JPH013129A - Separating agent for optical isomers - Google Patents
Separating agent for optical isomersInfo
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- JPH013129A JPH013129A JP62-157001A JP15700187A JPH013129A JP H013129 A JPH013129 A JP H013129A JP 15700187 A JP15700187 A JP 15700187A JP H013129 A JPH013129 A JP H013129A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は光学異性体の分離剤に関し、詳しくは担体に結
合したアビジンが使用されることを特徴とする光学異性
体用分離剤に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of Industrial Application] The present invention relates to an agent for separating optical isomers, and more particularly to an agent for separating optical isomers characterized in that avidin bonded to a carrier is used.
従って本発明は光学異性体の分離が技術課題として提起
されている化学の分野、とりわけ医薬品の分野において
利用される。Therefore, the present invention can be utilized in the field of chemistry, particularly in the field of pharmaceuticals, where the separation of optical isomers has been posed as a technical problem.
不斉炭素原子を含むキラルな化学物質について、その光
学異性体を分離することが特に医薬品の分野において強
く要求されている。ずなわち一つのラセミ体を構成する
複数の光学異性体の中の一つのものが特別に顕著な医薬
上の有用性、例えば顕著な薬理作用、顕著な生体内利用
性を示し、あるいは反対に顕著な毒性を示すことが一般
事実として明らかになり、従って医薬品としてはラセミ
体によって投与されるよりも、分離された光学異性体に
よって投与される方がより合理的であり、治療効果を高
める結果となるからである。There is a strong demand for separating optical isomers of chiral chemical substances containing asymmetric carbon atoms, especially in the pharmaceutical field. That is, one of the multiple optical isomers constituting a racemate exhibits particularly significant pharmaceutical utility, such as significant pharmacological action, significant bioavailability, or, on the contrary, It has become clear as a general fact that drugs exhibit significant toxicity, and therefore, it is more rational for pharmaceuticals to be administered as separated optical isomers than as racemates, resulting in increased therapeutic efficacy. This is because.
光学異性体の分離については従来から幾多の実験室的方
法が報告されてきたが、工業的規模において実施できる
ものは少なく、これは非常に困難な技術課題であると考
えられてきた。しかじカラムクロマトグラフィーの進歩
により、とりわけ液体クロマトグラフィーにより光学異
性体を分離する方法が一般に知られるようになリ、例え
ば下記文献１）〜８）に示されるごとくである。Many laboratory methods have been reported for the separation of optical isomers, but few of them can be implemented on an industrial scale, and this has been considered to be an extremely difficult technical problem. With the advancement of column chromatography, methods for separating optical isomers, particularly by liquid chromatography, have become generally known, as shown in, for example, the following documents 1) to 8).
１） デイ−・ダブル・アームストロングら：ジャーナ
ル・オブ・クロマトグラフインク・サイエンス、２２巻
（１９８４） ４１１頁−４１５頁（Ｄ、１八ｒｍｓｔ
ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＳｃｉｅｎｃｅ、
Ｖｏｌ ２２ （１９８４） ４１１． ４１５）２）
イエルケン・ヘルマンソン：ジャーナル・オプ・クロ
マトグラフィー、 ３２５ （１９８５） ３７９頁−
３８４頁（Ｊδｒｇｅｎ ｌｌｅｒｍａｎｓｓｏｎ ：
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
、 ３２５ （１９８５） ３７９−３８４）３） ア
イ・ダブル・ウニイナーら：ジャーナル・オプ・クロマ
トグラフィー、 ２８４ （１９８４）１１７頁−１２
４頁（１，ＬＷａｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ ： Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 、 ２８
４ （１９８４） １１７−１２４）４） ニス・アレ
ンマルクら：ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、
肛（１９８３）’ ６３頁−６８頁（Ｓ、ＡＩＩｅｎｍ
ａｒｋ ｅｔ ａｌ ： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｈ−ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、 ２６４ （１９８３
） ６３ ６８）５） ニス・アレンマルクら：ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー、刹７ （１９Ｂ２）
４７３頁−４７７頁（Ｓ、ＡＩＩｅｎｍａｒｋ ｅｔ
ａｌ ： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ、 ２３７ （１９Ｂ２） ４７３ ４７７
）６）米国特許第４，５３９，３９９号明細書７）特開
昭６０−４１６１９号公報
８） 三輪敬神ら：ケミカル・アンド・ファーマシュー
ティカル・プリテン、３５巻（１９８７） ６８２頁−
６８６頁（Ｔ、旧−ａ ｅｔ ａｌ ： Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ、Ｖｏｌ ３５（１９８７） ６８２上記文献
のうち、１）はキラルなシクロデキストリンを使用する
分離方法を開示し、６）は該シクロデキストリンをシリ
カゲルに結合せしめた固定相を使用して分離する方法を
開示している。1) Day-Double Armstrong et al.: Journal of Chromatographic Science, Vol. 22 (1984), pp. 411-415 (D, 18 rmst
rong et al: Journal of
Chromatographic Science,
Vol 22 (1984) 411. 415)2)
Jerken Hermanson: Journal op Chromatography, 325 (1985) p. 379-
384 pages (Jδrgen llermansson:
Journal of Chromatography
, 325 (1985) 379-384) 3) I. Double Unioner et al.: Journal of Chromatography, 284 (1984) pp. 117-12
4 pages (1, LWainer et al: Jour
nalof chromatography, 28
4 (1984) 117-124) 4) Nis Allenmark et al.: Journal of Chromatography,
Anus (1983)' pp. 63-68 (S, AIIenm
ark et al: Journal of C
h-romatography, 264 (1983
) 63 68) 5) Nis Allenmark et al.: Journal of Chromatography, Chapter 7 (19B2)
Pages 473-477 (S, AIIenmark et
al: Journal of Chromatog
raphy, 237 (19B2) 473 477
) 6) U.S. Patent No. 4,539,399 7) JP-A-60-41619 8) Keishin Miwa et al.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 35 (1987), p. 682-
686 pages (T, old-a et al: Chemic
al andPharmaceutical Bull
etin, Vol 35 (1987) 682 Among the above documents, 1) discloses a separation method using chiral cyclodextrin, and 6) discloses a separation method using a stationary phase in which the cyclodextrin is bonded to silica gel. is disclosed.
２）はキラルなα、−酸性糖蛋白を使用する技術を開示
しており、３）は（Ｒ）−Ｎ −（３，５−ジニトロヘ
ンジイル）フェニルグリシンを使用する技術を開示して
いる。４）および５）は牛血清アルブミンをそれぞれシ
リカおよびアガロースに結合せしめた固定相を使用して
分離する方法を開示している。７）はオロソムコイド、
その官能類似体等を使用して分離する方法を開示してい
る。2) discloses a technique using chiral α,-acidic glycoprotein, and 3) discloses a technique using (R)-N-(3,5-dinitrohendiyl)phenylglycine. . 4) and 5) disclose methods for separating bovine serum albumin using stationary phases bound to silica and agarose, respectively. 7) is orosomucoid,
Discloses a separation method using functional analogs thereof.
８）はオボムコイドを担体に結合せしめた固定相を使用
して分離する方法を開示している。8) discloses a method for separating ovomucoid using a stationary phase bound to a carrier.
しかしながら１）〜７）の技術における使用資材は一般
に高価である。またこれらの技術における分離方法は主
として多量の有機溶媒を使用する液体クロマトグラフィ
ーによって行われるので、使用資材は有機溶媒による変
性に対して安定でなければならないが、例えばアルブミ
ン、オロソムコイドはこの条件を十分に満足することが
できない。However, the materials used in techniques 1) to 7) are generally expensive. Furthermore, since the separation methods in these technologies are mainly carried out by liquid chromatography using large amounts of organic solvents, the materials used must be stable against denaturation by organic solvents, but albumin and orosomucoid, for example, do not meet these conditions sufficiently. I can't be satisfied with that.
又、８）は比較的安価な資材を使用し、有機溶媒による
変成に対しても安定であるが、オボムコイドの等電点が
３．９〜４．３と酸性のｗ４域にあるので塩基性の物質
の分離には優れているが、酸性の物質の分離は十分に満
足することができない。In addition, 8) uses relatively inexpensive materials and is stable against denaturation by organic solvents, but since the isoelectric point of ovomucoid is in the acidic W4 range of 3.9 to 4.3, it is basic. However, the separation of acidic substances is not satisfactory.
前記の問題点にかんがみ、本発明者らは塩基性に等電点
をもつ資材を利用して酸性の光学異性体を分離する技術
の提供を目的として種々の検討を行った。その結果、卵
白より簡単に入手することができるアビジンを使用する
ことにより目的を達成することができることを見出し、
本発明を完成するに到った。In view of the above problems, the present inventors conducted various studies with the aim of providing a technique for separating acidic optical isomers using a material having a basic isoelectric point. As a result, they discovered that the objective could be achieved by using avidin, which is easier to obtain than egg white.
The present invention has now been completed.
即ち本発明は、アビジンを担体に結合した固定相からな
ることを特徴とする光学異性体用分離剤を開示するもの
である。That is, the present invention discloses an optical isomer separation agent characterized by comprising a stationary phase in which avidin is bound to a carrier.
以下に本発明の詳細な説明する。The present invention will be explained in detail below.
アビジンは卵白中に存在し、分子量が約５３，０００、
等電点が９．５の糖蛋白質である。卵白からアビジンを
精製する方法としては硫酸アンモニウムによる沈澱、ベ
ントナイトへの吸着とイオン交換セルロース等がある。Avidin is present in egg white and has a molecular weight of approximately 53,000.
It is a glycoprotein with an isoelectric point of 9.5. Methods for purifying avidin from egg white include precipitation with ammonium sulfate, adsorption to bentonite, and ion exchange cellulose.
例えば、卵白を硫酸アンモニウム分画によりアビジン以
外の大部分の蛋白質を除き、その後弱酸性樹脂の咬着溶
離クロマトグラフィーを行うとか、あるいは分子ふるい
によるゲルクロマトグラフィーを行うとか、さらには疎
水性クロマトグラフィーを行えば容易にアビジンが得ら
れる。しかし卵白よりリゾチームあるいはコンアルブミ
ンを採取した後の残液からこれらの副産物として容易に
分画することもできる。従って本発明においては、アビ
ジンはこのようにして安価に製造したアビジンを入手し
て使用すればよく、アビジンの入手方法は特別に限定さ
れる必要はない。For example, egg white is subjected to ammonium sulfate fractionation to remove most of the proteins other than avidin, and then subjected to biting elution chromatography using a weakly acidic resin, gel chromatography using molecular sieves, or hydrophobic chromatography. Avidin can be easily obtained by doing this. However, lysozyme or conalbumin can also be easily fractionated as by-products from the residual liquid after collecting them from egg whites. Therefore, in the present invention, the avidin produced at low cost in this manner may be obtained and used, and the method of obtaining avidin is not particularly limited.
本発明に用いられる担体はアビジンと結合し、固定相を
形成し得るものであればよい。本発明による光学異性体
の分離は主として液体クロマトグラフィーによって行わ
れるので、担体としては例えばシリカゲル、セルロース
、合成ポリマー等を挙げることができる。The carrier used in the present invention may be any carrier as long as it can bind to avidin and form a stationary phase. Since the separation of optical isomers according to the present invention is mainly carried out by liquid chromatography, examples of the carrier include silica gel, cellulose, and synthetic polymers.
アビジンを担体に結合する方法は、固定相を形成するた
めに通常に行われている方法に従って行えばよい。従っ
て、例えばアミノプロピルシリカゲルを担体とし、Ｎ、
Ｎ−ジサクシニミジルカーボネートを架橋剤としてアビ
ジンを結合したり、あるいはシリカゲルを担体とし、３
−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを架橋剤と
してアビジンを結合したり、あるいはセルロースを担体
とし、ブロムシアンで活性化してからこれにアビジンを
結合したり、陽イオン交換合成ポリマーにアビジンを結
合したりする方法が考えられる。Avidin may be bound to the carrier according to a method commonly used to form a stationary phase. Therefore, for example, using aminopropyl silica gel as a carrier, N,
Avidin is bound using N-disuccinimidyl carbonate as a crosslinking agent, or silica gel is used as a carrier, and 3
- Binding avidin using glycidoxypropyltrimethoxysilane as a crosslinking agent, or binding avidin to cellulose as a carrier after activation with bromcyan, or binding avidin to a cation exchange synthetic polymer. There are possible ways.
本発明の主要な点は光学異性体の分離にあたりアビジン
が使用されることにあるので、本発明は担体との結合方
法によって特別に限定されるものではない。Since the main point of the present invention is that avidin is used for separating optical isomers, the present invention is not particularly limited by the method of binding to the carrier.
本発明の分離剤は前記したごとく、アビジンを担体に結
合して得られた固定相からなることを特徴とする。従っ
て本発明の分離剤には当該固定相が必須の構成成分とし
て含まれるが、同時に分離剤中に他の成分、例えばシリ
カゲルやセルロースが任意に選択されて加えられること
は自由であり、分離効率の向上のために適宜行うことが
できる。As described above, the separation agent of the present invention is characterized by comprising a stationary phase obtained by binding avidin to a carrier. Therefore, the separation agent of the present invention contains the stationary phase as an essential component, but at the same time, other components such as silica gel and cellulose can be arbitrarily selected and added to the separation agent, improving the separation efficiency. This can be done as appropriate to improve the performance.
本発明において光学異性体とは分子内に不斉炭素原子を
有するキラル化合物を言い、多くの医薬品にその例を見
ることができる。例えばイブプロフェン、ケトプロフェ
ン、プロゲルミド、フルルビプロフェン、クロルフェネ
シン、ピンドロール、クロルフェニラミン、クロルプレ
ナリン、タレマスチン、アロプレノロール、オクスプレ
ノロール、アスコルビン酸、プロプラノロール
では互いに鏡像関係にある複数の光学異性体が存在し、
一体となってラセミ体を形成している。In the present invention, an optical isomer refers to a chiral compound having an asymmetric carbon atom in the molecule, and examples thereof can be seen in many pharmaceuticals. For example, ibuprofen, ketoprofen, progelmide, flurbiprofen, chlorphenesin, pindolol, chlorpheniramine, chlorprenaline, talemastine, alloprenolol, oxprenolol, ascorbic acid, and propranolol have multiple optical isomers that are mirror images of each other. exists,
Together they form a racemate.
本発明の分離剤はこれらラセミ体を対象として、それら
からそれらを構成する光学異性体を分離するのに特に有
効である。The separating agent of the present invention is particularly effective for separating these racemates from their constituent optical isomers.
本発明の分離剤は主として液体クロマトグラフィーにお
いて使用される。従ってその使用方法は液体クロマトグ
ラフィーにおける通常の操作によって行えばよく、例え
ば本発明分離剤をカラムに充填し、光学異性体に係るラ
セミ体をチャージし、次にリン酸緩衝液、エタノール水
溶液、イソプロパツール等の移動相を流通せしめ、保持
時間の差によって、所用の光学異性体を単離すればよい
。The separating agent of the present invention is mainly used in liquid chromatography. Therefore, its use can be carried out by the usual operations in liquid chromatography. For example, the separation agent of the present invention is packed into a column, the racemic form of the optical isomer is charged, and then phosphate buffer, ethanol aqueous solution, isopropylene The desired optical isomer may be isolated by passing a mobile phase such as Pator or the like, depending on the difference in retention time.
以下に記載する実施例によって本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。The present invention will be explained in more detail with reference to Examples described below, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例１
アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ −ジサク
シニミジルカーボネート２ｇをＯ． １Ｍ炭酸水素ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６． ８） １００−に入れ、−液
撹拌し、ガラスフィルター上にとり、水洗して活性化ア
ミノプロピルシリカゲルの懸濁液を用意した。別にアビ
ジン２ｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ６
．８）３０艷に溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁
液に加え、本発明分離剤を得た。Example 1 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N,N-disuccinimidyl carbonate were mixed at O.V. The solution was added to 1M sodium bicarbonate buffer (pH 6.8) at 100°C, stirred, placed on a glass filter, and washed with water to prepare a suspension of activated aminopropyl silica gel. Separately, 2 g of avidin was added to 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 6).
．． 8) A solution dissolved in 30 ml was prepared and added to the suspension to obtain the separating agent of the present invention.
得られた分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体
分離用カラムとした。The obtained separation agent was packed into a steel column to prepare a column for separating optical isomers.
実施例２
シリカゲル１０ｇを１４０℃にて２４時間乾燥し、冷却
後、トルエン１４０−に懸濁し、３−グリシドキシプロ
ピルトリメトキシシラン１５ｍ／を加え、加熱還流し、
５時間後に上部より低沸点留分を除き、ガラスフィルタ
ー上にとり、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノー
ルで順次洗浄し、６０℃で２時間乾燥して、エポキシ活
性化シリカゲルを得た。この５ｇをｐ）１８．５のホウ
酸緩衝液５０ｍ７に懸濁し、これにアビジン５００■を
加え、室温にて２４時間反応させた。ガラスフィルター
上にとり、水洗して本発明分離剤を得た。Example 2 10 g of silica gel was dried at 140° C. for 24 hours, cooled, suspended in 140° C. of toluene, added with 15 m/3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, heated to reflux,
After 5 hours, the low-boiling fraction was removed from the upper part, taken on a glass filter, washed successively with toluene, tetrahydrofuran, and methanol, and dried at 60° C. for 2 hours to obtain epoxy-activated silica gel. 5 g of this suspension was suspended in 50 m7 of a boric acid buffer solution (p) 18.5, 500 μl of avidin was added thereto, and the suspension was reacted at room temperature for 24 hours. The mixture was placed on a glass filter and washed with water to obtain a separating agent of the present invention.
得られた分離剤を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に懸濁し、カラムに充填し、光学異性体分離用カラムと
した。The obtained separation agent was added to 20mM phosphate buffer (pH 7.0).
The suspension was suspended in water and packed into a column to prepare a column for separating optical isomers.
実施例３
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐｔ１８．３）に
市販のブロムシアン活性化セファローズ４Ｂを加えて膨
潤させ、これにアビジンを加えて混合し、本発明分離剤
を得た。Example 3 Commercially available bromcyane-activated Sepharose 4B was added to 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pt18.3) to swell it, and avidin was added and mixed to obtain the separating agent of the present invention.
実施例４
市販の陽イオン交換合成ポリマーをスチールカラムに充
填し、このカラムに酸性下アビジン水溶液を流通させア
ビジンを結合せしめ光学異性体分離用カラムとした。Example 4 A commercially available cation exchange synthetic polymer was packed into a steel column, and an avidin aqueous solution was passed through the column under acidic conditions to bind avidin, thereby preparing a column for separating optical isomers.
以下の実験例によって本発明の効果を示す。 The effects of the present invention will be illustrated by the following experimental examples.
実験例１
実施例１で用意された光学異性体分離用カラムを用いて
イブプロフェンのエナンチオマーにおける分離を試みた
。Experimental Example 1 Using the optical isomer separation column prepared in Example 1, an attempt was made to separate the enantiomers of ibuprofen.
なお、移動相は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｋ／に２） （
ｐＨ６，５）を使用し、流速を１．０ ｉ１／ｍｉｎと
した。The mobile phase was 20mM phosphate buffer (k/2) (
pH 6.5) was used, and the flow rate was 1.0 i1/min.
結果を第１図に示す。The results are shown in Figure 1.
第１図より本発明分離剤によって各光学異性体が分離さ
れたことが判明した。From FIG. 1, it was found that each optical isomer was separated by the separating agent of the present invention.
実験例２
実験例１と同様にしてケトプロフェンのラセミ体におけ
る分離を試みた。但し移動相のｐＨは７．０とした。Experimental Example 2 Separation of racemic ketoprofen was attempted in the same manner as in Experimental Example 1. However, the pH of the mobile phase was 7.0.
結果を第２図に示す。The results are shown in Figure 2.
第２図より本発明分離剤によって各光学異性体が分離さ
れたことが判明した。From FIG. 2, it was found that each optical isomer was separated by the separating agent of the present invention.
実験例３
実験例２と同様にしてプロゲルミドのラセミ体における
分離を試みた。Experimental Example 3 Separation of racemic progelamide was attempted in the same manner as in Experimental Example 2.
結果を第３図に示す。The results are shown in Figure 3.
第３図より本発明分離剤によって各光学異性体が分離さ
れたことが判明した。From FIG. 3, it was found that each optical isomer was separated by the separating agent of the present invention.
第１図は実験例１の結果を示す液体クロマトグラム、第
２図は実験例２の結果を示す液体クロマトグラム、第３
図は実験例３の結果を示す液体クロマトグラムである。Figure 1 is a liquid chromatogram showing the results of Experimental Example 1, Figure 2 is a liquid chromatogram showing the results of Experimental Example 2, and Figure 3 is a liquid chromatogram showing the results of Experimental Example 2.
The figure is a liquid chromatogram showing the results of Experimental Example 3.
Claims (1)
徴とする光学異性体用分離剤。 ２、担体がシリカゲルである特許請求の範囲第１項記載
の光学異性体用分離剤。 ３、担体がセルロースである特許請求の範囲第１項記載
の光学異性体用分離剤。 ４、担体が合成ポリマーである特許請求の範囲第１項記
載の光学異性体用分離剤。[Scope of Claims] 1. A separating agent for optical isomers, characterized by comprising a stationary phase in which avidin is bonded to a carrier. 2. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is silica gel. 3. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is cellulose. 4. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is a synthetic polymer.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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- 1987-06-24 JP JP62157001A patent/JPH0819010B2/en not_active Expired - Lifetime
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