JPS60180600A - 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＮＡＤ　（Ｐ）ＨＣ還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ホスフェート）〕の定量方法及び
定量用組成物に関する。

従来ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは　■ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの紫外部
における吸収を直接測定する方法　■ＮΔＤ（Ｐ）Ｈを
ダイアホラーゼを介して螢光物質に導き、その螢光を測
定する方法　■ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈをダイアホラーゼを介
してテトラゾリウム塩からホルマザンに導き、これを比
色定置する方法が知られている。

これらの方法には、以下のような短所がある。

即ち、■については、感度が低く、臨床検査に応用した
場合、紫外部での測定であるため、試料中の生体成分の
影響を受けやすい。■については、螢光光度計が必要で
ある。■については、微量成分の定量に際して感度が低
く、生成するホルマザンが水に難溶で、器具等に沈着し
、落ちにくく、テトラゾリウム塩、ホルマザンともに光
に不安定なものが多く、試薬保存面および測定時に注意
を要する。

より精度よ＜ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量する方法の開発が
望まれており、この目的のため検討の結果後述の一般式
（１）に示す化合物とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとを反応させて
生成する色素は極大吸収波長が６００ｎｍ前後にあり、
試料中特に生体成分中の５成分の影響を受けにくいこと
、可視部における測定が可能であること、感度が優れて
おり、試料が少量で定量できること、水溶性であるため
器具への沈着が殆どないこと等の優れた性質を有するこ
とが見出された。

本発明によればＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは■ダイアホラーゼも
しくは電子キャリヤー及び■ペルオキシダーゼもしくは
チオールオキシドリダクターゼの存在下下記一般式（Ｉ
）で表される化合物〔以下、化合物（Ｉ）という〕と反
応させて生成する色素を定量することにより定量される
。

一般式（１） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ，、Ｒ，
、Ｒ３は同一もしくは異なってよく、下記一般式（ｎ）
　、　、（ＩＩＩ）又は（Ｎ）で表される基を示す。

Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミノ。

アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリール。

置換アリール、アシル、ハロゲン原子、ニトロ。

スルホ、カルボキシル、アルコキシを示す。ｎは１．２
又は３を示し、Ｒ＋　、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つの
Ｚはヒドロキシル、アミノ又は置換アミノである。又、
Ｚｎにおける各Ｚは同一もしくは異なってもよい。

上記各定義においてアルキルは炭素数１〜５のアルキル
を包含し、メチル、エチル、フロビル。

ブチル、ペンチル等を示し、アルケニルは炭素数２〜５
の基を包含し、ビニル、プロピレン、ブチレン等が例示
される。アルコキシは炭素数１〜４の基を包含し、メト
キシ、エトキシ、プロポキシ。

ブトキシ等が例示される。

アリールとしては、フェニル、ナフチルが例示される。

アシルは炭素数２〜５のアシルを包含し、アセチル、プ
ロピオニル、ブチリル等が例示される。

ハロゲンは塩素原子、臭素原子、フッ素原子を包含する
。

置換アミノ、置換アルキル、置換アリールにおける置換
基としては、アルキル、アルケニル、アリール、アルコ
キシ、ヒドロキシル、カルボキシル、スルホ、スルホニ
ル、ハロゲン原子、アミノ。

アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニル、
アミノアルキル、アシル、ニトロ等が例示される。

該置換基中のアルキル、アルケニル、アリール。

アルコキシ、ハロゲン、アシル等は前記と同義を有する
。

本発明を実施するに際しては一般に緩衝液例えハクッド
バッファー、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酢
酸バッファー、トリスバッファー等にダイアホラーゼ又
は電子キャリヤー例えばフェナジンメトサルフェート（
ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（
ＭＰＭＳ）。

メルトラブル−等及びパーオキシダーゼ又はチオールオ
キシドリダクターゼ及び化合物（１）を加えて試薬液と
する。

試料に試薬液を加え３０〜５０℃の酵素が失活しない温
度で反応させ、生成した色素によって着色した反応液の
吸収を色素の極大吸収波長で試薬ブランクを対照として
測定し、あらかじめ既知量についてのテストからめた検
量線から試料中のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量することがで
きる。

本発明方法は後述の如く反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
生成する反応系に係る反応物質あるいは酵素活性を定量
する方法に適用できる。定量されるべき因子が化合物で
ある場合には一般に上記吸収測定に際して反応を約５〜
１０分行わせた後反応液の吸収を比色によって測定する
ことによって目的因子を定量できる。因子が酵素活性で
ある場合には一般に反応開始後の適当な時間における色
素生成速度を反応液の吸光度の変化からめることによっ
て該活性が定量できる。

緩衝液は１０ｍＭ〜ＩＭの濃度で用いられる。

ペルオキシダーゼ、チオールオキシドリダクターゼ、ダ
イアホラーゼは１〜５０００／ｍｌで電子キャリヤーは
０．０００１〜０．０１■／ｍｌで用いられる。化合物
（Ｉ）は反応するＮＡＤ　（Ｐ’）Ｈと等モル以上、通
常０．００１〜１　ｍｇ／ｍ＋で用いられる。

反応に際してＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは通常試料中の濃度が０
．００１〜１ｍｇ／ｍｌとなる様に試薬液もしくは蒸留
水で調整される。

ＮＡＤ（Ｐ’）Ｈを生成する反応系で本発明が適用され
る場合には、反応に関与する基質のような反応物質、酵
素、ＮＡＤ等は、測定すべき対象であるか否かによって
用いられる量が異なる場合が多いが、一般にそれぞれ０
．０００１〜１００　ｍｇ／ｍｌ。

１０−１０００　Ｕ／ｍｌ　、　０．０００１−１００
　ｍｇ／ｍｌで用いられる。

又、必要に応じてＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００等の界面活
性剤が用いられる。

ダイヤホラーゼ以外の電子キャリヤーが用いられる場合
、電子キャリヤーのダイヤホラーゼに対する相対活性は
下記のとおりであるから、これを指標として用いれば個
々に検量線をめることな〈実施できる。

（測定方法） １００ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）にペル
オキシダーゼ１０１／’ｍｌ、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−
１０００，１％、化合物Ｎ０４１を０．１ｍｇ／ｍｌ、
　ＮＡＤＨ５０ｍＭ／１を溶解し、試薬液とする。

３７℃に保った一定量の試薬液に対し、■ダイアホラー
ゼ５１／ｍｌ　■ＰＭＳ０．００１ｍｇ／ｍｌ■ＭＰＭ
Ｓ０．００１ｍｇ／＋ｎｌ　■メルトラブルー０、０’
０１　ｍｇ／ｍｌ　をこの濃度となるようにそれぞれ溶
解し、正確な一定時間内の吸光度変化量を６３３ｎｍに
て測定する。この吸光度変化量から、ダイアホラーゼを
１００とした時の相対活性を算出する。

本発明で用いられる化合物（１’）の具体例とその極大
吸収波長（λｍａｘ　）　、感度、水への溶解性が第１
〜４表に示される。

表中の略号は下記基を示す。又第１〜３表において○内
は位置を示し、基の表示のない位置はいずれも水素を示
す。

感度の測定は次の方法により行われた。

ＮＡＤＨ液： ０、　Ｉ　Ｍ　Ｆリス−ＨＣ１緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）
にＮＡＤＨを加えて０．５ｍＭ／ｊ！の溶液とする。

試薬液： Ｇｏｏｄ緩衝液にＩＯＵ／ｍｌペルオキシダーゼ。

５Ｕ／ｍｌダイアホラーゼ、　０．１　ｍｇ／ｍｌ　）
リドンＸ−１００及び０．１　ｍｇ／ｍｌ化合物（Ｉ）
（又は０、０１　ｍｇ　／ｍｌのニトロテトラゾリウム
ブルー）を含有する溶液を調製する。

５０μｌのＮ　Ａ　Ｄ　ｌ（液に３ｍｌの試薬液を加え
て反応させλｍａｘにおけるＯＤ値を測定し、ＮＴを用
いた場合を１００としたときの相対値を示す。

溶解性は２０℃の蒸留水に対する溶解度が０．０５ｍｇ
／ｍ１以下をＡ、　０．２　ｍｇ／ｍ１以上をＡＡとし
て表される。

ＭニーＣＨ＋　ＥニーＣ，Ｈ３Ｐｈ：べ■Ａ７：−Ｎ（
Ｃ１１２？）２　ＡｌｌニーＮＨＣ４１１゜Ａｓｈ　−
ＮＨ＜シ）ＤＣ，Ｈ５八、。：　−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）ＣＩ
Ｉ２ＣＨ２ＳＯ，Ｈ＾１ｓ：ＮＨべ○：）−Ｃ１ｌ。

第　１　表 第　２　表 第　３　表 第　４　表 ＮＴ二ニトロテトラゾリウムブルー 場明で用いられる化合物（Ｉ＞は染料合成の−とじて公
知の化合物であるが第１〜３表に］化合物は例えば以下
の方法によって合成で記載に記載の化合物Ｎｏの化合物
については−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロ−目
的化合物における下記に示される置換ベンもしくは置換
ナフタレンとを等モルづつ料の２〜１０倍量の６０％硫
酸中で反応さ。反応は５０〜１００℃で攪拌して行われ
３時間で完了する。さらに反応液の５〜６５℃前後の冷
水を加えて一夜攪拌を続ける。

応動を濾過し、８％硫酸で洗浄後真空乾燥目的物を得る
。アルカリ例えば水酸化ナトムを反応液に加えることに
よって沈澱が生易くなるので必要に応じて加える。

０゜ ５゜ ■　下記表に掲げる各化合物ＮＯに対応する公知の色素
を原料とし、原料色素を色素重量の８０倍量の蒸留水で
溶解する。この色素溶液を攪拌しながら、原料色素の２
倍ｍｏｌ量の水素化ホウ素す）　ＩＪウムを徐々に添加
し、還元反応を行う。

室温で約２時間攪拌後、この反応液をロータリーエバポ
レーターで濃縮乾固する。次にこの乾固物を溶解しつる
最低必要量の蒸留水にて溶解する。この溶解液の１５〜
２０倍容量のレジンＨｐ＝２０をガラスカラムに充填し
、コンディショニング後、前述の溶解液を充填し、使用
レジンの３〜４倍容量の蒸留水を流し、残存する水素化
ホウ素す）　ＩＪウムを除去する。この時目的物はＨＰ
−２０に吸着されている。次にメタノール／蒸留水＝１
／１の展開溶媒を流し、溶出液を適量づつ分取する。溶
出液中の目的物をＵ■モニターあるいはＴＬＣにて確認
後、必要なフラクションを集め、ロータリーエバポレー
ターで濃縮乾固し、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、９．１０．６７、６８の製法４、４’
−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロールとクロルベ
ンゼン（化合物Ｎｏ、９．１０　）あるいは１−ナフト
ール−３，５−ジスルホン酸（化合物Ｎｏ、６７．６８
　）とを６０％硫酸を用いて前述■の方法にて縮合させ
る。得られた化合物を適量の酢酸に溶解し、酸化鉛を触
媒として、ジメチルアミノ基の２つのメチル基の一方を
脱離さ・ｌ−１目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、１１．１２の製法 ２−メチル−５−ニトロペンズアルデノ＼イドとα−（
Ｎ−メチルアニリノ）−ｍ−）ルエンスルホン酸とをモ
ル比１；２で原料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え
、１００℃前後で１２０時間攪拌する。沈澱を熱いまま
グラスフィルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾
燥を行い目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、１９．２０の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ、Ｎ−ジメチル
アニリンおよびＮ−フェニル−ジベンジルアミンとをモ
ル比１：ｌ：ｌで原料化合物総重量の１０倍量の８０％
硫酸に加え、１９０℃前後で１２０時間攪拌する。沈殿
を熱いままクラスフィルターにて濾過し、５％硫酸で濾
洗後真空乾燥を行い、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、２１．２２の製法 ２．５−ジクロロベンズアルデハイドとα−（Ｎ−メチ
ルアニリノ）−ｍ−）ルエンスルホン酸とをモル比１：
２で原料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え、１００
℃前後で１２０時間攪拌する。沈殿を熱いままグラスフ
ィルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い
、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、２３．２４．２５．２６の製法２−ヒ
ドロキシベンズアルデハイドとＮ−フェニルジベンジル
アミン（Ｎｏ、２３．２４）　、あるいはＮ−ブチル−
０−トルイジン（Ｎｏ２５．２６）とをモル比１：２で
原料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え、１００℃前
後で１２０時間攪拌する。

沈殿を熱いままグラスフィルターにて濾過し、５％硫酸
で濾洗後真空乾燥を行い目的物を得る。

上記以外の化合物についても、上記の方法において原料
を目的化合物に応じて選ぶことによっであるいは公知文
献例えばＣｏ１ｏｒ　Ｉｎｄｅｘ　４巻に記載の方法に
よって製造できる。

本発明方法は、反応によってＮＡＤ（Ｐ）、Ｈを化学量
論的に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活
性の測定に適用できる。かかる反応系はＮＡＤ及びデヒ
ドロゲナーゼを用いる多くの反応系が知られている。か
かる物質としてグルコース、ガラクトース、乳酸、アル
コール、リンゴ酸、アルデヒド、キサンチン、コレステ
ロール。

胆汁酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性、
中性脂肪等があげられる。

これらの反応系が図式的に次に示され、反応系における
基質、酵素活性が測定できる。

グルコース−６−リン酸＋ΔＤＰ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン６−リン酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ
＋ Ｄ−ガラクトノ−Ｔ−ラクトン十ＮＡＤＨ＋ｌ（”″ ピルビン酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ” （了ｔｉフル１じ１ノ オキザル酢酸＋ＮＡＤＨ十Ｈ＋ Ｒ−ＣＯＯ″＋ＮＡＤＨ＋２Ｈ” 尿酸＋ＮＡＤＨ十Ｈ” ８、　中性脂肪、グリセロール グリセロール＋ｐ、１１方酸 ジヒドロキシアセトン＋ＮＡＤＨ ９，３α−ヒドロキシ胆汁酸＋ＮＡＤ 本発明で用いられるＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ定量用組成物は　
（イ）ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダクタ
ーセ　（ロ）ダイアホラーセ又は電子キャリヤー　及び
　（ハ）化合物（Ｉ）からなり、これらが前述の量比に
調製されたものは使用に便利である。さらに必要に応じ
て緩衝剤をこの組成物に組合せることができる。

測定されるべき因子によって必要な基質あるいは酵素を
加えた組成物あるいは別に用意して組合せたキットは種
々の物質もしくは酵素活性の定量に極めて便利で有用で
ある。

以下に本発明の態様を示す実施例を示す。

実施例１゜ 総胆汁酸の測定 １００ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐ　Ｈ６，５）１００
ｍｌにペルオキシダーゼ１０００単位、ダイアホラーセ
５００単位、３α−Ｈ３Ｄ５０単位。

Ｎ　Ａ　Ｄ　６６０　ｍｇ、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０をｌｏｏｍｇおよび発色化合物として　■化合物Ｎｏ
、４１を１０ｍｇ　■化合物Ｎｏ、５９を１０ｍｇ　■
化合物Ｎｏ、６１を１０ｍｇをそれぞれ溶解し、試薬液
とする。

試験官に血清１００μｌと上記試薬液３ｍｌをとり、３
７℃に１０分間放置した後発色剤のλｍａｘにおける吸
光度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成した検量
線より血清中の総胆汁酸濃度を算出する。

試薬液として、上記緩衝液に３α−Ｈ３Ｄ。

ＮＡＤ、ダイアホラーゼ、トリトンＸ−１００及び発色
化合物としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴ）を１
５ｍｇ用いる他は、前記と同様に実施する。

結果をガスクロマド法（ＧＣ）を用いて測定した数値と
対比して第５表に併記する。

［ 実施例２゜ ＬＤＨ活性の測定 １００ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐＨ８，２）１００ｍ
ｌにペルオキシダーゼ１０００単位、ＭＰＭＳｌ、５ｍ
ｇ、Ｌ−乳酸ナトリウム５Ｑｍｇ、ＮΔＤ１００ｍｇ、
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００１００ｍｇおよび発色化合
物として　■化合物Ｎ０５３を１０ｍｇ　■化合物Ｎｏ
、６９を１０ｍｇ　■化合物Ｎ０７５を１’　Ｏｍｇを
それぞれ溶解し、試薬液とする。

試薬液を予め３７℃で１０分間加温した後、血清２０μ
ｌを添加し、正確に１分後と３分後の吸光度を発色剤の
λｍａＸにおいて試薬盲検を対照として測定する。３分
後と１分後の吸光度差を計算し、予め作成した検量線よ
り、血清中のＬＤＨ活性を算出する。

試薬液として上記緩衝液にＭＰＭＳ、Ｌ−乳酸ナトリウ
ム、トリトンＸ−１００，ＮＡＤ、　−１０ｍｇのニト
ロテトラゾリウムブルー（Ｎ　Ｔ　）を溶解した液を用
いる他は上記と同様に実施する。

結果をＵＶ法を用いて測定した数値と対比して第６表に
併記する。

実施例３゜ 中性脂肪の測定 １００ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐＨ６，７５）１００
ｍｌにベルオキシダー−１：’　１０００単位、ダイア
ホラーゼ５００単位、リボプロティンリパーゼ５０００
０単位、グリセロールデヒドロゲナーゼ５０００単位、
　Ｎ　Ａ　Ｄ　５００　ｍｇ、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００を１００ｍｇ、および発色化合物として　■化合物
Ｎ。

７１を１０ｍｇ　■化合物Ｎｏ、６３を１０ｍｇ　■化
合物Ｎｏ、６５を１０ｍｇを溶解して試薬液とする。

試験管に血清２０μｍ七上記試薬液３ｍｌをとり、３７
℃に１０分間放置した後、発色剤のλｍａＸにおける吸
光度を試薬盲検を対照として測定し、予約作成した検量
線より血清中の中性脂肪濃度を算出する。

試薬液として上記緩衝液にダイアホラーゼ、リポプロテ
ィンリパーゼ、グリセロールデヒドロゲナー−１：’、
ＮＡＤ、）リドンＸ、１００及び１５ｍｇのニトロテト
ラゾリウムブルーを用いる他は上記と同様に実施する。

結果をグリセロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを
使用した系（Ａ）で測定した数値を対比して第７表に併
記する。

一通１表−土作皿肪倉】ユ■ノｊ上 特許出願人：協和メデックス株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式＜１）で表される化合物とＮＡＤ（Ｐ
   ）Ｈとを、■ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリ
   ダクターゼ及び　■ダイアホラーゼ又は電子キャリヤー
   　の存在下に反応させて生成する色素を定量することを
   特徴とするＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量方法 一般式（Ｉ） ｐ。 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ，、、Ｒ
   ，、Ｒ，は同一もしくは異なってよく下記一般式（ｎ）
   、（１１［）又は（ＩＶ）で表されＺは水素、ヒドロキ
   シル、アミノ、置換アミノ。 アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリール、置換
   アリール、アシル、ハロゲン、ニトロ。 スルホ、カルボキシル、アルコキシを示す。ｎは１．２
   又は３を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つのＺ
   はヒドロキシル、アミノ又は置換アミノである。又、Ｚ
   ｎにおける各Ｚは同一もしくは異なっていてもよい。
2. （２） （イ）ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダクタ
   ーゼ （ロ）ダイアホラーゼ又は電子キャリヤー　及び（））
   ）　一般式（１）で表される化合物からなるＮＡＤ　（
   Ｐ）Ｈ定量用組成物。