生体由来物質が、核
酸であること、分析対象化合物を近赤外光を用いた光学
的手段で検出することを含む。
【００２９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】本発明においては、前記一般式（Ｉ），
（II）、又は（III）の化合物を標識材とするものであ
るが、ここでＲ1 〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子（塩
素原子、臭素原子、沃素原子）又は１価の有機残基、そ
の他の上記官能基を表わす。１価の有機残基としては、
広範なものから選択することができる。
（II）、又は（III）の化合物を標識材とするものであ
るが、ここでＲ1 〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子（塩
素原子、臭素原子、沃素原子）又は１価の有機残基、そ
の他の上記官能基を表わす。１価の有機残基としては、
広範なものから選択することができる。
【００３１】アルキル基としては、例えばメチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、iso −プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、sec −ブチル基、iso −ブチル基、ｔ−ブチル
基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ
−オクチル基、ｔ−オクチル基等の炭素数が１〜１２個
の直鎖状又は分岐状のものが好ましい。
チル基、ｎ−プロピル基、iso −プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、sec −ブチル基、iso −ブチル基、ｔ−ブチル
基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ
−オクチル基、ｔ−オクチル基等の炭素数が１〜１２個
の直鎖状又は分岐状のものが好ましい。
【００３２】アリール基としては、例えばフェニル基、
ナフチル基、メトキシフェニル基、ジエチルアミノフェ
ニル基、ジメチルアミノフェニル基等の炭素数が６〜２
０個のものが好ましい。
ナフチル基、メトキシフェニル基、ジエチルアミノフェ
ニル基、ジメチルアミノフェニル基等の炭素数が６〜２
０個のものが好ましい。
【００３３】置換アラルキル基としては、例えばカルボ
キシベンジル基、スルホベンジル基、ヒドロキシベンジ
ル基等の炭素数が７〜１９個のものが好ましい。
キシベンジル基、スルホベンジル基、ヒドロキシベンジ
ル基等の炭素数が７〜１９個のものが好ましい。
【００３４】未置換アラルキル基としては、例えばベン
ジル基、フェネチル基、α−ナフチルメチル基、β−ナ
フチルメチル基等の炭素数が７〜１９個のものが好まし
い。置換もしくは未置換のアミノ基としては、例えばア
ミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロ
ピルアミノ基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基
等の炭素数１０個以下のものが好ましい。
ジル基、フェネチル基、α−ナフチルメチル基、β−ナ
フチルメチル基等の炭素数が７〜１９個のものが好まし
い。置換もしくは未置換のアミノ基としては、例えばア
ミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロ
ピルアミノ基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基
等の炭素数１０個以下のものが好ましい。
【００３５】置換もしくは未置換のスチリル基として
は、例えばスチリル基、ジメチルアミノスチリル基、ジ
エチルアミノスチリル基、ジプロピルアミノスチリル
基、メトキシスチリル基、エトキシスチリル基、メチル
スチリル基等の炭素数が８〜１４個のものが好ましい。
は、例えばスチリル基、ジメチルアミノスチリル基、ジ
エチルアミノスチリル基、ジプロピルアミノスチリル
基、メトキシスチリル基、エトキシスチリル基、メチル
スチリル基等の炭素数が８〜１４個のものが好ましい。
【００３６】アリールアゾ基としては、例えばフェニル
アゾ基、α−ナフチルアゾ基、β−ナフチルアゾ基、ジ
メチルアミノフェニルアゾ基、クロロフェニルアゾ基、
ニトロフェニルアゾ基、メトキシフェニルアゾ基等の炭
素数が６〜１４個のものが好ましい。
アゾ基、α−ナフチルアゾ基、β−ナフチルアゾ基、ジ
メチルアミノフェニルアゾ基、クロロフェニルアゾ基、
ニトロフェニルアゾ基、メトキシフェニルアゾ基等の炭
素数が６〜１４個のものが好ましい。
【００３７】又、一般式（Ｉ）においていえば、Ｒ1 と
Ｒ2 ，Ｒ2 とＲ3 ，Ｒ3 とＲ4 ，Ｒ 4 とＲ5 ，Ｒ5 とＲ
6 およびＲ6 とＲ7 の組合せのうち、少なくとも１つの
組合せで置換または未置換の縮合環を形成してもよい。
縮合環としては５員、６員、または７員環の縮合環であ
り、芳香族環（ベンゼン、ナフタレン、クロロベンゼ
ン、ブロモベンゼン、メチルベンゼン、エチルベンゼ
ン、メトキシベンゼン、エトキシベンゼンなど）、複素
環（フラン環、ベンゾフラン環、ピロール環、チオフェ
ン環、ピリジン環、キノリン環、チアゾール環、など）
脂肪族環（ジメチレン、トリメチレン、テトラメチレン
など）が挙げられる。これは一般式（II）、及び（III
）においてもいえる。
Ｒ2 ，Ｒ2 とＲ3 ，Ｒ3 とＲ4 ，Ｒ 4 とＲ5 ，Ｒ5 とＲ
6 およびＲ6 とＲ7 の組合せのうち、少なくとも１つの
組合せで置換または未置換の縮合環を形成してもよい。
縮合環としては５員、６員、または７員環の縮合環であ
り、芳香族環（ベンゼン、ナフタレン、クロロベンゼ
ン、ブロモベンゼン、メチルベンゼン、エチルベンゼ
ン、メトキシベンゼン、エトキシベンゼンなど）、複素
環（フラン環、ベンゾフラン環、ピロール環、チオフェ
ン環、ピリジン環、キノリン環、チアゾール環、など）
脂肪族環（ジメチレン、トリメチレン、テトラメチレン
など）が挙げられる。これは一般式（II）、及び（III
）においてもいえる。
【００３８】即ち一般式（II）においていえば、Ｒ8 と
Ｒ9 ，Ｒ9 とＲ10，Ｒ10とＲ11，Ｒ11とＲ12，Ｒ12とＲ
13およびＲ13とＲ14の組合せのうち、少なくとも１つの
組合せで置換又は未置換の縮合環を形成してもよい。
Ｒ9 ，Ｒ9 とＲ10，Ｒ10とＲ11，Ｒ11とＲ12，Ｒ12とＲ
13およびＲ13とＲ14の組合せのうち、少なくとも１つの
組合せで置換又は未置換の縮合環を形成してもよい。
【００３９】同様に一般式（III ）においていえば、Ｒ
15とＲ16，Ｒ16とＲ17，Ｒ17とＲ18，Ｒ18とＲ19，Ｒ19
とＲ20およびＲ20とＲ21の組合せのうち、少なくとも１
つの組合せで置換又は未置換の縮合環を形成してもよ
い。
15とＲ16，Ｒ16とＲ17，Ｒ17とＲ18，Ｒ18とＲ19，Ｒ19
とＲ20およびＲ20とＲ21の組合せのうち、少なくとも１
つの組合せで置換又は未置換の縮合環を形成してもよ
い。
【００４０】なお、上述中、一般式（Ｉ）〜（IV）中で
は一般式（Ｉ）が特に好ましく、またＲ1〜Ｒ7では水素
原子、アルキル基、スルホネート基が、Ｒ8〜Ｒ14では
水素原子、アルキル基、スルホネート基が、Ｒ15〜Ｒ21
では水素原子、アルキル基、スルホネート基が、Ａ，
Ｂ，Ｄ及びＥではアルキル基、アリール基がｒ'1，ｒ'2
では水素原子、アルキル基がそれぞれ好ましい。
は一般式（Ｉ）が特に好ましく、またＲ1〜Ｒ7では水素
原子、アルキル基、スルホネート基が、Ｒ8〜Ｒ14では
水素原子、アルキル基、スルホネート基が、Ｒ15〜Ｒ21
では水素原子、アルキル基、スルホネート基が、Ａ，
Ｂ，Ｄ及びＥではアルキル基、アリール基がｒ'1，ｒ'2
では水素原子、アルキル基がそれぞれ好ましい。
【００４１】又、一般式（Ｉ）においてＦ1 は、２重結
合によって結合した２価の有機残基を表わす。かかるＦ
1 を含む本発明で使用する化合物の具体例として下記一
般式（１）〜（１２）で表わすものを挙げることができ
る。但し、式中の
合によって結合した２価の有機残基を表わす。かかるＦ
1 を含む本発明で使用する化合物の具体例として下記一
般式（１）〜（１２）で表わすものを挙げることができ
る。但し、式中の
【００４２】
【外１３】 は下記のアズレニウム塩核を示し、式中の
【００４３】
【外１４】 を除く右辺がＦ1 を示している。
【００４４】
【化１７】 一般式 （１）
【００４５】
【化１８】 （２）
【００４６】
【化１９】 （３）
【００４７】
【化２０】 （４）
【００４８】
【化２１】 （５）
【００４９】
【化２２】 （６）
【００５０】
【化２３】 （７）
【００５１】
【化２４】 （８）
【００５２】
【化２５】 （９）
【００５３】
【化２６】 （１０）
【００５４】
【化２７】 （１１）
【００５５】
【化２８】 （１２）
【００５６】
【化２９】 （上記（１）〜（１２）の式中、Ｒ'1〜Ｒ'7及びＲ"1〜
Ｒ"7はＲ1 〜Ｒ7 と同様に水素原子、ハロゲン原子、ア
ルキル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、スチ
リル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、シ
アノ基、又はアリールアゾ基を示し、またＲ'1〜Ｒ'7及
びＲ"1〜Ｒ"7はＲ1 〜Ｒ7 と同様に置換または未置換の
縮合環を形成してもよい。ｎは０，１または２を、ｒは
１から８までの整数を、Ｓは０又は１をｔは１又は２を
示す。
Ｒ"7はＲ1 〜Ｒ7 と同様に水素原子、ハロゲン原子、ア
ルキル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、スチ
リル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、シ
アノ基、又はアリールアゾ基を示し、またＲ'1〜Ｒ'7及
びＲ"1〜Ｒ"7はＲ1 〜Ｒ7 と同様に置換または未置換の
縮合環を形成してもよい。ｎは０，１または２を、ｒは
１から８までの整数を、Ｓは０又は１をｔは１又は２を
示す。
【００５７】Ｍ2 は含窒素複素環を完成するに必要な非
金属原子群を表わす。
金属原子群を表わす。
【００５８】具体例としては、Ｍ2 はピリジン、チアゾ
ール、ベンゾチアゾール、ナフトチアゾール、オキサゾ
ール、ベンゾオキサゾール、ナフトオキサゾール、イミ
ダゾール、ベンズイミダゾール、ナフトイミダゾール、
２−キノリン、４−キノリン、イソキノリン又はインド
ールなどの含窒素複素環を完成するに必要な原子群で、
ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、沃素原子など）、
アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチルな
ど）、アリール基（フェニル、トリル、キシリルな
ど）、アラルキル（ベンジル、Ｐ−トリメチルなど）に
よって置換されていてもよい。
ール、ベンゾチアゾール、ナフトチアゾール、オキサゾ
ール、ベンゾオキサゾール、ナフトオキサゾール、イミ
ダゾール、ベンズイミダゾール、ナフトイミダゾール、
２−キノリン、４−キノリン、イソキノリン又はインド
ールなどの含窒素複素環を完成するに必要な原子群で、
ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、沃素原子など）、
アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチルな
ど）、アリール基（フェニル、トリル、キシリルな
ど）、アラルキル（ベンジル、Ｐ−トリメチルなど）に
よって置換されていてもよい。
【００５９】Ｒ22は、水素原子、ニトロ基、スルホネー
ト基、シアノ基、アルキル基（メチル、エチル、プロピ
ル、ブチルなど）又はアリール基（フェニル、トリル、
キシリルなど）を表わす。Ｒ23はアルキル基（メチル、
エチル、プロピル、ブチルなど）、置換アルキル基、
（２−ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、２−エ
トキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、３−メトキシ
プロピル、３−エトキシプロピル、３−クロロプロピ
ル、３−ブロモプロピル、３−カルボキシプロピルな
ど）、環式アルキル基（シクロヘキシル、シクロプロピ
ル）、アリル、アラルキル基（ベンジル、２−フェニル
エチル、３−フェニルプロピル、３−フェニルブチル、
４−フェニルブチル、α−ナフチルメチル、β−ナフチ
ルメチル）、置換アラルキル基（メチルベンジル、エチ
ルベンジル、ジメチルベンジル、トリメチルベンジル、
クロロベンジル、ブロモベンジルなど）、アリール基
（フェニル、トリル、キシリル、α−ナフチル、β−ナ
フチル）又は置換アリール基（クロロフェニル、ジクロ
ロフェニル、トリクロロフェニル、エチルフェニル、メ
トキシフェニル、ジメトキシフェニル、アミノフェニ
ル、スルフォートフェニル、ニトロフェニル、ヒドロキ
シフェニルなど）を表わす。
ト基、シアノ基、アルキル基（メチル、エチル、プロピ
ル、ブチルなど）又はアリール基（フェニル、トリル、
キシリルなど）を表わす。Ｒ23はアルキル基（メチル、
エチル、プロピル、ブチルなど）、置換アルキル基、
（２−ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、２−エ
トキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、３−メトキシ
プロピル、３−エトキシプロピル、３−クロロプロピ
ル、３−ブロモプロピル、３−カルボキシプロピルな
ど）、環式アルキル基（シクロヘキシル、シクロプロピ
ル）、アリル、アラルキル基（ベンジル、２−フェニル
エチル、３−フェニルプロピル、３−フェニルブチル、
４−フェニルブチル、α−ナフチルメチル、β−ナフチ
ルメチル）、置換アラルキル基（メチルベンジル、エチ
ルベンジル、ジメチルベンジル、トリメチルベンジル、
クロロベンジル、ブロモベンジルなど）、アリール基
（フェニル、トリル、キシリル、α−ナフチル、β−ナ
フチル）又は置換アリール基（クロロフェニル、ジクロ
ロフェニル、トリクロロフェニル、エチルフェニル、メ
トキシフェニル、ジメトキシフェニル、アミノフェニ
ル、スルフォートフェニル、ニトロフェニル、ヒドロキ
シフェニルなど）を表わす。
【００６０】Ｒ24は置換又は未置換のアリール基あるい
はそれらのカチオン基を表わし、具体的には、Ｒ24は置
換又は未置換のアリール基（フェニル、トリル、キシリ
ル、ビフェニル、アミノフェニル、α−ナフチル、β−
ナフチル、アントラリル、ピレニル、メトキシフェニ
ル、ジメトキシフェニル、トリメトキシフェニル、エト
キシフェニル、ジエトキシフェニル、クロロフェニル、
ジクロロフェニル、トリクロロフェニル、ブロモフェニ
ル、ジブロモフェニル、トリブロモフェニル、エチルフ
ェニル、ジエチルフェニル、ニトロフェニル、アミノフ
ェミル、ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェ
ニル、ジベンジルアミノフェニル、ジプロピルアミノフ
ェニル、モルホリノフェニル、ピペリジニルフェニル、
ピペラジノフェニル、ジフェニルアミノフェニル、アセ
チルアミノフェニル、ベンゾイルアミノフェニル、アセ
チルフェニル、ベンゾイルフェニル、シアノフェニル、
スルフォホネートフェニル、カルボキシレートフェニル
など）を示す。
はそれらのカチオン基を表わし、具体的には、Ｒ24は置
換又は未置換のアリール基（フェニル、トリル、キシリ
ル、ビフェニル、アミノフェニル、α−ナフチル、β−
ナフチル、アントラリル、ピレニル、メトキシフェニ
ル、ジメトキシフェニル、トリメトキシフェニル、エト
キシフェニル、ジエトキシフェニル、クロロフェニル、
ジクロロフェニル、トリクロロフェニル、ブロモフェニ
ル、ジブロモフェニル、トリブロモフェニル、エチルフ
ェニル、ジエチルフェニル、ニトロフェニル、アミノフ
ェミル、ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェ
ニル、ジベンジルアミノフェニル、ジプロピルアミノフ
ェニル、モルホリノフェニル、ピペリジニルフェニル、
ピペラジノフェニル、ジフェニルアミノフェニル、アセ
チルアミノフェニル、ベンゾイルアミノフェニル、アセ
チルフェニル、ベンゾイルフェニル、シアノフェニル、
スルフォホネートフェニル、カルボキシレートフェニル
など）を示す。
【００６１】Ｒ25は複素環基あるいはそれらのカチオン
基を表わし、より具体的にはＲ25はフラン、チオフェ
ン、ベンゾフラン、チオナフテン、ジベンゾフラン、カ
ルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ピリジ
ンなどの複素環から誘導された１価の複素環基を表わ
す。
基を表わし、より具体的にはＲ25はフラン、チオフェ
ン、ベンゾフラン、チオナフテン、ジベンゾフラン、カ
ルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ピリジ
ンなどの複素環から誘導された１価の複素環基を表わ
す。
【００６２】Ｒ26は水素原子、アルキル基（メチル、エ
チル、プロピル、ブチルなど）又は置換又は未置換のア
リール基（フェニル、トリル、キシリル、ビフェニル、
エチルフェニル、クロロフェニル、メトキシフェニル、
エトキシフェニル、ニトロフェニル、アミノフェニル、
ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニル、ア
セチルアミノフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、
アントラリル、ピレニル、スルフォホネートフェニル、
カルボキシレートフェニルなど）を表わす。
チル、プロピル、ブチルなど）又は置換又は未置換のア
リール基（フェニル、トリル、キシリル、ビフェニル、
エチルフェニル、クロロフェニル、メトキシフェニル、
エトキシフェニル、ニトロフェニル、アミノフェニル、
ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニル、ア
セチルアミノフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、
アントラリル、ピレニル、スルフォホネートフェニル、
カルボキシレートフェニルなど）を表わす。
【００６３】式中、Ｚ7 は置換されていてもよいピラ
ン、チアピラン、セレナピラン、テルロピラン、ベンゾ
ピラン、ベンゾチアピラン、ベンゾセレナピラン、ベン
ゾテルロピラン、ナフトピラン、ナフトチアピラン又は
ナフトセレナピラン、ナフトテルロピランを完成するに
必要な原子群を示す。
ン、チアピラン、セレナピラン、テルロピラン、ベンゾ
ピラン、ベンゾチアピラン、ベンゾセレナピラン、ベン
ゾテルロピラン、ナフトピラン、ナフトチアピラン又は
ナフトセレナピラン、ナフトテルロピランを完成するに
必要な原子群を示す。
【００６４】Ｌ7 は、硫黄原子、酸素原子又はセレン原
子、テルル原子を表わす。
子、テルル原子を表わす。
【００６５】Ｒ27及びＲ28は、水素原子、アルコキシル
基、置換又は未置換のアリール基、アルケニル基、複素
環基を表わす。
基、置換又は未置換のアリール基、アルケニル基、複素
環基を表わす。
【００６６】より具体的にはＲ27およびＲ28は水素原
子、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチルな
ど）、アルキルスルフォネート基、アルコキシル基（メ
トキシ、エトキシ、プロポキシ、エトキシエチル、メト
キシエチルなど）アリール基（フェニル、トリル、キシ
リル、スルフォールトフェニル、クロロフェニル、ビフ
ェニル、メトキシフェニルなど）、置換もしくは未置換
のスチリル基（スチリル、ｐ−メチルスチリル、ｏ−ク
ロロスチリル、ｐ−メトキシスチリル等）、置換もしく
は未置換の４−フェニル、１，３−ブタジエニル基（４
−フェニル、１，３−ブタジエニル、４−（ｐ−メチル
フェニル）、１，３−ブタジエニルなど）、又は置換も
しくは未置換の複素環基（キノリル、ピリジル、カルバ
ゾリル、フリルなど）を表わす。
子、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチルな
ど）、アルキルスルフォネート基、アルコキシル基（メ
トキシ、エトキシ、プロポキシ、エトキシエチル、メト
キシエチルなど）アリール基（フェニル、トリル、キシ
リル、スルフォールトフェニル、クロロフェニル、ビフ
ェニル、メトキシフェニルなど）、置換もしくは未置換
のスチリル基（スチリル、ｐ−メチルスチリル、ｏ−ク
ロロスチリル、ｐ−メトキシスチリル等）、置換もしく
は未置換の４−フェニル、１，３−ブタジエニル基（４
−フェニル、１，３−ブタジエニル、４−（ｐ−メチル
フェニル）、１，３−ブタジエニルなど）、又は置換も
しくは未置換の複素環基（キノリル、ピリジル、カルバ
ゾリル、フリルなど）を表わす。
【００６７】一般式II及びIII のＦ2 及びＦ3 について
もＦ1 と同様のことがいえる。
もＦ1 と同様のことがいえる。
【００６８】但しその場合は、Ｆ1 で表わされる符号
Ｒ'8〜Ｒ'14 がそれぞれＲ'1〜Ｒ'7にＲ"8〜Ｒ"14 がそ
れぞれＲ"1〜Ｒ"7に対応し、又Ｆ3 に関していえば、
Ｒ'14 〜Ｒ'21 がそれぞれＲ'1〜Ｒ'7にＲ"14 〜Ｒ"21
がそれぞれＲ"1〜Ｒ"7に対応している。
Ｒ'8〜Ｒ'14 がそれぞれＲ'1〜Ｒ'7にＲ"8〜Ｒ"14 がそ
れぞれＲ"1〜Ｒ"7に対応し、又Ｆ3 に関していえば、
Ｒ'14 〜Ｒ'21 がそれぞれＲ'1〜Ｒ'7にＲ"14 〜Ｒ"21
がそれぞれＲ"1〜Ｒ"7に対応している。
【００６９】なお、上記（１）〜（１２）のアズレニウ
ム核中、（３），（９），（１０）の式で表わされるも
のがより好ましく用いられる。特に（３）式が好まし
い。
ム核中、（３），（９），（１０）の式で表わされるも
のがより好ましく用いられる。特に（３）式が好まし
い。
【００７０】Ｒ1 〜Ｒ28，Ｒ'1〜Ｒ'21 ，Ｒ"1〜Ｒ"21
は一般式（Ｉ），（II），（III ）で示される化合物
（標識材）に水溶性を付与するために一つ以上の周知の
極性基を含むことが好ましい。該極性基には、例えばヒ
ドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホネート基、
アルキルスルホネート基、カルボキシレート基、アルキ
ルカルボキシレート基、４級アンモニウム塩基などが含
まれる。また、Ｒ1 〜Ｒ28，Ｒ'1〜Ｒ'21 ，Ｒ"1〜Ｒ"
21 は一般式（Ｉ）の化合物が生体由来物質と共有結合
を形成可能にするために、一つ以上の周知の反応性基を
含むことが好ましい。
は一般式（Ｉ），（II），（III ）で示される化合物
（標識材）に水溶性を付与するために一つ以上の周知の
極性基を含むことが好ましい。該極性基には、例えばヒ
ドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホネート基、
アルキルスルホネート基、カルボキシレート基、アルキ
ルカルボキシレート基、４級アンモニウム塩基などが含
まれる。また、Ｒ1 〜Ｒ28，Ｒ'1〜Ｒ'21 ，Ｒ"1〜Ｒ"
21 は一般式（Ｉ）の化合物が生体由来物質と共有結合
を形成可能にするために、一つ以上の周知の反応性基を
含むことが好ましい。
【００７１】該反応性基としては、イソシアネート、イ
ソチオシアネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジド
アミノ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
などの反応性部位を含む。また、これらの反応性部位は
標識材と生体由来物質との結合の立体障害を防ぐ目的で
ソチオシアネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジド
アミノ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
などの反応性部位を含む。また、これらの反応性部位は
標識材と生体由来物質との結合の立体障害を防ぐ目的で
【００７２】
【化３０】 （ｎ＝０，１〜６）などのスペーサ部を介在させてもよ
い。
い。
【００７３】特に上記反応性基として好ましいものは、
イソチオシアネート、スルホスクシンイミドエステル、
スクシンイミドエステル、マレイミドなどである。
イソチオシアネート、スルホスクシンイミドエステル、
スクシンイミドエステル、マレイミドなどである。
【００７４】
【外１５】 はアニオンで、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物
イオン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸塩イオ
ン、ｐ−トルエンスルホン酸塩イオン、メチル硫酸塩イ
オン、エチル硫酸塩イオン、プロピル硫酸塩イオン、テ
トラフルオロホウ酸塩イオン、テトラフェニルホウ酸塩
イオン、ヘキサフルオロリン酸塩イオン、ベンゼンスル
フィン酸塩イオン、酢酸塩イオン、トリフルオロ酢酸塩
イオン、プロピオン酸塩イオン、安息香酸塩イオン、シ
ュウ酸塩イオン、コハク酸塩イオン、マロン酸塩イオ
ン、オレイン酸塩イオン、ステアリン酸塩イオン、クエ
ン酸塩イオン、一水素二リン酸塩イオン、二水素一リン
酸塩イオン、ペンタクロロスズ酸塩イオン、クロロスル
ホン酸塩イオン、フルオロスルホン酸塩イオン、トリフ
ルオロメタンスルホン酸塩イオン、ヘキサフルオロアン
チモン酸塩イオン、モリブテン酸塩イオン、タングステ
ン酸塩イオン、チタン酸塩イオン、ジルコン酸塩イオン
などを表わす。
イオン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸塩イオ
ン、ｐ−トルエンスルホン酸塩イオン、メチル硫酸塩イ
オン、エチル硫酸塩イオン、プロピル硫酸塩イオン、テ
トラフルオロホウ酸塩イオン、テトラフェニルホウ酸塩
イオン、ヘキサフルオロリン酸塩イオン、ベンゼンスル
フィン酸塩イオン、酢酸塩イオン、トリフルオロ酢酸塩
イオン、プロピオン酸塩イオン、安息香酸塩イオン、シ
ュウ酸塩イオン、コハク酸塩イオン、マロン酸塩イオ
ン、オレイン酸塩イオン、ステアリン酸塩イオン、クエ
ン酸塩イオン、一水素二リン酸塩イオン、二水素一リン
酸塩イオン、ペンタクロロスズ酸塩イオン、クロロスル
ホン酸塩イオン、フルオロスルホン酸塩イオン、トリフ
ルオロメタンスルホン酸塩イオン、ヘキサフルオロアン
チモン酸塩イオン、モリブテン酸塩イオン、タングステ
ン酸塩イオン、チタン酸塩イオン、ジルコン酸塩イオン
などを表わす。
【００７５】これら標識材の具体例を表１、表２、表３
に示すがこれらに限定はされない。
に示すがこれらに限定はされない。
【００７６】またこれらアズレン系色素の合成法は、Ｕ
ＳＰ４，７３８，９０８に記載されている。
ＳＰ４，７３８，９０８に記載されている。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】 これら例示した標識材は、近赤外域７００〜９００ｎｍ
の波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数εは５
０，０００〜３００，０００ｌ／mol・cmの範囲にある。
また、例示した標識材は強い蛍光を発するものも含まれ
る。
の波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数εは５
０，０００〜３００，０００ｌ／mol・cmの範囲にある。
また、例示した標識材は強い蛍光を発するものも含まれ
る。
【００８４】表４に半導体レーザー波長領域で蛍光を示
す標識材の最大吸収波長（λmax ）と、最大蛍光波長
（λem）とを示す。（溶媒：エタノール／ジクロロメタ
ン＝１／４）
す標識材の最大吸収波長（λmax ）と、最大蛍光波長
（λem）とを示す。（溶媒：エタノール／ジクロロメタ
ン＝１／４）
【００８５】
【表８】 また、NO３の標識材に８３０ｎｍの半導体レーザー光
（１０ｍＷ）を入射したときの蛍光発光波形を図１に示
す。測定装置はＩＭＵＣ（大塚電子）である。
（１０ｍＷ）を入射したときの蛍光発光波形を図１に示
す。測定装置はＩＭＵＣ（大塚電子）である。
【００８６】また、もう一方、本発明において用いる標
識材は一般式（IV）の化合物であるが、式中、Ａ，Ｂ，
Ｄ及びＥは、水素原子又はアルキル基（例えば、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ −プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、ｓｅｃ −ブチル基、ｉｓｏ −ブチル基、ｔ−
ブチル基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル
基、ｎ−オクチル基、ｔ−オクチル基など）を示し、さ
らに他のアルキル基、例えば置換アルキル基（例えば、
２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、
４−ヒドロキシブチル基、２−アセトキシエチル基、カ
ルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、３−カル
ボキシプロピル基、２−スルホエチル基、３−スルホプ
ロピル基、４−スルホブチル基、３−スルフェートプロ
ピル基、４−スルフェートブチル基、Ｎ−（メチルスル
ホニル）−カルバミルメチル基、３−（アセチルスルフ
ァミル）プロピル基、４−（アセチルスルファミル）ブ
チル基など、環式アルキル基（例えば、シクロヘキシル
基など）、アリル基（ＣＨ２ ＝ＣＨ−ＣＨ２ −）、
アルケニル基（ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、
ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニ
ル基、ドデシニル基、プレニル基など）、アラルキル基
（例えば、ベンジル基、フェネチル基、α−ナフチルメ
チル基、β−ナフチルメチル基など）、置換アラルキル
基（例えば、カルボキシベンジル基、スルホベンジル
基、ヒドロキシベンジル基など）、置換もしくは未置換
のアリール基（例えば、フェニル基、アミノフェニル
基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、メトキシフェ
ニル基、ジメトキシフェニル基、トリメトキシフェニル
基、エトキシフェニル基、ジメチルアミノフェニル基、
ジエチルアミノフェニル基、ジプロピルアミノフェニル
基、ジベンジルアミノフェニル基、ジフェニルアミノフ
ェニル基、スルホネートフェニル基、カルボキシレート
フェニル基など）、置換もしくは未置換の複素環基（例
えば、ピリジル基、キノリル基、レピジル基、メチルピ
リジル基、フリル基、チェニル基、インドリル基、ピロ
ール基、カルバゾリル基、Ｎ−エチルカルバゾリル基な
ど）又は置換もしくは未置換のスチリル基（例えば、ス
チリル基、メトキシスチリル基、ジメトキシスチリル
基、トリメトキシスチリル基、エトキシスチリル基、ア
ミノスチリル基、ジメチルアミノスチリル基、ジエチル
アミノスチリル基、ジプロピルアミノスチリル基、ジベ
ンジルアミノスチリル基、ジフェニルアミノスチリル
基、２，２−ジフェニルビニル基、２−フェニル−２−
メチルビニル基、２−（ジメチルアミノフェニル）−２
−フェニルビニル基、２−（ジエチルアミノフェニル）
−２−フェニルビニル基、２−（ジベンジルアミノフェ
ニル）−２−フェニルビニル基、２，２−ジ（ジエチル
アミノフェニル）ビニル基、２，２−ジ（メトキシフェ
ニル）ビニル基、２，２−ジ（エトキシフェニル）ビニ
ル基、２−（ジメチルアミノフェニル）−２−メチルビ
ニル基、２−（ジエチルアミノフェニル）−２−エチル
ビニル基など）を示す。
識材は一般式（IV）の化合物であるが、式中、Ａ，Ｂ，
Ｄ及びＥは、水素原子又はアルキル基（例えば、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ −プロピル基、ｎ−ブチ
ル基、ｓｅｃ −ブチル基、ｉｓｏ −ブチル基、ｔ−
ブチル基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル
基、ｎ−オクチル基、ｔ−オクチル基など）を示し、さ
らに他のアルキル基、例えば置換アルキル基（例えば、
２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、
４−ヒドロキシブチル基、２−アセトキシエチル基、カ
ルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、３−カル
ボキシプロピル基、２−スルホエチル基、３−スルホプ
ロピル基、４−スルホブチル基、３−スルフェートプロ
ピル基、４−スルフェートブチル基、Ｎ−（メチルスル
ホニル）−カルバミルメチル基、３−（アセチルスルフ
ァミル）プロピル基、４−（アセチルスルファミル）ブ
チル基など、環式アルキル基（例えば、シクロヘキシル
基など）、アリル基（ＣＨ２ ＝ＣＨ−ＣＨ２ −）、
アルケニル基（ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、
ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニ
ル基、ドデシニル基、プレニル基など）、アラルキル基
（例えば、ベンジル基、フェネチル基、α−ナフチルメ
チル基、β−ナフチルメチル基など）、置換アラルキル
基（例えば、カルボキシベンジル基、スルホベンジル
基、ヒドロキシベンジル基など）、置換もしくは未置換
のアリール基（例えば、フェニル基、アミノフェニル
基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、メトキシフェ
ニル基、ジメトキシフェニル基、トリメトキシフェニル
基、エトキシフェニル基、ジメチルアミノフェニル基、
ジエチルアミノフェニル基、ジプロピルアミノフェニル
基、ジベンジルアミノフェニル基、ジフェニルアミノフ
ェニル基、スルホネートフェニル基、カルボキシレート
フェニル基など）、置換もしくは未置換の複素環基（例
えば、ピリジル基、キノリル基、レピジル基、メチルピ
リジル基、フリル基、チェニル基、インドリル基、ピロ
ール基、カルバゾリル基、Ｎ−エチルカルバゾリル基な
ど）又は置換もしくは未置換のスチリル基（例えば、ス
チリル基、メトキシスチリル基、ジメトキシスチリル
基、トリメトキシスチリル基、エトキシスチリル基、ア
ミノスチリル基、ジメチルアミノスチリル基、ジエチル
アミノスチリル基、ジプロピルアミノスチリル基、ジベ
ンジルアミノスチリル基、ジフェニルアミノスチリル
基、２，２−ジフェニルビニル基、２−フェニル−２−
メチルビニル基、２−（ジメチルアミノフェニル）−２
−フェニルビニル基、２−（ジエチルアミノフェニル）
−２−フェニルビニル基、２−（ジベンジルアミノフェ
ニル）−２−フェニルビニル基、２，２−ジ（ジエチル
アミノフェニル）ビニル基、２，２−ジ（メトキシフェ
ニル）ビニル基、２，２−ジ（エトキシフェニル）ビニ
ル基、２−（ジメチルアミノフェニル）−２−メチルビ
ニル基、２−（ジエチルアミノフェニル）−２−エチル
ビニル基など）を示す。
【００８７】ｒ１’，ｒ２’は水素原子又はアルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓ
ｏ −プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ −ブチル
基、ｉｓｏ −ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−アミル
基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、
ｔ−オクチル基など）を示し、さらに他のアルキル基、
例えば置換アルキル基（例えば、２−ヒドロキシエチル
基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル
基、２−アセトキシエチル基、カルボキシメチル基、２
−カルボキシエチル基、３−カルボキシプロピル基、２
−スルホエチル基、３−スルホプロピル基、４−スルホ
ブチル基、３−スルフェートプロピル基、４−スルフェ
ートブチル基、Ｎ−（メチルスルホニル）−カルバミル
メチル基、３−（アセチルスルファミル）プロピル基、
４−（アセチルスルファミル）ブチル基など）、環式ア
ルキル基（例えば、シクロヘキシル基など）、アリル基
（ＣＨ２ ＝ＣＨ−ＣＨ２ −）、アルケニル基（ビニ
ル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキ
セニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ドデシニル
基、プレニル基など）、アラルキル基（例えば、ベンジ
ル基、フェネチル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフ
チルメチル基など）、置換アラルキル基（例えば、カル
ボキシベンジル基、スルホベンジル基、ヒドロキシベン
ジル基など）を包含する。
（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓ
ｏ −プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ −ブチル
基、ｉｓｏ −ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−アミル
基、ｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、
ｔ−オクチル基など）を示し、さらに他のアルキル基、
例えば置換アルキル基（例えば、２−ヒドロキシエチル
基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル
基、２−アセトキシエチル基、カルボキシメチル基、２
−カルボキシエチル基、３−カルボキシプロピル基、２
−スルホエチル基、３−スルホプロピル基、４−スルホ
ブチル基、３−スルフェートプロピル基、４−スルフェ
ートブチル基、Ｎ−（メチルスルホニル）−カルバミル
メチル基、３−（アセチルスルファミル）プロピル基、
４−（アセチルスルファミル）ブチル基など）、環式ア
ルキル基（例えば、シクロヘキシル基など）、アリル基
（ＣＨ２ ＝ＣＨ−ＣＨ２ −）、アルケニル基（ビニ
ル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキ
セニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ドデシニル
基、プレニル基など）、アラルキル基（例えば、ベンジ
ル基、フェネチル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフ
チルメチル基など）、置換アラルキル基（例えば、カル
ボキシベンジル基、スルホベンジル基、ヒドロキシベン
ジル基など）を包含する。
【００８８】またＡ，Ｂ，Ｄ，ｒ１’，ｒ２’は好まし
くは一般式（Ｉ）の標識材（色素）に水溶性を付与する
ために一つ以上の周知の極性基を含む。該極性基には例
えばヒドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホン
基、アルキルスルホン基、カルボキシル基、アルキシカ
ルボキシル基、４級アンモニウム塩基などが含まれる。
また、Ａ，Ｂ，Ｄ，ｒ１’，ｒ２’は一般式（Ｉ）の標
識材が生体由来物質と共有結合を形成可能にするため
に、一つ以上の周知の反応性基を含むことが好ましい。
くは一般式（Ｉ）の標識材（色素）に水溶性を付与する
ために一つ以上の周知の極性基を含む。該極性基には例
えばヒドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホン
基、アルキルスルホン基、カルボキシル基、アルキシカ
ルボキシル基、４級アンモニウム塩基などが含まれる。
また、Ａ，Ｂ，Ｄ，ｒ１’，ｒ２’は一般式（Ｉ）の標
識材が生体由来物質と共有結合を形成可能にするため
に、一つ以上の周知の反応性基を含むことが好ましい。
【００８９】該反応性基としては、イソシアネート、イ
ソチオシナネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジ
ド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドなど
の反応性部位を含む。これらの反応性部位は標識材と生
体由来物質との結合の立体障害を防ぐ目的で
ソチオシナネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジ
ド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドなど
の反応性部位を含む。これらの反応性部位は標識材と生
体由来物質との結合の立体障害を防ぐ目的で
【００９０】
【化３１】 （ｎ＝０，１〜６）などのスペーサ部を介在させてもよ
い。特に上記反応性基として好ましいものは、イソチオ
シアネート、スクシンイミドエステル、スルホスクシン
イミドエステル、マレイミドである。
い。特に上記反応性基として好ましいものは、イソチオ
シアネート、スクシンイミドエステル、スルホスクシン
イミドエステル、マレイミドである。
【００９１】又一般式（IV）中のｋは０又は１でｌは
０，１又は２である。
０，１又は２である。
【００９２】
【外１６】 はアニオンで、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオ
ン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、Ｐ
−トルエンスルホン酸イオン、メチル硫酸イオン、エチ
ル硫酸イオン、プロピル硫酸イオン、テトラフルオロホ
ウ酸イオン、テトラフェニルホウ酸イオン、ヘキサフル
オロリン酸イオン、ベンゼンスルフィン酸イオン、酢酸
イオン、トリフルオロ酢酸イオン、プロピオン酸イオ
ン、安息香酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオ
ン、マロン酸イオン、オレイン酸イオン、ステアリン酸
イオン、クエン酸イオン、一水素二リン酸イオン、二水
素一リン酸イオン、ペシタクロロスズ酸イオン、クロロ
スルホン酸イオン、フルオロスルホン酸イオン、トリフ
ルオロメタンスルホン酸イオン、ヘキサフルオロアンチ
モン酸イオン、モリブデン酸イオン、タングステン酸イ
オン、チタン酸イオン、ジルコン酸イオンなどを表わ
す。
ン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、Ｐ
−トルエンスルホン酸イオン、メチル硫酸イオン、エチ
ル硫酸イオン、プロピル硫酸イオン、テトラフルオロホ
ウ酸イオン、テトラフェニルホウ酸イオン、ヘキサフル
オロリン酸イオン、ベンゼンスルフィン酸イオン、酢酸
イオン、トリフルオロ酢酸イオン、プロピオン酸イオ
ン、安息香酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオ
ン、マロン酸イオン、オレイン酸イオン、ステアリン酸
イオン、クエン酸イオン、一水素二リン酸イオン、二水
素一リン酸イオン、ペシタクロロスズ酸イオン、クロロ
スルホン酸イオン、フルオロスルホン酸イオン、トリフ
ルオロメタンスルホン酸イオン、ヘキサフルオロアンチ
モン酸イオン、モリブデン酸イオン、タングステン酸イ
オン、チタン酸イオン、ジルコン酸イオンなどを表わ
す。
【００９３】これらの標識材の具体例を表５に示すがこ
れらに限定されない。
れらに限定されない。
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
【表１１】
【００９７】
【表１２】
【００９８】
【表１３】 これら例示した標識材（色素）は、近赤外域７００〜９
００ｎｍの波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数
εは５０，０００〜３００，０００l/mol ・cmの範囲に
ある。また例示した標識材の一部は強い蛍光を発するも
のも含まれる。
００ｎｍの波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数
εは５０，０００〜３００，０００l/mol ・cmの範囲に
ある。また例示した標識材の一部は強い蛍光を発するも
のも含まれる。
【００９９】例えば、表５で例示したＮｏ３の色素は、
近赤外域の波長８１９ｎｍで最大吸収を示し、蛍光を発
する。その最大蛍光波長（λｅｍ）は８６４ｎｍであ
る。（溶媒：ジクロロメタン） 本発明においては、上記標識体を生体由来物質に担持さ
せるものであるが、担持させる生体由来物質の選択は、
分析すべき物質又は被検体によって決まる。即ち、生体
由来物質は被検体に対して、生物学的特異性を示すもの
を選択すると、特異的検出が可能になる。ここで言う、
生体由来物質は天然もしくは合成のペプチド、蛋白質、
酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細菌、核酸、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、抗原（例えばリコンビナント抗原も含む）
抗体などを含む。また臨床病理的に特に有用な物質とし
ては、以下のものがあげられる。
近赤外域の波長８１９ｎｍで最大吸収を示し、蛍光を発
する。その最大蛍光波長（λｅｍ）は８６４ｎｍであ
る。（溶媒：ジクロロメタン） 本発明においては、上記標識体を生体由来物質に担持さ
せるものであるが、担持させる生体由来物質の選択は、
分析すべき物質又は被検体によって決まる。即ち、生体
由来物質は被検体に対して、生物学的特異性を示すもの
を選択すると、特異的検出が可能になる。ここで言う、
生体由来物質は天然もしくは合成のペプチド、蛋白質、
酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細菌、核酸、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、抗原（例えばリコンビナント抗原も含む）
抗体などを含む。また臨床病理的に特に有用な物質とし
ては、以下のものがあげられる。
【０１００】ＩｇＧ．ＩｇＭ．ＩｇＥなどの免疫グロブ
リン：補体、ＣＲＰ．フェリチン、α1 マイクログロブ
リン、β2 マイクログロブリンなどの血漿蛋白およびそ
れらの抗体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ
１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エ
ストロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体：ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ．ＨＢｅ．ＨＢｃ）．
ＨＩＶ．ＡＴＬなどウイスル感染関連物質およびそれら
の抗体：ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズ
マ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体：トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニ
ア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体：フェニトイン、フェノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体：その他酵素、菌体外毒素（スチレリジン
Ｏなど）およびそれらの抗体などがあり、検体中の被測
定物質と抗原−抗体反応等を起こす物質が検体の種類に
応じて適宜選択されて使用される。
リン：補体、ＣＲＰ．フェリチン、α1 マイクログロブ
リン、β2 マイクログロブリンなどの血漿蛋白およびそ
れらの抗体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ
１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エ
ストロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体：ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ．ＨＢｅ．ＨＢｃ）．
ＨＩＶ．ＡＴＬなどウイスル感染関連物質およびそれら
の抗体：ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズ
マ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体：トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニ
ア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体：フェニトイン、フェノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体：その他酵素、菌体外毒素（スチレリジン
Ｏなど）およびそれらの抗体などがあり、検体中の被測
定物質と抗原−抗体反応等を起こす物質が検体の種類に
応じて適宜選択されて使用される。
【０１０１】本発明において標識材を上記生理活性物質
等の生体由来物質に担持（固定化）させるには以下の公
知の方法が利用できる。
等の生体由来物質に担持（固定化）させるには以下の公
知の方法が利用できる。
【０１０２】例えば、ｉ）イオン結合法、ii）物理吸着
法、iii)共有結合法などが挙げられる。
法、iii)共有結合法などが挙げられる。
【０１０３】イオン結合法は、主に正の電荷をもつ標識
材を静電的に蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体由来物質
に結合させるものである。
材を静電的に蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体由来物質
に結合させるものである。
【０１０４】物理吸着法は、標識材の親油性部と蛋白質
の親油性部との疎水結合を利用する結合法である。
の親油性部との疎水結合を利用する結合法である。
【０１０５】イオン結合法、および物理吸着法において
は結合反応工程は簡単であるが、標識材と生体由来物質
との結合力が弱い。
は結合反応工程は簡単であるが、標識材と生体由来物質
との結合力が弱い。
【０１０６】一方、共有結合法は、標識材又は生体由来
物質の少なくとも一方に反応性の高い官能基を結合し、
これを介して両者を共有結合するものであり、強固な結
合力が得られる。共有結合法により標識材と生体活性物
質等の生体由来物質とを結合させる際に、生体由来物質
中の結合に関与できる官能基としては、遊離のアミノ
基、水酸基、リン酸基、カルボキシル基、システインの
スルフヒドリル基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロ
シンのフェノール基、セリン，トレオニンの水酸基など
がある。
物質の少なくとも一方に反応性の高い官能基を結合し、
これを介して両者を共有結合するものであり、強固な結
合力が得られる。共有結合法により標識材と生体活性物
質等の生体由来物質とを結合させる際に、生体由来物質
中の結合に関与できる官能基としては、遊離のアミノ
基、水酸基、リン酸基、カルボキシル基、システインの
スルフヒドリル基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロ
シンのフェノール基、セリン，トレオニンの水酸基など
がある。
【０１０７】これらの官能基は、種々のジアゾニウム
塩、酸アミド、イソシアナート、活性型のハロゲン化ア
ルキル基、活性型のエステル基などと反応する。従っ
て、これらの官能基を標識材に導入することにより、種
々の方法で色素を生体由来物質に担持できる。一方、生
体由来物質、特に蛋白質を含む生体由来物質の高次構造
は、水素結合、疎水結合、イオン結合などの比較的弱い
結合によって保持されているため壊れ易く、従って標識
材との固定化に際しては、高温、強酸、強アルカリなど
の処理を避けて、緩和な条件下に行なうことが望まし
い。
塩、酸アミド、イソシアナート、活性型のハロゲン化ア
ルキル基、活性型のエステル基などと反応する。従っ
て、これらの官能基を標識材に導入することにより、種
々の方法で色素を生体由来物質に担持できる。一方、生
体由来物質、特に蛋白質を含む生体由来物質の高次構造
は、水素結合、疎水結合、イオン結合などの比較的弱い
結合によって保持されているため壊れ易く、従って標識
材との固定化に際しては、高温、強酸、強アルカリなど
の処理を避けて、緩和な条件下に行なうことが望まし
い。
【０１０８】緩和な条件下に固定化反応を行う１つの方
法として、標識材と生体由来物質の官能基とに反応する
二官能性の架橋剤を使用することができる。二官能性の
架橋剤としては例えば、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’で
表わされるカルボジイミド、一般式ＣＨＯ−Ｒ−ＣＨＯ
で表わされるジアルデヒド、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝
Ｏで表わされるジイソシアネート、などがある。
法として、標識材と生体由来物質の官能基とに反応する
二官能性の架橋剤を使用することができる。二官能性の
架橋剤としては例えば、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’で
表わされるカルボジイミド、一般式ＣＨＯ−Ｒ−ＣＨＯ
で表わされるジアルデヒド、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝
Ｏで表わされるジイソシアネート、などがある。
【０１０９】（Ｒ，Ｒ’は同一、又は異なる置換、また
は未置換のアルキル基、アリール基、アルキルアリール
基又は、アリールアルキル基である） 上記のようにして得た、標識材を生体由来物質に担持さ
せた標識複合体を用いて、特定の目的物質を分析する方
法について述べる。
は未置換のアルキル基、アリール基、アルキルアリール
基又は、アリールアルキル基である） 上記のようにして得た、標識材を生体由来物質に担持さ
せた標識複合体を用いて、特定の目的物質を分析する方
法について述べる。
【０１１０】ターゲット（分析対象物）が一種の細胞で
あるときは、標識複合体が、標識複合体に結合している
生体由来物質と相補的な細胞上の特定物質と、抗原、抗
体反応、核酸同志の水素結合等の特異的結合で結合し、
このような抗原、抗体もしくは核酸の量をその系の蛍光
量もしくは吸光度から測定することができる。
あるときは、標識複合体が、標識複合体に結合している
生体由来物質と相補的な細胞上の特定物質と、抗原、抗
体反応、核酸同志の水素結合等の特異的結合で結合し、
このような抗原、抗体もしくは核酸の量をその系の蛍光
量もしくは吸光度から測定することができる。
【０１１１】ターゲットが抗原抗体の関係にある分析の
場合は、標識材を抗原（あるいは抗体）に結合させた複
合体と、測定すべき抗体（標識材を抗体の方につけてい
るなら抗原）とを、抗原抗体反応をさせて、抗体（抗
原）と結合した複合体（Ｂ＝結合型）を抗体（抗原）と
結合しなかった複合体（Ｆ＝遊離型）から分離した後、
（Ｂ／Ｆ分離）結合した複合体（Ｂ）の量を蛍光量もし
くは吸光度から決定できる。上記に示した抗原抗体反応
を利用した手法は“検査と技術”ｖｏｌ・１６NO７（１
９８８）に詳しく記載されている。
場合は、標識材を抗原（あるいは抗体）に結合させた複
合体と、測定すべき抗体（標識材を抗体の方につけてい
るなら抗原）とを、抗原抗体反応をさせて、抗体（抗
原）と結合した複合体（Ｂ＝結合型）を抗体（抗原）と
結合しなかった複合体（Ｆ＝遊離型）から分離した後、
（Ｂ／Ｆ分離）結合した複合体（Ｂ）の量を蛍光量もし
くは吸光度から決定できる。上記に示した抗原抗体反応
を利用した手法は“検査と技術”ｖｏｌ・１６NO７（１
９８８）に詳しく記載されている。
【０１１２】さらに検出時の感度を考慮すると１分子の
生体由来物質に２個以上の、望ましくは１０個以上の標
識材が結合していることが望ましい。合成上あるいは感
度上から１０個〜１００個、さらに好ましくは２０個〜
５０個が結合しているとよい。
生体由来物質に２個以上の、望ましくは１０個以上の標
識材が結合していることが望ましい。合成上あるいは感
度上から１０個〜１００個、さらに好ましくは２０個〜
５０個が結合しているとよい。
【０１１３】以下実施例により本発明を更に具体的に説
明する。
明する。
【０１１４】
［実施例１］抗ヒトＣＲＰヒツジ血清（ＩｇＧ分画）
（Cooper Biomeodical Inc. 製）を０．５ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようｐＨ８．０のリン酸緩衝液で希釈し、抗
体溶液を調製した。上記抗体溶液８ｍｌに表１に記載し
たNO３の標識材（λmax ＝８３３ｎｍ）を０．２ｍｇ、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミドハイドロクロライド（以下ＷＳＣ）（同仁
化学製）０．０９ｇを加え、室温で３時間反応させて標
識材−抗体複合体を生成させた。セファロース６Ｂを充
填したゲル濾過クロマトグラフカラムで標識材−抗体複
合体を未反応物より分離精製した。得られた標識材−抗
体複合体の標識材と抗体との結合割合（モル比）は２．
１：１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視
吸光光度計を用いて、それぞれ波長λ＝８３３ｎｍおよ
びλ＝２８０ｎｍの吸光度を測定し、これを用いてそれ
ぞれ算出した。 ［実施例２］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ．Ｙ．ラ
バラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
ｐＨ８．２のリン酸緩衝液で希釈し、レクチン溶液を調
製した。
（Cooper Biomeodical Inc. 製）を０．５ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようｐＨ８．０のリン酸緩衝液で希釈し、抗
体溶液を調製した。上記抗体溶液８ｍｌに表１に記載し
たNO３の標識材（λmax ＝８３３ｎｍ）を０．２ｍｇ、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミドハイドロクロライド（以下ＷＳＣ）（同仁
化学製）０．０９ｇを加え、室温で３時間反応させて標
識材−抗体複合体を生成させた。セファロース６Ｂを充
填したゲル濾過クロマトグラフカラムで標識材−抗体複
合体を未反応物より分離精製した。得られた標識材−抗
体複合体の標識材と抗体との結合割合（モル比）は２．
１：１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視
吸光光度計を用いて、それぞれ波長λ＝８３３ｎｍおよ
びλ＝２８０ｎｍの吸光度を測定し、これを用いてそれ
ぞれ算出した。 ［実施例２］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ．Ｙ．ラ
バラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
ｐＨ８．２のリン酸緩衝液で希釈し、レクチン溶液を調
製した。
【０１１５】上記レクチン溶液１０ｍｌに表１記載のNO
６の標識材（λmax ＝８２５ｎｍ）０．２ｍｇを室温で
３時間反応させた。セファロース６Ｂを充填したゲル濾
過クロマトカラムで標識材−レクチンの複合体を分離精
製した。得られた複合材レクチンのモル比は３．７：１
であった。標識材およびレクチンのモル比は紫外可視吸
光光度計でそれぞれλ＝８２５ｎｍおよびλ＝２８０ｎ
ｍの波長での吸光度より算出した。 ［実施例３］抗ヒトＨＣＧモノクローナル抗体（ZyMED
Lab. Inc製品）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるようｐ
Ｈ７．２のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し
モノクローナル抗体溶液を調製した。
６の標識材（λmax ＝８２５ｎｍ）０．２ｍｇを室温で
３時間反応させた。セファロース６Ｂを充填したゲル濾
過クロマトカラムで標識材−レクチンの複合体を分離精
製した。得られた複合材レクチンのモル比は３．７：１
であった。標識材およびレクチンのモル比は紫外可視吸
光光度計でそれぞれλ＝８２５ｎｍおよびλ＝２８０ｎ
ｍの波長での吸光度より算出した。 ［実施例３］抗ヒトＨＣＧモノクローナル抗体（ZyMED
Lab. Inc製品）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるようｐ
Ｈ７．２のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し
モノクローナル抗体溶液を調製した。
【０１１６】上記抗体溶液８ｍｌに表１記載のNO１２の
標識材（λmax ＝７０５ｎｍ）０．３ｍｇを加え、室温
で３時間攪拌した。セファロース６Ｂを充填したゲル濾
過クロマトカラムで標識材−抗体複合体を分離精製し
た。
標識材（λmax ＝７０５ｎｍ）０．３ｍｇを加え、室温
で３時間攪拌した。セファロース６Ｂを充填したゲル濾
過クロマトカラムで標識材−抗体複合体を分離精製し
た。
【０１１７】得られた標識材−抗体のモル比は１．７：
１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視吸光
光度計を用い、それぞれ波長λ＝７０５ｎｍおよびλ＝
２８０ｎｍにおける吸光度より算出した。 ［実施例４］Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ．製）０．１ｍｇを５mmolリン酸
塩緩衝液（ｐＨ６）５ｍｌで希釈し、ＤＮＡ溶液とし
た。表１記載のNO５の標識材（λmax ＝７９６ｎｍ）
０．１ｍｇを５ｍｌの蒸留水に溶解し、この色素溶液に
ＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌しながらゆっくり滴下した。さ
らに室温で２時間攪拌し、ＤＮＡ−標識材複合体を生成
させた。
１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視吸光
光度計を用い、それぞれ波長λ＝７０５ｎｍおよびλ＝
２８０ｎｍにおける吸光度より算出した。 ［実施例４］Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ．製）０．１ｍｇを５mmolリン酸
塩緩衝液（ｐＨ６）５ｍｌで希釈し、ＤＮＡ溶液とし
た。表１記載のNO５の標識材（λmax ＝７９６ｎｍ）
０．１ｍｇを５ｍｌの蒸留水に溶解し、この色素溶液に
ＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌しながらゆっくり滴下した。さ
らに室温で２時間攪拌し、ＤＮＡ−標識材複合体を生成
させた。
【０１１８】上記ＤＮＡ−標識材複合体溶液にさらに４
０ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−標識材複合体を沈
殿させた。ＤＮＡ−標識材複合体をフィルタで分別し、
数回エタノールで洗浄した。洗浄したＤＮＡ−標識材複
合体は、２ｍｌの前記リン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再
び溶解させた。得られた標識材のＤＮＡに対する結合量
は、ＤＮＡ１μｇ当り０．５μｇであった。標識材およ
びＤＮＡの濃度は紫外可視吸光光度計を用いて、それぞ
れ波長λ＝７９６ｎｍおよびλ＝２６０ｎｍの吸光度よ
り算出した。 ［実施例５］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試薬
の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノール
アミンリンカーを用いて５’末端に１級アミンを導入し
た。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級ア
ミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
０ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−標識材複合体を沈
殿させた。ＤＮＡ−標識材複合体をフィルタで分別し、
数回エタノールで洗浄した。洗浄したＤＮＡ−標識材複
合体は、２ｍｌの前記リン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再
び溶解させた。得られた標識材のＤＮＡに対する結合量
は、ＤＮＡ１μｇ当り０．５μｇであった。標識材およ
びＤＮＡの濃度は紫外可視吸光光度計を用いて、それぞ
れ波長λ＝７９６ｎｍおよびλ＝２６０ｎｍの吸光度よ
り算出した。 ［実施例５］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試薬
の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノール
アミンリンカーを用いて５’末端に１級アミンを導入し
た。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級ア
ミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
【０１１９】上記オリゴヌクレオチド２００μｇ、１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた表１記載の標識
材Ｎｏ．２７（λｍａｘ＝８２６ｎｍ）２ｍｇを撹拌下
ゆっくりと添加した。室温で２４時間反応させたとこ
ろ、高速液体クロマトグラム上で核酸のピークが減少
し、新たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが
出現したので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア
社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。１７５μｇの核酸−標識材複
合体を得た。 ［比較例１］よく知られたシアニン系の近赤外吸収色素
ＮＫ−１９６７（日本感光色素研究所製）の化学構造を
次に示す。
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた表１記載の標識
材Ｎｏ．２７（λｍａｘ＝８２６ｎｍ）２ｍｇを撹拌下
ゆっくりと添加した。室温で２４時間反応させたとこ
ろ、高速液体クロマトグラム上で核酸のピークが減少
し、新たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが
出現したので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア
社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。１７５μｇの核酸−標識材複
合体を得た。 ［比較例１］よく知られたシアニン系の近赤外吸収色素
ＮＫ−１９６７（日本感光色素研究所製）の化学構造を
次に示す。
【０１２０】
【化３２】 実施例１で調製した抗体溶液５ｍｌに標識材として上記
シアニン色素０．３ｍｇを加え、室温で３時間攪拌し、
標識材−抗体複合体を生成させた。
シアニン色素０．３ｍｇを加え、室温で３時間攪拌し、
標識材−抗体複合体を生成させた。
【０１２１】セファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロ
マトグラフカラムで標識材−抗体複合体を分離精製し
た。
マトグラフカラムで標識材−抗体複合体を分離精製し
た。
【０１２２】得られた標識材−抗体のモル比は１．７：
１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視吸光
光度計を用い、それぞれ波長λ＝７４７ｎｍ，λ＝２８
０ｎｍの吸光度より算出した。 ［複合体の保存安定性］複合体の保存安定性を調べるた
めに以下の実験を行った。
１であった。標識材および抗体のモル比は紫外可視吸光
光度計を用い、それぞれ波長λ＝７４７ｎｍ，λ＝２８
０ｎｍの吸光度より算出した。 ［複合体の保存安定性］複合体の保存安定性を調べるた
めに以下の実験を行った。
【０１２３】実施例１〜５，比較例１で調整した標識複
合体を所定の濃度に１０mmolリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．
２）で調製した。この標識複合体溶液を７℃で遮光下３
日保存した。保存安定性テスト開始時、および終了時の
吸光度を所定の波長で測定し、開始時の吸光度を１００
としたときの終了時の吸光度の割合を算出した。
合体を所定の濃度に１０mmolリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．
２）で調製した。この標識複合体溶液を７℃で遮光下３
日保存した。保存安定性テスト開始時、および終了時の
吸光度を所定の波長で測定し、開始時の吸光度を１００
としたときの終了時の吸光度の割合を算出した。
【０１２４】蛍光を示す複合体については開始時の蛍光
強度を１００としたときの終了時の蛍光強度の割合を算
出した。
強度を１００としたときの終了時の蛍光強度の割合を算
出した。
【０１２５】その結果を表６に示す。
【０１２６】
【表１４】 表６に示したように本発明に係る標識複合体の水中での
吸光度変化、もしくは蛍光強度変化は比較品よりも小さ
かった。 ［実施例６］抗ヒトＣＲＰヒツジ血清（ＩｇＧ分画）
（Cooper Biomedical Inc.製）を０．５mg/mlの濃度と
なるようｐＨ７．２のリン酸緩衡生理食塩水（ＰＢＳ）
で希釈し、抗体溶液を調製した。上記抗体溶液８ｍｌに
表５記載のＮｏ．２９の標識材である色素（λｍａｘ
＝８１９ｎｍ）０．２ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミドハイドロクロ
ライド（以下ＷＳＣ）（同仁化学製）０．０９ｇを加
え、室温で３時間反応させ色素−抗体複合体を生成させ
た。セファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラ
フカラムで色素−抗体複合体を未反応物より分離精製し
た。得られた色素−抗体のモル比は２．５：１であっ
た。色素および抗体のモル比は、紫外可視吸光度計（島
津ＵＶ−３１００Ｓ）を用いて、それぞれ波長λ＝８１
９ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸光度より算出した。 ［実施例７］抗ヒトＨＣＧモノクロナール抗体（ＺｙＭ
ＥＤ Ｌａｂ， Ｉｎｃ． 製）を０．４ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにＰＢＳで希釈し、モノクロナール抗体
溶液を調製した。上記モノクロナール抗体溶液２ｍｌ、
表５記載のＮｏ．３２の色素（λｍａｘ ＝８２５ｎ
ｍ）０．３ｍｇ、ウッワード試薬Ｋ（東京化成）０．１
０ｇを加え室温で３時間反応させた。セファロース６Ｂ
を充填したゲル濾過クロマトカラムで色素−抗体の複合
体を分離精製した。得られた色素−抗体のモル比は３．
１：１であった。色素および抗体のモル比は紫外可視吸
光度計でそれぞれλ＝８２５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の波長における吸光度より算出した。 ［実施例８］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ・Ｙラバ
ラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるように
ＰＢＳで希釈し、レクチン溶液を調製した。上記レクチ
ン溶液１０ｍｌ、表５記載のＮｏ．４０の色素（λ
ｍａｘ ＝８０５ｎｍ）０．２ｍｇ、１％のグルタルア
ルデヒドを含む０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を１０ｍｌ加え室温で１時間反応させた。セ
ファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトカラムで色
素−レクチンの複合体を分離精製した。得られた色素−
レクチンのモル比は１．７：１であった。色素およびレ
クチンのモル比は紫外可視吸光度計を用い、それぞれ波
長λ＝８０５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸光度より算
出した。 ［実施例９］Ｍ１３ｍｐ１８−本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ製）０．１ｍｇを５ｍｌの５ｍｍ
ｏｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）で希釈し、ＤＮＡ溶液と
した。表５記載のＮｏ．３５の色素（λｍａｘ ＝７８
０ｎｍ）０．１ｍｇを２ｍｌエタノールに溶解し、この
色素溶液にＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌しながらゆっくり滴
下した。さらに室温で２時間攪拌し、ＤＮＡ−色素複合
体を生成させた。
吸光度変化、もしくは蛍光強度変化は比較品よりも小さ
かった。 ［実施例６］抗ヒトＣＲＰヒツジ血清（ＩｇＧ分画）
（Cooper Biomedical Inc.製）を０．５mg/mlの濃度と
なるようｐＨ７．２のリン酸緩衡生理食塩水（ＰＢＳ）
で希釈し、抗体溶液を調製した。上記抗体溶液８ｍｌに
表５記載のＮｏ．２９の標識材である色素（λｍａｘ
＝８１９ｎｍ）０．２ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミドハイドロクロ
ライド（以下ＷＳＣ）（同仁化学製）０．０９ｇを加
え、室温で３時間反応させ色素−抗体複合体を生成させ
た。セファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラ
フカラムで色素−抗体複合体を未反応物より分離精製し
た。得られた色素−抗体のモル比は２．５：１であっ
た。色素および抗体のモル比は、紫外可視吸光度計（島
津ＵＶ−３１００Ｓ）を用いて、それぞれ波長λ＝８１
９ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸光度より算出した。 ［実施例７］抗ヒトＨＣＧモノクロナール抗体（ＺｙＭ
ＥＤ Ｌａｂ， Ｉｎｃ． 製）を０．４ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにＰＢＳで希釈し、モノクロナール抗体
溶液を調製した。上記モノクロナール抗体溶液２ｍｌ、
表５記載のＮｏ．３２の色素（λｍａｘ ＝８２５ｎ
ｍ）０．３ｍｇ、ウッワード試薬Ｋ（東京化成）０．１
０ｇを加え室温で３時間反応させた。セファロース６Ｂ
を充填したゲル濾過クロマトカラムで色素−抗体の複合
体を分離精製した。得られた色素−抗体のモル比は３．
１：１であった。色素および抗体のモル比は紫外可視吸
光度計でそれぞれλ＝８２５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の波長における吸光度より算出した。 ［実施例８］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ・Ｙラバ
ラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるように
ＰＢＳで希釈し、レクチン溶液を調製した。上記レクチ
ン溶液１０ｍｌ、表５記載のＮｏ．４０の色素（λ
ｍａｘ ＝８０５ｎｍ）０．２ｍｇ、１％のグルタルア
ルデヒドを含む０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を１０ｍｌ加え室温で１時間反応させた。セ
ファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトカラムで色
素−レクチンの複合体を分離精製した。得られた色素−
レクチンのモル比は１．７：１であった。色素およびレ
クチンのモル比は紫外可視吸光度計を用い、それぞれ波
長λ＝８０５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸光度より算
出した。 ［実施例９］Ｍ１３ｍｐ１８−本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ製）０．１ｍｇを５ｍｌの５ｍｍ
ｏｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）で希釈し、ＤＮＡ溶液と
した。表５記載のＮｏ．３５の色素（λｍａｘ ＝７８
０ｎｍ）０．１ｍｇを２ｍｌエタノールに溶解し、この
色素溶液にＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌しながらゆっくり滴
下した。さらに室温で２時間攪拌し、ＤＮＡ−色素複合
体を生成させた。
【０１２７】上記ＤＮＡ−色素複合体溶液にさらに４０
ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−色素複合体を沈殿さ
せた。ＤＮＡ−色素複合体をフィルターで分別し、数回
エタノールで洗浄した。洗浄したＤＮＡ−色素複合体
は、２ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再び溶解さ
せた。得られた色素のＤＮＡに対する結合量はＤＮＡ１
μｇ当り０．５μｇであった。色素および抗体のモル比
は、紫外可視吸光光度計を用いてそれぞれ波長λ＝７８
０ｎｍおよびλ＝２６０ｎｍの吸光度より算出した。 ［実施例１０］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮ
Ａの塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０
量体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮ
Ａ自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノー
ルアミンリンカーを用いて５’末端に１級アミンを導入
した。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級
アミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−色素複合体を沈殿さ
せた。ＤＮＡ−色素複合体をフィルターで分別し、数回
エタノールで洗浄した。洗浄したＤＮＡ−色素複合体
は、２ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再び溶解さ
せた。得られた色素のＤＮＡに対する結合量はＤＮＡ１
μｇ当り０．５μｇであった。色素および抗体のモル比
は、紫外可視吸光光度計を用いてそれぞれ波長λ＝７８
０ｎｍおよびλ＝２６０ｎｍの吸光度より算出した。 ［実施例１０］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮ
Ａの塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０
量体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮ
Ａ自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノー
ルアミンリンカーを用いて５’末端に１級アミンを導入
した。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級
アミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
【０１２８】上記オリゴヌクレオチド２００μｇ、１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた表５記載の標識
材Ｎｏ．４６（λｍａｘ＝８１０ｎｍ）２ｍｇを撹拌下
ゆっくりと添加した。室温で２４時間反応させたとこ
ろ、高速液体クロマトグラム上で核酸のピークが減少
し、新たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが
出現したので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア
社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。１７５μｇの核酸−標識材複
合体を得た。
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた表５記載の標識
材Ｎｏ．４６（λｍａｘ＝８１０ｎｍ）２ｍｇを撹拌下
ゆっくりと添加した。室温で２４時間反応させたとこ
ろ、高速液体クロマトグラム上で核酸のピークが減少
し、新たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが
出現したので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア
社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。１７５μｇの核酸−標識材複
合体を得た。
【０１２９】＜色素複合体の保存安定性＞色素複合体の
保存安定性を調べるために以下の実験を行った。
保存安定性を調べるために以下の実験を行った。
【０１３０】実施例６〜１０で調製した色素複合体を所
定の濃度に１０ｍｍｏｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）
で調製した。この色素複合体の溶液を７℃で、遮光下、
３日間保存した。保存安定性テスト開始時および終了時
の吸光度を所定の波長で測定し、開始時の吸光度を１０
０としたときの、終了時の吸光度の割合を算出した。そ
の結果を表７に示した。
定の濃度に１０ｍｍｏｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）
で調製した。この色素複合体の溶液を７℃で、遮光下、
３日間保存した。保存安定性テスト開始時および終了時
の吸光度を所定の波長で測定し、開始時の吸光度を１０
０としたときの、終了時の吸光度の割合を算出した。そ
の結果を表７に示した。
【０１３１】
【表１５】 表７に示したように、本発明に係る色素複合体の水中で
の吸光度変化は比較品よりも小さかった。 ［実施例１１］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮ
Ａの塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０
量体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮ
Ａ自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにデオキシウリジル酸誘導体モノマー（図
２）を用いて上記２０量体オリゴヌクレオチドの５’側
に１級アミノ基を有するデオキシウリジル酸誘導体を２
０個、同様にＤＮＡ自動合成基によって付加した。ＣＰ
Ｇ−サポートからの切り出し、脱保護（１級アミノ基の
保護基であるトリフルオロアセチル基を含む）、高速液
体クロマトグラフィーによる精製は定法により行なっ
た。
の吸光度変化は比較品よりも小さかった。 ［実施例１１］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮ
Ａの塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０
量体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮ
Ａ自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにデオキシウリジル酸誘導体モノマー（図
２）を用いて上記２０量体オリゴヌクレオチドの５’側
に１級アミノ基を有するデオキシウリジル酸誘導体を２
０個、同様にＤＮＡ自動合成基によって付加した。ＣＰ
Ｇ−サポートからの切り出し、脱保護（１級アミノ基の
保護基であるトリフルオロアセチル基を含む）、高速液
体クロマトグラフィーによる精製は定法により行なっ
た。
【０１３２】１級アミノ基を結合した上記オリゴヌクレ
オチド２００μｇ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
９．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解した後、
あらかじめ２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解し
ておいた表１記載の標識材Ｎｏ．２７（λｍａｘ＝８２
６ｎｍ）２ｍｇを撹拌下ゆっくりと添加した。４０℃で
２４時間反応させたところ、高速液体クロマトグラム上
で核酸のピークが減少し、新たに核酸と標識材の吸収を
合わせ持ったピークが出現したので、反応液をゲル濾過
カラム（ファルマシア社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製し
た後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。３５０
μｇの核酸−標識材複合体を得た。この核酸−標識材複
合体の８２６ｎｍにおける吸収は実施例５に示した核酸
−標識材複合体の吸収に較べ約２０倍の強度を有してい
た。
オチド２００μｇ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
９．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解した後、
あらかじめ２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解し
ておいた表１記載の標識材Ｎｏ．２７（λｍａｘ＝８２
６ｎｍ）２ｍｇを撹拌下ゆっくりと添加した。４０℃で
２４時間反応させたところ、高速液体クロマトグラム上
で核酸のピークが減少し、新たに核酸と標識材の吸収を
合わせ持ったピークが出現したので、反応液をゲル濾過
カラム（ファルマシア社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製し
た後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。３５０
μｇの核酸−標識材複合体を得た。この核酸−標識材複
合体の８２６ｎｍにおける吸収は実施例５に示した核酸
−標識材複合体の吸収に較べ約２０倍の強度を有してい
た。
【０１３３】
【発明の効果】本発明においては、特定の構造の標識材
を生体由来物質と結合することにより、色素等の分解が
少なく、従って吸光度変化の少ない、もしくは蛍光強度
変化の少ない安定した複合体を形成できる。
を生体由来物質と結合することにより、色素等の分解が
少なく、従って吸光度変化の少ない、もしくは蛍光強度
変化の少ない安定した複合体を形成できる。
【０１３４】このため、本発明の該複合体を微量分析に
応用する場合には、貯蔵安定性に優れた試薬を提供でき
る。
応用する場合には、貯蔵安定性に優れた試薬を提供でき
る。
【図１】標識材の蛍光発光波形の一例を示すグラフであ
る。
る。
【図２】デオキシウリジル酸誘導体モノマーの構造式で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福井 哲朗 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 大西 敏一 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 岡本 尚志 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内
Claims (14)
- 【請求項１】 生体由来物質に標識材を担持させてな
り、分析対象化合物と結合させて分析対象化合物を近赤
外光を用いた光学的手段で検出するための標識複合体に
おいて、標識材が下記一般式（Ｉ），（II），又は（II
I） 【化１】 （式中Ｒ1 〜Ｒ7 は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1 〜
Ｒ7 は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1 は２価の有機残基を示す。 【外１】 はアニオンを示す。）、 【化２】 （式中Ｒ8 〜Ｒ14は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ8 〜
Ｒ14は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ2 は２価の有機残基を示
す。）、 【化３】 （式中Ｒ15〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基、
置換もしくは未置換のアミノ基、置換もしくは未置換の
スチリル基、ニトロ基、スルホネート基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。 【外２】 はアニオンを示す。）、で示される化合物からなること
を特徴とする標識複合体。 - 【請求項２】 生体由来物質が、抗体又は抗原である請
求項１記載の標識複合体。 - 【請求項３】 生体由来物質が、核酸である請求項１記
載の標識複合体。 - 【請求項４】 生体由来物質に標識材を担持させてな
り、分析対象化合物と結合させて分析対象化合物を近赤
外光を用いた光学的手段で検出するための標識複合体に
おいて、標識材が下記一般式（IV） 【化４】 （式中Ａ，Ｂ，Ｄ及びＥは水素原子、それぞれ置換また
は未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、
アラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基
から選ばれる基を示す。ｒ１'，ｒ２'は水素原子、それ
ぞれ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、アル
ケニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれる
基を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で 【外３】 はアニオンを意味する。）で示される化合物からなるこ
とを特徴とする標識複合体。 - 【請求項５】 生体由来物質が、抗体又は抗原である請
求項４記載の標識複合体。 - 【請求項６】 生体由来物質が、核酸である請求項４記
載の標識複合体。 - 【請求項７】 生体由来物質に下記一般式（I），（I
I）又は（III）で示される標識材を担持させてなる標識
複合体を用い、該標識複合体と分析対象化合物とを結合
させて分析対象化合物を光学的手段で検出する分析法。 【化５】 （式中Ｒ1〜Ｒ7は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ1〜
Ｒ7は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ1は２価の有機残基を示す。 【外４】 はアニオンを示す。）、 【化６】 （式中Ｒ8〜Ｒ14は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、アラルキル基、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキ
シル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を示し、Ｒ8〜
Ｒ14は互いに結合して、置換または未置換の縮合環を形
成するものでもよい。Ｆ2は２価の有機残基を示す。） 【化７】 （式中Ｒ15〜Ｒ21は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基、
置換もしくは未置換のアミノ基、置換もしくは未置換の
スチリル基、ニトロ基、スルホネート基、ヒドロキシ
基、カルボキシル基、シアノ基、又はアリールアゾ基を
示し、Ｒ15〜Ｒ21は互いに結合して、置換または未置換
の縮合環を形成するものでもよい。Ｆ3 は２価の有機残
基を示す。 【外５】 はアニオンを示す。） - 【請求項８】 前記生体由来物質が、抗体又は抗原であ
る請求項７記載の分析法。 - 【請求項９】 前記生体由来物質が、核酸である請求項
７記載の分析法。 - 【請求項１０】 分析対象化合物を近赤外光を用いた光
学的手段で検出する請求項７〜９記載の分析法。 - 【請求項１１】 生体由来物質に下記一般式（IV）で示
される標識材を担持させてなる標識複合体を用い、該標
識複合体と分析対象化合物とを結合させて分析対象化合
物を光学的手段で検出する分析法。 【化８】 （式中Ａ，Ｂ，Ｄ及びＥは水素原子、それぞれ置換また
は未置換の炭素数２以上のアルキル基、アルケニル基、
アラルキル基、アリール基、スチリル基および複素環基
から選ばれる基を示す。ｒ１’，ｒ２’は水素原子、そ
れぞれ置換又は未置換アルキル基、環式アルキル基、ア
ルケニル基、アラルキル基およびアリール基から選ばれ
る基を示し、ｋは０又は１、ｌは０，１又は２で 【外６】 はアニオンを意味する。） - 【請求項１２】 前記生体由来物質が、抗体又は抗原で
ある請求項１１記載の分析法。 - 【請求項１３】 前記生体由来物質が、核酸である請求
項１１記載の分析法。 - 【請求項１４】 分析対象化合物を近赤外光を用いた光
学的手段で検出する請求項１１〜１３記載の分析法。
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|---|---|---|---|
| JP15066592A JP3285609B2 (ja) | 1991-06-21 | 1992-06-10 | 標識複合体、及びそれを用いる分析法 |
| US07/900,302 US5512446A (en) | 1991-06-21 | 1992-06-18 | Labeled complex |
| EP92110320A EP0519474B1 (en) | 1991-06-21 | 1992-06-19 | Labeled complex |
| DE69226989T DE69226989T2 (de) | 1991-06-21 | 1992-06-19 | Markierter Komplex |
| US08/568,680 US5700647A (en) | 1991-06-21 | 1995-12-07 | Carbocation containing cyanine-type dye |
| US08/888,098 US5846730A (en) | 1991-06-21 | 1997-07-03 | Labelled complex |
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|---|---|---|---|
| JP15042891 | 1991-06-21 | ||
| JP3-150428 | 1991-06-21 | ||
| JP3-281645 | 1991-10-28 | ||
| JP28164591 | 1991-10-28 | ||
| JP15066592A JP3285609B2 (ja) | 1991-06-21 | 1992-06-10 | 標識複合体、及びそれを用いる分析法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05180845A true JPH05180845A (ja) | 1993-07-23 |
| JP3285609B2 JP3285609B2 (ja) | 2002-05-27 |
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|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0519474B1 (ja) |
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| DE (1) | DE69226989T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010169677A (ja) * | 2008-12-25 | 2010-08-05 | Canon Inc | 有毛細胞標識剤、及び該標識剤を用いた有毛細胞標識方法 |
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