JP4541731B2 - 核酸検出方法 - Google Patents
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Description
(1)検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(A鎖)と、該A鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(B鎖)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
(4)前記A鎖および前記B鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記B鎖伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
上記手法により核酸アレイ上でのユニバーサルPCRが可能となる。
(1)検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(A鎖群:A1鎖〜An鎖:n≧2)と、該A鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(B鎖群:B1鎖〜Bn鎖:n≧2)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖群の各鎖ごとに、3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマー(PB鎖群:PB1鎖〜PBn鎖:n≧2)として用意する工程。
(4)前記A鎖群および前記B鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記PB鎖群の複数のB鎖伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
(1)検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(A鎖)と、該A鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(B鎖)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
(4)前記A鎖および前記B鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記B鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも1種の一部、もしくは、全部を標識してPCR反応を行う工程。
(5)前記基板に結合したプローブから伸長増幅したA鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
(1)検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(A鎖群:A1鎖〜An鎖:n≧2)と、該A鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(B鎖群:B1鎖〜Bn鎖:n≧2)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖群の各鎖ごとに、3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマー(PB鎖群:PB1鎖〜PBn鎖:n≧2)として用意する工程。
(4)前記A鎖群および前記B鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記PB鎖群の複数のB鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも1種の一部、もしくは、全部を標識してPCR反応を行う工程。
(5)前記基板に結合したプローブから伸長増幅したA鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
(1)検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(A鎖)と、該A鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(B鎖)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして、更に前記A鎖の5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマーとして、それぞれ用意する工程。
(4)前記A鎖および前記B鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記B鎖伸長用プライマーと、前記A鎖伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマーとして用意し、前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖群の各鎖ごとに、5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマー(PA鎖群:PA1鎖〜PAn鎖:n≧2)として用意し、前記A鎖群の各鎖ごとに、3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマー(PB鎖群:PB1鎖〜PBn鎖:n≧2)として用意する工程。
上記で説明した検出方法を実現するための装置は、本発明の範囲に含まれうる。
(1)プライマーの準備
固相ユニバーサルPCRの検出対象を大腸菌(Escherichia coli:ATCC♯11775)の16s リボゾーマルRNA(rRNA)のゲノムDNAの以下に示す7部分(Ec1〜Ec7)のセンス側塩基配列とし、固相固定プライマーとして選択した。
Ec1 5' CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA 3' (配列番号:1)
Ec2 5' ATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCG 3' (配列番号:2)
Ec3 5' TTTGCTCATTGACGTTACCCGCAG 3' (配列番号:3)
Ec4 5' ACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGA 3' (配列番号:4)
Ec5 5' ATACAAAGAGAAGCGACCTCGCG 3' (配列番号:5)
Ec6 5' CGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGT 3' (配列番号:6)
Ec7 5' GCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAAT 3' (配列番号:7)。
HS(CH2)6OP(O2)O-dCTCTTGCCATCGGATGTGCCCA
また、アンチセンス側配列の共通プライマーの塩基配列として下記塩基配列(EcAP)を選択した:
EcAP 5' ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC 3' (配列番号:8)
EcAPは通常どおり合成した。全てのプライマーの脱保護、精製は定法の基づいて行った。
まず、大腸菌標準株を定法に従って培養した。微生物培養液を1.5 ml容量のマイクロチューブに1.0 ml(OD600=0.7)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5分間、4℃)。上精を捨てた後、Enzyme Buffer(50mM Tris-HCl:p.H. 8.0、25mM EDTA) 300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は再度遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5分間、4℃)。上精を捨てた後回収された菌体に以下の酵素溶液を加えミキサーを用いて再縣濁した:
Lysozyme 50 μl (20 mg/ml in Enzyme Buffer)
N-Acetylmuramidase SG 50 μl (0.2 mg/ml in Enzyme Buffer)。
[3-1]ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ:25mm×75mm×う1mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した1N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAアレイ用の石英ガラス基板を用意した。
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解しEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
(1)で述べた固相固定用プライマー(Ec1〜Ec7)をそれぞれ純水に溶解し、最終濃度(後記溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液(混合溶媒)を用意した。続いて、先に用意した7種のプライマーを上記混合溶媒に規定濃度なるようにそれぞれ溶解した。得られたDNA溶液をバブルジェットプリンター(商品名:BJF-850 キヤノン(株)製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)により表面に残ったDNA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAアレイを得た。
大腸菌ゲノムDNAの増幅方法を以下に示す。
tain 10,000×concentrate in DMSO)をあらかじめ純水で200倍に希釈した溶液1μlを加えて、プライマーアレイを65℃/3分間→92℃/2分間→45℃/3時間の条件下におき、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション反応終了後のDNAアレイをDNAアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いで蛍光測定を行った(励起波長532 nm、フォトマル電圧400V)。測定結果を表1に示す。なお本実施例では、全ての操作を2回実施したのでそれぞれの結果を表1に示した。
固相PCR時に実施例1で用いたプライマーに加えて、下記塩基配列を有するセンス側配列の共通プライマーの(EcSP)をアンチセンス側共通プライマーと同濃度で用いた以外は、実施例1と同様の方法で、固相PCRおよび蛍光検出を行った。
EcSP 5' GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG 3' (配列番号:9)。
(1)プライマーの準備
本実施例では実施例1で検出した大腸菌と同時に緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa:ATCC♯10145)のrRNAのゲノムDNAを検出する。そのために最初に緑膿菌用のチオール化センス側配列プライマー8種(Pa1〜Pa8)を実施例1と同様に合成した。該プライマーの塩基配列を以下に示した。
Pa1 5' TGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTC 3' (配列番号:10)
Pa2 5' TCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGC 3' (配列番号:11)
Pa3 5' GAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGG 3' (配列番号:12)
Pa4 5' GTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTC 3' (配列番号:13)
Pa5 5' GACCACCTGGACTGATACTGACAC 3' (配列番号:14)
Pa6 5' TGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTC 3' (配列番号:15)
Pa7 5' TTAGTTACCAGCACCTCGGGTGG 3' (配列番号:16)
Pa8 5' TAGTCTAACCGCAAGGGGGACG 3' (配列番号:17)。
PaAP 5' ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC 3' (配列番号:18)。
緑膿菌ゲノム抽出、大腸菌プライマーおよび緑膿菌プライマーを搭載したDNAマイクロアレイの作製、固相PCR(大腸菌ゲノムDNAおよび緑膿菌ゲノムDNA:それぞれ10 ng、EcAPおよびPaAP:それぞれ20 pmole)、ハイブリダイゼーション、洗浄等を実施例1と同様に行い、蛍光による検出を行った。その結果を表2に示す。
固相PCR時に実施例2で用いたプライマーに加えて、大腸菌と緑膿菌とのそれぞれのセンス側配列の共通プライマー(EcSPおよびPaSP)を同濃度で用いた以外は、実施例3と同様の方法で固相PCRおよび蛍光検出を行った。以下にPaSPの塩基配列を示す。
PaSP 5' GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG 3' (配列番号:19)。
実施例1と全く同様の方法により大腸菌ゲノム抽出、プライマーの合成、プライマーアレイの作製を行った後、下記の組成のPCR溶液を用いて固相PCRを遂行した。
実施例5の取り込み標識を用いて、実施例2から4の固相ユニバーサルPCR、あるいは固相マルチプレックスユニバーサルPCRを行い、蛍光強度はそれぞれ実施例2から4とは異なるものの、結果として大腸菌のrRNAゲノムDNA、あるいは大腸菌と緑膿菌との双方のrRNAゲノムDNAの同時検出が可能であることが示された。
共通プライマーEcAPをテトラメチルローダミン標識し、ハイブリダイゼーションをSYBR green等の蛍光色素を共存させずに行い、蛍光検出を上記テトラメチルローダミンを用いて行うこと以外は実施例1と全く同様の方法により固相ユニバーサル法による大腸菌ゲノムDNAの検出をおこなった。以下にテトラメチルローダミン標識EcAPの構造を示す。
5' Rho-CONH(CH2)6OP(O2)O-d ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC 3' (配列番号:20)
(Rho=テトラメチルローダミン)。
Claims (11)
- 下記工程を有する核酸の検出方法。
(1)検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(A鎖)と、該A鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(B鎖)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして、更に前記A鎖の5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマーとして、それぞれ用意する工程。
(4)前記A鎖および前記B鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記B鎖伸長用プライマーと、前記A鎖伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。 - 下記工程を有する核酸の検出方法。
(1)検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(A鎖)と、該A鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(B鎖)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖の5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマーとして用意し、前記A鎖の3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
(4)前記A鎖および前記B鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記A鎖伸長用プライマー及びB鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも1種の一部、もしくは、全部を標識してPCR反応を行う工程。
(5)前記基板に結合したプローブから伸長増幅したA鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。 - 下記工程を有する請求項1または2に記載の核酸の検出方法。
(1)検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(A鎖群:A1鎖〜An鎖:n≧2)と、該A鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(B鎖群:B1鎖〜Bn鎖:n≧2)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖群の各鎖ごとに、3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマー(PB鎖群:PB1鎖〜PBn鎖:n≧2)として用意する工程。
(4)前記A鎖群および前記B鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記PB鎖群の複数のB鎖伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。 - 下記工程を有する請求項3に記載の核酸の検出方法。
(1)検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(A鎖群:A1鎖〜An鎖:n≧2)と、該A鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(B鎖群:B1鎖〜Bn鎖:n≧2)とを用意する工程。
(2)前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
(3)前記A鎖群の各鎖ごとに、5’末端と、該5’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をA鎖伸長用プライマー(PA鎖群:PA1鎖〜PAn鎖:n≧2)として用意し、前記A鎖群の各鎖ごとに、3’末端と、該3’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をB鎖伸長用プライマー(PB鎖群:PB1鎖〜PBn鎖:n≧2)として用意する工程。
(4)前記A鎖群および前記B鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記PA鎖群および前記PB鎖群の各伸長用プライマーと、を用いてPCR反応を行う工程。
(5)PCR反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したA鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないB鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
(6)前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマーの固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。 - 前記PCR反応後に、前記基板上の反応液を洗浄除去する工程を更に有する請求項1〜4のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 前記B鎖伸長用プライマーが標識されており、前記ハイブリッド体の検出が該標識を用いて行われるものである請求項1〜4のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 前記標識が蛍光色素である請求項6に記載の核酸の検出方法。
- 前記ハイブリッド体の検出が二本鎖核酸に作用するインターカレーターあるいはグルーブバインダーとしての蛍光色素を用いて行われるものである請求項1〜4のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 前記ハイブリッド体の検出において、該蛍光色素を共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察する工程をさらに有する請求項7または8に記載の核酸の検出方法。
- 少なくともPCR反応および核酸の検出を、プライマーアレイが同一の容器中に存在する形態でおこなう請求項1〜9のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- PCR反応および核酸の検出を、それぞれ同一の手段を用いて継続的に観察しながらおこなう請求項10に記載の核酸の検出方法。
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