JPH03504975A

JPH03504975A - 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法

Info

Publication number: JPH03504975A
Application number: JP1506915A
Authority: JP
Inventors: ジマーマン　ダニエル　エイチ; エリオット　ドナルド　エイ
Original assignee: セル―エスシーアイ　コーポレイション
Priority date: 1988-06-14
Filing date: 1989-06-12
Publication date: 1991-10-31
Also published as: ATE130197T1; CA1339339C; EP0420913A4; DE68924850D1; DE68924850T2; AU3777989A; EP0420913B1; AU633007B2; US6096315A; WO1989012458A1; EP0420913A1; US5652342A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法主恩■発立本発明は、互いに共有結合的に結合する少なくとも二つのＴ細胞特異性結合リンガドよりなり、Ｔ細胞特異性リガンドの一つがＴ細胞の特定のクラス又はサブクラスに結合し、Ｔ細胞特異性結合リガンドの他方が病気若しくは病気の原因物質と関係する抗原又はそのエピトープである異種官能性（ｈｅｔｅｒ。

ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　）細胞免疫剤に関する。また、本発明は、異種官能性細胞免疫剤を含むワクチン及びその使用方法にも関する。

主肌■宜景細胞性免疫において、ウィルスのような病因剤は、抗原供与細胞（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）　　（以下ＡＰＣという）と呼ばれる特定細胞により飲み込まれる。ＡＰＣは、ウィルスを破壊し、ウィルスの抗原決定基、すなわち、ウィルスの特定ポリペプチドをポリペプチドフラグメントに*** する。これらのフラグメント化された抗原決定基は、次いで　ＡＰＣの細胞表面に移される。この時にＡＰＣは、また主要組織適合性複合分子クラスＩ及びクラス■（以下それぞれｒ　ＭＨＣクラス■」又はｒ　ＭＨＣクラス■」という。）を産生又は修飾し、これらのクラスは細胞性免疫に大いに関係し、内部で産生されＡＰＣの表面に移される。

Ｍ）Ｉｃクラス１分子は、特異的に細胞障害／サプレッサーＴ細胞（Ｔ、／Ｓ）に結合し、ＭＨＣクラス■分子は特定的にヘルパー／補助Ｔ細胞（Ｔ、）に結合する。ＭＨＣ分子は、少なくとも二つの結合部位、すなわちアグレトーブ結合部位（ａｇｒｅｔｏｐｅ　ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）として知られている抗原結合部位（これは種々のアグレトーブに対するＭＨＣ分子の間で高度に変化しうる。

）及びＴ細胞に結合する部位、すなわちＴ細胞特異性結合リガンド（これは高度に保存される。）を有する。（ビョルクマン、ビー、ジェイ（Ｂｊｏｒｋｍａｎ、　Ｐ、Ｊ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　　：　５０６（１９８７）及びビョルクマン、ビー・ジマイら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　　二５１２（１９８７）参照。）Ｔ細胞は、（１）ＡＰＣ表面上に存在するフラグメント化された抗原決定基のＴ細胞表面への結合及び（２）ＡＰＣ表面上に存在するＭ）Ｉｃ分子の高度に保存された領域のＴ細胞表面への結合の組合せにより活性化される。通常、フラグメント化抗原決定基又はＭＨＣ分子の高度に保存された領域のみによるＴ細胞表面への結合は、そのようにすることが、すべてではなくてもほとんどのＴ細胞の非制御的、かつ無差別的多クローン性活性化を生じ病原性状態を生じうるので、Ｔ細胞の活性化を生じない。ＭＨＣ分子のＴ細胞表面への結合は、一部分アグレトープにより媒介され、すなわち、抗原の？ｌＨＣ分子への結合はＭＨＣ分子に対しＴ細胞表面に結合する信号として作用する（ビョルクマン７　ピーシエイ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２２９：５０６（１９８７）参照。）更に、Ｆ’ｌＨＣ分子は認識部位を有するので、ＡＰＣ及びＴ細胞が同じ遺伝子組成を有する同じＭＨＣ分子を有しない場合、それらは「非自己」として認識され、したがって所望の相互作用は引き続いて起こることができない。

得られた活性化Ｔ細胞は、次いで血液流中又は各所で発病性又はこれに関連する剤、例えばウィルス感染細胞、腫瘍細胞を異物質として認識し、これを殺すように作用する。これは、例えばウィルスにより抗体なしで起こされる病気に対する細胞性免疫又は体液性免疫が関係することを生しる。

ＡＰＣ、代表的にはマクロファージも、抗原の相互作用とプロセンシングの結果としてインターロイキン１（以下ｒｌＬ−ＩＪとよふ。）を産生放出する。ＩＬ −１は、Ｔ細胞の活性化過程の一部としてＴ細胞と相互作用する。ＩＬ−１は活性化Ｔ細胞を生してインターロイキン２（以下ｒｌＬ−２Ｊという。）を産生ずる。しかし、はとんどのホルモンの場合と同様に、ＩＬ−１活性は一般化されており、すなわち、それは特にある抗原に特定なものでなくて、むしろ−膜化された炎症応答を引き起こすのに関係する。

ＭＨＣ分子は極めて大きく高度に多型性であるので、このようなものを被験者に投与する場合、抗原性の問題が生じる。更に、アグレトーブとＭＢＣ分子の高い変化性がある。したがって、関心のある病気を起こすかこれに関係する剤のための適当なＭＨＣ分子を単離し、関心のある病気に特定のＴ細胞を活性化しうるＭＨＣ分子の複合体を形成しうるようにすることは困難である。

本発明の例において、上記問題は、Ｔ細胞に結合するＭＨＣ分子の一部のみ、すなわち、その高度に保存される領域のみを用い、これを関心のある病気若しくは病気の作因と関係する抗原又はそのエピトープに共有結合的に結合し、これにより異種官能性細胞性免疫剤を形成し適当なＭＨＣ分子の単離又は大きくて多型性のＭＨＣ分子の使用の必要性を避けることにより克服される。更に、若干の場合には、抗原に応答する失敗の理由の一つは、抗原プロセッシング及び／又は適当なＭＨＣ分子の欠如である。本発明の異種官能性細胞免疫剤は、この問題を克服する。

エイズの研究をする臨床及び産業免疫学者は、細胞性免疫と病気の関係に集中しなかったが、これはほとんどの彼等の検定が体液性免疫機構に基づくためである。細胞性免疫の反応が遅いこと、感染しない宿主から導かれる生きた細胞の要求及び系固有のＭＨＣ制限が細胞性免疫から注意をそらせていた。したがって、細胞性免疫は、入力と出力は決定されるが内部機構についてはほとんど知られていない「ブランクボックス」に幾分似た状態であった。

エイズ又はヘルペスウィルスの再活性化の迅速なことは、再活性化が体液性応答機構の破壊の結果ではあり得ないことを示す。すなわち、再活性化は、血清抗体がまた豊富である間短い日数で起こる。一部は体液性応答における上記の状況的証拠のため、一部は細胞性機構における他の証拠のため、細胞性応答機構の破壊がこれらの病因剤の再活性化に関係している。

結核（以下ｒＴＢＪという。）、細胞性免疫が最高である他の病気の場合、Ｔ細胞成長因子としても知られるＩＬ−２は、ミコバクテリアに対するインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）細胞性免疫応答を回復することができる。ＩＬ−１はＴＢにかかっている被験者から得られるので、細胞によるＩＬ−２産生の刺激の欠如はＡＰＣ供与又は認識過程の失敗を意味する。

外因的に与えられたＴＬ−２は、エイズ患者に関するインビトロ検定系においてヒト免疫不全ウィルス（以下ｒＨＩＶ　Ｊという。）に対する細胞性免疫活性を少なくとも一部回復することができる。これは、エイズにおいてはＩＬ−１産生が正常以上であってもＩＬ−２産生不全もあることを示す。エイズ感染患者は、不十分か有効でない抗体依存細胞性細胞毒性Ｃ以下ｒ　ＡＤＣＣＪという。）、抗体補体細胞毒性（以下ｒＡＣＣＪという。）又はナチュラルキラー（以下ｒＮＫＪという。）活性をも、エイズ関連コンプレックス（ＡＩＤＳ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ）　　（以下ｒＡＲＣＪという。）又はエイズの何らかの臨床的徴候前の初期段階でさえ有する。

本発明の例において、エイズのような病気に特異的に細胞性免疫を刺激する、エイズのような病気のためのワクチンを提供する。

現在、検定が開発された反応を開始又は刺激する基質細胞としてまた細胞性免疫を評価する標的として宿主からの細胞を使用する細胞性免疫のための一連のインビトロ検定がある。これらのインビトロ検定は、細胞障害性ＴＩＪンパ球検定（以下ｒＣＴＬ　Ｊという。）；リンパ増殖検定、例えば三重水素化チミジン混入；プロティンキナーゼ検定、イオン輸送検定及びリンパ球泳動阻害機能検定（以下ｒＬＩＦ　Ｊという）を含む。（ヒラクリング・ジェイ・ケイ　（Ｈｉｃｋｌｉｎｇ、　Ｊ、　Ｋ、　　）ら、Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　、　６１　：　３４６３（１９８７）　　ｉヘンゲル・エイチ（Ｈｅｎｇｅｌ、　Ｈ，）ら、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

Ｕｌ５４１９６　（１９８７）　　；ソーレイ−ローソン、ディー・エイ（Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ、　　Ｄ、　　八、　）　ら■こｒｏｃ、　　Ｎａｔ＋、　　へ旦ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　　ＵＳ、へ、ユ８４：５３８４　（１９８７）　　；カシパル、ジー、ジエイ（Ｋａｄｉｖａｌ、　Ｇ、　Ｊ、）らム　ハ匹坦り、Ｌｌ２：２４４７　（１９８７）　　；サムエルソン・エル。

イー、　　（ＳａｍｍＪｓｏｎ、　　Ｌ、　　Ｅ、　　）　　らＪ、　　Ｔｍｍｕｎｏｌ、、１３９　　：　２７０８（１９８７）　；ケイソン、ジェイ　（Ｃａｓｏｎ、　Ｊ、　　）ら、Ｊ、　　Ｊｆｆｌｍｕｎｏｌ。

辿、、　１０２　：　ｉ０９　（１９８７）　；及びトセイン、アール、ジエイ（Ｔｓｅｉｎ、　Ｒ，Ｊ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２！ＪＬ：　６８　（１９８２）　　）これらの検定は、細胞性免疫活性に対する真の特異性を欠くこと、同じＭｌ（Ｃ型のＡＰＣによる抗原プロッセソシグと供与を必要とすること、遅いこと（数日にわたることがある。）、及び被験者による及び／又は放射性同位元素の使用を必要とすることがあることの点で不利である。

本発明の例において、上記問題を克服する、細胞性免疫のための診断検定が提供される。

全皿勿要り本発明の目的は、細胞免疫系と特異的に相互作用する異種官能性細胞免疫剤を提供することである。

本発明の他の目的は、異種官能性細胞免疫剤を用いて病気に対する細胞免疫を刺激することにより病気の予防及び治療用ワクチンを提供することである。

本発明の更に他の目的は、異種官能性細胞免疫剤を用いて病気に対する細胞免疫を刺激することにより病気の予防又は治療方法を提供することである。

本発明の別の目的は、異種官能性細胞免疫剤を用いて病気に対して活性であるＴ細胞の存在を検定することにより病気の診断方法を提供することである。

本発明の一例において、上記の目的は、互いに共有結合的に結合した少なくとも二つのＴ細胞特異結合リガンドよりなり、Ｔ細胞特異性結合リガンドの一つがＴ細胞の特定のクラス又はサブクラスに結合し、Ｔ細胞特異結合リガンドの他方が病気又は病気の作因と関係する抗原又はそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤により達成された。

第２の例において、本発明の上記目的は、有効成分として製薬上有効量の異種官能性細胞免疫剤と製薬上許容しうる担体又は稀釈剤よりなる病気の予防又は治療用ワクチンにより達成された。

第３の例において、本発明の上記目的は、病気にかかりやすい被験者にワクチンを投与することよりなる病気の予防方法により達成された。

第４の例において、本発明の上記目的は、病気にかかった被験者にワクチンを投与することによりなる病気の治療方法により達成された。

第５の例において、この発明の上記目的は、異種官能性細胞免疫剤を用いて被験者内の、病気に対して活性であるＴ細胞の存在を検定することからなる病気診断方法により達成された。

主班夏昆縦上記のように、本発明の一例において、上記目的は、互いに共有結合的に結合した少なくとも二つのＴ細胞特異性結合リガンドよりなり、Ｔ細胞特異性結合リガンドの一つがＴ細胞の特定のクラス又はサブクラスに結合し、Ｔ細胞特異性結合リガンドの他方が病気又は病気の作因に関係する抗原又はそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤により達成された。

ここで用いたように、「Ｔ細胞特異性結合リガンド」という表現は、Ｔ細胞の表面に結合する分子全体又は分子のＴ細胞結合部分のみ、好ましくは分子のＴ細胞結合部分のみをいう。

Ｔ細胞特異性結合リガンドが結合するＴ細胞の特別の型は、本発明に決定的なものでない。このようなＴ細胞の例は、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞及び細胞障害Ｔ細胞を含む。これらのＴ細胞は、これらのサブクラスを含み、例えばヘルパーＴ細胞のサブクラスは、抗体合成に必要なヘルパーＴ細胞及び細胞障害活性に必要なものを含む。

用いたＴ細胞の特定のクラス又はサブクラスに結合する特別のＴ細胞特異性結合リガンドは、本発明に決定的なものでない。

Ｔ細胞の特定のクラス又はサブクラスに結合する特別のＴ細胞特異性結合リガンドは、すべての成熟Ｔ細胞、成熟細胞障害Ｔ細胞のみ、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞又はそれらの特定のクラス又はサブクラスに結合するように選ぶことができる。このようなＴ細胞特異性結合リガンドの例は、？ｌＨＣクラスＩ及び■の部分；免疫グロブリンのＨ鎖のＦｅｅｌ域部分；１１゛分子；リンパ球機能関連分子−３（以下ｒＬＦＡ−３Ｊという。）；ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ− ４及びＣＤ−８ニ対する抗体；コンカナバリアＡ、ホークライードマイトジェン、落花生アグルチニン及び植物凝集のようなレクチン；　ＩＬ−１及びＩＬ−２のようなリンフ才力イン；及びｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）、　　（６０：４０）のような他の分子のようなＡＰＣ上に位置又はこれに結合もするＴ細胞特異性結合リガンドを含む。

ＭＨＣクラスＩの小さなタンパク質、すなわち、ｂ−２−ミクログロブリン（以下ｒｂ−２−？Ｉ　Ｊという。）（これは血清、腹水及び尿のような種々の体液中に見い出される。）は、これがＴ細胞特異性結合リガンドであることを示す生物学的特性を有することが最近示された。にッセン、エム、エイチ（Ｎｉｓｓｅｎ。

Ｍ、　Ｈ，）ら、Ｊ、　　Ｉｍｍ＋ｕｎｏ１．　、１３９　　：　１０２２　（１９８７）参照。）すなわち、この分子のインビトロＣＳ＋＋放出細胞障害検定系への添加が非対応及び対応系の両方においてＣＴＬ活性に増大効果を有し、すなわち、ヒト（非対応）及びネズミ（対応）　ｂ−２−Ｍがネズミ細胞を用いるこの検定系において同じ生物学的効果を生じる。　ｂ−２−Ｍの配列は、グソウ、ディー　（Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ　）ら、ムＩｍｍｕｎｏ１．．１３９　　：　３１３２　（１９８７）に報告されている。ｂ−２−Ｍのそれぞれ２４〜５８位置及び５８〜８４位置における次の配列が特に有用なＴ細胞特異性結合リガンドであると信じられる：ＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨ５ＤＬＳＦＳＫ　　　　（ＭＷ−４４７４）ＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ（ＭＷ　＝　３３９６）これら二つのポリペプチドは、若干の理由のためシスティンで終るように選ばれる。第１に、それらは線状エピトープ領域の恐らく外側にある部位を示す。これは、成熟ｂ−２−？Ｉにおいて、それらが分子内ジスルフィド結合の生成に関係するためである。

第２に、それらが病気若しくは病気の作因に関係する抗原又はそのエピトープに共有結合部位として役立つようにシスティンを利用するように選ばれる。

ＣＤ−２及びＬＦＡ−３に対する共通の配列が最近報告された。（ビーターソン、エイ　（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ａ、）　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　皿：　８４２　（１９８７）；及びシード、ビー（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　　：　８４０　（１９８７）参照。）Ｔ細胞上に見い出されるＣＤ−２、及び同様な、同一に導かれた分子でなくても、ＬＦＡ−３（これはマクロファージ、赤血球及び神経細胞に見い出される。）は、両方共種々のＴ細胞レセプター、リガンド及び変調相互作用に関係する。特に、位置８７〜１０１にあるＬＦＡ−３：ＫＶＳＩＹＰＴＫＧＫＮＶＬＥＫ　　　　　　　　　　　　　（ＭＷ＝　１９５６）又はシスティン（Ｃ）及び２個のグリシン（ｇｇ）が加えられたその誘導体：ｃｇｇＫＶｓ　ＩＹＰＴＫＧＫＮＶＬＥＫ　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　２２２８．３）ＫＶＳ　ＩＹＰＴＫＧＫＮＶＬＥＫｇｇｃ　　　　　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　２２２８　、３）又は位置４２〜５８における：ＫＴＳＡＫＲＫＩＡＱＦＲＫＥＫ　　　　　　　　　　　　　（？Ｉ臀＝　２０４３）又はその誘導体：ＫＴＳＡＫＫＫ　ＩＡＱＦＲＫＥＫｇｇｃ　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　２３１４）ｃｃｇＫＴｓＡＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＲ（ＭＷ＝　２３１４）は、有用なＴ細胞特異性結合リガンドであると信じられる。

Ｔｔｓ胞特異性結合リガンドとしてこれらのポリペプチドを直接使用する可能性に加えてこれらのポリペプチドの荷電性に基づいて、ＬＦＡ−３の他の領域内からの対応する酸性ポリペプチドはＴ細胞特異性結合リガンドとして有用であると信じられる。

（ブライトメイヤー、ジェイ、ビー（Ｂｒｅｉｔｍｅｙｅｒ、　Ｊ、　Ｂ、　）　。

Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　　：　７６０　（１９８７）参照。）それは、ＬＦＡ −３の、カルボキシルの最終又は最終から２番目の配列ＳＲ）ＩＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＣＩＶＬＹＭＮＧＩＬ　　　　　　　（ＭＷ＝３５２０）又は内部システィンがアミノ−酪酸（Ａｂｕ　）により置換され及び／又は内部メチオニンがツルーロイシン（Ｎｊ２ｅ）によす置換されるその誘導体：５ＲＨＲＹＡＩ、ＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｆＶＬＹＭＮＧＩＬ　　　　　　（ＭＷ　＝３５０２）ＳＲＨＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｌＶＬＹＮｌｅＮＧＴＬ　　　　　（ＭＷ　＝　３４７４）又はその誘導体：ｃｇｇＳＲＨＲＹＡＬ４ＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｌＶＬＹＮ］ｅＮＧＩＬ　　　　（ＭＷ＝３７４６）である。上記のように、これらの誘導体は、アミノ酪酸（Ａｂｕ　）とツルーロイシン（Ｎｌｅ　）を含む。前者の置換の理由は、スルフヒドリル源を除くことにより同種官能性複合体を形成する可能性を避けることである。後者の置換の理由は、ペプチド結合を***させてホモシスティン末端ポリペプチドを生成しうる不安定なメチオニンを除くことである。

ＣＤ−２，ＣＤ−３、ＣＤ−４及びＣＤ−８に対する抗体は、業界でよく知られている。（クング、ビー（Ｋｕｎｇ、　Ｐ、）ら、丘匹、胆葺、腹。

とし　用紅　、７４　：　４９１４　（１９８０）参照。）ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ−４，ＣＤ−８、レクチン及び１１に対する抗体に対するようにＴ細胞特異性結合リガンドの配列が知られていない場合、配列を全体又は部分で決定しなければならない。アンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を決定し、逆方向に二重鎖ＤＮＡ主鎖に沿って読み、アンチセンスポリペプチドをつくることにより（スミス、エル、アール。

（Ｓｍｊｔｈ、　Ｌ、　Ｉ？、）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３８　　；　７　（１９８７）参照。）又は米国特許第４，７０４，６９２号明細書に開示される電子計算機技術を用いることにより理論的配列を決定することが可能である。

コンカナバリンＡのようなレクチンは多価であり、かつそれらのりガントに対する特異性結合部位を有することが知られている。　（ニーデルマン、ジー、エム、　　（Ｅｄｅｌｍａｎｎ、　Ｇ、　Ｍ、）ら、ｈ０皿、に己、匙且男」−…；　２５８０　（１９７２）参照。）更に、れらがＴ細胞の特異的−穀油性化を起こし出来事の経路を変えることばよ（知られている。（チンマンマン、ディ、エイチ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、　Ｄ、　Ｈ，）　　ら１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ＪＪＪ−：　１３２６　（１９７３）参照。）コンカナバリンＡから導かれる一つの前記Ｔ細胞特異性結合配列は位置８０〜１１０にある：ＬＮＤＶＬＰＥ−シＲＶＧＬＤＳＡＳＴＧＬＹＫＥＴＮＴＩＬＳＷＳ　　　（Ｍ（ｂ４０４０）（ウォング、ジェイ、エル、　　（ＩＡａｎｇ、　Ｊ、　Ｌ、）　　　ら、Ｊ　　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　…〔：　１４９０　（１９７５）及びニーデルマン、ジー、エム。

ら、丘匹、ハ旦、囮９皿、」、鎚：　２５８０　（１９７２）参照。）ＩＬ−１が若干の型のＴ細胞、すなわち、ヘルパーＴ細胞及びサプレッサーＴ細胞に活性を有し、ＡＰＣにより生産されることは、よく知られている。

ネンシオニ、エル、　（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ、　Ｌ、）　　ら、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、を次のＴｗＪ胞特異性結合配列：ＶｉＩＧＥＥＳＮＤＫ　　　　　　　　（ＭＷ＝１１４９）又はその誘導体：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫｇｇｃ　　　　　　　（ＭＷ＝１．４２０）を記載する。

同様に、Ｔ細胞の一つの型、すなわちＴヘルハー細胞により産生されるＴＬ−２は、同−及び他のＴ細胞、すなわちＴｈ及びＴｃ／ｓ細胞上のレセプターと相互作用する。（アルドマン、エイ。

（Ａｌｔｍａｎ、　Ａ　）ら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　、１１：２１７６（１９８４）参照。）　ＩＬ−２は、免疫抗体応答に影響を有することが報告されている。本発明者らは、ＩＬ−２が特に位置３４〜３９で：ＬＥＨＬＬＬ　　　　　　　　　　（ＭＷ＝８２７）またその誘導体で：ｃｇｇＬＥＨＬＬ　　　　　　　　　（ＭＷ＝１０９８）Ｔ細胞特異性結合リガンドとして有用であると考える。その理由は、これらのポリペプチドがＩＬ−２と競争するのが結合バイオアッセイであるからである。（レイヘル、ダブリュー、イー。

（Ｒｅ１ｈｅｒ、　Ｗ、　Ｅ、）ら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８３　：９１８８　（１９８７）参照。）特に、ＩＬ−２の位置１８〜３２：ＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬ　　　　　（酔＝１８０２）をあげる。

アミノ酸ｒＴＳＳ−Ｔ　Ｊは、種々の源から高度に保存されるよである。（コーツ、ディー、ニス、　（Ｋｏｈｔｚ、　Ｄ、　Ｓ、）ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、＋６２　：　６５９　（１９８８）参照。）したがって、レトロウィルスのタンパク質配列中に見い出される上記配列（ＴＳＳ−Ｔ構造を有する。）の次の誘導体は、Ｔ細胞特異性結合リガンドとして用いることができる：ＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬｇｇｃ　　　　　（ＭＷ＝２０７１）ＡｂｕｇｇＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬ　　　　（ＭＷ＝２０５５）リウ、エフ、ティ、　　（Ｌｉｕ、　Ｆ、　Ｔ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌｆｉ：　６９０（１９７９）には、Ｄ−グルタミン酸と・リジンの重合体であり、ポリ−（Ｄ−ＧＬ）　（６０：　４０）と呼ばれる、又はアミノ酸に対する現在の命名法を用いてｄ−ポリ　（Ｅ／Ｋ）、、（６０：４０）と呼ばれる、抗体産生誘導用の抑制／抑圧性ハプテン担体を記載する。Ｔ細胞レセプターの現在の知識から見て、本発明者らは、Ｄ−グルタミン酸とりシンのこの重合体がサプレッサーＴ細胞に対するＴ細胞結合リガンドを取り囲むと考え、これにより本発明に有用であると考える。

ＭＨＣクラスＩ及び■の両分子が多重鎖から構成され、該多重鎖が相互、他の膜関係体、抗原、アグレトーブ、エピトープ及びＴ細胞レセプターに多重結合をつくることはよく知られている。このような分子の一つである上記ｂ−２−Ｍ　（グツソウ、ディー、　　（Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ、）ら、Ｊ、　　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏ１．、　」波：　３１３２　（１９８７））は、ＭＨＣクラスＩと関係する小さなタンパク質である。ｂ−２−Ｍの上記配列は、本発明の三価異種官能性細胞免疫剤を調製するのに用いることができる。同様に、ＬＦＡ−３又はＩａ”の配列は、ｂ−２−Ｍの位！　１−２１におけるアミノ末端ポリペプチド：ＩＮＲＴＰＫＩＮＶＲ５ＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮ　　　　（ＭＷ＝２７４９）又はその誘導体：ｃｇｇｌＮＲＴＰＫＩＮＶＲ５ＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮ　　　（ＭＷ＝３０２０）ＩＮＲＴＰＫＩＮＶＲ３ＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮｇｇｃ　　　　　（ＭＷ＝３０２０）と関連してＡＰＣとＴ細胞の両方を関係させたい場合、本発明の三価の異種官能性細胞免疫剤を調製するのに有用である。

抗体応答に対して免疫原であるので、ヒト絨毛性ソマトトロピン（以下ｒＨｃｓ」という。）の位置１６６〜１７４にある次のポリペプチドは、抗原エピトープに単に依存する効果と、これらのＨｃＳポリペプチドがしないＴ細胞へのりガント官能性結合の寄与をも必要とする効果とを判別する対照として役立てることができる。（アンチオニ、ジー、　　（Ａｎｔｉｏｎｉ、　Ｇ、）　　ら、Ｍｏｌ。

Ｔｍｍｕｎｏｌ、、　　２２　：　１３３７　（１９８７）参照）：ＦＲＫＤＭＤＫＶＥ　　　　　　　　　　（ＭＷ＝１３２１）及びその誘導体ＦＲＫＤＮ］ｅＤＫＶＥ　　　　　　　　（ＭＷ＝１２９３）ＦＲＫＤＮ］ｅＤＫＶＥｇｇｃ　　　　　　　（ＭＷ＝１５６５）ＡｂｕｇｇＦＲＫＤＮ］ｅＤＫＶＥ　　　　　　（ＭＷ＝１５４７）Ｔ細胞特異性結合リガンド又はそのＴ細胞結合部分又は対照ポリペプチドは、市販され又は顧客の求めにより製造され、（アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（フォスター・シティ−、ＣＡ）　、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　（サン・ラフエル、ＣＡ）、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ（Ｃａｎ＋ｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ケンブリッジ、　Ｕ、に、）、パヘム・インコーホレーテッド（Ｂａｃｈｅｍ　Ｉｎｃ、）　（）ランス、　ＣＡ）、サーバ（Ｓｅｒｖａ）　（ウェストベリー、ＮＹ））又は適当な天然源から得られる。

Ｔ細胞特異性結合リガンドは、乾燥粉末として乾燥環境下に−２０〜−７０℃で貯蔵される。

次の例において、すべての媒質と溶液は、特記しない限り新たに調製したガラス蒸留水又は同−又はそれより上の品質の水の中でつくられる。これらの例は説明の目的だけのために記載するものであって、決してこの発明を制限するものではない。

本例は、アミノ酸配列とヌクレオチド配列が知られているタンパク質、すなわちｂ−２−ＭのＴ細胞特異性結合部を単離し、決定することを述べる。ここで述べる研究は、種々の他のＴ細胞特異性結合リガンド、例えばコンカナバリンＡ、ポークライードマイトジェン、落花生アグルチニン及び植物凝集素のようなレクチン、　　ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ−４，ＣＤ−８等のような細胞表面りンパク質に対する抗体を含む抗体；並びにＬＦＡ−３及びｌａ＋のような表面タンパク質（全配列が知られてなくてもよい。）に対しても有用である。

この例において、培養ヒトＢ細胞から抽出されたｂ−２−Ｍを例えば、ラーチ、ビー、ジー（Ｌｅｒｃｈ、　Ｐ、　Ｇ）ら、ｍｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

２３　：　１３１頁（１９８６）に記載されるようなアフィニティクロマトグラフィにより精製する。

一層詳細には、ハイブリドーマＢＢＭ、１　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ−２８）を産生ずるネズミ単りローン性抗体（抗ヒ）　ｂ−２−Ｍ　）を　５．０〜１０％（ν／ｖ）ウシ胎児血清を含有するＲＰＭｒ　１６４０　　媒質中成長させる。

５Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度の細胞１００ｍ１が得られた時、５００ｘｇで１５〜２５°Ｃで５分間遠心分離することにより細胞を捕集し、０１１５Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、ＯＩＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７゜０）（以下ＰＢＳという。）の５０Ｒ１１中に再懸濁させ、上記のように遠心分離させ同じ緩衝液５０ｍ１中に再懸濁する。

５．０〜３０日、好ましくは１０〜１５日前に０．５＋ｎｌ　のブリスタン（サーバ、ウェストベリー、ＮＹ）を接種した１５〜２５匹（生後１０〜１４週）のＢａ１ｂ／ｃ雌マウスの各に得られたＢＢＭ、　１細胞（０，２Ｘ１０’〜１× １０６細胞／ｍｌ）の０．１〜１．０ｍｌ　、好ましくは０−５ｍ１　（０，３ ×１０６細胞／ｍｌ）を腹膜膣内注射する。接種したマウスを隔日を次の１０日間観察し、１０日から始めてマウスを検査し腹水液を、隔日を越えないで１６〜１８ゲージ針（Ｂベベル）で腹腔の「穿刺」、すなわち穿通と腹水液を滅菌した１５ｍ１遠心分離管に徐々に排出させることにより捕集した。４°Ｃで一夜貯えて液を凝固させた後、試料を１５００ｘｇ　、２〜８°Ｃで１５分間遠心分離し、清潔なストロ−で凝塊と分離し赤みがかかった色の腹水液を捕集した。

捕集した液を５０ｍ】遠心分離管にため、このように穿刺されているすべてのマウスが死ぬまで−２０〜−７０°Ｃに貯える。同時に同じロフトの細胞で接種されたマウスの一層からこのように捕集された液のすべてを解凍し、集め、上記のように遠心分離し、５、Ｏｎ＋］試料に分画し、使用まで凍結した。細胞の生存率、成長速度及び生産速度；マウス数；及び接種、捕集及び凝固物質から液を得る全効率のような、用いた特定ハイブリドーマの特性に応じて約５０〜１５０ｍ１の液を捕集する。

抗体を多くの他の液体タンパク質から沈殿分離することにより抗体を液（血清、腹水、組織培養液から精製する。例えば、抗体は、硫酸アンモニウムにより次のように選択的に沈殿することができる。

解凍液の容積を記録し、液を水浴中４°Ｃに冷却しながらおだやかにかきまぜる。血清を用いる場合、等量の冷い蒸留水又は脱イオン水を徐々に加える。次いで、絶えずかきまぜながら固体結晶酵素縁硫酸アンモニウム（ライフ・チクノロシーズ・インコーホレーテッド（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｊｎｃ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）を次のような計算量に加える　（全体ｇ＝容積ｍ１Ｘ０．７０６ｇ／ｌａ１　ｘ　Ｏ，４）。次いで、混合物を少なくとも１．０時間かきまぜ、３０００ｘｇで２〜８°Ｃで４５分間遠心分離し、沈殿タンパク賞を可溶性物質から分離する。次いで、沈殿タンパク質を例えば、ＰＢＳを用いて最小容積、代表的に出発試料の約１．０〜１０％中に再懸濁し、４°Ｃの同じ緩衝液に対し緩衝液交換当り最小２時間、少なくとも３回の緩衝液交換、緩衝液対試料の容積比少なくとも５０：１で透析する。次いで、使用又は貯蔵前に試料を、３０００ｘｇ、２〜８℃、１５分間の遠心分離により及び／又は限外ろ過（０，２μｍフィルター寸法）により清澄化する。かなりの時間貯蔵する場合、使用前試料を再び清澄にする。脂肪状薄膜が液相上に漂って存在する場合、次の若干の段階を妨害しうるので、薄膜の下に注射針を入れて捕集するかガラスウール繊維フィルターパッドを通ずることにより除いて棄てる必要がある。

一層詳細には、１００ｍ１の腹水または血清を用いる場合、５６．４８ｇの硫酸アンモニウムと共に１００ｍ　ｌの水を添加する。沈殿抗体を５．０１のＰＢＳ中に再懸濁させ、別の５．抛１のＰＢＳを用いて、物質を透析ハング中に洗い込む。１．０リツトルの０．０１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に対して１８〜７２時間、各少なくとも１．０リンドルの少なくとも３回の緩衝液交換を用いて透析後、容積は約１５ｍ１である。（注：特別の必要に応じて異なる緩衝液を透析に用いる。すなわち、ＤＥ−５２（ウォットマン（Ｗｈｏｔｍａｎ）　＋クリフトン（Ｃ１ｉｆｔｏｎ）、　ＮＪ）カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーは、通常０．００１〜０．０５　Ｍ　　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５）、好ましくは０．０１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いる；又は高速加圧液体クロマトグラフィー（以下ｒ　ＦＰＬＣＪという。）は、通常０．０１Ｍ）リスー〇ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５〜８．５）好ましくは０．０２Ｍトリス−）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）を用いる。）得られた物質をＤＥ−５２カラム（２，５Ｘ１０ｃｍ）に適用し、例えば、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で溶離し、２．Ｏｏ＋１画分を捕集した。抗体の大部分を、平均タンパク質含量＞５．０ｍｇ／ｍｌ　（１，Ｏｍｇ／ｍｌに対し１．５のＡ２１＋＜１に基づ（。）を有する２抛ｌの全容積に対する５〜１５の画分で捕集する。

別に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）　（シグマ・ケミカル・コンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、セントルイス、ＭＯ）を用いて抗体を血清、腹水から沈殿させることができ、これは組織培養液のような大量の希薄タンパク質溶液について最も有用である。

一層詳細に述べれば、容積を記録し、物質をＯ′Ｃに冷却する。

おだやかにかきまぜながら、微細粒状ＰＥＧ−６０００を添加して所望％（ｎ／ｖ）の最終濃度にする。ＩｇＭに対しＰＥＧ−６０００の最終濃度は約５．０％（ｗ／ｖ）である。ＩｇＧに対し、ＰＥＧｆ６０００の最終濃度は約１２％艶／ ν）であるが若干の場合には２０％（−／ν）まで必要である。すべてのＰＥＧ −６０００の溶解後、物質を少なくとも１．０時間、２〜８°Ｃでかきまぜ続ける。次いで、物質を≧１５００ｘｇ、２〜８°Ｃ１３０分間で遠心分離し、沈殿物と可溶物とを傾斜により分離する。次いで、沈殿をＰＢＳの最小容積（試料容積の１．０％（ｖ／ｖ）　）中に溶解し上記のように透析し分画する。

別法では、抗体を凝固した血清、血漿腹水、又は組織培養液から精製するためにカプリル（オクタン酸）処理を行うことができる。

一層詳細には、濃酢酸を少量ずつ徐々に４°Ｃでおだやかにかきまぜながらそれに加え、ｐＨを４〜５に調節する。次いでカプリル酸（オクタン酸）を例えば、腹水又は血清１００ｍ１　当り３．３ｍｌの量で少なくとも１．０時間、２〜８ °Ｃでかきまぜながら徐々に加え、物質を３０００χｇ、２〜８°Ｃ１３０分間で遠心分離して沈殿した非免疫グロブリンと可溶性抗体を分離する。沈殿を棄て上澄みのｐｔ＋を１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉ　７．５）で７．０に調節し、上澄みをＰＢＳ　、又は上記ＤＥ−５２クロマトグラフィーを行うべき場合は０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析する。

上記のように精製した、抗体の０．１〜２０Ｂ／ｍｌ　、好ましくは１．０ｍｇ／ｎ＋１の溶液に０．ＯＩＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中の新たに洗浄したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ−１０（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）　、リッチモンド、ＣＡ）の等容積、好ましくは５．０ｍｌを加える。次いで、タンパク質とゲルを入れた管又は容器を密封し、これを、抗体をゲルマトリックスにカップリングさせるために一夜回転ぶたつき容器中に２〜８°Ｃで入れる。翌日、液を傾斜除去し、ゲルを少なくとも３回１０倍容積の冷ＰＢＳで洗浄する。沈降ゲルをＰＢＳ中の０．１？’ｌエタノールアミンの等容積中に再懸濁し、１時間４°Ｃでかきまぜ、ＰＢＳで広範囲に洗浄し、次いでカオトロピック緩衝液、例えば、２，８ｎ１Ｃｈのような試薬（これはＴ細胞特異性結合リガンド、すなわち、ｂ− ２−Ｍを結合抗体から溶離するのに用いうる。）で「ストリップ」する。次いで、ゲルをＰＢＳ中に再平衡させ、最後に０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）　ＮａＮ、を含有するＰＢＳ中に４°Ｃで貯蔵する。最初の使用に対し、また長期間、すなわち１週間より長、い貯蔵後、ゲルは、最初にカラム（１，０〜１．５　Ｘ２．５〜５ＣＩｍ）にそそぎ、ＰＢＳ　、２．８　Ｍ　ＭｇＣｈ及びＰＢＳの各５０−１で洗浄する。

次いで、Ｔ細胞特異性結合リガンドｂ−２−Ｍを培養ヒ）Ｂ細胞（ＨＥＬ　９２．１．７）　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＴＩＢ−８０）から調製する。一層詳細には、ＨＥＬ　９２．１．７細胞を１０％（ｖ／ν）ウシ胎児血清を含有するＲＰＭｌ　１６４０を用いる懸濁培養液中で培養する。約５Ｘ１０’細胞／　ｍ　］の密度の細胞約１０１００Ｏを捕集する。次いで、細胞をラーチ、ビー、ジー、　　（Ｌｅｒｃｈ、　Ｐ、　Ｇ、）ら、」罰Ｌｂｌ凹立し、　ＩＬ　：　３２１（１９８６）記載のようにｂ−２−Ｈに対し抽出する。

別に、細胞を冷たい３．０　Ｍ　ＭＣＩ　１０〜２０ｍ１中に懸濁させ、短詩装置いた後、処理細胞を３０００χｇ、２〜８　’Ｃで３０分間遠心分離し、可溶化表面膜放出タンパク質を不溶物から小粒状化分離するようにする。可溶化膜タンパク質に１．０％（ｖ／ｖ）のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００を加える。次いで、物質を各１．０リツトルの冷ＰＢＳに対して３回変えて透析する。

透析後、試料を１０００χｇで３０分間遠心分離することにより清澄にする。調製物を所要に応じて０．２μｍフィルターを用いてろ過することができる。

その後、試料を上記のように調製した抗−ｂ−２−Ｍ　　アフィニティカラムに適用し、Ａ　２１１゜における吸収により検出して溶出液中の吸収レベルが出発試料の０．１％未満になるか検出不能になるまで１００ｍ１またはそれ以上のＰＢＳで溶離する。次いで、Ｔ細胞特異性結合リガンド、すなわちｂ−２−Ｍを２．８　Ｍ　ＭｇＣｌ□で１〜２０ｍ１／ｈｒの流量で溶離する。試料、緩衝液及びカラムに応じて０．１〜２．０ｍｌ　の容積を有する個々の画分を捕集する。

Ｔ細胞特異性結合リガンドと緩衝液に対して適当な分粒特性を有するサイズ排除（分子ふるい）及び／又は脱塩（緩衝液交換）クロマトグラフィーを上記アフィニティカラムからの、ピークタンパク質含有画分について行って塩含量を２．８　Ｍ　ＭｇＣ１ｇから減少させ凝集物を天然物から分離する。中性の、非解離緩衝液、例えば、ＰＢＳ　、又はトリス−）１ｃ１．０．０５月　ナトリウムバルビタール、０．０５　Ｍ　　ホウ酸ナトリウム又は０．１　Ｍ重炭酸ナトリウムのような０．６〜９．６のｐＨ範囲を有する他の塩緩荷液をこのクロルトゲラフイーに対して用いることができる。若干の場合には、解離緩衝液、例えば、５．０　ＭグアニジンＨＣＩ、　　８．０台尿素、）！／　ドアＸ　−１００ノような０．１〜２．０％（ｖ／ｖ）デタージェントをこのクロマトグラフィーのため、特に集塊除去のために用いることができる。０．１〜１．０Ｍギ酸アンモニウム又は０．１〜１．０　Ｍ酢酸アンモニウムのような、凍結乾燥を容易にする揮発性緩衝液も用いることができる。凍結乾燥が不要な場合、不揮発性緩衝液の使用が好ましい。試料容積は、床容積の約１．０％（ｖ／ｖ）以下であり、ボイド位置は床容積の約０．３〜０．４であり、内部容積は床容積の約１．０〜１．２であり、最適画分の大きさはカラムの約１．０％である。両分の捕集は試料の適用時に始まる。流量は製品により特定され、中間点ないしそれより低い値を用いるのが好ましい。

次いで、得られた精製Ｔ細胞特異性結合リガンドの酵素消化を行ってそのＴ細胞特異性結合部を決定する。一層詳細には、２．０ｒａｇ／ｍｌの精製Ｔ細胞特異性結合リガンドを０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）のような適当な酵素消化緩衝液に溶解し、その１．０ｍｌ　にトリプシン、キモトリプシン、プロテア−ゼゼＫ、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓプロテアーゼ、Ｓｕｂｍａｘｉｌａｒｉｓプロテアーゼ、スブチリシン又はクロストリバインのようなタンパク質分解酵素の５０μｌを加えて酵素対基質の重量比１：５０を達成する。例えば、２０ｍｇ／ｍ１ＯＰＢＳ中の精製ｂ−２−Ｍの０．１ｍｌ　　を０．ＬＨ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）の０．９ｍｌに添加する。次いで、５０ μｌの２．０ｍｇ酵素水溶液を添加する。インキュベーションを約３７°Ｃで約１０〜１２０分の時間行う。この点で、ビー玉でゆるやかに蓋をした例えば１３　Ｘ　１００ガラス試験管中の反応が管を沸騰水浴中２．０〜４．０ｃｍの深さに５分間ひたずことにより終了する。

終結反応試料を次いで凍結乾燥し、又は若干の場合、その１００μｍを１０＋ｎｌのＰＢＳに加え、直接検定する。後者は、消化されたポリペプチドを分離する必要がない場合、すなわち、消化されたポリペプチドを与える限定されたタンパク質分解のための許容しうる反応条件を決定することのみが必要な場合、初期段階で実施される。この場合には、各酵素に対する反応の６反復セットをつくり、終結はインキュベーションの０．１０．２０．３０゜６０及び１２０分後に行う。トリプシン消化も、リジンとアルギニン感受性部位を区別するため、天然及びシトテコニル化工細胞特異性結合リガンドに行う。なお、シトラコニル化リジンは、トリプシン加水分解に耐える。

一層詳細には、多重調製は、各酵素と時点に・ついて次のように別個に行う。２０ｍｇ／ｍｌタンパク質をＰＢＳ中に含有する精製ｂ−２−Ｍ　　調製物０．１ｍｌを０．１ｊ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７，０）に加え、次いでトリプシン、又はプロテア−ゼＫ、又はキモトリプシン、又はサーモリシン、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓプロテアーゼ、又はクロストリパイン又はＳｕｂｍａｘｉｌａｒｉｓプロテアーゼ、又はスブチリシンの１．０ｍｇ／ｍｌ酵素溶液の０．０５ｍ１を加える。

各時間系列に対して、前項に適合するガラス玉でおおった１３Ｘ　１００ｎ＋＋＋＋ガラス試験管中で六つの同一調製物をつくりインキュベーションの０．１０．２０．３０．−６０及び１２０分後、５分間沸騰水浴中３．０ｃｍ以上の深さに管を浸漬することにより反応を終結させる。上記のように、比較できる反応（トリプシンのみに対する）をシトラコン酸無水物処理ｂ−２−Ｍポリペプチドの存在又は非存在で行う場合、リシン部位は保護されているので、アルギニン部位のみが***に感受性がある。

若干の場合、メチオニンを***するため、例えばＣＮＢｒを用いる選択的化学加水分解をギ酸中で用いる。他の剤による他の***部位又は条件が報告されている。（フォンタナ、エイ、（Ｆ。

ｎｔａｎａ、　Ａ、）、　ｍｅｔｈ、　ｉｎ、　シｖｌ二すユ、　　２５　　：　４１９　（１９７２）　；及びオゾルス、ジェイ　（Ｏｚｏｌｓ、　Ｊ、）ら、Ｊ　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５２　：　５９８６（１９７７’）　　；及びハンチカー、ビー、イー、　　（Ｈｕｎｚｉｋｅｎ、　Ｐ、Ｅ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｅ、　Ｃｈｅｑ、、、　２５２：５９８６　（１９７７）　　：及びノ＼ンチカー、ビー、イー、　　（Ｈｕｎｚｊｋｅｎ、　Ｐ、　Ｅ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ。

１ｆＬＬ：　５１５　（１９８０参照。）アミノ及びカルボキシル末端アミノ酸は、製造業者（ピアース・ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ロックフォード、　ＩＬ）により推奨される適当なプロテアーゼを用いるか自動順次分解、分離及び分析系、すなわち、［ポリペプチド・シークエンサー（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）」（アプライド°ハイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）＋フォスター・シテ４−．（Ａ）により決定される。また、ポリペプチドの全アミノ酸含量は、沸騰６．ＯＮ　ＨＣ１中２４．４８及び７２時加水分解後又は「アミノ酸分析器」　（ベックマン（Ｂｅｃｋａ＋ａｎ）　＋パロ・アルドＣＡ；及びアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ−９（Ａ）の製造業者により推奨される他の適当な方法を用いて分析される。

精製Ｔ細胞特異性結合リガンドから導かれる反応性ポリペプチドを検出するために標＊競争抑制免疫検定が行われ、その場合、試験被検物、例えば酵素消化試料を若干の希釈度で指示薬を標識化指示薬とともにインキュベートする前にリンガド結合種と共にインキュベートする。通常反復は、少なくとも三つの異なる希釈度、通常三つの１０倍対数、すなわち１／１０．１／１００及び１／１０００で行う。極めて高濃度又は高い親和性のＴ細胞特異性結合リンガドについては、ｌ／１０．０００．１／１００，０００．１／１，０００，０００以上までのようないっそう高い希釈レベルが用いられる。

この場合における標識化指示薬は、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＯ３）　（ピアース・ケミカル、ロックフォード、ＩＬ）のような適当な分子と組み合わせたｂ−２−Ｍである。他の標識化指示薬は、放射性同位元素、蛍光染料又はワザビダイコンベルオキシダーゼのような通常の発色酵素を含み、ビオチンの代わりに使用しうる。競争は、単クローン性抗体又はＴ細胞膜のような他のリンガド結合種で行うことができる。前者の場合、希釈した酵素的又は化学的消化物質とビオチン−ｂ−２−Ｍ複合体を最適希釈（これはその特定ロッドであらかじめ決まる。）で適当に予備インキュベーションした後、物質の混合物をＴ細胞又は固定化単クローン性抗体と反応させる。代表的な場合、ｂ−２−’Ｈの１．０ｍｇ／ｄ熔液、指示薬／タンパク譬比２．０で希釈は１　：　１０，０００である。同一リガントをＴ細胞膜成分として認識するように適当に選択する場合、すなわち、ぞれが天然のリガンドに結合することをＴ細胞と競争する場合、固定化単クローン性抗体を用いることができる。非生体物質の使用が敏感な臨界的な、時には利用できない生体物質に依存することが少ないこと、使用及び条件制御の容易さを含む多くの理由で好ましい。

競争種と固定化物（細胞又は抗体被膜マイクロプレート）の混合物を、例えば単クローン性抗体被膜マイクロプレートに対し３７°Ｃで１２０分間、又はＴ細胞の場合、２〜８°Ｃで３０分間インキュベートした後、細胞又はマイクロプレートを広＜　ＰＢＳで洗浄し、結合標識化種の存在を可能であれば直接、要すれば発色させて検出する。発色が必要な場合、アビジンとワサビダイコンペルオキシダーゼかフルオレセインとの複合体をＩ：２５０〜１：５０００の希釈で用い、ビオチン誘導体に対し上記のようにインキュベートし、洗浄し必要に応じてその存在を検出するために処理する。

酵素系がＴ細胞特異性結合リガンドを消化するがその活性をほとんど変えないことを同定した場合、反応性ポリペプチドは実際はＲＰ−ＨＰＬＣ，高電圧電気泳動及び上昇方式の薄膜クロマトグラフィーのような種々の技術によるポリペプチドであることが実証される。

ＲＰ−）ＩＰＬＣに対し、Ｃ−１８カラム（νｙｄａｃ　１５〜２０．Ｚ／Ｉ１１３００人細孔径３０×５Ω）を用いることができる。この場合には、水性リン酸トリエチレルアンモニウム（’ＴＥＡＰＪ　）　　（ｐＨ２，２５）とＴＥＡＰ中０．１％（ν／ν）水性トリフルオロ酢酸（以下ｒＴＦＡＪ）という。）を有する６０又は７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの混合物のこう配を溶離緩衝液として用いることができる。分析カラムに対して２．Ｏｒｔ１１／ｍｉｎ及び調整カラムに対し７て８０〜Ｉ２０　ｄ／ｗｉｎの流量を用いることができる。ポリペプチドはＡ２□０における吸収をモニターすることにより検出される（ホージャー、シー、　　（Ｈｏｅｇｅ　ｒ　＋　Ｃ−）らＢｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ、　２　：　１３４（１９８７）参照。）高電圧電気泳動に対し、ホヮントマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ　）　３　ＭＭ紙のような固体支持体を用いる２次元分離を行う。酵素消化物質の全量１００〜４００　ｕｇを、２３　Ｘ　２３ｃｍ紙の、各寸法の１．０ｃｍ内側の角のスポット上に５．０〜１０μ！試料の酵素消化物質の多重添加と乾燥により支持体上に装填する。ピリジン：酢酸：水（２５：１：　２２５（ｖ／ｖ／ｖ））の緩衝液系を用い、２．０ｋｖと３５〜６０ｍＡで８０分間２〜８°Ｃで高圧電気泳動を行う。取り出し乾燥後、支持体を９０度回転し次いで薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に対する下記溶媒中で平衡させ同様な仕方でクロマトグラフを行う。乾燥後、ポリペプチドは、０．０２１５％（Ｗ／Ｖ）の市販ニンヒドリン噴霧又はアセトン中のフルオレサミン色素（ホフマンーラロッシュ（Ｈａｆｆｍａｎｎ−Ｉａｒｏｃｈｅ、ナツトレイ、　ＮＪ）　　とＵＶ光の使用により検出される。

上昇方式のＴＬＣに対し、３．０μ２の凍結酵素消化物質を１０％（ｖ／ｖ）酢酸に２．０■／−で溶解する。有用な市販ＴＬＣプレートの中にニー、メルク（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）　（ダルムスタント、***）がら得られるものがある。試料（３，０μりは、ピリジン：ｎ−ブタノール：酢酸：水（５０：　７５　：　１５二６０（シ／シ／ｖ／ｖ））の溶媒系で４°Ｃで飽和した雰囲気上に置いたプレートに適用される。２時間平衡にした後、プレートを溶媒中に約１．０ｃｍの深さに入れ一夜展開させる。通常、溶媒先端は約１８Ｃ１１上る。次いで、プレートを取り出し室温で乾燥する。乾燥後、ポリペプチドを上記のように検出する。

次いで、このように検出したポリペプチドを０．０７％（ν／ν）水酸化アンモニウムでプレートから溶離し、次いで競争制御分析を行う。（緩衝液などで適当な希釈が可能である場合、最初に凍結乾燥して濃縮する。）分離したポリペプチドをプレート（又は適当であれば紙）上に２．０％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで１５分間固定し、後に使用される酵素複合抗体と同じ種の２．０％（ν／ｖ）血清と、０．１針塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ）リス（ｐＨ８，０）中の２．０〜１０％（ν）Ｖ）ウシ血清アルブミンとの混合物で「封鎖コすることができる。次いで、固定ポリペプチドの反応性を例えば、ワサビダイコンペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼのようなビチオン −又は酵素−複合抗体の約０．１　μｇと、これと共に１〜１８時間、４〜３７゛Ｃでインギュベ−１・することにより反応さセ、同し緩衝液で洗浄し、次いで標準ウェスターン免疫学法（バイオチク（Ｂｉｏｔｅｃｈ）　、ロックビル、　ＭＤ）により沈降色で発色することにより分析する。

別に、ポリペプチドが反応する標識指示薬が抗体である場合、標識されない抗体を新たに調製した０、　１５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中に一般に約０．１〜１０μｇ／１ａｌｌの濃度で溶解し、次いでマイクロタイタープレートの穴当り１００〜２００μ２の量で加える。（イミュンロン・ダイナチク（Ｔｍｍｕｎｌｏｎ　Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、アレクサンドリア、ＶＡ又はＢＤ、オックスナード（Ｏｘｎａｒｄ）　、　ＣＡ）　。

この被覆抗体は、親分子及びその誘導体と反応性があるが、標識化された抗体と異なる特異性を有する。したがって、それは、他の抗体の結合と競争したり、妨害したり、刺激したりしなくて、むしろ他の単クローン性抗体が結合するリガンドに対する付着手段として役立つのみである。プレートは、２時間室温でおおい、ＰＢＳ中０．１％（ν／■）トウイーン−２０又はトリトンＸ−１００％のような他のおだやかなデタージェントと共に０．０１〜５．０　（ｖ／ν）ウシ血清アルブミン（以下ｒＢＳＡ　Ｊという。）で４°Ｃで３〜５回洗浄する。必要に応じて、０．０１％（ν／ν＞　ｐｖｐ及び／又は５．０〜２０■／ｄの、デキストロース又はスクロースのような糖を安定性のため最後数回の洗浄液中に加え、乾燥し暗い湿気のない環境中に４°Ｃで貯える。更に、必要に応して、穴はＢＳＡでブロンキングする前に０．２５〜２．０％（ｖ／ｖ）　、好ましくは０．２５％（ν／ｖ）のグルタルアルデヒドのような試剤で固定することができる。

０．１％デタージェント、例えばｌ・ウィーン−２０を含有するＰＢＳ中のポリペプチドの適当な希釈試料（１：１００〜ＬＯＯ０，０００）え、３７°Ｃで３０分〜２４時間インキュベートする。次いで、穴を５回ＰＢＳで洗い、同じ緩衝液中の適当な希釈度の検出複合体（１７１０００〜１００，０００）を加え、上記のようにインキュベートし洗浄する。次いで、基質を加え検出を上記のように行う。

更に、最終生成物のアミノ酸組成を決定し、次いで予見したアミノ酸組成と比較する。５〜１０％より大きい偏差を、生成物が予期したものであること及び偏差が酵素消化を決定するために用いた加水分解条件によることを実証するために調査する。

病気と関係する特別の抗原又はそのエピトープも、この発明に決定的なものでない。このような抗原の例は、ネコのふけ（ｃａｔ　ｄａｎｄｅｒ）抗原、ダストダニ糞（ｄｕｓｔ　ｍ１ｔｅ　ｆｅｃａｌ）抗原のようなアレルゲン及び小麦グルテニンのような食物アレルゲン；又は胸腫瘍細胞特異性標識である上皮成長因子（以下ｒＥＧＦ。

という。）又は直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び前立腺腫瘍のそれぞれ関係するがん胎児性抗原（以下ｒＣＥＡ　Ｊという。）若しくはブロスタート酸（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ａｃｉｄ）ホスファターゼ（以下ｒＰＡＰ　Ｊという。）のような自己誘導抗原；細胞表面抗原；又は糖尿症、リウマチ様関節炎及び甲状腺炎のような自己免疫と関係する抗原を含む。

更に、抗原又はそのエピトープが関係する病気の特別の原因物質も、この発明に決定的なものでない。病気の原因物質の例はプリオン（ｐｒｉｏｎ）　；　ｔ（ＩＶ、単純ヘルペスウィルス（以下ｒ　Ｈ５Ｖ　ｊという。）、エプスタイン− パルウィルス（以下ｒＥＢＶ　Ｊという。）サイトメガロウィルス（以下ｒＣＭＶ　Ｊという。）、ヒトＢリンフナトロピンク（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス（以下ｒＨＢＬν」という。）、水痘、帯状ヘルペスウィルス（以下ｒＶＺＶ　Ｊという。）、アデノウィルス及び肝炎Ｂウィルスのようなウィルス；連鎖球菌、ジフテリア、マイコバクテリウム及びトロポネマ（ｔｒｏｐｏｎｅ＋＊ａ）のような細菌；カンジダ属のような菌類；シアルシア属のような原生動物及び変形体、カイチュウ属及びリーシュマニア属のような寄生体を含む。

更に、予防、治療又は診断が望まれる特別の病気は、本発明に決定的なものでなく上記抗原又はそのエピトープに関係する任意の病気を含むことができる。

最近、次の配列を位置９０〜１０２．１５〜４０及び２２０〜２２３にそれぞれ有するプリオンタンパク質と反応する抗体をつくりうる若干のポリペプチドが報告された。（バリー、アール５エイ。

（Ｂａｒｒｙ、　　Ｒ，八、）ら、　ＪＬ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１４０　：　１１８５（１９８８））　　　：ＧＱＧＧＧＴＨＮ叶ＮＫＰＧＧＣ（肚＝１９６０）ＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＹＲＹＰＧＧＣ（ＭＷ＝３６８５）ＣＧＧＫＥＳＮＡＹＹＩ）ＧＲＲＳＳＡ　　　　　　　　　　（？１Ｗ＝２１０９）チャ７プマン、エム、ディー（Ｃｈａｐｍａｎ、　Ｍ、Ｄ、）　　ら、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１４０　：　８１２（１９８８）にネコのふけ抗原（Ｆｅｌ　ｄ　Ｉという。）に対し、位置１〜３３における抗原配列：ＧＩＴＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱν八ＱＹＫＡＰＤＶ　　　　（ＭＷ＝４２１３）又はそへ誘導体：ＧＩＴＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＰＤνＣ（ＭＷ＝４３３１）が記載される。

アデノウィルス型１２の早期領域タンパク質ＥＩｂとグリアジン（小麦グルテニンタンパク質）により共有される配列は、腹腔（ｃｏｅｌａｉｃ）病に重要な意味を有すると信じられている。（カラギアニス１　ジエイ、ニス、　　（Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ、Ｊ、Ｓ、）　　ら、Ｌａｎｃｅｔ督１　　：　８８４　（１９８７）及びカグノフ、エム、エフ、　　（Ｋａｇｎｏｆｆ、Ｍ、Ｆ、）ら丈、ＥＸＰ、伽すユ　」貼：　１５４４（１９８４）参照。）それは、り′リアジン中位置２１１〜２１７にある：ＦＲＰＳロＩＩＩＮ　　　　　　　　　（？ＩＷ＝９８３）及びその誘導体ＦＲＰＳＱＱＮｇｇＣ（ＭＷ＝１２５５）である。

アデノウィルスとグリアジンの間に共通に共有される上記エピトープは、自己免疫、アレルギー性及び伝染性条件の共同例と考えることができる。自己免疫及び伝染性条件と関係する他のエピトープは、ミコバクテリア精製タンノくり質誘導体（ＰＰＤ）のそれである。このエピトープは、動物におけるアジュノ〈ント誘起関節炎に意味を有する。（ライダー、オー（Ｌｉｄｅｒ、　０．）ら匡、■旦、に封、拡　居通、且：　４５７７（１９８７）参照。）ミニリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）　　とコラーゲンのエピトープ。

（ｘ７　７７、　’ｙ−イ・イー　（Ｅｌｌｅｒｍａｎ、　Ｋ、Ｅ、）　　ら、ハ勉匹。

■、Ｌ　：　２６５（１９８Ｂ）　　；ライダー、オーら、鋭江匹ｅ　　２３９　：　１８Ｈ１９８８）；及びカキモトケイら、Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４０　　：　７８（１９８８）参照。）は、それぞれ自己免疫脳を髄炎と関節炎に含まね、るエピトープの例である。このように、これらのタン）＜り質のエピトープは、本発明において決定し用いることができる。

体液性免疫と関係し、したがってこの発明Ｇこおし）で用し）うるＨＩＶの抗原又はそのエピトープの例は、ｇｐ　１２０及びｇｐ　４１のような旧Ｖのエンヘロープタンパク質を含む。

旧Ｖ　ｇｐ　４１は、位置５９４〜６０５に次の抗原性配列を有する。

（ハナボアー、ビー　（Ｂａｎａｐｏｕｒ、　Ｂ、）　　ら、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋υ９　　：　４０２７（１９８７）参照。）：Ｇ（１／Ｍ）讐ＧＣＳＧＫ　（Ｌ／Ｈ）　（Ｉ／Ｌ）　Ｃ若干の非臨界的位置に置換を有する遺伝子変異体が存在するので、これらの非臨界的位置は、「（）」により囲まれたこれらの位置に対する可能なアミノ酸と共に「／」により示した。

したがって、例えば、ＨＩＶ　ｇｐ　４１の上記抗原性配列の誘導体は次のようでありうる。

ＧＩＷＧＡｂｕＳＧｌｎｌＣ（ＭＷ＝１３８９）若干の動物実験によると位置６０９〜６２０における旧Ｖ　ｇｐ４１の次の隣接領域：ＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳ　　（ＭＷ＝１７００）は、動物では免疫原であるが、ヒトでは免疫原として存在しない場合があることが示される〔グナン、ジェー、ダブリュー。

等、（Ｊ、　Ｔｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１５６：２６１（１９８７）　〕、免疫原でないことは１つ以上の欠陥の結果であり得る。かかる欠陥の一つは適当なレセプターの欠如に基づくアグレトーブを認知し得ないこととすることができる。

同様に対応するＴ細胞は、望ましいＴ細胞クラスに対し存在し得す、例えばエピトープを認めるヘルパーＴ細胞が望ましいがエピトープを認める細胞障害性Ｔ細胞だけが存在する。従って両頭域を含む、以下に示すような他のポリペプチドは、本発明の異種官能性細胞免疫剤の合成に有用であると考えられる。

Ｇ　（Ｔ／Ｍ）　ＷＧＣＳＧＫ　（Ｌ／Ｈ）　（１／Ｌ）　ＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳまたは一つの形態では：ＬＧＬＷＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳ　　　　（ＭＷ＝３１１８）或いはその誘導体：ｃｇｇＬＧＬＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＮＡＳＷＳ　　　（ＭＷ＝３３８９）ＬＧＬＷＧＣ５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳｇｇｃ　　（ＭＷ＝３３８９）内側システィンの敏感な位置がアミノ酪酸（Ａｂｕ）で置換される場合には、エピトープは次に示す配剤を有する：ＬＧＬＷＧＡｂｕＳＧＫＬＩＡｂｕＴＴＡシＰＮＡＳＷＳｇｇｃ　　　　（ＭＷ＝３３５３）他の旧Ｖエンベロープタンパク質はｇｐ１２０である。液体性免疫に関連するそのエピトープの一つは位置１０８〜１１９における次の配列を含む（グナン、ジエー、ダブリュー等、Ｊ、　　Ｉｎｆｅｃｔ皿＋ｌ　１５６：２６１　（１９８７）参照）を含む：ＩＬＳＬＷＤＱＳＬＫＰＣ（ＭＷ　＝１６９０）シャン（Ｃｈａｎｎ）　、ティー、シー、等、ＥＭＢＯＪ、、　５　：３０６５（１９８６）　；　　シャン、ティー、シー、等、Ｅｍ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋１６　：１４６５（１９８６）　；　　サネディー。アール、シー、等、Ｌ　肛１．川堕。

２６２　：　５７６９８１９８７）　；　　およびサネディー。アール、シー等、鉢圏匹ｅ、　　２３１：　１５５６（１９８６））には位置５０３〜５３２におけるこれ等の配列位置命名法を用い同じエピトープが記載されている：ＶＡＰＴＡＫＲＶＶＱＲＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＧ　　　　　　　　　（ＭＷ＝３３４０）またはその誘導体：ＶＡＰＴＡＫＲＶＶＱＲＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＧｇｇｃ　　　　　（ＭＷ＝３６１１）抗体発生の表現で、ＨＩＶに対し免疫原でることが示される第１合成ポリペプチドの一つは位置７３５〜７５２におけるｇｐ４１タンパク質に対しては（Ｒ／Ｄ）　ＲＰＥＧ　ＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤＲ（Ｓ／Ｇ）　Ｃまたはその一形Ｂ：［？ＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＦＩＤＲＤＲ５Ｃ（ＭＷ＝２５７０）であり（サネディー。ビー、シー、等、蚤ｊ至部匹工２３１：　　１５５６（１９８６）参照）、従って全体でまたは一部で有用なポリペプチド配列であると考えられる。

サイモンシン　アルファーに類似することにより、配置９２〜１０９における旧シタンパク質、ｇａｇ　ＰＩ３の他の一つ：ＩＤシＫシＴＫＥＡＬＥ［ＥＥＥＱＮ　　　　（ＭＷ＝２４３８）またはその誘導体：ａｂｕｇｇｌＤＶＫＤＴＫＥＡＬＥＫＩＥＥＥＱＮ　　　　（ＭＷ＝２６９１）ＩＤＶＫＤＴＫＥＡＬＥＫ　ＩＥＥＥＱＮｇｇｃ　　　（ＭＷ　＝　２７０９）は液体性抵抗体を発生ずるため免疫化するための候補として議論されてきた（サーリン、ビー、等、影江但Ｉｃｅ、副録：１１３５（１９８６）参照）。サイモシン　アルファーに対する位置関係はサイモンシン　アルファーが免疫系ホルモンまたは免疫変調体であると考えられるので細胞免疫に対する要求および関連を強力に示唆する。

グナン、ジェー、ダブリュー、等、」、紐ム皿、■ｙｌｈ鉦：　２６１（１９８７）により記載されたｐ１７およびｐ２４の領域からの他のＨＩＶｇａｇポリペプチドは本発明において有用であると考えられる。これ等の誘導体は重要でありこの理由は若干の動物が抗体を認め抗体をこれ等のエピトープにし血清抗体をこれ等のエピトープを用いるインビボ検定において中和するからである（ホー、ディー、ディー、等ユ、ｕ皿１６皿：　２０２４（１９８７）　；およびサーリン、ピー、等、　）１μ匹見、匪：　１１３５（１９８６）参照）。

上述の如＜　ＨＳＶ　ＥＢＶ　ＣＭν、　ＨＢＬνおよびｖＺｖ抗体または本発明で有用であると考えられる。例えばツウソヒ（Ｚｗｅｉｇ）　、　　エッチ。

等、Ｊ　　　Ｖｉｒｏｌ、　　５１　：　３４０（１９８４）ニはＨＳＶ　ｇＣニ対し、位ｆ１２８１３９における次に示す抗原配列：ＤＲＲＤＰＬＡＲＹＧＳＲ（ＭＷ＝　１６５９）またはその誘導体ＤＲＲＤＰＬＡＲＹＧＳＲｇｇｃ　　　　（ＭＷ　＝　１９３２）が記載されている。

ホソシュ、ティ、エル、等、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１　：　３６０７（１９８７）　；およびウェイジャー、グブリュージェー等、Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、＋　６２　：５０１、　（１９８８Ｎ：：はＨＳＶ　ｇＤニ対し、位置１〜３０、特に位置９〜２１における抗原配列、特に位置１０．１６および２０におけるアミノ酸が記載されている　：ＫＲＡＬＡＤＡＳＬＩＩＩＡＤＰＮＲＦＲＧＩ＜ＤＬＰＶＬＤｔｌｌＬＴＤ　　　　（？１Ｗ＝３８８８）またはその誘導体：ＫＲＡＬＡＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱＬＴＤｃ　　　（ＭＷ＝４００９）キンヒングトン（Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ）　＋ビー、アール、等、Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ。

６２　：　８０２　（１９８Ｂ）にはν２νの主ＤＮＡ結合蛋白質ム二対しカルボキシ末端における抗原配列が記載されている：ＰＩＫＨＮＧＩＴＭＥＭＩ　　　　　　　　　（ＭＷ＝　１６０２）またはその誘導体：ＰＩＫＨＮＧＩＴＮＥＭｌｅＥＮｌｅｌｇｇｃ　　　　（ＭＷ　＝　１８１７）ＡｂｕｇｇＰＩＫ）ＩＮＧＩＴＮｌｅＥＮｌｅｌ　　　　（ＭＷ＝　１７９９）オーバー、ディー、イー、等、ムＶ江ｏ１．　６２　：　１１０８　（１９８８）にはＥＢＶ　ｇｐ８５に対し位置５１８〜５３３における抗原配列が記載さている　：Ｃ３ＬＥＲＥＤＲＤＡＷＨＬＰＡＹＫ　　　　　　（？讐＝　２４６７）肝炎Ｂウィルスの表面抗原蛋白質は位置１４４〜１５９における次の抗原領域を有する（パフ（Ｐｆａｆｆ）、エイ、エム、等、凹ム１　：　８６９（１９８２）参照）ＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬ　　　　　（ＭＷ　＝　２０７９）その誘導体：ＬＩ？ＧＤＬｇシＬＡＱＫシＡＲＴＬｇｇｃ　　　　　　　　（ＭＷ　＝　２３５０）或いは位置１３９〜１５８における他のものの命名法を使用すると（ハートナガール（Ｂｈａ　ｔｎａｇａｒ）　、ビー、ケイ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、とＬＵ鎖、　７９　：　４４００（１９８２）参照）：ＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦ　　　　（ＭＷ＝２５７３）その誘導体：ＣＴＫＰｆＤＧＮＡｂｕＴＡｂｕ　ＩＰＩＰＳＳｌｌｌＡＦ　　　　（ＭＷ　＝　２５３７）である。

肝炎ＢウィルスのｐｒｅＳ−２領域はまた特に位置９９〜１２１において抗原（ジョリベソト、エム、イー、等、Ｉｎｆｅｃｔ　　＆　　Ｉｍｍｕ匹１．、几：　１４９８　（１９８７）およびオウビバート、エフ、エム、等、Ｉｎｆｅｃｔ　　＆　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、、旦：　２６１（１９８４）参照）：ＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＳＴＴＳＴＧＰＣ（ＭＷ　＝　２７３１）その誘導体：ＤＹＱＧＮｌｅＬＰＶＡｂｕＰＬＩＰＧＳＳＴＴＳＴＧＰＣ（ＭＷ−２７３１）である。

細菌として重要なエピトープはビーチレイ、イー、エッチ。

等、」、旦ｐ、上、、」並：　６４７　（１９８７）に、例えば連鎖球菌の３種の菌のＭ蛋白質の第１の約ｌＯのアミノ末端領域の連鎖球菌エピトープおよびこれ等３種の異なるアミン末端配列を含むポリペプチドＴＶＴＲＧＴＩＳＤＰＲＪＦＰＲＧＴＶＥＮＰνＡＴＢＳＱＴＤＴＳＥＫｃ　　（ＭＷ＝４３０１）またはその誘導体が記載さており、ここで可能な反応性基を有する、リシンがグリシンにより１換され、この位置においてそれが他の変体中に見出されない添加システィンに隣接しているので、主エピトープの外側にあることを示唆する：ＴＶＴＲＲＧＴＴＳＤＰＲＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ５ＱＴＤＴＳＥＧｃ　　　（ＭＷ−４２３０）ジョリベント（Ｊｏｌｉｖｅｔ）、エム、イー、等、Ｔｎｆｅｃｔ　　＆Ｉｍｍｕｎｏ１．．５５　：　１４９８　（１９８７）には位置１８６〜２０１におけるジフテリアトキシンに対する次の抗原配列：ＣＡＧＮＲνＲＲ５ＶＧＳＳＬＫＣ（ＭＷ　＝１９４５）が記載さているかまたは内部システィンがアミノ酪酸により置換され２つのアラニンを添加する場合のその誘導体が記載されている：ａａＡｂｕＡＧＮＲＶＲＲ３ＶＧｓｓｌＪｃ　　　　　　（ＭＷ　＝　２１２３）Ｃ５Ｐ−１と称せられる、ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　＋　ノウレンジ（ｋｎｏｗｌｅｎｓｉ）等のような種に制限されないがかかる種を含む、プラスモジュール（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のサーカムスボロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉ　ｔｅ）段階蛋白質は種によって左右されるが内部反復配列を有する（リーズ、エル、ディ、等、Ｉｎｆｅｃｔ　　＆　Ｔｍｍｕｎｏｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　ｎＬ：　　６２９　（１９８７）　；　　およびグツト、エム、エフ。

等、５ｃｉｎｃｅ、　２３５　：　１０５９　（Ｉ９８７）参照）。Ｃ５Ｐ−１の次の抗原配列は本発明において有用なエピトープであると考えられる：ＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＣまたは（ＮＡＮＰ）４Ｃ（１’ｌ秤＝１９９４）Ｙ　（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱＰ）　２Ｃ（ＭＷ　＝　２９２５）ｃ　（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱＰ）　ｚＹ　　　　　（ＭＷ　＝　３Ｉ０６）ワクチンに使用されるＣ３Ｐ−１の他の配列は次の反復配列＝［（ＮＡＮＰ）　ｌ５（ＮＶＤＰ）コ　２　　　　　（ＭＷ＝１５０４７）並びに位置１０３〜１１６および位置３２３〜３４９において夫々次の２つの配列ＥＫＬＲＫＰＫ）ＩＫＫＬＫＱＰ　　　　　　（ＭＷ　＝　１９９２）ＮＮＥＥＰＳＤＫＨＩＥＱＹＬ■ＩＫＮＳＩＳＴＥＷＳＰＣ（肚＝　３８４９）を示す（グツド、エム、エフ、等、５ｃｉｎｃｅ、　２３５　：　１０５９　（Ｉ９８７）参昭）。後者の配列は「ヘルパーＴ細胞エピトーブス」により直接または間接的に免疫応答の発生に使用されてきた。最後の配列は若干の表現型の１−ＡおよびまたはＨ−２ＭＨＣ遺伝子により制限されることが示された。

次の配列を有する他の変形体タンパク質、即ち３５ｋｄタンパク質のアミン末端ポリペプチド配列は体液性応答に使用されてきた（バタローヨ、エチ、イー、等、Ｎａｔｕｒｅ、　３２８　：　６２９　（１９８７）参照）：ＷＧＧＰＡＮＫＫＮＡＧ　　　　　　　　　　　（ＭＷ＝１２３７）またはその誘導体：ａｂｕｇｇＷＧＧＰＡＮＨＮＡＧ　　　　　（ＭＷ　＝　１６２２）ＷＧＧＰＡＮＫＫＮＡＧｇｇｃ　　　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　１６４１）使用することができるマラリアタンパク質から他のポリペプチドはエトリンガ−、エッチ、エム、等、ムｆｍｕｎｏ１．．１４０　：６２６　（１９８Ｂ）　；　　サドフ、ジェイ、シー、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２ＡｆＬ：３３６（１９８８）　；　　リチャーズ、アール、エイ、等＋　　　　Ｉｎｆｅｃｔ　　＆Ｉｍｍｕｎｏ１．，５６：　６８２　（１９８８）　；　　リッチマン、ニス、ジェイ１等− 跋！ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ並ｄ、　Ｓ虱、那Ｌ　菫：　１６６７　　（１９８８）　；ワイズ、ダブリュー、アール、等」匹ｃ、Ｎａｔ１．　　Ａｃａｄ、上、進呈：　５７３　（１９８８）　；　　グツド、エム、エフ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１４０　：　１６４５（１７８８）　；グレーク、ディー、エイ、等、Ｊ、　　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４０　：　１９８９　（１９８８）　；およびグツド、エム、エフ、等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　　８５　：　１１９９　（１９８Ｂ）に記載せれているものを含む。

、ｔ　ハ、　ティー、イー、等、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２　：　１１０８　（１９８８）にもまたヒトＣ９からの対照ポリペプチド位置３９９〜４１３における補充系列が記載されている：ＣＬＩＤＤＶＶＳＬＩＲＧＧＴＲＫ　　　（ＭＷ＝２０１５）他の対照として、足および口の病気ウィルスに対するエピトープ配列を使用することができ、特殊なＶＰ−１は位置１４１〜１６０において次の配列を有しＣピットル、ジエイ、エル、等Ｎａｔｕｒｅ２９８　：　３０　（１９８３）参照）これにシスティンがアミノ酸において添加される：ｃＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ　　　（ＭＷ＝２６５２．２）このエピトープは上記ポリペプチドと同様の大きさおよび組成のもので病気若しくは病気の原因物質に関連する抗原またはそのエピトープ或いは他のＴ細胞特異結合リガンドの置換に対する対照配列として役立つことができる。アミノ末端にシスティンが付加されるため、それはスルフヒドリル結合を使用する若干の機構により結合することができる。

尚他の対照配列は発病させないまたは病気でない条件の代表であると考えられる、位置８１〜１０４におけるシトクロムＣの次の配列である（ホックス、ビー、ニス、等、ＪＬＩｍｍｕｎｏｌ、　＋　１３９：　１５７８　（１９８７）参照二ＩＦＡＧＩＫＫＡＮＥＲＡＥＬＩＡＹＬＫＱＡＴ）［Ｃ（Ｍ讐＝　３０９４）病気若しくは病気の原因物質に関連する抗原またはそのエピトープ或いは対照ポリペプチドは市場で入手し得るかまたは注文して合成され（アプライドバイオシステムス、フォスター市。

カリフォルニア（ＣＡ））、バイオリサーチ（サン　ラフエル、　ＣＡ）ケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルス　（ケンブリッジ英国）、バケム　インク　（Ｉｎｃ、）　　（）−ランス、　　ＣＡ）、サーバ（ウエストパーリイ、ニューヨーク（ＮＹ））若しくは天然給源から得られる。

病気若しくは病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープは乾燥粉末として−２０〜−７０″Ｃの乾燥雰囲気中に貯蔵される。

本発明の異種官能性細胞免疫剤の粒子の大きさは絶対的のものではない。一般に、異種官能性細胞免疫剤は長さが約２０〜１００のアミノ酸、好ましくは約４０〜６０のアミノ酸である。

本発明の二官能価結合剤を使用することにより製造することができる。本発明においてＴ細胞特異結合リガンドと病気または病気の原因物質と関連する抗原或いはそのエピトープと共有結合的に結合するのに使用し得る二官能価結合にはＮ− サクシンイミジルー３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート（以下ｒ　５ＰＤＰ　Ｊと称す）　（フォーマシア、ピスカタウエイ、二、！−シャーシー（ＮＪ）があり、これは活性化し、システィンの２つのスルフヒドリル基の間に架橋を形成するかまたは誘導された（プロビネーテソドーチオリエーテ・ノド（ｔｈｉｏｌｙａｔｅｄ）第１アミノ基とシスティンの間に架橋を形成し；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−サクシミドエステル（以下ｒＭＢｓ　Ｊと称す）（ビールス　ケミカル、ロツクフオートイリノイ（ＩＬ））があり、これはアミノ基を活性化し次いでスルフヒドリル基をシスティンのスルフヒドリルに結合して２つのポリペプチド間にジスルフィド結合を形成し、更に１−エチル−３− （３−、’メチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下ｒＥＤＣＪと称ス）（ビールスケミカル５　ロックフォード、イリノイ）があり、これは一つのポリペプチドのカルボキシル基を活性化し次いで引き続きこれを他のポリペプチドのアミノ基に付加することにより２つのポリペプチドを架橋することができる。Ｎ− イソシアノ−エチルモルホリン、ビス−ジアゾ化−ベンジジン、ベンゾキノンおよびグルタルアルデヒドはポリペプチドを結合するのに普通使用される他の試薬であり、本発明において使用することができビールス（Ｐｉｅｒｃｅ）ケミカル、ロックフォード、　ＩＬ；　イーストマン　コダックケミカルス、ロチェスター、　ＮＹ　、サーバ。

ウエストバーリイ、　ＮＹ　、シグマケミカル　コンパニー、セントルイス、　ＭＯおよびイー、アーク、ダーンスタンド、ドイツ連邦共和国から入手できる（ブライアンド、ジエイ、ニス、等　ＬＩｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈ　　　７８　：　５９　（１９８５）　；キタガワ、ティー、等Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７９　：　２３３　（１９７６）　；リウ、エフ、ティー、等Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、、　１８　：　６９０　（１９７９）　；　　ターニング　（Ｔｅｒｎｙｎｃｋ）ティー等、　　Ｔｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、、　１４　：　７６７　（１９７７）　：およびドレビン、エッチ、等、　Ｊ、　　Ｔｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ　　　７７　：　９　（１９８５）　　参照）。

本発明の異種官能性細胞免疫剤はまた科学的合成によるがまたは！ＪＩ換え体ＤＮＡ技術を用いることにより製造することができ、即ち、この場合Ｔ細胞特異結合リガンドと病気若しくは病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープのスクレオチド配列が相互に隣接し適切な裏機ベクターに挿入されて単一分子が組換え体によって合成される。

本発明の異種官能性細胞免疫剤を製造するために、ポリペプチドの化学的合成においてどのアミノ酸を安定な（反応性の低い）アミノ酸で置換するか、例えばメチオニンをノルロイシンで置換するかまたはシスティンをアミノ−酪酸で置換することができるかを決定することが配列を分析するのに先ず必要である。望ましい配列の一つはシスティンを含みアミノ−酪酸による置換が実際的でない場合には、このポリペプチドをＭＢＳ若しくはＥＤＣを用いて結合させることができる。システィンをジスルフィド結合により他のシスティン若しくは他の反応性基に結合させることが必要でない場合にはシスティンのアミノ−酪酸による置換が実際的である。システィンがポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端にある場合にはＴ細胞特異リガンド結合部分またはエピトープにあることは少ないようである。従ってこの位置における結合に二官能価結合剤群としてＭＢＳまたは５ＰＤＰを用いて行うことができる。

合成反応または他の条件に左右されるが、他の反応性基、例えばりシンのイプシロンアミノの如き基、アルギニンおよびヒスチジンの基およびアスパラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル基若しくはその誘導基の保護が必要でない場合がある。この場合Ｔ細胞特異結合リガンドと病気若しくは病気の原因物質に関連する抗体またはそのエピトープの結合を直接進めてあらかじめ保護を行うことなしに特異官能性細胞免疫剤を製造することができる。

リジンのイプシロン　アミノ基の一時的封鎖の如き、保護はポリペプチドを無水シトラコン酸、無水マレイン酸若しくはアミノ基の水素を可逆的に置換°する他の同様の酸無水物で予備処理することにより達成される。特異官能性細胞免疫剤を構成した後Ｈが置換される場合アミノに付加される酸基を次いで酸処理により置換する。

金城港じ−」理ｆｌｕ九肚支ゑ本例は５ＰＤＰを用いてｂ−２−ＭのＴ細胞特異結合リガンド部分に共有結合するＨＩＶエピトープを含む特異官能性細胞免疫剤の製造を示す。

ＡｂｕＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳ　　　　（ＭＷ　＝　１６８２）で表される旧ν ｇｐ　４１エピトープの誘導体３．４ｍｇ　（２，０ｐ　ｍｏｌｅ）を円錐形容器内で１５〜２５°Ｃの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７−５）　１．ｏｍｌにかきまぜながら溶解した。この溶液に新たにつくった５ＰＤＰ溶液０．１ｍｌ　（２０ａ　ｍｏｌｅ）を添加した（エタノールまたはＤＭＳＯニ溶解した５ＰＤＰ　６．４ｍｇ／ｍｌ）。　（注、水溶性形態の置換５ｐＤＰが入手される場合、これによりＤＭＳＯまたはエタノールのような有機溶媒の望ましくない使用が回避されるので水溶性形態のものを使用すべきである。）反応混合物を１５〜２５°Ｃの温度で０．５時間かきまぜ、然る後物質を脱塩カラム、例えばＢｉｏ−ｇｅｌＰ２．　Ｐ４．　Ｐ６またはＰｌｏ（バイオラド、リソチモンドＣＡ）またはセバデックス等価物を用いてクロマトグラフする。本例では、Ｐ− ２，Ｐ−４またはセバデックスＧ−１０（ファーマシア、ビスカｙｔ−ウェイ、　ＮＪ）を使用するのが好ましい。カラムの内側寸法は１．５　Ｘ７５ｃｍである　（尚０．９〜２．５　Ｘ５０〜１００ｃｍの寸法のものも満足される）。

０．１５　ＭＮａＣ］を含む０．０５Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を使用し流速１０〜２０ｍ１／ｈｒで溶離する。　（物質を疎液化しなければならない場合には、使用し得る代わりの許容し得る緩衝液は０．０５〜０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，０）である。）約１００または同程度の画分（好ましいカラムに対し分量で０．５〜１．０ｍ１）を集める。次いでカラムを寸法１．００ｍ１以上の同じ緩衝液で溶離する。溶出プロフィルを適切な波長、代表的にはＡＺＩＯ〜Ａ２９゜で吸光度を記録することにより監視する。ゲル　サイズ。

流速、緩衝液、ポリペプチドの形態等の理想的条件下で、置換および非置換のポリペプチドの、特に前端に、若干の分解がある場合がある。かかる望ましい分解が起こる場合には、第１ピークのスキュー（ｓｋｅｗｅｄ）選定が望ましい。次いで置換ポリペプチドを含む第１ピークの本体を示す主ピーク（通常２〜３１．０１画分であるがしばしば４〜６１．Ｏｎ＋］画分）がプールされる５ＰＤＰ− ポリペプチドの期待される収率は５０〜７５％である。

得られた種はプロピネートのカルボキシル基とポリペプチドにおけるアミノ基の間の２−ピリジル−ジチオ−プロピネート−ポリペプチドであり、５ＰＤＰのＮ −ヒドロキシサクシミドがポリペプチドのアミノ基により置換されている。

次に、カルボキシル末端にシスティンを含むｂ　−２−ＭのＴ細胞特異結合リガンド部：ＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ（Ｍ圓＝　３４００）を使用する。このポリペプチドが重合体のジスルフィドを全く形成しないことを確かめるため、６．８■のこのポリペプチドを０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液１．０ｍｌ中で１０ｏ＋Ｍのジチオスレチオール（以下ｒＤＴＴ　Ｊと称す）（１５，４ｍｇのＤＴＴを１０１の水に溶解し、次いで１００μｍを上記ポリペプチド溶液に添加することによりつくった）の存在下で還元する。常温で４５分後、還元したポリペプチドをＰ４またはＰ−６カラム（バイオラド、す・２チモンドＣＡ）上での分別により　ＤＴＴおよび他の生成物と分離する。

ポリペプチドのピーク画分を別々にプールする。

次に、各ポリペプチドの測定した等モル部分を円錐形反応容器中でかきまぜながら混合し反応を１５〜２５°Ｃで２時間行わせる。

これ等の条件下で、ｂ−２−Ｍポリペプチドにおけるシスティンの還元したスルフヒドリルは優先的に　旧νボリペブチドの２−ピリジル−プロピネート−ジスルフィドと反応し、２−ピリジルが置換され新しいジスルフィドが形成されこれがプロピネ−１・残留物とジペプチド架橋する。所要に応じて、キレート化剤、例えば０．００１〜０．０１ＭのＥＤＴＡを添加して例えば汚染した水、緩衝液等によりしばしば導入される汚染重金属との副反応を低減することができる。

次いで、モレキューラ　シーブおよび脱塩カラム例えばＧ−１０またはＧ−２５上で生成物および反応体を分離することにより反応を終了する。本例においては、１．２．３．２　　および約５ｋＤの物質を分離できるマトリックス、緩衝液および流速が望ましくＰ−６またはＧ−１０カラムのいずれかを好ましいものとして選ぶ。試料容量は約５．０ｍｌで２．５〜５．０ｃ＋ｏの直径を有するカラムを用いる。更に、この段階で、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ６，０）に安定剤、例えば０．１５Ｍ塩化ナトリウム、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡおよびしばしば０．０１％（ｗ／ｖ）ポリエチレン　グリコール６０００を、制菌剤、例えば１０００単位のペニシリンまたは１０Ｍｇ／ｎ＋１のストレプトマイシンと一緒に添加するのが望ましい。更に、溶出緩衝液のｐＨは安定化および貯蔵のためにｐＨ６，ｓに低下させることができる。

或いはまた、ＲＰ−１１ＰＬｃ分離または高電圧電気泳動を上述の如〈実施して分離しまたその純度を決定することができる。使用する溶出緩衝が低減したｐＨ１例えば５．２または　７．０を有する場合には、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いるのが好ましい。

得られた特異官能性細胞免疫剤を次に示す：ＫＤＷＳＦ　ＹＬＬＹＹＴＥＦ　ＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ−５ＰＤＰ　−Ａ　ｂ　ｕ　ＴＴＡ　ＶＰＷＮＡ　ＳＷＳ（ｂ−２−Ｍ　５８−８４）　　　　　　　（ＨＩＶ　６０５−６２０）ム　　　３　　ＭＳＢ　　　　　　　る本例はＭＳＢを用いＬＥＡ−３のＴ細胞特異結合リガンド部に共有結合する旧Ｖエピトープを含む特異官能性細胞免疫剤の製造を記載する。

６．７ｍｇ　（２，０ａ　ｍｏｌｅ）のＬＥＡ−３のＴ細胞特異結合リガンド部分のノルロイシン、アミノ−酪酸形態のもの＝　（ブライトマイヤー、ジュー。

ビー、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　：　７６０　シード、ビー、＋ｍ声つ一：　８４０　（１９８７）参照）ＳＲＨＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＣＩＶＴＹＭＮＶＬ　　　　（ＭＷ＝３４３１）またはその誘導体：５ＲＨＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡνＩＴＴＡｂｕｌＶＩＹＮ］ｅＮＶＬ　　　（ＭＷ＝３３８５）を１．０ｍｌのＰＢＳに溶解する。円錐形反応容器内でこの溶液に５０μｍのＭＢＳ　？８液（４，０ｐ　ｍｏｌｅ）　（ＭＢＳのジメチルホルムアミド２４．８ｍｇ／ｍｌ）を添加する。反応混合物を常温で３０分間連続かきまぜる。

次いで反応を下記の如くして終了する。

上記の如く適切なカラム、好ましくはＰ−４カラム（０，９Ｘ４０ｃ＋ａ）で溶出緩衝液として０．１？！リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）若しくは０゜１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）を用い４°Ｃで脱塩することにより生成物および反応体を分離する。所望生成物を含む適切な画分のプールを使用するまで（通常２４時間以内）４゛Ｃで貯蔵する。ＭＢＳ−ポリペプチドの代表的収量は３．０〜４．５ｍｇである。生成したポリペプチドは安息香酸のアミノ置換ポリペプチド誘導体である。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）３．抛ｌに３．１ｍｇ秤量した生成ポリペプチドに、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０ＩＭ　ＥＤＴＡを含む０．０５〜０．１門リン酸カトリウム緩衝液（ｐＨ６，４）に次に示す旧ν ｇｐ４１エピトープ５．２ｍｇ（２，０μ＋ｎｏｌｅ）を含有する溶液３．０ｍｌを添加する：ＲＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤＲＳＣ（Ｍ賀＝　２５７０）上記緩衝液を使用して溶存ガスを最小にする前に少なくとも３回の繰り返しサイクルで真空−ブリードを行うことにより脱酸素化することが重要である。或いはまた緩衝液を栓をした密封容器に貯蔵される新たに沸騰し蒸留または脱イオン化した水からつくることができる。

反応を常温で３時間続は次いで２−メルカプトエタノールを１．０ｍＭ　　（２ −メルカプトエタノールの０．１Ｍ溶液６０μｌ）の最終濃度まで添加し引き続きＮ−エチルマレイミドを　２．０ｍＭ　　（Ｎ　−エチルマレイミドの０．２Ｍ溶液６０μｍ）の最終濃度まで添加することにより終了する。

次いで、生成物を上述の如くして精製し防腐剤および他の安定剤、例えば１０〜２０ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧの存在下６．０〜６．５のｐＨで貯蔵する。

精製した異種官能性細胞免疫剤を次に示す：ＲＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤＲＳＣ−ＭＢＳ　　−５ＲＨＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｌＶＩＹＮｌｅ　　ＮＶ（ＭＷ＝６．０ｋＤ）（ＨＩＶ７３５−７５２）　　　（ＬＦＡ−３力ルホーｔ’ｚル配列）ム　　４　無　シト−コン　　び５ＰＤＰ　　　いる次の例では、Ｉｔ、−１βのＴ細胞特異結合リガンド部へと５ＰＤＰを用いて共有結合で連鎖したネコふけエピトープを有する異種官能性細胞免疫剤の製造について記載し、ここでこのＩＬ−１β のＴ細胞特異性リガンド結合部のイプシロンアミノリジン（類）を保護することで、望ましくない副反応を防止する。

ＩＬ−］βのＴ細胞特異性結合部誘導体：ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＮＤＫ　　（分子量＝　１４０２）を使用する（ネンチオー二２エル等：Ｎｅｎｃｉｏｎｉ　　Ｌ−ｅｔ　ａｌ。

’Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　」１３９　：８００．１９８７年参照）。しかし、上で議論したように、イプシロンアミノリジンを、例えば無水シトラコン酸か又はジメチル無水マレイン酸で保護し、望ましくない副反応を防止することがまず望ましい。

更に詳しくは、２．６ｍｇ　（２，０ａ　ｍｏｌｅ）のＩＬ−１βの上記Ｔ細胞特異性結合リガンドを、２００μ！の０．２Ｍ　Ｎ−エチルモルホリンアセテート中に溶解し、１．ＯＮ　ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整した。次いで、無水シトラコン酸（イー・メルク社、ダーレスタツツ）、西ドイツ：　Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｎｓｔａｄｔ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ又はピアスケミカル、ロックフォード、アイエル：　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ　（分子量１１２．０８）を、遊離アミノ基の化学量論数（この例では一モル当たり２つ、又は全部で４．０　μｍｏｌｅ）から計算して大過剰で、５から１０の等量分（典型的には５．０μりに分けて約５分間毎に、常時撹拌中の円筒型反応容器中へと加える。このｐＨを頻繁にモニターし、１．ＯＮ　ＮａＯＨによってｐＨを８．５か又は８．５を僅かに越える値に保持できるように調整する。１時間室温で撹拌した後、シトラコン酸化したポリペプチドを、無水シトラコン酸から、０．１μ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８，５）を用いたｐ−２カラム（１，５Ｘ２５ｃｍ）上のクロマトグラフィーによって分離する。全カラム量の約１／１００を典型的には示す留分であって、少なくとも１００の０．５　　ｖａｌサイズの留分を収集し、Ａ２２゜からｊｈ８゜でモニターする。誘導体ポリペプチドを含む第一のピークを凍結乾燥し、次いで必要であれば乾燥下に貯蔵し、下記のポリペプチドを得る。

ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＳＮＤＫ　（ｃｉ　ｔ）　　　　（分子量＝　１４１０）次いで、２．８■のシトラコン酸化ポリペプチド（２，０μｊ２）ヲ上記したように５ＰＤＰで処理し、下記のポリペプチドを得る。

５ＰＤＰ　−ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＳＮＤＫ　（ｃ　ｉ　ｔ）次に、８．７　ｍｇ　（２，０ｕ　ｍｏｌｅ）のネコふけエピトープ：Ｇ　ＩＴＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＰＤνＣ（分子量＝　４３３３）を、上記の５ＰＤＰ−ＩＬ−１βポリペプチドへとカップリングさせる。ＩＬ−１β Ｔ細胞特異結合リガンドをネコふけエピトープと上記のようにカップリングさせ、異種官能性細胞免疫剤を形成させた後、酸処理でシトラコン酸基を除去することで、シトラコン酸化された基のブロックを解除する。これを遂行するには、最終生成物をＰ−１０又はＧ−１０カラム分離した後、３．０〜５．０ｒａ１０）プールを、４°Ｃで４時間１．０リットルノ５．０％（Ｖ／Ｖ）酢酸を２つ取り換えて透析し、続いて０．１５？Ｉ塩化ナトリウムと０゜０１Ｍ　ＥＤＴＡとを含む０．０５？Ｉグリシン緩衝液（ｐ）１６．５）　１．０リツトルを２つ取り換え、少なくとも２時間及び次いで終夜２〜８°Ｃで透析する。

こうして得た異種官能性細胞免疫剤を下に示す。

Ｇ　Ｉ　Ｔ　ＰＡ　Ｖ　Ｋ　ＲＤＶＤＬＦ　ＬＴＧＴＰＤＥＹＶ　ＥＱ　ＶＡＱＹＫＡ　ＰＤＶｃ　−５μＭ−Ａ　ｂｕ　ｇｇＶＱＧＥＥＳmＤＫ（ネコふけ１．３３）　　（ＩＬ−１β　１６３−１７１）第二の例では、本発明の上記した目的を疾患の予防又は治療用のワクチンによって満たした。このワクチンは、有効成分として、製薬上有効な量の異種官能性細胞免疫剤及び製薬上許容できるキャリアーまたは希釈剤からなる。

本発明で使用する製薬上許容できるキャリアーは、本発明において必須ではない。製薬上許容できるキャリアーの例として、ヒト血清アルブミン及びガンマグロブリン等のタンパク質、又はデキストラン又はポリエチレングリコール等のポリマー、及び／又は明ばん等のアジュバント（補助液）が挙げられる。典型的な明ばんアジュバントは、アル−ゲル５０（ＡＬＵＧＥＬ　５０）である（セルバ　ファインビオケミカ社、ハイデルベルグ：　ＳｅｒνａＦｅｉｎｂｉｏｃｈｅ＋＋＋ｉｃａ、　）ｌｅｉｄｅｌ　ｂｅｒｇ、西ドイツ）。使用するキャリアーの量は、−Ｃには、本発明の異種官能性細胞免疫剤に対して５０　：　５０　（Ｖ／Ｗ）の比である。

本発明で使用する製薬上許容できる希釈剤は、本発明において必須ではない。製薬上許容できる希釈剤の例としては、０．１５門塩化ナトリウム及び０．０μＭ　ＥＤＴＡを含有する、無菌の０．０１〜１．０？Ｉ、好マＬ　＜　ハ０．０５Ｍ　（７）グリシン緩衝液（ｐＨ６，５）　　；　ＲＰＭ１１６４０のような組織培養基；又はハンクス平衡塩類溶液（ライフ　チクノロシーズ　インコーボレーテッド、ガイゼルスブルグ：Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）のような生理緩衝塩溶液が挙げられる。本発明の異種官能性細胞免疫剤は、一般には約０．１〜２０ｏＯμｇ／ｌｌ１Ｎの濃度、好ましくは約２．０〜１００μｇ／ｄの濃度に希釈する。

第三の例では、本発明の上記目的を、疾患感受性被験者へとワクチンを投与することからなる疾患の予防方法によって満たした。疾患感受性被験者とは、以前には疾患に曝されておらずまたその疾患のためにワクチンで処理されておらず、かっ、遺伝的因子、又は年令、性別、食事、ライフスタイル、居住等のような環境的因子のために、疾患に曝され及び／又は疾患を発現する危険が増大しつつある個体のことである。

第四の例では、本発明の上記した目的は、疾患に悩む被験者へと上記ワクチンを投与することからなる、疾患の治療方法によって満たされた。

このワクチン中の有効成分として使用する特定の異種官能性細胞免疫剤は、予防又は治療を行う病気によるであろう。即ち、特定の疾患を予防又は治療するためには、異種官能性細胞免疫剤のうち一成分が、この疾患又はこの疾患の作因、又はその工ピトープと関連した抗原でなければならない。

疾患の予防及び／又は治療のために投与するべき異種官能性細胞免疫剤の量は、被験者の年令、体重及び性別によるであろう。一般には、この異種官能性細胞免疫剤は、７０ｋｇの体重に対して約２．０〜１００μｇの量で投与し、好ましくは、７０ｋｇの体重に対して約１０〜２０μｇの量で投与する。

投与の部位及び方法は、本発明において必須でない。例えば、この異種官能性細胞免疫剤は、皮肉、皮下、腹腔内、筋肉内に投与でき、また、アジュバントを使用しないときには、静脈内に投与できる。好ましい投与方法は、皮肉又は筋肉内である。

この異種官能性細胞免疫剤の多重接種は、一般には、第−及び第二の接種の間に３〜４週、第二及び第三の接種の間に６月置いて行う。望ましいときは、引き続いてブースターも使用できる。

金成刊］１　　に・　る　クチン次の例に記載するのは、連鎖球菌（ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ）による感染の予防及び／又はこれによって感染した被験者の治療用のワクチンの製造である。

８．６　ｍｇ（２，０μｍｏｌｅ）の連鎖球菌性エピトープ：ＴＶＴＲＧＴＩＳＤＰＩＩＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ５ＱＴＤＴＳＥＫＣ（分子量＝４３０１）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、　１Ｍ　　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）２．Ｏｍｌ中に溶解し、室温で４５分間０．ＯＩＭ　ＤＴＴで還元し、上記のように精製する。

次いで、この物質を、当モル量の５ＰＤＰ誘導体化ｂ−２−Ｍ　　：ＳＰＤ’Ｐ −ＡｂｕＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＩ）ＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥ）ＩｓＤＬｓＦｓ　（分子量＝　４４７３）にカップリングさせる。これは、８．９■（２，０μｍｏｌｅ）のｂ−２−Ｍを、５ＰＳＰ（４，０μ＋ａｏｌｅ）の入ったＤＭＳＯ２４，８ｍｇ／　ｍ　ｉを０．０５ｍｆと、室温で２時間反応させることで生成する。こうして得た異種官能性細胞免疫剤を下に示す。

ＴＶＴＲＧＴＩＳＤＰＲＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ５ＱＴＤＴＳＫＥＣ−５ＰＤＰ　　−ＡｂｕＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＩＪＮＧＥＲＩＥＫＶＥ）ＩｓＤＬｓＦｓＫ　　（連鎖球菌性）　　（ｂ−２−Ｍ　２４−５８）精製の後、この異種官能性細胞免疫剤を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、及び１．０■／ｒａｇの明ばん等を含有する０、０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ６，５）中で平衡させると、連鎖球菌性感染に対するワクチンとして有用である。

第五の例では、上記した本発明の目的は、異種官能性細胞免疫剤を用い、疾患に対して活性である、被験者中のＴ細胞の存在を検定することからなる、疾患の診断方法によって満たされた。

ここでも、使用すべき特定の異種官能性細胞免疫剤は、診断を行う疾患によるであろう。即ち、この異種官能性細胞免疫剤のうち一つの成分は、診断を行う疾患又はこの疾患の作因、又はこの疾患のエピトープ又は対照例、又は非関連エピトープと関連した抗原でなければならない。

疾患を診断するため、即ち、この疾患に対して活性である被験者中のＴ細胞の存在を測定するために使用する検定の特定は、本発明において必須ではない。こうした検定の例としては、放射性同位元素を使用するリンパ増殖検定（ケーソン、ジエイ。

等：　Ｃａ５ｏｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　’Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　１０２　：　１０９＋　　１９８７年参照）；又は３−　　（４，５ −ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（以下、ＮＴＴとする）（シグマ　ケミカル　ツー。サン、ルイ、　ＭＯ）を使用した非放射性リンパ増殖検定（モスマン・ティー・：　Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ、　　ｒＪ。

１ｒｒＩｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　６５　：　５５．１９８３年参照）　　、にｒ＋−＊遊離検定のような、細胞死を測定する検定（［Ｍａｎｕａｌ　Ｃｌｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊイーディー、ローズ、エヌ等；Ｅｄ、　Ｒｏｓｅ、　Ｎ、ｅｔ　ａｌ　１９７６年中の９〜１８章参照及びｒＦｕｎｄ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊイーディー、アレクサンダー、ジェイ、ダブリュー等：　Ｅｄ、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｊ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ。

１９７７年参照）；カルボキシフルオレセイン　ジアセテート（以下、ＣＤＴＡとする）摂取検定（ブラニング、ジエ仁ダブリュー等：　Ｂｒｕｎｉｎｇ、　Ｊ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、　　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　３３　：３３、１９８０年参照：ハンソン、ワイ等：）ｌａｎｓｏｎ、　Ｙ、　ｅｔ　ａＬ　　’Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　」１００　　：　２６１　、１９８７年参照：モスマン、ティー：　Ｍｏｓｍａｎｎ、　Ｔ、　　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　」６５　：　５５．１９８３年参照：ゲルリエ、ディー等：Ｇｅｒｌｉｅｒ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　Ｊ　９４　：　５７．１９８６年参照）；リンパ球遊走阻止検定（イーディー、ローズ、エヌ等：　Ｅｄ、　Ｒｏｓｅ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　　ｒＭａｎｕａｌ　Ｃ１１ｎ。

ＩＩ！１ｍｕｎｏ１．．１１９７６年中の９〜１８章参照及びイーディー、アレクサンダー、ジエイ、ダブリュー等：　Ｅｃｌ、ΔＩｅｘａｎｄｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、ｅｔ　ａｌ。

’Ｆｕｎｄ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　」１９７７年参照）；リン酸化検定（サミュエルソン、エル、イー等：Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ、　Ｌ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ　　ｒＪ。

Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．Ｊ　１３９　　：　２７０８．１９８７年参照）；遅延型過敏症（ＤＨＴ）皮膚試験検定（カディバル、ジー、ジェイ等：　Ｋａｄｉｖａｌ、　Ｇ、　Ｊ、　ｅｔａｌ、　　’Ｊ、　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、　Ｊ　１３９　　：２４４７．１９８７年参照）；キーニー。

アール、ティー等：　Ｋｅｅｎｅｙ、　Ｒ，Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊｌｏｌ　　：１１０．１９８７年参照）；又は、５−［（４，６−シクロロトリアジンー２−イル）アミノ］　−フルオレセインヒドロクロリド（以下、ＤＴＡＦとする）のような色素を使用したＴ細胞結合検定（クン、ピー等：　Ｋｕｎｇ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　７７　：　４９１４．１９８０年参照）を挙げることができる。

リンパ増殖検定を、次のような特定の疾患に対する細胞免疫の試験用にモディファイした。例えば、Ｔ細胞を含有する、血液循環リンパ節又はスプレニックリンパ球の試料を、無菌技術を使用し、無菌コンテナー中での静脈穿刺によって、疾患又は疾患の作因又は疾患のエピトープ又は異種官能性細胞免疫剤と関連する抗原によって免疫化した動物から収集する。動物においてはしばしば、特にマウスやラット及び多くの場合ウサギを使用するとき、例えば、を椎脱臼、及び単細胞懸濁液中へと掻き裂かれた鼠径部リンパ節及び／又は肺臓によって摂取した後例えば１４日間、これらの動物は実験に供される。ヒトにおいて多くの場合そうであるように、全血を使用するときは、末梢血液又は単細胞リンパ球を、例えば、「フィコルーハイペイク」法（ファーマシア、ピスキャ７夕ウェイ：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａ−ｗａｙ、　ＮＪ）によって処理し、これらの細胞を再懸濁し、無菌培養マイクロウェルへと平板化する。フィコルーハイペイク処理ハ、長期の検定（時間又は日に亘る）中に栄養素を消費して阻害しうる、赤血球、マクロファージ類及び他の細胞を除去するためにしばしば実施される。これらを除去すると、結果の検定及び／又は解釈を実施化できるので望ましい。多くの場合、特に早い及び／又は急速なケースでは、この分離は不必要である。

更に詳しくは、９６ウエル　コースタ−平板を、１．０〜５．０×ｌＯ５、好ましくは２．ＯＸＩＯ３細胞／ウェルで、０．２　　ｍｌのＲＰＭｒ１６４０培地中にシードし、ペニシリン及びストレプトマイシンのような標準抗生物質、及びしばしば０．５〜１０％（ν／Ｖ）の相同性血清、例えば、ネズミ細胞には標準マウス血清又はヒト細胞にはヒ）ＡＢ血清及び他の型の細胞にはＢＳＡを補充する。

次に、２−メルカプトエタノールを０．００００５？の濃度とし、かつ疾患又は疾患の作因、又は疾患のエピトープと関連する抗原を０．００１　　ｕｇ／　ｍ４２〜１００　μｇ／　ｍｊ２、好ましくは０．０１〜１０μｇ　／ｍｌの濃度とし、又は異種官能性細胞免疫剤を一連の濃度、通常は約００ＯＯ０１〜１０μ ｇ／１ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．Ｏｕｇ／　ｎ＋４２とした溶液を、ウェルへと加える。

適切なデザインのためのレプリカーゼの使用と、より良い制御及び意義のある結果を得るための、下記に示すもののような、一連の関連する異種官能性細胞免疫剤の使用とを、通常１０μｇ／ｍｊ２で始まる幾つかの連続狛な希釈度で試験する。

ＴＲＶＴＲＧＴＩＳＤＰＲＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ５ＣＩＴＤＴＳＫ−３ＰＤＰ−ＣＹＶＳＧＦＩ（ＰＳＤＩＥνＤＬＬＸＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳ　　（連鎖球菌性）　　（ｂ−２ａ＋　２４−５８）ＩＦＡＧ　ＩＫＸＡＮＥＲＡＥＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫ−５ＰＤＰ−ＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＩ’１ＩＥＫＶＥＨ５ＤＬＳＦＳ　　　　（千トクロームＣ）　　　（ｂ−２−Ｍ　２４−５８）ＩＦＡＧ　ＩＫＫＡ　ＮＥＲＡ　ＥＬ　ＩＡ　ＹＬＫＱＡＴＫ　−５ＰＤＰ−ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡ（ＩＫＶＡＲＴＬＰＣ−１− ト’）Ｏ−ＬＣ）　　　（ＦＭＤＶ１４１−１６０）ＴＲＶＴＲＧＴ　Ｉ　５ＤＰＲＶＦ　ＰＲＧＴＶＥＮＰＶ　ＡＴＩ？ＳＱ　ＴＤＴＳＫ　−５ＰＤＰ　−ＶＰＮＬＲＧＤＬＱ　Ｖ　ＬＡＱＫ■`ＲＴＬＰ　　　　　　（連鎖球菌性）　　　　　（ＦＭＤＶ　１４１−１６０）同じポリペプチドであるが、しかし異なる配向と異なる連鎖方法を採用した、例えば、アミノ基のカルボジイミド活性化カルボキシル基を使用することでアミノ基をカルボキシルポリペプチドに結合させたポリペプチドを試験することが望ましい。

種々の培養微生物を、３〜６日間、好ましくは４日間、９５％の相対湿度で５％ＣＯ□、９５％空気の混合物中３７°Ｃで培養する。

次いで、１．ＯＣｉ／ｎｍｏｌの比活性を有する０、０４μｃｉの３Ｈ−チミジンにューイングランド　ニュークリアー社、ボストン、　ＭＡ）を各ウェルへと加え、３７°Ｃでの培養を１８時間続ける。この培養を終了し、この試料をプロセシングし、多重検定試料集菌機（以下、ＭＡＳＨとする）を用いて、ＤＮＡ中へと移入した３Ｈ−チミジンの量を測定する。再現性のため、４つのレプリカーゼ、細胞のないブランク、及び対照例としての種々の特異性、非特異性異種官能性細胞免疫剤を使用し、このデータを分析する。これらの結果を、集団の平均＋／−レプリカーゼの標準偏差として表示する。もし４つのレプリカーゼのうち３未満が許容され、即ち、Ｘ＋Ｓ、Ｄ、であれば、測定を繰り返さなければならなし）。平均の＋／−２０％よりも大きい値は除く。有意であるためには、一系列において２つの隣接する濃度での少なくとも２つの異なる平均値が、対照例の５０％よりも大きく異なっていなければならない。もしベースラインが有意であれば、そのときはデータは抑制効果又は刺激効果として解釈される。効果がなし）のは、その愚者が細胞免疫を持っていないことを意味する。この検定において、刺激効果は、ヘルパーＴ細胞活性が刺激性であることを示し、抑制効果は、ベースラインＴ細胞活性が系によって抑制されることを示す。

もし可能であれば、自然の生抗原又はそのエピトープ又は本発明の異種官能性細胞免疫剤のような試剤なしに、陽性及び陰性の対照例が、細胞の存在しないパックグラウンドレベルの好ましくは約２〜３倍の値を有しているように、典型的な検定条件を選ぶ。そして、陽性の対照例はバックグラウンドレベルの少なくとも１０倍、好ましくは１００倍以上の値を与えなければならず、陰性の対照例は、上記したと同じでなければならない。

この場合、試料を陽性又は有意として記録するには、二つの対照例の間の百分位数のうち最初の１７４を越えていなければならない。

多くの場合、細胞免疫の存在又は欠如を一次測定すれば充分である。結果の臨床的解釈は、しばしばケースバイケースの基準による。ここで、感染締固のように、３多くの場合、陽性の細胞免疫の存在を測定又は発現させたいという要望又は必要がある。アレルギーのような他の条件下では、免疫グロブリンのＩｇＧ又は他のクラス又はサブクラスとは反対に、細胞免疫が誤ってヘルパーＴ細胞を生じさせて過剰のＩｇＥを産生ずるかもしれない。更に他の場合には、細胞免疫に対する正しい型のＴ細胞、例えば、増大する抗体産生に対してヘルパーＴ細胞が存在しうることが診断で示されるかもしれないが、しかし、必要なことは、特定の、疾患と関連する抗原又は疾患の作因又はそのエピトープに対して細胞障害Ｔ細胞の産生が増大することである。

上で議論したように、ＭＴＴを用いる非放射性リンパ増殖検定は、特定の疾患に対する細胞免疫の試験にも使用できる（モスマン、ティー　：　Ｍｏｓｍａｎｎ、　Ｔ＋　　’Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　　Ｊ　６５　：　５５＋１９８３年参照：及びゲルリエ、ニー等：　Ｇｅｒｌｉｅｒ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　’、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　９４　：　５７．１９８６年参照）。

リンパ増殖の分析のために３Ｈ−チミジンの置換としてＭＴＴを使用するため、 ″Ｈ−チミジンを加える時点に至るまでは３Ｈ−チミジン検定におけるように細胞をプロセシングし、処理し、培養する。３Ｈ−チミジンを加える代わりに、ＭＴＴを、無菌で発熱物質のないＰＢＳ中へとＭＴＴ濃度５．０■／ｒａＩ！、まで溶解させ、０．２μｍフィルターを通して新たに濾過する。この溶液を、培養菌１００μｒ当たり１０μＥの割合で加える。この培養を３７°Ｃで４時間続ける。次いで、この培養を終結し、細胞を遠心分離し、流体を吸引し、細胞を再懸濁し、溶菌する。次に、青色沈澱の形の、移入され変換されたＭＴＴを、１００　　ｎ＋４２の０．０４Ｎ　ＨＣＥを含むイソプロパツールからなる１００μ！の酸−イツブロバノール溶液の添加によって溶解させた。ウェルの含有量は、室温で軌道振とう機上において穏やかに混合することで混合できるものであり、八９．。での吸収を１５分から１時間後に読む。

細胞毒性を分析するためのＭＨＣプロセシング及びプレゼンテーションの置換として、細胞毒性検定において異種官能性細胞免疫剤を使用するため、これらの細胞を、リンパ増殖検定におけるように、最初の６〜９日間異種官能性細胞免疫剤でプロセシングし、処理する。この時点で、標準ｃｒ”’　ａ離検定を実施する。更に詳しくは、これらの細胞をＱ、ｌ　　ｍｌエフェクター細胞へと、このエフェクター細胞の濃度の１０％と２００％との間で加えた。これらのエフェクター細胞と同じドナーから前日に感染細胞を新たに収集し、異種官能性細胞免疫剤の抗原が由来する病因によって０．０１〜１０、好ましくは１．０の感染多重度で終夜感染させる。終夜感染の後、これらの細胞をＣｒＣｌ　３によって、５１（ｒの形で標識し、次いで、可溶性放射能の量が結合細胞の１帆０００〜Ｌ　０００．　ＯＯＯｃｐｍのこうした標識感染標的細胞をエフェクター細胞へと加え、次いでこれらの細胞を４〜６時間３７゛Ｃで培養する。次に、これらの細胞をＰＢＳで５回洗浄し、カウントし１、このデータを対照例を用いて計算する。

また、上で議論したように、ＣＦＤＡ　ｆｆｉ取に基づく他の検定を、特定の疾患に対する細胞免疫を試験するために使用できる（モスマン、ティー　’Ｊ、　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　６５　：　５５．１９８３年参照；及びハンソン、ワイ等、　　’Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　］００　　：２６Ｌ１９８８年参照）。

ＣＦＤＡは細胞膜を通して受動的に透過し、次いで、細胞内酵素の結果として、生細胞によって加水分解されてカルボキシルフルオレセインとなり、これが生細胞内で蓄積され、それを青色の下で螢光性とするので、ＣＦＤＡは存利である。

更に詳しくは、細胞を準備し、疾患又は疾患の作因又は疾患のエピトープと関連する抗原によって処理し１．又はリンパ増殖又はＮＴＴ検定用に上述した異種官能性細胞免疫剤によって処理する。しかし、これらの検定におけるようにプロセシングする代わりに１、これらの細胞を無菌ハンクス平衡塩溶液で二回洗浄し、２５μ！のこの溶液中で再懸濁し、これと５．０μ！の新たに希釈及び濾過した（０．２μｍ　）　ＣＦＤＡ溶液を加える。このＣＦＤＡ溶液は次のように準備する；ブラニング、ジェイ、ダブリュー等；　Ｂｒｕｎｉｎｇ、　Ｊ、　ＩＡ。

ｅｔ　ａｌ、　’Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　　Ｊ　３３　：　３３＋　１９８９年（イーストマンコダソク社、ロチェスター、　ＮＹ）に記載されているように、６−カルボキシフルオレセインのアセチル化によって１０μ！の標準貯蔵液を準備し、冷所でダークボトル内の試薬級アセトン中に１０■／Ｉ１１！で貯蔵し、ガラスストッパーでシールする。次いで、０．０２Ｍ　　Ｉ−リス−１（ｐＨ７，４）又はヘベスＣｐＨ１，４）によって緩衝した１０ｎ＋４２のハンクス平衡塩溶液を加える。これらの細胞に所定時間の間、通常３７゛Ｃで培養して１５分間、ＣＦＤＡを摂取及び加水分解させた後、これらの細胞を新鮮なハンクス平衡塩溶液で洗浄し、０．０１〜１０■／ｍ１．のヘモグロビン中に再懸濁してバックグラウンドの散乱及びノイズを低減させる。ウェル中の細胞内へと注入されたＣＦＤＡは、この９６ウ工ル平板立体配置を利用した適当で入手可能な螢光計で螢光をモニターしてＣＦＤＡ含有量を測定することによって、測定する。

リン酸化検定は、本発明の異種官能性細胞免疫剤で細胞を活性化することで実施し、ＧＴＰからタンパク質中への３２ｐの注入を測定する。更に詳しくは、本発明の異種官能性細胞免疫剤での短い処理期間、即ち、約５〜６０分の後、例えば、０．００１〜０．１　μＣｉの２２ｐガンマ標識ＧＴＰによって１５〜２０分間、細胞を培養する。次いで、これらの細胞をプロセシングし、すべてのタンパク譬中又は、特異性内部タンパク質若しくは特異性免疫沈降膜タンパク質のような特異性タンパク質中へのｆｆ２ｐ注入を測定する。

遅延過敏症型検定（Ｄ）ＩＴ検定）は次のように実施する；疾患又は疾患の作因又はそのエピトープと関連する抗原、又は異種官能性細胞免疫剤を、、　ＰＢＳ中通当適当度、通常０．００１〜１０．０Ｈｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．Ｏｕｇ／　ａｌＩ！で、薄い皮下針及びシリジンを使用して、好ましくは２７ゲージで０．０５ｍｆ、皮膚の真皮層中へと注入する。形状、呈色反応、厚さ及び他の特性の変化を容易に観察でき、所望時にはのぎすで測定できる領域を選択する。これは通常、毛や色素沈着がほとんどないか又はまったくない領域を意味する。２４及び４８時間後、この領域を観察し、その結果を記録し、特に血腫、硬化及び形状を記録する。比較を容易にするため、しばしば、陽性ＤＨＴ反応を引き起こしかつ完全に不活性であることが知られている生理緩衝塩溶液のような標準剤を、１．０〜２．０１離れた部位に注入する。この叶Ｔ検定においては、試験物質を、その対照例に対するそれらの反応を参照しながら記録する（カディバル７ジー、ジェイ等：　Ｋａｄｉｖａｌ、　Ｇ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　　’ Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　１３９　　：２４４７．１９８７年参照：及びキーニー、アール、ティー等：　Ｋｅｅｎｅｙ＋　Ｒ，Ｔ、　ｅｔａｌ、　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｊ　１０１　　：　１１０．１９８７年参照）。

金戒■五−−葭肌剋次の例で記載するのは、診断剤として有効な、ＭＨＣクラス■及び■分子のいずれかを表面上に含有する細胞に結合するＴ細胞特異結合リガンドの製造である。

連鎖球菌性細菌の３系統のＭタンパク質のうち約最初の１０個のアミノ酸を適切な順序で含有する次のポリペプチドを（ビーチリ−、イー、エイチ：　Ｂｅａｃｈｌｅｙ、　Ｅ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　’Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｊ１６６　　：６４１．１９８７年参照）、無水シトラコン酸で処理し、上記したようにリジン（類）のアミノ基（類）をプロ・ツクする。シトラコン酸で処理し、続いて精製した後、これらの分子を０．０１ＭＤＤＴで還元し、システィンが確実に許容形態をとるようにする。

ＴＲＶＴＲＧＴＴＳＶＰＲＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲＳＱＴＤＴＳＫｃ　　（分子量＝　４２０９）次いで、上記のポリペプチドを、当モル量の次記ＩＬ− １βポリペプチド５ｐＤＰＷ導体へと１６３−１７１７１位置合させる。

ＳＰＤＰ−ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＳＮＤＫ　　（分子量＝　１４０１）これは、２．０　ｍｇ（２，０μｍ）のＩＬ−１βポリペプチドを、２４．８ｍｇ／ｍｌで５ＰＤＰ（４，０μｎ＋　）を含有するＤＭＳＯ０，０５ｔｅｌと２時間室温で反応させることで生成される。こうして得た異種官能性細胞免疫剤を下に示す。

ＴＲＶＴＲＧＴＩＳＤＰＲνＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ３ＱＴＤＴＳＫ−５ＰＤＰ−ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＳＮＤＫ（連鎖球菌性）　　　（ＩＬ−１β１６３ −１７１）次の対照例ポリペプチドは同様の方法で調製できる。

ＩＦＡＧＩＫＫＡＮＥＲＡＥＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫｃ−ＳＰＤＰ−ＡｂｕｇｇＶＱＧＥＥＳＮＤＫ（チトクロームＣ）　　　（ＩＬ−１β　１６３−１７１）ＩＦＡＧＩＫＫＡＮＥＲＡＥＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫｃ−５ＰＤＰ−ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ（チトクロームＣ）　　　（ＦＭＤＶ　　１４１− １６０）ＴＲＶＴＲＧＴＩＳＤＰＲＶＦＰｌ’１ＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲ３ＩＩＩＴＤＴＳＫ−３ＰＤＰ−ＶＰＮＬＲＱＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ　　　　　　　　（連鎖球菌性）　　　（ＦＭＤＶ　　１４１−１６０）査１１殊１１Ｊ扼剋次の例に記載するのは、診断剤として有用な、ＭＨＣクラスＩ及び■分子を表面上に含有する細胞に結合する、他のＴ細胞特異結合リガンドの製造である。

合成例６の連鎖球菌由来ポリペプチドを、コンカナバリンＡの誘導体へと８１− １１０位置で結合させる。

ｇｇｇＬＮＤＶＬＰＥＷＶＲＶＧＬＤＳＡＳＴＧＬＹＫＥＴＮＴＩＬＳＷＳ　　（分子量＝　４２６６）更に詳しくは、８．５■の上記コンカナバリンＡポリペプチド（２，０ｕｍ）を、合成例６に記載した０、５　　ｍ１２の５ＰＤＰ溶液と反応させ、引き続いて合成例６の連鎖球菌由来ポリペプチドと合成例に記載したように反応させ、次の異種官能性細胞免疫剤を得る。

ＴＲＶＴＲＧＴＴＳＶＰＲＶＦＰＲＧＴＶＥＮＰＶＡＴＲＳＱＴＤＴＳＫｃ−ＳＰＤＰ−ｇｇｇＬＮＤＶＬＰＥ−νＲＶＧＬＤＳＡＳＴＧＬＹＫＥＴＮＴＩＬＳＷＳ　　（連鎖球菌）（コンカナバリンＡ）次の対照例ポリペプチド、は、合成例６で記述したのと同じ法でコンカナバリンＡ誘導体に対して調製できる。

ＩＦＡＧＩＫＫＡＮＥＲＡＥＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫｃ−ＳＰＤＰ−ｇｇＬＮＤＶＬＰＥＷＶＲＶＧＬＤＳＡＳＴＧＬＹＫＥＴＮＴＩＬＳＷＳ　　　　　（チトクロームＣ）　　　（コンカナバリンＡ）ＩＦＡＧＩＫＫＡＮＥＲＡＥＬＴＡＹＬＫＱＡＴＫｃ−３ＰＤＰ−ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ（千トクｏ−４Ｃ）　　　（ＦＭＤＶｌ、４ｌ−１６０）ＲＴＬＰ　　　　　　（連鎖球菌性）　　　　（Ｆ門りν１４１−１６０）八　　　　　　　−続次の例に記載するのは、Ｔ細胞の表面への異種官能性細胞免疫剤の結合を可視化し、ＨＩＶに対して活性である被験者中のＴ細胞の存在を診断するために用いる、異種官能性細胞免疫剤の標識付けである。

上記のようにして得られた５、０■（１，０μｍｏｌｅ）の次記異種官能性細胞免疫剤：ＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ−ＳＰＤＰ−ＡｂｕＴＴＡＶＰＮＡＳＷＳ（ｂ−２−Ｍ　　５８−８４）　　　　（ｌ（１ν　６０５−６２０）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する２、０　　ｍｌの０．０５Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中に溶解させ、５．０　ｍｇ（１０ｕ　ｍｏｌｅ）のＤＴＡＦ　（イーストマン　コダック社、ロチニスター、　ＮＹ）又はＮＨ３−ビオチン（ピアスケミカル社、ロックフォード、ＩＬ）と１５〜２５° Ｃで反応させ、異種官能性細胞免疫剤を標識する。この異種官能性細胞免疫剤は幾分か不安定な二硫化物を有しているので、その条件は基本的に製造者によって推奨されるようにするが、その反応は２時間の間７．０のｐｎで実施し、その反応生成物は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ　、及び０．０１％（Ｗ／Ｖ）　ＰＥＧ−６０００を含有すル０．０５Ｍ　ＩＪ　７酸、ｌ、　ＩＪウム緩衝ｉ’ｆｆ１（ｐ）１６．５）を用いたＧ−１０カラム上で脱塩及び分留することによって直ちに分離する。こうして得られたポリペプチドを下に示す。

ＤＴＡＦ−ＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ−５ＰＤＰ−ＡｂｕＴＴＡνＰＮＡＳＷＳ（ｂ−２−Ｍ　　５８−８４）　　　　（ＨＩＶ　　６０５−６２０）このＤＴＡＦ標識異種官能性細胞免疫剤は、Ｔ細胞と共に３０〜６０分間２〜８°Ｃで培養して使用する。次いで、このＴ細胞を洗浄し、螢光顕微鏡下において、Ｔ細胞膜に対するこの異種官能性細胞免疫剤の結合の存在又は不存在を検査する。次いで、このように標識されたＴ細胞のパーセンテージの適切な定量を行う９８Ｈ５−ビオチンを使用して異種官能性細胞免疫剤を標識する場合は、次いで、これを、製造者であるピアスケミカル社（ロックフォード、　ＩＬ）によって記載されているように、固体支持体へと結合するアビジンを用いたアフィニティーカラムを使用することで精製できる。ＮＨ３−ビオチンを使用するときには、アビジン−ＦＩＴＣを使用し、異種官能性細胞免疫剤のＴ細胞への結合を可視化する。

三官能性免疫剤を診断用分析の下におく場合は、もし二つのオプションが各実体について可能であるとすればそのときは全体で８つの異種官能性細胞免疫剤が可能となる。しばしば、合成が不可能な組合せをグループ分けし、考慮に入れることによって、より少ない異種官能性細胞免疫剤が必要となる。

人　　　９　５ＰＤＰ　　びＭＢＳ′　　　　　る　三″′″″２＝」１次の例に記載するのは、本発明の三官能性免疫剤の製造である。

６．８■の下記ＬＦＡ−３Ｔ細胞特異結合リガンド：ＡｂｕｇｇＳＲＨＲＹＡＬＩＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｌＶＬＹＮｌｅＮＶ　　（分子量−３４００）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中の＋ｌＯμ＋ｎｏ１６の５ＰＤＰで活性化し、引き続イテ上記したように精製する。次いでこの精製物を、新たに還元及び精製した下記プラスモジウム（ｐＩａｓｍｏｄ４ｕｒａ）Ｃ５Ｐ−１配列４．０　ｍｇ（２，０μｍｏ　ｌ　ｅ）　　と反応させる。

Ｙ（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱＰ）ｚＣ（分子量＝１９９５）精製の後、この結果物を、４．０μ５ｏｌｅのＭＳＢと反応させてチロシンのアミノ基をチオール化しくｔｈｉｏｌｙａｔｅ）　、この後、分離された活性種を、２．０μｍｏｌｅの下記ｂ−２−Ｍ　Ｔ細胞特異結合リガンド：ＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ（分子量＝　３３９６）に加え、下記の三官能性免疫剤を得る。

ＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ−ＭＢＳ−ｙ　（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱ、Ｐ）２Ｃ−ＳＰＤＰ−ＡｂｕｇｇＳＲＨＲＹＡＬＴＰＩＰＬＡＶＩＴＴＡｂｕｌＶＬＹＮ］ｅＮＧＩＬ（ｂ−２−Ｍ　５８−８４）　　（Ｃ５Ｐ −１）（ＬＦＡ−３カルボキシル配列）本発明についてその特定の実施例を参照しながら詳細に説明したけれども、本技術に習熟した者であれば、本発明の精神と範囲とから離れることなく、種々の変更と変形とを行いうろことは明白である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年１２月１４日特許庁長官　　植　　松　　　　　　７　　殿　　　　　　−１１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２５０３２、発明の名称異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法３、特許出願人名　称　　セル　メト　インコーポレイテッド１９９０年７月２３日分子；リンパ球機能関連分子−３（以下ｒＬＦＡ−３Ｊという。）、ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ−４及びＣＤ−８に対する抗体；コンカナバリンＡ、ホークライードマイトジェン、落花生アグルチニン及び植物凝集のようなレクチン、　ＩＬ −１及びＩＬ−２のようなリンフ才力イン；及びｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）。（６０：　４０）のような他の分子のようなＡＰＣ上に位置又はこれに結合もするＴ細胞特異性結合リガンドを含む。

ＭＨＣクラスＩの小さなタンパク質、すなわち、ｂ−２−ミクログロブリン（以下ｒｂ−２−Ｍ　Ｊという。）（これは血清、腹水及び尿のような種々の体液中に見い出される。）は、これがＴ細胞特異性結合リガンドであることを示す生物学的特性を有することが最近示された。にッセン、エム、エイチ（Ｎｉｓｓｅｎ。

？１．　Ｈ，）ら、Ｊ、　　Ｔｍｍｕｎｏ＋、、　１３９　　：　１０２２　（１９８７）参照。）すなわち、この分子のインビトロＣｒ″゛放出細胞障害検定系への添加が非対応及び対応系の両方においてＣＴＬ活性に増大効果を有し、すなわち、ヒト（非対応）及びネズミ（対応）　ｂ−２−Ｍがネズミ細胞を用いるこの検定系において同し生物学的効果を生しる。ｂ−２−Ｍの配列は、グソウ、ディー（Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ　）ら、ムＴｍｍｕｎｏ１．．１３９　　：　３１３２　（１９８７）に報告されている。ｂ−２−Ｍのそれぞれ２４〜５８位置及び５８〜８０位置における次の配列が特に有用なＴ細胞特異性結合リガンドであると信しられる：ＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥ）ＩＳＤＬＳＦＳＸ　　　　（ＭＷ＝４４７４）ＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣ（Ｍ讐＝　３３９６）これら二つのポリペプチドは、若干の理由のためシスティンで終るように選ばれる。第１に、それらは線状エピトープ領域の恐らく外側にある部位を示す。これは、成Ｆ！ｂ−２−ｈにおいて、それらが分子内ジスルフィド結合の生成に関係するためである。

ＣＤ−２及びＬＦＡ−３に対する共通の配列が最近報告された。（ビーターソン、エイ　（Ｐｅｔｅｒｓｏｒｒ、八、）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　テ１２−９−：　８４２　（１９８７）；及びシード、ビー（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　譚ツー：　８４０　（１９８７）参照、）Ｔ細胞上に見い出されるＣＤ−２、及び同様な、同一に導かれた分子でなくても、ＬＦＡ−３（これはマクロファージ、赤血球及び神経細胞に見い出される。）は、両方共種々のＴ細胞（レセプター、リガンド及び変調相互作用）に関係する。特に、イ装置８７〜１０１にあるＬＦ八−３＝ＫＶＳＩＹＰｔＫＧＫＮνＬＥＸ　　　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　１９５６）又はシスティン（Ｃ）及び２個のグリシン（ｇｇ）が加えられたその誘導体：ｃｇｇＫＶｓＩ　ＹＰＴＫＧＫＮＶＬＥＫ　　　　　　　　　　　（ＭＷ　＝　２２２８．３）請　　求　　の　　範　　囲１、　　　　　　共有結合的に結合する少くとも２種のＴ細胞特異結合リガンドから主として成り、Ｔ細胞特異結合リガンドか異なる分子から誘導されまた上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドか病気若しくは病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープであり、特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合する上記Ｔ細胞特定結合リガンドかＩ、ｔＨｃ分子から誘導され、これが！ＩＩＨＣ分子の非多形領域から誘導されることを特徴とする特異官能性細胞免疫剤。

２、　上記Ｔ細胞か、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞からなる群から選はれたことを特徴とする請求項１の免疫剤。

３、　７細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドか、ＭＨＣクラスエ、１ｔｌＨｃクラス■、リンパ球機能関連分子−３、Ｃ，Ｄ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ−８に対する抗体、レクチン、リンフ才力イン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）。（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の免疫剤。

４、　病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項１記載の免疫剤。

５、　抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質か、ブリオン、ウィルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項１記載の免疫剤。

６、　　（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドか病気または病気の・原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上評容し得る担体または希釈剤を含むことを特徴とする病気の予防または治療用ワクチン。

７、　上記Ｔ細胞か、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サブレ・ソサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれｔこことを特徴とする請求項６記載のワクチン。

８、　Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、Ｍ）ＩｃクラスＩ、ＭＨＣクラス■、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ −８に対する抗体、フレチン、リンフ才力イン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）、　（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項６記載のワクチン。

９、　病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項６記載のワクチン。

ｌＯ０抗原またはそのエピトニプが関連する病気の原因物質か、ブリオン、ウィルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項６記載のワクチン。

１１、製薬上許容し得る分量か体重７０ｋｇ当り２．０〜１００μｇであることを特徴とする請求項６記載のワクチン。

１２、製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであることを特徴とする請求項１１記載のワクチン。

１３、　（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上許容し得る担体または希釈剤を含むワクチンを病気にかかりやすい人に投与することを特徴とする病気の予防方法。

１４、上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１３記載の方法。

１５、Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラス■、ＭＨＣクラス■、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ− ８に対する抗体、レクチン、リンフ才力イン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１３記載の方法。

１６、病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項１３記載の方法。

１７、抗原またはそのエピトープか関連する病気の原因物質が、プリオン、ウィルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項１３記載の方法。

１８、製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り２．０〜１００μｇであることを特徴とする請求項１３記載の方法。

１９、製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当りｌＯ〜２０μｇであることを特徴とする請求項１８記載の方法。

２０、　（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上許容し得る担体または希釈剤を含むワクチンを病気に苦しむ患者に投与することを特徴とする病気の治療方法。

２１、上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０記載の方法。

２２、Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラス■、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ− ８に対する抗体、レクチン、リンフ才力イン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）、、（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項２０記載の方法。

２３、病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項２０記載の方法。

２４、抗原またはそのエピトープか関連する病気の原因物質か、プリオン、ウィルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項２０記載の方法。

２５、製薬上許容し得る分量か体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであるこることを特徴とする請求項２０記載の方法。

２６、製薬上許容し得る分量か体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであることを特徴とする請求項２５記載の方法。

２７、病気に対し活性である、患者のＴ細胞の存在を検定することにより病気を診断するに当り、異種官能性細胞免疫剤の患者からのＴ細胞との結合を測定して上記病気に対し活性のＴ細胞の特定のクラスまたはサブクラスの存在を決定し、この際上記異種官能性細胞免疫剤が共有結合的に結合する少（とも２種のＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方か特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他のＴ細胞特異結合リガンドか病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープであることを特徴とする病気の診断方法。

２８、上記Ｔ細胞か、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２７記載の方法。

２９、Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドか、ＭＨＣクラス■、ＭＨＣクラス■、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ− ８に対する抗体、レクチン、リンフ才力イン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリー（Ｅ／Ｋ）、　（６０：４０）と［ａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項２７記載の方法。

３０、病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項２７記載の方法。

３１、抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、ブリオン、ウィルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項２７記載の方法。

３２、Ｔ細胞の存在を、リンパ球増殖検定Ｃｒ”“遊離検定、カルボキシフルオレセインジアセテート吸収検定、リンパ球移行抑制検定、リン酸化検定、遅延型過敏検定および染料を使用するＴ細胞結合検定からなる群から選ばれた検定を用いて検定することを特徴とする請求項２７記載の方法。

国際調査報告＋ｌＩ＋、−ａ−＾＊ｗ−ｔ−ｒ−ＴＩ−、ＰＣＴ／ＬＩＳ８９１０２５０３

Claims

【特許請求の範囲】

１．共有結合的に結合する少くとも２種のＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気若しくは病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープであることを特徴とする異種官能性細胞免疫剤。
２．上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞からなる群から選ばれたことを特徴とする請求項１の免疫剤。
３．Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ− ８に対する抗体、レクチン、リンフォカイン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の免疫剤。
４．病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項１記載の免疫剤。
５．抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、プリオン、ウイルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項１記載の免疫剤。
６．（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上許容し得る担体または希釈剤を含むことを特徴とする病気の予防または治療用ワクチン。
７．上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれたことを特徴とする請求項６記載のワクチン。
８．Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ− ８に対する抗体、クレチン、リンフォカイン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項６記載のワクチン。
９．病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項６記載のワクチン。
１０．抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、プリオン、ウイルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項６記載のワクチン。
１１．製薬上許容し得る分量が体量７０ｋｇ当り２．０〜１００μｇであることを特徴とする請求項６記載のワクテン。
１２．製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであることを特徴とする請求項１１記載のワクチン。
１３．（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上許容し得る担体または希釈剤を含むワクチンを病気にかかりやすい人に投与することを特徴とする病気の予防方法。
１４．上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１３記載の方法。
１５．Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ −８に対する抗体、レクチン、リンフォカイン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１３記載の方法。
１６．病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
１７．抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、プリオン、ウイルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
１８．製薬上許容し得る分量が体量７０ｋｇ当り２．０〜１００μｇであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
１９．製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
２０．（Ａ）共有結合する少くとも２つのＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他方のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープである異種官能性細胞免疫剤の製薬上有効量と、（Ｂ）製薬上許容し得る担体または希釈剤を含むワクチンを病気に苦しむ患者に投与することを特徴とする病気の治療方法。
２１．上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０記載の方法。
２２．Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、リンバ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ −８に対する抗体、レクチン、リンフォカイン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項２０記載の方法。
２３．病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
２４．抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、プリオン、ウイルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
２５．製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであるこることを特徴とする請求項２０記載の方法。
２６．製薬上許容し得る分量が体重７０ｋｇ当り１０〜２０μｇであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
２７．病気に対し活性である、患者のＴ細胞の存在を検定することにより病気を診断するに当り、異種官能性細胞免疫剤の患者からのＴ細胞との結合を測定して上記病気に対し活性のＴ細胞の特定のクラスまたはサブクラスの存在を決定し、この際上記異種官能性細胞免疫剤が共有結合的に結合する少くとも２種のＴ細胞特異結合リガンドを含み、上記Ｔ細胞特異結合リガンドの一方が特定のクラスまたはサブクラスのＴ細胞に結合し他のＴ細胞特異結合リガンドが病気または病気の原因物質と関連する抗原またはそのエピトープであることを特徴とする病気の診断方法。
２８．上記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、補助Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞障害Ｔ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
２９．Ｔ細胞の特定のクラスまたはサブクラスに結合する上記Ｔ細胞の特異結合リガンドが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、リンパ球機能関連分子−３、ＣＤ−２に対する抗体、ＣＤ−３３に対する抗体、ＣＤ−４に対する抗体、ＣＤ −８に対する抗体、レクチン、リンフォカイン、免疫グロブリンのＨ鎖のＦｃ領域の部分、ｄ−ポリ−（Ｅ／Ｋ）ｎ（６０：４０）とＩａ＋から成る群から選ばれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
３０．病気に関連する上記抗原またはそのエピトープがアレルゲン、腫瘍抗原または自己免疫関連抗原であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
３１．抗原またはそのエピトープが関連する病気の原因物質が、プリオン、ウイルス、細菌、菌類、原生動物または寄生体であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
３２．Ｔ細胞の存在を、リンパ球増殖検定Ｃｒ＋＋＋遊離検定、カルボキシフルオレセインジアセテート吸収検定、リンパ球移行抑制検定、リン酸化検定、遅延型過敏検定および染料を使用するＴ細胞持合検定からなる群から選ばれた検定を用いて検定することを特徴とする請求項２７記載の方法。