JP3138513B2 - Separating agent for optical isomers - Google Patents
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は光学異性体の分離剤に関
し、詳しくは担体に固定化されたリゾチーム又は分子構
造の一部を修飾したリゾチームを使用した光学異性体用
分離剤に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a separating agent for optical isomers, and more particularly to a separating agent for optical isomers using lysozyme immobilized on a carrier or lysozyme having a partially modified molecular structure.
【０００２】[0002]
【従来の技術】不斉炭素素子を含むキラルな化学物質に
ついて、その光学異性体を分離することが特に医薬品の
分野において強く要求されている。すなわち一つのラセ
ミ体を構成する複数の光学異性体の中の一つのものが特
別に顕著な医薬上の有用性、例えば顕著な薬理作用、顕
著な生体内利用性を示し、あるいは反対に顕著な毒性を
示すことが一般事実として明らかになり、従って医薬品
としてはラセミ体として投与されるよりも、分離された
光学異性体として投与される方がより合理的であり、治
療効果を高める結果となるからである。2. Description of the Related Art For chiral chemicals containing an asymmetric carbon element, it is strongly required to separate optical isomers, particularly in the field of pharmaceuticals. That is, one of a plurality of optical isomers constituting one racemate shows a particularly significant pharmaceutical utility, for example, a significant pharmacological action, a significant bioavailability, or conversely, a significant It is a general fact that it is toxic, and therefore it is more rational to administer the drug as a separate optical isomer than to the racemate, resulting in enhanced therapeutic efficacy Because.
【０００３】光学異性体の分離については従来から幾多
の実験室的方法が報告されてきたが、工業的規模におい
て実施できるものは少なく、これは非常に困難な技術課
題であると考えられてきた。しかしカラムクロマトグラ
フィーの進歩により、とりわけ液体クロマトグラフィー
により光学異性体を分離する方法が一般に知られるよう
になった。これらの方法については、例えば下記文献
１）〜７）に示されている。 １） イエルゲン・ヘルマンソン：ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー，３２５（１９８５）３７９頁−３
８４頁（Joergen Hermansson:Journal of Chromatograp
hy, ３２５（１９８５）３７９−３８４） ２） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２６４（１９８３）６３頁−６８頁
（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２６
４（１９８３）６３−６８） ３） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２３７（１９８２）４７３頁−４７７
頁（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２
３７（１９８２）４７３−４７７） ４） 特開昭６０−４１６１９号公報 ５） 三輪敏紳ら：ケミカル・アンド・ファーマシュー
ティカル・ブリテン，３５巻（１９８７）６８２頁−６
８６頁（T.Miwa et al:Chemical and Pharmaceutical B
ulletin,Vol ３５（１９８７）６８２−６８６） ６） 萩中 淳ら：クロマトグラフィア，２９巻（１９
９０）５８７頁−５９２頁（J.Haginaka et al:Chromat
ographia,Vol ２９（１９９０）５８７−５９２） ７） 特開昭６４−３１２９号公報 上記文献のうち、１）はキラルなα1 −酸性糖蛋白を使
用する技術を開示している。２）および３）は牛血清ア
ルブミンをそれぞれシリカおよびアガロースに結合せし
めた固定相を使用して分離する方法を開示している。
４）はオロソムコイド、その官能類似体等を使用して分
離する方法を開示している。５）および６）はオボムコ
イドを担体に結合せしめた固定相を使用して分離する方
法を開示している。７）はアビジンを担体に結合せしめ
た固定相を使用して分離する方法を開示している。A number of laboratory methods have been reported for the separation of optical isomers, but few can be carried out on an industrial scale, and this has been considered to be a very difficult technical task. . However, with the advancement of column chromatography, a method for separating optical isomers, especially by liquid chromatography, has become generally known. These methods are described in, for example, the following documents 1) to 7). 1) Jergen Hermannsson: Journal of
Chromatography, 325 (1985) p. 379-3
Page 84 (Joergen Hermansson: Journal of Chromatograp
hy, 325 (1985) 379-384) 2) S. Allenmark et al .: Journal of Chromatography, 264 (1983) pp. 63-68 (S. Allenmark et al: Journal of Chromatography, 26)
4 (1983) 63-68) 3) S. Allenmark et al .: Journal of Chromatography, 237 (1982) pp. 473-474.
Page (S. Allenmark et al: Journal of Chromatography, 2
37 (1982) 473-477) 4) JP-A-60-41619 5) Toshinari Miwa et al .: Chemical and Pharmaceutical Britain, 35 (1987) 682-6.
86 (T. Miwa et al: Chemical and Pharmaceutical B
ulletin, Vol 35 (1987) 682-686) 6) Atsushi Haginaka et al .: Chromatography, Vol. 29 (19)
90) 587-592 (J. Haginaka et al: Chromat
ographia, Vol 29 (1990) 587-592) 7) JP-A-64-3129 Among the above documents, 1) discloses a technique using a chiral α 1 -acid glycoprotein. 2) and 3) disclose a method for separating bovine serum albumin using a stationary phase bound to silica and agarose, respectively.
4) discloses a method for separation using orosomucoid, a functional analog thereof, and the like. 5) and 6) disclose a method for separating ovomucoid using a stationary phase bound to a carrier. 7) discloses a method for separating avidin using a stationary phase bound to a carrier.
【０００４】しかしながら１）〜７）の技術における使
用資材は一般に高価である。またこれらの技術における
分離方法は主として多量の有機溶媒を使用する液体クロ
マトグラフィーによって行われるので、使用資材は有機
溶媒による変性に対して安定でなければならないが、例
えばアルブミン、オロソムコイドはこの条件を十分に満
足することができない。However, the materials used in the techniques 1) to 7) are generally expensive. In addition, since the separation method in these techniques is mainly performed by liquid chromatography using a large amount of an organic solvent, the materials used must be stable against denaturation by the organic solvent.For example, albumin and orosomucoid satisfy this condition sufficiently. Can not be satisfied.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、光学異性体の分離に有用な分離剤であって、安価
でかつ有機溶媒による変性に対して安定な光学異性体用
分離剤を提供することである。Accordingly, an object of the present invention is to provide a separating agent useful for separating optical isomers, which is inexpensive and stable against denaturation by an organic solvent. It is to be.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成するために種々の検討を行った。その結果、卵白より
簡単に入手することができるリゾチームを使用すること
により上記目的を達成することができることを見い出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はリ
ゾチーム又は分子構造の一部を修飾したリゾチームが担
体に結合されている固定相からなることを特徴とする光
学異性体用分離剤である。The present inventor has made various studies to achieve the above object. As a result, they have found that the above object can be achieved by using lysozyme which can be easily obtained from egg white, and have completed the present invention. That is, the present invention is a separating agent for optical isomers, characterized in that lysozyme or lysozyme partially modified in molecular structure comprises a stationary phase bound to a carrier.
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。リゾチー
ムは卵白中に存在し、分子量が約１４３００〜１４６０
０、等電点１0.７の蛋白質である。リゾチームは結晶化
することができ、陽イオン交換クロマトグラフィーまた
は界面移動電気泳動で分離することができる。しかしリ
ゾチームは、卵白からのオボムチンの沈澱に先だって取
り除くことができる。即ち卵白のpHを9.５に調整し、５
％ NaCl を加えて、等電点のリゾチームを接種（seedin
g ）するとリゾチームが結晶化するので、結晶として得
ることができる。従って本発明に用いられるリゾチーム
として、このようにして安価に製造したリゾチームを使
用することが好ましいが、本発明に使用するリゾチーム
の入手方法がこの方法に限定されるわけではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail. Lysozyme is present in egg white and has a molecular weight of about 14300-1460
0, a protein with an isoelectric point of 10.7. Lysozyme can crystallize and can be separated by cation exchange chromatography or interfacial transfer electrophoresis. But lysozyme can be removed prior to the precipitation of ovomucin from egg white. That is, the pH of the egg white was adjusted to 9.5 and 5
% NaCl and inoculate lysozyme with isoelectric point (seedin
g) Then, lysozyme crystallizes and can be obtained as crystals. Therefore, as the lysozyme used in the present invention, it is preferable to use lysozyme produced in this manner at low cost, but the method for obtaining the lysozyme used in the present invention is not limited to this method.
【０００８】本発明に用いられる担体は、リゾチーム又
は分子の一部が修飾されたリゾチームと結合し、固定相
を形成し得るものであればよい。本発明の分離剤を用い
た光学異性体の分離は、主として液体クロマトグラフィ
ーによって行われるもので、担体としては例えばシリカ
ゲル、ガラス、セルロース、カーボンまたは合成ポリマ
ー（例えば、ポリビニルアルコール）等を挙げることが
できる。[0008] The carrier used in the present invention may be any carrier that can form a stationary phase by binding to lysozyme or lysozyme in which a part of the molecule is modified. The separation of the optical isomers using the separating agent of the present invention is mainly performed by liquid chromatography, and examples of the carrier include silica gel, glass, cellulose, carbon, and a synthetic polymer (for example, polyvinyl alcohol). it can.
【０００９】リゾチーム又は分子の一部が修飾されたリ
ゾチーム（以下リガンドと呼ぶ）が結合されている担体
からなる固定相は、固定相を形成するために通常行われ
ている方法に従って形成することができる。例えば、リ
ゾチームを担体に結合するには、例えばアミノプロピル
シリカゲルを担体とし、Ｎ，Ｎ−ジサクシニミジルカー
ボネートを架橋剤としてリゾチームを結合する方法、ガ
ラスを担体とし、３−グリシドキシプロピルトリメトキ
シシランを架橋剤としてリゾチームを結合する方法、セ
ルロースを担体とし、ブロムシアンで活性化してからこ
れにリゾチームを結合する方法、イオン交換合成ポリマ
ーにリゾチームを結合する方法等が挙げられる。A stationary phase comprising a carrier to which lysozyme or a partially modified lysozyme (hereinafter referred to as a ligand) is bound can be formed according to a method usually used for forming a stationary phase. it can. For example, to bind lysozyme to a carrier, for example, a method of binding lysozyme using aminopropyl silica gel as a carrier and N, N-disuccinimidyl carbonate as a cross-linking agent, a method using glass as a carrier, Examples thereof include a method of binding lysozyme using methoxysilane as a cross-linking agent, a method of binding lysozyme to cellulose using a carrier as a carrier and activating with bromocyan, and a method of binding lysozyme to an ion-exchange synthetic polymer.
【００１０】また、分子の一部を修飾したリゾチームが
担体に結合した固定相を得る方法には、あらかじめ分子
の一部を修飾しておいたリゾチームを共有結合やイオン
結合などによって担体に結合する方法と、リゾチームを
結合させておいた固定相に先に述べた方法による修飾を
施して目的とする固定相を得る方法がある。例えばアミ
ノプロピルシリカゲルやアミノ基が結合した合成ポリマ
ーを担体とし、グルタルアルデヒドやＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネートを架橋剤としてリガンドを結合し
たり、あるいはシリカゲルやガラス若しくはカーボンを
担体として３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラ
ンを架橋剤としてリガンドを結合したり、あるいはセル
ロースを担体とし、ブロムシアンで活性化してからこれ
らにリガンドを結合したり、陰イオン交換合成ポリマー
にリガンドを結合したりする方法により製造できる。In order to obtain a stationary phase in which lysozyme partially modified with a molecule is bound to a carrier, lysozyme partially modified in a molecule is bound to the carrier by a covalent bond or an ionic bond. There is a method and a method in which a stationary phase to which lysozyme is bound is modified by the method described above to obtain a desired stationary phase. For example, aminopropyl silica gel or a synthetic polymer to which an amino group is bonded is used as a carrier, glutaraldehyde or N, N-disuccinimidyl carbonate is used as a cross-linking agent to bind a ligand, or silica gel, glass or carbon is used as a carrier, and 3-glycol is used. A method in which a ligand is bound by using sidoxypropyltrimethoxysilane as a cross-linking agent, or a cellulose is used as a carrier, and the ligand is bound to these after activation with bromocyan, or a ligand is bound to an anion exchange synthetic polymer. Can be manufactured.
【００１１】一般に蛋白質分子を修飾する方法には、化
学的方法、酵素的方法、物理的方法等が挙げられる。即
ち、蛋白質分子中のアミノ基、イミダゾール基又はカル
ボキシル基にアルデヒド類、酸無水物又はアルコール類
を反応させると、それぞれ、シッフ塩基、Ｎ−置換イミ
ダゾール基又はエステルが生成して化学的修飾がなされ
る。又、酵素の持つ多彩な作用を用いれば、官能基の修
飾、分子の酸化や還元、分子の一部を除去するなどの反
応が緩和な条件で行い得る。例えば、リゾチームの一部
をグルタル化したリゾチームは次のようにして得ること
ができる。In general, methods for modifying protein molecules include chemical methods, enzymatic methods, and physical methods. That is, when an aldehyde, an acid anhydride or an alcohol is reacted with an amino group, an imidazole group or a carboxyl group in a protein molecule, a Schiff base, an N-substituted imidazole group or an ester is formed, respectively, and a chemical modification is performed. You. In addition, if various actions of the enzyme are used, reactions such as modification of a functional group, oxidation or reduction of a molecule, and removal of a part of a molecule can be performed under mild conditions. For example, lysozyme obtained by glutarizing a part of lysozyme can be obtained as follows.
【００１２】リゾチームおよびグルタルアルデヒドをpH
6.８のりん酸塩緩衝液に入れ、３０℃で１５時間攪拌
後、生成したグルタル化リゾチーム（非還元型）、ある
いはさらに水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のり
ん酸塩緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し還元後、生成
したグルタル化リゾチーム（還元型）を得ることができ
る。Lysozyme and glutaraldehyde are adjusted to pH
6.8 Phosphate buffer (pH 6.8) using glutamic lysozyme (non-reduced) or sodium borohydride after stirring for 15 hours at 30 ° C. After reducing the mixture by stirring at 4 ° C. for 12 hours, the resulting glutarized lysozyme (reduced form) can be obtained.
【００１３】グルタル化リゾチームの精製方法は、特に
限定されず、一般に用いられる方法によることができ
る。例えば、セファデックスＧ２５カラムクロマトグラ
フィーを使用して、上記反応液より未反応のグルタルア
ルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムを除去すること
ができる。また、リゾチームの一部をジオール化したリ
ゾチームを得るには、例えば、リゾチームおよび２，３
−エポキシプロパノールをpH8.０のりん酸塩緩衝液中に
加え、室温で２４時間攪拌後、精製すればよい。[0013] The method of purifying glutarized lysozyme is not particularly limited, and may be a commonly used method. For example, unreacted glutaraldehyde and sodium borohydride can be removed from the reaction solution by using Sephadex G25 column chromatography. In order to obtain lysozyme obtained by partially lysozyme lysozyme, for example, lysozyme and 2,3
Epoxypropanol may be added to a pH 8.0 phosphate buffer, stirred at room temperature for 24 hours, and purified.
【００１４】また、リゾチームの一部をアシル化したリ
ゾチームを得るには、例えば、リゾチームおよび対応す
る酸無水物をpH8.５のほう酸塩緩衝液にいれ、２５℃で
３０〜６０分攪拌後、精製すればよい。グルタル化した
リゾチームをアミノプロピルシリカゲルに結合するに
は、具体的には次のようにすればよい。In order to obtain lysozyme in which a part of lysozyme is acylated, for example, lysozyme and a corresponding acid anhydride are placed in a borate buffer of pH 8.5 and stirred at 25 ° C. for 30 to 60 minutes. It may be purified. The binding of the glutarized lysozyme to aminopropyl silica gel may be carried out specifically as follows.
【００１５】グルタル化したリゾチームをpH6.８の炭酸
水素ナトリウム緩衝液に溶解する。別にアミノプロピル
シリカゲルおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジルカーボネー
トをpH6.８の炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解懸濁さ
せ、一晩攪拌後、分取水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲル懸濁液を得る。先に用意したグルタル化リゾチ
ームの溶液を活性化アミノプロピルシリカゲル懸濁液に
加え、攪拌後水洗してシリカゲルにグルタル化リゾチー
ムが架橋剤を介して結合した光学異性体分離剤を得るこ
とができる。Glutarized lysozyme is dissolved in a sodium hydrogen carbonate buffer at pH 6.8. Separately, aminopropyl silica gel and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a sodium hydrogencarbonate buffer solution (pH 6.8), stirred overnight, and washed with preparative water to obtain an activated aminopropyl silica gel suspension. . The glutarized lysozyme solution prepared above is added to the activated aminopropyl silica gel suspension, and the mixture is stirred and washed with water to obtain an optical isomer separating agent in which glutarized lysozyme is bonded to silica gel via a crosslinking agent.
【００１６】また、リゾチームを結合させておいた固定
相上のリゾチームに化学修飾を行うには次のようにすれ
ばよい。例えば、親水性合成ポリマーにペンタエチルヘ
キサミン等のポリアミンを導入した担体とＮ，Ｎ−ジサ
クシニミジルカーボネートをpH6.８炭酸水素ナトリウム
緩衝液に溶解、懸濁させ一晩攪拌し、分取水洗して活性
化合成ポリマーの懸濁液を得る。別に、リゾチームをpH
6.８炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解した溶液を用意
し、前記懸濁液に加えることにより、リゾチームが結合
したポリマー充填剤を得る。この充填剤およびグルタル
アルデヒドをpH6.８のりん酸緩衝液に入れ、３０℃で１
５時間攪拌後、生成したグルタル化リゾチーム（非還元
型）、あるいはさらに水素化ほう素ナトリウムを用いて
pH6.８のりん酸塩緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し、
還元後、生成したグルタル化リゾチーム（還元型）がア
ミド結合および架橋剤を介して合成ポリマーに結合した
光学異性体分離剤を得ることができる。Further, the chemical modification of lysozyme on the stationary phase to which lysozyme has been bound may be carried out as follows. For example, a carrier obtained by introducing a polyamine such as pentaethylhexamine into a hydrophilic synthetic polymer and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a sodium hydrogencarbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, and then separated and washed. To obtain a suspension of the activated synthetic polymer. Separately, lysozyme pH
6.8 A solution dissolved in sodium bicarbonate buffer is prepared and added to the suspension to obtain a lysozyme-bound polymer filler. The filler and glutaraldehyde are placed in a phosphate buffer at pH 6.8, and
After stirring for 5 hours, use the resulting glutarized lysozyme (non-reduced) or further sodium borohydride
Stir in phosphate buffer at pH 6.8 at 4 ° C. for 12 hours,
After reduction, an optical isomer separating agent can be obtained in which the generated glutarized lysozyme (reduced form) is bonded to the synthetic polymer via an amide bond and a crosslinking agent.
【００１７】このようにリゾチームを化学修飾すること
により、光学異性体分離カラムとしてのカラムライフ
（サンプル注入回数）を大幅に伸ばすことができる。担
体１００重量部に対するリゾチーム又は修飾リゾチーム
の結合割合は、８〜１１重量部、好ましくは９〜１０重
量部、一般に約１０重量部が適当である。本発明の分離
剤は前記したごとく、リゾチームを担体に結合した固定
相、担体に固定化されたリゾチームの分子構造の一部を
修飾した固定相、若しくは分子構造の一部を修飾したリ
ゾチームを担体に結合した固定相からなることを特徴と
する。従って本発明の分離剤には当該固定相が必須の構
成成分として含まれるが、同時に分離剤中の他の成分、
例えばシリカゲル、ガラス、セルロース、カーボンやポ
リマー等、リゾチーム又は修飾リゾチームが結合してい
ない担体が任意に選択されて加えられることは自由であ
り、分離の向上のために適宜行うことができる。By chemically modifying lysozyme in this way, the column life (number of sample injections) as an optical isomer separation column can be greatly extended. The binding ratio of lysozyme or modified lysozyme to 100 parts by weight of the carrier is suitably 8 to 11 parts by weight, preferably 9 to 10 parts by weight, and generally about 10 parts by weight. As described above, the separating agent of the present invention comprises a stationary phase in which lysozyme is bound to a carrier, a stationary phase in which a part of the molecular structure of lysozyme immobilized in the carrier is modified, or a lysozyme in which part of the molecular structure is modified as a carrier. Characterized by comprising a stationary phase bonded to Therefore, the separating agent of the present invention contains the stationary phase as an essential component, but at the same time, other components in the separating agent,
For example, a carrier to which lysozyme or modified lysozyme is not bound, such as silica gel, glass, cellulose, carbon or polymer, may be arbitrarily selected and added, and may be appropriately added to improve separation.
【００１８】本発明の分離剤を用いて分離することがで
きる光学異性体とは、分子内に不斉炭素原子を有するキ
ラル化合物を言い、多くの医薬品にその例を見ることが
できる。例えばクロルフェニラミン、クロルプレナリ
ン、ピンドロール、ヴェラパミル、プロプラノロール、
ジメチンデン、エチアジド等を挙げることができる。こ
れらの化合物においては互いに鏡像関係にある複数の光
学異性体が存在し、一体となってラセミ体を形成してい
る。本発明の分離剤はこれらラセミ体を対象として、こ
れらを構成する光学異性体を分離するのに特に有効であ
る。The optical isomer that can be separated using the separating agent of the present invention refers to a chiral compound having an asymmetric carbon atom in the molecule, and examples thereof can be found in many pharmaceuticals. For example, chlorpheniramine, chlorprenaline, pindolol, verapamil, propranolol,
Dimethindene, ethiazide and the like can be mentioned. In these compounds, a plurality of optical isomers that are in a mirror image relationship to each other exist, and form a racemic body integrally. The separating agent of the present invention is particularly effective for separating these racemates and separating the optical isomers constituting them.
【００１９】本発明の分離剤は主として液体クロマトグ
ラフィーにおいて使用される。従ってその使用方法は液
体クロマトグラフィーにおける通常の操作によって行え
ばよく、例えば本発明の分離剤をカラムに充填し、光学
異性体に係るセラミ体をチャージし、次にりん酸緩衝
液、エタノール水溶液、イソプロパノール等の移動相を
流通せしめ、保持時間の差によって、所望の光学異性体
を分離すればよい。The separating agent of the present invention is mainly used in liquid chromatography. Therefore, the method of its use may be carried out by the usual operation in liquid chromatography, for example, by filling the column with the separating agent of the present invention, charging the ceramibody relating to the optical isomer, and then phosphate buffer, ethanol aqueous solution, A mobile phase such as isopropanol may be allowed to flow, and the desired optical isomer may be separated depending on the difference in retention time.
【００２０】[0020]
【実施例】以下に記載する実施例によって本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。 実施例１ アミノプロピルシリカゲル（信和化工（株）製：ＵＬＴ
ＲＯＮ ＮＨ２、アミノプロピル基含量：８重量％）３
ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジルカーボネート２ｇを
0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）１００mlに
入れ、一夜攪拌し、ガラスフィルター上にとり、水洗し
て活性化アミノプロピルシリカゲルの懸濁液を調製し
た。別にリゾチーム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを
前記懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフ
ィルター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得
られた分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分
離用カラムとした。 実施例２ グルタルアルデヒド0.１ｇおよびリゾチーム２ｇを0.６
Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）に入れ、３０℃で１５時間
攪拌し、グルタル化リゾチームを合成した。セファデッ
クスＧ２５カラムクロマトグラフィーにより未反応のグ
ルタルアルデヒドを除きグルタル化リゾチーム（非還元
型）を単離した。グルタル化リゾチーム（非還元型）の
一部を、水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のりん
酸緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し還元し、グルタル
化リゾチーム（還元型）を得た。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 Aminopropyl silica gel (manufactured by Shinwa Kako Co., Ltd .: ULT)
RON NH2, aminopropyl group content: 8% by weight) 3
g and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate
The suspension was placed in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, and washed with water to prepare a suspension of activated aminopropyl silica gel. Separately, a solution prepared by dissolving 2 g of lysozyme in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8) was prepared, added to the suspension, stirred at 30 ° C. for 15 hours, taken on a glass filter, and washed with water. Thus, a separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 2 0.1 g of glutaraldehyde and 2 g of lysozyme were added to 0.6 g
The mixture was placed in an M phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours to synthesize glutarized lysozyme. Unreacted glutaraldehyde was removed by Sephadex G25 column chromatography to isolate glutarized lysozyme (non-reduced form). A part of the glutarized lysozyme (non-reduced form) is reduced by stirring with sodium borohydride in a phosphate buffer at pH 6.8 at 4 ° C. for 12 hours to give glutarized lysozyme (reduced form). Obtained.
【００２１】次に、親水性ポリマー（ポリビニルアルコ
ール共重合体）ゲルにポリアミン（ペンタエチルヘキサ
ミン）を導入したカラム充填剤〔アサヒパックＮＨ２Ｐ
−５０（旭化成製）〕２ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミ
ジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝
液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラスフィ
ルター上にとり、水洗して活性化合成ポリマーゲルの懸
濁液を調製した。別に非還元型あるいは還元型グルタル
化リゾチーム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを前記
懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィル
ター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得られ
た分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分離用
カラムとした。 実施例３ アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲルの懸濁液を調製した。別にリゾチーム２ｇを0.
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０mlに溶解
した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、リゾチー
ム結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤２ｇおよび
グルタルアルデヒド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液
（pH6.８）３０mlに入れ、３０℃で１５時間攪拌し本発
明の分離剤（非還元型）を得た。さらに0.２ｇの水素化
ほう素ナトリウムを加え４℃で１２時間攪拌、還元し本
発明の分離剤（還元型）を得た。得られた分離剤をスチ
ールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例４ アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびグルタルアルデヒ
ド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）１００ml
に入れ、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上
にとり水洗した。このグルタル化シリカゲルにリゾチー
ム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH6.８）３０mlに
溶解し反応させるとともに、リゾチームのグルタル化も
行わせしめ、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例５Ａ 実施例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてリ
ゾチーム結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤を五
酸化りんデシケーター中にて乾燥した後、0.０６Ｍりん
酸塩緩衝液（pH8.０）に懸濁し、２，３−エポキシプロ
パノール0.５mlを加えて室温にて２４時間攪拌して本発
明分離剤を得た。得られた分離剤をスチールカラムに充
填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例５Ｂ リゾチーム２ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液に懸濁し、
２，３−エポキシプロパノール0.５mlを加えて室温にて
２４時間攪拌してジオール化リゾチームを得た。次に、
アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲルの懸濁液を調製した。別にジオール化リゾチー
ム２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３
０mlに溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加
え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上にと
り、水洗し、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例６Ａ 実施例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてリ
ゾチーム結合シリカゲル充填剤を得た。本充填剤1.８ｇ
および１mlのジオキサンに0.２２５mlの無水酢酸を溶解
した溶液を0.１Ｍほう酸塩緩衝液（pH8.５）５０mlに入
れ、２５℃で３０分攪拌後、ガラスフィルター上にと
り、水洗して本発明の分離剤を得た。得られた分離剤を
スチールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとし
た。 実施例６Ｂ リゾーチム２ｇを１mlのジオキサン0.２２５mlの無水酢
酸を溶解した溶液とともに0.１Ｍのほう酸塩緩衝液（pH
8.５）に入れ、アセチル化リゾチームを得た。次に、ア
ミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニ
ミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラスフ
ィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシリ
カゲルの懸濁液を調製した。別にアセチル化リゾチーム
２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０
mlに溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、
本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチールカラ
ムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。Next, a column packing [Asahi Pack NH2P] prepared by introducing a polyamine (pentaethylhexamine) into a hydrophilic polymer (polyvinyl alcohol copolymer) gel.
-50 (manufactured by Asahi Kasei)] 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate are put in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated A suspension of a chemically synthesized polymer gel was prepared. Separately, a solution prepared by dissolving 2 g of non-reduced or reduced glutarized lysozyme in 30 ml of 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 6.8) was prepared, added to the above suspension, and stirred at 30 ° C. for 15 hours. The mixture was washed on a glass filter and washed with water to obtain a separating agent of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 3 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were placed in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, placed on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of aminopropyl silica gel was prepared. Separately add 2 g of lysozyme to 0.
A solution dissolved in 30 ml of 1M sodium bicarbonate buffer (pH 6.8) was prepared and added to the suspension to obtain a lysozyme-bound silica gel filler. 2 g of this filler and 0.1 g of glutaraldehyde were placed in 30 ml of 0.06 M phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours to obtain a separating agent (non-reduced type) of the present invention. Further, 0.2 g of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours and reduced to obtain a separating agent (reduced type) of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 4 3 g of aminopropyl silica gel and 0.1 g of glutaraldehyde were added to 100 ml of 0.06 M phosphate buffer (pH 6.8).
After stirring at 30 ° C. for 15 hours, the mixture was taken on a glass filter and washed with water. 2 g of lysozyme was dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogencarbonate (pH 6.8) and reacted with the glutarized silica gel, and lysozyme was also subjected to glutarization to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 5A A lysozyme-bonded silica gel filler was obtained using aminopropyl silica gel in the same manner as in Example 1. This filler was dried in a phosphorus pentoxide desiccator, suspended in a 0.06 M phosphate buffer (pH 8.0), added with 0.5 ml of 2,3-epoxypropanol, and stirred at room temperature for 24 hours. Thus, the separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 5B 2 g of lysozyme was suspended in 0.06 M phosphate buffer,
0.5 ml of 2,3-epoxypropanol was added and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to obtain diolated lysozyme. next,
3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate are put in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated aminopropyl silica gel. Was prepared. Separately, 2 g of diolated lysozyme was added to 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 6.8) 3
A solution dissolved in 0 ml was prepared, added to the suspension, stirred at 30 ° C. for 15 hours, placed on a glass filter, and washed with water to obtain a separating agent of the present invention. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 6A A lysozyme-bonded silica gel filler was obtained using aminopropyl silica gel in the same manner as in Example 1. 1.8 g of this filler
And a solution prepared by dissolving 0.225 ml of acetic anhydride in 1 ml of dioxane was placed in 50 ml of 0.1 M borate buffer (pH 8.5), stirred at 25 ° C. for 30 minutes, placed on a glass filter, washed with water and washed with the present invention. Was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers. Example 6B 2 g of lysozyme was combined with a solution of 0.225 ml of acetic anhydride in 1 ml of dioxane in 0.1 M borate buffer (pH
8.5) to obtain acetylated lysozyme. Next, 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were put into 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of aminopropyl silica gel was prepared. Separately, 2 g of acetylated lysozyme was added to a 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 6.8) 30
Prepare a solution dissolved in ml, add it to the suspension,
The separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was packed in a steel column to obtain a column for separating optical isomers.
【００２２】以下の実験例によって本発明の効果を示
す。 実験例１ 実施例１で調製した光学異性体分離用カラムを用いてベ
ンゾインのエナンチオマーにおける分離を試みた。な
お、移動相は２０ｍＭりん酸塩緩衝液（KH2PO4 /K2HP
O4)(pH6.９）／２プロパノール＝９５／５（Ｖ／Ｖ）を
使用し、流速を0.８ml／min とした。The effects of the present invention are shown by the following experimental examples. Experimental Example 1 Using the column for separating optical isomers prepared in Example 1, separation of enantiomers of benzoin was attempted. The mobile phase was 20 mM phosphate buffer (KH 2 PO 4 / K 2 HP
O 4 ) (pH 6.9) / 2 propanol = 95/5 (V / V) and the flow rate was 0.8 ml / min.
【００２３】結果を図１に示す。図１より本発明分離剤
によって各光学異性体が分離されたことが判明した。 実験例２ 実施例３で調製した（非還元型）光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例１と同様にしてマレイン酸クロルフェ
ニラミンのラセミ体における分離を試みた。FIG. 1 shows the results. From FIG. 1, it was found that each optical isomer was separated by the separating agent of the present invention. Experimental Example 2 Separation of racemic chlorpheniramine maleate was attempted in the same manner as in Experimental Example 1 using the (non-reduced) optical isomer separation column prepared in Example 3.
【００２４】結果を図２に示す。図２より本発明分離剤
によって各光学異性体が分離されたことが判明した。 実験例３ 実施例１及び実施例２で調製した光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例１と同様にしてマレイン酸クロルフェ
ニラミンのラセミ体における分離を繰り返し試みた。実
施例１で調製したリゾチームカラムで分析した場合、５
０回の注入でカラムの劣化が始まり、分離が充分に行わ
れなくなったのに対して、実施例２で調製したグルタル
化リゾチームカラムで分析した場合には、３００回の注
入でもカラムの劣化が起こらなかった。FIG. 2 shows the results. From FIG. 2, it was found that each optical isomer was separated by the separating agent of the present invention. Experimental Example 3 Separation of racemic chlorpheniramine maleate was repeatedly performed in the same manner as in Experimental Example 1 using the optical isomer separation columns prepared in Example 1 and Example 2. When analyzed with the lysozyme column prepared in Example 1, 5
Degradation of the column started after 0 injections and separation was not sufficiently performed. On the other hand, when analysis was performed using the glutarized lysozyme column prepared in Example 2, degradation of the column was observed even after 300 injections. Did not happen.
【００２５】[0025]
【発明の効果】本発明の光学異性体用分離剤は、光学異
性体を効率よく分離することができ、また安価であり、
かつ有機溶媒による変性に対して安定である。例えば、
従来の牛血清アルブミンでは、１−プロパノールは５％
以下でしか使用できなかったが本発明の分離剤では、例
えば、グルタル化リゾチームの場合、５０％メタノー
ル、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノー
ル、アセトニトリル等の溶媒の使用が可能である。The separating agent for optical isomers of the present invention can efficiently separate optical isomers and is inexpensive.
And it is stable against denaturation by organic solvents. For example,
In conventional bovine serum albumin, 1-propanol is 5%
Although it could only be used in the following, in the case of the separating agent of the present invention, for example, in the case of glutarized lysozyme, a solvent such as 50% methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol and acetonitrile can be used.
【図１】実施例１で調製した光学異性体分離用カラムを
用いてベンゾインのエナンチオマーにおける分離を試み
た結果を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the results of an attempt to separate benzoin enantiomers using an optical isomer separation column prepared in Example 1.
【図２】実施例３で調製した（非還元型）光学異性体分
離用カラムを用いてマレイン酸クロルフェニラミンのラ
セミ体における分離を試みた結果を示す図面である。FIG. 2 is a view showing the results of an attempt to separate a racemic chlorpheniramine maleate using a (non-reduced) optical isomer separation column prepared in Example 3.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 17/02 Ｃ０７Ｋ 17/02 17/14 17/14 // Ｃ０７Ｃ 49/83 Ｃ０７Ｃ 49/83 Ｚ Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｚ (56)参考文献 特開 昭63−218249（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−41619（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07B 63/00 C07B 57/00 310 Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C07K 17/02 C07K 17/02 17/14 17/14 // C07C 49/83 C07C 49/83 Z C12P 41/00 C12P 41/00 Z ( 56) References JP-A-63-218249 (JP, A) JP-A-60-41619 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) C07B 63/00 C07B 57/00 310
Claims (3)
担体に結合されている固定相からなり、リゾチーム分子
構造の一部の修飾が、グルタル化若しくはその還元化、
ジオール化、またはアシル化であることを特徴とする光
学異性体用分離剤。1. A lysozyme modified in part of its molecular structure comprises a stationary phase bonded to a carrier, and the modification of part of the lysozyme molecular structure is carried out by glutarization or reduction thereof.
A separating agent for optical isomers, which is diolated or acylated.
ルタル化若しくはその還元化であることを特徴とする請
求項１記載の光学異性体用分離剤。2. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the partial modification of the lysozyme molecular structure is glutarization or reduction thereof.
ス、カーボンまたは合成ポリマーである請求項１または
２記載の光学異性体用分離剤。3. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is silica gel, glass, cellulose, carbon or a synthetic polymer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03269709A JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03269709A JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05112472A JPH05112472A (en) | 1993-05-07 |
| JP3138513B2 true JP3138513B2 (en) | 2001-02-26 |
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ID=17476086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP03269709A Expired - Lifetime JP3138513B2 (en) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Separating agent for optical isomers |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| JP (1) | JP3138513B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1664108B1 (en) * | 2003-08-21 | 2009-10-14 | Novo Nordisk A/S | Separation of polypeptides comprising a racemized amino acid |
-
1991
- 1991-10-17 JP JP03269709A patent/JP3138513B2/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
| JPH05112472A (en) | 1993-05-07 |
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