JPH05112472A - Separation agent for optical isomer - Google Patents
Separation agent for optical isomerInfo
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- JPH05112472A JPH05112472A JP26970991A JP26970991A JPH05112472A JP H05112472 A JPH05112472 A JP H05112472A JP 26970991 A JP26970991 A JP 26970991A JP 26970991 A JP26970991 A JP 26970991A JP H05112472 A JPH05112472 A JP H05112472A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は光学異性体の分離剤に関
し、詳しくは担体に固定化されたリゾチーム又は分子構
造の一部を修飾したリゾチームを使用した光学異性体用
分離剤に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a separating agent for optical isomers, and more particularly to a separating agent for optical isomers which uses lysozyme immobilized on a carrier or lysozyme whose molecular structure is partially modified.
【０００２】[0002]
【従来の技術】不斉炭素素子を含むキラルな化学物質に
ついて、その光学異性体を分離することが特に医薬品の
分野において強く要求されている。すなわち一つのラセ
ミ体を構成する複数の光学異性体の中の一つのものが特
別に顕著な医薬上の有用性、例えば顕著な薬理作用、顕
著な生体内利用性を示し、あるいは反対に顕著な毒性を
示すことが一般事実として明らかになり、従って医薬品
としてはラセミ体として投与されるよりも、分離された
光学異性体として投与される方がより合理的であり、治
療効果を高める結果となるからである。2. Description of the Related Art With respect to a chiral chemical substance containing an asymmetric carbon element, it is strongly required to separate its optical isomers, especially in the field of pharmaceuticals. That is, one of a plurality of optical isomers constituting one racemate shows a particularly remarkable medicinal usefulness, for example, a remarkable pharmacological action, a remarkable bioavailability, or, conversely, a remarkable effect. Toxicity is generally shown, and therefore it is more rational for a drug to be administered as the separated optical isomer rather than as a racemate, resulting in enhanced therapeutic effect. Because.
【０００３】光学異性体の分離については従来から幾多
の実験室的方法が報告されてきたが、工業的規模におい
て実施できるものは少なく、これは非常に困難な技術課
題であると考えられてきた。しかしカラムクロマトグラ
フィーの進歩により、とりわけ液体クロマトグラフィー
により光学異性体を分離する方法が一般に知られるよう
になった。これらの方法については、例えば下記文献
１）〜７）に示されている。 １） イエルゲン・ヘルマンソン：ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー，３２５（１９８５）３７９頁−３
８４頁（Joergen Hermansson:Journal of Chromatograp
hy, ３２５（１９８５）３７９−３８４） ２） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２６４（１９８３）６３頁−６８頁
（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２６
４（１９８３）６３−６８） ３） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２３７（１９８２）４７３頁−４７７
頁（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２
３７（１９８２）４７３−４７７） ４） 特開昭６０−４１６１９号公報 ５） 三輪敏紳ら：ケミカル・アンド・ファーマシュー
ティカル・ブリテン，３５巻（１９８７）６８２頁−６
８６頁（T.Miwa et al:Chemical and Pharmaceutical B
ulletin,Vol ３５（１９８７）６８２−６８６） ６） 萩中 淳ら：クロマトグラフィア，２９巻（１９
９０）５８７頁−５９２頁（J.Haginaka et al:Chromat
ographia,Vol ２９（１９９０）５８７−５９２） ７） 特開昭６４−３１２９号公報 上記文献のうち、１）はキラルなα1 −酸性糖蛋白を使
用する技術を開示している。２）および３）は牛血清ア
ルブミンをそれぞれシリカおよびアガロースに結合せし
めた固定相を使用して分離する方法を開示している。
４）はオロソムコイド、その官能類似体等を使用して分
離する方法を開示している。５）および６）はオボムコ
イドを担体に結合せしめた固定相を使用して分離する方
法を開示している。７）はアビジンを担体に結合せしめ
た固定相を使用して分離する方法を開示している。Although many laboratory methods have been reported for the separation of optical isomers, few of them can be carried out on an industrial scale, which has been considered to be a very difficult technical problem. .. However, advances in column chromatography have made generally known methods for separating optical isomers, especially by liquid chromatography. These methods are shown in, for example, the following documents 1) to 7). 1) Jergen Hermannson: The Journal of
Chromatography, 325 (1985) 379-3.
Page 84 (Joergen Hermansson: Journal of Chromatograp
hy, 325 (1985) 379-384) 2) S. Allenmark et al: Journal of Chromatography, 26 , 264 (1983) 63-68.
4 (1983) 63-68) 3) S. Alemmark et al., Journal of Chromatography, 237 (1982) pp. 473-477.
Page (S. Allenmark et al: Journal of Chromatography, 2
37 (1982) 473-477) 4) JP-A-60-41619 5) Toshi Miwa, et al .: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 35 (1987) page 682-6
Page 86 (T. Miwa et al: Chemical and Pharmaceutical B
ulletin, Vol 35 (1987) 682-686) 6) Atsushi Haginaka et al .: Chromatography, Vol. 29 (19)
90) pp. 587-592 (J. Haginaka et al: Chromat
Ographia, Vol 29 (1990) 587-592) 7) JP-A-64-3129 Among the above documents, 1) discloses a technique using a chiral α 1 -acid glycoprotein. 2) and 3) disclose a method of separating bovine serum albumin using a stationary phase bound to silica and agarose, respectively.
4) discloses a method for separation using orosomucoid, its functional analogue, and the like. 5) and 6) disclose a method of separating ovomucoid using a stationary phase bound to a carrier. 7) discloses a method for separating avidin using a stationary phase bound to a carrier.
【０００４】しかしながら１）〜７）の技術における使
用資材は一般に高価である。またこれらの技術における
分離方法は主として多量の有機溶媒を使用する液体クロ
マトグラフィーによって行われるので、使用資材は有機
溶媒による変性に対して安定でなければならないが、例
えばアルブミン、オロソムコイドはこの条件を十分に満
足することができない。However, the materials used in the techniques 1) to 7) are generally expensive. Moreover, since the separation method in these techniques is mainly performed by liquid chromatography using a large amount of organic solvent, the materials used must be stable against denaturation by an organic solvent.For example, albumin and orosomucoid sufficiently meet this condition. Can't be satisfied with.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、光学異性体の分離に有用な分離剤であって、安価
でかつ有機溶媒による変性に対して安定な光学異性体用
分離剤を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, an object of the present invention is to provide a separating agent useful for separating optical isomers, which is inexpensive and stable for modification with an organic solvent. It is to be.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成するために種々の検討を行った。その結果、卵白より
簡単に入手することができるリゾチームを使用すること
により上記目的を達成することができることを見い出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はリ
ゾチーム又は分子構造の一部を修飾したリゾチームが担
体に結合されている固定相からなることを特徴とする光
学異性体用分離剤である。Means for Solving the Problems The present inventor has conducted various studies to achieve the above object. As a result, they have found that the above object can be achieved by using lysozyme, which is more easily available than egg white, and completed the present invention. That is, the present invention is a separating agent for optical isomers, characterized in that it comprises a stationary phase in which lysozyme or lysozyme partially modified in molecular structure is bound to a carrier.
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。リゾチー
ムは卵白中に存在し、分子量が約１４３００〜１４６０
０、等電点１0.７の蛋白質である。リゾチームは結晶化
することができ、陽イオン交換クロマトグラフィーまた
は界面移動電気泳動で分離することができる。しかしリ
ゾチームは、卵白からのオボムチンの沈澱に先だって取
り除くことができる。即ち卵白のpHを9.５に調整し、５
％ NaCl を加えて、等電点のリゾチームを接種（seedin
g ）するとリゾチームが結晶化するので、結晶として得
ることができる。従って本発明に用いられるリゾチーム
として、このようにして安価に製造したリゾチームを使
用することが好ましいが、本発明に使用するリゾチーム
の入手方法がこの方法に限定されるわけではない。The present invention will be described in detail below. Lysozyme is present in egg white and has a molecular weight of approximately 14300 to 1460.
It is a protein with 0 and an isoelectric point of 10.7. Lysozyme can be crystallized and separated by cation exchange chromatography or interface migration electrophoresis. However, lysozyme can be removed prior to ovomucin precipitation from egg white. That is, the pH of egg white is adjusted to 9.5 and 5
% NaCl and add isoelectric point of lysozyme (seedin
g) Then lysozyme crystallizes and can be obtained as crystals. Therefore, it is preferable to use inexpensively produced lysozyme as the lysozyme used in the present invention, but the method for obtaining lysozyme used in the present invention is not limited to this method.
【０００８】本発明に用いられる担体は、リゾチーム又
は分子の一部が修飾されたリゾチームと結合し、固定相
を形成し得るものであればよい。本発明の分離剤を用い
た光学異性体の分離は、主として液体クロマトグラフィ
ーによって行われるもので、担体としては例えばシリカ
ゲル、ガラス、セルロース、カーボンまたは合成ポリマ
ー（例えば、ポリビニルアルコール）等を挙げることが
できる。The carrier used in the present invention may be any carrier as long as it can bind to lysozyme or partially modified lysozyme of the molecule to form a stationary phase. Separation of optical isomers using the separating agent of the present invention is mainly performed by liquid chromatography, and examples of the carrier include silica gel, glass, cellulose, carbon or synthetic polymers (for example, polyvinyl alcohol). it can.
【０００９】リゾチーム又は分子の一部が修飾されたリ
ゾチーム（以下リガンドと呼ぶ）が結合されている担体
からなる固定相は、固定相を形成するために通常行われ
ている方法に従って形成することができる。例えば、リ
ゾチームを担体に結合するには、例えばアミノプロピル
シリカゲルを担体とし、Ｎ，Ｎ−ジサクシニミジルカー
ボネートを架橋剤としてリゾチームを結合する方法、ガ
ラスを担体とし、３−グリシドキシプロピルトリメトキ
シシランを架橋剤としてリゾチームを結合する方法、セ
ルロースを担体とし、ブロムシアンで活性化してからこ
れにリゾチームを結合する方法、イオン交換合成ポリマ
ーにリゾチームを結合する方法等が挙げられる。The stationary phase comprising a carrier to which lysozyme or a partially modified lysozyme (hereinafter referred to as a ligand) is bound can be formed according to a method generally used for forming a stationary phase. it can. For example, in order to bind lysozyme to a carrier, for example, aminopropyl silica gel is used as a carrier, N, N-disuccinimidyl carbonate is used as a crosslinking agent to bind lysozyme, glass is used as a carrier, and 3-glycidoxypropyltris Examples thereof include a method of binding lysozyme using methoxysilane as a cross-linking agent, a method of activating bromine with cellulose as a carrier and then binding lysozyme thereto, and a method of binding lysozyme to an ion exchange synthetic polymer.
【００１０】また、分子の一部を修飾したリゾチームが
担体に結合した固定相を得る方法には、あらかじめ分子
の一部を修飾しておいたリゾチームを共有結合やイオン
結合などによって担体に結合する方法と、リゾチームを
結合させておいた固定相に先に述べた方法による修飾を
施して目的とする固定相を得る方法がある。例えばアミ
ノプロピルシリカゲルやアミノ基が結合した合成ポリマ
ーを担体とし、グルタルアルデヒドやＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネートを架橋剤としてリガンドを結合し
たり、あるいはシリカゲルやガラス若しくはカーボンを
担体として３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラ
ンを架橋剤としてリガンドを結合したり、あるいはセル
ロースを担体とし、ブロムシアンで活性化してからこれ
らにリガンドを結合したり、陰イオン交換合成ポリマー
にリガンドを結合したりする方法により製造できる。Further, in order to obtain a stationary phase in which lysozyme modified in part of the molecule is bound to the carrier, lysozyme modified in part in the molecule is bound to the carrier by a covalent bond or an ionic bond. There are a method and a method in which the stationary phase to which lysozyme has been bound is modified by the method described above to obtain the desired stationary phase. For example, aminopropyl silica gel or a synthetic polymer having an amino group bonded thereto is used as a carrier, glutaraldehyde or N, N-disuccinimidyl carbonate is used as a cross-linking agent to bind a ligand, or silica gel, glass or carbon is used as a carrier. By a method such as binding a ligand using sidoxypropyltrimethoxysilane as a cross-linking agent, or using cellulose as a carrier and activating with bromocyan, then binding a ligand to these, or a method of binding a ligand to an anion exchange synthetic polymer. Can be manufactured.
【００１１】一般に蛋白質分子を修飾する方法には、化
学的方法、酵素的方法、物理的方法等が挙げられる。即
ち、蛋白質分子中のアミノ基、イミダゾール基又はカル
ボキシル基にアルデヒド類、酸無水物又はアルコール類
を反応させると、それぞれ、シッフ塩基、Ｎ−置換イミ
ダゾール基又はエステルが生成して化学的修飾がなされ
る。又、酵素の持つ多彩な作用を用いれば、官能基の修
飾、分子の酸化や還元、分子の一部を除去するなどの反
応が緩和な条件で行い得る。例えば、リゾチームの一部
をグルタル化したリゾチームは次のようにして得ること
ができる。Generally, the method for modifying a protein molecule includes a chemical method, an enzymatic method, a physical method and the like. That is, when an amino group, an imidazole group, or a carboxyl group in a protein molecule is reacted with an aldehyde, an acid anhydride, or an alcohol, a Schiff base, an N-substituted imidazole group, or an ester is formed, respectively, and chemically modified. It Further, by using various actions of enzymes, reactions such as modification of functional groups, oxidation and reduction of molecules, and removal of a part of molecules can be performed under mild conditions. For example, lysozyme obtained by glutarizing a part of lysozyme can be obtained as follows.
【００１２】リゾチームおよびグルタルアルデヒドをpH
6.８のりん酸塩緩衝液に入れ、３０℃で１５時間攪拌
後、生成したグルタル化リゾチーム（非還元型）、ある
いはさらに水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のり
ん酸塩緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し還元後、生成
したグルタル化リゾチーム（還元型）を得ることができ
る。PH of lysozyme and glutaraldehyde
Put it in 6.8 phosphate buffer and stir at 30 ° C for 15 hours, then use the glutarized lysozyme (non-reducing type) or sodium borohydride to produce phosphate buffer at pH 6.8. The resulting glutarized lysozyme (reduced form) can be obtained after reduction by stirring at 4 ° C. for 12 hours.
【００１３】グルタル化リゾチームの精製方法は、特に
限定されず、一般に用いられる方法によることができ
る。例えば、セファデックスＧ２５カラムクロマトグラ
フィーを使用して、上記反応液より未反応のグルタルア
ルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムを除去すること
ができる。また、リゾチームの一部をジオール化したリ
ゾチームを得るには、例えば、リゾチームおよび２，３
−エポキシプロパノールをpH8.０のりん酸塩緩衝液中に
加え、室温で２４時間攪拌後、精製すればよい。The method for purifying the glutarized lysozyme is not particularly limited and may be a commonly used method. For example, Sephadex G25 column chromatography can be used to remove unreacted glutaraldehyde and sodium borohydride from the reaction solution. Further, to obtain lysozyme in which a part of lysozyme is diol, for example, lysozyme and 2,3
-Epoxy propanol may be added to a phosphate buffer of pH 8.0, stirred at room temperature for 24 hours, and then purified.
【００１４】また、リゾチームの一部をアシル化したリ
ゾチームを得るには、例えば、リゾチームおよび対応す
る酸無水物をpH8.５のほう酸塩緩衝液にいれ、２５℃で
３０〜６０分攪拌後、精製すればよい。グルタル化した
リゾチームをアミノプロピルシリカゲルに結合するに
は、具体的には次のようにすればよい。To obtain lysozyme in which a part of lysozyme is acylated, for example, lysozyme and the corresponding acid anhydride are added to a borate buffer solution having a pH of 8.5 and stirred at 25 ° C. for 30 to 60 minutes. It may be purified. To bind glutarized lysozyme to aminopropyl silica gel, specifically, the following may be performed.
【００１５】グルタル化したリゾチームをpH6.８の炭酸
水素ナトリウム緩衝液に溶解する。別にアミノプロピル
シリカゲルおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジルカーボネー
トをpH6.８の炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解懸濁さ
せ、一晩攪拌後、分取水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲル懸濁液を得る。先に用意したグルタル化リゾチ
ームの溶液を活性化アミノプロピルシリカゲル懸濁液に
加え、攪拌後水洗してシリカゲルにグルタル化リゾチー
ムが架橋剤を介して結合した光学異性体分離剤を得るこ
とができる。Glutarized lysozyme is dissolved in a sodium hydrogen carbonate buffer solution having a pH of 6.8. Separately, aminopropyl silica gel and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a sodium hydrogen carbonate buffer solution having a pH of 6.8, and the mixture is stirred overnight and washed with preparative water to obtain an activated aminopropyl silica gel suspension. .. The previously prepared solution of glutarized lysozyme is added to the activated aminopropyl silica gel suspension, and the mixture is stirred and washed with water to obtain an optical isomer separating agent in which glutarized lysozyme is bound to silica gel via a crosslinking agent.
【００１６】また、リゾチームを結合させておいた固定
相上のリゾチームに化学修飾を行うには次のようにすれ
ばよい。例えば、親水性合成ポリマーにペンタエチルヘ
キサミン等のポリアミンを導入した担体とＮ，Ｎ−ジサ
クシニミジルカーボネートをpH6.８炭酸水素ナトリウム
緩衝液に溶解、懸濁させ一晩攪拌し、分取水洗して活性
化合成ポリマーの懸濁液を得る。別に、リゾチームをpH
6.８炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解した溶液を用意
し、前記懸濁液に加えることにより、リゾチームが結合
したポリマー充填剤を得る。この充填剤およびグルタル
アルデヒドをpH6.８のりん酸緩衝液に入れ、３０℃で１
５時間攪拌後、生成したグルタル化リゾチーム（非還元
型）、あるいはさらに水素化ほう素ナトリウムを用いて
pH6.８のりん酸塩緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し、
還元後、生成したグルタル化リゾチーム（還元型）がア
ミド結合および架橋剤を介して合成ポリマーに結合した
光学異性体分離剤を得ることができる。The chemical modification of lysozyme on the stationary phase to which lysozyme is bound may be carried out as follows. For example, a carrier prepared by introducing a polyamine such as pentaethylhexamine into a hydrophilic synthetic polymer and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a pH 6.8 sodium hydrogen carbonate buffer solution, stirred and stirred overnight, and washed with preparative water. To obtain a suspension of activated synthetic polymer. Separately, pH of lysozyme
6.8 A solution dissolved in a sodium hydrogen carbonate buffer is prepared and added to the suspension to obtain a lysozyme-bound polymer filler. The filler and glutaraldehyde were added to a phosphate buffer of pH 6.8 at 30 ° C for 1 hour.
After stirring for 5 hours, using the glutarized lysozyme (non-reducing type) or sodium borohydride
Stir for 12 hours at 4 ° C in phosphate buffer pH 6.8,
After reduction, it is possible to obtain an optical isomer separation agent in which the produced glutarized lysozyme (reduced type) is bound to the synthetic polymer through the amide bond and the cross-linking agent.
【００１７】このようにリゾチームを化学修飾すること
により、光学異性体分離カラムとしてのカラムライフ
（サンプル注入回数）を大幅に伸ばすことができる。担
体１００重量部に対するリゾチーム又は修飾リゾチーム
の結合割合は、８〜１１重量部、好ましくは９〜１０重
量部、一般に約１０重量部が適当である。本発明の分離
剤は前記したごとく、リゾチームを担体に結合した固定
相、担体に固定化されたリゾチームの分子構造の一部を
修飾した固定相、若しくは分子構造の一部を修飾したリ
ゾチームを担体に結合した固定相からなることを特徴と
する。従って本発明の分離剤には当該固定相が必須の構
成成分として含まれるが、同時に分離剤中の他の成分、
例えばシリカゲル、ガラス、セルロース、カーボンやポ
リマー等、リゾチーム又は修飾リゾチームが結合してい
ない担体が任意に選択されて加えられることは自由であ
り、分離の向上のために適宜行うことができる。By chemically modifying lysozyme in this way, the column life (the number of times of sample injection) as an optical isomer separation column can be significantly extended. A suitable binding ratio of lysozyme or modified lysozyme to 100 parts by weight of the carrier is 8 to 11 parts by weight, preferably 9 to 10 parts by weight, and generally about 10 parts by weight. As described above, the separating agent of the present invention comprises a stationary phase in which lysozyme is bound to a carrier, a stationary phase in which a part of the molecular structure of lysozyme immobilized in the carrier is modified, or a lysozyme in which a part of the molecular structure is modified as a carrier. It is characterized by comprising a stationary phase bound to. Therefore, the stationary phase is contained in the separating agent of the present invention as an essential component, but at the same time, other components in the separating agent,
For example, a carrier to which lysozyme or modified lysozyme is not bound, such as silica gel, glass, cellulose, carbon or polymer, can be arbitrarily selected and added, and can be appropriately used for improving separation.
【００１８】本発明の分離剤を用いて分離することがで
きる光学異性体とは、分子内に不斉炭素原子を有するキ
ラル化合物を言い、多くの医薬品にその例を見ることが
できる。例えばクロルフェニラミン、クロルプレナリ
ン、ピンドロール、ヴェラパミル、プロプラノロール、
ジメチンデン、エチアジド等を挙げることができる。こ
れらの化合物においては互いに鏡像関係にある複数の光
学異性体が存在し、一体となってラセミ体を形成してい
る。本発明の分離剤はこれらラセミ体を対象として、こ
れらを構成する光学異性体を分離するのに特に有効であ
る。The optical isomers that can be separated using the separating agent of the present invention refer to chiral compounds having an asymmetric carbon atom in the molecule, and examples thereof can be found in many pharmaceutical products. For example chlorpheniramine, chlorprenaline, pindolol, verapamil, propranolol,
Examples include dimethindene and ethiazide. In these compounds, a plurality of optical isomers having a mirror image relationship to each other exist, and they together form a racemate. The separating agent of the present invention is particularly effective in separating the optical isomers constituting these racemates.
【００１９】本発明の分離剤は主として液体クロマトグ
ラフィーにおいて使用される。従ってその使用方法は液
体クロマトグラフィーにおける通常の操作によって行え
ばよく、例えば本発明の分離剤をカラムに充填し、光学
異性体に係るセラミ体をチャージし、次にりん酸緩衝
液、エタノール水溶液、イソプロパノール等の移動相を
流通せしめ、保持時間の差によって、所望の光学異性体
を分離すればよい。The separating agent of the present invention is mainly used in liquid chromatography. Therefore, the method of use may be carried out by a usual operation in liquid chromatography. For example, a column is filled with the separating agent of the present invention, a cerami body related to an optical isomer is charged, and then a phosphate buffer solution, an aqueous ethanol solution, The desired optical isomer may be separated by circulating a mobile phase such as isopropanol and the retention time difference.
【００２０】[0020]
【実施例】以下に記載する実施例によって本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。 実施例１ アミノプロピルシリカゲル（信和化工（株）製：ＵＬＴ
ＲＯＮ ＮＨ２、アミノプロピル基含量：８重量％）３
ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジルカーボネート２ｇを
0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）１００mlに
入れ、一夜攪拌し、ガラスフィルター上にとり、水洗し
て活性化アミノプロピルシリカゲルの懸濁液を調製し
た。別にリゾチーム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを
前記懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフ
ィルター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得
られた分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分
離用カラムとした。 実施例２ グルタルアルデヒド0.１ｇおよびリゾチーム２ｇを0.６
Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）に入れ、３０℃で１５時間
攪拌し、グルタル化リゾチームを合成した。セファデッ
クスＧ２５カラムクロマトグラフィーにより未反応のグ
ルタルアルデヒドを除きグルタル化リゾチーム（非還元
型）を単離した。グルタル化リゾチーム（非還元型）の
一部を、水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のりん
酸緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し還元し、グルタル
化リゾチーム（還元型）を得た。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 Aminopropyl silica gel (manufactured by Shinwa Kako Co., Ltd .: ULT)
RON NH2, aminopropyl group content: 8% by weight) 3
and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate
A suspension of activated aminopropyl silica gel was prepared by placing the mixture in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirring overnight, loading onto a glass filter and washing with water. Separately, prepare a solution prepared by dissolving 2 g of lysozyme in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), add it to the above suspension, stir at 30 ° C. for 15 hours, then place on a glass filter and wash with water. The separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 2 0.6 g of glutaraldehyde and 2 g of lysozyme
It was placed in M phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours to synthesize glutaric lysozyme. Unreacted glutaraldehyde was removed by Sephadex G25 column chromatography to isolate glutarized lysozyme (non-reduced form). A portion of the glutarated lysozyme (non-reduced form) was reduced by stirring with sodium borohydride in a pH 6.8 phosphate buffer at 4 ° C for 12 hours to reduce the glutarized lysozyme (reduced form). Obtained.
【００２１】次に、親水性ポリマー（ポリビニルアルコ
ール共重合体）ゲルにポリアミン（ペンタエチルヘキサ
ミン）を導入したカラム充填剤〔アサヒパックＮＨ２Ｐ
−５０（旭化成製）〕２ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミ
ジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝
液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラスフィ
ルター上にとり、水洗して活性化合成ポリマーゲルの懸
濁液を調製した。別に非還元型あるいは還元型グルタル
化リゾチーム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを前記
懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィル
ター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得られ
た分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分離用
カラムとした。 実施例３ アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲルの懸濁液を調製した。別にリゾチーム２ｇを0.
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０mlに溶解
した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、リゾチー
ム結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤２ｇおよび
グルタルアルデヒド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液
（pH6.８）３０mlに入れ、３０℃で１５時間攪拌し本発
明の分離剤（非還元型）を得た。さらに0.２ｇの水素化
ほう素ナトリウムを加え４℃で１２時間攪拌、還元し本
発明の分離剤（還元型）を得た。得られた分離剤をスチ
ールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例４ アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびグルタルアルデヒ
ド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）１００ml
に入れ、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上
にとり水洗した。このグルタル化シリカゲルにリゾチー
ム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH6.８）３０mlに
溶解し反応させるとともに、リゾチームのグルタル化も
行わせしめ、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例５Ａ 実施例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてリ
ゾチーム結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤を五
酸化りんデシケーター中にて乾燥した後、0.０６Ｍりん
酸塩緩衝液（pH8.０）に懸濁し、２，３−エポキシプロ
パノール0.５mlを加えて室温にて２４時間攪拌して本発
明分離剤を得た。得られた分離剤をスチールカラムに充
填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例５Ｂ リゾチーム２ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液に懸濁し、
２，３−エポキシプロパノール0.５mlを加えて室温にて
２４時間攪拌してジオール化リゾチームを得た。次に、
アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲルの懸濁液を調製した。別にジオール化リゾチー
ム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３
０mlに溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加
え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上にと
り、水洗し、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例６Ａ 実施例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてリ
ゾチーム結合シリカゲル充填剤を得た。本充填剤1.８ｇ
および１mlのジオキサンに0.２２５mlの無水酢酸を溶解
した溶液を0.１Ｍほう酸塩緩衝液（pH8.５）５０mlに入
れ、２５℃で３０分攪拌後、ガラスフィルター上にと
り、水洗して本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例６Ｂ リゾーチム２ｇを１mlのジオキサン0.２２５mlの無水酢
酸を溶解した溶液とともに0.１Ｍのほう酸塩緩衝液（pH
8.５）に入れ、アセチル化リゾチームを得た。次に、ア
ミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニ
ミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラスフ
ィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシリ
カゲルの懸濁液を調製した。別にアセチル化リゾチーム
２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０
mlに溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、
本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチールカラ
ムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。Next, a column packing material [Asahi Pack NH2P] prepared by introducing polyamine (pentaethylhexamine) into a hydrophilic polymer (polyvinyl alcohol copolymer) gel.
-50 (manufactured by Asahi Kasei)] and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were added to 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of chemically synthesized polymer gel was prepared. Separately, prepare a solution of 2 g of non-reduced or reduced glutarized lysozyme dissolved in 30 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), add it to the above suspension, and stir at 30 ° C. for 15 hours. It was then placed on a glass filter and washed with water to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 3 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were placed in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter and washed with water to activate. A suspension of aminopropyl silica gel was prepared. Separately 2 g of lysozyme.
A solution dissolved in 30 ml of 1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8) was prepared and added to the above suspension to obtain a lysozyme-bonded silica gel filler. 2 g of this packing material and 0.1 g of glutaraldehyde were placed in 30 ml of 0.06 M phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours to obtain the separating agent (non-reducing type) of the present invention. Further, 0.2 g of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours and reduced to obtain a separating agent (reduced type) of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 4 3 g of aminopropyl silica gel and 0.1 g of glutaraldehyde were added to 100 ml of 0.06M phosphate buffer (pH 6.8).
After stirring for 15 hours at 30 ° C., it was placed on a glass filter and washed with water. 2 g of lysozyme was dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogencarbonate (pH 6.8) in this glutarized silica gel and reacted, and lysozyme was glutarized to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 5A A lysozyme-bonded silica gel filler was obtained by using aminopropyl silica gel in the same manner as in Example 1. The filler was dried in a phosphorus pentoxide desiccator, suspended in 0.06M phosphate buffer (pH 8.0), 0.5 ml of 2,3-epoxypropanol was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. Then, the separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 5B 2 g of lysozyme was suspended in 0.06 M phosphate buffer,
0.5 ml of 2,3-epoxy propanol was added and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to obtain diolated lysozyme. next,
3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were put into 100 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated aminopropyl silica gel. A suspension of was prepared. Separately, 2 g of diolated lysozyme was added to 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer solution (pH 6.8) 3
A solution dissolved in 0 ml was prepared, added to the above suspension, stirred at 30 ° C. for 15 hours, placed on a glass filter and washed with water to obtain a separating agent of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 6A A lysozyme-bonded silica gel filler was obtained by using aminopropyl silica gel in the same manner as in Example 1. This filler 1.8g
Then, a solution of 0.225 ml of acetic anhydride dissolved in 1 ml of dioxane was added to 50 ml of 0.1 M borate buffer (pH 8.5), stirred at 25 ° C for 30 minutes, taken on a glass filter and washed with water according to the present invention. Was obtained. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 6B A solution of 2 g of lysozyme in 1 ml of dioxane 0.225 ml of acetic anhydride in 0.1 M borate buffer (pH
8.5) to obtain acetylated lysozyme. Next, 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were added to 100 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of aminopropyl silica gel was prepared. Separately, add 2 g of acetylated lysozyme to a 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer solution (pH 6.8) 30
Prepare a solution dissolved in ml, add it to the suspension,
The separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.
【００２２】以下の実験例によって本発明の効果を示
す。 実験例１ 実施例１で調製した光学異性体分離用カラムを用いてベ
ンゾインのエナンチオマーにおける分離を試みた。な
お、移動相は２０ｍＭりん酸塩緩衝液（KH2PO4 /K2HP
O4)(pH6.９）／２プロパノール＝９５／５（Ｖ／Ｖ）を
使用し、流速を0.８ml／min とした。The effects of the present invention will be shown by the following experimental examples. Experimental Example 1 An attempt was made to separate benzoin enantiomers by using the optical isomer separation column prepared in Example 1. The mobile phase was 20 mM phosphate buffer (KH 2 PO 4 / K 2 HP).
O 4 ) (pH 6.9) / 2 propanol = 95/5 (V / V) was used, and the flow rate was 0.8 ml / min.
【００２３】結果を図１に示す。図１より本発明分離剤
によって各光学異性体が分離されたことが判明した。 実験例２ 実施例３で調製した（非還元型）光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例１と同様にしてマレイン酸クロルフェ
ニラミンのラセミ体における分離を試みた。The results are shown in FIG. From FIG. 1, it was found that the optical isomers were separated by the separating agent of the present invention. Experimental Example 2 An attempt was made to separate racemic chlorpheniramine maleate in the same manner as in Experimental Example 1 by using the (non-reduced) optical isomer separation column prepared in Example 3.
【００２４】結果を図２に示す。図２より本発明分離剤
によって各光学異性体が分離されたことが判明した。 実験例３ 実施例１及び実施例２で調製した光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例１と同様にしてマレイン酸クロルフェ
ニラミンのラセミ体における分離を繰り返し試みた。実
施例１で調製したリゾチームカラムで分析した場合、５
０回の注入でカラムの劣化が始まり、分離が充分に行わ
れなくなったのに対して、実施例２で調製したグルタル
化リゾチームカラムで分析した場合には、３００回の注
入でもカラムの劣化が起こらなかった。The results are shown in FIG. From FIG. 2, it was found that the optical isomers were separated by the separating agent of the present invention. Experimental Example 3 Using the columns for separating optical isomers prepared in Example 1 and Example 2, separation of racemic chlorpheniramine maleate was repeated in the same manner as in Experimental Example 1. When analyzed with the lysozyme column prepared in Example 1, 5
While the column started to deteriorate after 0 injections and the separation was not sufficiently performed, when analyzed by the glutarized lysozyme column prepared in Example 2, the column deteriorated even after 300 injections. It didn't happen.
【００２５】[0025]
【発明の効果】本発明の光学異性体用分離剤は、光学異
性体を効率よく分離することができ、また安価であり、
かつ有機溶媒による変性に対して安定である。例えば、
従来の牛血清アルブミンでは、１−プロパノールは５％
以下でしか使用できなかったが本発明の分離剤では、例
えば、グルタル化リゾチームの場合、５０％メタノー
ル、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノー
ル、アセトニトリル等の溶媒の使用が可能である。The separating agent for optical isomers of the present invention is capable of efficiently separating optical isomers and is inexpensive.
It is also stable against denaturation by organic solvents. For example,
With conventional bovine serum albumin, 5% of 1-propanol
Although it can be used only below, in the separating agent of the present invention, for example, in the case of glutarized lysozyme, it is possible to use a solvent such as 50% methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol or acetonitrile.
【図１】実施例１で調製した光学異性体分離用カラムを
用いてベンゾインのエナンチオマーにおける分離を試み
た結果を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the results of attempting separation of enantiomers of benzoin using the optical isomer separation column prepared in Example 1.
【図２】実施例３で調製した（非還元型）光学異性体分
離用カラムを用いてマレイン酸クロルフェニラミンのラ
セミ体における分離を試みた結果を示す図面である。FIG. 2 is a drawing showing the results of an attempt to separate racemic chlorpheniramine maleate using the column for separating (non-reducing) optical isomers prepared in Example 3.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/02 7731−4Ｈ 17/14 7731−4Ｈ // Ｃ０７Ｃ 49/83 Ｚ 8213−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｚ 8828−4Ｂ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Office reference number FI technical display location C07K 17/02 7731-4H 17/14 7731-4H // C07C 49/83 Z 8213-4H C12P 41 / 00 Z 8828-4B
Claims (3)
たリゾチームが担体に結合されている固定相からなるこ
とを特徴とする光学異性体用分離剤。1. A separating agent for optical isomers, which comprises a stationary phase in which lysozyme or lysozyme partially modified in molecular structure is bound to a carrier.
ルタル化若しくはその還元化、ジオール化、またはアシ
ル化である請求項１記載の光学異性体用分離剤。2. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the partial modification of the lysozyme molecular structure is glutarization or reduction thereof, diolation, or acylation.
ス、カーボンまたは合成ポリマーである請求項１または
２記載の光学異性体用分離剤。3. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is silica gel, glass, cellulose, carbon or a synthetic polymer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03269709A JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03269709A JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05112472A true JPH05112472A (en) | 1993-05-07 |
| JP3138513B2 JP3138513B2 (en) | 2001-02-26 |
Family
ID=17476086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03269709A Expired - Lifetime JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3138513B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526234A (en) * | 2003-08-21 | 2007-09-13 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Separation of polypeptides containing racemized amino acids |
-
1991
- 1991-10-17 JP JP03269709A patent/JP3138513B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526234A (en) * | 2003-08-21 | 2007-09-13 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Separation of polypeptides containing racemized amino acids |
| JP2012102104A (en) * | 2003-08-21 | 2012-05-31 | Novo Nordisk As | Separation of polypeptide comprising racemized amino acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3138513B2 (en) | 2001-02-26 |
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