JPH05246898A - Separating agent for optical isomer - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain an inexpensive separating agent for optical isomers, composed of a stationery phase in which avidin having its partially modified molecular structure is bound to a carrier, capable of efficiently separating an acidic optical isomer and stable to denaturation with an organic solvent. CONSTITUTION:Avidin is modified by partially converting its molecular structure into a glutaryl derivative with glutaraldehyde and further reducing the resultant compound or providing a diol with 2,3-epoxypropanol, etc., acylating the molecular structure with acetic anhydride, etc., then binding the modified avidin with a carrier such as a synthetic polymer, e.g. polyvinyl alcohol, aminopropylated silica gel, aminopropylated glass or cellulose. Thereby, the objective inexpensive separating agent for optical isomers stable to denaturation with an organic solvent is obtained. Furthermore, the separating agent is packed in a column and the enantiomer of fenoprofen can be moved with a 20mM phosphate buffer solution (pH6.5) to separate respective optical isomers.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は光学異性体用分離剤に関
し、詳しくは担体に固定化された分子構造の一部を修飾
したアビジンを使用した光学異性体用分離剤に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a separating agent for optical isomers, and more particularly to a separating agent for optical isomers which uses avidin having a part of the molecular structure immobilized on a carrier modified.

【０００２】[0002]

【従来の技術】不斉炭素原子を含むキラルな化学物質に
ついて、その光学異性体を分離することが特に医薬品の
分野において強く要求されている。すなわち一つのラセ
ミ体を構成する複数の光学異性体の中の一つのものが特
別に顕著な医薬上の有用性、例えば顕著な薬理作用、顕
著な生体内利用性を示し、あるいは反対に顕著な毒性を
示すことが一般事実として明らかになり、従って医薬品
としてはラセミ体として投与されるよりも、分離された
光学異性体として投与される方がより合理的であり、治
療効果を高める結果となるからである。光学異性体の分
離については従来から幾多の実験室的方法が報告されて
きたが、工業的規模において実施できるものは少なく、
これは非常に困難な技術課題であると考えられてきた。
しかしカラムクロマトグラフィーの進歩により、とりわ
け液体クロマトグラフィーにより光学異性体を分離する
方法が一般に知られるようになった。これらの方法につ
いては、例えば下記文献１）〜９）に示されている。2. Description of the Related Art With respect to a chiral chemical substance containing an asymmetric carbon atom, it is strongly required to separate its optical isomers, especially in the field of pharmaceuticals. That is, one of a plurality of optical isomers constituting one racemate shows a particularly remarkable medicinal usefulness, for example, a remarkable pharmacological action, a remarkable bioavailability, or, conversely, a remarkable effect. Toxicity is generally shown, and therefore it is more rational for a drug to be administered as the separated optical isomer rather than as a racemate, resulting in enhanced therapeutic effect. Because. Many laboratory methods have been reported for the separation of optical isomers, but few can be carried out on an industrial scale.
This has been considered to be a very difficult technical challenge.
However, advances in column chromatography have made generally known methods for separating optical isomers, especially by liquid chromatography. These methods are shown in, for example, Documents 1) to 9) below.

【０００３】１） ディー・ダブル・アームストロング
ら：ジャーナル・オブ・クロマトグラフィック・サイエ
ンス、２２巻（１９８４）４１１−４１５頁(D. W. Arm
stronget al: Journal of Chromatographic Science, V
ol. 22 (1984) 411-415) ２） イエルゲン・ヘルマンソン：ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー，３２５（１９８５）３７９頁−３
８４頁（Joergen Hermansson:Journal of Chromatograp
hy, ３２５（１９８５）３７９−３８４） ３） アイ・ダブル・ワイナーら：ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー，２８４（１９８４）１１７頁−１
２４頁（I. W. Wainer et al:Journal of Chromatograp
hy, ２８４（１９８４）１１７−１２４） ４） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２６４（１９８３）６３頁−６８頁
（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２６
４（１９８３）６３−６８） ５） エス・アレンマルクら：ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー，２３７（１９８２）４７３頁−４７７
頁（S.Allenmark et al:Journal of Chromatography,２
３７（１９８２）４７３−４７７） ６） 米国特許第４，５３９，３９９号明細書 ７） 特開昭６０−４１６１９号公報 ８） 三輪敏紳ら：ケミカル・アンド・ファーマシュー
ティカル・ブリテン，３５巻（１９８７）６８２頁−６
８６頁（T.Miwa et al:Chemical and Pharmaceutical B
ulletin,Vol ３５（１９８７）６８２−６８６） ９） 特開昭６４−３１２９号公報1) Dee Double Armstrong et al .: Journal of Chromatographic Science, 22 (1984) 411-415 (DW Arm
stronget al: Journal of Chromatographic Science, V
ol. 22 (1984) 411-415) 2) Jergen Hermannson: The Journal of
Chromatography, 325 (1985) 379-3.
Page 84 (Joergen Hermansson: Journal of Chromatograp
hy, 325 (1985) 379-384) 3) I Double Weiner et al .: Journal of.
Chromatography, 284 (1984) 117 page-1.
Page 24 (IW Wainer et al: Journal of Chromatograp
hy, 284 (1984) 117-124) 4) S. Allen Marc, et al: Journal of Chromatography, 264 (1983) 63, pp. -68 (S.Allenmark et al: Journal of Chromatography, 26
4 (1983) 63-68) 5) S. Arenmark et al., Journal of Chromatography, 237 (1982) pp. 473-477.
Page (S. Allenmark et al: Journal of Chromatography, 2
37 (1982) 473-477 6) U.S. Pat. No. 4,539,399 7) JP-A-60-41619 8) Miwa Toshishin et al .: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 35 (1987) 682-6.
Page 86 (T. Miwa et al: Chemical and Pharmaceutical B
ulletin, Vol 35 (1987) 682-686) 9) JP-A-64-3129.

【０００４】上記文献のうち、１）はキラルなシクロデ
キストリンを使用する分離方法を開示し、６）は該シク
ロデキストリンをシリカゲルに結合せしめた固定相を使
用して分離する方法を開示している。２）はキラルなα
₁-酸性糖蛋白を使用する技術を開示しており、３）は
（Ｒ）−Ｎ−（３，５−ジニトロベンゾイル）フェニル
グリシンを使用する技術を開示している。４）および
５）は牛血清アルブミンをそれぞれシリカおよびアガロ
ースに結合せしめた固定相を使用して分離する方法を開
示している。７）はオロソムコイド、その官能類似体等
を使用して分離する方法を開示している。８）はオボム
コイドを担体に結合せしめた固定相を使用して分離する
方法を開示している。９）はアビジンを担体に結合せし
めた固定相を使用して分離する方法を開示している。し
かしながら１）〜７）の技術における使用資材は一般に
高価である。またこれらの技術における分離方法は主と
して多量の有機溶媒を使用する液体クロマトグラフィー
によって行われるので、使用資材は有機溶媒による変性
に対して安定でなければならないが、例えばアルブミ
ン、オロソムコイドはこの条件を十分に満足することが
できない。８）は比較的安価な資材を使用し、有機溶剤
による変性に対しても安定であるが、オボムコイドの等
電点が３．９〜４．３と酸性の領域にあるため、塩基性
の物質の分離には優れているが、酸性の物質の分離には
十分に満足する結果を与えることができない。また、
９）はカラムの寿命が短いという問題がある。Among the above documents, 1) discloses a separation method using a chiral cyclodextrin, and 6) discloses a separation method using a stationary phase in which the cyclodextrin is bound to silica gel. .. 2) is a chiral α
A technique using ₁ -acid glycoprotein is disclosed, and 3) discloses a technique using (R) -N- (3,5-dinitrobenzoyl) phenylglycine. 4) and 5) disclose a method for separating bovine serum albumin using a stationary phase bound to silica and agarose, respectively. 7) discloses a method of separation using orosomucoid, its functional analogues and the like. 8) discloses a method of separating ovomucoid using a stationary phase bound to a carrier. 9) discloses a method for separating avidin using a stationary phase bound to a carrier. However, the materials used in the techniques 1) to 7) are generally expensive. Moreover, since the separation method in these techniques is mainly performed by liquid chromatography using a large amount of organic solvent, the materials used must be stable against denaturation by an organic solvent.For example, albumin and orosomucoid sufficiently meet this condition. Can't be satisfied with. 8) uses a relatively inexpensive material and is stable against denaturation by an organic solvent, but since the ovomucoid has an isoelectric point of 3.9 to 4.3, it is a basic substance. , But it does not give satisfactory results for the separation of acidic substances. Also,
9) has a problem that the life of the column is short.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、光学異性体の分離に有用な分離剤であって、安価
で、有機溶媒による変性に対して安定であり、かつカラ
ム寿命の長い、光学異性体用分離剤を提供することであ
る。また本発明の他の目的は、塩基性に等電点をもつ資
材を利用して、酸性の光学異性体の分離に有用な光学異
性体用分離剤を提供することである。Therefore, an object of the present invention is a separating agent useful for separating optical isomers, which is inexpensive, stable to denaturation by organic solvents, and has a long column life. The purpose is to provide a separating agent for optical isomers. Another object of the present invention is to provide a separating agent for optical isomers, which is useful for separating acidic optical isomers, by utilizing a material having an isoelectric point in basicity.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成するために種々の検討を行った。その結果、卵白より
簡単に入手することができるアビジンの分子構造の一部
を修飾して使用することにより上記目的を達成すること
ができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は分子構造の一部を修飾したアビジン
が担体に結合されている固定相からなることを特徴とす
る光学異性体用分離剤である。Means for Solving the Problems The present inventor has conducted various studies to achieve the above object. As a result, they have found that the above object can be achieved by modifying and using a part of the molecular structure of avidin that can be easily obtained from egg white, and completed the present invention.
That is, the present invention is a separating agent for optical isomers, characterized in that it comprises a stationary phase in which avidin whose molecular structure is partially modified is bound to a carrier.

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。アビジン
は卵白中に存在し、分子量が約５３０００、等電点が
９．５の蛋白質である。卵白からアビジンを精製する方
法としては、硫酸アンモニウムによる沈殿、ベントナイ
トへの吸着とイオン交換セルロースによる方法等があ
る。例えば、卵白を硫酸アンモニウム分画によりアビジ
ン以外の大部分の蛋白質を除き、その後弱酸性樹脂の吸
着溶離クロマトグラフィーを行うとか、あるいは分子ふ
るいによるゲルクロマトグラフィーを行うとか、さらに
は疎水性クロマトグラフィーを行うことにより容易にア
ビジンが得られる。また、卵白よりリゾチームあるいは
コンアルブミンを採取した後の残液からこれらの副産物
として容易に分画することもできる。従って本発明に用
いられるアビジンとして、このようにして安価に製造し
たアビジンを使用することが好ましいが、本発明に使用
するアビジンの入手方法がこの方法に限定されるわけで
はない。The present invention will be described in detail below. Avidin is present in egg white and is a protein having a molecular weight of about 53,000 and an isoelectric point of 9.5. Methods for purifying avidin from egg white include precipitation with ammonium sulfate, adsorption on bentonite, and ion exchange cellulose. For example, egg white is subjected to ammonium sulfate fractionation to remove most of the proteins other than avidin, followed by adsorption and elution chromatography on a weakly acidic resin, or gel chromatography using a molecular sieve, and further hydrophobic chromatography. As a result, avidin can be easily obtained. It is also possible to easily fractionate these by-products from the residual liquid after collecting lysozyme or conalbumin from egg white. Therefore, as the avidin used in the present invention, it is preferable to use inexpensively produced avidin in this manner, but the method for obtaining avidin used in the present invention is not limited to this method.

【０００８】本発明に用いられる担体は、分子構造の一
部が修飾されたアビジンと結合し、固定相を形成し得る
ものであればよい。本発明の分離剤を用いた光学異性体
の分離は、主として液体クロマトグラフィーによって行
われるもので、担体としては例えばシリカゲル、ガラ
ス、セルロース、カーボンまたは合成ポリマー（例え
ば、ポリビニルアルコール）等を挙げることができる。
分子の一部が修飾されたアビジン（以下リガンドと呼
ぶ）が結合されている担体からなる固定相は、固定相を
形成するために通常行われている方法に従って形成する
ことができる。例えば、アビジンを担体に結合するに
は、例えばアミノプロピルシリカゲルを担体とし、Ｎ，
Ｎ−ジサクシニミジルカーボネートを架橋剤としてアビ
ジンを結合する方法、シリカゲルを担体とし、３−グリ
シドキシプロピルトリメトキシシランを架橋剤としてア
ビジンを結合する方法、セルロースを担体とし、ブロム
シアンで活性化してからこれにアビジンを結合する方
法、陽イオン交換合成ポリマーにアビジンを結合する方
法等が挙げられる。The carrier used in the present invention may be any one as long as it can bind to avidin whose molecular structure is partially modified to form a stationary phase. Separation of optical isomers using the separating agent of the present invention is mainly performed by liquid chromatography, and examples of the carrier include silica gel, glass, cellulose, carbon or synthetic polymers (for example, polyvinyl alcohol). it can.
The stationary phase composed of a carrier to which avidin having a part of the molecule modified (hereinafter referred to as a ligand) is bound can be formed according to a method generally used for forming a stationary phase. For example, to bind avidin to a carrier, for example, aminopropyl silica gel is used as a carrier, and N,
A method for binding avidin using N-disuccinimidyl carbonate as a cross-linking agent, silica gel as a carrier, a method for binding avidin with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane as a cross-linking agent, cellulose as a carrier, and activation with bromocyan. Then, a method of binding avidin thereto, a method of binding avidin to the cation-exchange synthetic polymer, and the like can be mentioned.

【０００９】また、分子の一部を修飾したアビジンが担
体に結合した固定相を得る方法には、あらかじめ分子の
一部を修飾しておいたアビジンを共有結合やイオン結合
などによって担体に結合する方法と、アビジンを結合さ
せておいた固定相に先に述べた方法による修飾を施して
目的とする固定相を得る方法がある。例えばアミノプロ
ピルシリカゲルやアミノ基が結合した合成ポリマーを担
体とし、グルタルアルデヒドやＮ，Ｎ−ジサクシニミジ
ルカーボネートを架橋剤としてリガンドを結合したり、
あるいはシリカゲルやガラス若しくはカーボンを担体と
して３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを架
橋剤としてリガンドを結合したり、あるいはセルロース
を担体とし、ブロムシアンで活性化してからこれらにリ
ガンドを結合したり、陰イオン交換合成ポリマーにリガ
ンドを結合したりする方法により製造できる。Further, in order to obtain a stationary phase in which avidin modified in a part of the molecule is bound to the carrier, avidin modified in advance in a part of the molecule is bound to the carrier by a covalent bond or an ionic bond. There are a method and a method in which the stationary phase to which avidin has been bound is modified by the method described above to obtain the desired stationary phase. For example, aminopropyl silica gel or a synthetic polymer having an amino group bonded is used as a carrier, and glutaraldehyde or N, N-disuccinimidyl carbonate is used as a crosslinking agent to bond a ligand,
Alternatively, silica gel, glass or carbon may be used as a carrier to bind a ligand with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane as a cross-linking agent, or cellulose may be used as a carrier and activated with bromocyan before binding with a ligand, or an anion. It can be produced by a method of attaching a ligand to an exchange synthetic polymer.

【００１０】一般に蛋白質分子を修飾する方法には、化
学的方法、酵素的方法、物理的方法等が挙げられる。即
ち、蛋白質分子中のアミノ基、イミダゾール基又はカル
ボキシル基にアルデヒド類、酸無水物又はアルコール類
を反応させると、それぞれ、シッフ塩基、Ｎ−置換イミ
ダゾール基又はエステルが生成して化学的修飾がなされ
る。又、酵素の持つ多彩な作用を用いれば、官能基の修
飾、分子の酸化や還元、分子の一部を除去するなどの反
応が緩和な条件で行い得る。例えば、アビジンの一部を
グルタル化したアビジンは次のようにして得ることがで
きる。アビジンおよびグルタルアルデヒドをpH6.８のり
ん酸塩緩衝液に入れ、３０℃で１５時間攪拌後、生成し
たグルタル化アビジン（非還元型）、あるいはさらに水
素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のりん酸塩緩衝液
中で、４℃で１２時間攪拌し還元後、生成したグルタル
化アビジン（還元型）を得ることができる。グルタル化
アビジンの精製方法は、特に限定されず、一般に用いら
れる方法によることができる。例えば、セファデックス
Ｇ２５カラムクロマトグラフィーを使用して、上記反応
液より未反応のグルタルアルデヒドおよび水素化ホウ素
ナトリウムを除去することができる。また、アビジンの
一部をジオール化したアビジンを得るには、例えば、ア
ビジンおよび２，３−エポキシプロパノールをpH8.０の
りん酸塩緩衝液中に加え、室温で２４時間攪拌後、精製
すればよい。Generally, the method for modifying a protein molecule includes a chemical method, an enzymatic method, a physical method and the like. That is, when an amino group, an imidazole group, or a carboxyl group in a protein molecule is reacted with an aldehyde, an acid anhydride, or an alcohol, a Schiff base, an N-substituted imidazole group, or an ester is formed, respectively, and chemically modified. It Further, by using various actions of enzymes, reactions such as modification of functional groups, oxidation and reduction of molecules, and removal of a part of molecules can be performed under mild conditions. For example, avidin obtained by glutarizing a part of avidin can be obtained as follows. Avidin and glutaraldehyde were added to a phosphate buffer of pH 6.8, and the mixture was stirred at 30 ° C for 15 hours, and then the produced glutarized avidin (non-reducing type) or sodium borohydride was used to adjust the pH to 6.8. The resulting glutarized avidin (reduced form) can be obtained after reduction by stirring in a phosphate buffer at 4 ° C. for 12 hours. The method for purifying glutarized avidin is not particularly limited, and may be a commonly used method. For example, Sephadex G25 column chromatography can be used to remove unreacted glutaraldehyde and sodium borohydride from the reaction solution. To obtain avidin in which a portion of avidin is diol, for example, avidin and 2,3-epoxypropanol are added to a phosphate buffer of pH 8.0, and the mixture is stirred at room temperature for 24 hours and purified. Good.

【００１１】また、アビジンの一部をアシル化したアビ
ジンを得るには、例えば、アビジンおよび対応する酸無
水物をpH8.５のほう酸塩緩衝液にいれ、２５℃で３０〜
６０分攪拌後、精製すればよい。グルタル化したアビジ
ンをアミノプロピルシリカゲルに結合するには、具体的
には次のようにすればよい。グルタル化したアビジンを
pH6.８の炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解する。別にア
ミノプロピルシリカゲルおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジ
ルカーボネートをpH6.８の炭酸水素ナトリウム緩衝液に
溶解懸濁させ、一晩攪拌後、分取水洗して活性化アミノ
プロピルシリカゲル懸濁液を得る。先に用意したグルタ
ル化アビジンの溶液を活性化アミノプロピルシリカゲル
懸濁液に加え、攪拌後水洗してシリカゲルにグルタル化
アビジンが架橋剤を介して結合した光学異性体分離剤を
得ることができる。To obtain avidin in which a portion of avidin is acylated, for example, avidin and the corresponding acid anhydride are added to a borate buffer solution having a pH of 8.5 at 25 ° C. for 30 to 30 ° C.
It may be purified after stirring for 60 minutes. To bind glutarized avidin to aminopropyl silica gel, specifically, the following may be performed. Glutarized avidin
It is dissolved in a sodium hydrogen carbonate buffer solution having a pH of 6.8. Separately, aminopropyl silica gel and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a sodium hydrogen carbonate buffer solution having a pH of 6.8, and the mixture is stirred overnight and washed with preparative water to obtain an activated aminopropyl silica gel suspension. .. The previously prepared solution of glutarized avidin is added to the activated aminopropyl silica gel suspension, and after stirring and washing with water, an optical isomer separating agent in which glutarized avidin is bound to silica gel via a crosslinking agent can be obtained.

【００１２】また、アビジンを結合させておいた固定相
上のアビジンに化学修飾を行うには次のようにすればよ
い。例えば、親水性合成ポリマーにペンタエチルヘキサ
ミン等のポリアミンを導入した担体とＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネートをpH6.８炭酸水素ナトリウム緩衝
液に溶解、懸濁させ一晩攪拌し、分取水洗して活性化合
成ポリマーの懸濁液を得る。別に、アビジンをpH6.８炭
酸水素ナトリウム緩衝液に溶解した溶液を用意し、前記
懸濁液に加えることにより、アビジンが結合したポリマ
ー充填剤を得る。この充填剤およびグルタルアルデヒド
をpH6.８のりん酸緩衝液に入れ、３０℃で１５時間攪拌
後、生成したグルタル化アビジン（非還元型）、あるい
はさらに水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のりん
酸塩緩衝液中で、４℃で１２時間攪拌し、還元後、生成
したグルタル化アビジン（還元型）がアミド結合および
架橋剤を介して合成ポリマーに結合した光学異性体分離
剤を得ることができる。The chemical modification of avidin on the stationary phase to which avidin has been bound may be carried out as follows. For example, a carrier prepared by introducing a polyamine such as pentaethylhexamine into a hydrophilic synthetic polymer and N, N-disuccinimidyl carbonate are dissolved and suspended in a pH 6.8 sodium hydrogen carbonate buffer solution, stirred and stirred overnight, and washed with preparative water. To obtain a suspension of activated synthetic polymer. Separately, a solution of avidin dissolved in a pH 6.8 sodium hydrogen carbonate buffer is prepared and added to the suspension to obtain a polymer filler having avidin bound thereto. This filler and glutaraldehyde were put in a phosphate buffer of pH 6.8 and stirred at 30 ° C for 15 hours, and then the glutarized avidin (non-reducing type) produced or sodium borohydride was used to adjust the pH to 6.8. After stirring for 12 hours at 4 ° C. in a phosphate buffer of 100 ° C., the resulting glutarized avidin (reduced form) is bound to a synthetic polymer through an amide bond and a cross-linking agent to obtain an optical isomer separation agent. be able to.

【００１３】このようにアビジンを化学修飾することに
より、光学異性体分離カラムとしてのカラムライフ（サ
ンプル注入回数）を大幅に伸ばすことができる。担体１
００重量部に対する修飾アビジンの結合割合は、８〜１
１重量部、好ましくは９〜１０重量部、一般に約１０重
量部が適当である。本発明の分離剤は前記したごとく、
担体に固定化されたアビジンの分子構造の一部を修飾し
た固定相、若しくは分子構造の一部を修飾したアビジン
を担体に結合した固定相からなることを特徴とする。従
って本発明の分離剤には当該固定相が必須の構成成分と
して含まれるが、同時に分離剤中の他の成分、例えばシ
リカゲル、ガラス、セルロース、カーボンやポリマー
等、修飾アビジンが結合していない担体が任意に選択さ
れて加えられることは自由であり、分離の向上のために
適宜行うことができる。By chemically modifying avidin in this manner, the column life (the number of times of sample injection) as an optical isomer separation column can be significantly extended. Carrier 1
The binding ratio of modified avidin to 00 parts by weight is 8 to 1
1 part by weight, preferably 9-10 parts by weight, generally about 10 parts by weight, is suitable. The separating agent of the present invention, as described above,
It is characterized by comprising a stationary phase in which a part of the molecular structure of avidin immobilized on a carrier is modified, or a stationary phase in which avidin modified in a part of the molecular structure is bound to the carrier. Therefore, the stationary phase is contained in the separating agent of the present invention as an essential constituent component, but at the same time, other components in the separating agent, for example, silica gel, glass, cellulose, carbon, polymer and the like, are carriers to which modified avidin is not bound. Can be arbitrarily selected and added, and can be appropriately performed to improve separation.

【００１４】本発明の分離剤を用いて分離することがで
きる光学異性体とは、分子内に不斉炭素原子を有するキ
ラル化合物を言い、多くの医薬品にその例を見ることが
できる。例えばイブプロフェン、ケトプロフェン、フル
ルビプロフェン、フェノプロフェン、ピンドロール、オ
クスプレノール等を挙げることができる。これらの化合
物においては互いに鏡像関係にある複数の光学異性体が
存在し、一体となってラセミ体を形成している。本発明
の分離剤はこれらラセミ体を対象として、これらを構成
する光学異性体を分離するのに特に有効である。本発明
の分離剤は主として液体クロマトグラフィーにおいて使
用される。従ってその使用方法は液体クロマトグラフィ
ーにおける通常の操作によって行えばよく、例えば本発
明の分離剤をカラムに充填し、光学異性体に係るセラミ
体をチャージし、次にりん酸緩衝液、エタノール水溶
液、イソプロパノール等の移動相を流通せしめ、保持時
間の差によって、所望の光学異性体を分離すればよい。The optical isomers which can be separated using the separating agent of the present invention refer to chiral compounds having an asymmetric carbon atom in the molecule, and examples thereof can be found in many pharmaceutical products. For example, ibuprofen, ketoprofen, flurbiprofen, fenoprofen, pindolol, oxprenol, etc. can be mentioned. In these compounds, a plurality of optical isomers having a mirror image relationship to each other exist, and they together form a racemate. The separating agent of the present invention is particularly effective in separating the optical isomers constituting these racemates. The separating agent of the present invention is mainly used in liquid chromatography. Therefore, the method of use may be carried out by a usual operation in liquid chromatography. For example, a column is filled with the separating agent of the present invention, a cerami body related to an optical isomer is charged, and then a phosphate buffer solution, an aqueous ethanol solution, The desired optical isomer may be separated by circulating a mobile phase such as isopropanol and the retention time difference.

【００１５】[0015]

【実施例】以下に記載する実施例によって本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。 比較例１（アビジン結合シリカゲル担体） アミノプロピルシリカゲル（信和化工（株）製：ＵＬＴ
ＲＯＮ ＮＨ₂ 、アミノプロピル基含量：８重量％）３
ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジルカーボネート２ｇを
0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）１００mlに
入れ、一夜攪拌し、ガラスフィルター上にとり、水洗し
て活性化アミノプロピルシリカゲルの懸濁液を調製し
た。別にアビジン２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝
液（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを前
記懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィ
ルター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得ら
れた分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分離
用カラムとした。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. Comparative Example 1 (Avidin-bonded silica gel carrier) Aminopropyl silica gel (Shinwa Kako Co., Ltd .: ULT)
RON NH ₂ , aminopropyl group content: 8% by weight) 3
and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate
A suspension of activated aminopropyl silica gel was prepared by placing the mixture in 100 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirring overnight, loading onto a glass filter and washing with water. Separately, prepare a solution of 2 g of avidin dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), add it to the above suspension, stir at 30 ° C. for 15 hours, then place on a glass filter and wash with water. The separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.

【００１６】実施例１（グルタル化アビジン結合ポリマ
ー担体） グルタルアルデヒド0.１ｇおよびアビジン２ｇを0.６Ｍ
りん酸塩緩衝液（pH6.８）に入れ、３０℃で１５時間攪
拌し、グルタル化アビジンを合成した。セファデックス
Ｇ２５カラムクロマトグラフィーにより未反応のグルタ
ルアルデヒドを除きグルタル化アビジン（非還元型）を
単離した。グルタル化アビジン（非還元型）の一部を、
水素化ほう素ナトリウムを用いてpH6.８のりん酸緩衝液
中で、４℃で１２時間攪拌し還元し、グルタル化アビジ
ン（還元型）を得た。次に親水性ポリマー（ポリビニル
アルコール共重合体）ゲルにポリアミン（ペンタエチル
ヘキサミン）を導入したカラム充填剤〔アサヒパックＮ
Ｈ２Ｐ−５０（旭化成製）〕２ｇおよびＮ，Ｎ−ジサク
シニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化合成ポリマーゲル
の懸濁液を調製した。別に非還元型あるいは還元型グル
タル化アビジン２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH6.８）３０mlに溶解した溶液を用意し、それを前記
懸濁液に加え、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィル
ター上にとり、水洗し、本発明の分離剤を得た。得られ
た分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分離用
カラムとした。Example 1 (Glutarized avidin-bonded polymer carrier) 0.1 g of glutaraldehyde and 2 g of avidin were added to 0.6M.
It was placed in a phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours to synthesize glutaric avidin. Unreacted glutaraldehyde was removed by Sephadex G25 column chromatography to isolate glutarized avidin (non-reduced form). A part of glutarized avidin (non-reduced type)
Glutarated avidin (reduced form) was obtained using sodium borohydride in a phosphate buffer of pH 6.8 with stirring at 4 ° C. for 12 hours for reduction. Next, a column packing material obtained by introducing polyamine (pentaethylhexamine) into a hydrophilic polymer (polyvinyl alcohol copolymer) gel [Asahi Pack N
2 g of H2P-50 (manufactured by Asahi Kasei) and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were added to 100 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of chemically synthesized polymer gel was prepared. Separately, prepare a solution prepared by dissolving 2 g of non-reduced or reduced glutarized avidin in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), add it to the above suspension, and stir at 30 ° C. for 15 hours. It was then placed on a glass filter and washed with water to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.

【００１７】実施例２（グルタル化アビジン結合ガラス
担体） アミノプロピル化ガラス（信和化工（株）製 アミノプ
ロピル基含量：６重量％）３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピル化
ガラスの懸濁液を調製した。別にアビジン２ｇを0.１Ｍ
炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０mlに溶解した
溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、アビジン結合
ガラス充填剤を得た。この充填剤２ｇおよびグルタルア
ルデヒド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）３
０mlに入れ、３０℃で１５時間攪拌し本発明の分離剤
（非還元型）を得た。さらに0.２ｇの水素化ほう素ナト
リウムを加え４℃で１２時間攪拌、還元し本発明の分離
剤（還元型）を得た。得られた分離剤をスチールカラム
に充填し、光学異性体分離用カラムとした。Example 2 (Glutarized avidin-bonded glass carrier) 3 g of aminopropylated glass (manufactured by Shinwa Kako Co., Ltd., aminopropyl group content: 6% by weight) and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were added to 0.1 M. A suspension of activated aminopropylated glass was prepared by putting it in 100 ml of a sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirring it overnight, placing it on a glass filter and washing it with water. Avidin 2g 0.1M separately
A solution dissolved in 30 ml of sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8) was prepared and added to the above suspension to obtain an avidin-bonded glass filler. 2 g of this filler and 0.1 g of glutaraldehyde were added to 0.06 M phosphate buffer (pH 6.8) 3
It was put in 0 ml and stirred at 30 ° C. for 15 hours to obtain the separating agent (non-reducing type) of the present invention. Further, 0.2 g of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours and reduced to obtain a separating agent (reduced type) of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.

【００１８】実施例３（グルタル化アビジン結合シリカ
ゲル担体） 比較例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてア
ビジン結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤２ｇお
よびグルタルアルデヒド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝
液（pH6.８）３０mlに入れ、３０℃で１５時間攪拌し、
本発明の分離剤（非還元型）を得た。さらに０．２ｇの
水素化ほう素ナトリウムを加え、４℃で１２時間攪拌し
て還元し、本発明の分離剤（還元型）を得た。得られた
分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体分離用カ
ラムとした。 実施例４（グルタル化アビジン結合シリカゲル担体） アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびグルタルアルデヒ
ド0.１ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液（pH6.８）１００ml
に入れ、３０℃で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上
にとり水洗した。このグルタル化シリカゲルにアビジン
２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH6.８）３０mlに溶
解し反応させるとともに、アビジンのグルタル化も行わ
せしめ、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチ
ールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例５（ジオール化アビジン結合シリカゲル担体） 比較例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてア
ビジン結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤を五酸
化りんデシケーター中にて乾燥した後、0.０６Ｍりん酸
塩緩衝液（pH8.０）に懸濁し、２，３−エポキシプロパ
ノール0.５mlを加えて室温にて２４時間攪拌してジオー
ル化し、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチ
ールカラムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。 実施例６（ジオール化アビジン結合シリカゲル担体） アビジン２ｇを0.０６Ｍりん酸塩緩衝液に懸濁し、２，
３−エポキシプロパノール0.５mlを加えて室温にて２４
時間攪拌してジオール化アビジンを得た。次に、アミノ
プロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシニミジ
ルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラスフィル
ター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシリカゲ
ルの懸濁液を調製した。別にジオール化アビジン２ｇを
0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０mlに溶
解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、３０℃
で１５時間攪拌後、ガラスフィルター上にとり、水洗
し、本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチール
カラムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。Example 3 (Glutarized avidin-bonded silica gel carrier) In the same manner as in Comparative Example 1, aminopropyl silica gel was used to obtain an avidin-bonded silica gel filler. 2 g of this filler and 0.1 g of glutaraldehyde were added to 30 ml of 0.06M phosphate buffer (pH 6.8) and stirred at 30 ° C. for 15 hours,
The separating agent (non-reducing type) of the present invention was obtained. Further, 0.2 g of sodium borohydride was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours for reduction to obtain the separating agent (reduced type) of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 4 (Glutarized avidin-bonded silica gel carrier) 3 g of aminopropyl silica gel and 0.1 g of glutaraldehyde were added to 100 ml of 0.06M phosphate buffer (pH 6.8).
After stirring for 15 hours at 30 ° C., it was placed on a glass filter and washed with water. To this glutarized silica gel, 2 g of avidin was dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogencarbonate (pH 6.8) and reacted, and avidin was glutarized to obtain a separating agent of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 5 (diolated avidin-bonded silica gel carrier) In the same manner as in Comparative Example 1, aminopropyl silica gel was used to obtain an avidin-bonded silica gel filler. The filler was dried in a phosphorus pentoxide desiccator, suspended in 0.06M phosphate buffer (pH 8.0), 0.5 ml of 2,3-epoxypropanol was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. It was converted to a diol to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 6 (Silica gel carrier bound with diolated avidin) 2 g of avidin was suspended in 0.06 M phosphate buffer solution to give 2,
0.5 ml of 3-epoxy propanol was added to the mixture at room temperature for 24 hours.
After stirring for a period of time, diolated avidin was obtained. Next, 3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were added to 100 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated. A suspension of aminopropyl silica gel was prepared. Separately, 2 g of diolated avidin
Prepare a solution dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), add it to the suspension, and add it to 30 ° C.
After stirring for 15 hours, it was taken on a glass filter and washed with water to obtain the separating agent of the present invention. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.

【００１９】実施例７（アセチル化アビジン結合シリカ
ゲル担体） 比較例１と同様にアミノプロピルシリカゲルを用いてア
ビジン結合シリカゲル充填剤を得た。この充填剤1.８ｇ
および１mlのジオキサンに0.２２５mlの無水酢酸を溶解
した溶液を0.１Ｍほう酸塩緩衝液（pH8.５）５０mlに入
れ、２５℃で３０分攪拌してアセチル化した後、ガラス
フィルター上にとり、水洗して本発明の分離剤を得た。
得られた分離剤をスチールカラムに充填し、光学異性体
分離用カラムとした。 実施例８（アセチル化アビジン結合シリカゲル担体） アビジン２ｇを、１mlのジオキサンに0.２２５mlの無水
酢酸を溶解した溶液とともに0.１Ｍのほう酸塩緩衝液
（pH8.５）に入れ、アセチル化アビジンを得た。次に、
アミノプロピルシリカゲル３ｇおよびＮ，Ｎ−ジサクシ
ニミジルカーボネート２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH6.８）１００mlに入れ、一夜攪拌し、ガラス
フィルター上にとり、水洗して活性化アミノプロピルシ
リカゲルの懸濁液を調製した。別にアセチル化アビジン
２ｇを0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.８）３０
mlに溶解した溶液を用意し、それを前記懸濁液に加え、
本発明の分離剤を得た。得られた分離剤をスチールカラ
ムに充填し、光学異性体分離用カラムとした。Example 7 (Acetylated avidin-bonded silica gel carrier) In the same manner as in Comparative Example 1, aminopropyl silica gel was used to obtain an avidin-bonded silica gel filler. 1.8 g of this filler
A solution of 0.225 ml of acetic anhydride in 1 ml of dioxane was added to 50 ml of 0.1M borate buffer (pH 8.5), and the mixture was stirred at 25 ° C for 30 minutes for acetylation, and then placed on a glass filter. It was washed with water to obtain the separating agent of the present invention.
The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers. Example 8 (Acetylated avidin-bonded silica gel carrier) 2 g of avidin was put into a 0.1 M borate buffer solution (pH 8.5) together with a solution of 0.225 ml of acetic anhydride dissolved in 1 ml of dioxane, and acetylated avidin was added. Obtained. next,
3 g of aminopropyl silica gel and 2 g of N, N-disuccinimidyl carbonate were put into 100 ml of 0.1M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 6.8), stirred overnight, taken on a glass filter, washed with water and activated aminopropyl silica gel. A suspension of was prepared. Separately, add 2 g of acetylated avidin to a 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer solution (pH 6.8) 30
Prepare a solution dissolved in ml, add it to the suspension,
The separating agent of the present invention was obtained. The obtained separating agent was filled in a steel column to give a column for separating optical isomers.

【００２０】以下の実験例によって本発明の効果を示
す。 実験例１ 実施例２で調製した（非還元型）光学異性体分離用カラ
ム（グルタル化アビジン結合ガラス担体）を用いてフェ
ノプロフェンのエナンチオマーにおける分離を試みた。
なお、移動相は２０ｍＭりん酸塩緩衝液（KH₂PO₄ /K₂HP
O₄)(pH6.5 ）／アセトニトリル＝１００／３（Ｖ／Ｖ）
を使用し、流速を1.0 ml／min とした。結果を図１に示
す。図１より本発明分離剤によって各光学異性体が分離
されたことが判明した。The effects of the present invention will be shown by the following experimental examples. Experimental Example 1 Separation in the enantiomers of fenoprofen was tried using the column for separating (non-reducing) optical isomers (glutarized avidin-bonded glass carrier) prepared in Example 2.
The mobile phase was 20 mM phosphate buffer (KH ₂ PO ₄ / K ₂ HP).
O ₄ ) (pH6.5) / acetonitrile = 100/3 (V / V)
Was used and the flow rate was 1.0 ml / min. The results are shown in Figure 1. From FIG. 1, it was found that the optical isomers were separated by the separating agent of the present invention.

【００２１】実験例２ 実施例２で調製した（非還元型）光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例１と同様にしてケトプロフェンのラセ
ミ体における分離を試みた。なお、移動相は２０ｍＭり
ん酸塩緩衝液（KH₂PO₄ /K₂HPO₄)(pH6.5 ）／エタノール
＝１００／６（Ｖ／Ｖ）を使用し、流速を1.0 ml／min
とした。結果を図２に示す。図２より本発明分離剤によ
って各光学異性体が分離されたことが判明した。 実験例３ 比較例１及び実施例４で調製した光学異性体分離用カラ
ムを用いて実験例２と同様にしてケトプロフェンのラセ
ミ体における分離を繰り返し試みた。比較例１で調製し
たアビジン結合シリカゲル担体カラムで分析した場合、
４０回の注入でカラムの劣化が始まり、分離が充分に行
われなくなったのに対して、実施例４で調製したグルタ
ル化アビジン結合シリカゲル担体カラムで分析した場合
には、３００回の注入でもカラムの劣化が起こらなかっ
た。Experimental Example 2 An attempt was made to separate a ketoprofen in a racemic form in the same manner as in Experimental Example 1 by using the (non-reduced) optical isomer separation column prepared in Example 2. The mobile phase was 20 mM phosphate buffer (KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ ) (pH6.5) / ethanol = 100/6 (V / V), and the flow rate was 1.0 ml / min.
And The results are shown in Figure 2. From FIG. 2, it was found that the optical isomers were separated by the separating agent of the present invention. Experimental Example 3 Using the columns for separating optical isomers prepared in Comparative Example 1 and Example 4, separation of ketoprofen in racemic form was repeatedly attempted in the same manner as in Experimental Example 2. When analyzed by the avidin-bonded silica gel carrier column prepared in Comparative Example 1,
The column started to deteriorate after 40 injections and the separation was not sufficiently performed, whereas when analyzed with the glutarized avidin-bonded silica gel carrier column prepared in Example 4, the column was separated even after 300 injections. Deterioration did not occur.

【００２２】[0022]

【発明の効果】本発明の光学異性体用分離剤は、光学異
性体を効率よく分離することができ、また安価であり、
かつ有機溶媒による変性に対して安定である。また、酸
性の光学異性体を効率よく分離することができる。The separating agent for optical isomers of the present invention is capable of efficiently separating optical isomers and is inexpensive.
It is also stable against denaturation by organic solvents. Moreover, acidic optical isomers can be efficiently separated.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例２で調製した（非還元型）光学異性体分
離用カラムを用いてフェノプロフェンのエナンチオマー
における分離を試みた結果を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the results of attempting separation in the enantiomers of fenoprofen using the column for separating (non-reducing) optical isomers prepared in Example 2.

【図２】実施例２で調製した（非還元型）光学異性体分
離用カラムを用いてケトプロフェンのラセミ体における
分離を試みた結果を示す図面である。FIG. 2 is a drawing showing the results of an attempt to separate a racemic form of ketoprofen using the column for separating (non-reducing) optical isomers prepared in Example 2.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 分子構造の一部を修飾したアビジンが担
体に結合されている固定相からなることを特徴とする光
学異性体用分離剤。1. A separating agent for optical isomers, which comprises a stationary phase in which avidin having a partly modified molecular structure is bound to a carrier. 【請求項２】 アビジン分子構造の一部の修飾が、グル
タル化若しくはその還元化、ジオール化、またはアシル
化である請求項１記載の光学異性体用分離剤。2. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the partial modification of the avidin molecular structure is glutarization or reduction thereof, diolation, or acylation. 【請求項３】 担体がシリカゲル、ガラス、セルロー
ス、カーボンまたは合成ポリマーである請求項１または
２記載の光学異性体用分離剤。3. The separating agent for optical isomers according to claim 1, wherein the carrier is silica gel, glass, cellulose, carbon or a synthetic polymer.