JPS61501912A - 合成ポリペプチドにより誘発されたヒトインタ−ロイキン−２に対する抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 合成ポリペプチドにより誘発されたヒ トインターロイキン−２に対する抗体 技術分野 本発明は、（ａｌ各ポリペプチドが、リンホカイン特にインターロイキン−２の エビ１−−ブ又は決定基部分のアミノ酸残基配列に実質的に対応するアミノ酸残 基配列を含むところの化学的に合成されたポリペプチド、ポリペプチドのポリマ ー及び担体に結合されたポリペプチドの接合体；Ｑ＋）ポリペプチド及びそれか ら作られた抗体の製造法及び使用法；及び（Ｃ１評価されるサンプル中のインタ ーロイキン−２の存在及び量を測定するための診断系に関する。

背景 免疫応答は、種々の効果器及び細網内皮系の調節細胞の間の複雑な相互反応を含 む、脳腺由来リンホカインつまりＴ細胞は、これらの相互反応において重要で役 割を演じる。Ｔ細胞は、いくつかの効果器機能たとえばマクロファージによる標 的細胞のリシスを仲介し、また体液性及び細胞性免疫応答を調節する。

Ｔヘルパー細胞が抗体反応においてＢ細胞と協力することが確認されるや、免疫 学者はそのような相互反応を仲介する可溶性因子を探索しはじめた。

ダ、トン（Ｄｕｔｔｏｎ）ら、プログ・イミエノル（Ｐｒｏｇ、　Ｉｍ＋ｍｕｎ ｏ１．）。

１３５５　（１９７１）は、下記因子を産生ずる細胞及び関連する受容体部位を 持つ他の細胞の間のシグナルとして挙動する可溶性生成物又は因子を報告した。

この研究は、抗体反応を増大する因子の能力を示し、多数の同様な研究が続いた 。活性化されたＴ細胞により主に作られた可溶性因子が免疫系において深入な調 節効果を持つことが今では良く報告されている。アルドマン（八１ｔＩｌａｎ） 　ら、Ａｄν、　Ｉｍｍｕｎａｌ、、　３３．７４（１９８２）。

細胞性免疫反応の多数の効果に責任あるリンパ細胞の可溶性因子が、リンホカイ ンと呼ばれる。最近まで、リンホカイ゛／は、特定の生化学的及び生物学的特性 によるよりも、特定の評価におけるそれらの生物学的活性により、すなわち機能 的に定義された。このアプローチは、専門用語の不正確かつ冗長な系をもたらし た。

評価を引き出す定義に結びつく拘束を取除くために、リンホカインを記述する新 しい系が開発された。この系は、いくつかのリンホカイン活動が実際に単一の生 化学体の種にの生物学的局面であることを明らかに示す多数の独立の及び協同の 研究に基づく、たとえばアーデン（Ａａｒｄｅｎ）ら、Ｊ、　Ｉｍ−ｕｎｏｌ、 、　１２３．２９２Ｂ　（１９７９）を参照されたい、「インターロイキン」と いう分集（リンパ細胞の間を意味する）は、リンパ細胞の種々の集団の間でシグ ナルとして働く能力を持つリンホカインを指すために選択される。

本明細書で特に興味あるリンホカインは、以前にはＴ細胞成長因子（ＴＣＧＦ） として知られていたインターロイキン−２（ＩＬ−２）である、ＩＬ−２の産生 及び活動のメカニズムは、スミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）、イムノロジー　レビｘ　− （１ｍ＋ｗｕｎｏ１．　［ｌｅｖ、）、５１．３３７　（１９８０）により提寓 されている。そのモデルによれば、マクロファージが抗原により活性化されてイ ンターロイキン−１（ＩＬ−１）を作る。抗原は、それに対して細胞が敏感にさ れる特定の物質又は非特異的***促進物質たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨ Ａ）　、コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ＾）又はポソクウィード***促進物質（Ｐ ＷＭ）であることができる、抗原はＩＬ−１と共に、一連のＴ細胞に対し分化シ グナルを与える。この分化は、ＩＬ−２産生及び分泌を結果する。

同時に、抗原はマクロファージ依存シグナルと共に又はなしで、別の一種のＴ細 胞を刺激して、ＩＩ、−２のための表面受容体を示す、ＩＬ−２とその細胞受容 体の間の相互作用は、異る機能サブセットに属するＴ細胞の増殖を結果する。す なわち、ＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖のための普遍的シグナルを提供する。

免疫応答におけるその重要な役割を仮定すると、ＩＬ−２のレベル及び活動にお ける欠陥が種々の疾病状態において見られることは驚ろくにあたらない、アルド マン（Ａｌｔ＋＊ａｎ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、門ｅｄ、、１５４、？９１　（１９ ８１）は、全身性エリトマト−デス（ＳＬＥ）を示す自己免疫マウス系統がＩＬ −２産生及び応答性における深入な欠陥を持つことを報告した。これら知見は後 に、バレラ（Ｖａｒｅｌａ）ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｊｎｕｅｓｔ、、６９．１ ３８８　（１９８２）及びリンカーイスラエリ　（Ｌｉｎｋｅｒ　−Ｉｓｒａｅ ｌ　ｉ）ら、ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１３０ ．２６５１　（１９８３）により、ＳＬＥを持つヒトにおいて例証された。

ＩＬ−２欠陥はまた、年とったマウス及びヒトにおいて見られた。トーマン（Ｔ ｈｏｍａｎ）　ら、Ｊ、　Ｉ＋ｗｍｕｎｏ１．、１２８．２３５８（１９Ｂ　２ ）及びギリス（Ｇｉｌｌｉｓ）ら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６７（ １９８１）。同様の欠陥が、−次免疫欠陥をわずらう子供において〔フロメルベ ルグ（Ｆ１ｏ＋＋＋ｅｒｂｅｒｇ）ら、Ｊ、Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．．１３０．２６ ４４　（１９８３））、同種間骨髄移植を受けた者において〔ワレン（Ｗａｒｒ ｅｎ）　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１．１７７１（１９８３））及び 寄生体感染マウスにおいて〔レイチー（Ｒｅｉｎｅｒ）　ら、　Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕ ｎｏ１．１３１．１４８７　（１９８３））報告された。そのような欠陥はまた 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、悪性腫瘍において、及び成るウィルス感 染においても強く疑われる。

ＩＬ−２の生物学的作用のいくつかは、たぶん治療的意味を持つ、一つの例は、 細胞障害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）を含むキラー細胞のいくつかのタイプ〔ワグ ナ−（Ｗａｇｎｅｒ）ら、Ｉｍ＋＊ｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、＋　５１．２１５　（ １９８０））−自然のキラー（ＮＫ）細胞（ヘニ−（Ｈｅｎｎｅｙ）ら、ネイチ ア（Ｎａｔｕｒｅ）、２９１．３３５　（１９８１））及びリンホカイン活性化 キラー（ＬＡＫ）細胞〔グリム（Ｇｒｉ＋ｎ＋）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 、１５５．１８２３　（１９８２））の活動を誘発する又は増大する能力である 。これらキラー細胞の各々は、インビトロで腫瘍標的細胞を分解（Ｉｙｓｅ）で き、かつ悪性腫瘍の決定及び監視においてインビボ効果器細胞として関係づけら れる。

さらに、精製されたＩＬ−２が、マウスにおいて確立されたＴ細胞白血球の退行 を起すことにより、敏感にされたＴ細胞及び化学的治療剤の有効性を増大するで あろうことが最近示された。チーバー（Ｃｈｅｅｖｅｒ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、、１５５．９６８（１９８２）。

リンホカインの存在を血清学的に検出できる剤は、その生物学的効果をモニター するのとは違って、病気を診断するにおいて及びＴ細胞関連免疫欠陥のための免 疫治療剤において価値がある。特に、ＩＬ−２に反応性の抗体は、ＩＬ−２生物 学的活動の可能な決定的研究免疫精製、ＩＬ−２免疫評価法の開発、この分子の 活性部位の同定、及び免疫応答におけるＴ　Ｌ−２の生物学的活性を決定するた めの一連のインビボ研究を可能にする。

最近の報告は、ＩＬ−２に反応性のモノクローナル抗体を開発することが可能で あることを示唆する。今日まで、これら抗体の開発における主な問題は、免疫化 及び血清学的評価が可能になるように精製され濃縮された形で十分なＩＬ−２蛋 白質を蓄えることの困難さである。抗ＩＬ−２活動を得るために均質なＩＬ−２ で免疫化することは必須ではないけれど、少くともマククログラム量のＩ　Ｌ− ２蛋白質で免疫化することが重要である。しかし抗ＩＬ−２活動を認識する免疫 評価の開発は、比較的純粋なＩＬ−２の使用を必要とする。

ＩＬ−２の精製された量を得ることの困難性は、従来のＩＬ−２調整法の二つの 欠点を反影する。第一に、多数のリンホカインが、単一のクローンされたＴ細胞 源により分泌されうる。

このことは、特定のリンホカインの単離をかなり困難にする。

第二に、精製手順は数段階を含み、比較的多量のＩＬ−２含有培養基を必要とす る。

ｒＬ−２の可能性ある治療的価値の別の例は、抗原と一緒に、無脳腺ヌードマウ スにおいて機能細胞仲介免疫を誘発するその能力である。ワグナ−ら、ネイチア 、２４８．２７８　（１９８０）　。

無脳腺ヌードマウスは、脳腺を先天的に欠き、かつ脳腺由来リンパ細胞（Ｔ細胞 ）の顕著な欠陥を持つ無毛マウスである。この知見は更に、ＩＬ−２が、Ｔ細胞 関連免疫欠陥の成る状態における免疫治療能力を持つことを示唆する。

本発明の簡単なまとめ 本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＴＬ−２）のアミノ酸残基配列の一部分 に実質的に対応するアミノ酸残基配列を持つ比較的短い合成ポリペプチドを免疫 原として用いるヒトインターロイキン−２に対する抗体の製造に関する。とくに 、１３〜１５のアミノ酸から成る８つのポリペプチド（第１図及び第２図参照） が化学的に合成された。これら合成ポリペプチドは、本明細書でＩＬ−２ポリペ プチドと呼ばれる。

ＩＬ−２ポリペプチドは、蛋白質担体に接合され、ラビット及びマウスを免疫化 するために用いられた。得た免疫血清は、部分的に精製された扁桃腺由来ヒ）　 Ｉ　Ｌ−２に対する反応性についての固相酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬＩＳＡ ）においてスクリーンされた。８つのポリペプチドのうち４つにより誘発された 抗体、詳しくはオリゴクロ−ナ抗体は、ヒトＩＬ−２に対して反応する（結合す る）ことが見られた。

本発明の合成ポリペプチドは、約６〜約４０のアミノ酸残基、好ましくは約１０ 〜約２０のアミノ酸残基を含み、インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸 残基配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む、各合成ポリペプチドは、単独 で、ポリマーとして、又は担体に結合された接合体としてを動量で生理学的に許 容される希釈剤中で宿主に注入された場合、ＩＬ−２の抗原決定基に対する抗体 の産生を誘発する能力を持つ。

とくに、下記の四つのポリペプチド（左から右へかつアミノ末端からカルボキシ 末端の方向に書いて）により誘発された抗体は、ヒトＴＬ−２に結合することが 見い出された。

ＴｈｒＡｓｎＳｅｒＡ　１　ａＰｒｏＴｈｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＬｙｓ　 ＬｙｓＴｈｒＧ　］ｎＬｅｕ　；ＬｅｕＧ　ＩｕＧ　］　ｕＧ　１　ｕＬｅｕＬ ｙｓ　ＰｒｏＬｅｕＧ　ｌ　ｕＧ　１　ｕＶａ　ＩＬｅｕＡ　５ｎＬｅ旧Ｖａ　 １１１　ｅＶａ　ＩＬｅｕＧ　Ｉ　ｕＬｅｕ　ＬｙｓＧ　ｌ　ｙｓｅｒＧ　ｌ　 ｕＴｈｒＴｈｒＰｈｅＭｅ　ｔｃｙｓ　；及びＡｓｎＡｒｇＴｈｐ　Ｉ　１　ｅ ＴｈｒＰｈｅｃｙｓＧ　Ｉ　ａｓｅｒ　Ｔ　Ｉｅ　Ｉ　１　ｅＳｅｒＴ　ｈｒＬ ｅｕＴｂｒ本明細書で定義されるようなオリゴクローナル抗体は、約６〜約４０ のアミノ酸残基を含む中庸な長さのポリペプチド上のエピトープにより誘発され かつこれに結合する免疫応答の免疫グロブリン生成物である。オリゴクローナル 抗体は通常、−より多い細胞により作られた受容体の混合物である。そのように 作られたオリゴクローナル受容体は通常、それらの結合において、蛋白１に鎖（ 単数又は複数）の長さ全体に亘ってエピトープ性領域を持ちうる全蛋白質分子に 対して生じたポリクローナル受容体よりもエピトープ的により特異性である。こ こで有用なポリペプチドで免疫化された動物は、オリゴクローナル受容体（抗体 ）を含む血清を作る。

これら抗体のＴＬ−２との反応性は、下記の研究により確認された：ａ）ＩＬ− ２生物学的活性及び免疫反応性の同一のプロフィールが観察され、次に粗ＩＬ− ２上澄みの順次かつ独立のクロマトグラフ研究が行われた；ｂ）抗ポリペプチド 及び抗ＩＬ−２活性が同じ分画でペプチド免疫親和性カラムから溶離された；Ｃ ）親和性精製された抗ＩＬ−２ポリペプチド抗体はジュルカ７　）　（Ｊｕｒｋ ａｔ）白血病Ｔ細胞系統から誘発された電気泳動的に純粋なヒトＩＬ−２に結合 した；またｄ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル上で、ＩＬ−２ポリペプ チドの一つ（Ｐ８４）により誘発された親和性精製されたラビット抗体は、ウェ スターンプロット分析により測定して１５，０００〜１８．０００ダルトンの蛋 白質を免疫沈降した。

また、ＩＬ−２生物学的活性が、ゲル中のほぼ同じ位置から溶離された。親和性 精製された抗Ｐ８４抗体は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激されたヒト末 梢血リンパ細胞（Ｐ　Ｂ　Ｌ）の細胞質を特異的に着色した。また抗ＩＬ−２ポ リペプチド抗体は、ＥＬＩＳＡ法において純粋なヒト組換えＩＬ−２（Ａｌ１換 えＩＬ−２としても知られている）に結合した。

本発明はまた、抗体産生細胞、及び骨髄腫又は僅か一つの受容体分子を分泌する 別の自己侵害性細胞系統がら融合された単一細胞のクローンにより作られた受容 体であるモノクローナル抗体に関する。そのような受容体は最初に、コーラ−（ にｏｈｌｅｒ）及びミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、ネイチア、２５６． ４９５（１９７５）により記述された。引用することによりその記載をここに組 込む。

本明細書で示されるように、合成ＩＬ−２ポリペプチドに対するオリゴクローナ ル及びモノクローナル抗体は、インターロイキン−２を研究するため、及び生物 的液中のｒＬ−２のレベル及びそのようなレベルと病気との関連を測定するため の定量的評価を開発するための有用なプローブである。

とくに、本発明の一実施態様は、インターロイキン−２の抗原決定基の存在の評 価のための診断系に関する。この系は、本発明のオリゴクローナル及びモノクロ ーナル抗体を含む第一〇′包装を含む、これら抗体の所定量がＩＬ−２を含む水 性組成物の所定量と混合されるとき、免疫学的反応により複合体が形成される。

複合体の存在は、好ましくは系の第二の包装中に含まれるラベルにより決定する ことができる。

本発明の更に別の実施Ｂ様において、オリゴクローナル及びモノクローナル抗体 は、インターロイキン−２を結合し精製するのに有用な親和性吸着体の活性な結 合部分を形成する。ここで抗体は、ＩＬ−２に対し化学的に不活性な固体支持体 たとえばアガロース又は架橋結合したアガロースにリンクされる。そのように準 備された親和性吸着体は次に、ＩＬ−２含有水性組成物と混合されることができ 、可逆的抗体−抗原複合体を形成し、これはその後解離されて、精製された形の ＩＬ−２を与える。

本発明の更に別の利点、利益及び用途は、以下の詳しい説明、実施例及び請求の 範囲から、当該分野に習熟した者にとって明らかであろう。

図面の簡単な説明 本開示の一部を成す図面において： 第１図は、呑口ら、ネイチア、３０２．３０９　（１９８３）により決定された インターロイキン−２の１５３のアミノ酸配列を示す。本発明に従う合成のため に選択された蛋白質の領域は、アンダーラインにより示されている。アンダーラ インのどちらかの端の文字Ｃは、−次配列では見られないシスティンの付加を示 す、下記の一文字コード及び慣用の三文字コード（第２図を見よ）は、表記され るアミノ酸に対応する二Ａ、Ａｌａ（Ｌ−アラニン）；Ｃ，Ｃｙｓ　（Ｌ−シス ティン）；Ｄ、Ａｓｐ（Ｌ−アスパラギン酸）；Ｅ、Ｇｌｕ　（Ｌ−グルタミン 酸）；Ｆ、Ｐｈｅ　（Ｌ−フェニルアラニン）　；Ｃ；、　Ｇｌｙ　（グリシン ）：Ｈ，Ｈｉｓ（Ｌ−ヒスチジン）；Ｉ、Ｉｌｅ　（Ｌ−イソロイシン）；に、 Ｌｙｓ　（Ｌ−リジン）；Ｌ、Ｌｅｕ　（Ｌ−ロイシン）；Ｍ、Ｍｅｔ（Ｌ−メ チオニン）；Ｎ、Ａｓｎ　（Ｌ−アスパラギン）；Ｐ、Ｐｒｏ　（Ｌ−プロリン ）；Ｑ、Ｇｌｎ　（Ｌ−グルタミン）；Ｒ，Ａｒｇ　（Ｌ−アルギニン）；Ｓ、 Ｓｅｔ　（、Ｌ−セリン）；Ｔ、Ｔｈｒ　（Ｌ−スレオニン）；Ｖ、Ｖａ　１　 （Ｌ−バリン）；Ｗ、Ｔｒｐ　（Ｌ−トリプトファン）；ａｎｄＹ。

Ｔｙｒ（Ｌ−チロシン）。

第２図は、Ｐ８１　（カルボキシ末端システィンを持っ残基１８−３２）；Ｐ８ ３　（カルボキシ末端システィンを持っ残基５ｌ−６４）；ＰＩＯ（残基６５− ７８）；Ｐ８４　（残基７９−９２）；ｐＨ（カルボキシ末端システィンを持っ 残基９４−１０８）；ＰＩ３　（残基１１１−１２５）；ＰＩ３　（アミノ末端 システィンを持つ残基１２６−１３８）；及びＰ８２（残基１３９−１５３）と 呼ぶポリペプチドのアミノ酸配列を、各アミノ酸に対し上述した慣用の三文字コ ードを用いて示す、残基位置数の各々は、第１図に示すＩＬ−２分子の左から右 へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向にとった位置に基づく。

第３図は、酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬＩＳＡ）におけるラビット抗Ｐ８２血 清の特異性を示す一連の三つのグラフ（パネルＡ％Ｂ及びＣ）を示す、ラビット 抗Ｐ８２血清（ＲαＰ　８２）　；同じラビットからの免疫化前血清（正常ラビ ット血清）　（ＮＲＳ）；及び過免疫ラビット抗Ｂ型肝炎ポリペプチド（ＲαＰ ７２）血清は、Ｐ８２（パネルＡ）、部分的に精製された扁桃腺ＩＬ−２ｔｍｌ 整物（パネルＢ）−又はＰ８１　（パネルＣ）をコーティングされたプレート上 で力価測定された。ＢＳＡコーティングしたプレートにおける背景反応を差引い た後に、数値が与えられる。

第４図は、可溶性ポリペプチドによるラビット抗Ｐ８４血清仲介ＥＬＩＳＡの抑 制を示す、ａ相性精製されたラビット抗Ｐ８４血清は、順次増大する濃度の可溶 性Ｐ８１又はＰ８４の存在下又は不存在下で、Ｐ８４をコーティングされた又は ＴＣＧＦ（ＩＬ−２）をコーティングされたプレートでインキュベートされた。

第５図は、精製されたジュルカソ）　（Ｊｕｒｋａｔ）誘発ＩＬ−２に対する抗 Ｐ８２抗体のＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応性を示す、！！！相性精製されたラビット抗Ｐ ８２又は抗ヒトＩｇＧ（対照）抗体は、ＩＬ−２をコーティングされた又はＢＳ Ａをコーティングされたプレート上で力価測定された。

第６図は、ＡｃＡ４４分画された扁桃腺由来ＩＬ−２の生物学的活性及びＥＬ　 Ｉ　ＳＡ反応性プロフィールを示す、２０ｍｊ！分画のサンプルが無希釈でＥＬ 　Ｉ　ＳＡにおいて微小力価プレートをコーティングするために用いられるが、 又は１：１００の希釈で生物学的活性についてテストされた。生物学的活性を欠 いた擬ＩＬ−２ｗＡ整物の分画がＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて並行してテストされた 。親和性精製されたラビット抗Ｐ８４　（１：　２００）がＥＬ　Ｉ　ＳＡで用 いられた。

第７図は、親和性精製された抗Ｐ８４抗体を用いる、粗製の扁桃腺由来の、ＩＬ −２含有上澄みのウェスターンプロ７ト分析を示す。１ｏｏｘ濃縮された上澄み からの電気泳動的に移動された蛋白質は、５μｇ　／　ｍ　ｌの親和性精製ラビ ット抗Ｐ８４抗体と反応された。パラレルゲルの２−厚さのスライスの溶離物は 、１　：　１００の希釈でＩＬ−２活動についてテストされた。

第８図は、親和性精製された抗Ｐ８４抗体による、ＰＨＡ刺激されたＰＨＡ刺激 されたＰＢＬの免疫螢光染色の写真である。

又は先に２０μｇ　／　ｍ　ｌのＰ８４で予備インキエベーシッンされた（パネ ルＢ）。

発明の詳しい記述 ■、導入 Ｔ細胞生育因子（ＴＣＧＦ）としても知られるインターロイキン−２（ＩＬ−２ ＞は、Ｔ細胞由来グリコプロティンである。

ＩＬ−２は、特異的細胞表面受容体〔ロブ（Ｒｏｂｂ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１５４．１４５５　（１９８１））へのその結合を通して成人Ｔ細胞 〔スミス（Ｓｗｉｔｈ）、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｏ、＋　５１．３３７（１ ９８０））の増殖のための普遍的シグナルを与えると考えられる。もともとＩＬ −２は、レクチン活性化Ｔ細胞の長期的生育を支持することが示されていた（モ ルガン（Ｍａｒｇａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１２８．８２１　 （１９７６）及びルセッティ（Ｒｕｓｃｅｔｔｉ）　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、＋　１１９．１３１　（１９７７））　。

ＩＬ−２の発見は、機能的な抗原特異的Ｔ細胞系統の確立へと進む〔ギリス（Ｇ ｉｌｌｉｓ）ら、ネイチア、２６８．１５４　、（１９７７））　。

ＩＬ−２研究の最近の進歩は、ヒ）ＩＬ−２に対するモノクローナル抗体を産生 ずるＢ細胞ハイプリドーマ〔スミスら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３１．１８０８　（１９８３）；及びロブら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０．５９９０　（１９８３）　 ）　；及び発現されることができ生物学的に活性なＩＬ−２へと翻訳されうるヒ ト相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の分子クローニング〔呑口ら、ネイチア、３０２ ．３０５　（１９８３））の開発をもたらした。

この分野における急速な進歩にも拘らず、ＩＬ−２の構造−機能相関は未知のま まである；たとえば活性部位に含まれる特定のアミノ酸残基はまだ知られていな い、更に、ギリスら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２０．２０２７　（１９７８）記載のように敏感かつ信幀で きるｌ　Ｌ−２バイオアフセイが利用できるが、この評価法は、生物的液体中の ＩＬ−２の定量のためにそれをルーチン的に用いることを妨げる種々の禁止的物 質に影響されやすい。

最近の研究は、合成ポリペプチドをレルナー（Ｌｅｒｎｅｒ）　Ｒ，Ａ、。

ネイチア、２９９．５９２　（１９８２）及びサツトクリフェ（Ｓｕｔｃｌｉｆ ｆｅ）ら、サイエンス、２１９．２６０　（１９８３）記載のように完全な蛋白 質中の所定の一部アミノ酸残基配列に対し特異的な抗体を誘発するために用いう ろことを示した。そのような抗体は、天然の蛋白質分子の文脈では免疫原性でな いポリペプチドに対してさえ生しられうる。

従って抗ポリペプチド抗体は、複雑な蛋白質の微細構造を分析するために強力な 道具である０本発明は、合成ポリペプチドに対する抗体を生じるそのような方法 論を用いる。抗体は、呑口ら１、ネイチア、３０２．３０５　（１９８３）に記 載のようなし）ＩＬ−２分子に刊行されたアミノ酸残基配列から導かれたい（つ かの合成ポリペプチドに対して生じられる。そのような抗体の特性の決定及び抗 ポリペプチド抗体がヒ）ＩＬ−２を認識しこれに結合する（反応する）証拠も記 載される。

本発明に従う合成ポリペプチドは、インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ 酸配列に免疫学的に実質的に対応する隣接するアミノ酸のアミノ酸残基配列を持 つ、このポリペプチドは、約６〜約４０のアミノ酸残基、好ましくは約１０〜約 ２０のアミノ酸残基を含む、ポリペプチドは、単独で又はポリマーとして又はキ イホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのような担体に結合された接合 体として生理的に許容される希釈ビヒクル中に有効量で入れられて宿主に投与さ れると、宿主において抗ポリペプチド抗体の産生を誘発する。

本明細書において、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という分集は互換的に用 いられる０合成ポリペプチドという分集は、天然に生じられた蛋白質及びそのフ ラグメントを含まないアミノ酸残基の化学的に構築された（生物学的な構築及び 分解と対比して）鎖を意味する。そのような合成ポリペプチドは、宿主において 抗ポリペプチド抗体の産生を誘発できる。

種々の文法形での「免疫学的に実質的に対応する」という表現は、記述されるポ リペプチド配列がポリペプチド及び抗原決定基に結合する抗体の産生を誘発する ことを意味して本明細書及び請求の範囲においてポリペプチド配列に関係して用 いられる。

種々の文法形での「実質的に対応する」という表現は、記述されるポリペプチド 配列上アミン末端及びカルボキシ末端の一方又は双方における三つまでのアミノ 酸残基及びポリペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基における保守的のみの置 換の含をを意味して本明細書及び請求の範囲においてポリペプチド配列に関係し て用いられる。

上で用いた「保守的置換」という分集は、一つのアミノ酸残基が別の生物学的に 類似の残基により置き代えられたことを示すことを意味される。保守的置換の例 としては、一つの疎水性残基たとえばＩｊｅ、Ｖａｊ！、Ｌｅｕ又はＭｅｔと別 の疎水性残基の置換、又は一つの極性残基と別の極性残基との置換たとえばＡｒ ｇとＬｙｓ、ＧｊｕとＡｓｐ、又はＧｊｎとＡｓｎなどの間の置換が挙げられる 。

いくつかの例では、イオン性残基と反対に荷電したイオン性残基との置換、たと えばＬｙｓによるＡｓｐの置換は、これらイオン性基が単に溶解度補助を与える だけであると考えられる点で当該分野で保守的と云われてきた。しかし一般に、 本明細書で検討する置換が全蛋白質と比べて比較的短い合成ポリペプチド抗原に おけるものである故に、イオン性残基と反対電荷の別のイオン性残基との置換は 、非イオン性残基とイオン性残基の間の置換、嵩高の残基たとえばＰｈｅ、　Ｔ ｙｒ又はＴｒｐと嵩高くない残基たとえばＧＪｙ、Ｉｌｅ及びｖａｉとの置換と 同じく急進的置換であると本明細書で考えられる。

「非イオン性」及び「イオン性」残基という分集は、生理的ｐＨ値において各々 、通常は電荷を持たない又は通常は電荷を持つアミノ酸残基を示すものとして通 常の意味で本明細書で用いられる。非イオン性残基の例としては、Ｔｈｒ及びＧ ｌｎが挙げられ、一方、イオン性残基の例はＡｒｇ及びＡｓｐである。

本発明の方法に従い、適当な宿主が生理的に許容される希釈剤中の合成ポリペプ チドの有効量で処理され、ここでポリペプチドはインターロイキン−２の抗原決 定基のアミノ酸配列に免疫学的に実質的に対応するアミノ酸残基配列を持つ、イ ンターロイキン−２の抗原決定基を！！！議しかつこれに結合しうる抗ポリペプ チド抗体がかくして作られる。

この方法において、得た「抗ポリペプチド抗体」は所定の特異性を持ち、ＩＬ− ２の抗原決定基に結合する抗体と実質的に同じ構造を持つ、このタイプの抗体は 、抗原決定基の構造を定義するための改善された手段を提供し、ならびに診断及 び治療のための手段を提供する。

「受容体」という分集は、たとえば免疫化された動物の血清中におけるような実 質的に純粋な形の抗体、又は実質的に純粋な形の抗体のイディオタイプ含有ポリ アミド部分（抗体結合部位）を意味するために本明細書で用いられる。ここで有 用な受容体は、少くとも生理的ｐＨ値及びイオン強度において水性溶液又は固相 でインターロイキン−２の抗原決定基と混合されると、これに少くとも結合する 。好ましくは、受容体はまた、約５〜約９のｐｉ範囲内で、萎留水のイオン強度 ないし約１Ｍ塩化ナトリウムのイオン強度のようなイオン強度でそのような抗原 決定基に結合する。

抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分は、抗原分子のエピトープに結合する 抗体の部分である。そのような部分としては、周知の酵素開裂法により抗体から 作られるＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’及びＦ　（ａｂ”）２フラグメントが挙げられ る。たとえばチオフィロポウロス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ）とディクソ ン（Ｄｉｘｏｎ）の米国特許第４．３４２．５６６号明細書参照、イディオタイ プ含有ポリアミドがそから得られるところの抗体は免疫原に対して又は免疫原に より生じられると記述されるので、イディオタイプ含有ポリアミド受容体はまた 、抗体からイディオタイプ含有ポリアミドを得るために開裂段階が必要であるこ とを理解したうえで、「生じられる」又は「誘発される」とも云われる。

本発明のオリゴクローナル受容体は、ハブテンにより修飾された異種蛋白質に対 して生じられた従来作られているポリクローナル受容体と区別されなければなら ない、これら受容体は典型的には、ハブテン修飾の部位に関して低い親和力のも のであり、抗体の多くは、非自己の、大きな蛋白質分子担体に対して生じられた 。

受容体はまた、モノクローナルである。モノクローナル抗体を作るための方法は 周知である０本発明で有用なモノクローナル抗体は、ニマン（Ｎｉｉ＋ａｎ）ら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８０．４９４９　（１９８３）に記載のように免疫原としてポリペプチドを用い て作ることができる。モノクローナル抗体は典型的には、ハイブリドーマ組織培 養物から、又はハイブリドーマ組織が導入された動物から得た腹水から得られる 。

本発明の方法は、天然に生じる蛋白質の抗原決定基を模倣し天然蛋白質に対して 反応性の誘発された血清の大きな分画をもたらす合成ポリペプチドに対する抗体 を作る。

本発明の別の面に従い、合成ポリペプチドに対する抗体を作る方法は、宿主中で 天然には免疫原性でない抗原決定基に対する抗体を生じるために使用できる。す なわち、巨大分子の成る部分は抗体により結合される能力を持つ（すなわち抗原 性である）が、抗体の産生を誘発しない（すなわち免疫原性でない）７本発明に 従い作られた抗ポリペプチド抗体は従って、完全な蛋白質分子との普通の免疫化 により作られた抗体に比べていくつかの明瞭な利点を持つ。

「抗原」という分集は歴史的には、抗体により結合されるものを指すため、及び 抗体の産生を誘発するものを指すために用いられてきた。極最近の使用法は、抗 原の意味を抗体により結合されるものに限定し、一方、「免疫原」という分集が 抗体産生を誘発するもののために用いられる。いくつかの例では、合成ポリペプ チドがポリペプチドに結合する抗体の産生を誘発するために用いられる場合のよ うに、抗原と免疫原が同じものである。しかし、同じポリペプチドが、免疫グロ ブリンのような完全な（全体の）蛍白質にも結合する抗体を誘発するために用い られることもでき、その場合ポリペプチドは免疫原かつ抗原であり、一方、免疫 グロブリンは抗原である。ここで述べるものが免疫原性かつ抗原性である場合、 それは一般に抗原と呼ばれるであろう。

本発明の更に別の面において、診断系及び診断法が開示される。これらの系及び 方法は、診断系又は方法において本発明のポリペプチドを利用し、又はこのポリ ペプチドを、診断系又は方法で直接用いられる本発明の受容体の産生を誘発する ために利用する。

本発明の更に別の面は、親和性（アフィニティ）＠着体を意図する。ここで本発 明のポリペプチドは、抗体のような本発明の受容体の産生を誘発するために用い られる。この受容体は、架橋デキストリンのような支持体にカップルされて、体 サンプルから天然に生じたｌ　Ｌ　−２を得て精製するために用いうる観相性吸 着体を形成する。

■、モノクローナル受容体の製造 免疫原性ポリペプチド及びＩ　Ｌ　−２蛋白質リガンド（このアミノ酸残基配列 にそのポリペプチドが部分的に対応する）の両者を認識するモノクローナル受容 体を成功裡に調製するために、下記に概説する段階を追打しなければならない。

免疫原性ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチドの接合体が用意さ れる。このポリペプチドは、中庸な長さ、たとえば約６〜約４０のアミノ酸残基 、好ましくは約１０〜約２０の残基のアミノ酸残基配列を持つ、免疫原性ポリペ プチドのアミノ酸残基配列は、リンホカインたとえばｒＬ−２のアミノ酸残基配 列の一部に対応する。免疫原性ポリペプチドはそれ単独でリガンドとして用いう るが、担体たとえばキイホールリンベントヘモシアニン（ＫＬＨ）、アルブミン たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、赤血 球細胞たとえばヒツジ赤血球、破傷風トキソイド及びエデスチン、ならびにポリ 　（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸などに結合された接合 体としてポリペプチド免疫原を用いることが好ましい。

ポリペプチドの免疫原性及び抗原性は、ポリペプチドをキイホールリンベットヘ モシアニン担体に結合して接合体とし、次にこのように作られた接合体をマウス を免疫化するために用いることによってテストできる。有用なポリペプチドは、 １ケ月間に３回の免疫化後に少くとも約１：４００希釈度であるポリペプチドに 対する免疫化マウスの血清の５０％結合力価を作るに十分に免疫原性かつ抗原性 である。ここで免疫化の各々は、接合体中に少くとも約１０μｇ、好ましくは少 くとも約５０μｇのポリペプチドを含み、最初の免疫化のために完全なフロイン トのアジュバントを用い、その後は了シュバントとして明ばんを用いる。

このテスト手順は、免疫原としての所与のポリペプチドの使用の前に行われる必 要はないが、しかしどのポリペプチドが望むモノクローナル受容体を作るにおい て有用であるかを決める予備スクリーニング法としてそうすることが好ましい、 予備スクリーニングとして用いられるのかどうかに拘らず、免疫原としてここで 有用なポリペプチドは、上述の免疫化法を用いて上述の力価を与える。

免疫原性ポリペプチドが準備されると、マウス、ラビット、ヤギ、ウマなどの動 物が免疫原性ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチドの接合体を用 いて過免疫化されて、その受容体分子が少くとも約１：４００希釈度のポリペプ チドに対する５０％結合力価を示すところの過免疫血清を与える。すなわち、ペ プチドの免疫原性を予備テストするために用いられることが望まれたのと同じ動 物、マウス、をＭａｂを生じるために用いることができる。

過免疫状態を与えるために必要な免疫化法は知られるように、なかんずく動物の タイプ、動物体重、ポリペプチド及び担体（もし用いられるなら）及びアジュバ ント（もし用いられるなら）の免疫原性及び量、及び所定の期間に投与される免 疫化の数の関数であることを注記する。少くとも約１：４００の５０％結合力価 希釈度を得るために上述の手順は、テストマウスにおいて過免疫状態を与え、他 の動物において過免疫状態を誘発するための比較化できる基礎として用いうる。

また、過免疫化状態を与えるために３回の免疫化が必ずしも要求されず、しがし 有用なポリペプチドでは１ケ月におけるそのような３回の免疫化がその状態を作 るために十分であり、さもなくばポリペプチドはハイブリドーマ及び本発明のそ のモノクローナル抗体の高収量産生のために十分に免疫原性ではないことも注記 する。

過免疫化動物においてそのように作られた血清受容体分子はまた、免疫原性ポリ ペプチドがアミノ酸残基配列において対応するところのＩＬ−２の部分に結合す る。これら結合評価は、後記の材料及び方法の部で述べられる。ＩＬ−２の純粋 なサンプルがこれら評価で用いられる必要はなく、むしろＩＬ−２を含む細胞抽 出物又は組ｖ＆調製物たとえば顕微鏡スライドを用いることができることを注記 する。

過免疫化された動物は、少くともｉ：４ｏｏ希釈度の５０％結合力価を作る免疫 化の投与後少くとも約３０日間更に免疫化を投与することなく維持される、すな わち生かし続けられる。

云い換えれば、動物は最初に、過免疫化状態を与えるべく免疫化され、次に過免 疫は減少することを許される。

結合活性の減少は典型的には、マウスで１〜約５ケ月かかる。

結合力価のこの減少は、プライムされた芽細胞が、免疫原が再び導入されたとき に激しい応答を起すことができるようになる期間に対応すると考えられる。

免疫原性ポリペプチド又はその接合体を用いるたとえば静脈内注射による促進免 疫化は、維持の期間が終った後すなわち最後の免疫化の少くとも３０日後に動物 に投与される。促進された動物のヒ臓細胞又はリンパ細胞のような抗体産生細胞 は次に、ハイブリドーマ細胞を作るために促進投与の日から約３〜約５日内に同 し又は異る動物タイプからの骨髄腫細胞系統と融合される。促進は、芽細胞の成 熟を、これら細胞がポリペプチドに対するオリゴクローナル抗体のほぼ最適量を 分泌する点まで刺激すると考えられる。

Ｐ３ｘ６３又は５Ｐ２１０、ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｈ ＡＴ）感受性の骨髄腫細胞系統が、マウスヒ臓細胞との融合において用いるのに 好ましい。しかし他の細胞系統も用いうる。ハイブリドーマ細胞はその後、非産 生性細胞による過増殖を低減するため及びインビトロ条件下で容易に増殖する細 胞のための選択法を与えるために、食餌層又はマクロファージの存在又はその必 要性のない制限的希釈度でクローンされる。

そのように作られたハイブリドーマ細胞は、次に免疫原性ポリペプチドがアミノ 酸残基配列において対応するところのＩＬ−２の決定基部分に結合するモノクロ ーナル受容体分子の産生（分泌）について評価される。その後、ＩＬ−２に結合 するモノクローナル受容体分子を産生ずるハイブリドーマ細胞が、追加的量のこ れらハイブリドーマ細胞、及びＴＬ−２に結合するこれら細胞により分泌される モノクローナル受容体を作るために更に培養される。典型的には、そのような培 養は、制限的希釈度で、たとえば培養物増殖くぼみ当り平均約１細胞で行われる 。

好ましい実施において、作られたハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチド免疫 原ならびにＩ　Ｌ−２に結合するモノクローナル受容体分子の産生について評価 される。その後、免疫原性ポリペプチド及びＩＬ−２の両者に結合するモノクロ ーナル受容体分子を産生ずるハイブリドーマ細胞が、好ましくは培養される細胞 である。

ＩＬ−２のサンプルが限られる場合、免疫原性ポリペプチドに結合するモノクロ ーナル受容体の分泌について最初にハイブリドーマをスクリーンすることが便利 である。このポリペプチドへのボジチブな結合を示すハイブリドーマクローンは 次に、貯蔵のために凍結される。それらは次に、多数のモノクローナル受容体が 多数の異るハイブリドーマ細胞から作られるのではなくて、真にモノクローナル な抗体が作られたことを確かめるために制限的希釈によりサブクローニングされ る。これら制限的希釈サブクローニング培養物は典型的には、必要とされな０食 餌層またはマクロファージなしで再び実施される。

終局的に作られるハイブリドーマ細胞は、周知のようなそのような細胞のための 通常のインビトロ組織培養法に従って培養できる。より好ましくは、ハイブリド ーマ細胞は、類領の周知法を用いて動物において培養されて、そのように発生さ れた腹水からモノクローナル受容体が得られる。腹水の発生のために用いられる 動物は典型的には、スクリブス　クリニック　アンド　リサーチ　ファンデーシ ラン（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ ｔｉｏｎ）、う・ジララ、カリ７ｒ−ＪＬ／ニーアノマウス舎で飼育されたＢ　 Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスであり、しかしマウス以外の動物がハイブリドーマの 製造のために用いられるとき、マウス又はこの動物タイプが腹水の製造のために 用いられる。

■　考察 ここで与えられたデータは、天然のヒトＩＬ−２と反応性の抗体がヒトＩＬ−２ 分子の既知のアミノ酸残基配列から導き出された合成ポリペプチドにより免疫化 されたラビット及びマウスにおいて作られることを示す、この配列は、ヒトＩＬ −２をコードする最近クローニングされたｃＤＮＡから推論され、直接蛋白質配 列決定〔スミスら、Ｊ、　Ｉｗｍｕｎｏｌ、、前出、及びロブら、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、前出〕により少くとも部分的に確 認された。

いくつかの証拠が、ここに述べる抗ポリペプチド抗体が天然のヒ、ト■Ｌ−２を 認識することを明確に示す。第一に、抗ＩＬ−２ポリペプチド血清は、部分的に 精製された扁桃腺由来ＩＬ−２に（ならびに免疫化ポリペプチドに）結合し、し かし免疫化部血清又は無関係なポリペプチドに対する過免疫血清は結合しない、 しかし抗ＩＬ−２ポリペプチド血清は、無縁なポリペプチド又は擬ＩＬ−２調製 物に結合しない、また！Ｌ−２への結合は、可溶性免疫化ポリペプチドにより特 異的に禁止される。

加えて、粗ＩＬ−２含有上澄みが種々の分離原理（すなわちＡｃＡ−４４、Ａｆ ｆｉゲルブルー又はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ　クロマトグラフィ）に基づく いくつかの独立の工程により分画されるとき、生物学的活性と免疫反応性とのプ ロフィール間の優れた相関が観察される。

本発明の抗ポリペプチド抗体が天然のヒ）！Ｌ−２を認識することをここで示す 別の証拠としては下記が挙げられる。（１）抗ポリペプチド及び抗ＩＬ−２活性 がペプチド免疫親和性カラムから共溶離する。（２）親和性精製された抗ポリペ プチド抗体は、本質的に純粋であると考えられるエレクトロフォーカスされたジ ュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）由来ＩＬ−２Ｃロブら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｓｄ。

前出〕に結合する。　ｆ３）　Ｉ　Ｌ　−２生物学的活性及び免疫反応蛋白質（ ウェスターンプロット分析により同定された）は、粗製の扁桃腺由来の、ＩＬ− ２含有上澄みが５ＤＳ−ＰＡＧＥにより４分離されるときほとんど同じ位置に移 行する。また（４）ヒトＩＬ−２ポリペプチドの一つに対する親和性精製された 抗体は、ミトゲン活性化されたヒト末梢血液リンパ細胞において特異的着色反応 を作る。抗ＩＬ−２ポリペプチドは、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法において純粋な又は組換 えのＩＬ−２に結合する。後記の結果の部でより詳しく説明されるこれらの独立 の知見は一致して、ここで述べる抗ポリペプチド抗体がヒトＩＬ−２分子を認識 することを示している。

興味あることに、ポリペプチドＰ１２、Ｐ８１、Ｐ８２又はＰ８４に対する親和 性精製抗体は、ヒ）ＩＬ−２の生物学的活性を中和せず、またＩＬ−２含有上澄 みからＩＬ−２を免疫沈降しなかった。このことは、生物学的活性のために必要 なアミノ酸残基配列が、抗ＩＬ−２抗体を誘発したこの四つのポリペプチドには 全体的に又は部分的に欠けていることによるのであろう、ウィルス保護又は蛋白 質活動の禁止のための抗体を誘発するために特定のアミノ酸残基配列が必要であ ろうという事実は、***について〔ブリトル（Ｂｒｉｔｔｌｅ）ら、ネイチア 、２９８．３０（１９８２））及びｐｐ５０ｓｒｃ形質転換性蛋白質のチロシン 特異的キナーゼ活動について〔ゲントリイ　（Ｇｅｎｔｒｙ）ら、Ｊ、、Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、＋　２５８．１１２１９　（１９８３））各々先に示されて いる。

一方、抗体の成るものがＩＬ−２活動を禁止する又は溶液中のＩ　Ｌ−２と反応 することに失敗することは、親和性（アフイニティ）問題を表わすかも知れない 、たとえば、天然ＩＬ−２に対して生じられた抗体の場合でさえ、ＩＬ−２活動 を中和するために大過剰の抗体が必要とされることが示されている［スミスら、 Ｊ、　ＩＩＩＩｍｕｎｏｌ、、　１３１．１８０８　（１９８３）　〕、これは 多分、ＩＬ−２とその細胞受容体〔ロブら、前出〕の間の相互作用の親和性がｒ Ｌ−２とその各々の抗体〔スミスら、前出〕の間の相互作用の親和性よりも数オ ーダー大きいためであろう。

ここに述べる方法に従う他の１　＋−−−２ポリペプチドに対する別の抗体の調 製がこの問題を解明するであろう。

ヒトジュルカ２．ト由来Ｉ　Ｌ−２に対する抗体を産生ずるモノクローナルハイ ブリドーマの達成が最近報告された〔スミスら、前出、及びロブら、Ｐｒｏｅ、 　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ、８０．５９９０（１９８３）） 、前述したように、そのようなハイブリドーマの製造を保証する必須の要件の一 つは、免疫化のための精製されたＩＬ−２の十分に多量の使用であり、従って培 養物上澄みの比較的大量を調製し処理することを要する（スミス、前出〕。

スミスらにより特徴づけられた三つのモノクローナル抗体は、ＩＬ−２分子上の 明瞭なエピトープと反応するようであるが、これらエピトープはまだ同定されて いない、ロブらの研究において、モノクローナル抗体は、ＩＬ−２分子上の糖部 分と反応するように見えた。この抗体は、ジュルカット由来ＩＬ−２と反応した が、扁桃腺由来ＩＬ−２とは反応しなかった。

対照的に、本発明は、ヒ）　Ｉ　Ｌ　−２分子の所定の一部アミノ酸残基配列に 対する抗体の調製に関する０合成ポリペプチドを用いる決定は、蛋白質担体に適 当に結合された合成ポリペプチドを用いて蛋白質分子の事実上任意の領域に対す る抗体を誘発することができるという比較的最近の知見に基づいた。それは、天 然分子の文脈においては免疫原性でない領域を包含する〔レルナー、Ｒ，Ａ、、 　＊イチア、２９９．５９２　（１９８２））。

そのような抗体は、二つの重要な利点を与える。第一に、容易に調製される純粋 なポリペプチドの使用は、免疫化のために必要な大量の十分に純粋な天然抗原の 調製の必要性を除く、第二に、合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列は既知であ るので、このポリペプチドは所定の特異性の抗体の産生を誘発できる。

また、抗体が、天然蛋白質の文脈においては抗原的に「ザイレント」である合成 −次アミノ酸残基配列に対して生しられうる〔レルナー、前出、及びサソトクリ フェら、サイエンス、２１９．６６０　（１９８３））ので、免疫原性エピトー プの陣容及び従ってＩＬ−２分子に対する抗体のスペクトルが、合成ポリペプチ ドの使用によってかなり拡張されうる。ＩＬ−２反応性抗ポリペプチド抗体の価 値の特に重要な例は、生物学的機能及び／又は細胞表面受容体への結合を仲介す るＩＩ、−２分子中のこれらポリペプチド部分を同定するための使用である。

意味ある例は、クローニングされたｓｒｃ遺伝子のヌクレオチド配列から導かれ た合成ポリペプチド対する最近報告された抗体である〔ゲントリイら、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ４，２５８．１１２１９（１９８３））、この抗体を用いて、形 質転換する蛋白質ｐｐ６０ｓｒｅの生物学的活動（とくにチロシン特異性キナー ゼ活性）のために必要なペンタデカペプチドを同定することができた。

抗Ｐ８４抗体がＰＨ５刺激されたヒ）ＰＢＬの細胞質を特異的なＩＩＬｉＰ！Ｊ で着色できるという知見は、これら抗体が病気に関連してＩＬ−２産生細胞を数 える敏感かつ信頼できる手段として働きうろことを強く示唆している。この特定 の知見は、天然抽ラフトＴＬ−２に対して作られたモノクローナル抗体を用いた 極めて最近の研究で報告されたものと類憤である〔スティンマン（Ｓｔｅｉ＋ｕ ＋ａｎ）　ら、サイエンス、２２０　、１１８８　（１９８３）　）。

また、突然変異などから得られ、生物学的活性の喪失又は修飾をもたらすところ の、ＩＬ−２の一部アミノ酸残基配列の変化は、理論的に成る病気と結びつけら れる。もしそのようなＩＬ−２変種が存在すれば、抗ポリペプチド抗体はこれら 変種の同定を容易にする。

抗ポリペプチド抗体の高度に区別する力が、明瞭に確立されている。たとえばそ のような抗体は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原のサブタイプ間〔ゲリンら、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８０．２３６５　（１９８３））及び二つのデキストリン結合性骨髄腫蛋白質の 過可変部におけるイディオタイプ決定基間（マクミラン（門Ｃ１ｉｌｌａｎ）ら 、セル（Ｃｅｌｌ）　、３５．８５９　（１９８３））を区別することができる 。

いくつかの免疫疾患状態を直す〔ワグナ−ら、ネイチ了、２８４．２７８　（１ ９８０）　〕−インビボで腫瘍拒否を助ける〔チーバー（Ｃｈｅｅｖｅｒ）ら、 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５５．９６８（１９８２））、及びインビトロで ＣＴＬ、ＮＫ及びＬ　Ａ　Ｋ細胞の誘発を高める又は刺激するＩＬ−２の能力は 、このリンホカインについて大きな興味を起こさせ、ＩＬ−２が免疫治療手段を 与えるかも知れないことを示唆した。また、ＩＬ　２異常と種々の病気との結び つきは、治療分野においてヒトＩＬ−２ＩＬ−２から導かれた合成ポリペプチド を用いる抗Ｉ　Ｌ　−２抗体の製造の比較的容易さは、そのような抗体が、より 正確なリンホカイン評価の確立及健丈及び病気におけるリンホカイン産生細胞の カウントを含むｌ　Ｌ−２の種々の研究において有用である。

■５診断系及び方法 たとえば特定の病気の診断において、特定の抗原が生物学的サンプル中に補助物 （ａｉｄ）として存在するかどうか知ることがしばしば望ましい。

診断剤系の例は、酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬＩＳＡ）（ここでは指示基は、 抗体に結合されたホースラディツシュペルオキシダーゼのような酵素である）、 又はラジオイムノアッセイ　（ここでは指示基は、本発明の合成ポリペプチド又 はこれに対し生じた抗体のいずれかに存在する１２５■のような放射性元素であ る）である。

本発明に従い、インターロイキン−２の抗原決定基の存在を評価する診断系は、 約６〜約４０のアミノ酸残基を含みかつＩＬ−２の抗原決定基のアミノ酸配列に 免疫学的に実質的に対応するアミノ酸配列を持つ合成ポリペプチドに対して動物 宿主中で生じられた抗体を生化学的に活性な形で含む、この診断系において、上 述の抗体は評価されるべき混合されたサンプルと免疫反応して免疫反応物を形成 し、この存在が指示手段によりシグナルされる。

指示手段は、上述の抗体と同じクラスの抗体に対して同１５種の動物から成るし られた、酵素に結合した第二の抗体を含むことができる。指示手段は、免疫反応 物中に存在する最初に述べた抗体に結合することにより免疫反応をシグナルする 。この系において、シグナルは、結合した酵素と加えられた基質との反応により 示される。指示手段はまた、抗体に結合された放射性元素を含むことができる。

また本発明に従い、体成分中のインターロイキン−２の抗原決定基の存在を評価 するための診断系（好ましくはキットの形）は、別々の容器中に （ａｌ　インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸残基配列に免疫学的に実 質的に対応する約６〜約４０のアミノ酸残基の配列を含む本発明の合成ポリペプ チドを生物学的に活性な形で含む第一の反応剤、ここでポリペプチドは、担体に 結合されて接合体とされ、宿主動物にワクチンとしてを動量で導入されると、イ ンターロイキン−２の抗原決定基と免疫反応できる抗体の産生を宿主において誘 発することができる；及び（ｂｌ　合成ポリペプチドと免疫反応する抗ポリペプ チド抗体を生化学的に活性な形で、第−及び当該第二の反応剤の間の免疫反応の 存在を指示する指示手段と共に含む第二の反応剤を含む。

第−及び第二の反応剤は、評価されるべき体成分又は培養物上澄みの所定量の存 在下で所定量で混合されると、指示手段によりシグナルされる免疫反応のある量 を与える。この免疫反応量は、抗原決定基を含むインターロイキン−２が体成分 中に存在しない場合、既知の免疫反応量と異る。

上述のように、第一の反応剤は、前述の合成ポリペプチドの一つそのようなポリ ペプチドの組合せ、それから作られたポリマー又は接合体を含む、第二の反応剤 は、合成ポリペプチド又はその接合体に対して生じられた抗体のイディオタイプ 領域を含むポリアミド（第一の反応剤の受容体）を含む、第二の反応剤のイディ オタイプ含有ポリアミドは、実質上完全な抗体、又はその調製が先に述べられた Ｆ　ａＬ　Ｆ　ａｂ’又はＦ（ａｂ’）を抗体分画であることができる。指示基 がまた系に備えられことができ、二つの反応剤のどちらかと当初結合される又は 離されていることができる。

評価されるべき体成分の所定量の存在下での第−及び第二の反応剤の所定量の混 合は、第一の反応剤と第二の反応剤（その受容体）、及びＩＬ−２と同じ受容体 の間の免疫反応をもたらす。第−及び第二の反応剤の間でそのように作られた免 疫反応の程度又は量は、体成分中に存在するＩＬ−２の量が増加又は減少すると 既知の免疫反応量と異る。

そのような競争的結合評価において、第一の反応剤（ＩＬ−２ポリペプチド又は 純粋な完全なＩＬ−２３は、ｌ　Ｌ−２ポリペプチドに対して作られた抗体（受 容体）分子上の限られた数の結合部位への結合について、未知サンプル中のＩＬ −２と競争する。すなわち、反応において未知ＩＬ−２の量が増せば、第一（固 相反応剤）への抗体の結合が減少する。第−及び第二の反応剤の間の免疫反応の 量は典型的には、体成分中に通常存在する量に比べて！Ｌ−２の増加するとき減 少する。

実際には、所定の既知量の第一の反応剤が、前述のＥＬＩＳ＾プレートの一つの ような固体支持体に結合される。第二の反応剤により結合されないＢＳＡのよう な蛋白質が次に固体支持体にコーティングされて、固体支持体上の非特異的蛋白 質結合の部位をブロックする。結合されなかったブロック化蛋白質は次に通常、 すすぎによって除去される。

第二の反応剤及び評価されるサンプルは実質上同時に、第一の結合された反応剤 と混合されることができる。より好ましくは、第二反応剤及び評価されるべきサ ンプルの両者の所定の既知量が互に混合されて免疫複合体を形成し、次にこの混 合物が、結合された第一の反応剤と混合されて、免疫複合体を形成しなかった第 二反応剤を第一の支持体に結合した反応剤に結合する。

混合物は、第−及び第二の反応剤が反応するのに十分な時間維持される。固体支 持体に結合されなかった成分は次に、たとえばすすぎによって除かれる。

別の診断系は、生化学的に活性な形の上述の抗イデイオタイプ抗体及び指示手段 を含む。この形において、抗イデイオタイプ抗体又はそのＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ ”又はＦ　（ａｂ”）２分画は、評価されるべきサンプル中の抗原と反応して、 免疫反応生成物を形成し、この存在は指示手段によりシグナルされる。

上述の系はまた、抗イデイオタイプ抗体と同じクラスの抗体に対し同じ種から生 じられた第二の抗体を指示手段の一部として含むことができる。たとえば、抗イ デイオタイプ抗体がラビットで生じられる場合、市販入手できるヤギ抗ラビット 抗体を用いることができる。そのような第二の抗体は便宜には、ラベルたとえば ホースラディッションペルオキシダーゼ（ＨＰ　Ｒ）、グルコースオキシダーゼ などを含む結合された酵素；ヨウ素１２５又は１３１、水素３、硫黄３５又は炭 素１４を含む放射性元素；　ＮＭＲ活性元素たとえばフッ素１９又は窒素１５； 螢光染料たとえばフルオレセインを含む。

別の実施Ｌｉ様において、抗体がたとえば上述の手順に従いインターロイキン− ２の二つの異る抗原決定基に対して用意されることができる。第一の抗体の所定 量が、上述した固体支持体又は後記の微小力価プレートのくぼみに結合される； そして第又は指示基の既知量でラベルされる。とくに、インターロイキン−２活 性の存在について評価されるべき未知サンプルは、合成ＩＬ−２ポリペプチドに 対して作られた固相結合抗体と混合される。混合物は、インターロイキン−２が 固相結合抗体に結合するのに十分な時間維持され、次に結合されなかった物質を 除くために洗われる０次に、結合されたインターロイキン−２の量は、結合され たＩＬ−２を別の合成ｒＬ−２ポリペプチドに対して生じられた抗体（指示手段 によりラベルされた）と接触させ、指示手段によりシグナルされる免疫反応量を 測定することにより決定できる。

本発明においての使用に適する別の免疫化学的評価法は、少くとも下記の三つの 形の酵素免疫評価（ＥＴＡ）を含む：免疫酵素測定テスト、抗原又は抗体のため のサンドインチ法及びホモジニアスＥＩＡ。

ＥＬＩＳＡテストは、最初に開発されたものであり、標準的競争ラジオイムノア ッセイ　（ｔＡ）法にちなんでパターン化される。前述したように、ラベルされ た抗原とラベルされない抗原が、限られた量の固相抗体への付着を競争する。置 き代えられた酵素ラベルが定量され、続く計算はＲＩＡ法のと本質的に同じであ る。

免疫酵素測定法においては、未知量の抗原が過剰の酵素ラベルされた抗体と反応 され、次にラベルされた抗体のための固相抗原が加えられる。遠心分離により、 固相抗原と反応した過剰のラベルされた抗体分子を除き、可溶性相中に酵素活性 を残す。

次に可溶性相に含まれる酵素活性が計算され、それにより未知サンプル中の抗原 濃度の尺度を与える。

サンドイツチ法は、抗原の多価性及び二つの異る抗体分子と同時に結合するその 能力に依る。第一の抗体分子は通常、固相反応物である。それは、未知サンプル 中の抗原分子の総ての結合（複合化）を保証するよう過剰に用いられる。評価さ れるべきサンプルの混合及び抗原−抗体複合体形成反応が完了した後に、過剰の 酵素ラベル抗体が加えられ、第一の混合物から得られた複合体とインキュベート される。ラベルされた抗体は次に、抗原上の利用しうる決定基と結合する。結合 されなかったラベルされた抗体は洗いによって除かれ、結合したラベルの酵素活 性が決定される。先のように、複合体に結合した酵素の量は、評価されるサンプ ル内の抗原量の間接的尺度である。

主指示基又はラベルがＨＲＰ又はグルコースオキシダーゼのような酵素である場 合、免疫反応が起り抗体−抗原複合体が形成された事実を可視化するために追加 的反応剤が必要とされる。

ＨＲＰのためのそのような追加的反応剤としては、過酸化水素及び酸化染料前駆 体たとえばジアミノベンジジンが挙げられる。

グルコースオキシダーゼと共に用いられる追加的反応剤としては、ＡＢＴＳ染料 及びグルコースが挙げられる。

「指示基」又は「ラベル」という分集は、受容体に結合される又は別々に用いら れる却−原子及び分子を包含するべくここで用いられ、これら原子又は分子が単 独で用いられるか追加的反応剤と組合せて用いられるかに拘らない、そのような 指示基又はラベルはそれら自体、免疫化学で周知である６指示蟇又はラベルは好 ましくは、受容体と共に供給され、それと−緒に包装され又は別々に包装されう る。過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的反応剤はまた、ＨＲＰの ような指示基が用いられる場合、系に含められうる。そのような物質は、多くの 指示基と同様に市販で容易に入手でき、診断系と共に供給する必要はない、加え て、過酸化水素のようないくつかの反応剤は放置して分解し又はさもなくばいく つかの放射性元素のように短寿命であり、最終ユーザーにより供給されるのがよ り良い。

ＩＬ−２の抗原決定基の存在を測定するために、別の診断評価を用いうる。たと えば、Ｉ　Ｌ〜２含有細胞は、固定された組織切片の細胞質着色（免疫Ｍｉ織学 又は免疫螢光−第ｘｍ部参照）により、又は螢光活性化細胞ソーターの使用（フ ロー　サイトフルオロメトリー）により検出できる。

螢光活性化細胞ソーター（ＦＡＣ３）を用いるフロー　サイトフルオロメトリー は、Ｔ及びＢタンパ細胞を分離する一つの方法である。ＦＡＣ３では、各小滴が ＦＩＴＣ（フルオレセイン　イソチオシアネート）又はＴＲＩＣＴ（テトラメチ ル　ローダミン　イソチオシアネートのような螢光ラベルを付された一つの細胞 を含むように、小滴が小さなノズル内で超音波振動により発生される。小滴が１ つずつレーザービームを通過するとき、各細胞はその螢光の強さ、色及び偏光に 間して分析される。

個々の細胞からの特徴的シグナルが次に、細胞が成る予め選定した基準に合うか どうか決定するべく分析される。もしそうなら、その細胞を含む小滴は電気的に 荷電され、そして電場を通過するときに進路を曲げられて主流から別けられる。

適当な螢光性抗体をＴ又はＢ細胞に付着することにより、細胞懸濁物から一つの 又は他方の細胞集団を分離できる。

すなわち、親和性精製されたＩＬ−２、又はＩＬ−２の決定基部分に実質的に対 応する合成ポリペプチドは、正常な提供者又は種々の病的状態の個体から得た生 物学的液体（培養物上澄み、血清など）中のＩＬ−２の検出において有用な抗体 を得るために用いることができる。これら抗体は、直接結合又は競争的結合評価 において用いることができる。

そのような結合評価は、下記のものを含む：（ａｌ　固体支持体に結合されたＩ Ｉ、−２又は本発明の合成ポリペプチドの一つへのラベルされた特定の抗体の結 合の、サンプル中のラベルされていないＩＬ−２による競争的禁止；申）固体支 持体に結合された本発明の抗体への既知量のラベルされたＩＬ−２又は本合成ポ リペプチドの一つの結合の、サンプル中のラベルされていないＩＬ−２による競 争的禁止；（Ｃ１固体支持体に結合された第一の抗体へのサンプル中のＩＬ−２ の結合を第二のラベルされた抗体の添加により測定。

〔第−及び第二の抗体は好ましくは、ＩＬ−２から導かれたポリペプチド又は天 然のＩＬ−２に対して生じられたモノクローナル抗体であり、そのような抗体は 交叉反応しない（Ｉ　Ｌ−２結合について競争しない）〕； ＋ｄ）ＩＬ−２関連モノクローナル抗体に対して向けられたラベルされた抗イデ イオタイプ抗体の結合の、サンプル中のラベルされていないＩＬ−２による競争 的禁止。

細胞表面受容体又は結合部位に結合した■！、−２の量（及び従ってサンプル中 に存在した細胞表面受容体の量）はまた、下記のようにして決定できる。

ＩＬ−２表面受容体を持つ細胞は、ラベルされていないＩＬ−２（又はその部分 ）とインキュベートされる。得た懸濁物は、インターロイキン−２がＩＬ−２細 胞表面受容体に結合するのに十分な時間維持され、次に非結合物質を除くために 細胞は洗われる。細胞に結合したインターロイキン−２の量は次に、結合したＩ Ｌ−２を、指示手段でラベルされた合成ＩＩ、−２ポリペプチドに対して生じら れた抗体（抗ポリペプチド抗体）と接触させ、そして何らかの非結合物質を分離 することによって決定できる。指示手段によりシグナルされるＩＬ−２に結合す るラベルされた抗ポリペプチド抗体の量は、細胞表面受容体に結合したＩＬ−２ の量の尺度である。また、細胞表面受容体に結合したＩＬ−２の量は、サンプル 中の細胞表面受容体の量に比例する。

加えて、細胞表面受容体又は結合部位に結合したラベルされた親和性精製された ＩＬ−２（又はその部分）の量が決定できる。そのような方法において、ＩＬ− ２はたとえば３５３メチオニンにより内部的にラベルされ、第Ｖ部で後述するよ うに免疫吸着体カラムで親和性精製される。あるいは、ＩＬ−２は親和性精製さ れ、次に目ｓＩで外部的にラベルされることができる。

細胞（たとえば自己免疫病の患者からの）は、９６のくぼみの免疫濾過プレート 中のフィルターディスク上に固定される。

但し、各くぼみは適当な血清又はＢＳＡを含む緩衝液でブロックされている０次 に細胞は、順次増加される濃度のラベルされた親和性精製されたＩＬ−２と反応 させられる。

非結合ＩＬ−２は、免疫濾過によりくぼみから洗われ、各くぼみ中に残るラベル の量が測定される。結合されたＩＬ−２の量を各くぼみに加えられたＩＬ−２の 濃度と関連づける標準カーブが構成できる。ＩＬ−２の既知の分子量及びラベル されたＩＬ−２の特異的活性に基いて、このデータは飽和に結合されるＩＬ−２ 分子の数（及び従って細胞表面結合部位の数）の決定を可能にするであろう。

非特異的（飽和しない）結合は、ラベルされていないＩＬ〜２の過剰の存在下で 結合実験を行うことにより決定できる。これら結果は次に、特異的結合を決定す るために、飽和での結果から差引きされる。

Ｖ　ＴＬ−２精製のための親和性吸着体その中で本発明のオリゴクローナル又は モノクローナル抗体が活性な結合部分を構成しているところの親和性吸着体（ア フィニティ　ツルバント）は、本発明の更に別のａ様を成す。

この態様において、本発明に従い作られた抗体のような受容体が、これら吸着体 により精製されるべきリンホカインに対して化学的に不活性である固体支持体に 結合される。「化学的に不活性」という分集はここで、固体支持体とリンホカイ ンの間の化学的反応が起きないことを意味して用いられる。しかし、固体支持体 とリンホカインの間の物理的相互作用たとえば非特異的結合は起ることができ、 また起り、しかしそのような相互作用は好ましくは最小にされる。

固体支持体は、種々の物質、たとえば架橋デキストランたとえば５ｅｐｈａｄｅ ｘ　（商標）Ｇ−２５、−５０、−１００、−２００など（ファーマシア　ファ イン　ケミカルズ（Ｐｈａｒｓａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ピス カタウエイ、ニュージャーシイから入手できる）アガロース及び架橋アガロース たとえば５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４ＢＳＣＬ４Ｂなど（ ファーマシア　ファイン　ケミカルズより入手できる）　；Ｂｉｏ−ＧｅＪ　（ 商標）Ａ−０，５Ｍ５Ａ−１，５Ｍ、Ａ−５０Ｍなど（バイオ−ラド　ラボラト リーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｅ、リッチモンド、カリフォ ールニアから入手できる）；又はポリアクリルアミドビーズたとえばＢｌｏ−Ｇ ｅｌ１Ｐ　２、Ｐ−３０，Ｐ−１００、Ｐ−３００など（パイオーラド　ラボラ トリーズから入手できる）を包含する。

ポリアクリルアミドビーズは、上述の支持体のうち最小の非特異的結合の傾向を 持ち、しかしまた典型的には、その結合容量を制限する低い多孔度をも持つ、ア ガロース及び架橋アガロース物質がここで好ましく、固体支持体として例示的に 用いられるであろう。

アガロース支持体は典型的には、シアノゲンブロマイドを用いて結合（リンキン グ）のために活性化される。活性化された支持体は次に洗われ、活性化支持体の 乾燥なしで受容体分子にリンクされる。支持体にリンクされた受容体は次に洗わ れ、使用の用意が整う。支持体上の未反応基は、もし望むなら、アミンたとえば エタノールアミン又はＴｒｉｓと反応させられることができるが、しかしこれら 反応性基の反応性は迅速に消滅する。

親和性吸着体は、ビーカー又はフラスコ中のようにルーズな状態で用いることが でき、あるいはそれはカラムに詰めることができる。使用前に親和性吸着体を、 リンホカイン精製のために用いられる緩衝液又は他の水性媒体中で洗って、非特 異的に結合した蛋白質又は支持体に不安定に結合された受容体を除去することが 好ましい。

親和性吸着体の抗体が結合するポリペプチドのアミノ酸残基配列に対するアミノ 酸残基配列を持つＩＬ−２の水性組成物たとえば血清又は細胞抽出物が用意され 、次に親和性吸着体と混合される。この混合物は、抗体とリンホカインの間の可 逆的なリンクされた抗体−抗原複合体を形成する。

そして複合体は、複合体化されなかった水性組成物の残りから分離され、それに より親和性吸着体に可逆的にリンクされた精製された形のリンホカインを得る。

混合がビーカー又はフラスコ中で行われる場合、この分離は、濾過及び洗滌によ り行える。吸着体がカラムに入っているとき、分離は、やはり非複合体化水性媒 体の溶離により、好ましくは続いての洗滌段階により行える。

精製された蛋白質が親和性吸着体なしで望まれる場合、それは典型的には種々の 手順により得られる。これら手順のいずれにおいても、可逆的にリンクされた複 合体は、支持体にリンクされた抗体及びＩＬ−２の成分部分へと解離され、続い てリンクされた抗体からＩＬ−２を分離して、親和性吸着体から遊離された精製 されたリンホカインが得られる。

可逆的複合体の解離は、多数の方法で行える。典型的には、約２．５のｐＨ値の ０．２Ｍグリシン塩酸塩溶液が用いられる。あるいは、結合されたＩＬ−２は、 抗体を生じるために用いられた免疫原性ポリペプチドの過剰と可逆的複合体の混 合により、リンクされた受容体から競争的に分離できる。そのような競争は、Ｉ Ｌ−２の起りうる変性を回避する。解離したＩＬ−２の親和性吸着体からの分離 は、前述のように行える。

親和性吸着体の調製及びその使用は周知である。しかし、本発明のオリゴクロー ナル抗体を組込んだそのような物質及び使用は、従来入手できなかった。抗原が 支持体にリンクされている親和性吸着体、その調製法、使用の詳細な記述は、「 手段としての抗体」　（＾ｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ）　、マルカロ ニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）及びワール（Ｗａｒｒ）　’１ｌＡ−ジョーン 　ワイリーアンド　サンズ、ニューヨーク、第６４〜６７頁及び７６〜９６頁（ １９８２）に見られる。

■　結果 Ａ　ラビット抗ポリペプチド血清のＥＬＩＳＡ反応性その配列がインターロイキ ン−２（ＩＬ−２）の一部のアミ、ノ酸残基配列に実質的に対応する１３〜１５ のアミノ酸残基より成る化学的に合成されたポリペプチドの破傷風トキソイド又 はキイホールヘモシアニン接合体を用いてラビットが免疫化された。得た血清は 、免疫化ポリペプチド及び部分的に精製されたＩＬ−２に対する反応性（これの 認識及びこれへの結合）についてＥＬＩＳＡＴ：調べられた。

特異性対照は下記を含んだ：（ａ）非近縁のポリペプチド；価）ヒトＩＬ−２の 原調製物（すなわちミトゲンなしで培養された扁桃腺由来細胞の上澄みに、培養 された放射線照射されたリンホブラストイド細胞のＰＨＡ及びＰＭＡ上澄みをプ ール）；及び（Ｃｌウシ血清アルブミン、更に別の特異性対照は、＋ｄ＋免疫化 されたラビットについての免疫化部血清及び＋８１０蹄疫ウイルス又はＢ型肝炎 ウィルスの表面抗原のアミノ酸残基配列から導かれた合成ペプチド〔とくにクル ゾ（Ｋｕｒｚ）ら、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｉｃ　Ａｃ１ ｄ　Ｒｅｓ、）　９．１９１９　（１９８１）及びバレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚ ｕｅｌｌａ）ら、ネイチア、２８０．８１５（１９７９）記載の口諦疫ウィルス 及び肝炎の合成ポリペプチド嵐６５及び７２〕に対し特異性の過免疫ラビット血 清を含んだ。

第３図は、ラビット抗Ｐ８２血清（ＲｃｒＰ８２）の特異性を示す代表的結果を 示す、抗Ｐ８２血清は、ＩＬ−２に対し反応性の四つの抗血清のうち最高の抗Ｉ Ｌ−２力価を持った。抗Ｐ８２血清（ＲｃｔＰ８２）は、免疫化ペプチドＰ８２ （パネルＡ）及び扁桃腺ＩＬ−２調製物（パネルＢ）をコーティングされたプレ ートに対して、免疫化部正常ラビット血清（ＮＲ３）又はラビット抗Ｐ７２（Ｂ 型肝炎）血清（ＲαＰ７２）が示すよりもはるかに強い反応を示した。抗Ｐ８２ 血清は、非近縁のポリペプチドＰ８１　（パネルＣ）に対して僅かバンクグラウ ンドレベルの反応のみを作った。

下記の表１に示すように、ポリペプチドＰ１３３を除（総てのポリペプチドは、 高力価の抗ポリペプチド抗体を誘発した。しかし、八つのポリペプチドのうちの 四つは、固相ＥＬ　Ｉ　ＳＡで扁桃腺由来ＩＬ−２ｉＩｉｌ製物と反応した抗体 を誘発した。

表　１ ラビ、ト抗Ｉ　Ｌ　−２ポリペプチド血清の代表的抗体力価抗体力価１ ポリペプチド　茨ｒ　（−ポリペプチド　Ｗ上旦ユＩＰＩＯ６５−７８４Ｘ１０ ’　１０ ｐＨ９４−１０８−Ｃ２，５Ｘ１０’　１０Ｐ１２　１１１−１２５　１．２ｘ 　１０’　１ｘｌｏ”ＰＩ３　Ｃ−１２６１３８３Ｘ１０Ｓ　３０Ｐ８１　１８ −３２−ＣｌＸｌ０ｈ　１ｘｌＯ”Ｐ８２　１３９−１５３　２Ｘ１０’　５Ｘ １０’Ｐ　８３　５１−６４−　Ｃ無視しうる　無視しうるＰ８４　７９−９２ 　１゜２Ｘ１０’　５Ｘ１０”ｉ、′Ａ飽和（４９０ｎ−での最大光学密度（０ ，０，）の５０％〕を作る希釈度の逆数 ２、　刊行されたＩＬ−２の配列に基づく　〔呑口ら、ネイチア、３０２．３０ ９　（１９８３））、Ｃは、カップリングの目的でカルボキシ末端又はアミノ末 端に加えられたシスティン残基を指す。

抗ＩＬ−２抗体は、第三免疫化の１週間後に初めて検出された。その後、抗体の 濃度は減少する傾向があったが、第３注射の６〜８ｉ１！ｌ後に与えられるポリ ペプチド−担体接合体による追加的促進後に抗体の力価は増加する傾向にあった 。抗体は長期間残存した。抗ＩＬ−２力価は、各抗ボリベブチド力価より低かっ た（表１）６種々のＩＬ−２由来ポリペプチド間の交叉反応は観察されなかった 。ラビット中でＩＬ−２反応性抗体を誘発した同し四つのポリペプチドは、マウ スにおいて抗Ｉ　Ｌ−２の形成を誘発した。

Ｂ９可溶性ポリペプチドによる固相ＥＬＩＳＡの禁止同じ抗体集団が、免疫化ポ リペプチドと及びＩＬ−２と反応するかどうか確かめるために、順次増加する１ 度の可溶性ポリペプチドの存在下でＥＬ　Ｉ　ＳＡを行った。

第４図に示すように、固相Ｐ８４又はＩＬ−２に対する抗Ｐ８４血清の反応性は 、溶液中のＰ８４ポリペプチドにより特異的に禁止された（ｍ７！当り１０〜１ ００ナノグラムのポリペプチドで５０％禁止）が、非近縁のポリペプチドＰ８１ によっては禁止されなかった。抗ポリペプチド抗体の同じ限られた集団がＩＬ− ２と反応した。なぜなら、所与の可溶性ポリペプチドは、ＩＬ−２への特定の抗 ポリペプチド抗体の結合を禁止したからである。

Ｃ１精製されたジュルカフト（Ｊｕｒｋａｔ）　Ｉ　Ｌ　−２に対する反応性 部分的に精製された扁桃腺由来ＩＬ−２に対する反応性を示した抗血清が、各ポ リペプチドとカンプルされたＡｆｆｉ−ｇｅｊｌ。

のカラムで親和性精製された。抗ポリペプチド抗体及び抗ＩＬ−２抗体が、ｐＨ ２，５のグリシン・ＨＣＩ！緩衝液の添加後にカラムから共溶出した。

親和性精製された抗体の結合が、ＡｃＡ−４４クロマトグラフイ及び（等電フォ ーカシング）ＩＥＦにより精製されたジェルカット由来ＩＬ−２に対してＥＬ　 Ｉ　ＳＡで研究された。この調製物は、１０％ＳＤＳゲルでＩＬ−２シングルバ ンドを与え、９０％純粋であると考えられた。これは、先に用いられた扁桃腺由 来ＩＬ−２よりも純粋なヒト＋ｔ、−２ｇｊｉ製物を示す。

第５図に示すように、親和性精製された抗Ｐ８２抗体（ＲαＰ８２）は、精製さ れたＴＬ−２（ＴＣＧＦ）と特異的に反応した。別の類似の測定において、親和 性精製された抗Ｐ１２及び抗Ｐ８４抗体も、精製されたジュルカフトＴＬ−２ま たは組換えＩＬ−２と反応したが、抗Ｐ８１は有意の反応性を欠いた。

Ｄ、ＴＬ−２生物学的活性とＥＬ　Ｉ　ＳＡ免疫反応性との相関ｌ　Ｌ−２含有 粗扁桃腺上澄の４１をＡｃＡ−４４カラムで分画し、各分画は、ＩＬ−２バイオ アツセイにおいて生物学的活性を、固相ＥＬＩＳＡにおいて抗ポリペプチド抗体 との免疫反応性をテストされた。後者の場合、混ぜ物なしのく非希釈の）分画が 、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートをコーティングするために用いられた。

第６図は、親和性精製されたラビット抗Ｐ−８４抗体による代表的測定の結果を 示す、生物学的活性と免疫反応性の間の優れた相関が見られ、二つの活性分布の ピークは同じである。

対照的に、擬Ｉ　Ｌ　−２ｉｔｉ製物のＡｃＡ−４４由来分画は、抗ポリペプチ ド抗体と有意な程度に反応しなか、た。また、生物学的活性と免疫反応性の間の 優れた相関が、その後の二つの追加的精製工程；詳しくはＡｆｆｉ−ｇｅｌ　ｂ ｌｕｅ上でのクロマトグラフィ及びＶｔ　＜　ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ　ク ロマトグラフィに対しても見られた。

類似の相関が、抗Ｐ８２抗体で、及びより低い程度に抗ＰＩ２抗体で観察された 。これら結果は、部分的に精製されたＩＬ−２調製物中の抗ポリペプチド抗体に より認識される抗原が事実ＩＬ−２であることを強く示唆する。

Ｅ、ウェスターンプロット分析 抗Ｐ８４抗体と反応するＩＬ−２含有培養物上澄みの抗原の同定を更に行うため に、ウェスターンプロット法〔トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＬＩＳＡ、７６．４３５０（１９７９））を 用いた。ウェスターンプロット分析に付された粗製の濃縮された扁桃腺由来上澄 みは、抗Ｐ８４抗体と反応した１５．０００〜１８，０００の分子量範囲の二つ の接近して位置する蛋白質バンドを示した（第７図）、免疫化部血清又は非近緑 の抗体は、同じように反応はしなかった。

さらに、生物学的に活性なＩＩ、−２が、ゲル中の最も同一性の位置から鋭いピ ークで溶出された（第７図）、、これらの結果は、ｔａ＋抗Ｐ８４抗体がヒトＩ Ｌ−２のサイズに対応する位置に移行する蛋白質（，１，数又は複数）と反応す ること、及び山）この蛋白質及びＩＬ−２の生物学的活性はゲル上で共移行する ことを示している。

Ｆ、ＰＨＡ刺激された細胞の免疫螢光法抗ポリペプチド抗体がＩＬ−２産生細胞 とイン廿イツに反応するかどうか決定するために研究を行った。ＰＨＡ刺激され た（又は対照の）ヒトＰＢＬを固定し、親和性精製されたラビット抗Ｐ８４抗体 及びＦＩＴＣ接合ヤギ抗ラビッうＩｇＧで処理した。

ＰＨＡ刺激されたＰＢＬの細胞質着色を観察した（第８ａ図）。

この反応の詳細は次のことを示した：（δ）着色は、ｌ　ｍ　Ａ’当２０μｇの 可溶性Ｐ８４による抗Ｐ８４抗体のプレインキュベーションにより除去されたが 、Ｐ８１でのインキュベーションではそうならなかった；（ｂｌ刺激されなかっ た及びリボ多糖刺激されたＰＢＬは着色されなかった；またｆｃｌ抗Ｐ７２（Ｂ 型肝炎）抗体で処理された、ＰＩ］Ａ！ｔｌＩｆ！１．されたＰＢＬは同じ条件 下で着色されなかった。

■　材料及び方法 Ａ、ヒトＪＬ−２の産生 ＩＬ−２は、ヒト扁桃腺細胞から及びジュルヵソトヒト白血病Ｔ細胞系統から導 き出された。通常の扁桃腺切除の間に除去された扁桃腺は、サンジエゴ小児科病 院から得た。扁桃腺を無菌条件下で細かく切り刻み、裂くことによって、単一細 胞懸濁物（提供者当り２〜５Ｘ１０９細胞）を調製した。ジュルカット細胞（ク ローン１０Ｅ４）は、Ｇ、デンネート（Ｄｅｎｎｅｒｔ）博士、サルク　インス ティチュート　フォア　バイオロジカルスタディーズ（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ）、う・ジョラ、カリ フォルニア、から得た。

Ｉ　Ｌ−２産生のために、細胞（ヒト扁桃腺由来の及びジュルカット細胞）は、 ２×１０−細胞／ｍｌで、２部のＲＰＭＩ−１６４０培養基（Ｍ、Ａ、バイオプ ロダクツ社）、１部のダルベツコの修正イーグルの培養基（ＤＭＥＭ）（Ｍ、Ａ 、バイオプロダクツ社）及び１部のハムのＦ−１２培養基（Ｍ、Ａ、バイオプロ ダクツ社）を含む培養基中で培養された。培養基は、４．５ｇ／ｆのグルコース 、ｌＯμＭのエタノールアミン、各々５μｇ　／　ｍ　Ｉ！、のインスリン、ト ランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムの混合物（ＩＴＳ、コラボレイチプ　 リサーチ社、ウオルサム、マサチューセッツ）、５０膜ｇ／ｍｌのゲンタマイシ ン、５Ｘ１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール及び１０膜ＭのＨＥＰＥＳ緩衝 液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン　スルホン酸〕を補 われた。

ＩＬ−２の産生は、フィトミトゲンの添加により細胞において刺激された。フィ トミトゲンは、少ししか共通の構造的特徴を持たずしかし下記の三つの特性（そ の最初のもののみが、蛋白質がフィトミトゲンであると考えられるために必須で ある）により特徴づけられる蛋白質の不均質な群である二ｆｌｌ＄＋！への特異 的結合、（２）細胞の凝集反応、及び（３）リンパ細胞の刺激。これら特性を考 慮すると、フィトミトゲン（レクチンとも呼ばれる）は、抗体と似ているが、し かしレクチンは特異的刺激に応答して作られないこと、レクチンは炭水化物に対 するその特異性において限定されること及びレクチンは免疫グロブリンではなく てかなり種々の蛋白質の群を含むことの点で抗体とは異る。

免疫学で最も頻繁に用いる三つのレクチンは、ナタマメから抽出されたコンカナ バリンＡ　（ｃｏｎ＾）、インゲンマメから抽出されたフィトヘマグルチニン（ ＰＨＡ）　、及びアメリカヤマゴボウの根及び葉に見られるポンクライード　ミ トゲン（ＰＷＭ）である、　レクチンの添加後に、非***性リンパ細胞は生長し 、分化し、そして増殖する；いいかえればレクチンは核***刺激物質（ミトゲン ）として働く、ミトゲン効果は、拡大されたリンパ細胞（芽細胞）を数えること 又はラベルされたチミジン、ウリジン又はロイシンが各々ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋 白質に入る速度の増加を測定することによって測定できる。

レクチン刺激されたリンパ細胞は、抗原により刺激されたリンパ細胞と同様な機 能的特徴の同じスペクトルを示す、たとえば、刺激されたＢ細胞は免疫グロブリ ンを分泌し、一方、刺激されたＴリンパ細胞は、他の細胞の挙動に影響するリン ホカインを産生じ、かつ細胞障害性細胞として挙動しうる。

本測定において、ＩＬ−２産生は、ジュルカ７）細胞において１％フィトヘマグ ルチニン−Ｍ　（ＰＨＡ−Ｍ、グランドアイランド　バイオロジカル社、グラン ドアイランド、ニューヨーク）及び５０膜ｇ／ｍＡホルボール　ミリステート　 アセテート（ＰＭＡＳＰ−Ｌバイオケミカル社、ミルウォーミー、ワイオミング ）により刺激された。扁桃腺由来細胞は、同じ条件下で、しかし０．５ｘｌＯ’ 細胞／　ｍ　ｌの濃度で、放射線をあてられた（５００ラド）　Ｄａｕｄｉ　Ｉ 　ＡＴＣＣＣＣＬ　２１３）又はＲａｊｉ　（ＡＴＣＣＣＣＬ８６〕リンホブラ ストイド細胞系統細胞を加えることにより刺激された。

擬又は類（Ｕ　Ｉ　Ｌ　−２調製物は、ＰＨＡ−Ｍ及びＰＨＡの不存在下で扁桃 腺細胞を培養すること、及び放射線をあてられたＤａｕｄｉ又はＲａｊｉリンホ ブラストイド細胞をＰＨＡ−Ｍ及びＰＭへの存在下で別々に培養することによっ て作られた。検出しうるＴＬ−２活性を欠く二つの別々の培養物の上澄みを集め 、プールした。

全上澄みは、４２時間後に３．　ＯＯＯ観点／分（ｒｐｍ　）で１５分間の遠心 分離により収穫され、濾過され、凍結貯蔵された。

この調製物は、以降では、擬ＩＬ−２調製物と呼ばれるである扁桃腺由来上澄み は、ＹＭ−１０膜（アミコン社（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒρ、）、レキシントン、マ サチューセッツ）を通して５０〜１００倍に濃縮された。各々の濃縮された上澄 みは、ＡｃＡ−４４ｇｅ７！　（ＬＫＢプロダクターＡＢ、ブロマ、スエーデン ）の５ｅ＋ａＸ９Ｑｃｍ徘除カラムのｉｌｌ過、続いてＡｆｆｉ　ｇｅｊ！　ｂ ｊ！ｕｅ　（バイオ−ラド、リッチモンド、カリフォールニア）の２．５（ＪＸ ＩＯ国親和性カラムの通過を含む連続的クロマトグラフィにより精製された。下 記の０部で述べるＩＬ−２バイオアフセイにおいて活性を示した分画がプールさ れた。活性なプールを更に、ＡｃＡ−４４クロマトグラフイカラムに通すことに より精製した。

あるいは、活性なプールは、ｐＨ３〜１０のアンホリン混合物（ＬＫＢプロダク ターＡＢ、スエーデン）中で１００ｍＪ！Ｉ肝カラム（ＬＫＢプロダクターＡＢ 、スエーデン）上での等電フォーカシング（ＩＥＦ）に付された。この手順は、 ＩＬ−２生物学的活性の３０〜５０％回収で１．　ＯＯＯ〜３．　ＯＯ０倍精製 をもたらした。

ジュルカソト細胞から導かれたＩＬ−２は、ロブら、Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１５４．１４５５　（１９８１）により記載されたのと同様な手順で 、但し下記の変更を伴って、精製された。　ＹＭ−１０膜での濃縮後に、細胞培 養物上澄みを、ＡｃＡ−４４カラムで分画し、上述のようにエレクトロフォーカ スした。

Ｃ，ＩＬ−２バイオアフセイ 培養物上澄み、又は種々の精製段階の間に得られた物質は、ギリス、Ｊ、　ｌ５ ｎｕｎｏ１．、１２０．２０２７　（１９７８）に記載される方法に従ってＩＬ −２活性についてテストされた。アービンのカリフォールニア大学のＪ、ワトソ ン博士から得たＩＬ−２依存系統、ＣＴＬＬ−２が、指標細胞源として用いられ た。

簡単に云えば、テスト上澄みは、５％の胎児ウシ血清（Ｆｅ２）及び５　Ｘ　１ ０−’Ｍの２−メルカプトエタノールを補われたＩ？Ｐ阿１−１６４０培養基２ ＯｐＡ中に２又は４倍希釈された。　ＣＴＬＬ−２細胞（ＩＸＩＱ’）が、希釈 されたテスト上澄みに加えられ、５％二酸化炭素の加湿雰囲気中で３７℃で２４ 時間インキュベートされた。培養物は、１マイクロキユーリーのトリチウム化チ ミジンＭ）ＩＴｄＲ１６，７キユ一リー／ミリモル、ニューイングランド　ニュ クリア、ボストン、マサチューセン・ン）での４時間ターミナル　パルスに続い てスカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）細胞ハーベスタ−（フローラボラトリーズ（Ｆ ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　。

ツクビル、メリーランド）で収穫され、液体シンチレーションカウンターでカウ ントされた。

約１：４０の最終希釈で最大３ＨＴｄＲ取り込みの５０％を定形的に与えた扁桃 腺由来上澄みは、比較目的のために１０４位／ｍｌの活性と仔意的に指定される 。テスト上澄み中の活性は、退行分析を用いて、最大応答の５０％を作った希釈 度を比較することにより計算された。

■、ペプチド合成及び選択 Ａ、ポリペプチドの合成 合成されるべき約１５のアミノ酸を含むポリペプチドは、呑口ら、ネイチア、３ ０２．３０９　（１９８３）に記載のヒトＩＬ−２の刊行されている配列から選 ばれた。この選択は、天然蛋白質の表面に露出されていることが最もありそうな ヒトＩＬ−２のアミノ酸残基配列を決定するための一連のコンピューター分析に 部分的に基づいた。たとえば、リノチモンドら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｊ！、、 １１９．５３７　（１９７８）参照。

ポリペプチドは、メリフィールドら、Ｊ、　Ａｓ＋、　Ｃｈｅ＋ｍ、　Ｓｏｃ、 。

８５．２１４９　（１９６３）及びホウテンら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄ ｅＰｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１６．３１１　（１９８０）記載のよう に固相法により化学的に合成された。ここで用いられる比較的短いポリペプチド は、ヒ）ＩＬ−２の抗原決定基に実質的に対応する。

第１図は、ＩＬ−２の］、　５３のアミノ酸残基配列を示す。ここで述べる８つ の合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列は、第１及び２図に示される。ある例で は、下記のように蛋白質担体へのカップリングを助けるために、ポリペプチドの いくつかのアミノ末端又はカルボキシ末端に゛システィン残基が加えられた。

総てのポリペプチドの組成は、アミノ酸分析により確認された。

−Ｃに、免疫原又は合成ポリペプチドは、インターロイキン−２の抗原決定基ド メインのアミノ酸残基に対応する多数のアミノ酸を用意し、これらアミノ酸を、 この抗原決定基のペプチド配列に対応するペプチド配列を持つポリペプチドへと 合成することの工程により作られる０作られた合成ポリペプチドは、通常これを 担体にリンクして接合体を形成し、そして接合体を生理的に許容される希釈剤に 分散させることによってワクチンを作るために用いることができる。

ポリペプチドは好ましくは、システィン樹脂を用いる前述の固相法に従い合成さ れる。メリフィードら（前出）参照０個々のアミノ酸上の側鎖は、下記のように 保護される：Ａｒｇ−）シル、Ｓ　ｅｒｓ　Ｔｈｒ−、Ｇ　１　ｕ及びＡｓｐ− ０−ベンゾイル；Ｔｙｒ−０−ブロムベンジルオキシカルバミル；Ｔｒｐ−Ｎ− ホルミル。

Ｔｒｐ残基上のＮ−ホルミル基は、樹脂支持体からペプチドの解離後に、ｌ、Ｑ 　１ｇ／ｍｆｆのペプチド濃度で１．０　Ｍ重炭酸アンモニウムで室温で１６時 間の処理により除去される。山域ら、ジャーナル　オフ゛　オーガニック　ケミ ストリー（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ−、。

３８．２５９４　（１９７３）、各工程におけるカップリングの効率は、ニンヒ ドリン又はピクリン酸でモニターでき、好ましくは総ての場合において９９％よ り高い、ギシン、Ａｎａ　ｌ　。

Ｃｈｅｗ、Ａｃｔａ＋　５　８　、２４８−２４９（１９７２）及びカイザー（ Ｋａｉｓｅｒ）、＾ｎａｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　３４．５９５−５９８　（ １９８０）参照。

Ｂ、ポリマーの調製 本発明のポリペプチドは、互に連続されて、多数のポリペプチドを含む抗原性ポ リマーを形成できる。そのようなポリマーは、免疫学的反応の増大という利点を 持ち、ポリマーを構成するのに種々のポリアミドが用いられる場合には、インタ ーロイキン−２のいくつかの抗原決定基と免疫反応する抗体を誘発する追加的能 力の利点を持つ。

ポリマーは、上述のようにポリペプチドを合成しそしてアミン及びカルボキシ末 端の両者にシスティン残基を加えてジＣｙｓポリペプチドを形成することにより 作ることができる。その後、１０＋ｇのジＣｙｓポリペプチド（非酸化系のシス ティン残基を含む）を、０，１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液の２５０ｍｌに溶解 する。溶解したジＣｙｓポリペプチドを次に、得た溶液を約１８時間又はエルマ ンテスト〔エルマン、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　＋８２ １０−７７　（１９５９））によりヰ★出できる遊離メルカプタンがなくなるま でゆっくりと攪拌することにより空気酸化する。このようにして作られたポリマ ーは、多数の本発明のポリペプチドを繰返し単位として含む、これらポリペプチ ド繰返却位は、酸化されたシスティン残基により互に結合されている。

Ｃ９蛋白Ｘ）旦体へのポリペプチドのカップリング合成ポリペプチドは、下記の 二つの方法のいずれかによって、キイホールリンベントヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　 Ｈ）又は破傷風トキソイドにカップリングされた。第一の方法では、担体は、リ ウ（Ｌ　ｉ　ｕ　）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、８０．６ ９０（１，９７９）記載のように、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルにより活性化され、次にポリペプチドのアミノ又はカル ボキシ末端に加えられたシスティン残基を介してポリペプチドにカップリングさ れた。第二の方法ではポリペプチドは、周知のように０゜０４％グルタルアルデ ヒド溶液を用いて、遊離のアミノ基を介して担体にカフブリングされた。たとえ ばクリブステインら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓｃ、。

１４７．３１８（１９８３）参照。

前述のように、合成ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシ末端に加えられ たシスティン残基は、ジスルフィド結合及びミハエル付加反応生成物を経て接合 体を形成するために特に有用であることが判った。しかし、接合体の調製のため に当業界で周知の他の方法も用いうる。別の結合法の例としては、グルタルアル デヒド（前出）などのようなジアルデヒドの使用、又は水溶性カルボジイミドた とえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用 におけるようなカルボジイミド法の使用が挙げられる。

有用な担体は、当業界で周知であり、一般に自体蛋白質である。そのような担体 の例は、キイホールリンベントヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロ ブリン、アルブミンたとえばウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミン（各々 ＢＳＡ又はＨ３Ａ）、赤血細胞たとえばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）、破傷風トキ ソイド、ならびにポリ　（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）のようなポリアミノ 酸などである。

やはり当業界で周知のように、合成ポリペプチドをその担体に、中間の結合基に よって結合することがしばしば有益である。

上述のようにグルタルアルデヒドがそのような結合基の一つである。しかし、シ スティンが用いられる場合、中間結合基は好ましくは、ｍ−マレイミドベンゾイ ル　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）である。ＭＢＳは典型的 には最初、エステル−アミド交換反応により担体に付加される。その後、上述の ミハエル反応が行われ、又は付加の後にブロックされたメルカプト基たとえばチ オール酢酸（ＣＨ＋Ｃ０３Ｈ）がマレイミドニ重結合を横切り付加される。アシ ルブロッキング基の解離後に、脱ブロックされたリンキング基メルカプタンと合 成担体の選択は、抗原の決定基部分によりも、抗原の意図される最終用途により 依存し、本発明には特に含められない判断基準に基づく、たとえば、もしワクチ ンが動物で用いられるなら特定の動物で不都合な反応を起さない担体が選ばれる べきである。もし、ワクチンがヒトで用いられるなら、ヒトでの用途を意図され る任意のワクチンに妥当するのと同じ配慮、つまり担体及び／又は得た抗原の免 疫化学的又は他の副反応のないこと、安全性及び効率に大きな注意が払われる。

■、免疫化手順 ここで用いられる接種物又はワクチンは、ポリペプチド単独で所定の量を、グル タルアルデヒドとの反応により互に結合された個々のポリペプチドのポリマーと して、又は担体に結合された接合体として含む、これら接種物は、約ｐＨ７〜ｐ Ｈ１０の中庸なｐＨ値で接種当り約２０μｇ〜約５００ｍｇのポリペプチド濃度 でたとえば空気中酸素による酸化を行われるポリペプチド末端を含みうる。ポリ ペプチドの上述の量は、担体が用いられた場合、担体重量を除いたポリペプチド の重量を云う。

接種物はまた、生理的に許容される（受容できる）希釈剤たとえば水又は食塩水 を含み、また更に典型的にはアジュバントを含んだ、完全なフロイントのアジュ バント（ＣＦＡ）　、不完全なフロイントのアジュバント（ＩＦＡ）及び明ばん のようなアジュバントが当業界で周知であり、いくつかの供給源から市販入手で きる。

接種物貯蔵溶液は、下記のようにしてＣＦＡＳ　ＩＦＡ又は明ばんを用いて作ら れた：接種当り望む量のポリペプチドを与えるのに十分な量の合成ポリペプチド 、ポリマー状ポリペプチド又は接合体を、７，２のｐＨ値又は任意の他の適当な ｐｉｔ値のリン酸縁緩衝された食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。

次に等体積のＣＦＡ、ＩＦＡ又は明ばんをポリペプチドと混合して、水対オイル 比が約１＝１である、ポリペプチド、水及びアジュバントを含む接種物を得た。

混合物をその後、均質化して接種物貯蔵溶液を得た。

ラビットに、完全なフロイントのアジュバント（ＣＦＡ）、不完全なフロイント のアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化された又は明ばん（各側において５ｍｇ／ｍ ｚ）に混合された３００〜４００μｇのポリペプチド接合体を含む接種物を、各 々第０．１４及び２１日に筋肉内注射した。各免疫化は、動物の脇腹肉の接種物 の四回の筋肉注射より成る。注射当り上述の投与量の十分の−を用いて、同様に してマウスを免疫化した。

動物は、最後の注射の７及び１４日後に採血された。いくつかの例では、必要な ら動物は明ばん中の促進注射を受け、その後採血された。対照の免疫化部血清は 、最初の免疫化の直前に採血することにより、各動物から得られた。

接種物貯蔵溶液はまた、キイホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、Ｉ　 ＦＡ　（不完全なフロイントのアジュバント）中のＫＬＨ％ＫＬＨ−明ばん吸着 、ＫＬＨ−明ばん吸着−百日咳（ρｅｒｔｕｓｓｉｓ）、エデスチン、チログロ ブリン、破傷風トキソイド及びＩＦＡ中破傷風トキソイドを用いて調製できる。

宿主に抗原又は接種物を注射又は他の導入を行うと、宿主の免疫系は多量の抗体 を産生ずることにより抗原に応答する０作った抗原すなわち合成ポリペプチドと 担体から形成される抗原の特異的抗原決定基は、興味の天然抗原の決定基に免疫 学的に実質的に対応するので、宿主は天然の抗原に対して免疫となる。

本発明がワクチンとして用いられる場合、これが望まれる結果である。

接種当りのポリペプチドの有効量は、なかんずく、接種される動物の種、動物の 体重及び選択された接種法に周知のように依存する。接種物は典型的には、ポリ ペプチド又はポリペプチドポリマーを水、食塩水又はアジュバントに懸濁するこ とにより、又はポリペプチドを担体に結合し、担体結合ポリペプチド゛（接合体 ）を同様の生理的に許容される希釈剤たとえばアジュバント　（前述のような） に懸濁することにより固体ポリペプチド又はポリペプチドポリマーから調製され る。ワクチン中に存在するポリペプチドの有効量は、担体重量を除いて、接種当 り約２０μｇ〜約５００ｍｇであることができる。

Ｘ０診断 血清又は親和性精製された抗体（体サンプルのような）が、酵素結合免疫吸着体 評価（ＥＬＩＳＡ）で研究された。プレート当り９６のくぼみを持つ丸底１ｍｍ ｕｌｏｎ　２　（商標）微小力価プレート（ダイナチックラボラトリーズ社、ア レキサンドリア、バージニア）を、ポリペプチドの溶液（５００ｎｇ／ｍ　ｆ） 　、部分的に精製されたＩＬ−２（５０〜１００車位／　ｍ　１２　）又は１％ ラウン清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングした。１％ＢＳＡ緩衝液中の血清 の順次希釈物をプレートに加えて、プレートのくぼみの中の非特異的蛋白質結合 部位をブロックした。

プレートを次に３７℃に１時間維持（インキュベート）し、０．０５％のポリオ キシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　２０）を含むリ ン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）溶液（ｐＨ７，２＞で８回洗った。

プレートを次に、マウス抗体を測定するために親和性精製されたホースラディツ シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ＋　Ｉ　ｇＭ、又は ラビット抗体を測定するためにヤギ抗ラビットＩｇＧ（タボ（Ｔａｇｏ）社、バ ーリンガム、カリフォールニア）の１：２０００希釈で３７℃で１時間維持した 。

その後プレートを水で洗い、固体支持体に結合されたペルオキシダーゼラベルさ れた抗体をｐｏｓ、ｏクエン酸塩・リン酸塩緩衝液中の０．４　ｗａｇ／　ｍ　 １のオルトフェニレンジアミン及び０．００６％過酸化水素（両者ともシグマケ ミカル社、セントルイス、ミズリー、より入手）の溶液と反応させて色ラベルを 現像した。

反応は、暗やみ中で１５〜３０分間の後に２Ｍ硫酸の５０μｌを加えて停止され た。吸光度は、４９０ｎ＋ｗでモデルＭＲ６００マイクロプレートリーダー（ダ イナチック　ラボラトリーズ、アレキサンドリア、バージニア）を用いて測定さ れた。

各プレートにコーティングされたポリペプチドの半分及びＩＬ−２の半分を飽和 するのに必要な血清中の抗体量がその後、標準的方法で計算された。これらの結 果は、第Ｖｌ　（Ａ）部の表１に示される。

χ１．ラビット抗ポリペプチド抗体の親和性精製２ＩＩｇのポリペプチドを、洗 われたＡｆｆｉ−ｇｅｌｌ　０　（バイオ・ラド、リッチセント、バージニア） の２ｍｌに加えられた１００１１１１１の３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン 酸（ＭＯＰＳ）ＩＩ衝液（ｐＨ７，５）１ｍｊ！に溶解し、４℃で１夜維持した 。ゲル上の未反応基は、１Ｍ塩化アンモニウムの１７１０体重を用いて室温（２ ３℃）で１時間ブロックされた。ゲルにカップリングしたポリペプチドを次に、 ＰＢＳで洗い、次に１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，５）で洗い、そし てプラスチックシリンジのＩＸＺＣＯｌカラムに詰めた。

免疫ラビット血清（５〜２　Ｑｍｊりをカラムに２０〜４０ｍβ／時間の流速で 加えた。カラムをＰＢＳで洗い、結合した抗体を１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝 液でｐＨ２，５で溶出した。酸性の溶離物（分画当り２ｍｉ’）を、１ＭのＴｒ ｉｓ　−ＨＣ１緩衝液（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−・１，３−プロパ ンジオール）の１／２０体積で中和した。

分画は、ポリペプチドをコーティングした又はＩＬ−２をコーティングしたプレ ート上で、上述のようにしてＥＬ　Ｉ　ＳＡで研究され、それらの蛋白質含量は ローリイ法〔ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｆｆ　、　Ｃｈｅ＋ｉ、 、　１９３．２６５　（１９５１））により測定された。活性な溶離物分画をプ ールし、１〜５１ｍｇ蛋白質／ｍ蛋白質槽し、ＰＢＳに対して透析し、次に１． ００　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐ）１７．５　）に対して透析し、−２０℃で貯蔵した 。

Ｘ■　ウェスターンプロット分析 粗製の、１００倍濃縮のｌ　Ｌ−２含有上澄み中の蛋白質成分は、ラエムリ　（ Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチア、２２７．５８０　（１９７０）記載のようにドデ ソル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離さ れ、次にトウビンら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７６．４３５０　（１９７９）記 載のようにニトロセルロース紙上に電気泳動的にプロットされた。

ブＣ１７トは、ジランソンら、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、１．３（１９ ８４）記載の標準法の変法を用いて、抗体による非特異的結合を最小にするため にブロックされ、親和性精製された抗Ｐ８４抗体（５μｇ　／　ｍ　１　）でラ ベルされた。

プロ、りされたラベルされたプロットは次に、ブロッキング緩衝液〔ジョンソン ら、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、　］、３（１９８４）により３回洗われ 、１×１０ｈカウント／分／ゲルレーンの濃度の１２５１−黄色ブドウ球菌蛋白 ＷＡと共に室温で１時間維持された。放射能ラベルされた蛋白質Ａは、複合体化 反応を通してＩｇＧ抗体の存在のためのラベルを与える。

蛋白質Ａラベルされたプロットは、上述のようによく洗われ、水ですすがれ、乾 燥され、そしてオートラジオグラフィに付された。パラレルゲルは、多数の２１ １１１厚さのスラスイスに切断され、スライスは、それを細かく刻み、５％ＦＣ ３補給培養基３０ＯｕＪ中で３７℃で１６６時間インキュベートることによより 溶出された０次に培養基を４℃で４時間インキュベートして、ゲルからＳＤＳを 沈降させた。遠心分離により沈陣物を除き、上澄みを上述のようにＩＬ−２活性 についてテストした。

ｘｍ　免疫螢光法 ヒト末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）を、フイコルーヒバク遠心分離（Ｈｊｔｏｐ ａｑｕｅ−１０７７：商標、シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー）によ りヘパリン化血液から分離した。この細胞を、０．５％フィトヘマグルチニン− Ｍの存在下又は不存在下で、ＲＰＭＩ−１６４０培養基＋５％胎児ウシ血清（Ｆ ｅ２）中で２Ｘ１０’細胞／ｍｌで培養した。三日後に細胞を収穫し、２度洗い 、細胞遠心分離機を用いてガラススライド上にベレット化した。

スライドメタノールで５分間固定し、水で洗い、ＰＢＳ及び１０％ＦＣ５中の１ ０〜５０μｇ／ｒｒ＃の抗ＩＬ−２ポリペプチド抗体又は対照抗体と共に室温で ３０分間インキュベートした。スライドを水で洗った後に、各スライドを、フル オレセイン　イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合したヤギ抗うビフトＩｇＧ（ カペル　ラボラトリーズ、コツクランビル、ペンシルベニア）の１＝５０希釈物 で４℃で３０分間処理し、水で洗い、位相差及び螢光顕微鏡法でツアイス顕ａ鏡 で観察した。

上述は、本発明を例示することを意図するものであって、制限するものではない 、多数の変化及び修正が、本発明の精神及び新規な概念の範囲から離れることな く行われうる。ここに述べた特定の抗体、組成物及び用途に関して制限が意図さ １０　れてはいす、また推論されるべきではない。

１、　２０　４０ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴ５ＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨ ｒ、ＬＬＤＬＱＭ工ＬＮＧ工ＮＮＹＥＩＩ （１Ｂ−３２−Ｃ） （５１−６４−Ｃ）　ＰＬＯ（７９−９２）　（９４−１０８−Ｃ）ＲＤＬ工Ｓ Ｎ工ＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＩ’Ｆ’ＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴ工ＶＥＦＩ、ＮＲ Ｗ工Ｔｌ：′ＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（Ｃ−１２６−１３８） （ＬＳＩ）　（２０）　（３０）　（３２）Ｐａｌ　τｈｒＡｓｎｓｅｒＡ１ａ ＰｘｏτｈｒｓｅｒｓｅｚｓｅｚτｈｒＬｙｓＬｙｓτｈｒＧｌｎＬｅｕｃｙｇ Ｐａ３　、Ｔ７ｒＬｙ５Ａ８ｎＰｒＯＬｙ８シｕＴｈｒＡｒ９Ｍ！ｔシｕＴｈｒ ＰｈｅＬｙＩＰｈＩＣｙ！１（６５）　（）ｏ）　（）８） ＰＬＯ’ｒｙｒＭｅｔｐｒｏＬｙｓｒ、、ｙ幻ｕａＴｈｒＧｌｕＬｅｕＬｙｓｓ ＨｉｓＬｅｕＧ１ｎＣｙｓＰ　８４　Ｌｅ　ｕＧ　１　ｕＧ　１　ｕＧ　１　ｕ ＴＪａ　ｕ　ＬＹ　ｉ　Ｐｒ　ＯシｕＧｌ　ｕＧ　ｌ　ｕＶａ　Ｉ　Ｌｅ　ｕＡ ｓ　ｎVｕ （９４）　（１００）　（１０ｇ） ！’１１　Ｇ１ｎ５ｅｒ　ＬｙｉＡｓｎＰｂｅＨｌｓ　ＬｅｕＡｒ　ｇＰｒ　ｏ Ａｒ　９ＡＳ　ｐＬｅｕ！１ｅＳｅｒＡｓｎＣｙｓ（ｉｌｌ）　（１２０）　（ １２５） ＰＩ３　Ｖａ１！ＬｅＶａｌＬｅｕＧ１ｕＬｅｕＬｙｓＧｌｙＳｅｒＧ１ｕＴｈ ｒＴｈｒＰｈｅＭｅｔＣｙｓ１１１３　ＣｙｓＧ１ｕＴｙｒＡｌａＡｓｐＧｌｕ ＴｈｒＡｌａＴｈｒ工１ｅＶａｌＧ１ｕＰｈｅＬａｕＰａ　２　ＡｓｎＡｒ　ｇ Ｔｒ　ｐ！　１ｅＴｈ　ｒＰｈｅＣｙ　５Ｇ１ｎｓｅｒ　Ｘ　ｌｅ　Ｘ　１ｅｓ ｅ　ｒＴｈ　ｒ　Ｌｅ　ｕτｈｒ０．０．　（４９０ｎｍ） 浄書（内容に変更なし） １４”ｂ（内容に変更なし） 一一−ｉｎ；＃　ｆｎ３ｈ　ｇ　１；１００１ｃｐＨ１１＋　１０３１浄書（内 容に変更なし） スライ久　８　１６　２４　３２　４０ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ。８ａ ＦＩＧ、　８ｂ 手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８５１００５３０３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　昭和６１年６月ｌＯ日７、補正の内容　別紙のとおり ・−＝−＝−・−・・・−＝　”ＣＴ７ｔＪＳ　８　’）　／　００５３　Ｑ− Ｃ＾―−ＮＰＣＴ／ＵＳ８５１００５３０

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸残基配列に実質的に対応する アミノ酸残基配列を持つ、約６〜約４０のアミノ酸残基を含む合成ポリペプチド であって、単独で、ポリマーとして又は担体に結合されたポリペプチドの接合体 として、有効量で生理的に許容される希釈剤中で宿主に注入された場合、インタ ーロイキン−２の上記抗原決定基に対する抗体の産生を誘発する能力を持つ合成 ポリペプチド。
2. ２．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第１項に従う合成ポリペプ チド。
3. ３．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第１項に従う合成ポリペプ チド。
4. ４．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第１項に従う合成ポリペプ チド。
5. ５．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第１項に従う合成ポリペプ チド。
6. ６．インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸配列に免疫学的に実質的に対 応するアミノ酸残基配列を持つ、約６〜約４０のアミノ酸残基を含む合成ポリペ プチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含む接種物であって、宿主に導 入されたときインターロイキン−２の上述の決定基と免疫反応する抗体の産生を 宿主において誘発できる接種物。
7. ７．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向 に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第６項に従う接種物。
8. ８．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向 に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第６項に従う。
9. ９．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向 に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第６項に従う接種物。
10. １０．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方 向に書いて式 【配列があります】 により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲第６項に従う接種物。
11. １１．合成ポリペプチドが、キイホールリンペットヘモシアニン、不完全なフロ イントのアジュバント中のキイホールリンペットヘモシアニン、明ばん、キイホ ールリンペットヘモシアニン明ばん吸着、キイホールリンペットヘモシアニン− 明ばん吸着−百日咳、エデスチン、チログロブリン、破傷風トキソイド及び不完 全なフロイントのアジュバント中の破傷風トキソイドより成る群から選ばれた担 体に結合されている請求の範囲第６項に従う接種物。
12. １２．インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸残基配列に免疫学的に実質 的に対応するアミノ酸配列を持つ約６〜約１０のアミノ酸残基を含む合成ポリペ プチドに対して動物宿主において生じた抗体であって、インターロイキン−２の 上記抗原決定基と免疫反応する能力を持つ抗体。
13. １３．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方 向に書いて式 【配列があります】 及び 【配列があります】 より成る群から選ばれた式により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲 第１２項に従う抗体。
14. １４．インターロイキン−２の抗原決定基の存在を評価するための診断系であっ て、インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸配列に免疫学的に実質的に対 応するアミノ酸配列を持つ、約６〜約４０のアミノ酸残基を含む合成ポリペプチ ドに対して動物宿主において生じた抗体を生化学的に活性な形で含み、上記抗体 は評価されるべく混合されたサンプルと免疫反応して、その存在が指示手段によ りシグナルされるところの免疫反応物を形成するところの診断系。
15. １５．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方 向に書いて 【配列があります】 及び 【配列があります】 より成る群から選ばれた式により示されるアミノ酸残基の配列を含む請求の範囲 第１４項に従う診断系。
16. １６．酵素に結合した第二抗体を含む指示手段を更に含み、ここで該第二抗体は 最初に述べた抗体と同じクラスの抗体に対して同じ種から生じられたものであり 、上記免疫反応物中に存在する最初に述べた抗体に結合することにより上記免疫 反応をシグナルするものであること、及び該シグナルは上記結合した酵素と加え られた基質との反応により指示されるものであるところの請求の範囲第１４項に 従う診断系。
17. １７．上記指示手段が上記抗体に結合された放射性元素を含み、上記免疫反応が 該放射性元素を含む上記免疫反応物の沈降を起すものであるところの請求の範囲 第１４項に従う診断系。
18. １８．体成分中のインターロイキン−２の抗原決定基の存在の評価のための診断 系において、 （ａ）インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸残基配列に免疫学的に実質 的に対応する、約６〜約４０のアミノ酸残基の配列を含む合成ポリペプチドを生 物学的に活性な形で含む第一の反応剤、ここで上記ポリペプチドは、担体に結合 されて接合体とされて有効量でワクチンとして宿主動物に導入されると、インタ ーロイキン−２の上記抗原決定基と免疫反応する抗体の産生を宿主において誘発 することができること；及び（ｂ）上記合成ポリペプチドと免疫反応する抗ポリ ペプチド抗体を生化学的に活性な形で、上記第一の反応剤及び当該第二の反応剤 の間の免疫反応の存在を指示する手段と共に含む第二の反応剤 を別々の容器に含み； 上記第一及び第二の反応剤は、評価されるべき体成分の所定量の存在下で所定量 で混合されると、上記指示手段によりシグナルされる免疫反応量を与え、この免 疫反応の量は、上記抗原決定基を含むインターロイキン−２が上記体成分中に存 在しない時、既知の免疫反応量と異るところの診断系。
19. １９．（ａ）インターロイキン−２の抗原決定基に対する抗体の産生を誘発する のに十分な量の合成ポリペプチドを宿主に投与すろこと、ここで上記合成ポリア ミドはインターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸残基配列に実質的に対応す るアミノ酸残基配列を持つこと；及び （ｂ）このように作られた抗ポリペプチド抗体を回収することの段階を含む、抗 ポリペプチド抗体を形成する方法。
20. ２０．（ａ）請求の範囲第１項の合成ポリペプチドに対する抗ポリペプチド抗体 を用意すること； （ｂ）抗ポリペプチド抗体が結合する抗原決定基の存在について評価されるべき サンプルの所定量と上記抗ポリペプチド抗体の所定量を混合すること； （ｃ）この混合物を、上記抗ポリペプチド抗体が混合されたサンプル中に存在す る抗原決定基に結合するのに十分な時間維持すること；及び （ｄ）上記抗ポリペプチド抗体とインターロイキン−２の上記抗原決定基との間 の結合の量を測定することを含む、サンプル中のイソターロイキン−２の抗原決 定基の存在を評価する方法。
21. ２１．インターロイキン−２の抗原決定基のアミノ酸配列に免疫学的に実質的に 対応するアミノ酸配列を持つ、約６〜約４０のアミノ酸残基を含む合成ポリペプ チドに対して動物宿主において生じられた抗体を生化学的に活性な形で結合され ている不活性な固体支持体を含む親和性吸着体であって、インターロイキン−２ を含む水性組成物と混合されると可逆的複合体を形成する親和性吸着体。