JPH02797A - ポリペプチドおよびその誘導体、ならびにそれを含有する医薬および診断組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、自己免疫疾患とくに関節炎状態の緩和、治療
および診断に適当なポリペプチドおよびその誘導体に関
する。さらに、本発明は、これらの化合物からなる医薬
および診断用組成物、ならびに免疫学的試験を実施する
だめの試験キットに関する。

発明の背景 関節の構成要素または生体の結合域に対する自己免疫が
関与すると考えられる慢性的な関節炎に罹患している思
考は数百万に達する。これらの状態には、慢性関節リウ
マチ、強直性を椎炎、ライチル症候群およびその他の型
の反応性関節炎が包含される。これらの疾患の病因は不
明であるが、様々な微生物による以前の感染が、遺伝的
に感受性の高い個体では誘発環境として作用するように
思われる。たとえば、慢性関節リウマヂ患者は、マイコ
バクテリウム抗原に対して異常な反応性を示すことがあ
り、マイコバクテリウムのＢＣＧ株による免疫感作が１
５０例中１ｓ例に関節炎を招いたことが明らかにされて
いる。強直性を椎炎はクレブシェラ属またはエルシニア
属の細菌種による感染、またその他の関節炎の症例はサ
ルモネラ属、シゲラ属等による感染と関連づけられてき
た。

大多数の症例において、これらの微生物による関節の能
動的な感染の証拠はなく、微生物感染が関節に存在する
自分自身の抗原に対する個体の明瞭な自己免疫応答の引
き金になるものと考えられてきた。アジュバント１１１
１節炎（ＡＡ）は、ラットの感受性株をマイコバクテリ
ウムに免疫感作することによって誘発される関節炎の実
験モデルである。

免疫感作約１２０模に発症する疾患は慢性関節リウマチ
の多くの特徴を有し、ＡＡは慢性関節リウマチのモデル
と考えられてきた。

先行技術 ＥＰ−Ａ−０１８１３６４号には Ｈｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｈ−３７、Ｈ，ｋａｎｓ
ａｓｉ　ｉおよびＬｖａｃｃａｅのようなある種のマイ
コバクテリ１クムの水性アセトン可溶性および不溶性分
画が開示されている。Ｉｔ／ｌＶｃ、ｌ−１−３７の可
溶性分画は、アジュバント関節炎に対する抵抗性を生じ
る免疫応答を誘発することが発見された。不溶性分画は
アジュバント関節炎の誘発の原因となると考えられてい
る。Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖａｃｃａｅはアジ
ュバント関節炎誘発成分を含まないことが明らかにされ
た。さらに、ＥＰ−Ａｏ　　１８１　３６４号には、マ
イコバクテリウムに対する反応性によって選択されたあ
る種の系およびクローンが記述されている。これらの系
およびクローンは、照射ラットに接種して関節炎の誘発
に使用できる。Ａ２と命名された系のひとつは、照射ラ
ットに静脈内注射すると関節炎を誘発することが明らか
にされた。同じ系のＡ２は、非照射ラットの予防接種に
使用すると、その債にマイコバクテリウムに対する能動
免疫処置で誘発する自己免疫関節炎に有効である。細胞
系Ａ２はクローン化されている。２種の別個のクローン
が１ｑられ、それぞれＡ２ｂおよびＡ２ｃと命名されて
いる。Ａ２ｂは関節炎を惹起するが、その予防接種には
使用できないのに対し、クローン△２Ｃは関節炎を惹起
しないがその予防接種に使用できる。関節炎の予防に加
えて、クローンＡ２ＣはＡＡの治療にも使用できる。ざ
らに、りローンＡ２ｂおよびＡ２ｃは、関節病原性また
は関節病原性の抑制に関与する抗原の同定に使用できる
。両クローンは、全マイクロバクテリウムならびに軟骨
プロテオグリカンタンパク質に応答する。

ヨーロッパ特許出願第８７　２０１６９１．０Ｍ（１９
８７年９月７日出願、公告第０２６２７１０号）には、
分子間約６４ＫＤで、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ
ｍｎ＋ｕｎｉｔｙ１１９８５．８００〜８０６頁に記載
された製法によって１９られるポリペプチドが、自己免
疫関節炎および類似の自己免疫疾患に対する抵抗性を誘
発する免疫原として有用である旨述べられている。

上述の論文では、問題のペプチドは抗原へと呼ばれてい
るので、本明細書でもこの名称を使用する。この論文に
よれば、抗原△は、Ｓａｕ　３Δで切断したマイ］バク
テリウムＤＮＡノラグメントをラムダベクターＥＭＢＬ
ａ中にクローニングすることにより大腸菌中でマイコバ
クテリウム・ボビスＢＣＧ　　ＤＮＡの遺伝子バンクを
構築して得られた。マイコバクテリウム抗原の発現は高
度免疫ウサギ血清でウェスタン１０ツテイングを行い解
析した。この論文には、試験した７７０個のクローン中
に、各種のマイコバクテリウム抗原を微小、一般には検
出限界に近い濃度で産生ずる数個のクローンが認めたと
述べられている。１個の特定のクローンが選ばれ、さら
に検討された。このクローンは６４ｋＤの抗原を産生じ
た。この抗原の構造遺伝子の前にラムダプロモーターＰ
、を配置することにより、過剰産生大腸菌株が得られた
。この論文には、この６４ｋＤタンパク質と交差反応す
る抗原が広範囲のマイコバクテリウム中に、また皮膚試
験に通常用いられるいわゆる精製タンパク質誘導体中に
も存在することが示されている。最後に、この論文には
、６４ｋＤ抗原に対する抗体が結核患者の血清に存在す
ることが予備実験で示された旨述べられている。

ヨーロッパ特許出願第０　２６２　７１０号にはまた、
抗原Ａのアミノ酸配列が次のように記載されている。

１　　ｆＨＡＫＴＩＡＹＤＥＥ　　ＡＲＲＧＬＥＲＧＬ
Ｎ　　ＡＬＡＤＡＶＫＶＴＬＧＰＫＧＲＮＶＶＬＥ　　
ＫＫ１４ＧＡＰＴＩＴＮ　　ＤＧＶＳＩＡＫＥＩＥ６１
　　　　ＬＥＤＰＹＥＫｒＧＡ　　ＥＬＶＫＥＶＡＫＫ
Ｔ　　ＤＤＶＡＧＤＧＴＴＴＡＴＶＬ八ＱＡＬＶＲＥＧ
ＬＲｔへＶＡＡＧＡ　　ＮＰＬＧＬＫＲＧＩＦ１２１　
　　ＫＡＶＥＫＶＴＥＴＬ　　ＬＫＧＡに［ＶＥＴＫ　
　ＥＱＩＡＡＴＡＡＩＳＡＧＤＱＳＩＧＤＬＩ　　ＡＥ
ＡＨＤＫＶＧＮＥ　　ＧＶＩＴＶＥＥＳＮＴ１８１　　
　ＥＧＬＱｌ、ＥＬＴＥＧ　ＨＲｒＤＫＧＹＩＳＧ　　
ＹＦＶＴＤＰＥＲＱＥ＾ＶＬＥＤＰＹＩＬＬ　　ＶＳＳ
ＫＶＳＴＶＫＤ　　ＬＬＰＬＬＥＫＶＩＧ２４１　　　
ＡＧＫＰＬＬ［ＩＡＥ　　ＤＶＥＧＥＡＬＳＴＬ　ＶＶ
ＮＫＩＲＧＴＦＫＳＶＡＶＫＡＰＧＦＧ　　ＤＲＲＫＡ
ＨＬＱＤＨＡＩＬＴＧＧＱＶＩＳ３０１　　　　［ＥＥ
ＶＧＬＴＬＥＮＡ　　０ＬＳＬＬＧＫＡＲＫ　　ＶＶＶ
ＴＫ［１ＥＴＴ（ＶＥＧＡＧＤ↑ＤＡＩ　　ＡＧＲＶＡ
ＱＩＩｔＱＥ　　Ｉ［Ｎ５ＤＳＤＹ［１Ｒ３６１ＥＫＬ
ＱＥＲＬＡＫＬ　　ＡＧＧＶＡＶＩＫＡＧ　　ＡＡＴＥ
ＶＥＬＫＥＲＫＩＩＲＩＥＤＡＶＲＮ　　ＡＫ八へへ［
ＥＧＩＶ　　ＡＧＧＧＶＴＬＬＱＡ４２１　　　ＡＰＴ
ＬＤＥＬＫＬＥ　　ＧＤＥＡＴＧＡＮＩＶ　　ＫＶＡＬ
［ＡＰＬＫＯＩ八ＦＮＳＧへＥＰＧ　　ＶＶ八［ＫＶＲ
ＮＩＰ　　ＡＧＩＩＧＬＮＡＱＴＧ４８１　　　　ＶＹ
ＥＤＬＬＡＡＧＶ　　ＡＤＰＶＫＶ丁Ｒ３Ａ　　ＬＱＮ
ＡＡＳＩＡＧＬｒＬＴＴＥＡＶＶＡＤ　ＫＰＥＫＥＫＡ
ＳＶＰ　ＧＧＧＤＨＧＧＨＤＦ本明細書においては、ア
ミノ酸残基は以下の文字を用いて示す。

Ａアラニン　Ｉイソロイシン　ＲアルギニンＣシスチン
　Ｋリジン　Ｓセリン Ｄアスパラギン酸　Ｌロイシン　ＴスレオニンＥグルタ
ミンｌ！１Ｍメチオニン　ＶバリンＦフェニルアラニン
　Ｎアスパラギン Ｗトリプトファン　Ｇグリシン　ＰプロリンＹチロシン
　Ｈヒスチジン　Ｑグルタミンヨーロッパ特許出願第０
　２６２　７１０号には、さらに、抗原Ａが、他の細菌
種に存在する抗原と血清学的に交差反応することが述べ
られている。これは、抗原Ａ−［に存在するエピトープ
が、様々の細菌種、たとえばマイコバクテリウム、エシ
ェリヒア、トレボネマ、シゲラ、サルモネラ、エルジニ
ア、ノカルジア、キャンピロバクターおよびクレブシェ
ラの同等のタンパク買上に同様に存在することを示して
いる。たとえば、抗原Ａのアミノ酸配列は、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ、　８３　ニア
０１３〜７０１７　（１９８６）に間ポされているＨｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅからの６５ｋＤ
タンパク質のアミノ酸配列ときわめて高いホモロジーを
示すことが明らかにされている。たとえば、抗原Ａのア
ミノ酸配列１３４〜２０１はＨ，Ｉｃｐｒａｅの上述の
６５ｋＤタンパク質中にも同様に存在する。

さらに、ヨーロッパ特許出願用０　６２７　１０号には
、抗原Ａ自体は関節病原性を示さず、Ｈ，ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓによって誘発されるラットのｆＩ１節炎を
防御することが明らかにされている。

最後に、ヨーロッパ特許出願用０　２６２　７１０号に
は、ＥＰ−Ａ−０１８１３６４号に開示されているＴ細
胞クローンＡ２ｂおよびＡ２Ｇの、１１ｇ節病原性また
は関節病原性の抑制を伴う抗原の同定のための利用が記
載されている。

両りａ−ンとも、全フィコバクゾリウムならびに抗原へ
に応答する。Ｔｉｔ胞クローンに対する抗原への刺激活
性に関与するエピト−プの位置をさらに明らかにするた
め、抗原へのフラグメントについて検討が行われた。こ
れらの７ラグメントは、遺伝子の欠失変異体によって産
生された切断誘導体、ざらにβ−ガラクトシダーぜとの
融合タンパク質、および合成的に作ったペプチドであっ
た。

この研究から、Ｔｉ１ｌ胞クローンの刺激に関与するエ
ピトープは、抗原Ａアミノ酸配列１７１〜２４０にある
ことが明らかにされた。ヨー０ツバ特許出願第０　２６
２　７１０号は、とくに、抗原Ａアミノ酸配列１７１〜
２４０を有するポリペプチドと配列ホモロジーを示すポ
リペ１チドに関する。

このホモロジーは、ポリペプチドが４〜７０個のアミノ
酸残基から構成され、このアミノ酸配列中少なくとも４
個のアミノ酸残基は、抗原Ａアミノ酸配列１７１〜２４
０を有するポリペプチドにおける同じアミノ酸残基と同
じ相対的位置にあるとするものである。　Ｔｉ［１ＪＩ
ｌクローンＡ２ｂおよびＡ２Ｇによって認識されるポリ
ペプチドのひとつは抗原Ａアミノ酸配列１８０〜１９６
をもっていた。

発明の説明 さらに研究の結果、■細胞クローンＡ２ｂおよびＡ２Ｃ
によって認識される抗原Ａエピトープのさらに正確な定
義が可能になった。ポリペプチドは公知の固相法を用い
て製造し、これらのポリペプチドについてＴ細胞り０−
ンに対する刺激活性を試験した。結果は図に示すとおり
である。刺激試験におけるペプチドの濃度は常に１μ９
／ｒｒｄｌとした。Ｔｉ飽（２Ｘ１０’個／ウェル）を
補助細胞として照射（１５００Ｒ）同系胸腺細胞（２×
１０６個／ウェル）の存在下に４日間培養し、ついでｍ
胞を３日−チミジンと１６時間反応させて、増殖反応を
測定した。チミジンの取り込みによる１分間あたりのカ
ウント数（ｃｐｓ）を３回測定し、抗原を加えないで３
回実施した対照試験の結果の平均で割った。このように
して得られた比の平均値を刺激指数（３１士標準偏差、
ＳＩ＝試験ｃｐｍ／抗原を含まない対照ｃｐｍ　）とす
る。培養メリジウムは、１％ラット血清、５ｘ１０’Ｍ
２−メルカプトエタノール、２１１１８グルタミン、１
００単位／ｍｅのペニシリンおよび１００μｇ／ｄのス
トレプトマイシンを補充したダルベツコ改良イーグル培
地（Ｇｉｂｃｏ　）とした。同様にして、Ｈ，ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓの加熱死菌（Ｈ３７Ｒａ、　Ｄｉｆｃ
ｏ　）についても試験した（Ｍｔ）。

図に示したように、配列１５３〜１７１．１８５〜１９
６．１９０〜２００および１９７〜２１８を有するポリ
ペプチドは反応せず、配列１８３〜１９６を有するペプ
チドはわずかに反応する。

配列１７４〜１９２．１８０〜１９６および１８０〜１
８８を右するポリペプチドは反応性を示す。

これらのデータから、■細胞クローンＡ２ｂおよびＡ２
ｃによって認識されるエピトープは、抗原Ａ配列１７２
〜１９２に存在し、配列１８０〜１８８が最も重要な部
分であることがわかる。

■細胞クローンＡ２ｂおよびＡ２ｃによって同様に認識
される軟骨のプロテオグリカンタンパク質のアミノ酸配
列（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６１　：　３５１
９〜３５３５．１９８６）が抗原Ａ配列１８０〜１８８
とホモロジーを示ずことは注目に値する。

さらに高いホモロジーがエプスタイン−バールウィルス
かラノ抗原の配列（Ｎａｔｕｒｅ、　３１０　：　２０
７〜２１１．１９８４）に認めら、このウィルスは慢性
関節リウマチの開始に関係することが示唆されている（
Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　６５　：　１２３８
〜１２４２．１９８０）。■細胞クローンＡ２ｂはこの
相同性配列を有するポリペプチドに応答する。

さらに、主に関節炎患者に存在するといわれる白血球抗
原（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　　ＩＩ　：　１１１８〜
１１２０．１９８７）であるＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｑ　３
の配列（Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、　　１３９　：３５０
６〜３５１１．１９８７）も、抗原Ａ配列１８０〜１８
８とホモロジーを示す。最後に、ヒトのラミンＡおよび
Ｃのアミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、　３１９　：　４６
３〜４６８．１９８６　：およびＰＡＮＳ、８３　：　
６４５０〜６４５４．１９８６）が、抗原Ａ配列１８０
〜１８８とホモロジーを示す。ラミンＡおよびＣはヒト
細胞の核膜の部分で、中間フィラメントタンパク質に関
係がある。■細胞クローンはこの相同性構造と明らかに
反応する。これらのホモロジーを例示すると次のとおり
である。

ｉａｏ　　　１ａａ Ｔ［ＧＬＱＬ［ＬＴ　　抗原ＡおよびＨ，１ｅｏｒａｅ
６５にロＴＡＶＶＡ１．ＥＬＱ軟骨プロテオグリカンタ
ンパク質ＴｒＧＬＱＰＱＤＴエプスタイン−パールウィ
ルス抗原ＲＨＮＹＱＬＥＬＲＨＬＡ−ＤＱ３ ＲＡＲＬＱＬＥＬＳラミン八およびＣ 本発明は、式 へ式％ で示される抗原△アミノ酸配列１７２〜１９２を有する
ポリペプチド、ならびに配列１７２〜１７９および／ま
たは配列１８９〜１９２のすべてまたは一部を欠くアミ
ノ酸配列を有する前記ポリペプチドから誘導されるポリ
ペプチドに関する。

配列１７２〜１７９および／または配列１８９〜１９２
の一部を欠く場合、ポリペプチド中に存在する配列１７
２〜１７９および１８９〜１９２の部分は、抗原へ配列
１７２〜１９２を有するポリペプチドの上述の式中と同
じアミノ酸配列を有する。

また、本発明は、上に定義したポリペプチドと配列ホモ
ロジーを示すポリペプチドに関する。本明細書において
、配列ホモロジーを示すポリペプチドとは、４〜２１個
のアミノ酸残基からなり、その配列中受なくとも４個の
アミノ酸残基は、上に定義した抗原Ａアミノ酸配列１７
２〜１９２を有するポリペプチドまたはそれから誘導さ
れてより短い配列を有するポリペプチドの場合と同じ相
対位置に存在するポリペプチドを意味する。

さらに詳しくは、本発明は、抗原Ａ配列１８０〜１８８
を有するポリペプチドおよびそれと配列ホモロジーを示
すポリペプチド、たとえば、配列ＴＡＶＶＶ八ＬＥＬＱ
、　ＴＦＧＬＱＰＱＤＴ　、ＲＩＩＮＹＱＬＥＬＲオヨ
ヒＲＡＲＬＱＬｔＬＳを有する上述のポリペプチドに関
する。

Ｔｉ１ｌ胞クローンＡ２ｂおよびＡ２Ｇは上に定義した
ポリペプチドのすべてに応答するが、このポリペプチド
の抗原性および免疫原性は、ポリペプチドの抗原決定基
の提示を改良できる少なくとも１個のラジカルにカップ
リングすることによって増強できる。このようなラジカ
ルは本技術分野において公知で、たとえば、ペプチド、
テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、β−ガラ
クトシダーゼおよび微生物外膜タンパク質のラジカルが
ある。問題のポリペプチドのマルチマーも考慮される。

これらの修飾ポリペプチドら本発明の一部を形成する。

本発明によるすべてのポリペプチド、すなわち、抗原Ａ
アミノ酸配列１７２〜１９２を有するポリペプチド、そ
れから誘導される配列１７２〜１７９および／または配
列１８９〜１９２のすべてまたは一部を欠くアミノ酸配
列を右するポリペプチド、上記ポリペプチドと配列ホモ
ｔ〕ジーを示すポリペプチド、ならびにマルチマーを含
む上に定籠した修飾ペプチドは、免疫原として医薬組成
物とくに、自己免疫疾患とくに慢性関節リウマチの緩和
および治療用ワクチンに、また抗原としてこれらの疾患
の診断用組成物として使用できる。これらの医薬および
診断用組成物は、本技術分野において公知の方法で製造
でき、また本発明の一部を形成するものである。上に定
義した本発明の修飾ペプチドの活性を、以下の実験によ
り例示する。

Ｈｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂＯｒｃｕｌｏｓｉｓ
　（Ｍ　ｔ　）によるアジュバント関節炎（ＡＡ）の誘
発に対する防御をラットで試験した。免疫原は、よく知
られているゲルタールアルデヒド法を用いてウシ血漬ア
ルプミン（ＢＳＡ）にカップリングさせた抗［Ａアミノ
酸配列１７７〜１８８とした。ラット５匹を１群として
、ＢＳＡ単独、１７７〜１８８−ＢＳＡ抱合体１００μ
びおよび抱合体５００μびをそれぞれフロイントの不完
全アジュバントに取り、腹腔内に投与した。ＢＳＡは１
７７〜１８８−ＢＳＡ５００μ９のＢＳＡ含吊に相当す
る用量を投与した。７日後、ラットに０．１−の鉱油に
懸濁したＭｔ　１１１１９を皮肉投与して免疫感作して
ＡＡを誘発した。関節炎評点は関節を毎日検査して決定
し、実験終了時には組織学的検査で確認した。

結果を第１表に示す。

第１表 第−７日における１７７〜１８８−ＢＳＡ抱合体ＯＯ０ ４，０１，５０ ７，０２，３１，０ ２，３２，８１，１ １，７１，８０，８ 同じ１７７〜１８８−ＢＳＡ抱合体による免疫感作の効
果は、Ｍｔ免疫感作後７日日月も試験した。この場合も
、発症した関節炎はＢＳＡ免疫感作対照ラットに認めら
れる関節炎に比べて軽度であった。関節炎が最も激しい
時ｗ４（第２０日）における平均関節炎評点は、１００
μ３で免疫感作したラット群で１．５００μ９で免疫感
作したラット群で１．８であったのに対し、ＢＳＡ免疫
感作対照の平均評点は６であった（各群の動物数は６）
。

以下の実験は、本発明の非修飾ポリペプチドの免疫原活
性を例示する。

この実験では、第０日に、各群６匹のラットに対し、鉱
油０．１ａｉｔ中に懸濁したＭｔ　ＩＩＩＦｇを皮肉投
与して関節炎を誘発した。第７日に、１群のラットにＰ
ＢＳ単独、第２の群にはＰＢＳに溶解した抗原へアミノ
酸配列１８０〜１８８ペプチド１０μ９、第３の群には
ＰＢＳ中上記ペプチド１００μ９を、それぞれ静脈内投
与した。

第２表は、本発明のペプチドが、関節炎症状の発症を有
意に抑制することを示している。

第２表 第７日におけるＰＢＳ中１８０〜１８８の静脈内投与に
よる免疫感作のＡＡに対する防御５．０ ６．４ １０．７ １２．８ ９．４ ６．４ ２．０ ３．８ ７．４ ３．８ ４．２ ３．２ １．２ ２．８ ４．４ ２．０ ２．４ １．８ 以下に、本発明によるペプチドの免疫学的テストでの抗
原としての使用について説明する。

若年性ｒＩＡｍ炎リウマチ（ＪＲＡ）患者３６人から採
取した血清について、１：４０及び１：８０で稀釈して
スタンダード固相ＲＴＡによりテストした。比較のため
に、非ＪＲＡ患者１５人から採取した血清、及び他の病
気の子供３６人から採取したコントロール血清について
もテストした。

ＪＲＡ患者の１０人は多発性ＲＡ、１４人はｐａｕｃｉ
　ＲＡ、　１２人は全身性ＲＡであった。

抗原は次の通りである。

１、ＡＰ：ＥＰ−ＡＯ１８１３６４に記載されている如
きＨｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｗｌｏｓｉ
ｓのアセトン沈澱画分： ２、抗原Ａ； ３、アミノ酸配列１８０−１８８の抗原へを有するペプ
チド； ４、軟骨プロテオグリカン蛋白中に生じる配列ＴＡＶＶ
ＡＬＥＬＱを有するペプチド。

テストは以下のようにして実施した。

抗原２．５μグのＰＢＳ５０μＩｌ溶液を各ウェルに加
えて、抗原をマイクロプレート上にコートした。室温で
２時間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し
た。１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。室温で３０分
間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し
、血清を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１＝４０及び１：８０で
希釈して加えた。室温で２時間インキュベーション後、
ＰＢＳで３回洗浄し、ヤギ抗ヒトイムノグロブリンであ
ってヨードで１００．０００力ウント／分で放射ラベル
したものを各ウェルに加えた。４０℃で１晩インキユベ
ーシヨンし、Ｐ［３Ｓで４回洗浄後、放射活性を測定し
た。コントロールの平均より少なくとも２倍高い標準輸
動のものを反応ポジティブとした。

結果は次の表■に示した。

本：非−ＪＲＡ患名のうちのポジティブ反応を示した２
人の患者からの血清（１３％）は、ヒザの関節炎患者と
節赤血病患からのものであった。

本発明のポリペプチドの免疫原性を改善する他の方法と
して、公知の遺伝子操作技術を用いて、本発明のポリペ
プチドをそれ自体もしくは融合タンパク質の一部として
、またはそのマルチマーとして発現する微生物を構築す
る方法がある。これらの微生物は、問題の微生物に対す
る抗体の産生および！飽性免疫の発現を誘発するのみで
なく、自己免疫疾患の緩和および治療にも有用な生ワク
チンの製造に使用できる。

これらの遺伝子操作微生物およびこれらを含有する医薬
組成物も、本発明の一部を形成する。適当な遺伝子操作
微生物の例としては、ワクシニア、マイコバクテリウム
・ボビスＢＣＧおよびサルモネラ株を挙げることができ
る。

最後に、本発明は、上述の抗原性化合物の少なくとも１
種と容器、または上述の診断用組成物と容器からなる免
役学的試験を実施するためのキットを提供する。

本発明の抗原性化合物および診断用組成物ならびに診断
用キットは様々なタイプの検定に使用することができる
。たとえば、 Ａ、１．　　リンパ球増殖試験、またはこのような増殖
を指示する任意の実体の測定 ＾、２．　　リンパ球活性化の存在および程度を確立す
る標準手段で検定可能な、リンパ球の活性化の測定が指
標となる変化、とくに ａ、リンホカインの産生、たとえばインターロイキン−
２（ｌＬ−２＞の産生、 ｂ、γ−インターフェロン、 Ｃ１移８阻止因子（ＭＩＦ）、 ｄ、膜マーカー、たとえばｌ［−２受容体、ピーナツ凝
集受容体の発現、 ｅ、酵素たとえばヘパラナーゼの発現 Ｂ、抗体力価の絶対値または他の組成物によって得られ
る値の比としての測定。これらの値または比は、疾患の
有無を指示する。得られた定量的な値は、疾患の型温度
の確立に有用である。

本発明の診断用組成物は、上に定義した本発明の抗原性
化合物１種または２種以上を適当なアジュバントおよび
補助成分と配合することにより製造できる。標準または
検定手段の付いた標準化キットは、関節炎疾患ならびに
そのステージおよび／または市篤度の迅速かつ簡便な判
定手段として価値がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種配列のポリペプチドに対するＴ１［１１
１ａクローンＡ２ｂおよびＡ２Ｃの反応を示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【アミノ酸配列があります】 で示される抗原Ａアミノ酸配列１７２〜１９２を有する
   ポリペプチド、ならびに配列１７２〜１７９および／ま
   たは配列１８９〜１９２のすべてまたは一部を欠くアミ
   ノ酸配列を有する前記ポリペプチドの誘導体。
2. （２）式 ＴＦＧＬＱＬＥＬＴ で示されるアミノ酸配列１８０〜１８８を有する特許請
   求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
3. （３）４〜２１個のアミノ酸残基からなり、その配列中
   少なくとも４個のアミノ酸残基は特許請求の範囲第１項
   または第２項のポリペプチドにおける同じアミノ酸残基
   が同じ相対的位置にあるアミノ酸配列を有するポリペプ
   チド。
4. （４）アミノ酸配列 ＴＡＶＶＡＬＥＬＱ、 ＴＥＧＬＱＰＱＤＴ、 ＲＨＮＹＱＬＥＬＲまたは ＲＡＲＬＱＬＥＬＳ を有する特許請求の範囲第３項に記載のポリペプチド。
5. （５）その抗原性および免疫原性を増強する少なくとも
   １個のラジカルに連結された特許請求の範囲第１項から
   第４項までの１または２以上による化合物。
6. （６）免疫原性を増強するラジカルは、ペプチド、テタ
   ヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、β−ガラクト
   シダーゼまたは微生物外膜タンパク質のラジカルである
   特許請求の範囲第５項に記載の化合物。
7. （７）特許請求の範囲第１項から第４項までの１または
   ２以上による化合物のマルチマー。
8. （８）特許請求の範囲第１項から第４項までの１または
   ２以上による化合物を、それ自体または融合タンパク質
   の一部もしくはマルチマーとして発現する微生物。
9. （９）遺伝子操作を受けたワクシニア、マイコバクテリ
   ウム・ボビスＢＣＧまたはサルモネラ株である特許請求
   の範囲第８項に記載の微生物。
10. （１０）特許請求の範囲第１項から第７項までの１もし
    くは２以上による化合物または特許請求の範囲第８項も
    しくは第９項の微生物からなる、自己免疫疾患とくに関
    節炎状態に対する医薬組成物とくにワクチン。
11. （１１）特許請求の範囲第１項から第７項までの１また
    は２以上による化合物からなる診断用組成物。
12. （１２）特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
    かの化合物または特許請求の範囲第１１項の診断用組成
    物を含む容器からなる免疫学的試験実施用キット。