JPH03503209A - レセプター膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプター膜 技術分野 本発明は受容体（レセプター）分子および（または）イオンチャンネルを取り込 んだ膜に関するものである。

従来技術 両親媒性分子（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は溶液中におい て凝集し、例えば、単層、ミセル、黒膜、そして一つ又は複数のコンパートメン トからなるマルチラメラタイプのベシクル又はリポソームのような、２次元ある いは３次元の配列を形成することが知られている。また、このような両親媒性分 子は交差結合可能な部分（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋａｂｌｅ　ｍｏｉｅｔｉｅｓ） を伴って形成されることが知られている。例えば、紫外線照射又は電離性放射線 のような適当な刺激を与えると、あたかも交差結合可能な部分は両親媒性分子が ２次元もしくは３次元に適切に配列された後に重合される。さらに、最適なレセ プター分子は両親媒性分子の秩序だった配列の中に含まれることが知られている 。

膜のイオン選択性又はイオンの膜透過性は、膜が有する孔またはチャンネルの数 、大きさおよび化学的構造に依存する。膜を透過する透過性溶質分子は前記孔ま たは前記チャンネルを通る。

膜のイオン透過性を高めるイオノホアと呼ばれるある群の分子は膜に取り込まれ ることが知られている。イオンチャンネルはイオノホアの特別な一形態をなすも ので、この用語の意味するところはチャンネルを通ることによってイオンが膜を 透過するということである。

イオノホアを取り込んだ膜は自然界において存在し、また人工的にも作ることが できる。オーストラリア特許出願第４０１２３／８５号はバイオセンサーにイオ ノホアを取り込んだ膜を利用したことが開示されている。この文献に挙げられた イオノホアはアセチルコリン受容体である。アセチルコリン受容体はアセチルコ リン存在下において開閉イオノホア（ｇａｔｅｄ　１ｏｎｏｐｈｏｒｅ）として 機能することによって、イオンが膜を透過することを促進させることができる。

このようなことは、神経シナプスにおいて見られることと同じである。

本発明は、両親媒性分子の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）による 密閉配列（ｃｌｏｓｅｌｙ　ｐａｃｋｅｄ　　ａｒｒａｙ）からなり、かつ膜が 以下の特徴を有する。すなわち、（１）膜はへリフラス又はそれらの凝集体を形 成可能なペプチド、ボダンド（ｐｏｄａｎｄｓ）、コロナンド（ｃｏｒｏｎａｎ ｄｓ）　、クリプタンド（ｃｒｙｐｔａｎｄｓ）およびそれらの組合物からなる 群から選択された複数のイオンチャンネルを含み、そして（あるいは）（２）少 なくとも自己凝集性両親媒性分子の一部部分が支持部（ｓｕｐｏｒｔｉｎｇ　ｅ ｎｔｉｔｙ）に結合したレセプター分子からなり、該レセプター分子はレセプタ 一部位（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｉｔｅ）を有し、免疫グロブリン、抗体、抗体断 片、色素、酵素およびレクチンからなる群から選択されたものである。前記支持 部は脂質の頭部（ｌｉｐｉｄ　ｈｅａｄ　ｇｒｏｕｐ）、炭水化物鎖（ｈｙｄｒ ｏｃａｒｂｏｎ　ｃｈａｉｎ（ｉ））、交差結合可能な分子（ｃｒｏｓｓ−１ｉ ｎｋａｂｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および膜タンノ（り質（ｍｅｍｂｒａｎｅｐ ｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択されたものである。この支持部はレセプター 分子のレセプタ一部位から離れた端に結合している。

両親媒性分子は、通常は親水性の「頭」部と疎水性の「尾」部を持つ界面活性剤 分子（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）である。

界面活性剤は、陽イオン性（例えば４ＩｉｌＬアンモニア塩）、陰イオン性（例 えば、有機スルホン酸塩）、両生イオン性（例えば、ホスホチジルコリン、ホス ホチジルエタノールアミン）、膜スパン脂質（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐａｎｎｉ ｎｇ　　１ｉｐｉｄ）または非イオン性（例えば、ポリエステル原料）のような 既知のものである。両親媒性分子は好ましくはそれらが交差結合してなるもので ある。そのために、ビニル、メタクリレート、ジアセチレート、イソシアノまた はスチレン基のような交差結合可能な部分を頭部または尾部に含まなくてはなら なし１゜そのような基は、好ましくは福山らが米国化学学会誌（Ｊ。

Ａｍｃｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　２３２１−２３２７１０１１．１９８６　 ）４こ発表したようなスペーサー基を介して両親媒性分子に結合するものである 。重合は、フリーラジカルビニルエーター存在下又は非存在下における加熱、お よび増感剤（ｓｃｎｓｉｔｉｓｅｒ）又はビニルエーター存在下もしくは非存在 下における放射処理を含む不飽和単量体の重合に用いられる方法のどれでも行な うことが可能である。

発明の開示 本発明の好ましい実施態様では、レセプター分子を含まない両親媒性分子は、他 の分子の相補的な部分と交差結合する部分を含有あるいは付加したものである。

より好ましし１実施体様では、支持部（ｓｕｐｏｒｔｉｎｇ　ｅｎｔｉｔｙ）と 共有結合的に結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）されたイオンチャン ネルおよび（または）受容体分子もまた、他の分子の相補的な部分と交差結合す る部分を含有あるいは装飾されている。

上記したように、本発明において用いられるイオンチャンネルはへリフラスおよ びそれらの凝集体を形成可能なペプチド、ボダンド、コロナンドおよびクリプタ ンドからなる群から選ばれたものである。しかしながら、イオンチャンネルはへ リフラス又はその凝集体を形成することが可能なひとつのペプチドからなるもの が好ましい。

ボダン阻クリプタンドおよびコロナンドについてはすでに科学系の文献、例えば 、化学学会誌化学情報（Ｖ、Ｆ。

Ｋｒａｇｚｅｎら：　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｈｃｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ 、、　１２７５．１９８５）、米国化学学会誌（０，Ｅ、　５ｉｃｌｃｋｅｎら ：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、　４２６１１０９．１９８７）　、テトラヘドロンレターズ（Ｊ、Ｇ 。

Ｎｅｅｖｃｌら：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｃ＋ｔｅｒｓ、　２２６３２５ ．１９８４）に記載されている。

。−へリフラスを形成するペプチドは、一般にイオンチャンネルを形成するため に凝集体として存在する必要がある。−般的には、α−へリックスはイオンチャ ンネルが凝集体を貫通するようにして凝集体を形成する。

イオンチャンネルはβ−へリックスを形成するペプチドであることが望ましい。

そのようなポリペプチドとしては例えばグラミシジンＡがある。グラミシジンＡ の一次配列は第１図に示した。この分子は詳細に研究されており、詳しくは「生 体膜と生体エネルギー学（Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｅｒ ｇｅｔｉｃｓ）Ｊ　　（Ｂ、Ａ、コーネル著、１９８７年　６５５−６７６ペー ジ）を見よ。　イオンチャンネルとしてのグラミシジンＡは非極性生体膜を貫通 する極性チャンネルとして機能する。グラミシジンＡは合成によるか、または細 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｂｒｅｖｉｓ　）からの抽出によって生産される。リ ン脂質二重層においてはグラミシジンＡは、リン脂質二重層に実質的に分配され たへりソクスニ量体として存在する。

両親媒性分子とグラミシジンＡとの交差結合を考えると、グラミシジンＡは１． ２．３あるいは４個のトリプトファンとスチレンのような重合可能な基とが置換 することによって修飾される。重合可能な基はネイティブなグラミシジンＡの第 ９．１１．１３および（または）１５番目のアミノ酸残基のα位炭素に付着する 。

さらに本発明においてイオンチャネルとして用いられる分子には、グラミシジン Ｂ、グラミシジンＣ１グラミシジンＤ１グラミシジンＧＴ、グラミシジン０Ｍ１ グラミシジンＧＭ−、グラミシジンＧＮ’−、グラミシジンＡ′（デュボス；　 Ｄｕｂｏｓ）、バンド３タンパク質、バクテリオロドプシン、メリチン、アラメ チン、アラメチン類似化合物、ボーリン、チロシジン、およびチロスリシンが含 まれる。

以後、これらのグラミシンを単純なグラミシンとして見做して言及する。

グラミシンの特別な例として、膜が単層の場合、グラミシンＡの単量体をイオン チャンネルとして用いることができる。膜が二重層である場合は、グラミシジン Ａ二量体の合成類似化合物をイオンチャンネルとして用いることができる。

この合成類似化合物は最適な交差結合部分を与える。さらに、膜が二重層である 場合はイオンチャンネルは２つのグラミシジンＡ単量体とすることも考えられ、 それぞれの単量体はそれぞれ異なる層にある。この場合、グラミシジンＡ単量体 はそれらの層を拡散して通ることが可能で、２つの単量体が一列に並んだときに 、二重層にイオンチャンネルが形成される。

高いコンダクタンスを有する膜コートとしてイオンチャンネルを取り込んだ本発 明の膜を利用する可能性がある一方、多くの場合においてアナライト（ａｎａｌ ｙｔｅ）の存在に反応する膜コンダクタンスが必要である。よって、本発明の好 ましい実施態様では、イオンチャンネルは該イオンチャンネルの一端に結合もし くは付着したレセプタ一部分（ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｉｅｔｙ）によって開閉さ れるもので、普通に存在する場合、レセプタ一部分は第１状態にあり、アナライ トが結合すると第２状態になる。このような状態の変化はイオンチャンネルのイ オン透過性に変化を及ぼす。

第１状態にあるレセプタ一部分は通常、イオンチャンネルのイオン透過が遮られ ているか、妨害されている。レセプターへのアナライトの付着によってレセプタ ーを第２状態にすることによって、イオンチャンネルをイオンが透過できるよう にする。このようなことから、イオンチャンネルが、アナライトの一分子のよう に小さなものとして検知されよう。アナライトの一分子がイオンチャンネルに付 着することによって、イオンチャンネルが開き、イオンが膜から漏れる。このイ オンの漏れが一定時間続くことによって、該漏れがレセプターへアナライトが結 合するシグナルとして確認できよう。

一つのイオンチャンネルによで生ずる膜を横切る電流を測定してみると、通常１ つのチャンネルにつき４ｐＡの電流が流れることがわかる。

当業者によって容易に理解されるように、レセプタ一部分が第１状態である場合 、イオンはイオンチャンネルを通過可能となり、そして第２状態にある場合、イ オンのイオンチャンネルの透過は遮られるか、もしくは妨害される。

レセプタ一部分は要求するアナライトに結合する能力を有し、かつアナライトを 結合することによってイオンチャンネルを第１状態から第２状態に変える能力を 有する何らかの化学的なもの（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｎｔｉｔｙ）である可能性 がある。レセプタ一部分は他の分子を識別することのできる何らかの化合物ある いは合成物である。天然のレセプターには抗体、酵素、レクチン、染料などがあ る。例えば、抗原に対する受容体は抗体で、一方、抗体に対するレセプターは抗 抗体、または、好ましくはほかならぬ抗体によって認識される抗原のどちらかで ある。

レセプタ一部分の好ましい実施体様は、イオンチャンネルに付着するもので、好 ましくはポリペプチドイオンチャンネルのペプチド末端配列を含むもので、該末 端配列は抗体に結合できる。抗体の結合は末端配列の形を変え、イオンがイオン チャンネルを通過できるようにする。レセプタ一部分は適当な方法のどれかによ ってイオンチャンネルに付着する可能性があり、付着は完全なものである必要は ない。よって、レセプターは共有結合的（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）に、あるいは 非共有結合的（ｎｏｎ−ｃｏｖｅｌｅｎｔｌｙ）にイオンチャンネルに結合する 。

アナライトはレセプタ一部分に結合し、さらに、位置の変化、立体像の変化、ま たはイオンチャンネルを第１から第２の状態に変換するような変化を引き起こす 何らかの適当な分子もしくは分子の集まりであろう。もし、レセプターがペプチ ドであるならば、アナライトは抗体もしくは免疫グロブリン、酵素または細胞表 層レセプターであろう。しかし、もしレセプターが抗体または酵素であるならば 、アナライトはそれに結合するような何らかの分子であろう。

上記の実施例において、第１状態にあるレセプタ一部分は効果的にイオンチャン ネルを塞ぐ。この開閉方法（ｍｅｔｈｏｄｏｆ　ｇａｔｉｎｇ）の種々の変形例 はイオンチャンネルに”プラグ（ｐｌｕｇｇｉｎｇ）”されることが可能な化合 物をレセプタ一部分に与えることによって行なわれる。この実施例においてレセ プタ一部分へのアナライトの結合はイオンチャンネルにブラグされた化合物を効 果的に引きだすものであることから、アナライトの結合によってイオンがチャン ネルを通過することが可能となる。プラグとして用いられる化合物としては、レ セプター自身またはより小さな分子、例えば、エチルアンモニウムイオン、およ びカルシウムカチオンのような２価イオンと同様にイオンチャンネルを全体的に 阻害するメチルアンモニウムイオンがある。さらに、グアノジニウムイオンはイ オンチャンネルを部分的に阻害するもので、一方、フェノール、エタノールアミ ン、そしてアンモニウムイオンのより長い鎖のものもまた、プラグとして用いる ことが可能な化合物であろう。

一般的には、イオン直径が４ないし６オングストロームの正に荷電されたものが 、イオンチャンネルに対してイオンの流入を許し、かつチャンネルに”プラグさ れるに十分なフレツキシビリテイを持ってレセプタ一部分に付着するものとして 利用可能であると考えられている。

より好ましい実施態様において、レセプタ一部分は抗体、または好ましくは、少 なくとも一つのＦａｂフラグメント（以下、Ｆａｂと呼ぶ）を含む抗体断片から なるものである。この取り合わせにおいて、Ｆａｂは第１状態下ではイオンのチ ャンネル通過を許し、第２状態下ではイオンの通過を遮断する。

即ち、科学的理論に合うことを望むまでもなく、イオンチャンネルが２価のグラ ミシジンＡで、かつレセプターがイオンチャンネルに付着したＦａｂからなる場 合は、イオンのチャンネル通過は２価のグラミシジン人骨格の***（ｄｉｓｒｕ ｐｔｉｏｎ）による、あるいはＦａｂに結合した２価のグラミシジンのへリック ス部分の***によるアナライトへのＦａｂの結合（即ち、第２状態）によって阻 害されることが一般的には知られている。

本発明では、少なくとも支持部（ｓｕｐｏｒｔｉｎｇ　ｅｎｔｉｔｙ）に結合し たレセプタ一部分からなる両親媒性分子からなり、レセプター分子および支持部 はともに新たな両親媒性体（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）を形成する。このことは、 高密度のレセプタ一部位（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｉｔｅ）を有する膜の形成を可 能とする。

原理的には、レセプタ一部位の密度は単独に、個々のレセプター分子間の立体的 障害物（ｓｃｅｒｉｃ　ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を考慮することによって限定され る。本発明のより好ましい実施態様によれば、レセプター分子が抗体断片である 場合、この抗体断片は少なくともひとつのＦａｂフラグメントを含むものである 。本発明のより好ましい実施態様によれば、支持部は交差結合可能な分子または 膜タンパク質のどちらかであり、かつ好ましくは交差結合可能な分子は両機能的 （ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）なものである。本発明における他の好ましい実 施態様として、抗体断片は２つのＦａｂフラグメントからなり、それぞれのＦａ ｂは異なる抗原を認識する。さらに他の好ましい実施態様では、抗体断片はひと つのＦａｂフラグメントを単に含む。

本発明のさらなる好ましい実施態様では、両親媒性分子からなる部分が支持部に 結合したレセプター分子を含む場合、膜は異なる分子または抗原決定因子（ａｎ ｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ）に反応する複数のレセプターを含むで あろう。例えば、複数のレセプター分子が２つの異なるＦａｂの混合物からなる 場合、その半数のレセプターがひとつの抗原決定因子に向けられ、他の半数のレ セプターは他の抗原決定因子に向けられることが可能である。

免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖（２つのＬ鎖および２つのＨ鎖）がジス ルフィド結合することによって構成されたＹ字形分子である。ＬおよびＨポリペ プチド鎖はドメインと呼ばれる球状領域に包まれている。Ｈ鎖のＣア、およびＣ ｙ２ドメインの間にあるヒンジ領域として知られている部分（Ｄ、Ｓ、スミスお よびＳ、ウッミ　（１９６７）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２１６巻　３３２ ページ）はタンパク質分解酵素によって切断される。酵素のパパインによる切断 はＹ形分子の両腕を離すもので、即ち、ＦａｂフラグメントをＦｃ枝部から離す （ｓ、ザッパコスタら　（１９６８）免疫学雑誌（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）第 １００巻　１２６８ページ）。Ｆａｂフラグメントはイオン交換クロマトグラフ ィ（Ａ、Ｌ、ノフキンスら　（１９６ｇ）免疫学雑誌（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ）　　第１００巻　３１４ページ）およびアフイニテイクロマトグラフイ（Ｆ、 デュラファルグら（１９７６）免疫学雑誌（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　　第１ ２３巻　２４７ページ）によって精製される。本発明の他の好ましい実施体様で はＦａｂフラグメントは脂質の頭部群、炭化水素鎖、両機能***差結合可能な分 子、および膜タンパク質からなる群から選択された支持部（ｅｎｔｉｔｙ）に共 有結合によって連結する。この共有結合による連結（ｃｏｖａｌａｎｔ　ｌｉｎ ｋａｇｅ）はＦａｂタンパクにおいて用いられる種々の連結部位（ｌｉｎｋａｇ ｅ　５ｉｔｅ）に利用される。システィン残基のスルフィドリル基、リジン残基 のａ−アミノ、Ｃ−アミノ基、チロシン残基のヒドロキシフェノール基およびヒ シヂン残基のイミダゾール基は上記に挙げた支持部のどれとでも結合させること ができる。後者の分子に一度結合すると、新しい両親媒性体（ａｍｐｈｉｐｈｉ ｌｅ）が形成されることによって、Ｆａｂフラグメントが膜につなぎとめられ、 その結果、該Ｆａｂフラグメントは膜表面に存在するどのような選ばれた抗体に 対してでも高感受性および安定性を有する検知手段（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として 作用する。

特に好ましい膜タンパク質はポリペプチドのグラミシジンＡである。このポリペ プチドは普通、膜内において２価として存在する。

当業者に理解されるように、膜タンパク−レセプター結合の調製において組み換 えＤＮＡ技術は便利なものである。

本発明の他のより好ましい実施態様は両親媒性分子の少なくとも一部分が炭化水 素と共有的に結合したレセプター分子からなることを特長とする。好ましくは、 レセプター分子はＦａｂフラグメントである。炭化水素鎖の数を変えることによ って農相（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｈａｓｅ）が変化する。炭化水素鎖の数の変化 によってなされる農相としては、膜が外側が極性で内側が疎水性である管を形成 するヘキサゴナルＩ　（Ｈ，）相、および膜が外側が疎水性で内側が親水性であ る管を形成するヘキサゴナル■Ｉ（ＨＩＩ）相がある。形成される他の膜構造と しては、ラメラおよびミセルである。

炭化水素鎖はまた、バイオセンサーの形成においては炭化水素鎖自身が同表面（ ｓｏｌｉｄ　５ｕｒｆａｃｅ）　、例えばセラミック、オキサイド、ハイドロゲ ル、シリコン、ポリマー、および遷移金属への膜の結合に関与する。好ましい遷 移金属としてはパラジウム、金およびプラチナがある。これは非共有結合または 共有結合反応によってなされる。よって、固体基質上のビニル基はビニル処理さ れた脂質と共重合され、流化処理された脂質は金属（例えば金またはパラジウム ）基質に付着することができ、または綜合または付加反応は脂質を固定すること に利用できよう。もし必要とあれば、固体基質の修飾はシリカ表面のシリレーシ ョンのような既知の技術によって達成されよう。

前記したように、本発明は高密度のレセプタ一部位を有する膜を提供するもので ある。この場合、レセプター分子はＦａｂフラグメントである。レセプター分子 としてＦａｂフラグメントを用いる場合、両親媒性分子の２％にＦａｂフラグメ ントを含ませることができる。好ましくは、１％から２％の両親媒性分子にＦａ ｂフラグメントが含まれる。

支持部に結合したレセプター分子を含む両親媒性分子の少なくとも一部分を有す る本発明に基づく膜は、特にバイオセンサーとして利用可能である。それらの膜 は高選択結合表面として目的とする分子を結合する。目的とする分子の結合は既 知の方法のどれかによって記録される。この既知の方法としては、 （ａ）円二色性、 （ｂ）蛍光偏光法、 （ｃ）内部反射法、 （ｄ）光散乱法、 （ｅ）表面プラズマ共振法、 （ｆ）表面音波修飾法、 （ｇ）　？を位効果法、例えば電圧変化、（ｈ）アンペア効果法、例えば電流変 化、（ｉ）温熱効果法、例えば温度変化または熱の流動、（ｊ）反射される量ま たは密度の変化、例えば圧電装置の振動周波数変化、 （ｋ）農相変化の測定、 （１）ラジオイムノアッセイ、および （ｍ）エンザイムイムノアッセイである。

膜にイオンチャンネルが含まれ、かつ自己凝集両親媒性分子の少なくとも一部分 が支持部に結合したレセプター分子を含むような状態では、イオンチャンネルは グラミシジンＡであることが好ましく、そして好ましくはレセプター分子は抗体 または少なくとも一部分がＦａｂフラグメントが含まれる抗体断片からなる。

本発明のより好ましい実施態様ではイオンチャンネルは開閉する（ｇａｔｅｄ） 。この実施態様では、膜は支持部に付着したレセプターを含む両親媒性分子に非 常に接近してアナライトに結合したイオンチャンネルを含み、レセプターはアナ ライトに結合することができる。未結合のアナライト非存在下、イオンチャンネ ルに結合したアナライトはレセプターに付着することによってイオンチャンネル をイオンが通過できるようにする。未結合のアナライトを加えることによって、 レセプターに対する競合が起こり、レセプターからイオンチャンネルに結合した アナライトの遊離が起こり、イオンチャンネルにおけるイオンの通過が阻害され る。レセプタ一部位に対するアナライトの結合は、レセプタ一部位の変化を引き 起こし、イオンチャンネルの遮断を解除することによってイオンの通過を許す。

この実施態様においては、膜が二重層であることが望ましく、イオンチャンネル は２つのグラミシジン単体または共有的に結合した二量体で、かつレセプタ一部 分がＦａｂフラグメントである。

よりこのましい実施態様において結合基（リンカー：１ｉｎｋｅｒ　ｇｒｏｕｐ ）はレセプター分子と支持部との間および（または）イオンチャンネルとレセプ タ一部分との間に与えられる。脂質の頭部群に結合したリンカ−は、脂質それ自 身に近接して起こる立体障害の減少によるレセプター分子の反応を起こすのに十 分な長さのものでなくてはならない。

リンカ−は好ましくは疎水性のものでないことが望ましく、それによって水性レ セプター分子方向に延びて、レセプター分子への付着を余儀なくされる基によっ てその延長が止められる。例えば、Ｆａｂのチオール基は、リンカ−結合マレイ ミド基に結合するのに適し、またはハロゲン化アルキルのような吸電子剤（ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ　）に適している。同様な問題がグラミシジンＡのよう なイオンチャンネルに対するレセプタ一部分の付着のためのリンカ−基の***に 見られる。

本発明の膜は、特にバイオセンサーの生産において利用できる。従って、本発明 の好ましい実施態様は本発明の膜に取り込まれたバイオセンサーを提供する。イ オノホア存在および非存在下における自己凝集膜のコンダクタンスの変化の測定 方法は、科学的文献によって詳細に記載されており、黒膜チェンバー、穴の開い た膜、ポリマーまたはセラミックスを被覆するために作られた単層、二重層また は積み重なった脂質における電極、および微小電極に支持された単層または二重 層に取り込まれたおよそ１ないし１０個のイオンチャンネルを含むパッチクラン プ法がある。信号解析の方法は２．３、または４つのターミナルインピーダンス 測定方法が用いられる。即ち、周波数特性、ノイズスペクトル、サイクリックボ ルタンメタリーまたはイオンチャンネル固有の生成または崩壊の統計が膜全体の コンダクタンスの変化の特長をつかむために用いられる。

バイオセンサーの形成における膜の利用において主要な問題点の一つは膜のもろ さである。本発明者はこの問題点を克服して同表面の上に本発明の膜を形成し、 かつこの膜が丈夫なものであることを発見した。

この方法は互いに反応し合う膜と同表面とを提供することを含む。好ましい同表 面として、ヒドロゲル、セラミックス、オキサイド、シリコン、ポリマーおよび 遷移金属を含む。好ましい遷移金属としては、金、プラチナおよびパラジウムが ある。バイオセンサーを作るにあたって好ましい同表面はパラジウムコーテッド ガラス電極である。

好ましい実施態様において、本発明は同表面に付着した膜二重層からなり、二重 層は上層および下層を有し、下層は固表面に隣接し、固表面またはその上に設け られた基と反応する基を提供する。即ち、二重層の各層は自己凝集性の両親媒性 分子およびグラミシジン単体からなり、上層の両親媒性分子の一部分は支持部に 結合したレセプター分子を含み、該レセプター分子は免疫グロブリン、抗体、抗 体断片、色素、酵素およびレクチンからなる群から選択されたレセプター分子か らなり、該支持部は脂質頭部、炭化水素鎖、交差結合性分子、および膜タンパク からなる群から選択された支持部からなる。支持部はレセプター分子上のレセプ タ一部位から離れた端に結合されている。

この実施態様では、レセプター分子は抗体断片であることが望ましく、かつＦａ ｂフラグメントであることが望ましい。

また、固表面はパラジウムコーテッドガラス電極であることが望ましい。

より好ましい実施態様では、固表面に付着した膜二重層からなるバイオセンサー を提供することで、該二重層は上層および下層を有し、該下層は固表面に隣接し 、かつ固表面またはその上に設けられた基と反応する基を提供する。即ち、二重 層の各層は自己凝集性の両親媒性分子およびグラミシジン単体からなり、レセプ タ一部分は上層においてグラミシジン単体に付着している。

バイオセンサーに関する当業者において理解されるように、膜の部分を少なくす ることによって、シグナルダイナミックスレンジおよびバンド輻を改良によるセ ンサーの感受性および選択性が増加するだろう。

図面の簡単な説明 本発明を以下の図を参照しながら説明する。

第１図はグラミシジンＡの構造を示すものである。

第２図はイオンチャンネル開閉の説明図である。

第３図ないし第５図は種々の農相が得られることを示す図である。

第６図は実施例８において形成されるような本発明の膜バイオセンサーを用いた アナライトの検出を示すグラフである。

第３図ないし第５図において、１０はレセプター分子を示しており、１１は炭化 水素を示し、８炭素から２５炭素の種々の長さの非極性部分はメチレン、アルケ ン、アルキルまたは置換芳香化合物を含む。Ｘはレセプタ一部分１０に結合ある いは付着した炭化水素基の数を示すものである。この数は極性基の層の集まりに 依存している。抗体断片では、Ｘは平面状膜を作るのに必要なおよそ５０に等し い。よって、幾何学的図式は凝集した両親媒性物によって形成された長い範囲の 構造を示す。第３図に示すように炭化水素基の数が大きい場合、ヘキサゴナル相 ！■膜が作られる。第４図は炭化水素基の数がおよそ５０の時、ラメラ相撲が作 られ、一方、第５図に示すように炭化水素基の数が小さい場合、ミセル相撲が作 られる。

発明を実施するための最良の形態 本発明を実施例に基づいて以下説明する。

ｐ−ヒドロキシアセトフェノンを１−（ｐ−アセトキシフェニル）エタノールに 変換した後、コーワンらの方法（有機化学雑誌り、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）　 　１９５８年、第２３巻　５４４ページ）によってｐ−アセトキシスチレンを生 産するために硫酸水素カリウムの存在下における液相脱水によって脱水した。２ ５°Ｃにおいて水（１４ｍｌ）に水酸化カリウム（ｔ、ｓｇ）加えた攪拌溶液に ｐ−アセトキシスチレン（１，６ｇ）を加えた。攪拌は０〜５°Ｃにおいて２時 間続けた。その後、混成物はエタノールで洗い、液相は飽和炭酸水素ナトリウム 溶液で中和した。ロウ固形物として固化された潤油（０，７ｇ）を産出するため に、産物はジクロルメタン中に抽出し、溶液を乾燥して無水塩化カルシウムにし て溶媒を取り除いた。

（ロ）メチル１１−　−ビニルＰヘノキシ）ウンデカ酸の合成室温において１時 間、塩化水素ガスを１１−ブロモウンデカ酸（２，６５ｇ）含有メタノール（２ ０ｍｌ）からなる攪拌溶液中に泡立たせた。その後、溶媒を取り除き、エーテル 中の残滓を水で洗い、乾燥させて無水硫酸ナトリウムにし、溶媒を取り除いた。

残滓ベールオイル（ｐａｌｅ　ｏｉｌ）　（２，８ｇ、１００％）はメチル１１ ．−ブロモウンデカ酸として同定された。

これを、ハセガワらの方法（Ｐｏｌｙｍ、　Ｂｕｌｌ、、　１９８５年、第１４ 巻、３１ページ）によって１ｌ−（ｐ−ビニルＰヘノキシ）ウンデカ酸に変換し た。

ハセガワらの方法（Ｐｏｌｙｍ、　Ｂｕｌｌ、、　１９８５年、第１４巻、３１ ページ）を追試して行なったが、濃縮段階は５日間反応させ、産物はシリカゲル クロマトグラフィにかけた。溶離はエーテル／軽油（１：３）でおこなった。０ ．９２ｇの１ｌ−（ｐ−ビニルＰフェノキシ）ウンデカ酸から得られる産物の全 体量は１．２５ｇ（６６％）であった。

Ｊ、　Ｃ，ベダーセン（アメリカ化学学会誌（Ｊ、　Ａｅｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　　１９６７年、第８９巻、７０１７ページ）の方法、 沸点１２１−１２２°Ｃ／１５　ｍｍ　Ｈｇ、によって、トリエチレングリコー ル、チオニルクロライドおよびピリジンから１．８−ジクロ０．３，６−シオキ サオクタンを調製した。１．８−ジクロロ−３，６−シオキサオクタン（４ｏｇ ）および水酸化カリウム（１１，８ｇ）を含むエチレングリコール（１００ｍｌ ）からなる溶液を１０００Ｃ１１８時間の条件下で攪拌した。その後、混成物を 冷やし、濾過して残滓をア七トン（２ｘ　３５ｍ１）で洗った。集められた濾過 液を蒸留してクリアオイル（１３，５ｇ、　３０％）、沸点＋２０−１２２°Ｃ １０，２ｍｍ　Ｈｇ１１．ｒ、　（液状膜）　　３４３０ｃｍ−’、を生産した 。

（ロ）１１−クロロ−３，６，９−トリオキサウンデク−１−イルサクシネート １１−クロロ−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−オル（２，ＯＯｇ）、 無水コハク酸（０，９４１ｇ）　、ピリジン（０，１０ｍ１）およびジメチルア ミノピリジン（０，０２ｇ）を含むテトロヒドロフラン（１０ｍｌ）からなる溶 液を２４時間、還流した。混成物を冷却し、クリアオイル（２，９ｇ、　１００ ％）　、　１．ｒ、　（液状膜）３０００　（ｂ、　ＣＯ□Ｈ）　、１７３０　 （Ｃ−０）　ｃｍ”、を生産した。

−２−〇−オクタデシルー３−〇−１１−クロロ−３，６，９−）ジオキサウン デク−１−イルサクシネートイル）グリセロール１１−クロロ−３，６，９−） リオキサウンデクー１−イルサクシネート（０，６０ｇ）を塩化チオニル（５ｍ 　１．　）に溶解し、３時間還流した。余剰塩化チオニルを除去し、トルエン（ ５ｍｌ）を加え、かつベールイエローオイル（（０，６４ｇ、　１００％）　、 １．ｒ、　（液状膜）　　１７８５　（Ｃ０ＣＩ）　、１７３０　（Ｃ＝Ｏ）　 ｃｍ−’）として塩化カルボン酸を生産するために０．１ｍｍＨＨにおいて除去 した。

塩化カルボン酸（０，１５ｇ）を含むテトラヒドロフラン（０，５ｍ１）を、ｌ −０−（１１−（ｐ−ビニルフェノキシ）ウンデカノイル）−２−０−オクタデ シルグリセロール（０，３００ｇ）およびピリジン（０，１０ｍ１）を含むテト ラヒドロフラン（５ｍｌ）に滴加した。混成物は室温で１８時間攪拌した後、水 （７５ｍｌ）に注いだ。集めたクロロホルム抽出物を硫酸（５％、５０ｍ１）お よび塩類溶液（５０ｍｌ）で洗い、乾燥（ＭｇＳＯ，）させて蒸発させた。粗生 成物を、エチルアセテート／軽油、４０：６０ｖ／ｖを溶離液として用いたシリ カゲルクロマトグラフィにかけて固化（（０，２５ｇ、　４９％）　、　１．ｒ 、　（液状膜）　１７３０　（Ｃ−０）　ｃｍ−’））シたクリアオイルの産物 を生産した。以下、この化合物をリンカ−脂質と呼ぶ。

１−０−（１１−（ｐ−ビニルフェノキシ）ウンデカノイル）　−２−０−オク タデシルグリセロール（ｏ、２ｏｇ）　、再蒸留した無水酢酸（３ｍｌ）および ピリジン（０，２ｍ１）を室温で１８時間、攪拌した。過剰な無水酢酸は蒸留し て残滓をクロロホルム（４０ｍｌ）に取った。クロロホルムは炭化水素ナトリウ ム（５％、２ｘ５０ｍｌ）、塩酸（５％、　５０ｍ１）水（５０ｍ　ｌ　）で洗 い、乾燥（ＭｇＳＯ，）　させ、かつｔ、　１．　ｃ、　ＩＲ１７３５ｃｍ−’ 　　（ｃｍｏ）によって均質化された無色の油（０，１６ｇ、７４％）として産 物を得るために蒸発させた。以下、この化合物をアセテート脂質とグラミシジン Ａ　（０，０６３３ｇ）　、　１１−クロロ−３，６，９−）リオキサウンデク ー１．イルサクシネート（０，０３２ｇ）　、ジシクロへキシルジイミド（０， ０２１ｇ）およびジメチルアミノピリジン（０，２０ｇ）を含むジクロロメタン を室温で２４時間攪拌した。

その後、混成物は水（４ｘ　５０ｍ１）で洗い、乾燥（Ｍｇｓｏ４）させ、かつ 蒸発させた。白色固体０．３０ｇ　１．　Ｒ，１７２５（Ｃｏ、）１６２５　（ ＣＯＮＨ）　ｃｍ−’　　としてグラミシジン類似化合物（以下、グラミシジン Ｒと呼ぶ）を産生ずるためにジオキサンを溶離液として用いた予備層（ｐｒｅｐ ａｒａｔｉｖｅ　１ａｙｅｒ）クロマトグラフィによって粗生成物を精製した。

ＩｇＧ抗体はプロティンＡに対するクロマトグラフィによって腹水からＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動のシングルバンドとして精製される。Ｆａｂ２フ ラグメントはペプシン消化（１：１００　　酵素：抗体重量比）　ｐＨ４，２， ３０分によって精製抗体から調製され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気カチ オン交換クロマトグラフィはにおいてｍ、ｗ、　１００，０００のシンクルバン ドとして確立された精製活性Ｆ　ａ　ｂ　２フラグメントをカチオン交換クロマ トグラフィによって得た。還元状態における電気泳動では、Ｆａｂ　２フラグメ ントの二つのＦａｂ’のコンポーネントのＬ−鎖およびＨ−鎖に該当するｍ、ｗ 、２５，０００のパン１９８１年、第２０巻、４２２９−３１ｉページ）によっ てＦａｂ　２の修飾により得ることができる。Ｆａｂ２はｐＨ５，５、室温３時 間の条件下で２０ｍＭジチオスレイトルによって還元した。ジチオスレイトルは ｍ、ｗ、３０，０００の分子をカットオフする膜による超微細濾過によって取り 除いた。Ｆａｂ’はＦａｂ　２に対する同等の抗体結合活性を有し、ＳＤＳ電気 泳動において非還元状態もしくは還元状態でそれぞれｍ、ｗ、５０，０００およ び２５，０００のマーカーの部分にシングルバンドとして認められる。Ｆａｂ’ フラグメントは両親媒性単層に結合する前に新鮮な状態で調製された。

Ｆａｂ２をクロラミンＴ方法によって１０’ｃｐｍ／ｍｇの特異的活性を示すよ うに１２５Ｉで放射性標識した。’　”　’ＩＦａｂ２を未標識Ｆａｂ２に対し て１　ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍＨの特異的活性を示すように未標識Ｆａｂ２中に取 り込ませ、Ｆａｂ’フラグメントは上記のようにして調製した。

脂質に対するＦａｂの共有結合および結合アッセイ抗体のペプシン消化およびそ れに続＜　Ｆａｂ’フラグメントへのＦａｂ２フラグメントの還元によってＦａ ｂ’のカルボキシル末端においてひとつの単活性チオール基を生産する。脂質分 子に対するこのチオール基のカップリングは重合可能な脂質分子に付着したポリ エチレンオキシド上の末端塩素との反応を経て達成される。

誘導脂質（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ　１ｉｐｉｄ）の単層はデカン溶液中の拡散 脂質によってラングミュアブロジェット溝の空気−水界面上に形成される。事前 に表面を疎水性にしたナイロンベグ基質を界面に浸したので、脂質の炭化水素鎖 は基質の表面と相互作用した。

溝の表面は事前に脂質を取り除かれており、基質を素早く引き上げてＦａｂ’溶 液に移した。

脂質を被覆した基質は０．１から１．０ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＨ８）か らなるＦａｂ’の水溶液に浸した。Ｆａｂ’上の特異的チオールと脂質ポリエチ レン酸化物結合基の塩素とをＮ２中において室温で３ないし２０時間反応させた 。脂質を被覆した基質においてなされる反応のマーカーとして’　２５ＩＦａｂ ’を用いた。

そして、Ｆａｂ’結合脂質被覆基質は１ないし５ｍｇ／ｍ１（ｐＨ７，４）の１ ２５１−ｈＣＧを含むマイクロタイターウェルに移した。基質全体の放射活性は １５分間のインキュベーション後に測定した。

マイクロタイターウェルに同量の抗体を用いた従来のイムノアッセイと比較して みると、Ｆａｂ−脂質被覆基質を用いることによって、少なくとも感受性が２倍 に改善された。

同様な処理をパラジウムコーテッドガラススライド基質に行なうと、従来のイム ノアッセイ技術に比べ、感受性が３倍に上がった。＋　２５　ｔ−ｐａｂの放射 性測定からの計算によると、少なくともｃｍ２当たり１０”Ｆａｂ分子の被覆は インキュベーション１０時間以上で達成された。

ヒトのコリオゴナドトロピン（ＬＣＧ）上の２つの異なる面に結合する２種類の モノクローナルＦａｂフラグメントは、ひとつのＦａｂのみの場合と比べて感受 性が５０％増加した。

ＨＣ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ　−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｔｒ ｐ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｖａ　ｌ−Ｄ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ −Ｖａｌ−Ｇ　ｌｙ−Ａｌａ−１−”Ｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｖ ａｌ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌ ｅｕ−Ｔｒｐ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２０Ｈの配列を有し、かつＧＡ分子の頭と頭とが 共有結合的に結合した二量体が得らＢＯＣ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）を保護する側鎖お よび他のＢＯＣアミノ酸は日本のペプチド研究所株式会社より購買した。ｌ−目 Ｃ−ＤＬ−ロイシンはケンブリッジアイソトープ研究所（マサチューセッツ州、 ウオバーン）から入手した。ＢＯＣ−Ｔｒｐ　（ＣＨＯ）ＯＣＨ２ＰＡＭレシン （０，６９ｍｍｏＩ７ｇ）はアブライドバイオシステムズがブラサドらの方法（ 国際雑誌ペプチドタンパク研究（Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）第１９巻、１９８２年、＋６２− １７１ページ）によって、開始物質である！−”Ｃ−ＤＬ−ロイシンを余り変化 させることなく、ＢＯＣ−１−”Ｃ−Ｄ−ロイシンを合成した１−１３標識−Ｄ −ロイシンを除くすべてのアミノ酸をマニュアルどおりに加えて４３０ペプチド 合成装置（アプライドバイオシステムズ）を用いて１−　”　Ｃ−ＤＬ−Ｌｅｕ 　、　ｓ二量体は同相法によって合成した。

０．５ｍｍｏｌのＢ　ＯＣ−Ｔ　ｒ　ｐ　（ＣＨＯ）を含むＢＯＣ−Ｔｒｐ（Ｃ ＨＯ）ＯＣＨ２ＰＡＭレシン（０，７２ｇ）によって開始される合成は１％交交 差台ポリスチレンをエステル化した。

最初の６サイクルはＢＯＣアミノ酸のシングルカップリングで、残りのすべての サイクルではダブルカップリングである。最初のカップリングはＤＭＦ中におい てなされ、かっＤＣＭ溶媒と再カップリングされる。

それぞれのアミノ酸は以下の段階で加えられる。

１、　　ＤＣＭ中でのレシン洗浄。

２６５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ　　１８．５分処理後、ＤＣＭ中において３３％ＴＦ Ａ　８０秒処理によるＢＯＣ基の除去。

３．３ＤＣＭ洗浄。

４、　　ＤＭＦ中において１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）　　 ２　ｘ　１分処理による中性化。

５、　５ＤＭＦ洗浄。

６、　２ｍｍｏｌ　ＢＯＣアミノ酸およびジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ ＣＣ）を用いたアミノ酸無水物（２倍量の無水物）を経るＤＭＦ中における２６ 分のカップリングサイクル。

７．５ＤＣＭ洗浄。

再カップリングサイクル： １　　カップリング溶媒（Ｄ　ＣＭ、）中においてｌ洗浄。

２．１０％ＤＩＥＡ含有ＤＣＭ　３０秒。

３゜　５　ＤＣＭ　　洗浄。

４、　　ＤＣＭ中における再カップリング　３０分。

５、’Ｉ　ＤＭＦ洗浄。

６．５ＤＣＭ洗浄。

手作業でｌ−１３Ｃ−標１−　Ｄ−ロイシンをペプチドに加えた。

レジンはこのサイクルの第５段階（中性化および洗浄）後においてシ合成装置反 応容器から取り除いた。

−当量（０，５ｍｏｌ）のＢＯＣ１−１３Ｃ−Ｄ−ロイシンを２　ｍ　Ｉ　Ｄ　 Ｍ　Ｆに加え、１０分間攪拌した。その後、−当量のＤＣＣを含有した２　ｍ　 ｌ　Ｄ　Ｍ　Ｆを加え、室温で一晩反応させた。

その後レジンを合成装置に戻し、該合成装置においてレジンの洗浄とそれに続く 未標識のＢＯＣ−Ｄ−ロイシンとを上記の再カップリングサイクルにより再カッ プリングさせた。

合成の各サイクルの完了時にレジン試料を取って、定量的ニンヒドリンアッセイ 　（サリンらによる。分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ）第１１７巻　１４７−１５７ページ、１９８１年）により、カップリン グの程度を決定した。

ブラサドらの方法（１９８２）にもとづくフォルミレージョン反応後、末端エタ ノールアミド部分を与えるためにエタノールアミンと反応させることによって完 全なペプチドを取り除いた。

粗ペプチドの最初の精製はセファデックスＬＨ２０カラム（ファルマシア）　１ ００ｃｍ　ｘ　３．２ｃｍ　ｉｄを用いてエタノールで濾過した。

このカラムからフラクションを集め、均等ＭｅＯＨ溶媒（９２％ＭｅＯＨ）また は９２％−１００％勾配のＭ　ｅ　ＯＨを用いたラジアルコンプレッションカラ ム（８ｍｍ　ｉｄ　ｘ　１０　ｃｍ）での逆相ＨＰＬＣによって解析した。

ＴＬＣによる解析はシリカゲルプレート（メルク　キエゼルゲル６０　Ｆ−２５ ４）によって行ない、溶媒はクロロホルム／ＭｅＯＨ／氷酢酸（９０：１０：３ ）およびＣＨＣｌ、／ＭｅＯＨ／Ｈ２０（６５：２５：４）で、バンドは紫外線 光で可視化した。

以下の例は金属電極に付着した両親媒性物質−イオンチャンネル表面から作られ たバイオセンサーに関するものである。レセプター分子は両親媒性物質−イオン チャンネルコートに共有結合的に結合している。レセプター分子へのリガンドの 結合は開閉機構として作用し、イオンチャンネルのコンダクタンスを変化させる 。以下の実施例に示すように、開閉機構はイオンチャンネル濃度およびレセプタ ー濃度と関連して脂質グラミシジン表面は実施例５の記載と同様にしてパラジウ ムコーテッドガラス電極の上に調製された。第１の単層はドデカンーチオル：グ ラミシジン（比３０対１）からなり、第２の単層はアセテート脂質：グラミシジ ンＲ（比１００対１）からなるものであった。グラミシジンＲの形成は実施例４ の記載にもとづいた。

６６０分子の２つの離れた部位に結合するｈＣＧに対する２つのモノクローナル 抗体から調製されたＦａｂを含むＦａｂ溶液中に電極をインキュベートした。２ つのタイプのＦａｂの比はｌ：ｌであった。Ｆａｂの全濃度はリン酸緩衝液（ｐ Ｈ８）中において０．１ないし１．０ｍｇ／ｍｌであった。電極は室温で３ない し１９時間インキュベートした。電極の電気的インピーダンスは３電極システム 、「ソラートロン１２５０　ＦＲＡＪインピーダンスアナライザーおよび電気− 化学インターフェイス増幅器を用いて１ミリヘルツから５ミリヘルツの周波数範 囲において測定した。脂質グラミシジン二重層のインピーダンスは１．６ｘ　１ ０’の伝導性グラミシジンチャンネルに相当する１０ミリヘルツにおいて１０’ °９５オームであった（伝導性チャンネルの数の推定はすべて１０１′オーム／ チヤンネルの黒脂質膜におけるグラミシジン抵抗にもとづく）。

光学的なインキュベーション時間はＦａｂ溶液において１２時間であり、これに よって、５．９ｘ　１０’の伝導性グラミシジンチャンネル（１ミリヘルツで測 定）から１０ミリヘルツにおいて１０６．１５オームの上昇したインピーダンス が測定された。

流れ出ている水で電極を洗うことおよび蒸留水に４８時間浸すことは電極のイン ピーダンスを変えなかった。

電極はｈｃａ含有０．１ＭＮａＣ１中において３７°Ｃ１１５分間インキュベー トした。蒸留水での洗浄後、電極は０．１ＭＮａＣ１セルに戻し、そのインピー ダンスを測定した。Ｆａｂ溶液において１２時間インキュベートすることが、ｈ ＣＧ結合に対するインピーダンスのもつとも感受性の高い変化をもたらした。

１ｍｌ当たり０．９６ナノグラムのｈＣＧによって、１０ミリヘルツにおいてｌ ｏ６．２０オームの増加インピーダンスが得られた。これは１ミリヘルツで測定 された４、８　ｘ　１０’個の伝導性グラミシジンチャンネルに相当するもので ある。

蒸留水またはエタノールによる洗浄はインピーダンスを変えることはなかった。

蒸留水または０．１ＭＮａＣ１にに電極を浸すこともまた、インピーダンスを変 えることはなかった。

実施例８ パラジウムコーテッドガラス電極は実施例７に記載した方法によって被覆した。

第１の単層は実施例７に記載されている通りであり、第２の単層は全脂質ニゲラ ミジンの比が１００：１になるようにして構成され、ここにおいて全脂質はアセ テート脂質ニリンカー脂質（実施何重ないし３を見よ）の電極のインピーダンス は実施例７に記載したとおりに測定した。電極はＦａｂ溶液に実施例７に示した ように５ないし１０時間インキュベートした。Ｆａｂ溶液において５．５時間イ ンキュベーション後に脂質−Ｆａｂ電極によって測定したところ、１．９　ｘ　 １０’個の伝導性グラミシジンチャンネルに相当するｌＯミリヘルツにおけるイ ンピーダンスは１０”オームであり、一方において脂質−グラミシジンのみの二 重層では１０ミリヘルツにおけるインピーダンスは１０４′オームであった。

ｈＣＧは実施例７に記載したようにしてＦａｂ被覆脂質−グラミシジンコーテッ ド電極とともにインキュベートした。Ｆａｂ溶液における５、５時間のインキュ ベーションによってｈＣＧ結今に対して最も感受性の高い変化が認められた。１ ｍｌ当たり０．９６ナノグラムのｈＣＧの添加によって１．２　ｘ　１０５個の 伝導性グラミシジンチャンネルに相当する。　１０ミリヘルツにおけるインピー ダンスはｘｏｓ、５ｓオームであった。全濃度が２．５６ｎｇ／ｍｌのところへ ざらにｈＣＧを添加するとによって、５．６　ｘ　１０５個の伝導性グラミシジ ンチャンネルに相当する、ｌＯミリヘルツにおけるインピーダンスはｌｏｓ、９ ｓオームであった。

上記と同様の塗装（コート）を施した他の電極では、５．５時間のＦａｂインキ ュベーションによりｌＯミリヘルツにおけるインピーダンスはｘ０５゛ｌオーム であり、また１ｍｌ当たり０．９６ナノグラムのｈＣＧの添加によるｌＯミリヘ ルツにおけるインピーダンスはｘ０６．＋５オームであった。対照として、ｈＣ Ｇ（すなわち、１．９２　ｘ　１０”’ｍｏｌ／ｍ＋）の変わりに同量の牛血清 アルブミンを添加すると、１０ミリヘルツにおけるインピーダンスはｘｏｓ、＊ ｏオームであり、ｈＣＧを除く脂質−Ｆａｂコーテッド電極と等価である。

実施例９ パラジウムコーテッドガラス電極は実施例７に記載された方法を用いた塗装（コ ート）した。第１の単層はドデカンエチオール：グラミシジンＡ　（１０：１） で、第２の単層は脂質：グラミシジンリンカ−（２：１）から構成された。イン ピーダンス測定は実施例７の記載にしたがって行なった。

二重層のインピーダンスは１ｍＨｚにおいて１０ｓ、ａｓオームであった。実施 例７に記載されたようにしてＦａｂ溶液に１６時間インキュベートすると、１ｍ Ｈｚにおけるインピーダンスは１０６９オームであった。ｈＣＧを０．０８ｎｇ ／ｍｌ添加すると、１ｍＨｚにおけるインピーダンスは１０４　、５６オームで あった。

実施例１０ （ａ２　＊イオンはグラミシジンチャンネルを特異的に阻害する。

Ｃａ”のガラミシジン阻害能を調べるためにＣａ”イオンを脂質−グラミシジン リンカ−コーテッド電極に添加した。

パラジウムコーテッドガラス電極は実施例６に記載された方法によって制作し、 かつ第１の単層はドデカンエチオール：グラミシジンＡ　（１０：１）からなり 、第２の単層はシミリストイルホスファチジルエタノールアミン：グラミシジン Ｒ（ｌ：１）からなるようにした。インピーダンス測定は実施例７に記載された 方法によって行なった。二重層は１０ｍＨｚにおけるインピーダンスが１０５． ６５オームであった。測定中のセルに５０ｍＭのＣａ”イオンを添加すると、１ ０　ｍ　Ｈｚにおけるインピーダンスが１０５　、３５オームまで増加し、この ことは伝導性グラミシジンチャンネルの数が減少したことを示している。

ＦＩＧＬ）ＲＥ　　２ ＵＯ １、、＝ＶｔＬ　　Ｌ −Ｌｅｕ４ Ｌ−Ａｌａ　　５ １）−Ｖａ１６ Ｌ−ＶＪＬ１７ −Ｖａｌｅ Ｌ−τｒｐ　９ Ｄ−Ｌｃｕ　　ｔ。

Ｌ−τｒｐ　１１ Ｄ−Ｉ、αｕ　１２ Ｌ−τｒｐ　１３ Ｄ−Ｌ’ｅｕ１４ ＦＩＧＬ’ＲＥ　１ 国際調査報告 Ｎ守任ズ■フ侶コ江乞αに■αにＬ９講にΣだアαなｌＮ３玖貫兎川’ＬＩＣＡ 箕ｌ路、にＪ胆８８１００２７３ＡＩＪ４０Ｌ２３／８５　、　　　　ＣＡ　１ ２２３０３９　　　　　ｙ１５８８３４　　　　ＪＰ６１００２０５５Ｍ＋３乃 ８９／８４　　　　　ＣＡ１２３１０４８　　　　　ＥＰ　　１４０５２１　　 　　コロ００７８３５０ＴＥ　　４７１３３２４

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．自己凝集両親媒性分子の密集配列からなる膜において、該膜は以下のことを 特長とする；（１）膜はヘリックス又はそれらの凝集体を形成可能なペプチド、 ポダンド、コロナンド、クリプタンドおよびそれらの組合物からなる群から選択 された複数のイオンチャンネルを含み、そして（あるいは）（２）少なくとも、 自己凝集両親媒性分子の一部分は支持部（サボーテイングエンテテイ）に結合し たレセプター分子を含み、該レセプター分子はレセプター部位を有し、該レセプ ター分子は免疫グロブリン、抗体、抗体断片、色素、酵素およびレクチンからな る群から選択されるものからなり、前記支持部は脂質の頭群、炭化水素鎖、交差 結合可能な分子および膜タンパク質からなる群から選択されるもので、前記支持 部は前記レセプター分子の前記レセプター部位から離れた端に結合している。
2. ２．請求項（１）にクレームした膜において、イオンチャンネルはａ−ヘリック スのペプチドが凝集したものである。
3. ３．請求項（１）にクレームした膜において、イオンチャンネルはβ−ヘリック スを形成するペプチドである。
4. ４．請求項（３）にクレームした膜において、イオンチャンネルはグラミシジン またはその類似化合物である。
5. ５．請求項（３）にクレームした膜において、イオンチャンネルはグラミシジン Ａまたはその類似化合物である。
6. ６．請求項（１）ないし（５）にクレームしたそれぞれの膜において、レセプタ ー部分はその端部においてイオンチャンネルに付着または結合し、該レセプター 部分は普通は第１状態にあるが、アナライトに結合したときは第２状態にあり、 前記レセプター部分の前記状態変化はイオンチャンネルを通過するためのイオン の能力を変化させる。
7. ７．請求項（６）にクレームした膜において、レセプター部分はその端部をイオ ンチャンネルに付着させている。
8. ８．請求項（６）または（７）にクレームした膜において、レセプター部分は抗 原である。
9. ９．請求項（６）または（７）にクレームした膜において、レセプター部分は抗 体または抗体断片である。
10. １０．請求項（９）にクレームした膜において、抗体断片は少なくとも一つのＦ ３ｂフラグメントを持つ。
11. １１．請求項（１０）にクレームした膜において、レセプター部分はＦａｂフラ グメントである。
12. １２．請求項（１）ないし（５）にクレームしたそれぞれの膜において、レセプ ター分子に付着したもの（エンテテイ）は交差結合可能な分子または膜タンパク 質である。
13. １３．請求項（１）ないし（５）または（１２）にクレームしたそれぞれの膜に おいて、交差結合可能な分子は二価性である。
14. １４．請求項（１）ないし（５）にクレームしたそれぞれの膜において、レセプ ター分子は抗体または抗体断片である。
15. １５．請求項（１４）にクレームした膜において、レセプター分子は少なくとも ひとつのＦ８ｂフラグメントを含む抗体断片である。
16. １６．請求項（１５）にクレームした膜において、レセプター分子はＦａｂフラ グメントである。
17. １７．請求項（１６）にクレームした膜において、Ｆａｂフラグメントは炭化水 素鎖に付着しており、また膜の両親媒性分子の２％までが炭化水素鎖に付着した Ｆａｂフラグメントを含む。
18. １８．請求項（１７）にクレームした膜において、膜の１ないし２％の両親媒性 分子は炭化水素鎖に付着したＦａｂフラグメントを含む。
19. １９．請求項（１）ないし（５）または（１２）ないし（１８）にクレームされ たそれぞれの膜において、両親媒性分子の一部分は支持部に結合したレセプター 分子を有し、偶々のレセプター分子は異なる分子または抗原決定基に対して反応 性がある。
20. ２０．請求項（１９）にクレームした膜において、レセプター分子は異なる抗原 決定基を認識しうる２つのＦａｂフラグメントである。
21. ２１．請求項（１）ないし（５）または（１２）ないし（２０）にクレームした それぞれの膜において、抗体または少なくとも一つのＦａｂフラグメントを含む 抗体断片と反応する抗原はイオンチャンネルに付着し、かつそのことによって、 抗原が抗体又は抗体断片と結合したときに、イオンがイオンチャンネルを通過で きる。
22. ２２．請求項（１）ないし（５）または（１２）ないし（２０）にクレームした それぞれの膜において、イオンチャンネルは支持部に結合したレセプター分子を 含む両親媒性分子に非常に近接し、さらに該レセプター分子はイオンチャンネル を通過するためのイオンの能力を変化させる。
23. ２３．請求項（２２）にクレームした膜においてレセプター分子は抗体または少 なくとも一つのＦａｂフラグメントを含む抗体断片である。
24. ２４．請求項（２３）にクレームした膜においてレセプター分子はＦａｂフラグ メントである。
25. ２５．請求項（２２）ないし（２４）にクレームしたそれぞれの膜において、イ オンチャンネルはグラミシジンである。
26. ２６．請求項（２２）ないし（２５）にクレームしたそれぞれの膜において、二 重層およびイオンチャンネルは２個のグラミシジン単量体もしくは共有結合的に 結合した二量体である。
27. ２７．請求項（１）ないし（２６）にクレームされたそれぞれの膜において、レ セプター分子を含まないところの両親媒性分子は、他の同様な分子の少なくとも 一つの部分に交差結合した少なくとも一つの該部分に相当する部分を含むか、あ るいはそのように修飾されている。
28. ２８．請求項（１）ないし（２７）にクレームされた膜において、イオンチャン ネルお上び（または）支持部に結合したレセプター分子を含む両親媒性分子の部 分は、他の同様な分子の少なくとも一つの部分に交差結合した少なくとも一つの 該部分に相当する部分を含心か、あるいはそのように修飾されている。
29. ２９．請求項（１）ないし（２８）にクレームされた膜において、膜は固表面（ ソリッドサーフェイス）に付着し、該付着は膜に与えられた基によってなされて おり、該基は固表面またはその上に供給された基と反応する。
30. ３０．請求項（２９）にクレームした膜において、固表面はハイドロゲル、セラ ミックス酸化物、シリコン、プラスチックまたは遷移金属からなる群から選択さ れる。
31. ３１．請求項（３０）にクレームした膜において、遷移金属は金、プラチナおよ びパラジウムからなる群から選択される。
32. ３２．固表面に付着した膜二重層を含むバイオセンサーにおいて、該二重層は上 方および下方層を有し、該下方層は固表面またはその上に与えられた基に近接す る；二重層のそれぞれの層は、自己凝集両親媒性分子およびグラミシジン単量体 からなり、上方層の両親媒性分子部分は支持部に結合したレセプター分子を含み 、該レセプターはレセプター部位を有し、該レセプター分子は免疫グロブリン、 抗体、抗体断片、色素酵素およびレクチンからなる群から選択され、支持部は脂 質の頭群、炭化水素鎖、交差結合可能な分子および膜タンパク質からなる群から 選択され、該支持部はレセプター分子のレセプター部位から離れた端に結合する 。
33. ３３．請求項（３２）にクレームしたバイオセンサーにおいて、レセプター分子 は少なくとも一つのＦａｂフラグメントからなる抗体断片である。
34. ３４．請求項（３２）または（３３）にクレームしたバイオセンサーにおいて、 レセプター分子はＦａｂフラグメントである。
35. ３５．請求項（３２）または（３４）にクレームしたそれぞれのバイオセンサー において、固表面はバラジウムコーテッドガラス電極である。
36. ３６．固表面に付着した膜二重層からなるバイオセンサーにおいて、該二重層は 上方および下方層を有し、下方層は固表面に近接し、かつ固表面またはその上に 与えられた基と反応する基が付加されている；二重層のそれぞれの層は自己凝集 両親媒性分子およびグラミシジン単量体からなり、レセプター部分は上方層のグ ラミシジン単量体に付着している。
37. ３７．請求項（３６）にクレームしたバイオセンサーにおいて、レセプター部分 はＦａｂフラグメントである。
38. ３８．請求項（３６）もしくは（３７）にクレームしたバイオセンサーにおいて 、固表面はバラジウムコーテッドガラス電極である。