JPH03505731A - 自己免疫の改善に有用なｍｈｃによって媒介される毒性抱合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫の改善に有用なＭＭＣによって媒介される毒性抱合体 技五分互 本発明は、自己免疫症の治療およびこの病気の治療および診断に有用な物質およ び方法に関する。特に、本発明は、主要な組織適合性複合体（ＭＢＣ）　糖タン 白質と自己免疫に関する抗原のフラグメントを表わすペプチドとの複合体を用い ることによりヘルパーＴ細胞を標的とする複合体に関する。これらの複合体は、 放射性同位体または診断の目的のだめの他の標識或いは毒素またはこれらの複合 体を治療上有用にする他の物質に抱合させることもできる。

宜景且王 ３０種類を上回る自己免疫症が、現在知られており、これらは重症筋無力症（Ｍ Ｇ）および多発性硬化症（ＭＳ）を含む世間の注目を集めた多くのものがある。

これらの病気の特色は、患者の組織に免疫系が攻撃することであり、これらの組 織抗原は免疫系によって「自己」と認識されるため病気に罹っていないヒトの妨 げとなる。自己免疫症では、この認識は明らかには起こらず、患者の組織は侵入 者として治療され、すなわち免疫系がこの仮想の異種標的を破壊しようとするの である。

自己免疫症を治療する大まかな方法は、勿論一般的な免疫抑制である。この方法 は、免疫応答を積み重ねる必要がある真の異種物質に患者が応答する能力を損な うといった明白な不利益を有する。若干ではあるが改善された方法は、抗体また は標的組織を包含する免疫複合体の除去に依存している。

この方法も好ましくない副作用を有し、完全なものというのは困難である。以下 に詳細に記載する本発明の方法は、「クロノタイプ」試薬、すなわち自己抗原に 敏感な免疫系の細胞のみを攻撃する試薬に依存する。

免疫応答を記載するのに考えられる一般的なパラダイムでは、挙げられる具体的 な抗原は１９５９年にバーネットによって提唱されたクローン膨張となる。この シナリオによれば、特定の患者は無数のＴおよびＢ細胞であってそれぞれが様々 な抗原決定基に結合するレセプターを有するものを有することになる。抗原に暴 露すると、抗原は他のものは無視して選択的に抗原が含む抗原決定基の適当なレ セプターを有する細胞に結合する。この結合によって、娘細胞であってそのそれ ぞれが同じレセプターでマークされたもののクローン母集団となる。クロノタイ プ試薬は、対象の抗原に適当なＴおよびＢ細胞の部分集合のみに影響を与える。

本発明の組成物の場合には、抗原決定基は通常は自己免疫症に関するものである 。

本発明のクロックイブ試薬は、自己免疫症によって冒される組織の抗原決定基に 特異的なりローンを表わすＴ−ヘル７＜−細胞を標的とするように具体的に設計 されている。Ｔ−ヘルパー細胞はＭＨＣタン白質に関連する決定基のみを認識す るので、本発明の複合体はＭＨＣタン白質の有効な部分を包含する。

近年、特異抗原に免疫が応答するのを禁止させようとする幾つかの関連した方法 があった。例えば、自己抗原チログロブリンをリシンＡに抱合して、この抱合体 が通常はこの抗原に応答するリンパ球の試験管内での抗体応答を特異的に抑制す ることが示された。このような免疫毒素は、特異的に自己抗体を分泌するリンパ 球クローンを欠失させることが示唆された（レニー・ディービーら、Ｌａｎｃｅ ｔ　（１９８３年１２月１０日）、１３３８〜１３３９）。ディーナー・イーら 、匙違徂姐（１９８６）、　２３１゜１４８〜１５０は、酸感受性スペーサーを 用いてダウノマイシンをハプテン（この場合には、オポアルブミン）に抱合させ ることによって、リンパ球機能の抗原特異性抑制を起こす化合物の構成を示唆し た。この抱合体は、試験管内および生体内でＢリンパ球によって抗体分泌のハプ テン特異性抑制を引き起こした。ダウノマイシン（と酸感受性スペーサーと）の Ｔ細胞に特異的名モノクローン抗体に対する抱合体も、コンカナバリンＡに対す るＴリンパ球による応答を除去した。スチールズ・アールケイエムら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　（１９８５）、　１３４．８４１〜８４６は、毒素抱合体におけ る毒性要素として放射線を用いた。ラットに無標識レセプターを注射する前に、 エレクトリック・フィッシュからの放射能標識をした精製したレセプターを投与 した。このレセプターの注射は、実験的に自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）を 誘発させる標準的な方法である。コントロールラットでは、レセプターを投与し てＥＡ？ｌＧの症状を示す病気を誘発させる前に、無標識レセプターまたは放射 能標識したアルブミンのみを予め注射したが、この放射能ｍｔｉレセプターで前 処理したものは症状が軽かった。標識し、それ故破壊的なレセプターは選択的に 免疫拮抗細胞を除去するものと思われた。前処理用のりシン／レセプター抱合体 を用いる同様な研究は、キレン・ジェイエイら、ム士ｎｎｖｕｎｏＬ　（１９８ ４）。

１３３、２５４９〜２５５３によって報告された。

Ｔ細胞を破壊する特異性の少ない方法は、通常はヒクソン・ジェイアール、ル世 −ハリ上Ｊ亘匝些（１９旦Ｚ年１月２８日）、４〜５によって報告されたｆＬ− ２／毒毒素台体による処理である。

逆の、関連した方法では、リウ・エムエイら、５ｃｉｅｎｃｅ（１，９８８）、 η１３９５〜３９７は、細胞毒性Ｔ細胞の特異性とは無関係にこの細胞毒性Ｔ細 胞と所望な標的を「結合する」方法を報告している。この方法では、一般的な細 胞毒性Ｔリンパ球レセプターＣＤ３に特異的な抗体を標的腫瘍細胞の表面レセプ ターに特異的なホルモンに抱合させた。この抱合体は、メラニン細胞刺激ホルモ ンが用いたホルモンである時には、細胞毒性Ｔリンパ球を活性化してヒト黒色腫 細胞を破壊することができた。

免疫の最新のモデルは、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）における遺伝子によ ってコードされたクラス■の糖タン白質をその表面に含む抗原提供細胞（ＡＰＣ ）によって接種されることによって抗原が少なくとも部分的に免疫応答を移動す ると仮定している。次いで、抗原を、表面に結合したＭＨＣ糊タン白質の関連に おいて特異的Ｔヘルパー細胞に提供し、抗原特異的Ｔ細胞レセプターとこの抗原 −糖タン白質複合体との相互作用によりＴヘルパー細胞を刺激して、細胞毒性Ｔ 細胞機能の誘発、Ｂ細胞機能の誘発およびこの応答を助け、幇助する多くの因子 の分泌を包含する抗原特異性免疫応答を媒介する。

自己免疫症におけるＭＨＣクラス■タン白質の関与は、動物モデルで示されてい る。

ＭＨＣクラス■タン白質自体に対する抗体またはＭｌ（Ｃクラス■遺伝子の発現 を誘発する化合物に対する抗体の投与はこれらのモデル系における自己免疫条件 の展開を妨げる。ヘルパーＴ細胞の役割も、抗ＣＤ４モノクローン抗体を用いて 自己免疫系を妨害することによってこれらのモデルで示されており、ＣＤ４は特 徴的なヘルパーＴ細胞レセプターである（シズル・ジエイエイら、５ｃｉｅｎｃ ｅ　（１９８８）　、　２４０．６５９〜６６２）。

尤ユ■Ｍ丞 本発明は、好ましくない自己免疫の原因である免疫系の性状を同定し且つ破壊す る方法に関する。本発明の組成物および方法は、ＭＨＣによってコードされる糖 タン白質に関連して特定の抗原を認識するヘルパーＴ細胞を標的とするように設 計される。本発明の複合体は、抗原に関してＴリンパ球および免疫系の他の細胞 の相互作用を誘発する抗原提供細胞を効果的に代用する。単離されたＭＨＣクラ ス■抗原自体は、Ｔヘルパーリンパ球に対する抗原エピトープの提示において抗 原提供細胞を効果的に置換することができる（ワンッ・ティーエイチら、Ｐｒｏ ｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ　（１９８４）＋　８１．７５６４ 〜７５６８　）。、しかしながら、毒素のようなエフェクター機能を抗原提供細 胞（ＡＰＣ）に換えることによって、さもなければ抗原が創作する免疫応答を効 果的に破壊し、標識をＡＰＣ表面に代えることによって、抗原が相互作用する免 疫系の部分が同定される。

本発明は自己抗原自身によって開始され、自己免疫反応を起こす方法と同様な方 法で免疫系と相互作用する自己抗原の形態を提供し、改良法では、例えば免疫系 および更に重要にはこの好ましくない方法で応答する免疫系の能力を破壊する他 の系の関連部分を同定する追加の機能を提供する。

一つの態様では、本発明の組成物は、（１）ＭＨＣによってコードされる抗原提 供糖タン白質の有効部分と、（２）抗原の有効部分と、（３）エフェクターの３ 成分複合体であるつ最初の二つの成分は共有結合または非共有的に会合すること によって結合させることができ、次に第三のエフェクター成分、最も一般的には 毒素または標識へ抱合する。エフェクター成分はＡＰＣ表面の代わりをし、免疫 系の標識に関する複合体の効果を変化させる。

もう一つの態様では、本発明の組成物、すなわち（１）Ｍ　ＨＣ↓こよってコー ドされる抗原提供糖タン白質の効果的部分および（２）抗原の有効部分との二成 分複合体を精製する。

これらの二成分は共有結合的にまたは非共有結合的会合によって結合することが できる。

したがって、一つの観点では、本発明は前記複合体である組成物に関する。他の 観点では、本発明は、本発明の複合体が活性成分である薬学組成物、特定の抗原 、特に自己免疫に関する免疫系を抑制する方法、および本発明の複合体および薬 学組成物を用いる特異抗原と反応する免疫系の部分を同定する方法に関する。

したがって、本発明の一つの特徴は、弐ＸユＭＨＣｉペプチド（１）または Ｍ）ｌｃｉベプチドユＸ（２） 〔式中、Ｘは毒素および標識基から選択される官能基であり、ＭＨＣはＭＨＣＩ Ｊｉタン白譬であって、それが通常存在する細胞表面から解離したものであり、 「ペプチド」は自己抗原と会合したエピトープ含有抗原ペプチドであり、 上は共有結合によって式（１）においてＸとＭＭＣまたは式（２）においてＸと ペプチドに結合した共有結合または２価のリンカ−であり１ 、えは共有結合、非共有結合的会合またはＭＨＣおよびペプチドと共有結合的に 結合したまたは会合したリンカ−である〕を有する複合体である。

本発明のもう一つの特徴は、を推動物患者の自己免疫症を治療する方法であって 、治療を必要とするを推動物にこの複合体が活性成分であり、Ｘがｉ素である複 合体または薬学組成物を投与することを特徴とする方法である。

更にもう一つの本発明の特徴は、を推動物患者の自己免疫症を監視する方法であ って、治療を必要とするを推動物にこの複合体が活性成分であり、Ｘが毒素であ る複合体または薬学組成物を投与することを特徴とする方法である。

更にもう一つの本発明の特徴は、式 ％式％ （ＭＨＣ，２およびペプチドは請求項１に定義した通りである）を有する組成物 を調製する方法であって、ＭＢＣ−ＩＩ含有細胞からＭＨＣ−ＩＩ糖タン白質を 単離し、このＭＢＣをペプチドと共にインキュベーシヨンし、透析によって過剰 のペプチドを除去することがら成る方法である。

皿皿旦Ｈ！星に班 図−１は、本発明の典型的複合体の線図であり、図−２は、ヒ）　ＨＬＡ−Ａ２ 抗原（クラスＩ）の三次元構造を示し、 図−３は、改質したクラス■のＭＨＣ−コード糖タン白質の活性部分の模式的表 現を示し、 図−４は、好ましい第二世代ＭＨＣタン白質の設計図を示し、 図−５は、ＭＨＣＰＶタン白質を含む平坦な膜二重層であって、抗原提供細胞の 表面を模したものの線図であり、図−６は、アセチルコリンレセプタータン白質 のアルファサブユニットのアミノ酸配列およびコードｍＲＮＡを示し、図−７は 、ミニリン塩基性タン白質のアミノ酸配列を示し、図−８は、Ｉ−Ａｂ−アルフ ァ鎖をコードするヌクレオチド配列を示し、 図−９ば、Ｉ−Ａｂ−ヘーター鎖をコードするヌクレオチド配列を示し、 図−１０は、ヒトのＤＱ／ＤＲハブロタイブおよび自己免疫症との関連のリスト を示し、 図−１１は、本発明の複合体の自己免疫症の診断および／または治療に利用する のに好適なプロトコールを示し、図−１２は、ＮＰ−４０可溶性膜抽出物を含む Ｉ−Ａｋの調製図を示し、 図−１３Ａは、１０−２．１６モノクロ一ン抗体の親和性精製およびそのＣＮＢ ｒによって活性化したセファロース４Ｂへのカップリングの略図であり、 図−１３Ｂは、図−１３Ａ（７）略図によッテ精製された１０−２．１６モノク ロ一ン抗体の純度を示すゲルのコピーであり、図−１４は、Ｉ−Ａ’の精製の略 図を示し、図−１５は、図−１４の略図によって精製されるＴ−Ａｋの純度を示 す、ポリアクリルアミドゲルであり、図−１６は、Ｉ−Ａ’およびＭＢＰ（１− １３）を含む複合体による増殖の速成についての８種類の研究の結果を示す棒グ ラフであり、Ｉ−ＡｋはＩＡ’とも呼ばれ、図−１７は、ＭＢＰ（１−１３）を 用いる免疫感作がら生じるマウスのＥＡＥの進展を示すグラフであり、図−１８ は、ＭＢＰ（１−１１）による免疫感作の結果マウスのＢＩＯＡ　（４Ｒ）から 得られるＴ細胞クローン４Ｒ３，４によってＥＡＥの養子移入を示すグラフであ る。

日を　　　るためのン１ 本発明の複合体は３つの成分、すなわち免疫系に対して関連効果を有する自己抗 原または他の抗原性配列を表わすペプチド、抗原の表示に関与するＭＨＣでコー ドされた糖タン白質の有効部分、および通常は毒素または標識であるエフェクタ ー成分の３成分を含む。一般に、エフェクタ一部分はＭＨＣによってコードされ る糖タン白質または場合によっては抗原に共有結合によって抱合しており、ペプ チド抗原とＭＨＣタン白質とは共有結合または非共有結合的結合によって会合す ることができる。この系の成分のそれぞれは、下記に個別的に記載され、次いで これらの複合体を調製し、評価して、用いることができる方法の説明を行う。

Ｘ且旦血米底立 ＭＨＣによってコードされる糖タン白質は、ヒトおよびネズミの系で広汎に研究 されている。一般的に、それらはあらゆる細胞の表面に見出され且つ主として細 胞毒性Ｔ細胞によって認識されるクラスＩの糖タン白質として分類されている。

マクロファージのような補助細胞を含む数種類の細胞の表面にみられるクラス■ は、ヘルパーＴ細胞に対する抗原の提示に関与する。組織適合性タン白質の幾つ かが単離され、特徴決定されている。

ネズミＩ−Ａ（クラス■）の組織適合性タン白質を精製する方法は、テユーケウ ィッツ・エイビーら、門０１ｅＣ吐虹加二肥（旦ｕ（１９８３）　、　２０　、 １１３９〜１１４７に開示されている。Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅサブリージョンによ ってコードされる単離された抗原は、３２〜３８ｋｄのアルファ鎖と２６〜２９ ｋｄのベーター鎖の２本の非共有結合的に結合したペプチド鎖がら成ることが示 された。第三の不変の３１ｋｄペプチドはこれら２本のペプチドと非共有結合的 に会合しているが、これは多形ではなく、細胞表面上の抗原の成分とは思われな い（七カリ・アールビー、ムシ１１吋、　（１９８６）、虫、　１４９０〜１５ ０４）。Ｉ−Ａ領域の７種類の対立変体のαおよびβ鎖はクローニングされて配 列された（エステス、「Ｔ細胞クローン」３〜１９）。

ヒトのクラスエタン白質も研究されている。染色体６上のヒト（ＨＬ八）のＭＭ Ｃは３個の遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、　　ＨＬＡ−Ｂおよび）ＩＬＡ−Ｃを有して おり、その最初の２個は多数の対立遺伝子コードアロ抗原を有する。これらは、 ４４ｋｄサブユニツトと総ての抗原性特異性に共通な１２ｋｄのβ２−マイクロ グロブリンサブユニットから成ることが見出されている。これらの決定基可溶性 ＨＬＡ抗原の単離はスプリンガー・ティーエイら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ八ｃａへ 　Ｓｃｉ、　（１９７６）、７３．２４８１〜２４８５　、タレメントソン・ケ イジェイら「膜タン白質」、アジ・エイ監修；ブジョークマン・ビー、バーバー ド大学博士論文（１９８４）に記載された。

更に研究が行われて、クラス１のヒト抗原であるＨＬＡ　−Ａ２の３−Ｄ構造の 詳細な図が得られた（ブジョークマン・ピーシエイら、Ｎａｔｕｒｅ、　　（１ ９８７）　、　３２９．５０６〜５１２．５１２〜５１８）。この図では、重鎮 のβ２−マイクログロブリンタン白質およびα３セグメントが会合しており、重 鎮のα８およびα２領域が抗原結合ポケントの塩基を形成するものと思われる（ Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）、　２３８．６１３〜６１４　；ブジョークマン ・ピージョイら、Ｎａ　ｔｕ□匹（同上））。可溶性ＨＬＡ　−４２は、ターナ −・エムジェイら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９７５）、　２５０．４５１ ２〜４５１９　；バーハム・ビーら、Ｊ　　ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９７７）、 　２５２．７５５５〜７５６７によって記載されているように、ホモ接合ヒドリ ンノド法芽球様セルラインＪ−￥からの血漿膜をパパイン消化の後に精製するこ とができる。パパインはトランスメンプラン領域の近くの４４ｋｄ鎖を切断して 、β３．β２．β３およびβ２マイクログロブリンから成る分枝を生成する。ク ラス１のＨＬＡ　−Ａ２抗原の推定三次元構造の表示を図−２に示す。

クラス■のＭＨＣ抗原の三次元構造は詳細には知られていないが、クラス■の糖 タン白質はクラスＩと同様なドメイン構造を有するものと考えられる。それは、 膜二重層から伸びる２本のクラス■の鎖のＮ末端ドメイン部分から形成される。

一本の鎖のＮ末端部分は、ＭＨＣクラスＩ抗原配列のβ１およびα２領域と同様 な２個のドメインを有する。対向鎖は、β、およびβ２で示される２個のドメイ ンを有する。（エステス（同上）に記載されているような）クラス■の抗原遺伝 子のクローニングを行うことによって、例えば下記のようにクラスＨのＭＭＣ結 合ドメインの操作を行うことができる。

本発明の複合体のＭＨＣ糖タン白質部分を、次にリンパ球から単離することによ って得て、所望なペプチド抗原を結合する能力をスクリーニングすることができ る。リンパ球は複合体で治療される固体の種から得られる。例えば、それらは当 該技術分野に知られている手法を用いて、複製不全エプスタイン−バーウィルス で形質転換することによって不変になった標的となる自己免疫症に冒されている 固体からのヒトＢ細胞から単離することができる。

ＭＨＣｍタン白質は、パパインでの処理、３ＭＫＣｌでの処理、および洗剤での 処理による可溶化を含む各種の手法を用いて多（の細胞から単離されている。好 ましい方法では、リンパ球からのクラス■のタン白質の洗剤抽出の後に親和性精 製を用いる。次いで、洗剤を透析または選択結合ビーズ、とバイオビーズによっ て除去することができる。

また、多くのクラス■タン白質のアミノ酸配列が知られており、遺伝子がクロー ニングされているので、タン白質を組換え法を用いて作成することができる。第 一世代の合成ＭＨＣタン白質では、Ｈ（α）鎖およびＬ（β）鎖は、疎水性ドメ インの欠失を行うカルボキシ末端の切断を用いて合成され、カルボキシ末端を任 意に選択して毒素または標識の抱合を促進することができる。例えば、第３図に 示されるＭＨＣタン白質では、リジン残基が導入される。更に、カルボキシ末端 の近くのシスティン残基を包含させて、鎖のジスルフィド結合を形成する手段を 従供し、合成遺伝子にも制限部位を包含させて発現ベクターへの挿入および遺伝 子配列を操作して同族体をコードするのを促進する。αおよびβ鎖を次に発現ベ クターに挿入し、適当な宿主、例えばＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、公募または 他の適当な細胞中で別個に発現させ、得られる組換えタン白質をペプチド抗原の 存在下にて組換えする。

遺伝子の利用可能性によって容易に配列を操作することができるので、第二世代 の好ましい構成は第４図に示されるように、ハイブリッドクラス■およびクラス ■の特徴を含み、クラスｎ　Ｍ　ＨＣのα、およびβ１　ドメインが端と端βシ ート接触を生じるこれらのドメインの間で分子内二量体化を行うことができる柔 軟部分を介して結合している。次に、β１セグメントはクラス■のβ２　ドメイ ンに融合して、β２マイクログロブリンは同時発現して複合体を安定化する。ク ラス■遺伝子のトランスメンプランおよび細胞内ドメインも含むことができるが 、リポソームを用いて複合体を輸送しなければそうする点はないことがある。一 層単純なバージョンはβ１およびβ１　ドメインのみを含み、毒素の抱合のため のＣ−末端リジンを有する（第４図）。

発現ベクターの構成および適当なりＮＡ配列からの組換え体産生は、自体公知の 方法によって行われる。

発現は、原核生物または真核生物系において行うことができる。原核生物は、最 も頻繁にはＦ、　ｃｏｌｉの各種の菌株によって表わされる。しかしながら、他 の微生物菌株、例えば。ベー乙文ムーー咀と（ハ枦↓腹■ｕｂｔｉｌｉｓ）のよ うなバチルス、各種の二二上至土ス（ハ肋亜μ班鯨）または他の細菌株を用いる こともできる。これらの原核生物系では、複製部位と宿主と適合する種に由来す る制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉは 典型的にはｐＢＲ３２２、ポリバーら、Ｇｅｎｅ　（１９７７）　　２　、９５ によって報告されているＥ、　ｃｏｌｉ種由来のプラスミドを用いて形質転換さ れる。

原核生物制御配列が通常用いられ、本明細書では転写開始のプロモーターと、所 望によりリポソーム結合部位配列と共に、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ） およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（チェンジら、Ｎａｔｕｒｅ　（１ ９７７）、　１９８．１０５６）、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ ー系（ゲラデルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８０）＋　 　８　＋　４０５７）およびランブタ由来のＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子 リポソーム結合部位（シマタケら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）、　２９２．１ ２８）のような通常用いられるプロモーターのようなオペレーターを含むものと 定義される。原核生物と適合性を有する任意の利用可能なプロモーター系を用い ることができる。本明細書に引用される上記または下記の総ての文献の内容は、 参考として本明細書に包含される。

真核生物の宿主に有用な発現系は、適当な親核生物遺伝子由来のプロモーターか ら成っている。例えば、公募に有用なプロモーターのクラスには３−ホスホグリ セレートキナーゼのプロモーターのような解糖酵素の合成のプロモーター（ヒソ ラマンら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅｌＩ＋、　（１９８０）、　２５５．２０７３ ）を包含する。

他のプロモーターはエノラーゼ遺伝子（ホランド・工しジエイら、Ｊ　Ｂｉｏｌ 　Ｃｈｅｗ、　（１９８］）、　２５６．１３８５）またはＹＥｐ１３から得ら れるＬｅｕ　２遺伝子（ブローチ・ジェイら、Ｇｅｎｅ、　（１９７８）。

８．１２１）からのプロモーターが挙げられる。

適当な哺乳類のプロモーターには、ＳＶ４０　（フィールスら、Ｎａｔｕｒｅ、 　（１９７８）、　３７３．１ｉ３）からの初期および後期プロモーターまたは ポリオーマ、アデノウィルス■、ウシパピローマウィルスまたはトリ肉腫ウィル ス由来のような他のウイルスプロモーターが挙げられる。適当なウィルスおよび 哺乳類のエンハンサ−は、上記に引用している。

発現系は、当該技術分野に公知の標準的な連結および制限手法を用いる標準的な 方法を用いてＭＨＣ配列に走査可能に連結した前記コントロール要素から構成さ れる。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成されたオリゴヌクレオチド を開裂して、調整し、所望一形態に再連結される。

部位特異性ＤＮＡ開裂は、当該技術分野で一般に理解されている条件下で適当な 制限酵素（または複数の酵素）で処理することによって行われ、その詳細は製造 業者または市販の制限酵素によって記載されている。例えば、ニュース・イング ランド・バイオラプスの製品カタログを参照されたい。一般に、プラスミドまた はＤＮＡ配列約１■は緩衝溶液２０ｍ中で酵素１単位によって開裂され、本明細 書の実施例では、典型的には制限酵素の過剰量を用いてＤＮＡ基質を完全に消化 する。約３７°Ｃで約１時間〜２時間のインキュベーション時間が適当であるが 、変更を行うこともできる。それぞれのインキュベーションの後に、タン白質を フェノール／クロロホルムで抽出することによって除去し、次いでエーテル抽出 を行い、核酸をエタノール沈澱させた後セファデックスＧ−５０スピンカラム上 で処理することによって水性分画から回収することができる。所望ならば、標準 的手法を用いるポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法によって、 開裂したフラグメントのサイズ分離を行うことができる。サイズ分離は、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　（１９８０）、　６５．４９９〜 ５６０に一般的に説明されている。

制限開裂されたフラグメントは、５０ｍＭ　）リスｐ）１７．６　、５０１ＭＮ ａＣ１、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　６　ｍＭ　ＤＴＴおよび５〜ＩＭｄＮＴＰ中 で２０〜２５°Ｃで約１５〜２５分間のインキユバ−９３２フ時間を用いて、４ 種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）の存在下にてＥ、 　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウ）の大きなフラグメントで処理 することによって、平滑末端とすることができる。フレノウフラグメントは５′ 粘着末端を満たすが、４種類のｄＮＴＰｓが存在しても突出している３′一本領 に砕かれる。所望ならば、粘着末端の性状によって指定される制限内でｄＮＴＰ ｓまたは選択されたｄＮＴＰｓの一つのみを供給することによって選択的に修理 することができる。フレノウで処理した後、混合物をフェノール／クロロホルム で抽出し、エタノール沈澱させた後、セファデックスＧ−５０スピンカラム上で 処理する。

合成オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調 製される。アニーリングまたは標識の前の一本鎖のキナーゼ処理は、５０ｍＭ　 ）リス、ｐ）１７．６　、１０ｍＭＭｇＣ１ｚ　、　５　ｍＭジチオスレイトー ル、１〜２　ｍＭ　ＡＴＰ　、　１．７　ｐＭ”Ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍｃｉ　１ ０＋Ｍ）　、０．１　ｍＭスペルミジン、０．１　ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡの存在下に て０．１ｎＭの基質にポリヌクレオチドキナーゼの過剰量、例えば約１０単位を 用いて行う。

連結は下記のような標準的条件および温度にて１５〜３０１１１の容量で行う＝ ２０１１１ＭトリスーＨＣｌ　　、　ｐＨ７，５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　、　１ ０ｍＭＤＴＴ　、　３３ｎ／ｍｌ　ＢＳＡ　、　１０ｍＭ〜５０ｍＭ　ＮａＣ１ および４Ｍ　ＡＴＰ　。

０．０１〜０．０２　（ワイス）単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、０°ｃ（ｒ粘着末端 」連結）、または１　ｍＭ　ＡＴＰ、　０．３〜０．６（ワイス）単位Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ、１４°Ｃ（ｒ平滑末端」連結）。分子間の「粘着末端」連結は、通 常は３３〜１００ｘｒ／ｍの総ＤＮＡ濃度（５〜１１００ｎ総末端濃度）で行わ れる。分子間平滑末端連結（通常は１０〜３０倍モル過剰量のリンカ−を用いる ）は、１〆総末端濃度で行われる。

「ベクターフラグメント」を用いるベクターの構成では、ベクターフラグメント は通常は細菌性アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′ホスフエー トを除去し、ベクターが再連結するのを防止する。ＢＡＰ消化は、ベクタ−１ｔ ｒｇ当たりＢＡＰ約１単位を用いてＮａ”およびＭｇ”２の存在下にて約１５０ ｍＭのトリス中でｐＨ８で、６０°Ｃで約１時間行う。核酸フラグメントを回収 するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱を行 い、セファデックスＧ−５０スピンカラムに適用することによって脱塩する。ま たは、好ましくないフラグメントの追加の制限酵素消化によって二重に消化した ベクター中で、再連結を防止することができる。

ｃＤＮＡまたは配列の修飾を必要とするゲノムＤ　Ｎ　Ａ由来のベクターの部分 には、部位特異性ブライマー指向性突然変異誘発を用いることができる。これは 、限定された不適正以外の所望な変異を表わす変異誘発される一本鎖ファージＤ ＮＡに相補的なブライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われる。簡単に言 えば、合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の直接的合成のブライ マーとして用い、生成する二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換する 。形質転換した細菌の培養液をトップアーガーに接種して、ファージの宿主であ る単細胞からプラークを形成させる。

理論的には、新プラークの５０％は、一本領として、変異誘発した形態を有する ファージを含み、５０％は基の配列を有する。生成するプラークを、正確な調和 のハイブリッド形成を行うことができるが、基の鎖との不適正はハイブリッド形 成を防止するのに十分である温度でキナーゼ処理した合成ブライマーとハイブリ ッド形成させる。プローブとハイブリッド形成するプラークを採取し、培養して 、ＤＮＡを回収する。

しかしながら、本発明のタン白質では、合成遺伝子を用いるのが好都合である。

遺伝子デザインは制限部位を含むことができ、これによって遺伝子を容易に操作 してコード配列部分をこれらのコード同族体と置換することができる。

プラスミドの構成のための正確な連結は、Ｅ、ｃｏｌｉゲネティック・ストック ・センター、ＣＧＳＣ＃６１３５または他の適当な宿主を最初に連結混合物で形 質転換することによって確かめることができる。好ましい形質転換体は、アンピ シリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質耐性によって、または当該技術分 野で理解されているようにプラスミドの構成の様式によって変化する他のマーカ ーを用いて選択される。次いで、形質転換体からのプラスミドを、フレウェル・ ディービーらのＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｊ　ＵＳＡ、　（１９６９ ）、　６２．１１５９に記載の方法によって調製した後、所望ならばクロラムフ ェニコール増幅６６７）を行う。単離したＤＮＡを、制限によって分析しおよび ／またはサンガー・エフら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔｌｓＡ ＋（１，９７７）、、フ’４．５４６３および更にメ・ンシングら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓｈ型、　（１９８１）、　　９．３０９またはマキサムら、伽 旦剰」ｌ上眩巳倶旦旺。

（１９８０）、　６５．４９９の方法によって記載されているジデオキシ法によ って配列を決定する。

次に、構成されたベクターをタン白質の産生に好適な宿主に形質転換する。

用いる宿主の種類によって、それらの細胞に的する標準的手法を用いて形質転換 を行う。コーエン・エスエヌの、ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ 、、　（１９７２）、　６９．２１１０に記載されているように塩化カルシウム を用いるカルシウム処理またはマニアチスら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ　、　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ＋　　（１９８２）、コー ルド・スプリング・ハーバ−・プレス、２５４頁に記載のＲｂＣｌ法を原核生物 または他の実質的な細胞壁バリヤーを有する細胞に用いる。このような細胞壁の ない哺乳類の細胞には、グラハムとファン・デル・ニブ、Ｖｉｒｏ■ｌ、　（１ ９７８）、　５２．５４６のリン酸カルシウム沈澱法またはエレクトロボーレー ション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）が好ましい。酵母には、ヴアン・ゾ リンゲン・ピーら、Ｊ　Ｂａｃｔｅｒ、　　（１９７７）、　１３０．９４６お よびシアオ・シー・エルら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、 　　（１９７９）、　７６、３８２９の方法によって形質転換を行う。

次いで、形質転換細胞をＭＭＣ配列の発現に好適な条件下にて培養し、組換えに よって産生されるタン白質を培養液から回収する。

坑１上運ムＬＬ 多数の自己免疫症に対する抗原タン白質または組織が知られている。例えば、実 験的に誘発した自己免疫症では、病原に関与する抗原が特性決定されており、ラ ットおよびマウスの関節炎では、コラーゲン誘発関節炎において天然型■コラー ゲンが同定され、アジュバント関節炎ではミコバクテリア熱シヨツクタン白質が （スチュアートから（１９８４）、　Ａｎｎ　ＲｅνＩｍｍｕｎｏｌ、　　２　 、１９９〜２１８　；ファン・エーデンら（１９８８）、　Ｎａｔｕｒｅ。

３３１、　ｌ７ｌ−１７３）同定され、マウスにおける実験的なアレルギー性甲 状腺炎では千ログロブリンが同定され（マロンら（１９８８）、　Ｌｈｚ１封、 　１５２．１１１５〜１１２０）　、実験的なアレルギー性重症筋無力症（ＥＡ ？ｌＧ）ではアセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）が同定され（リントストロ ームら、（１９８８）＋　Ａｄｖ　Ｊａｍｕｎｏｌ。

４２、２３３〜２８４）、またマウスおよびラットでの実験的アレルギー性脳を 髄炎（ＥＡＥ）ではタンパク脂質タン白質（ＰＬＰ）が同定されている（アチャ ーーオーベアら、同上を参照されたい）。

また、ヒトでは、例えばヒトリウマチ様関節炎における■型コラーゲン（ホロシ ッッら、（１９８６）　、　Ｌａｎｃｅｔ、　　ｉｉ　、　３０５〜３０９）お よび重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプター（リントストロームら、（ １９８８）、同上）が同定されている。

抗原提供細胞（ＡＰＣ）の表面におけるＭＨＣ塘クン白質による抗原の提供は抗 原タン白質が加水分解されて小さなペプチド単位になった後に起こるものと考え られている。抗原タン白質内のこれらの小さなセグメントの位置は、経験的に決 定することができる。これらのセグメントは長さが８〜１５単位であると予想さ れ、Ｔヘルパー細胞によって認識されるアグレトープ（ａｇｒｅ　ｔｏｐｅ）と エピトープとを含んでいる。エピトープ自体は、Ｔヘルパー細胞の抗原特異性レ セプターを認識する５〜６個のアミノ酸の隣接するまたは隣接しない配列であり 、アグレトープは、ペプチドとＭＨＣ［タン白質との結合の重要な隣接または非 隣接配列である。

関連する８〜１５個のアミノ酸のサブユニットを決定する経験的方法は、骨格筋 肉のアセチルコリンレセプターのαサブユニットを用いて例示される。重症筋無 力症（ＭＧ）では、自己免疫応答はこのサブユニットの領域に向けられる。神経 筋接合部のシナプス後部膜におけるアセチルコリンレセプターが失われると、Ｍ Ｇの症状が起こる。

ＭＧでは、アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のαサブユニットに対する自 己抗体がＡＣｈＲに向けられた自己免疫応答と関連している。ＭＧ患者の８５％ は、αサブユニットに反応する自己抗体を有している。これらのうち、６０％は 、６０〜８０の残基の間に配置されている主免疫原性領域（ＭＩＲ）と呼ばれる αサブユニットのペプチドセグメントに結合する抗体を持っている（ツァルトス とリントストローム、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ」兄、　（１９８ ０）、　７７、７５５）。自己反応性ヒトＴ細胞によって認識されるペプチドセ グメントは、αサブユニット上にも配置されている（ホーフィールド′ら、Ｐｒ ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｊ　ＵＳＡ＋（１９８７））。これらのＴ細胞 によって認識されるエピトープは、残基１〜３０．１２５〜１４７．１６９〜１ ．８１．２５７〜２７１及び３５１〜３６８の間に成る。更に、ヒトではＡＣｈ Ｒペプチド１９５〜２１２及び２５７〜２６９は、それぞれＨＬＡ　−ＤＲ５及 びＨＬＡ−ＤＲ３、０９ｗ２Ｆ！ＨＣハブロタイブの重症筋無力症患者のエピト ープとして部分的に特性決定されている（アーチャーオルベア（１９８９）、同 上を参照されたい）。

このレセプターのαサブユニットと結合しているエピトープを提供することがで きるアグリトープを有するペプチドは、次のようにして決定される。

トルベト・カリフォルニタス（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）Ａ ＣｈＲで免疫するときにヒト重症筋無力症の特徴の多くを有する病気を発現する マウスの種をモデルとして用いられる。Ｍｌ（Ｃクラス■の糖タン白質を、レク チン及びモノクローン抗体親和性担体を用いてこの種のマウスの肺臓細胞がら単 離する。

生成したＭＨＣクラスＨタン白質は、洗剤透析によってリン脂質小胞に取り込ま れる。次いで、生成する小胞を清浄なガラスカバースリップに融合させて、それ ぞれに第５図に示されるようなＭＨＣ分子を含む平坦な脂質二重層を生成させる （プライアンとマコーネル、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＬＩＳＡ、　（１ ９８４）８１、６１５９）。

粘着性の平坦な脂質膜に埋設されたＭＨＣクラス■分子を含む１個のカバースリ ップを数個の２４ウエル培養プレートのそれぞれのウェルに入れる。αサブユニ ット配列に対応し且つ１個以上の放射能標識したア′ミノ酸残基（下記の方法で 調製）を含む約４０の重複する２ｏ残基合成ペプチドのそれぞれ１個を、カバー スリップおよびＰＢＳを有するウェルに入れて、数日間インキュベーションする 。ＭＨＣクラス■糖タン白質「ポケット」におけるペプチドの結合の範囲を、カ バースリップ上のＭＨＣクラス■の平坦な脂質膜対平坦脂質膜のみに取り込まれ る放射能の量によって測定する。放射能の特異的取り込みは、結合したペプチド が平坦な脂質膜に含まれるＭＨＣクラス■分子の数腫の１つのアグレトープ（Ｍ ＨＣクラス■ペプチド結合部位）を含むことを示している。この方法ではＡＣｈ Ｒのαサブユニットに対するアグレトープの組がＡＣｈＲまたは精製したαサブ ユニットで免疫することによりＭＧの症状を示すマウスの種について定義される 。

次いで、アグレトープを含むαサブユニット合成ペプチドセグメントのそれぞれ を、カバースリップ上の平坦な脂質膜に埋設された単離したＭＨＣクラス■タン 白質の結合「ポケット」に取り込む。１つのカバースリップを２４ウエル培養プ レートのそれぞれのウェルに加え、ＡＣｈＲに対して免疫下マウスからの（およ び粘着性ＭＨＣクラス■タン白質を単離した）種からの肺臓細胞をそれぞれのウ ェルに加える。トリチウム化したチミジンのＤＮＡ中への吸収によって測定され るＴ細胞の増殖は、ＭＨＣクラス■タン白質結合ペプチドがアグレトープおよび Ｔ細胞に結合させるためのエピトープとを含むことを示している。

迅速複数ペプチド合成（ｒａｐｉｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ（ＲＡＭＰＳ）　）のためのデュポンの装置および手法を用いて 、トルベト・カリフォルニクス（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ） ＡＣｈＲからの重複する（１０残基の重複）２０残基ペプチドの組の構成員を合 成する。このペプチドの配列は既知であり、第６図に示されている。１種類以上 の放射性アミノ酸をそれぞれの合成ペプチドに取り込む。側鎖が保護されたＦＭ ＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェニル活性エステルを用いて、標準的逐次固相 ペプチド合成法を応用してペプチドを合成した後、標準的側鎖の脱保護および固 相支持体からのペプチドアミドを同時に放出する。

また、アセチルコリンレセプタータン白質のような抗原タン白質の８〜１５アミ ノ酸の推定セグメントを含む重複配列をゲイセン・エイチェムら、Ｌ工ｍｍｕｎ 　Ｍｅｔｈ、　（１９８７）、　１０２．２５９〜２７４の方法で合成すること ができる。合成した放射能標識したペプチドは、それらを個別的に（プレート上 で）前記のように脂質膜二重層に配合した精製したＭＨＣタン白質と共にインキ ュベーションすることによって試験する。

中枢神経系のミニリン鞘、すなわちミニリン塩基性タン白質（ＭＢＰ）を破壊す る多発性硬化症（Ｍ　Ｓ　）では、ミニリンの主要なタン白質成分が主な自己抗 原である。ＭＢＰタン白質の適当なセグメントも、ウシミニリンの塩基性タン白 質で免疫したときに実験的なアレルギー性脳を髄炎（ＥＡＧ）を発生させるマウ スの種を用いて経験的に測定され、ＭＢＰの配列は第７図に示される。

全身性エリテマトーデスを複雑な系統（ｓｙｓｔｅｍｏｌｏｇｙ）を有するが、 赤血球に対する自己免疫応答から生じる。この病気の抗原性エフェクターである ペプチドは、赤血球の表面のタン白質に見出されている。

リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、滑液に見出されるタン白質に対する免疫応答から 生じる慢性炎症である。

インシュリン依存性の真正糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インシュリンの分泌に関与す るランゲルハンス島内のβ細胞に対する自己免疫攻撃によって生じる。ランゲル ハンス島の表面抗原およびインシュリンに対する循環抗体は、ＩＤＤＭに先行す ることが知られている。ＩＤＤＭの免疫応答を誘導するのに重要なペプチドは、 インシュリン配列およびランゲルハンス島の表面タン白質の部分であると考えら れている。

関連する抗原ペプチドのサブユニットは比較的短いので、ペプチド合成の標準的 自動的方法を用いて容易に合成することができる。或いは、単離したまたは合成 りＮＡ配列を用いて組換えにより作成することができるが、これはこの長さのペ プチドに対して最も効率的な方法ではない。

したがって、要約すれば、標識をした試験ペプチドの組が調製され、ＭＨＣタン 白質を含有する平坦な脂質膜中でＭＢＣに結合するものがアグレトープを含むこ とが示される。

次に、同定したペプチドを従来の固相合成によって調製し、病気を誘発するヘル パーＴ細胞クローンのエピトープを含むサブユニットは、候補ペプチドをネズミ の抗原誘導細胞（ＡＰＣ）と（または単離したＭＨＣ複合体と）完全な長さのタ ン白質で免疫したマウスからの牌臓或いはリンパ節Ｔ細胞と共にインキュベーシ ョンすることによって定量される。好適な候補であれば、この系のＴ細胞の増殖 を促進する。この第二の一層小さなサブセントは好適なペプチド成分を表わす。

王１」じシヒｍｌ又立 一つの態様では、本発明の複合体は、問題となっているペプチドに対する応答を 破壊するように設計される。この場合、分子のエフェクタ一部分は、例えば毒素 、化学療法剤、細胞毒Ｔ細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、または「硬」放 射線、例えばβ放射線を放出する放射性同位体となる。例えば、多数のタン白質 毒素が、リシン、ジフテリア、ゲロニン、シュドモナス毒素、およびアブリンを 包含する当該技術分野で公知である。化学療法剤には、例えばドキソルビシン、 ダウノルビシン、メトトレキセート、細胞毒素、およびアンチセンスＲＮＡが挙 げられる。抗生物質を用いることもできる。

細胞毒Ｔ１１１胞表面分子に対する抗体が単離されており、これらは毒素として 働くことができる。更に、イツトリウム−９０、リン−３２、鉛−２１２、ヨウ 素−１３１またはパラジウム−１０９のような放射性同位体を用いることができ る。放出された放射線は、標的Ｔ細胞の破壊を行う。

場合によっては、エフェクター成分の活性部分がリポソームまたはデキストラン キャリヤーのような伝達系に取り込まれるが、これらの場合には、活性成分また はキャリヤーが複合体中に結合されていてもよい。

エフェクター分子を標識と使用とする場合には、テクネチウム−９９またはイン ジウム−１１１のようなγ線放出放射性同位体を用いることができる。更に、例 えばフルオレセイン乙こよる螢光標識のような他の種類の標識を用いることもで きる。

エフェクター成分は第２図に示されるようにＭＨＣ糖タン白質に結合させること ができ、またはその性状が好適であればペプチド部分に結合することもできる。

例えば、ヨウ素−１３１または他の放射性同位体標識は、ペプチド決定基配列に 包含することもできる。

複金葬ｐ長或 錯体の要素は、当該技術分野に知られている標準的手段によって結合させること ができる。例えば、タン白質毒素をカルボジイミドを用いる標準的脱水反応によ ってまたはへテロ二官能性リンカ−によって抱合させることができる。抗原ペプ チドはＭＨＣタン白質のポケット部分と非共有結合的に結合させることができ、 またはそれらを共有結合的に結合させることもできる。

複合体を調製する順序はそれぞれの場合の成分によって変わる。例えば、特定の プロトコールでは、ペプチド部分とＭＨＣ部分を混合によって非共有結合的に結 合させ、次に所望ならば５ＰＤＰ　（ピアス・ケミカルス製）のような市販のリ ンカ−を用いて、エフェクターを共有結合的にＭＨＣに結合させる。或いは、エ フェクターとＭＨＣを最初に脱水反応を用いて抱合させ、この抱合体をペプチド 成分と複合体形成させる。

エフェクターそれ自身がクン白質である場合には、全複合体を組換え法を用いて 適当なコードＤＮＡから直接作成してもよい。例えば、ヒトおよびマウスにおけ るＭＧのエピトープとして特性決定されているＡＣｈｌ？ペプチド１９５〜２１ ５をＭＧと関連したＭＨＣ抗原から誘導されるポリペプチドのＮ末端基に結合さ せることができる。−文字アミノ酸コードにおけるＡＣｈＲペプチドのアミノ酸 配列は、ＤＴＰＹＬＤＩＴＹＨＦＩＭ口ＲＩＰＬＹＦＶである。このペプチドを コードするオリゴヌクレオチドは、アミノ酸に対する既知のコドン、好ましくは 発現に用いられる生物に好ましく用いられるコドンがオリゴヌクレオチドの設計 に用いられる。各種の生物および様々な種類の細胞に対する好ましいコドンの利 用が、当該技術分野において知られている。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉで発現する場 合には、ＡＣｈＲ１９５〜２１５をコードする好適なオリゴヌクレオチド配列は 次のようなものとすることができる： ５’　　ＧＡＣＡＣＣＣＣＧ　　ＴＡＣＣＴＧ　　ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣ ＡＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧ　　ＣＧＴ　　ＡＴＣＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＡ ＣＴＴＣＣＴＧ　　３’この配列を、次に、当該技術分野に知られている手法を 用いて、ＭＨＣ抗原から誘導されるペプチドをコードする配列に取り込むことが できる。分子を発現して折り畳むときには、ＡＣｈＲペプチド抗原が標的Ｔ細胞 のエピトープとして利用されるような部位となる。

一つのプロトコールでは、ＡＣｈＲ１９５〜２１５ペプチドは適当なＭＨＣ分子 のＮ末端基に結合する。組換え複合体をマウスで用いるときには、例えばＡＣｈ ＲペプチドをＩ−Ａｂ−αまたはＩ−Ａｂ−β鎖をコードする配列に取り込むこ とができる。

これらの鎖をコードする配列は既知であり、第８図（α鎖）および第９図（β鎖 ）に示され、これらの図にはこれらの鎖の制限酵素部位および重要なトメ・イン も示されている。ΔＣｈＲペプチドをβ鎖に取り込もうとするときには、例えば オリゴヌクレオチドをリーダーペプチドの代替物として挿入することができる。

ポリヌクレオチド内の配列を置換する方法は、当該技術分野に知られており、そ の例はプラスミドの構成についての部分に記載されている。

同様なプロトコールは、適当なヒ）ＨＬＡ抗原に由来するペプチドをコードする 配列中にＡＣｈＲペプチドを取り込むのに用いることができる。例えば、ヒトで はハブロタイブＤＲ２Ｄｗ２がＭＧと結合する。したがって、ＡＣｈＲペプチド をＤＲ２対立遺伝子のβ鎖をコードする配列に取り込むことができる。主要な血 清学的特異性ＤＰＩ−９のＤＲ小領域における構造上の基礎は、多くのＤＲハブ ロタイブからのＨＬＡ　−ＤＲ−β鎖をコードする配列と同様に既知である。例 えば、ベルら、（１９８７）　。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　８４．６２３４〜６２３８ を参照されたい。

上記のように、自己免疫抗原ペプチドとＭ　ＨＣ成分をペプチド結合を介して結 合させることができる。しかしながら、他の結合様式は当業者に明らかであり、 塘クン白質に対する炭水化物基、例えばαおよび／またはβ鎖の炭水化物残基を 介する結合が挙げられる。

複企体■鍾盪 本発明の複合体は、試験管内の系を用いてまたは生体内モデルを用いて分析する ことができる。試験管内の系では、複合体を、複合体のペプチドと結合した条件 に関与するタン白質または抗原で免疫した被験者からの抹消血Ｔ細胞と共にイン キュベーションする。良好な複合体は、追加の抗原で刺激しても、抗原特異性Ｔ 細胞のそれ以上の増殖を防止する。

生体内系では、単離したエピトープまたはＡＰＣの存在下にて完全な長さの抗原 に応答して増殖するＴ細胞がクローニングされる。このクローンを免疫されたこ とのない組織適合性を有する動物に注射して、自己免疫症を誘発させる。次に、 この病気に関連した症状を発現させる。関連した複合体の投与は、この病気の症 状を改善またはなくするものである。

エフェクター成分を有するまたは持たない複合体の種類のいずれでも用いること ができる。好ましい様式では、この治療は二倍である。それぞれを抗原の有効部 分を含むＭＨＣでコードした抗原提供糖タン白質の複合体で処理して、免疫系を ダウンレギュレートする。それ以上のダウンレギュレーションは、ＭＨＣでコー ドした抗原を提供する糖タン白質、処理される自己免疫症に特異的な抗原の有効 部分およびエフェクター成分を含む三成分複合体で処理することによって達成さ れる。更に、複合体のパネルを治療に用いることができる。

例えば、抗原の一個を上回るペプチドが自己免疫応答に関与するものと思われ、 および／または一個を上回る抗原が包含されると思われるときには、それぞれ適 当なＭＨＣでコードした抗原提供ポリペプチドを含むパネルと抗原の有効部分か ら選択される数種類の複合体で処理することができ、これらはエフェクター成分 を有することもまたは持たないこともできる。

標識した複合体の投与により、診断の用途における病気に関与する免疫系の部分 を同定することができる。

’ｔ＠ＩＦＩ、ｌ”Ｋ１−たは診断のためのＭＨＣム　の゛自己免疫症について の固体の診断または治療に用いられる本発明のＭＨＣ複合体を選択するため、自 己抗原の提供に関与するＭＨＣ抗原の種類を同定する。

特異的自己免疫機能不全は、特異的ＭＨＣのタイプと相関される。ヒトにおける ＤＱ／ＤＲハブロタイブのリストとそれらの自己免疫症との関連を第１０図に示 す。自己免疫症と関連する対立遺伝子と次にＭＭＣでコードしたポリペプチドを 同定する方法は当該技術分野に知られている。欧州特許第２８６４４７号明細書 に記載の方法が好適である。この方法では、数段階を行う。第一にＭＨＣ抗原と 自己免疫症との関連を、遺伝学的研究に基づいて決定する。これらの研究を行う 方法は当業者に知られており、ヒトにおける総ての既知のＨＬＡ症についての情 報は、コペンハーゲンのエイチェルエイ・アンド・ディシーズ・レジストリー（ ＨＬＡ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に保持されている。病気 と関連したポリペプチドをコードする配座は、病気と最も強く結合するものであ る（第１０図参照）。

第二に、ＭＭＣ抗原／ポリペプチドと関連した病気をコードする特異的対立遺伝 子を同定する。この対立遺伝子の同定では、感染性対立遺伝子が支配的であると 仮定する。対立遺伝子の同定は、特異的サブタイプと病気との強い正の関連を決 定することによって行う。これは、多くの方法で行うことができるが、それらの 総ては当業者に知られている。例えば、サブタイピングは、混合リンパ球応答（ ＭＬＲ）タイピングおよび感作リンパ球試験（ＰＬＴ）によって行うことができ る。これらの方法は両方とも、ペイルドブラックウェル監修、ハンドブック・オ ブ・イクスペリメンタル・イムノロジーに記載されている。検討されるＭＨＣ廃 剤に特異的なりＮＡプローブを用いてＤＮＡ制限フラグメント長さ多形（ＲＦＬ Ｐ）を分析することによって行うこともできる。例えば、ネボム（１９８６）　 。

Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋　４７５＋　　１゜ＭＨＣ配座に 対するプローブを調製する方法は、当業者に知られている。例えば、ブレジャー センら、（１９８６）、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　 ７９゜５９６６　；ワイスマンら、メディシン・イン・トランジ−ジョン：ザ・ センテニアル・オブ・ザ・ユニバージティー・オブ・イリノイ・カレッジ・オブ ・メディシン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ　Ｃｅ ｎｔｅｎｎｉａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ１ｌｉｎｏ ｉｓ　Ｃｏｌ］ｅｇｅｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（イー・ピー・コーエン監修、 １９８１）を参照されたい。

罹病性を付与するサブタイプの最も完全な同定は、配座のゲノムＤＮＡ、または 配座内でコードされるｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの配列化によって行われる。配 列されるＤＮＡは、ＭＨＣでコードされたポリペプチドの超可変部をコードする 部分を含む。プローブを用いて所望なりＮＡを特異的に同定し、所望な領域を増 幅する手法は、当該技術分野で知られており、例えばポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）の手法が挙げられる。

特異的自己免疫症に罹病性を付与する対立遺伝子が一旦同定されれば、対立遺伝 子内でコードされたポリペプチドも同定可能であり、すなわちポリペプチド配列 はそれをコードする対立遺伝子内のＤＮＡの配列から推定することができる。

診断および／または治療に用いられる本発明のＭＭＣ抗原複合体は自己免疫症の 状態と関連したＭＭＣ抗原および同じ病気の状態と関連した自己免疫抗原から誘 導される。

例えば、９０％を越えるリウマチ性関節炎の患者は０ｗ４または０ｗ１４のハブ ロタイブを有する（第１０図を参照）、、ヒトリウマチ性関節炎の標的抗原は、 タイプ■のコラーゲンであることも知られている。したがって、リウマチ性関節 炎の患者の治療または診断に用いられる本発明の複合体は、タイプ■コラーゲン の有効部分と複合した抗原提供の可能なりｗ４および／またはＤ−１４から誘導 されるポリペプチドを含むものが挙げられる。

自己免疫症の診断および、／または治療を行うための本発明の複合体の利用に好 適なプロトコールを第１１図に示す。簡単に説明すれば、自己免疫症を有する（ または罹りやすい個体を同定し、自己免疫機能不全を同定する。同定は、症状学 および／または家族の病歴の検討によって行うことができる。

個体のＭＨＣタイプは、例えばＭ　Ｌ　Ｒ１血清学的分析およびＤＮＡ分析（Ｒ ＦＬＰおよびＰＣＲ法を含む）による細胞タイピングを含む当該技術分野に知ら れている数種類の方法の１種類以上によって決定される。個体のＴ細胞を試験管 内で検討して自動反応性Ｔ細胞によって認識される（複数の）自己ペプチドを決 定するのであり、これは、それぞれ前記のような弐Ｘ−’ＭＨＣｉペプチド（式 中、ＸはＴ細胞を殺すことができる残基である）の本発明の標識した複合体を用 いて行われる。Ｔ細胞を標的とする複合体を決定した後、個体を、特異的自動反 応性Ｔ細胞複製を抑制することができる本発明の複合体および／または自動反応 性Ｔ細胞を殺すことができるもので処理し、これらはそれぞれタイプＭＢＣ−Ｌ ペプチドおよびＸｉＭＨＣｉペプチド（式中、ＸはＴ細胞を殺すことができる残 基である）の複合体である。（残りの自動反応性Ｔ細胞によって決定される）療 法を、前記の本発明の認識された複合体を用いてＴ細胞結合の研究で監視する。

本明細書に用いられる「個体」という用語はあらゆる哺乳類および基本的に同等 なＭＨＣ系を有するほとんど総てのを推動物を包含する。

生生吉成狂至％　５’　）Ｌｔ糸 下記のものは、これらの条件に就いての本発明の複合体の効果を評価するのに用 いることができる自己免疫症についてのモデル系である。

全　　エリテマトーデス（ＳＬＥ） 自己免疫ニューシーラントプラック（ＮＺＢ）マウスとフェノタイプの正常なニ ューシーラントブランク（ＮＺＷ）種のＦ、雑種は、親のＮ　Ｚ　Ｂ主に見られ るよりも激痛の重い全身性自己免疫病を発現する。これらのマウスは、核抗原と それに続くヒトにおけるＳＬＨに極めて類似した女性に多い致死免疫複合体によ って媒介される糸球体腎炎のような幾つかの免疫異常を表わす。ナイトら、Ｌｈ ｌＪ封、　（１９７８）、　１４７．１６５３゜病気のヒトおよびネズミの形態 では、ＭＨＣ遺伝子生成物との強い関連性が報告されている。ＨＬＡ　−ＤＲ２ およびＨＬＡ　−ＤＲ３の個体は、一般的な母集団より高い危険率でＳＬＥを発 現するが（ライナートセンら、Ｌ匡■ユ」閃、　（１９７８）、　２９９゜５１ ５）、ＮＺＢ／ＷＦ＋７　ウス（Ｈ−２”ｕ）　テハ、ＮＺＷ親かう誘導される ｈ−２’ハブロタイブに結合した遺伝子が、狼庶様腎炎の発現に関与する。

本発明の複合体の効果は、生存率およびタンパク尿および抗ＤＮＡ抗体の出現の ような症状の発現の進行状態によって測定することができる。

タンパク尿は、ウリスティックス（Ｕｒｉｓｔｉｘ、マイルス・ラボラトリーズ ・インコーボレーテド、エルクハート、インディアナ）を使用することによって 比色法によって測定して、下記のようなタンパク尿の近似値を得る：痕跡、１０ ■／’ｄｌ；１＋、３０ｍｇ／ｄｌ　；　２　＋、　１００ｍｇ／ｄｉ　；　３ 　＋、３００ｍｇ／ｄｌ　；および４＋１０００■／ｄｌ、高度のタンパク尿の 発現は、マウスを複合体で処理することによって著しく遅れる。

ＮＺＢ／ＷＦ、マウスにおける抗ＤＮＡ特異性抗体の存在は、ゾウアリとストー シー、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　（１９８６）、　９０．１０ ５に記載の酵素結合イムノソーベント法（ＥＬＩＳＡ）の改良法を用いることに よって決定する。

重症　無　症（ＭＧ 重症筋無力症は、ＨＬＡ−Ｄに結合した幾つかのヒト自己免疫症の一つである。

サーフエンヘルグら、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉ　ｅｎｓ。

（１９７Ｂ）、　１２．１３６；マソクデビットら、八ｒｔｈ　Ｒｈｅｕｍ、　 　（１９７７）＋皿、５９゜ＭＧでは、アセチルコリンレセプターに対する抗体 がシナプス後膜におけるＡｃＣｈｏＲの損失を媒介することによって神経筋の伝 達を損なう。

ＳＪＬ／　Ｊ雌性マウスは、ヒトＭＧのモデル系である。これらの動物において 、他の種からの可溶性ＡｃＣｈｏＲタン白質でこのマウスを免疫することによっ て、実験的自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）が誘発される。ＥＡＭＧに対する 罹病性は、部分的にはＭＨＣに関連しており、Ｈ−２のＩ領域に配置されている 。

クリスタドスら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　（１９７９）、　１２３．２５４０ ゜＾ｃＣｈｏＲタン白質は、Ｊ−幻１シ棟」胆月ｆｏｒｎ暉側がら精製され、ワ ルドーら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　　（１９８３ ）　８０．２７１３の方法によって分析され、この文献の内容は参考として本明 細書に包含される。乳化したＡｃＣｈｏＲ（完全フロインドアジュバント中１５ ハ）を、背中、後脚肉踊、尾の基部の６つの部位に皮膚内に注射する。動物を、 ４週間後に同じ養生法で再免疫する。

抗ＡｃＣｈｏＲ抗体を測定することによって評価することができる。抗ＡｃＣｈ ｏＲ抗体の水準を、ワルドーら、同上に記載のマイクロタイターＥＬＩＳＡ法に よって測定する。標準的試薬容量は、ウェル当たり５０Ｉ１１である。試薬は、 通常は室温で２時間ウェル中でインキュベーションする。重炭酸塩緩衝液、ｐＨ ９，６で希釈したＡｃＣｈｏＲ５ｇを、それぞれのウェルに加える。ＡｃＣｈｏ Ｒでインキュベーションした後、０．０５％ツイーンと０．０５％ＮａＮを含む リン酸緩衝食塩水から成る洗浄液でプレートを４回濯ぐ。マウス血清を、０．０ １Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７，２）　　、　１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　。

２、０　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．０５％ツイーン８０．０．０５ ％ＮａＮ：＋（Ｐ−ツイーン緩衝液）で希釈して、プレート上でインキュベーシ ョンする。プレートを洗浄した後、Ｐ−ツイーン緩衝液で希釈されたβ−ガラク トシダーゼ−抱合ヒツジ抗マウス抗体をそれぞれのウェルに加える。最終的に洗 浄した後、酵素基質ｐ−ニトロフェニル−ガラクトピラノシドをプレートに加え 、基質の触媒作用の程度を１時間後における４０５ｎｍでの吸光度から決定する 。

抗ＡｃＣｈｏＲ抗体は、非免疫マウスに比較して、ＡｃＣｈｏＲマウスで免疫し たものに含まれることが期待される。複合体での処理により、免疫化したマウス 中の抗ＡｃＣｈｏＲ抗体のタイターを著しく減少することが予測される。臨床的 ＥＡＭＧについて複合体で処理した効果を評価することもできる。筋無力症の症 状には、頭と首をうなだれた特徴的な猫背、背中の極端なアーチ形成、拡げた四 肢、異常歩行および姿勢回復の困難がある。

軽度の症状は、標準的ストレス試験の後に存在し、これは複合体の投与によって 改善される。

リウマチ　矢　＝′ＲＡ ヒトにおいては、リウマチ性関節炎への罹病率は、ＨＬＡ　Ｄ／ＤＲと関連して いる。原始タイプ■コラーゲンに対するマウスでの免疫応答を用いて、ヒトのＲ Ａに類イ以する多くの組織学的および病理学的特徴を有する関節炎に対する実験 的モデルを設定した。マウスでのコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）への罹病率を Ｈ−２Ｔ領域、特にＩ−Ａ小領域に配置した。ヒユーズら、Ｆｅｄ　Ｐｒｏｃ、 　　（１９８４）、　４３．　１８２０゜罹患し易い種、ＤＢＡ−１からのマウ スは、ウーレイとルースラ、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８５）、　１３４． ２３６６に記載の手法を用いて原始タイプ■コラーゲンでマウスを処理すること によってＣＩＡを生じさせ、前記文献の内容は、本明細書に参考として包含され る。

もう一つのモデルでは、ラットにおけるアジュバント関節炎がヒト関節炎の実験 的モデルおよび細菌性抗原によって引き起こされる自己免疫関節炎のプロトタイ プである。ホロシッツら、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ シーアールシー・プレス）（１９８６）　　；ピアソン、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　 Ｒｈｅｕｍ　（１９６４）、　　７．８０゜この病気は、アジュバンｌ−（ＭＴ ）に反応性であることがＴ細胞のクローンによる伝染性によって明らかなように 、細胞によって媒介される免疫応答の結果であり、同じくクローニングされた細 胞を用いる研究による病気の標的自己抗原は、軟骨のプロテオグリカン分子の（ 複数の）部分となると思われる。

ラットでのアジュバント病は、ピアソン、同上に記載の方法によって、数箇所の 部位、好ましくは皮肉にまたは脚または尾の基部にフロイントのアジュバント（ 殺した結核菌またはその化学的両分、鉱油、および乳化剤）を−回注射すること によって産生される。アジ二′バントは、他の抗原の不在で与えられる。

この病気の発現の複合体による治療の効果を観察する。この発現は組織病理学的 なものであり、滑液内層細胞の増殖を有する急性および亜急性滑膜炎、主として 関節および特定の組織の単核性浸潤、結合組織パンヌスによる骨および関節軟骨 の侵襲および特に犯された関節に隣接する骨膜の新たな骨の形成がある。重症ま たは慢性の場合には、繊維または骨の強直のような破壊的変化が起こる。これら の組織病理学的症状は、フロイントのアジュバントに感作してから約１２日後に コントロール動物で現れることが予想される。

インシュリン依　　　　　尿　（ＩＤＤＭ）ＩＤＤＭは、膵臓のランゲルハンス 島のインシュリン分泌細胞の選択的破壊の結果として観察される。この病気にお ける免疫系の関与は、単核細胞によるランゲルハンス島の早期浸潤の形態学的証 拠、抗ランゲルハンス島細胞抗体の検出、ＩＤ０Ｍ母集団における対立遺伝子） ＩＬＡ　−ＤＲ３および−ＤＲ４の高頻度およびＩＤＤＭと各種の自己免疫病と の間の臨床的関連によって示唆される。自発性ＩＤＤＭと甲状腺炎の動物モデル はＢＢクラット発現した。ヒトと同様に、ラットの病気はＭＭＣ抗原をコードす る遺伝子によって部分的にコントロールし、島の浸潤を特徴とし、抗島抗体の存 在と関連する。Ｉ−Ｅと等価のクラスＩＩＭＭＣ抗原は、ＢＢクラットおける自 己免疫病の発現に関与するものと思われる。ビオタートら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）、　　（１９８５）、　８２．６６２７゜形態学 的評価では、インシュリン炎は、島内に単核炎症細胞が存在することを特徴とす る。甲状腺炎は、最低基準として甲状腺内における病巣の間質リンパ球浸潤液を 特徴とする。

最も重症の場合は、散在性の多量なリンパ球浸潤液、小胞の破壊、線維症、およ び病巣のヒュルトレ細胞の変化を示す。

ビオタートら、同上を参照されたい。

ＢＢクラット本発明の複合体での治療は、ＩＤＤＭおよび甲状腺炎に関連した臨 床的および形態学的症状の発現を改善しまたは防止することが期待される。

もう一つのモデルでは、ＮＯＤマウス種（Ｈ〜２に’Ｄｂ）は、自己免疫ＩＤＤ Ｍのネズミでのモデルである。これらの動物における病気は、抗島細胞抗体、重 症インシュリン炎、β細胞の自己免疫破壊の証拠を特徴とする。カナザヮら、Ｄ ｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ。

（１９８４Ｌ　２７．１１３゜この病気は、リンパ球によって受動的に転位し、 サイクロスポリン−Ａで処理することによって防止することができる（イケハラ ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＩＪＳＡ。

（１９８５）　、浜、７７４３；モリら、以１徂％お工蹟（１９８６）　、社、 ２４４゜未処理の動物は、深いグルコース不耐性およびケトン症を発現し、およ び病気の徴候から数週間以内に死亡する。雌性動物の７０〜９０％および雄性動 物の２０〜３０％が、誕生から６か月以内に糖尿病を発現する。飼育の研究は、 罹病率に関する少なくとも２個の遺伝的配座を定義し、その内の一つはＭＨＣに 配置されている。血清学的および分子の水準でのＮＯＤクラス■抗原の特徴決定 は、自己免疫病の罹病率はＩ−Ａに関連することを示している。アチャーオーベ アおよびマンクデビット、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　 　（１９８７）、　８４．２３５゜＃ＮＯＤマウスを複合体で処理すると、糖尿 病の徴候を示す以前の時間が長くなりおよび／またはこの病気を改善または防止 することが期待される。

・アレルギー　−界（ＥＡＥ） 実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）は、多くの点で多発性硬化症（ＭＳ）の ヒトの病気に類似している中枢神経系の誘発された自己免疫症である。この病気 は、マウスおよびラットのような多くの種で誘発させることができる。

この病気は麻痺が急に起こることを特徴とする。ＣＮＳにおける単核細胞による 脈管周囲の浸潤が、マウスとラットのいずれにも観察される。この病気を誘発す る方法と症状学は、アランリン（１９８５）　Ｔｈｅ　Ａｕｔｏｉｎｍｕｎｅ　 Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（ローゼおよびマツカイ監修、アカデミツクプレス・インコ ーボレーテド）３９９〜４２７頁およびアチャーオーベアら、（１９８９）、　 Ａｎｒ＋　Ｒｅｖユ憇、７，３７７〜４０５゜ 遺伝子が媒介する罹病性の一つは、ＭＨＣクラスＵ　ｉＪ域に配置されている（ ムーアら（１９８０）　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４．１８１５〜１８２０） 。最も良好に解析された脳を髄炎発症タン白質はミニリン塩基性タン白質（ＭＢ Ｐ）であるが、他の脳を髄炎発症抗原が脳に見出されている。免疫原性エピトー プが配置されている（アチャーオーベアら、同上）。ＰＬマウス種（Ｈ−２’） では、ＭＢＰ中における２個の脳を髄炎発症ペプチドである、ＭＢＰペプチドｐ ３５〜４７　（ＭＢＰ３５〜４７）およびアセチル化ＭＢＰｐ　ｌ〜９　（ＭＢ Ｐ　ｉ〜９）が特性決定された。

ＥＡＥが誘発された個体における病状の改善に対する本発明の複合体の効果は、 生存率、および症状の発現の新工場鏡によって測定することができる。

欠功」■αＳ支昼 本発明の複合体は、ＭＨＣの経皮領域を含む場合には、リポソームまたはミセル ノ形態で投与するのが好都合である。

しかしながら、この領域が欠失されるときには、この複合体をペプチド含有薬物 に好都合に用いられる方法で投与することができる。投与は全身性であり、注射 、好ましくは静脈内注射によって行い、したがって注射の投与経路と適合する処 方を用いることができる。好適な配合物は、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍ ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、マック・パブリッシング・カンパニー、 フィラデルフィア、ペンシルバニア、最新版に見られる。ネズミ被験動物には１ ０〜５００Ｉ！ｇの投与水準が有効であり、約Ｏ０５■／ｋｇ〜２５■／ｋｇが 示唆される。

下記の実施例によって本発明を例示するが、本発明を制限するものではない。

実１達１− 影り謔−（」皿回２、−１肛１ヨ川ヒベ１ム１豆制引１ウシミニリン塩基性タン 白質（ＢＭＢＰ）のアミノ酸１〜１３を表わすヨード化された合成ペプチドを、 ＦＭＯＣで保護したアミノ酸の標準的固形和合成を用いて合成する。生成するペ プチドは配列＾ｃ−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＡｒＨ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−（１−１３１）Ｔｙｒ−Ｎ ）ｌｚを有する。ＭＨＣｎをトウルケビッツら、同上の方法により、ＰＬ／Ｊ種 の肺臓細胞から精製する。この文献の内容は、参考として本明細書に包含される 。唐花中または脂質二重層（同上）として精製されたＭＨＣｎを合成ぺプチドと 共にインキュベーションして、高分子量画分への放射能標識の吸収が最適にする 。次に、過剰の放射能標識したペプチドを透析またはゲル濾過によって除去した 後、生成する複合体を脂質の存在にて透析してミセルを形成する。

１施■又 毒、としてのＭＨＣＩＩ　−ＢＭＢＰのＢＭＢＰのＮ末端の１３アミノ酸に特異 的なりローニングされたＴヘルパー細胞を、スタイマンの方法によってＢＭＢＰ で免疫したＰＬ／Ｊ種のマウスから得る。単離したクローニングしたＴヘルパー 細胞を、実施例１で調製した複合体と共に１０６細胞数／ｄおよび複合体が０． １〜１．０■／ｄの濃度で３７°Ｃで４〜１６時間インキュベーションする。

細胞を洗浄して、次いでＴリンパ球の細胞生存率を洗浄した細胞について測定す る。培養物をコンカナバリンＡと共にインキュベーションして、Ｔヘルパー細胞 生存率と増殖の指標としてトリチウム化したチミジンの吸収を測定する。

放射能標識した複合体を用いて、ＢＭＢＰおよび自己抗原提供細胞の存在下にて 処理した後の細胞の生存率は、無標識複合体を用いてインキュベーションしたま たはＢＭＢＰなＬ７でトリチウム化したチミジンの存在下にてインキュベーショ ンした細胞の生存率は５０％未満である。

１施輿主 マウスＩ−Ａ”およびラッｌ−ＭＢＰペプチドの　八　を　いる試　　内でのＴ ｌ胞のダウンレギュＬ／−ジョンヒト多発性硬化症に類似する病気モデルである マウスにおける実験的アレルギー性膜を髄炎を誘発することが知られているミニ リン塩基性タン白賞（ＭＢＰ）のエピトープに対するＴ細胞クローンにおける非 感作性の誘発におけるクラスＩＩＭＨＣ−ペプチド複合体の効率を下記に示す。

ラッ）ＭＢＰペプチド（１〜１１）に対するマウスの免疫化によって調製されお よび抗原の特異性を特徴付けるＴ細胞クローンＡＪ１．２および４Ｒ３，４が、 スタンフォード大学のバット・ジョーンズ博士から得られた。

ラットＭＢＰペプチドを有するＩ−Ａ”複合体を、生成したマウスＩ−Ａ″およ び配列が知られており、Ａｃ−八５ＱＫＲＰＳＱＲＨＧＳＫ である合成ラットＭＢＰペプチド（１〜１３）を用いて形成した（ザムビルら、 （１９８６）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２４．２５８〜２６０）。

マウスＩ−Ａｋを、トウルケビッツら（１９８３）　、同上に基づいた改良法に よって精製した。基本的に、Ｉ−Ａｋを含む再現性の可溶性膜抽出液をＮＰ−４ ０を用いて調製した。タン白質−Ａ上での親和性クロマトグラフィによって精製 し、抽出液からのＩ−ＡｋをＣＮＢｒで活性化したセファロース４ｂにカップリ ングさせた１０〜２．１６個の抗体を含むカラムを用いて親和性クロマトグラフ ィによって精製した。ＮＰ　−４０可溶性膜抽出液、１０〜２．１６　Ｍａｂの 精製およびそのＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂへのカップリングおよび Ｉ−Ａ’の精製についての調製図をそれぞれ、第１２図、第１３ａ図および第１ ４図に示す。第１３ｂ図は、精製した１０〜２．１６抗体の純度を示すポリアク リルアミドゲルのコピーである。ポリアクリルアミドゲル分析によって観察した Ｉ−Ａ’の純度を、第１５図に示す。

Ｉ−Ａ’とラットのＭＢＰペプチドの複合体を形成させるために、３０ｍＭオク チルグルコシドと５０倍モル過剰量のＨＰＬＣで精製したＭＢＰペプチドを含む ＰＢＳ中の親和性精製したＩ−Ａ）′１０ｘを、総容量１２５Ｉ中で混合した。

サンプルを一定の振盪を行いながら３７°Ｃで１６時間インキュベーションし、 リポソーム分離のためにまたは細胞研究のためにＧ−２４セフアデツクス脱塩に よりペプチドから分離し、ＰＢＳに対して透析した後、ＲＰＭＩ媒質で３６時間 ４°Ｃで透析した。

Ｔ−Ａｋ−ＭＢＰペプチド複合体のリポソームへの導入は次のようにして行った 。２５ニア５：２のモル比のコレステロールニジバルミトイルホスファチジルコ リン（ＤＰＰＣ）　ニジバルミトイルホスファチジルエタノールアミン−フルオ レセイン（ＤＰＰＥＦ）から成る脂質溶液を、３０ｍＭオクチルグルコシド（Ｏ Ｇ）を含むクロロホルム中で調製した。脂質を真空で乾燥し、予め形成させた１ ７ｍＭのＯＧを含むＰＢＳ中のＩ−Ａ’−ペプチド複合体を５　：　１　（ｗ／ ｗ）の比率で乾燥した脂質と混合した。混合物を２〜３分間振盪し、４°Ｃに冷 却し、最終的にＰＢＳに対して透析した後４°Ｃで３６時間ＰＲ旧媒質によって 透析した。

（１２５−１＞で標識したＩ−Ａｋを用いる実験では、フルオレセイン化した脂 質が脂質混合物中に含まれ、リポソーム中へのＩ−Ａ″の取り込みをシンチレー ション法によって測定した。

平坦な脂質膜を、親和性精製したＩ−Ａｋのみを含むまたはワッツら（１９８５ ）、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　８２．５４８０〜５ ４８４の方法によって精製したＩ−Ａ″＋ＭＢＰ（１〜１３）リポソーム５０〜 １００Ｉを用いて無菌の１２１］ＩＩＩＩのガラスカバースリップ上に調製した 。平坦な膜中のＴ−Ａｋの存在を、フルオレセイン抗−Ｉ−Ａ”抗体で染色した 後、螢光顕微鏡によって確かめた。螢光性の抗−Ｉ−Ａ’で染色したとき、背景 には螢光は認められなかった。

ＭＢＰペプチド刺激の６〜８日後に得られたＡＪｌ、２および４１’１３．４細 胞を２回洗浄し、４Ｘ１０’細胞を平坦な膜に加えた。

プレートを５％ＣＯ□中で３７°Ｃで４８〜７２時間インキュベーションした後 、コロニーの形成について目視で検査した。

洗剤で可溶化したクラス■分子の効果を、精製したＩ−Ａｋのみの５０〜１００ ｄ、精製したＩ　−Ａ’　＋ＭＢＰ（１〜１３）、および媒質のみでＩ　ＸＩＯ ’　ＡＪｌ、　２または４Ｒ３，４細胞を５％ＣＯ□中で３７°Ｃで５時間イン キュベーションした。このインキュベーションの後、細胞を９０ｔｔｌに希釈し 、抗原提供細胞（ＡＰＣ）および抗原（ＭＢＰ（１〜１３）〕に応答する能力を 増殖分析法で試験した。細胞の増殖の指標として、３−（４，５〜ジメチル−チ アゾール−２，７１−２，５ジフエニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）の吸 収を用いた。３Ｈ−チミジン吸収によって通常観察されるＤ　Ｎ　Ａ合成と、Ｍ ＴＴの吸収によって測定されたミトコンドリアの活性は、異なる細胞機能である が、牌Ｗ＆細胞の培養液の刺激の開始から３日後に観察したこれらの２種類の活 性は、互いに極めて良好に探知した（モレキュラー・デバイス・アプリケーショ ン・ブレチン・ナンハ一一０１１−Ａ１９８８年２月９日）。

データーは、媒質のみで培養された細胞に比較してクラス１１＋Ａｇと共にイン キュベーションされた細胞の増殖の抑制率として表わされ、下記式： ％式％（ 光度）１．。〔Ｔ細胞す十肺臓細胞〕 （吸光度）、７゜〔Ｔ細胞Ｃ十肺臓細胞＋ＭＢＰ（１〜１１）　）　−（吸光度 ）５．。［Ｔ細胞Ｃ十肺臓細胞〕 ［式中、Ｔ細胞ａ　＝　Ｉ　−ＡＩ′−ＭＢＰ（１〜１３）複合体で予備インキ ュベーションしたＴＩＩＩ胞、 Ｔ細胞ｂ＝Ｉ−Ａ、’のみで予備インキュベーションしたＴ細胞、 Ｔ細胞Ｃ−媒質で予備インキュベーションしたＴ細胞〕を用いることによって計 算された。

クラスｎＭＨｃのみの存在下にて培養した増殖は一般には大半の研究で媒質のみ を用いて培養した細胞に等しかったので、この後者の数を用いて抑制率を得た。

３個のウェルの標準偏差は大半の実験では＜１０％であった。

最初に２種類の定性的研究を行い、１−Ａｋ十ＭＢＰ（１〜１３）での予備処理 がＩ−Ａ″＋ＭＢＰ（１〜１３）を含むリポソームから調製した平坦膜に対する Ｔ細胞クローンの結合を変化させるかどうかを決定した。ＭＢＰ（１〜１３）の みの存在下にて、すなわち抗原提供細胞（ＡＰＣ）なしで平坦膜上に特徴的なコ ロニーを形成したので、ＡＪｌ、２細胞をこれらの研究について用いた。Ｉ−Ａ ｋ＋ＭＢＰ（１〜１３）を用いてへＪ１．２細胞を５時間予備インキュベーショ ンしたところ、Ｉ−Ａ’または媒質のみでインキュベーションした細胞に比較し て平坦な膜に形成されるコロニーの数が抑制された。第二の実験では、ＡＪｌ、 ２細胞がＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１〜１３）またはＩ−Ａ’のみを含むリポソームで ５時間インキュベーションした後、前記の方法で調製した平坦な膜に加えた。洗 剤で可溶化したＴ　−ＡｋＭＢＰ（１〜１３）で予め記載したように、Ｉ−Ａ″ 十門ＢＰ（１〜１３）を含むリポソームで細胞を培養したところ、Ｉ−Ａｋのみ を含むリポソームでインキュベーションした細胞比較してコロニーの数は減少し た。コロニーは精確に計数することができなかったがそれらの数における明らか な差異は明白であった。

これらの研究はＴ細胞クローンの機能に対するＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ　（１〜１３） の効果を定量することはできなかったので、ＡＰＣおよびＭＢＰ（１〜１３）の 存在での４Ｒ３，４またはＡＪｌ、２細胞の増殖についてのこの錯体での予備イ ンキュベーションの効果を検討した。それ故、４Ｒ３，４またはＡＪｌ、２細胞 は、Ｉ−Ａｋ十ＭＢＰ（１〜１３）　　、　Ｉ−Ａ″または媒質のみを５０〜１ ００ｍを用いて３７°Ｃで５時間予備インキュベーションした。次に、これらの 細胞を適当な濃度に希釈し、Ａ、　Ｐ　Ｃに加えた。抗原［１１８Ｐ（１〜１３ ）］を加えて、最終濃度を１３．３ｎ〜５３．２ｎの範囲とした。

研究に用いたＡＰＣを雌性Ａ／Ｊマウスの肺臓から調製した。簡単に言えば、肺 臓を取出し、単細胞懸濁液を無菌の顕微鏡スライドの艶消しをした末端部の間で 緩やかに裁断した。

残りの細胞を、抗生物質を含むＰＲＭＩで２回洗浄し、３７℃で１時間１０ｎ／ ｍｌｌのマイトマイシン−Ｃでインキュベーションした。このインキュベーショ ンの後、肺臓細胞を抗生物質を含むＲＰＭＩで５回洗浄して、計数して、ＡＰＣ として用いた。

ＡＰＣとＭＢＰ（１〜１３）で細胞を７２時間インキュベーションした後、増殖 の程度をＭＴＴ吸収を用いて定量した。８回のこれらの研究の結果を、第１６図 に示す。研究１，３および４では、４Ｒ３，４細胞を前記の様にインキュベーシ ョンした。研究２では、４Ｒ３，４細胞をＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１〜１３）または ■〜Ａｋのみを含むリポソームで予備インキュベーションした。次に、Ｔ細胞を １０％フィコール溶液中から遠心分離によって未決間のリポソームから分離し、 増殖分析に用いた。研究５〜８は、クローンＡＪ１．２を用いて行った。Ｉ−Ａ ｋのみを用いてインキュベーションした細胞は、媒質中で培養した細胞と同程度 に増殖した。この方法で予備インキュベーションしたＴ細胞クローンは、ＡＰＣ の不在では増殖できなかった。

前記のデーターはクラスＭＭＣ＋ＭＢＰ（１〜１３）の錯体が？ＩＢＰ（１〜１ １）に特異的なＴ細胞クローンにおける劇的な非感作性を誘発させる。更に、こ のデーターはこの複合体が免疫学的に反応性であり、したがってＭＢＰで刺激さ れたＴ細胞クローンに結合したことを示している。

尖施炭↓ マウスにお番るＥＡＥのチ Ｔ細胞クローンＡＪ１．２および４Ｒ３，４の養子移入並びにＭＢＰ（１〜１３ ）によるマウスの免疫は、マウスにＥＡＥを発現させる。

ペプチドを有するＥＡＥを、完全なＭＢＰでマウスにＥＡＥを誘発させる方法を 用いて誘発させた。簡単に言えば、ＭＢＰ（１〜１３）をＰＢＳに溶解し、完全 なフロイントのアジュバントと激しく混合して、濃厚なエマルジョンを形成させ た。

雌性Ａ／、Ｊマウスにこの混合物の１００ｎを横腹の４か所に注射した。２４時 間および７２時間後に、百日咳毒素４００ｎｇを静脈内に注射した。２匹の個体 マウスを毎日ＥＡＥの発現および死亡率を観察した。第１７図の結果をＭＢＰ（ １〜１３）で免疫したマウスにおけるＥＡＥの発現を示す。

ＥＡＥの養子移入のために、ＭＢＰ（１〜１３）で免疫したＢＩＯＡ（４Ｒ）種 のマウスから得られるＴ細胞クローン４Ｒ３，４を用いた。

ＢＩＯＡ　（４Ｒ）マウスに３５０ランドの全身放射線を照射した後、４００ｎ ｇの百日咳毒素を静脈内に注射した。２〜３時間後に、３日前に肝Ｐ（１〜１３ ）で刺激した１０　Ｘ　１０”の４Ｒ３，４細胞を静脈内に注射した。これらの 動物を、ＥＡＥの徴候と死亡率について毎日２回観察した。この研究の結果を、 第１８図に纏める。

亥１１汁ｉ Ｔ−Ａｋ−ＭＢＰ（１〜１３　　　人　によるＥＡＥのダウンレギュレーション ＥＡＥの経路を逆にするＴ−Ａ”−ＭＢＰ（１〜１３）の能力を、下記の方法で 検討した。ＥＡＥを、完全フロイントのアジュバンＩ・と混合したＭＢＰ（１〜 １３）の１００■で、Ａ／Ｊ雌性マウスに誘発し、破傷風類毒素２００〜４００ ｎｇまたは３５０ラツドを照射して破傷風類毒素で処理したＢＩＯＡ　（４Ｒ） の雌マウスに１〜１０Ｘ１０６４Ｒ３，４Ｔ細胞の養子移入を行った。免疫して から２または３日後またはＥＡＥの症状が明らかになってがら、動物に複合体を 注射した。投与の量と経路は、予備研究によって決定し、明らかに無毒である濃 度のものを用いる。追加のコントロールとして、複合体のみおよび関連抗原を含 む複合体で処理したマウスを処理する。動物を二人の独立な観察者によって一日 二回観察した。マウスの全群中のＥＡＥの重篤度を、前記に記載した尺度で等級 に分ける：　０＝ＥＡＥの徴候なし；１＝わずかな尾の緊張のみ；２＝不全対麻 痺；３＝中程度の重さの不全対麻痺；４＝完全対麻痺；および５＝瀕死状態。

災施炭旦 １　を　する　　かＢ　　のＥＢＶ多　−自己免疫機能不全を有する個体から抹 消血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、全血または軟膜１：１を無菌のリン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ）ｐＨ７，２で希釈し、フィコール−ハイバク上で懸濁液を重層し、 卓上遠心分離で１８００〜２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。フィコール −ハイバクとＰＢＳ−血漿の界面におけるバンドに含まれるＰＢＭＮＣをピペッ トで採取し、ＰＢＳで２回洗浄する。

細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭ１１６４０中に５Ｘ１０６ 細胞／戚で差異懸濁し、ポリスチレンフラスコで培養し、３７°Ｃで１時間イン キュベーションして単球を除去する。非粘着性細胞を回収し、遠心分離によって 造粒し、１５％ＦＢＳを含むＣａ”−Ｍｇ”不合ダルベツコＰＢＳ中に、ｌ０Ｘ ＩＯ’細胞／成で再懸濁する。　ＡＥＴ−３ＲＢＣ（２％ｖ　／　ｖ　）をＰＢ ＭＣと１：１に混合して、混合物を１１００Ｘで２０分間遠心分離した後、氷上 で１時間インキュベーションする。ベレットを穏やかに再懸濁して、懸濁液を前 記の方法でフィコール−ハイバクによって遠心分離する。Ｂ細胞と残りの単球を 含むバンドを回収する。

Ｂ細胞の形質転換は、Ｂ９５−８細胞ラインを用いて行う（ウォールスとクララ ホールド、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ ｃｈ　（ジ−ジービー・クラウス監修、アイアールエル・プレス）。Ｂ９５−８ 細胞を媒質で１＝３に希釈して、３７°Ｃで５日間培養する。上澄液を採取して 、２５０Ｘｇで１５分間遠心分離し、０．４５ミクロンのミリポアフィルタ−で 濾過する。次にＥＢＶを１０．０００ｒｐ１１．４℃で２時間遠心分離によって 濃縮し、ウィルスを含むベレットをｌＯ％ＦＢＳを含むＲＰＭ１１６４０に基の 容積の１％で懸濁する。

Ｂ細胞を形質転換するため、ウィルスの母液を２Ｘ１０６細胞を含む培養液で１ ：９に希釈する。ウィルスを４℃で１〜２時間細胞に吸着させた後、細胞を２５ ０Ｘｇで遠心分離する。

精製する細胞ベレットを、ｌ０ＦＢＳを含むＲＰＭ１１６４０に約０．７×１０ ６〜７．０Ｘ１０’細胞／ｄで懸濁させる。形質転換した細胞を、標準的法を用 いてクローニングする。

この方法で作成した形質転換したＢ細胞は、ヒ）ＭＨＣ糖タン白質の単離に好適 である。

ｒ！ＧＯＲＥ　　ｌ ｒ工Ｇυ東＝２ 第１世代の構成 第２世代の構成 ｒ工ＧＵＲＥ　　５ Ｆ工ＧＵＲＥ　　６ ５ｅｔ １−Ａ’−α １−Ａｂ−β Ｆ’ＩＧＵＰ二　９ 白人Ｄｏ／ＤＲハブｂタイカ ）　　′ＩＬ：：ｉ：Ｉ：　　　　　ｌ：Ｉ　　　　　：：　　　　　；　　　 　　二　　　　：　　　　　：′、、３　　　　″′四゛１h“１で″す ：：”５　　（：：Ｈ：Ｈ；　　；：’、　　：；；富２４：５，２．：　：　 　；；ｒ　Ｉに１．ＩＰ、Ｅ　　！　０ ＮＰ−４０可溶性膜抽出物の開裂 上ＴｌＶ液 （合計タンパク質＝１８〜２３ｎ＠） １−ＡＫの平面ポリアクリルアミドゲルの分析Ｆ工ＧｔＪＲＥ　　１ｓ ＩＡＫ　＋　ＩＩＢＰ　（１−１３）による増殖の阻害％　抑制率 ）”ＩＧＬ！Ｐ、Ｅ　１６ インビボでのＥＡＥ Ｆ工ＧＵＲＥ　１フ インビボでのＥＡＥ Ｆ工ＧＴＪＰ、Ｘ　１８ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年１２月２５日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２７８４ ２　発明の名称 自己免疫の改善に有用なＭＭＣによって媒介される毒性抱合体 ３　特許出願人 名　称　バイオスパン　コーボレイション４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号静光虎ノ門ビル〒１０５電話（５０ ４）０７２１ ５　補正書の提出年月日 １９９０年７月２４日 浄書（内容に変更なし） 補正された請求の範囲 １、弐 Ｘ−ＬＭ　）Ｉ　Ｃ−！−ペプチド（１）またはＭｌ（Ｃ−Ｌ　ヘプチドエｘ（ ２） （式中、Ｘは毒素および標識基から選択される官能基であり、 ＭＨＣは抗原結合ポケットを含んで成る主要組織適合性複合体由来の成分を表わ し、前記ＭＨＣ成分は細胞表面とは関係せず、 ペプチドはエピト−プ含有自己抗原性ペプチドであり、土は共有結合によって式 （１）においてＸとＭＨＣまたは式（２）においてＸとペプチドに結合した共有 結合または２価のリンカ−であり、 又は共有結合、非共存結合的関連またはＭＨＣおよびペプチドと共有結合的に結 合したまたは関連したリンカ−である）を有する複合体。

２　ペプチドが、　　゛ 重症筋無力症（ＭＧ）、 多発性硬化症（ＭＳ）、 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、 リウマチ性関節炎（ＲＡ）　、および インシュリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）がら成る群から選択される自己免疫 病に関連した抗原のエピトープを含む８〜１５アミノ酸の配列である、請求の範 囲第１項に記載の組成３、ＭＨＣ成分がＭＨＣ−ＩＩのＮ末端のα１．α２およ びβ１およびβを領域である、請求の範囲第１項に記載の組成物。

４、ＭＭＣ成分がＭＨＣクラス■分子である請求の範囲第１項に記載の組成物。

５、　を推動物の自己免疫病を治療する方法であって、この治療を必要とするを 推動物に請求の範囲第１項に記載の複合体または請求の範囲第１項に記載の複合 体が活性成分であってＸが免疫応答毒素である、薬学組成物を投与することを特 徴とする方法。

６、　を推動物の自己免疫病の監視法であって、この治療を必要とするを推動物 に請求の範囲第１項に記載の複合体または請求の範囲第１項に記載の複合体が活 性成分であってＸが毒素である、薬学組成物を投与することを特徴とする方法。

７、　自己免疫病を治療するのに有用な薬学組成物であって、請求の範囲第１項 に記載の複合体を活性成分として、製薬上許容可能な賦形剤と混合して含む、薬 学組成物。

８、　リポソームを含んで成る請求の範囲第７項に記載の薬学組成物。

９、式 ％式％ （ＭＨＣは抗原結合ボケ７）を含んで成る主要組織適合性複合体由来の成分を表 わし、前記ＭＨＣ成分は細胞表面とは関係せず； ペプチドはエピト−プ含有自己抗原性ペプチドであり；そして 童は共有結合、非共有結合的関連またはＭＨＣおよびペプチドと共有結合的に結 合したまたは関連したリンカ−である）の組成物を調製するための方法であって 、ＭＭＣ成分を製造することができる細胞からＭＨＣ成分を単離し； 前記ＭＢＣ成分を前記ペプチドと共にインキュベートし；そして透析により過剰 のペプチドを除くことを含んで成る方法。

１０、ＭＨＣペプチドを脂質の存在にて透析し、ミセルまたはリポソームを形成 させることも含む、請求の範囲第９項に記載の方法。

１１゜請求の範囲第９項に記載の方法によって調製される式？Ｉ）ｌｃｊ−ペプ チドを有する組成物。

１２、　Ｍ求の範囲第１０項に記載の方法によ、って調製される弐Ｍｌ（Ｃ”ペ プチドを存する組成物。

Ｘ３．被験動物を請求の範囲第１１項に記載の組成物で処理することも含む、請 求の範囲第５項に記載の方法。

１４、被験動物を薬学組成物であって請求の範囲第１１項に記載の複合体が活性 成分であるもので処理することも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。

１５、被験動物を請求の範囲第１２項に記載の組成物で処理することも含む、請 求の範囲第５項に記載の方法。

１６、被験動物を薬学組成物であって請求の範囲第１２項に記載の複合体が活性 成分であるもので処理することも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。

１７１式 ％式％ （ＭＨｃｉよ抗原結合ポケットを含み、そしてカルボキシ末端疎水性ドメインを 欠く主要組織適合性複合体由来の成分を表わし； ペプチドはエピトープ含有自己抗原性ペプチドであり；そして 又は共有結合、非共有結合的関連またはＭＭＣ成分およびペプチドと共有結合的 に結合したまたは関連したリンカ−である）を有する組成物。

１８、前記ＭＨＣ成分のカルボキシ末端疎水性ドメインが少なくとも１つのシス ティン又はリシン残基により置換されている請求の範囲第１７項記載の組成物。

１９、前記ＭＨＣ成分がα’ＭＦＩＣ−１１ドメイン及びβ’　ＭＨＣ−■ドメ インを含んで成り、ここで前記β’Ｍｏｃ−ｎドメインがβ２ＭＨＣ−Ｉドメイ ンに関連するα”ＭＨＣ−１ドメインに融合される請求の範囲第１８項記載の組 成物。

２０、前記ＭＨＣ成分がα’ＭＨＣ−ｎドメイン及びβＩ肚ｃ−ｎドメインを含 んで成る請求の範囲第１９項記載の組成物ゆ２１、自己免疫病を治療するのに有 用な薬学組成物であって、請求の範囲第２０項に記載の複合体を活性成分として 、製薬上許容可能な賦形剤と混合して含む、薬学組成物。

２２、式 ＸｌＭＨＣ−Ｌ　ペプチド（１）またはＭ）ＩＣ−！−ヘブチト土ｘ（２） （式中、Ｘは毒素および標識基から選択される官能成分であり、 ＭＨＣは抗原結合ポケットを含む主要組織適合性複合体由来の成分を表わし、前 記ＭＨＣ成分は細胞表面とは関係せず；ペプチドはエピトープ含有自己抗原ペプ チドであり；上は共有結合によって式（１）においてＸとＭＨＣ成分または式（ ２）においてＸとペプチドに結合した共有結合または２価のリンカ−であり；そ して 又は共有結合、非共有結合的関連またはＭＨＣ成分およびペプチドと共有結合的 に結合したまたは関連したリンカ−である）を有する複合体を調製するための方 法であって；前記成分を生成することができる細胞からＭＨＣ成分を単離し； 前記ＭＨＣ成分を前記ペプチドと共にインキュベートし；透析により過剰のペプ チドを除去し；そして式（１）におけるＭＨＣ成分又は式（２）におけるペプチ ドにＸを共有結合せしめることを含んで成る方法。

２３、ＭＭＣ成分がペプチドと共にインキュベートされる前、Ｘが式（１）にお けるＭＭＣ成分又は式（２）におけるペプチドに共有結合される請求の範囲第２ ２項記載の方法。

２４、Ｘが式（１）におけるＭＨＣ成分又は式（２）におけるペプチドに２価の リンカ−を通して共有結合される請求の範囲第２２項記載の方法。

２５、前記７抗原績合ポケットが２つの別々のポリペプチド鎖を含んで成る請求 の範囲第９項記載の方法。

２６、前記ＭＨＣ成分が主要組織適合性複合体のクラス■糖タンパク質である請 求の範囲第９項記載の方法。

２７、前記ペプチドがウシミニリン塩基性タンパク質（ＢＭＢＰ）に由来する請 求の範囲第９項記載の方法。

２８、前記ペプチドがＢＭＢＰのアミノ酸１〜１３を含んで成る請求の範囲第２ ７項記載の方法。

２９、前記成分を生成できる細胞が細菌、酵母又は哺乳類細胞である請求の範囲 第９項記載の方法。

３０、前記哺乳類細胞がマウス細胞である請求の範囲第２９項記載の方法。

３１、前記マウス細胞が肺臓から単離される請求の範囲第３０項記載の方法。

手続補正書（方式） 平成３年　９月之ム日 特許庁長官　深　沢　　　亘　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２７８４ 平成１年特許願第５０７６５０号 ２、発明の名称 自己免疫の改善に有用なＭＨＣによって媒介される毒性抱合体 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　バイオスパン　コーボレイション５、補正命令の日付 平成３年８月２７日（発送日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の８の規定による補正書の翻訳文 ７、補正の内容 補正書の翻訳文の浄書（但し、補正書の翻訳文として提出のうち、図面の翻訳文 に係る部分の削除以外、内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　１通■上専ｔ　　　　　　　　　　　１ 国際調査報告 ＋ｍ、ｌ−１−−＋ｈｍｗ−ｂＯ−ｈ−、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２’７８４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式： Ｘ１ＭＨ２ペプチド（１）または ＭＨＣ２ペプチド１Ｘ（２） 〔式中、Ｘは毒素および標識基から選択される官能基であり、ＭＨＣはＭＨＣ糖 タン白質であって、それが通常存在する細胞表面から解離したものであり、 「ペプチド」は自己抗原と関連したエピトープ含有抗原ペプチドであり、 １は共有結合によって式（１）においてＸとＭＨＣまたは式（２）においてＸと ペプチドに結合した共有結合または２価のリンカーであり、 ２は共有結合、非共有結合的関連またはＭＨＣおよびペプチドと共有結合的に結 合したまたは関連したリンカーである〕を有する複合体。
2. ２．ペプチドが、 重症筋無力症（ＭＧ）、 多発性硬化性（ＭＳ）、 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、 リウマチ性関節炎（ＲＡ）、および インシュリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）から成る群から選択される自己免疫 病に関連したエピトープ抗原を含む８〜１５アミノ酸の配列である、請求の範囲 第１項に記載の組成物。
3. ３．ＭＨＣの有効部分がＭＨＣ−ＩＩのＮ末端α１，α２およびβ１およびβ２ 領域である、請求の範囲第１項に記載の組成物。
4. ４．ＭＨＣの有効部分を脾臓細胞から単離し、ペプチドと結合する能力をスクリ ーニングする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
5. ５．脊椎動物の自己免疫病を治療する方法であって、この治療を必要とする脊椎 動物に請求の範囲第１項に記載の複合体または請求の範囲第１項に記載の複合体 が活性成分であってＸが毒素である、薬学組成物を投与することを特徴とする方 法。
6. ６．脊椎動物の自己免疫病の監視法であって、この治療を必要とする脊椎動物に 請求の範囲第１項に記載の複合体または請求の範囲第１項に記載の複合体が活性 成分であってＸが毒素である、薬学組成物を投与することを特徴とする方法。
7. ７．自己免疫病を治療するのに有用な薬学組成物であって、請求の範囲第１項に 記載の複合体を活性成分として、製薬上許容可能な賦形剤と混合して含む、薬学 組成物。
8. ８．リボソームを含んで成る請求の範囲第７項に記載の薬学組成物。
9. ９．下記式： ＭＨＣ２ペプチド 〔ＭＨＣ、２およびペプチドは請求項１に定義した通りである〕を有する組成物 を調製する方法であって、ＭＨＣ−ＩＩ含有細胞からＭＨＣ−ＩＩ糖タン白質を 単離し、このＭＨＣをペプチドと共にインキュベーションし、透析によって過剰 のペプチドを除去することから成る方法。
10. １０．ＭＨＣペプチドを脂質の存在にて透析し、ミセルまたはリボソームを形成 させることも含む、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．請求の範囲第９項に記載の方法によって調製される式ＭＨＣペプチドを有 する組成物。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の方法によって調製される式ＭＨＣ２ペプチド を有する組成物。
13. １３．被験動物を請求の範囲第１１項に記載の組成物で処理することも含む、請 求の範囲第５項に記載の方法。
14. １４．被験動物を薬学組成物であって請求の範囲第１１項に記載の複合体が活性 成分であるもので処理することも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。
15. １５．被験動物を請求の範囲第１２項に記載の組成物で処理することも含む、請 求の範囲第５項に記載の方法。
16. １６．被験動物を薬学組成物であって請求の範囲第１２項に記載の複合体が活性 成分であるもので処理することも含む、請求の範囲第５項に記載の方法。