CN106404683A - 一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷脂的检测技术领域，特别涉及一种磷脂检测试剂。本发明在试剂R1和R2中分别使用了柠檬酸钠缓冲液和Bis-Tris Propane（1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷）缓冲液。在试剂中使用的Bis-Tris Propane缓冲液是生物缓冲液，对试剂中所使用的过氧化物酶有较好的保护作用，并且不会对反应体系产生负面影响。试剂R1中包含磷脂酶D、DAOS、Triton X-305 solution、Emulgen 707、还原保护剂、螯合保护剂、防腐剂；所述试剂R2包含：缓冲液、4-氨基安替吡啉、过氧化物酶、胆碱氧化酶、防腐剂。本磷脂的检测试剂具有稳定性好、价格低廉的优点，可广泛推广用于磷脂检测领域。

Description

一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法

技术领域

本发明涉及磷脂检测领域，具体涉及一种利用氧化酶法来检测磷脂的检测试剂和检测方法。

背景技术

磷脂（Phospholipid），也称磷脂类、磷脂质，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。磷脂是组成生物膜的主要成分，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，分别由甘油和鞘氨醇构成。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水（亲油）的长烃基链。由于此原因，磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，常与蛋白质、糖脂、胆固醇等其它分子共同构成脂双分子层，即细胞膜的结构。

血清磷脂主要包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂和脑磷脂等四部分。临床工作中一般测定血清总磷脂有化学法和酶法测定两类方法，如需进一步检查血清磷脂的组成则需要借助薄层层析、气相层析或高效液相层析等各项技术。升高原因：梗阻性黄疸、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、Ziere综合征、糖原累积病、肥胖症、糖尿病、急慢性胰腺炎、肾病综合征、甲状腺功能减低症、脂肪肝、脂肪营养不良、妊娠、口服避孕药等。降低原因：重症肝炎、失代偿肝硬化、丹吉尔(Tangier)病、甲状腺功能亢进症、吸收不良综合征、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、Wolman病、Leye综合征、多发性硬化症等。

目前检测磷脂的方法较多，主要检测方法有色谱分析方法、质谱检测方法、化学法、酶法等方法。其中色谱和质谱检测方法最为准确，但是这两种方法对仪器和操作人员要求较高，使用成本太贵，不适合大面积的推广。化学成本法相对较低，但是这种方法准确度不高，容易受到干扰。酶法则在市面上较为常见，这种方法主要是借助于TRINDER反应进行，利用磷脂酶和胆碱氧化酶生成H2O2，借助色原进行成色反应，本方法应用较广，价格便宜，操作方便，适合全自动生化分析仪器的配套使用，但是本法因为涉及到酶类较多，且涉及到TRINDER反应本身固有的抗干扰能力不强等问题，市面上现有的磷脂检测试剂多为不稳定和抗干扰能力差等问题，影响着正常的使用。本发明为解决这几个问题，研究发明了一种抗干扰性强、稳定性好的氧化酶法磷脂检测试剂及其使用方法。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种稳定性强的利用氧化酶法检测血清磷脂的检测试剂。同时还提供了一种利用本发明的检测试剂检测血清磷脂的检测方法。

磷脂在磷脂酶D的作用下水解生成胆碱和磷脂酸，胆碱被胆碱氧化酶氧化生成过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林、DAOS反应生成蓝色染料。此染料在600nm有最大吸收峰，吸收强度与血清中磷脂含量成正比。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，包括试剂R1和试剂R2。其特征在于：

所述试剂R1包含，生物缓冲液，其中溶质在试剂R1中的浓度为100-150mmol/L：

磷脂酶D 0.5KU/L-2KU/L

DAOS 1.2mmol/L-3.2 mmol/L

Triton X-305 solution 1ml/L-3ml/L

Emulgen 707 0.5ml/L-2ml/L

还原保护剂 0.5mmol/L-2mmol/L

螯合保护剂 1mmol/L-5mmol/L

防腐剂 1g/L-5g/L

所述试剂R2包含，缓冲液，其中溶质在试剂R2中的浓度为100-200mmol/L：

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L-1.5 mmol/L

过氧化物酶 10KU/L-15 KU/L

胆碱氧化酶 8KU/L-12KU/l

防腐剂 1g/L-5g/L。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述试剂R1中还包括：抗坏血酸氧化酶1-5KU/L。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述试剂R2中还包括：FAD2-5 mg/L和蔗糖 5g/L-10g/L。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述试剂R1中缓冲液为柠檬酸缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L的，在25℃时，缓冲液的PH值为6.0。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述试剂R2中缓冲液为Bis-Tris Propane生物缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L，在25℃时，缓冲液的PH为7.1。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述防腐剂为纳他霉素。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述R1试剂中螯合保护剂为HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸)。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述R1试剂中还原保护剂为DTT(二硫苏糖醇)。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）量取试剂R1和试剂R2；

（2）将待测血清与试剂R1混合，测得波长为600nm时的吸光度A1；

（3）将试剂R2加入步骤（2）的混合溶液内，3-8min后，测得波长为600nm时的吸光度A2。

本发明一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法，其特征在于，步骤（3）中的反应时间为5min。试剂R1和试剂R2的制备方法为在将各原料量取好，加入到容器中，混合均匀即可。

本发明在试剂R1和R2中分别使用了柠檬酸钠缓冲液和Bis-Tris Propane（1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷）缓冲液。在试剂中使用的Bis-Tris Propane（1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷）缓冲液是生物缓冲液，对试剂中所使用的过氧化物酶有较好的保护作用，并且不会对反应体系产生负面影响。在试剂R1中加入了Triton X-305 solution和Emulgen 707两种表面活性剂，这两种表面活性剂能有较好的提高试剂的乳化作用，并且对磷脂酶D这种重要的工具酶有非常强的保护作用，同时有较好的增效作用。为了增强R2试剂中关键酶胆碱氧化酶的稳定性，特在R2试剂中加入了蔗糖和酶保护剂FAD，大大提高了酶的稳定性。

本发明还在试剂中加入了抗坏血酸氧化酶和螯合剂HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸)，能够有效的去除抗坏血酸和重金属离子的干扰，且适量的螯合剂HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸)与特异性保护工具酶磷脂酶D，DTT（二硫苏糖醇）的加入则可以防止空气对酶的氧化。

本磷脂的检测试剂具有稳定性好、价格低廉的优点，可广泛在磷脂检测领域进行推广。

本磷脂的检测方法，其原理是，A2与A1的差值，与标准液的使用同样方法测得的数值的差值之比乘上标准液的PLIP的浓度，就是待测血清的浓度，具有速度快、稳定性强等优点。

附图说明：

图1为配方1、配方2和配方3的稳定性趋势图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

（1）配方1（一种现有氧化酶法的磷脂检测试剂）：

R1的组分：

柠檬酸缓冲液（PH7.2） 100mmol/L

磷脂酶D 0.46U/mL

DAOS 1.2mmol/L

抗坏血酸酶 0.6U/mL

R2的组分：

柠檬酸缓冲液（PH7.2） 100mmol/L

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L

过氧化物酶 17U/mL

胆碱氧化酶 7.2U/mL。

（2）配方2（一种优化稳定的氧化酶法磷脂检测试剂）：

R1的组分：

柠檬酸缓冲液 100mmol/L

磷脂酶D 0.5KU/L

DAOS 1.2mmol/L

Triton X-305 solution 1ml/L

Emulgen 707 0.5ml/L

DTT（二硫苏糖醇） 0.5mmol/L

HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸) 1mmol/L

抗坏血酸氧化酶 1KU/L

防腐剂 （纳他霉素） 1g/L

R2的组分：

Bis-Tris Propane生物缓冲液 200mmol/L

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L

过氧化物酶 10KU/L

胆碱氧化酶 8KU/L

FAD 2mg/L

蔗糖 5g/L

防腐剂（纳他霉素） 1g/L。

（3）配方3（一种关键原材料增加后的稳定的氧化酶法的磷脂检测试剂）：

R1的组分：

柠檬酸缓冲液 200mmol/L

磷脂酶D 2KU/L

DAOS 3.2mmol/L

Triton X-305 solution 3ml/L

Emulgen 707 2ml/L

DTT（二硫苏糖醇） 2mmol/L

HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸) 5mmol/L

抗坏血酸氧化酶 5KU/L

防腐剂 （纳他霉素） 5g/L

R2的组分：

Bis-Tris Propane生物缓冲液 200mmol/L

4-氨基安替吡啉 1.5mmol/L

过氧化物酶 15KU/L

胆碱氧化酶 12KU/L

FAD 5mg/L

蔗糖 10g/L

防腐剂（纳他霉素） 5g/L。

（4）检测方法：在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，本检测试验采用日立7180全自动分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为600nm，利用速率法进行测定。分别将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作步骤如表1。

表1

计算方法：磷脂含量（U/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。

（5）干扰性试验：取新鲜混合血清，分成3等份，将每份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求，然后分别用配方1、配方2和配方3的试剂，同时测定对比血清中磷脂的含量。加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2，相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－无干扰物质的样本的测定均值)/无干扰物质的测定均值×100%。

由表2可以看出，抗坏血酸、胆红素、血红蛋白和甘油三酯对配方2和配方3的测试结果没有明显干扰，而对配方1的影响较大，说明本检测试剂具有较强的抗干扰能力。

表2

。

（6）试剂的稳定性试验：

将配方1、配方2和配方3中的试剂，均匀分装13组。每组的试剂量：R1为20mL，R2为5mL。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测磷脂质控品（靶值为200mg/dL），检测结果如图1所示，配方2和配方3相差不大，试剂在2-8℃储存条件下比配方1中的磷脂测定试剂盒更加稳定。

Claims (10)

1.一种磷脂的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和R2的组成如下：

1）试剂R1的组分为：溶质在试剂R1中的浓度为100-150mmol/L：

磷脂酶D 0.5KU/L-2KU/L

DAOS 1.2mmol/L-3.2 mmol/L

Triton X-305 solution 1ml/L-3ml/L

Emulgen 707 0.5ml/L-2ml/L

还原保护剂 0.5mmol/L-2mmol/L

螯合保护剂 1mmol/L-5mmol/L

防腐剂 1g/L-5g/L

2）试剂R2的组分为：溶质在试剂R2中的浓度为100-200mmol/L

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L-1.5 mmol/L

过氧化物酶 10KU/L-15 KU/L

胆碱氧化酶 8KU/L-12KU/l

防腐剂 1g/L-5g/L。

2.根据权利要求1所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中还包括：抗坏血酸氧化酶1-5KU/L。

3.根据权利要求1所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中还包括：FAD2-5 mg/L和蔗糖 5g/L-10g/L。

4.根据权利要求1-3任一所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中缓冲液为柠檬酸缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L的，在25℃时，缓冲液的PH值为6.0。

5.根据权利要求4所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中缓冲液为Bis-Tris Propane生物缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L，在25℃时，缓冲液的PH为7.1。

6.根据权利要求5所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述防腐剂为纳他霉素。

7.根据权利要求6所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述R1试剂中螯合保护剂为HEDTA (羟乙基乙二胺三乙酸)。

8.根据权利要求7所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述R1试剂中还原保护剂为DTT(二硫苏糖醇)。

9.根据权利要求6所述的磷脂的检测试剂，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。

10.一种权利要求7所述的磷脂的检测试剂用于检测磷脂的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）量取试剂R1和试剂R2；

（2）将待测血清与试剂R1混合，测得波长为600nm时的吸光度A1；

（3）将试剂R2加入步骤（2）的混合溶液内，3-8min后，测得波长为600nm时的吸光度A2。