DE112018007259T5 - Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurebildenden Selbststabilisierungs-Anbindung - Google Patents

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Abstract

Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon, wie in Formel I gezeigt:wobei:der Kreis ein Gerüst darstellt, wobei das Gerüst eine C1-8-Alkylidengruppe, eine C1-8-Heteroalkylidengruppe, eine C6-10-Arylidengruppe oder eine C4-10-Heteroarylidengruppe aufweist;L einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Protein aufweist;M eine Succinimidgruppe oder eine hydrolytische Succinimidgruppe mit geöffnetem Ring aufweist;Ac über eine Aminogruppe mit dem Gerüst verbunden ist, wobei Ac eine säurebildende Einheit aufweist, die zur Stabilisierung des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats dient, und wobei Ac ein Fragment aufweist, das aus mindestens einer Aminogruppe und mindestens einer säurebildenden Gruppe, oder einer Oligopeptidgruppe besteht, die aus einer Vielzahl von Aminosäureeinheiten besteht;D eine Wirkstoffeinheit aufweist;A einen Binder aufweist;m eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; undn 1 oder 2 ist.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Anwendung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats zur Behandlung von Krebs oder anderen Krankheiten, und insbesondere auf die Anwendung einer speziellen hydrophilen, säurestabilisierten Anbindung bei der Herstellung von einem Antikörper-Wirkstoff-Konjugat zur Erhöhung der Wirkstoffstabilität im Plasma bei gleichzeitiger signifikanter Verbesserung der Pharmakokinetik (PK).
  • Technischer Hintergrund
  • Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) sind eine Klasse neuartiger zielgerichteter Wirkstoffe, die im Allgemeinen aus drei Komponenten bestehen: einem Antikörper oder antikörperähnlichen Liganden, einem niedermolekularen Wirkstoff und einem Binder, der den Antikörper an den Wirkstoff koppelt. Antikörper-Wirkstoff-Konjugate machen sich spezifische Erkenntnisse zu bestimmten Antigenen durch Antikörper zunutze, um Wirkstoffmoleküle in die Nähe von Zielzellen zu transportieren und sie dort wirksam freizusetzen, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Im August 2011 genehmigte die U.S. Food and Drug Administration (FDA) das neue ADC von Seattle Genetics, AdecteisTM, für die Behandlung des Hodgkin-Lymphoms sowie des anaplastischen grosszelligen Lymphoms (ALCL), und die klinische Anwendung hat die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Wirkstoffklasse nachgewiesen.
  • Bei Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten werden Konjugate, die sich in der klinischen Erprobung befinden, um eine effiziente Bindung des Wirkstoffmoleküls an den Antikörper zu gewährleisten, in der Regel über Binder an Lysinreste auf der Oberfläche des Liganden oder an Cysteinreste (erhalten durch teilweise Reduktion der Disulfidbindungen zwischen den Ketten) in der Gelenkregion des Antikörpers gebunden. Das Vorhandensein einer großen Anzahl von Lysinresten (mehr als 80) auf der Antikörperoberfläche und die nicht-selektive Natur der Kopplung führen jedoch zu Unsicherheiten bei der Anzahl der Kopplungen und Stellen, was wiederum zu einer mangelnden Homogenität von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten führt. Die Sulfhydryl-Kopplung kann das Problem der mangelnden Konsistenz der Produktqualität wirksam mildern, und Maleimid als Binder kann unter milden Bedingungen schnell und hochselektiv Thioether-Produkte mit Antikörper-Sulfhydrylgruppen bilden.
    Figure DE112018007259T5_0002
  • Eine zunehmende Anzahl von Studien hat jedoch gezeigt, dass die Zugabe von Succinimid mit Sulfhydryl ein reversibler Prozess ist (inverse Michael-Addition), und wenn das Additionsprodukt in das Plasma gelangt, kann der Austausch des Additivprodukts mit einer Albumin-Sulfhydrylgruppe, der zur Freisetzung des Wirkstoffmoleküls führt, durch die Anwesenheit einer großen Anzahl von Proteinen mit freien Sulfhydrylgruppen im Plasma deutlich beobachtet werden. Die Freisetzung des Wirkstoffmoleküls führt einerseits zu toxischen Nebenwirkungen, andererseits wird die Wirksamkeit des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats reduziert. (Siehe Shen, et al. „Conjugation site modulate the vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates", Nature Biotech (2012) 30:184-189; Baldwin & Kiick, Bioconj. Chem 2011, 22, 1946-1953; Alley, et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 759-765.)
  • Viele Forscher haben veröffentlichte Studien mit dem Ziel durchgeführt, die Stabilität von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten im Plasma zu verbessern und die Sulfhydrylgruppen-Reverse-Michael-Addition zu reduzieren. Es wurde berichtet, dass das zyklische Thioether-Additivprodukt, das durch Maleimid und Sulfhydryl gebildet wird, in wässriger Umgebung hydrolysiert werden kann, um ein Thioether-Produkt mit geöffnetem Ring zu bilden. Im Gegensatz zu zyklischen Sulfid-Additivprodukten bleiben Sulfid-Produkte mit geöffnetem Ring im Plasma stabil und werden nicht mehr mit anderen Sulfhydrylgruppen ausgetauscht. Daher kann der Austausch von Sulfhydrylgruppen wirksam vermieden werden, wenn das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat in eine Struktur mit geöffnetem Ring umgewandelt wird, bevor es in den Körper gelangt.
    Figure DE112018007259T5_0003
  • Die Geschwindigkeit einer additiven Ringöffnungsreaktion wird von vielen Faktoren beeinflusst, einschließlich des pH-Werts und der Temperatur der Reaktion sowie der Struktur, die der Reaktion unterliegt, und aufgrund der Empfindlichkeit von Antikörpern gegenüber pH-Wert und Temperatur ist eine schnelle Ringöffnung bei einem pH-Wert und einer Temperatur, die der Antikörper tolerieren kann, die beste Wahl durch Optimierung der Bindungsstruktur. Das Patent WO2016025752 offenbart ein Verfahren, bei dem eine stark elektronenanziehende Gruppe außerhalb des Succinimidrings eingeführt wird, wobei das Verfahren die Elektronenabsorption nutzt, um den Austausch von Thioether-Additivprodukten mit Albumin zu reduzieren; jedoch ist es gerade wegen des Vorhandenseins dieser elektronenanziehenden Gruppe schwierig, die Succinimid- und Arzneimittelbindung unter natürlichen Bedingungen zu erhalten, und Succinimid, das eine stark elektronenanziehende Gruppe trägt, ist sehr anfällig für die Ringhydrolyse, nach der es nicht mehr in der Lage ist, eine weitere Zugabe mit Thioether durchzuführen.
    Figure DE112018007259T5_0004
  • Das Patent Nr. US20130309256 von Seattle Genetics (US) offenbart einen Binder, der neben dem Succinimid eine Basisgruppe und eine Elektronen-anziehende Gruppe einführt, wobei die Albumin-Austauschrate des Additivprodukts aufgrund der Wirkung der Basisgruppe wirksam reduziert werden kann, wodurch die Stabilität im Plasma signifikant verbessert wird. Wie allgemein bekannt ist, ist der pH-Wert von humanem Plasma schwach basisch, und obwohl der Einbau basischer Gruppen die Ringöffnung des Succinimids fördern kann, wird die Verbesserung der Hydrophilie des gesamten Moleküls schwieriger. Dieses Phänomen wird in einem späteren Patent von Seattle Genetics, WO2015057699 , gut bestätigt. Nachdem die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine stabilisierte Verbindung, die eine basische Gruppe trägt, in ein Zielmolekül eingebaut hatten, stellten sie fest, dass das gesamte Antikörper-Wirkstoff-Konjugat-Molekül in Mäusen bei höheren Wirkstoffbelastungen aufgrund der Hydrophobie immer noch schnell abgebaut wird (siehe Patent Nr. WO2015057699 , Seite 225), und um die obige Situation zu verbessern, waren die Erfinder gezwungen, eine komplexe Polyethylenglykol-Struktur in die Seitenkette des Moleküls einzubringen, um die Aggregation des Moleküls zu verbessern (siehe Patent Nr. WO2015057699 ) .
  • Neben der Verringerung des Albuminaustauschs und der Verbesserung der Plasmastabilität ist ein weiterer wichtiger Faktor, der beim Design von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten berücksichtigt werden muss, die Menge des Wirkstoffs, die pro Zielwirkstoff abgegeben werden kann (d. h. die Menge des zytotoxischen Wirkstoffs, die an jeden Zielwirkstoff (z. B. jeden Antikörper) gebunden ist), was als Wirkstoffmenge bezeichnet wird. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine höhere Arzneimittelmenge eine bessere Wirksamkeit als eine niedrigere Arzneimittelmenge ergibt (z.B. sollte eine 8-Einheiten-Ladung im Vergleich zu einer 4-Einheiten-Ladung eine bessere in vivo- und in vitro Wirksamkeit aufweisen). Die Begründung für diese Theorie ist, dass Konjugate mit höheren Wirkstoffmengen mehr Wirkstoffe (zytotoxische Wirkstoffe) an die Zielzellen abgeben. In-vitro-Ergebnisse haben auch bestätigt, dass Konjugate mit höheren Wirkstoffmengen in vitro eine höhere Aktivität gegenüber Zelllinien aufweisen. Einige spätere Studien haben jedoch gezeigt, dass diese Hypothese in vivo in Tiermodellen noch nicht in ähnlicher Weise bestätigt werden konnte. In der Literatur wurde beobachtet, dass Konjugate mit 4-Einheiten- und 8-Einheiten-Dosierungen eines Auristatins in einem Mausmodell unerwartet eine ähnliche Aktivität aufweisen, und es wurde keine höhere Wirksamkeit unter einer 8-Einheiten-Dosierung beobachtet. Siehe Hamblett, et al., Clinical Cancer Res. 10: 7063-70 (2004). Hamblett et al. deckten die Gründe für das oben beschriebene experimentelle Phänomen auf und berichteten weiter, dass ADCs mit höherer Belastung in Tiermodellen schneller aus dem Kreislauf entfernt werden. Diese schnellere Clearance deutet auf eine Tendenz hin, dass Konjugate mit höherer Belastung im Vergleich zu Konjugaten mit niedrigerer Belastung instabilere PKs aufweisen. Darüber hinaus weisen höher belastete Konjugate bei Mäusen eine niedrigere MTD auf und haben daher einen engeren therapeutischen Index. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass ADCs mit einer Belastung von zwei an einer künstlich modifizierten Stelle auf einem monoklonalen Antikörper die gleichen oder bessere PK-Eigenschaften und therapeutische Indizes aufweisen als einige ADCs mit einer Belastung von vier Einheiten. Siehe die von Junutula et al. veröffentlichten Berichte, Clinical Cancer Res. 16: 4769 (2010).
  • Eine Erhöhung der Arzneimittelbelastung erhöht theoretisch die Menge des Arzneimittels, die von einem einzelnen Antikörper in die Zielzelle transportiert wird. Aufgrund der Hydrophobizität des Arzneimittels nimmt die Hydrophobizität eines ADC jedoch mit zunehmender Arzneimittelmenge zu, was zu einer ADC-Aggregation im Körper und einem verringerten therapeutischen Index führt. Zu den alternativen Verfahren zur Überwindung der Tendenz, dass ADCs mit höherer Belastung weniger erwünschte PK-Eigenschaften aufweisen, gehört die Hinzufügung von löslichmachenden Gruppen zur ADC-Struktur. Zum Beispiel kann ein Polyethylenglykol-Polymer oder ein anderes wasserlösliches Polymer zum Binder (z.B. der Bereich zwischen dem Arzneimittel und den Antikörper-Bindungsstellen) hinzugefügt werden, um die Tendenz zur ADC-Aggregation zu überwinden. Trotz der Tatsache, dass Seattle Genetics die Fähigkeit entwickelt hat, Anbindungen (bzw. Junctions) durch den Einbau von basischen Gruppen zu stabilisieren, besteht z.B. immer noch die Notwendigkeit, die PK von Arzneimittelmolekülen bei hohen Belastungen zu verbessern, z.B. durch die Einführung von Seitenketten-PEGs in das Anbindungs-Wirkstoff-Konjugat. Die Zugabe von solubilisierenden Gruppen erhöht jedoch die Komplexität des Herstellungsprozesses solcher Konjugate.
  • Daher ist ein neuer Ansatz auf dem Gebiet der neuartigen ADCs, die zur Verbesserung der nachteiligen Auswirkungen eines hohen Wirkstoff-Antikörper-Verhältnisses (DAR) eingesetzt werden, dringend erforderlich, der gleichzeitig die durch den Sulfhydryl-Austausch von Succinimid verursachte Erhöhung der Plasmastabilität überwinden und gleichzeitig die pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten mit einem hohen DAR verbessern kann. Die säurestabilisierte Grenzschicht, die durch die vorliegende Erfindung gebildet wird, erfüllt in bemerkenswerter Weise beide der oben genannten Anforderungen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein spezielles hydrophiles, säurestabilisiertes Anbindungs-Wirkstoff-Konjugat zur Verfügung zu stellen. Bei der Durchführung von Experimenten stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu ihrer Überraschung fest, dass im Gegensatz zu der in US20130309256 beschriebenen Einführung von basischen Gruppen die Einführung einer säurebildenden Aminosäure- oder Oligopeptideinheit den Sulfhydryl-Austausch von Succinimid- und Antikörperkonjugaten reduziert und gleichzeitig ein hohes Maß an Stabilität im Blutplasma aufrechterhält. Es wurde auch experimentell nachgewiesen, dass das entworfene Konjugat aufgrund des Einbaus einer oder mehrerer Aminosäuren ein ähnliches Maß an Hydrophilie wie das unkonjugierte Targeting-Reagenz aufweist und somit pharmakokinetische (PK) Eigenschaften behält, die denen des unkonjugierten Targeting-Reagenzes in vivo ähnlich sind. Daher trägt das Vorhandensein einer säurebildenden, stabilisierten Anbindung zur Wirksamkeit des Wirkstoffs über die beiden oben genannten Wege bei, die zusammen die Stabilität des Wirkstoffs im Plasma erhöhen und die Pharmakokinetik (PK) des Wirkstoffs verbessern.
  • Die Einführung einer säurestabilisierten Verbindungsstelle ermöglicht es dem Konjugat auch, eine höhere Wirkstofflast (d.h. eine höhere Menge an hydrophilen Wirkstoffverbindungen pro Zielreagenz) im Vergleich zu Konjugaten mit einer geringeren Wirkstofflast zu haben, während die gewünschten PK-. Eigenschaften erhalten bleiben und in vivo die gleiche oder eine bessere Aktivität aufweisen. (So kann z.B. ein Konjugat mit 4 Einheiten oder 8 Einheiten die gleichen oder bessere PK-Eigenschaften aufweisen als ihre Pendants mit 2 bzw. 4 Einheiten; solche Konjugate mit 4 Einheiten oder 8 Einheiten können die gleichen oder bessere PK-Eigenschaften aufweisen als ihre Pendants mit 2 bzw. 4 Einheiten).
  • Konkret liefert die vorliegende Erfindung ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wie in Formel I gezeigt:
    Figure DE112018007259T5_0005
    Wobei:
    • L einem Antikörper, Antikörperfragment oder Protein entspricht;
    • M Bernsteinsäureimid oder hydrolysiertem Bernsteinsäureimid entspricht;
    • Ac einem Fragment entspricht, das aus einer Aminogruppe und einer Säuregruppe besteht, oder einem Oligopeptid, das aus einer Vielzahl von Aminosäuren besteht, wobei der Amino-Abschnitt mit dem gezeigten Kreis verbunden ist;
    • D dem Wirkstoff-Abschnitt entspricht; und
    • A dem Binder-Abschnitt entspricht;
  • Der Kreis bezeichnet ein Gerüst, das einem substituierten oder unsubstituierten C1-8-Alkyliden, C1-8-Heteroalkyliden, C6-10-Aryliden oder C4-10-Heteroaryliden entspricht.
  • m entspricht einer ganzen Zahl von 1 bis 20, und n entspricht 1 oder 2.
  • Vorzugsweise entspricht dieser Antikörper einem Antikörper für einen Zelloberflächenrezeptor und ein tumorassoziiertes Antigen.
  • Vorzugsweise entspricht Ac einer säurebildenden Aminosäureeinheit oder einem säurebildenden Oligopeptid, wobe I die Säuregruppe von Ac aus einem oder mehreren Sets ausgewählt wird, die eine Carbonsäure-, Phosphorsäure-, phosphorige Säure- oder Sulfonsäuregruppe umfassen.
  • Weiter bevorzugt entspricht Ac vorzugsweise einer natürlichen Aminosäure oder einer unnatürlichen Aminosäure mit einem isoelektrischen Punkt von 7,0 oder weniger oder einem daraus zusammengesetzten Oligopeptid.
  • In einigen bevorzugten Beispielen besteht die Oligopeptideinheit vorzugsweise aus 2 bis 5 Aminosäuren.
  • In einigen bevorzugten Beispielen entspricht A einem spaltbaren Binder oder einem nicht spaltbaren Binder.
  • In einigen bevorzugten Beispielen entspricht dieser Wirkstoff einem zytotoxischen Wirkstoff, einem Wirkstoff zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
  • Noch bevorzugter ist der Wirkstoff D aus einem Satz ausgewählt, der Maitansin- Wirkstoffe, Australin-Wirkstoffe, Benzodipyrrol- Wirkstoffe, Pyrrolozodiazol-Wirkstoffe, Amantin oder Derivate davon und Camptothecin-Verbindungen bzw. Zusammensetzung umfasst.
  • In einigen bevorzugten Beispielen hat A die folgende Formel:
    Figure DE112018007259T5_0006
    Dabei entspricht C einer optionalen erweiterbaren Einheit am Ende, E einer optionalen aufbrechbaren Einheit, F einer Abstandseinheit und die Indizes e und f entsprechen 0 oder 1. Die Wellenlinie zeigt eine Verbindungsstelle zwischen der säurehaltigen selbststabilisierten Anbindung und einer Wirkstoffeinheit an.
  • In einigen bevorzugten Beispielen stellt der Kreis eine Cl-8-Alkylengruppe oder eine C1-8-Heteroalkylengruppe dar.
  • Bevorzugt stellt der Kreis eine C1-3-Alkylengruppe dar;
  • In einigen bevorzugten Beispielen wird Ac aus einer Menge ausgewählt, die (D/L) Glycin, (D/L) Alanin, (D/L) Leucin, (D/L) Isoleucin, (D/L) Valin, (D/L) Phenylalanin, (D/L) Prolin, (D/L) Tryptophan umfasst, (D/L)-Serin, (D/L)-Tyrosin, (D/L)-Cystein, (D/L)-Methionin, (D/L)-Asparagin, (D/L)-Glutamin, (D/L)-Threonin, (D/L)-Asparaginsäure, (D/L)-Glutaminsäure oder die folgenden Strukturformeln:
    Figure DE112018007259T5_0007
    wobei eine Wellenlinie eine Verknüpfungsstelle zum Gerüst anzeigt und R einem willkürlichen Verknüpfungsfragment zwischen einer Aminogruppe und einer Phosphatgruppe entspricht.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht eine Anbindungs-Wirkstoff-Bindung vor, die wie folgt aufgebaut ist:
    Figure DE112018007259T5_0008
    • Ac entspricht einer Aminosäureeinheit mit einem isoelektrischen Punkt von weniger als 7;
    • D entspricht dem Wirkstoff-Abschnitt;
    • A entspricht dem Binder-Abschnitt;
    • q entspricht einer ganzen Zahl von 1 bis 8, und n entspricht 1 oder 2.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsträger oder eine pharmazeutische Hilfsstoffzusammensetzung.
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon wird bei der Herstellung von Wirkstoffen zur Behandlung von Krebs, Immunkrankheiten und Entzündungen verwendet.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt die für die Zusammensetzungenll erhaltenen Ergebnisse des MS-TOF-Tests.
    • 2A zeigt die für H-11 erhaltenen Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests.
    • 2B zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für H-20.
    • 2C zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für H-29.
    • 2D zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für H-39.
    • 2E zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für H-41.
    • 2F zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für H-43.
    • 2G zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für MC-VC-PAB-MMAE.
    • 2H zeigt die Ergebnisse des SEC-HPLC-Tests für DPR-VC-PAB-MMAE.
    • 3 zeigt die Ergebnisse von in-vivo-Stabilitätsstudien mit unkonjugierten Antikörpern, ADCs mit säurestabilisierten Zusammensetzungen und Kontroll-ADCs.
    • 4 zeigt HIC-Chromatographie-Ergebnisse für ADCs mit säurestabilisierten Zusammensetzungen und einem Kontroll-ADC.
    • 5 zeigt die in vivo-Wirksamkeitsergebnisse für ADCs mit säurestabilisierten Zusammensetzungen und einem Kontroll-ADC.
    • 6 entspricht einem Diagramm, das die experimentellen Ergebnisse zeigt, die für Beispiel 56 erzielt wurden.
  • Spezifische Ausführungsformen
  • Nach umfangreichen und intensiven Forschungsbemühungen stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung überrascht fest, dass Antikörper-Wirkstoff-Konjugate mit einer säurestabilisierten Grenzfläche eine bessere Stabilität im Plasma aufweisen und hydrophiler sind als herkömmliche Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, und dass die konjugierten Strukturen einer höheren Belastung standhalten können, während die gewünschten pharmakokinetischen Eigenschaften der Strukturen bei geringer Belastung erhalten bleiben. Eine höhere Arzneimittelbelastung führt zu einer besseren Aktivität und therapeutischen Wirksamkeit.
  • Insbesondere hat ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurebildenden stabilisierten Zusammensetzung, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, eine Maleimid-Einheit, die bei der Kopplung mit der Antikörper-Sulfhydrylgruppe und unter Beteiligung der stabilisierenden säurebildenden Gruppe den Ring hydrolysiert, und die resultierende Struktur erfährt keinen Austausch mit anderen sulfhydrylhaltigen Makromolekülen im Plasma, wodurch ein Abwerfen des Wirkstoffmoleküls verhindert wird.
    Figure DE112018007259T5_0009
  • Gleichzeitig führt das Vorhandensein einer oder mehrerer hydrophiler Säuregruppen zur Bildung einer ringgeöffneten Struktur, die hydrophiler ist als das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat, wodurch Probleme wie eine verminderte Aktivität aufgrund einer erhöhten Wirkstoffbelastung verhindert werden.
  • Das resultierende Antikörper-Wirkstoff-Konjugat kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass der Wirkstoff eine Zielzellpopulation, z.B. eine Gruppe von Tumorzellen, erreicht. Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat bindet spezifisch an Zelloberflächenproteine, und die resultierenden Konjugate werden nach dem Zufallsprinzip endocytiert. Innerhalb der Zelle wird der Wirkstoff in Form eines aktiven Wirkstoffs freigesetzt, um eine oder mehrere Wirkungen zu erzielen. Zu den Antikörpern gehören chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, menschliche Antikörper, Antikörperfragmente, die an Antigene binden können, Antikörper-Fc-Fusionsproteine oder Proteine. Lebensfähige Wirkstoffe sind hochwirksame Wirkstoffe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Maytansinoide, Auristatine, Calicheamicine, Doxorubicine, Benzodipyrrol-Antibiotika (Duocarmycine und CC-1065), Pyrrolobenzodiazepin-Dimere (PBDS), Kropfstoffe, Camptothecin und Derivate wie SN38, Irinotecan und Ixitecan.
  • Detaillierte Beschreibung des Patents
  • Abkürzungen und Definitionen
  • Sofern nicht anders angegeben, haben die folgenden hier verwendeten Begriffe und Phrasen die folgende Bedeutung. Wenn hierin ein geschützter Name verwendet wird, umfasst der geschützte Name, sofern der Kontext nichts anderes angibt, die Produktformulierung, das Generikum und den pharmazeutischen Wirkstoff des geschützten Produkts.
  • Der Begriff „Alkylen“ bezieht sich auf eine zweiwertige geradkettige gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, einschließlich Gruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylengruppen sind unter anderem Methylen (-CH2-), Ethylen (-CH2-CH2-), n-Propylen, n-Butylen, n-Pentylen, n-Hexylen usw. Sofern nicht anders angegeben, bezieht sich der Begriff „Aryl“ auf eine mehrfach ungesättigte, im Allgemeinen aromatische Hydroxylgruppe, die ein monozyklischer oder ein fusionierter oder ein kovalent verbundener polyzyklischer Ring (mit bis zu drei Ringen) sein kann. Der Begriff „Heteroaryl“ bezieht sich auf eine Arylgruppe (oder einen Ring), die 1 bis 5 Heteroatome enthält, die aus einem Satz ausgewählt sind, der N, O und S umfasst, wobei Stickstoff- und Schwefelatome gegebenenfalls oxidiert sein können und Stickstoffatome gegebenenfalls einer quaternären Ammoniation unterzogen werden können. Eine Heteroarylgruppe kann über ein Heteroatom an den Rest des Moleküls gebunden sein. Nicht einschränkende Beispiele für Arylgruppen sind: Phenyl, Naphthyl und Diphenyl, während nicht einschränkende Beispiele für Heteroarylgruppen enthalten sind: Pyridyl-, Pyridazinyl- , Pyrazinyl-, Pyrimidinyl- (Pyrimindinyl-), Triazinyl-, Chinolinyl-, Chinoxalinyl-, Chinazolinyl-, Misolinyl-, Phthalaziniyl-, Benzotriazinyl-, Purinyl-, Benzimidazolyl-, Benzopyrazolyl-, Benzotriazolyl-, Benzotriazolyl-, Isobenzofuranyl-, Isoindolyl-, Indolyl- , Benzotriazinyl- und Thienopyridinylgruppen, Thienopyrimidinyl, Pyrimidinyl, Imidazopyridin, Benzothiazolyl, Benzofuranyl, Benzothienyl, Indolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Isothiazolyl, Pyrazolyl, Indolyl, Tyridinyl, Imidazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiadiazolyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Furanyl, Thienyl usw. Wenn sie als „substituiert“ beschrieben werden, werden die Substituenten der oben beschriebenen aromatischen und heteroaromatischen Systeme aus den nachstehend aufgeführten verwendbaren Substituenten ausgewählt.
  • Wie im vorliegenden Patent erwähnt, bezieht sich eine Arylidengruppe auf das Vorhandensein von zwei kovalenten Bindungsstrukturen in der oben erwähnten Arylstruktur in der ortho-, meta- oder para-Position.
  • Sofern hierin nicht anders angegeben, können Substituenten, die aus Kohlenwasserstoffgruppen bestehen (einschließlich derer, die allgemein als Alkyliden, Alkenyl, Alkinyl und Cycloalkyl bezeichnet werden), einer Vielzahl von verschiedenen Gruppen entsprechen, die aus dem folgenden Satz ausgewählt werden: -Halogen, -OR', - NR'R", -SR', -SiR'R "R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', - CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', - NR"C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2) =NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NR'S(O)2R", -CN and -NO2, wobei die Anzahl der Substituenten von 0 bis (2m'+1) reicht, wobei m' die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in der Gruppe ist. R', R" und R"' entsprechen jeweils unabhängig voneinander einem Wasserstoffatom, unsubstituiertem Cl-8-Alkyl, unsubstituiertem Aryl, mit 1 bis 3 Halogenatomen substituiertem Aryl, unsubstituiertem C1-8-Alkyl, C1-8-Alkoxy oder C1-8-Thioalkoxy oder einer unsubstituierten Aryl-C1-4-Alkylgruppe. Wenn R' und R" an dasselbe Stickstoffatom gebunden sind, können sie mit diesem Stickstoffatom 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Element-Ringe bilden. Zum Beispiel enthält -NR'R" 1-Pyrrolidinyl und 4-Morpholinyl.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich das „Derivat“ einer Zusammensetzung auf eine Substanz, die eine ähnliche chemische Struktur wie die entsprechende Zusammensetzung hat, die aber auch mindestens eine chemische Gruppe enthält, die in der Zusammensetzung nicht vorhanden ist und/oder der mindestens eine chemische Gruppe fehlt, die in der Zusammensetzung vorhanden ist. Die Zusammensetzung, mit der das Derivat verglichen wird, wird als „Stammverbindung“ bezeichnet. Im Allgemeinen kann ein „Derivat“ aus der AusgangsZusammensetzung über einen oder mehrere chemische Reaktionsschritte hergestellt werden.
  • Antikörper, Antikörperfragmente und Proteine
  • In den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung entsprechen Antikörper, Antikörperfragmente und Proteineinheiten gezielten Arzneimitteln, die spezifisch an ein Zielelement binden. Antikörper, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, sind in der Lage, spezifisch an zelluläre Bestandteile oder an andere Zielmoleküle von Interesse zu binden. In einigen Aspekten wirkt die Antikörpereinheit so, dass sie die Arzneimitteleinheit an eine spezifische Zielzellpopulation abgibt, mit der die Ligandeneinheit interagiert. Zu den Liganden können unter anderem Proteine, Polypeptide und Peptide sowie Nichtproteine wie Zucker gehören. Geeignete Ligandeneinheiten sind z.B. Antikörper, wie (vollständige) Antikörper in voller Länge sowie antigenbindende Fragmente davon. In Verkörperungen, bei denen die Ligandeneinheit ein Nicht-Antikörper-Zielreagenz ist, kann sie einem Peptid oder Polypeptid oder einem Nicht-Protein-Molekül entsprechen. Beispiele für solche zielgerichteten Reagenzien sind Interferone, Lymphokine, Hormone, wachstums- und koloniestimulierende Faktoren, Vitamine, Nährstofftransportmoleküle oder jedes andere zellbindende Molekül oder jede andere zellbindende Substanz. In einigen Ausführungsformen ist der Binder kovalent an ein Schwefelatom auf dem Liganden gebunden. In einigen Aspekten ist das Schwefelatom das Schwefelatom des Cysteinrests, das die Disulfid-Zwischenkettenbindung des Antikörpers bildet. In einem anderen Aspekt ist das Schwefelatom ein Cysteinrest, der in die Ligandeneinheit eingeführt wurde und der die Disulfid-Interkettenbindung des Antikörpers bildet. In einem anderen Aspekt ist das Schwefelatom ein Schwefelatom eines Cysteinrests, der in die Ligandeneinheit eingeführt wurde (z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder chemische Reaktion). In anderer Hinsicht wird das Bindergebundene Schwefelatom aus einem Cysteinrest, der die Disulfidbindung zwischen den Ketten des Antikörpers bildet, oder einem frontalen Cysteinrest, der in die Ligandeneinheit eingeführt wurde (z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder chemische Reaktion), ausgewählt. In einigen Ausführungsformen wird das von Kabat (Kabat E.A., et al., (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242) definierte EU-Indexnummerierungssystem verwendet.
  • Wie in diesem Patent verwendet, umfasst der Begriff „Antikörper“ oder „Antikörpereinheit“ im Rahmen dieses Patents jeden Teil der Antikörperstruktur. Diese Einheit kann an einen Rezeptor, ein Antigen oder eine andere Zielrezeptoreinheit, die zur Zellpopulation gehören, binden, reaktiv damit assoziieren oder einen Komplex damit bilden. Ein Antikörper kann jedes Protein oder proteinähnliche Molekül sein, das an einen Teil der Zellpopulation bindet, einen Komplex bildet oder mit einem Teil der Zellpopulation reagiert, die für eine Behandlung oder biologische Modifikation vorgesehen ist.
  • Die in dem vorliegenden Patent verwendeten Antikörper umfassen polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper, wobei die polyklonalen Antikörper heterogene Gruppen von Antikörpermolekülen sind, die aus dem Serum eines immunen Tieres stammen. Zu den monoklonalen Antikörpern gehören unter anderem monoklonale Antikörper von Mäusen und Menschen, humanisierte monoklonale Antikörper oder chimäre monoklonale Antikörper sowie Antikörper, die von anderen Spezies abgeleitet sind. Menschliche monoklonale Antikörper können mit jeder der vielen auf dem Gebiet bekannten Techniken hergestellt werden (z.B. Teng, et al. 1983, proc. Natl. Akad. Sci. USA. 80: 7308-7312; Olsson, et al. 1982, MEthan, Enzymol 92: 3-16).
  • Ein Antikörper, der das in diesem Patent beschriebene Antikörper-Wirkstoff-Konjugat umfasst, sollte vorzugsweise die Antigen-Bindungsfähigkeit beibehalten, die er in seinem ursprünglichen wilden Zustand besitzt. Somit ist ein Antikörper, wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, in der Lage, vorzugsweise ausschließlich an ein entsprechendes Antigen zu binden. Zu den Antigenen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, gehören z.B. Tumor-assoziierte Antigene (TAA), Zelloberflächen-Rezeptorproteine und andere Zelloberflächenmoleküle, Zellüberlebensregulatoren, Zellproliferationsregulatoren, Moleküle, die mit Gewebewachstum und -differenzierung assoziiert sind (sofern ihre Funktion bekannt oder vorhergesagt ist), Lymphokine, Zytokine, Moleküle, die an der Regulierung der Zellzirkulation beteiligt sind, Moleküle, die an der Angiogenese beteiligt sind, und Moleküle, die mit der Angiogenese assoziiert sind (sofern ihre Funktion bekannt oder vorhergesagt ist). Tumorassoziierte Faktoren können Cluster-Differenzierungsfaktoren entsprechen (z.B. CD-Proteine).
  • Zu den Antikörpern, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung in einem Antikörper-Wirkstoff-Konjugat beschrieben werden, gehören unter anderem Antikörper, die auf Zelloberflächenrezeptoren und auf tumorassoziierte Antigene abzielen. Solche tumorassoziierten Antigene sind in der Industrie gut bekannt und können mit Antikörpervorbereitungsverfahren und -informationen hergestellt werden, die in der Industrie gut bekannt sind. Um wirksame Targets auf zellulärer Ebene zu entwickeln, die in der Krebsdiagnose und -behandlung eingesetzt werden könnten, haben Forscher, versucht, Transmembran- oder andere tumorassoziierte Peptide zu identifizieren. Diese Targets werden spezifisch auf der Oberfläche einer oder mehrerer Krebszellen exprimiert, während auf der Oberfläche einer oder mehrerer nicht-krebsartiger Zellen nur eine geringe oder gar keine Expression beobachtet wird. Typischerweise werden solche tumor-assoziierten Polypeptide auf der Oberfläche von Krebszellen im Vergleich zur Oberfläche von Nicht-Krebszellen in größerem Ausmaß überexprimiert. Die Identifizierung solcher tumorassoziierten Faktoren hat das Potenzial, die Spezifität der antikörperbasierten Krebstherapie erheblich zu verbessern.
  • Proteine oder Peptide, die im Rahmen des vorliegenden Patents zur Herstellung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats verwendet werden, können jedes beliebige Peptid oder Protein sein, das eine Affinität zu einem Epitop oder entsprechenden Rezeptor hat, und sie müssen nicht unbedingt zur Immunglobulin-Familie gehören. Diese Peptide können mit ähnlichen Techniken isoliert werden, wie sie für Phagen-Display-Antikörper verwendet werden (Szardenings, J Recept Signal Transduct Res. 2003: 23(4): 307-49). Die Verwendung von Peptiden aus solchen zufälligen Peptidbibliotheken kann ähnlich wie bei Antikörpern und Antikörperfragmenten sein. Peptid- oder Protein-bindende Moleküle können an ein Makromolekül oder ein anderes Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Albumin, Polymere, Liposomen, Nanopartikel oder Dendrimere, gebunden oder damit verbunden sein, solange diese Bindung es dem Peptid oder Protein erlaubt, seine Antigen-Bindungsspezifität zu behalten.
  • Zu den Tumor-assoziierten Antigenen gehören Antigene, die in der Industrie gut bekannt sind. Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die den tumorassoziierten Antigenen entsprechen, sind in öffentlich zugänglichen Datenbanken wie Genbank zu finden. Zu den tumorassoziierten Antigenen im Zusammenhang mit dem Antikörper-Targeting gehören alle Aminosäuresequenzvarianten und Homologe, die mindestens 70 %, 80 %, 85 %, 90 % oder 95 % Homologie zu einer in der verfügbaren Literatur identifizierten Sequenz aufweisen oder biologische Eigenschaften und Merkmale haben, die mit einer Sequenz eines tumorassoziierten Antigens identisch sind, die in der Literatur identifiziert wurde.
  • Der Begriff „Hemmung“ oder „Hemmung durch“ bezieht sich darauf, dass die nachweisbare Menge reduziert oder vollständig verhindert wird.
  • Der Begriff „Krebs“ bezieht sich auf einen physiologischen Zustand oder eine Krankheit, die durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Der Begriff „Tumor“ schließt Krebszellen ein.
  • Der Begriff „Autoimmunkrankheit“ bezieht sich auf eine Krankheit oder Störung, die durch die gezielte Beeinflussung der eigenen Gewebe oder Proteine einer Person entsteht.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptables Salz“ auf ein pharmazeutisch akzeptables organisches oder anorganisches Salz einer Zusammensetzung (z.B. ein Wirkstoff, eine Wirkstoff-Anbindung oder ein Liganden-Anbindungs-Wirkstoff-Konjugat). Diese Zusammensetzung kann mindestens eine Amino- oder Carboxylgruppe enthalten und somit ein Adduktsalz mit einer entsprechenden Säure oder Base bilden. Beispiele für Salze zur Veranschaulichung sind unter anderem Sulfat, Trifluoracetat, Citrat, Acetat, Oxalat, Chlorid, Bromid, Iodid, Nitrat, Hydrogensulfat, Phosphat, saures Phosphat, Salze der Isonicotinsäure, Lactat, Salicylat, saures Citrat, Weinstein, Oleat, Tannat, Pantothenat, Hydrogentartrat, Ascorbat, Salicylat, Formiat, Benzoat, Glutamat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzolsulfonat, p-Toluolsulfonat, Kalium- und Natriumsalze usw. Zusätzlich haben pharmazeutisch annehmbare Salze mehr als ein geladenes Atom in ihrer Struktur. Beispiele, in denen mehrfach geladene Atome, die Teil eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes sind, mehrere Instanzen des Gegengewichts aufweisen können. Beispielsweise kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz ein oder mehrere geladene Atome und/oder ein oder mehrere entgegenwirkende Atome aufweisen.
  • Bevorzugte Wirkstoffe beziehen sich auf: zytotoxische Wirkstoffe, die in der Krebstherapie eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Maitansin oder Maytansinoide, Analoga von Dolastatin 10, Cachymycin, Doxorubicin, Benzodipyrrol-Antibiotika (Duocarmycin, CC-1065, usw.), Pyrrolo[2,1-c][1,4] benzodi-Azepine (PBDs) oder PBD-Dimmer und Derivate davon, Amantin oder Derivate davon und Camptothecin-Verbindungen einschließlich Camptothecin, Hydroxycamptothecin, SN-38, Icticam, Irinotecan usw..
  • Andererseits sind lebensfähige Wirkstoffe nicht auf die oben genannten Kategorien beschränkt, sondern umfassen vielmehr alle Wirkstoffe, die in einem Antikörper-Wirkstoff-Konjugat verwendet werden können.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Erfindung auch Radioisotope, die über eine säurebildenden, selbststabilisierte Zusammensetzung verbunden sind. Dazu gehören u.a., aber nicht nur, Radioisotope: 3H, 11C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At und 213Bi.
  • Basierend auf dem Mechanismus der Wirkstofffreisetzung in die Zelle, wie er hier verwendet wird, lassen sich „Binder“ oder „Antikörper-Wirkstoff-Konjugat-Binder“ in zwei Kategorien einteilen: nichtaufbrechbare Binder und aufbrechbare Binder.
  • Bei Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, die einen nicht-aufbrechbaren Binder enthalten, ist der Mechanismus der Wirkstofffreisetzung wie folgt: Nachdem das Konjugat an das Antigen gebunden und endocytiert worden ist, wird der Antikörper im Lysosom enzymatisch gespaltet, wobei ein aktives Molekül freigesetzt wird, das aus einem niedermolekularen Wirkstoff, einem Binder und einem Antikörper-Aminosäurerest besteht. Die daraus resultierende Veränderung der Molekularstruktur des Wirkstoffs verringert nicht seine Zytotoxizität, aber da das aktive Molekül geladen ist (aufgrund der Aminosäurereste), kann es nicht in benachbarte Zellen eindringen. Daher wird der Wirkstoff nicht in der Lage sein, benachbarte Tumorzellen abzutöten, die das Zielantigen nicht exprimieren (antigen-negative Zellen) (so genannter „Bystander-Effekt“) (Ducry, et al. 2010, Bioconjugate Chem. 21: 5-13).
  • Ein aufbrechbarer Binder kann, wie der Name schon sagt, den aktiven Wirkstoff (den niedermolekularen Wirkstoff selbst) in der Zielzelle aufbrechen und freisetzen. Aufbrechbare Binder lassen sich in zwei Hauptklassen einteilen: chemisch instabile Binder und enzymatisch instabile Binder.
  • Chemisch instabile Binder können aufgrund von Unterschieden in den Eigenschaften von Plasma und Zytoplasma selektiv gebrochen werden. Zu diesen Eigenschaften gehören pH-Wert, Glutathionkonzentration usw.
  • In einigen Ausführungsformen des vorliegenden Patents entspricht der Binder einem pH-empfindlichen Binder, der allgemein auch als säureempfindlicher Binder bezeichnet wird. Solche Binder sind im neutralen Milieu des Blutes relativ stabil (pH 7,3 bis 7,5), werden aber in schwach sauren Endosomen (pH 5,0 bis 6,5) und Lysosomen (pH 4,5 bis 5,0) hydrolysiert. Die meisten Antikörper-Wirkstoff-Konjugate der ersten Generation verwenden diese Art von Bindern, z.B. Hydrazone, Carbonate, Acetale und Ketale. Aufgrund der begrenzten Plasmastabilität säureempfindlicher Binder haben Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, die auf solchen Bindern basieren, in der Regel eine kurze Halbwertszeit (2 bis 3 Tage). Diese kurze Halbwertszeit hat bis zu einem gewissen Grad die Verwendung von pH-sensitiven Bindern in der neuesten Generation von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten eingeschränkt.
  • Glutathion-empfindliche Binder sind auch als Disulfid-Binder bekannt. Der entsprechende Mechanismus der Wirkstofffreisetzung beruht auf dem Unterschied zwischen der hohen intrazellulären Glutathionkonzentration (millimolarer Bereich) und der relativ niedrigen Glutathionkonzentration (mikromolarer Bereich) im Blut. Dies gilt insbesondere für Tumorzellen, wo ein niedriger Sauerstoffgehalt zu einer erhöhten Reduktase-Aktivität und damit zu höheren Glutathionspiegeln führt. Disulfidbindungen sind thermodynamisch stabil und weisen daher eine gute Stabilität im Plasma auf.
  • Enzym-instabile Binder, wie z.B. PeptidBinder, ermöglichen eine bessere Kontrolle der Wirkstofffreisetzung. Peptid-Binder können effektiv durch lysosomale Proteasen wie Cathepsin B oder Fibronektin gespalten werden (in einigen Tumorgeweben finden sich erhöhte Spiegel dieser Enzyme). Man geht davon aus, dass diese Peptidbindung aufgrund des ungeeigneten extrazellulären pH-Wertes sowie der Anwesenheit von Serumprotease-Inhibitoren im Plasmakreislauf sehr stabil ist, so dass die Proteasen normalerweise inaktiv sind. Aufgrund der hohen Stabilität des Plasmas sowie der günstigen intrazellulären Bruchselektivität und Potenz werden Enzym-instabile Binder weithin als brechbare Binder für Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet. Typische enzym-instabile Binder sind Val-Cit(vc), Phe-Lys und andere.
  • Eine Abstandhaltereinheit ist im Allgemeinen zwischen einem zerbrechlichen Binder und dem aktiven Wirkstoff eingebettet oder selbst Teil des zerbrechlichen Binders. Der Wirkmechanismus der Abstandhaltereinheit ist folgender: Wenn der zerbrechliche Binder unter geeigneten Bedingungen bricht, wird die Abstandhaltereinheit spontan strukturell neu angeordnet, wodurch der Wirkstoff, an dem sie befestigt ist, freigesetzt wird. Übliche solcher Abstandhaltereinheiten sind p-Aminobenzylalkohole (PABs) und β-Glucuronide, substituierte oder unsubstituierte Ethylendiamine usw.
  • Im vorliegenden Patent können die folgenden Abkürzungen verwendet werden, die so zu verstehen sind, dass sie die folgenden festen Bedeutungen haben: Boc: tert-Butoxycarbonyl; DCC: Dicyclohexylcarbodiimid; DCM: Dichlormethan; DIPEA: Diisopropylcarbodiimid; DMF: N, N-Dimethylformamid; DMAP: 4- (N, N-Dimethylamino)pyridin; HATU: (1-[Bis(dimethylamino)methylen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxid-hexafluorophosphat; HPLC: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie; PEG: Polyethylenglykol; TFA: Trifluoressigsäure; THF: Tetrahydrofuran; PBS: Phosphatpufferlösung (pH 7,0 bis 7,5).
  • Zu den pharmazeutisch verwendbaren Hilfsstoffen gehören alle Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien oder Hilfsstoffe wie Konservierungs- und Antioxidationsmittel, Füllstoffe, Sprengmittel, Netzmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel, Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungsmittel, antimikrobielle und antimykotische Mittel, Mittel zur verzögerten Absorption usw. Der Einsatz solcher Medien und Mittel mit pharmazeutisch wirksamen Substanzen ist in der Praxis gut bekannt. Neben der Unverträglichkeit zwischen jedem herkömmlichen Medium oder Reagenz mit dem Wirkstoff wurde auch dessen Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen berücksichtigt. Als eine geeignete Form der therapeutischen Kombination können auch ergänzende Wirkstoffe in diese Zusammensetzung eingearbeitet werden.
  • Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind die folgenden:
    1. 1. Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurestabilisierten Verbindungsstelle, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann die Austauschrate mit Albumin-Sulfhydrylgruppen in vivo erheblich reduzieren und die Plasmastabilität signifikant erhöhen.
    2. 2. Aufgrund des Einbaus einer Säuregruppe weist die durch die vorliegende Erfindung geschaffene säurestabilisierte Grenzfläche eine bessere Wasserlöslichkeit auf molekularer Ebene auf, wodurch die PK-Eigenschaften eines entsprechenden Antikörper-Wirkstoff-Konjugats, das in vivo eine bessere Wirksamkeit zeigt, wirksam verbessert werden.
    3. 3. Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurestabilisierten Verbindungsstelle, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, bietet nicht nur eine erhöhte Plasmastabilität, sondern verbessert auch die PK-Eigenschaften des endgültigen Konjugats, und diese Vorteile sind in der Lage, die Anforderungen einer höheren Wirkstoffbelastung voll zu erfüllen, indem die Aggregation von Antikörper-Wirkstoff-Konjugat bei einer hohen Wirkstoffbelastung reduziert wird und gleichzeitig eine bessere Wirksamkeit im Vergleich zu niedrigeren Wirkstoffbelastungen erzielt wird.
  • Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung in Verbindung mit konkreten Beispielen näher beschrieben, und es sollte verstanden werden, dass die genannten Beispiele nur zur Veranschaulichung der Erfindung dienen und nicht den Umfang der Erfindung einschränken sollen. Prüfverfahren, für die in den folgenden Beispielen keine spezifischen Bedingungen angegeben sind, wurden im Allgemeinen unter konventionellen Bedingungen oder unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Prozentsätze, Proportionen, Verhältnisse oder Anteile auf Gewichtsbasis angegeben. Sofern nicht anders definiert, sollen alle im folgenden Text verwendeten professionellen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutungen haben, die von Fachleuten allgemein verstanden werden. Darüber hinaus können alle Verfahren und Materialien bzw. Stoffe, die den beschriebenen ähnlich oder gleich sind, in den durch die vorliegende Erfindung gebildeten Verfahren angewandt werden. Die im folgenden Text beschriebenen bevorzugten Verfahren und Materialien bzw. Stoffe dienen nur zu Demonstrationszwecken.
  • Bei den folgenden Ausführungsformen der Erfindung wird im Allgemeinen wie folgt vorgegangen:
  • Allgemeines Vorgehen A
  • Nach einer Vorreinigung wurden Antikörpermoleküle mit einem Monomeranteil von mehr als 95 % mit Hilfe eines Ultrafiltrationszentrifugenröhrchens in Phosphatpuffer mit EDTA in einer Konzentration von 10 mg/ml ausgetauscht. TCEP in einer 10-fachen molaren Menge des Antikörpers wurde hinzugefügt und die resultierende Reaktion acht Stunden lang ablaufen gelassen. Die Disulfidbindungen zwischen den Antikörperketten wurden geöffnet, und die Anzahl der freien Sulfhydrylgruppen wurde mit Hilfe des Ellman-Verfahrens bestimmt, um festzustellen, ob alle Disulfidbindungen geöffnet wurden oder nicht. Als nächstes wurde die Zugabe einer molaren Menge, die 10-mal so groß wie die des Antikörpers ist, hinzugefügt und die resultierende Reaktion acht Stunden lang ablaufen gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde ein Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 30 KDa verwendet, um die Lösung in PBS auszutauschen, und die abgekoppelte Zugabe wurde entfernt.
  • Allgemeines Vorgehen B
  • Pharmakokinetische Studien
  • ELISA-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in Serum: Die Antikörperbeschichtung (2 ug/ml) wurde über Nacht bei 4°C durchgeführt, gefolgt von einem dreimal wiederholten PBST-Waschen und einer einstündigen Blockierung von 1% BSA+PBST bei 37°C; die Serumproben wurden inkubiert und dreimal mit PBST gewaschen; Detektionsantikörper (monoklonale Anti-Fc-Antikörper oder polyklonale Antikörper [HRP-markiert]) wurden eine Stunde bei 37°C inkubiert, dreimal mit PBST gewaschen und mit TMB entwickelt; danach wurden 2 M H2SO4 verwendet, um die Reaktion zu beenden, und Messungen wurden mit einem Mikro-Platten-Lesegerät durchgeführt.
  • Allgemeines Vorgehen C
  • Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)-Untersuchung
  • Die ADC-Analyse wurde mittels Hydrophober Interaktions Chromatographie (HIC) durchgeführt. Die Elution wurde mit 0 bis 100% mobiler Phase B (MPB) durchgeführt, wobei die mobile Phase A (MPA) aus 1,5 M Ammoniumsulfat und 0,025 M Natriumphosphat und die MPB aus 0,025 M Natriumphosphat und 25% Isopropanol bestand. Das Probenbeladungsvolumen betrug ungefähr 20µg, und die Gradientenelution war in 15 Minuten abgeschlossen. 280 nm UV wurde zum Nachweis verwendet, und je stärker die wassertransportierende Probe war, desto später wurde der Spitzenwert erzeugt.
  • Allgemeines Vorgehen D
  • Plasma-Stabilitätsstudien
  • Eine feste Menge der ADC-Probe wurde dem Humanplasma, für das bereits humanes IgG entfernt worden war, hinzugefügt, wobei jedes ADC-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung hergestellt wurde; anschließend wurde die Inkubation in einem 37°C warmen Wasserbad für 0 Stunden und 72 Stunden durchgeführt, wonach die ADC-Probe entfernt und 100 ul Protein A (MabSelect SuReTM LX Lot:#10221479GE, gewaschen mit PBS) zugegeben wurde; anschließend wurde die Adsorption unter Rühren auf einem Vertikalmischer zwei Stunden lang durchgeführt, gefolgt von Waschen und Elution, um inkubierte ADCs zu erhalten; die Plasmastabilität jeder inkubierten ADC-Probe wurde dann mittels RP-HPLC bestimmt.
  • Allgemeines Vorgehen E: Stellenspezifische Koppelung der OEZA
  • Nach einer Vorreinigung wurden Antikörpermoleküle mit einem Monomeranteil von mehr als 95 % mit Hilfe eines Ultrafiltrationszentrifugenröhrchens in Phosphatpuffer mit EDTA in einer Konzentration von 10 mg/ml ausgetauscht. TCEP in einer 10-fachen molaren Menge des Antikörpers wurde hinzugefügt und die resultierende Reaktion zwei Stunden lang ablaufen gelassen. Unter Verwendung eines Ultrafiltrationszentrifugenröhrchens zum Austausch der Lösung in pH 6,5-Phosphatpuffer wurde DHAA in einer molaren Menge, die das Zehnfache des Antikörpers beträgt, hinzugefügt und die resultierende Reaktion zwei Stunden lang ablaufen gelassen. Danach wurde eine Zugabe in der 3-fachen molaren Menge des Antikörpers zugegeben und die resultierende Reaktion vier Stunden lang ablaufen gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde ein Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 30 KDa verwendet, um die Lösung in PBS auszutauschen, und die entkoppelte Zugabe wurde entfernt, um ein ortsspezifisch gekoppeltes ADC (DAR = 2) zu erhalten.
  • Beispiel 1
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 1
  • Figure DE112018007259T5_0010
  • 50 g (S)-N-Benzyloxycarbonyl-N'-tert- Butoxycarbonyl-2,3-diaminopropionsäure wurden in 500 mL Dichlormethan gelöst, danach wurden 50 mL Trifluoressigsäure zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, woraufhin Ethylacetat hinzugefügt wurde, um den resultierenden Feststoff zu lösen, gefolgt von der Zugabe von Hexan und Rühren, um Feststoffe auszufällen, die filtriert und getrocknet wurden, um ein festes Produkt mit einem Gewicht von 21 g zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 239,1 (M+H)+
  • Beispiel 2
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 2
  • Figure DE112018007259T5_0011
  • 200 mL Benzylalkohol wurden in einen Reaktionskolben gegeben und Thionylchlorid (6,69 mL, 92,4 mmol) langsam tropfenweise in einem Wasserbad zugegeben; nachdem die tropfenweise Zugabe abgeschlossen war, wurde eine Stunde lang gerührt, gefolgt von der chargenweisen Zugabe von Zusammensetzung 1 (20 g, 84 mmol), und nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde Benzylalkohol über eine Ölpumpe unter vermindertem Druck abdestilliert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 150:1) abgetrennt, um 22 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 329,1 (M+H)+
  • Beispiel 3
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 3
  • Figure DE112018007259T5_0012
  • Zusammensetzung 2 (10 g, 30,4 mmol) wurde in 150 mL Acetonitril gelöst, Diisopropylethylamin (DIEA, 4,72 mL, 36,58 mmol) wurde hinzugefügt und tert-Butylbromacetat (4,75 g, 24.4 mmol) in einem Eiswasserbad tropfenweise zugegeben; nach der tropfenweisen Zugabe ließ man die Reaktion 30 Minuten lang ablaufen, bevor das Reaktionsgemisch zur weiteren Reaktion auf Raumtemperatur gebracht wurde, woraufhin eine TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 10:1) durchgeführt wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 100:1) abgetrennt, um 5,9 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 443,3 (M+H)+
  • Beispiel 4
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 4
  • Figure DE112018007259T5_0013
  • Zusammensetzung 3 (5,9 g, 13,3 mmol), 30 mL 1,4-Dioxan und 30 mL Wasser wurden in einen Reaktionskolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von DIEA (3,3 mL, 20 mmol) und der tropfenweisen Zugabe von Boc-Anhydrid (14,5 g, 66.7 mmol) bei Raumtemperatur; die resultierende Reaktionslösung war gelb, und man ließ die Reaktion nach der tropfenweisen Zugabe etwa 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen, wonach eine TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 30:1) durchgeführt wurde. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde Dioxan durch Konzentration unter vermindertem Druck entfernt und DCM zugegeben, um eine Extraktion durchzuführen, gefolgt von einer Konzentration unter vermindertem Druck, um ein gelbes öliges Rohprodukt zu erhalten; dieses wurde dann einer Trennung mittels Kieselgelsäulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 300:1) unterzogen, um 6,6 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+) : 443,3 (M+H)+-Boc, 543,2 (M+H)+
  • Beispiel 5
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 5
  • Figure DE112018007259T5_0014
  • 6,6 g von Zusammensetzung 4 wurden in 50 ml Methanol gelöst, 1,32 g von 5% Pd/C hinzugefügt und der Wasserstoffgasaustausch wurde zwei- bis dreimal durchgeführt, während die Mischung bei Raumtemperatur reagierte und die TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1) durchgeführt wurde. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung filtriert und unter reduziertem Druck bei 40°C konzentriert, um 4,4 g Produkt zu erhalten, das direkt in der nächsten Reaktion verwendet wurde.
  • Beispiel 6
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 6
  • Figure DE112018007259T5_0015
  • Zusammensetzung 5 (4,4 g, 13,8 mmol) wurde in 40 mL Eisessig gelöst, Maleinsäureanhydrid (2,71 g, 27,6 mmol) hinzugefügt und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde mittels TLC überwacht (DCM: MeOH = 3:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck konzentriert und der entstandene Rückstand mit einer HPLC-Flüssigphase gereinigt.
    (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 215 nm) .
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 90%A, 10 bis 25 min, 90 bis 45% A, 25 bis 55min, 45 bis 40%A
  • Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 43 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 1,51 g eines weißen Feststoffs zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 317,9 (M+H)+-Boc, 417,9 (M+H)+
  • Beispiel 7
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 7
  • Figure DE112018007259T5_0016
  • Zusammensetzung 6 (1,2 g, 2,88 mmol) wurde in 25 mL trockenem Toluol und 2,5 mL DMA-Lösung gelöst und Triethylamin (1,2 mL, 8,65 mmol) hinzugefügt (einige trockene Molekularsiebe können hinzugefügt werden), Stickstoffgasaustausch wurde durchgeführt und die Mischung wurde auf 120°C erhitzt, während die Reaktion mittels TLC überwacht wurde (Entwickler: DCM: MeOH = 3:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan:Methanol von 20:1 bis 10:1) getrennt, um 700 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 299,2 (M+H)+-Boc, 399,3 (M+H)+
  • Beispiel 8
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 8
  • Figure DE112018007259T5_0017
  • 700 mg (1,7 mmol) von Zusammensetzung 7 wurden in 3,5 mL DMF gelöst, danach wurden 531 mg (2,11 mmol) EEDQ und 733 mg (1,93 mmol) Val-Cit-PABOH zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter reduziertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan: Methanol von 50:1 bis 20:1) aufgetrennt, um 520 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+) : 660,3 (M+H)+-Boc, 760,4 (M+H)+
  • Beispiel 9
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 9
  • Figure DE112018007259T5_0018
  • 520 mg (0,685 mmol) von Zusammensetzung 8 und 1,04 g (3,42 mmol) NCP wurden nacheinander in einen Reaktionskolben gegeben, 10 mL DMF zur Auflösung der Feststoffe und 0,33 mL (2,05 mmol) DIEA wurden zugegeben, wonach die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen konnte. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan: Methanol = 30:1) aufgetrennt, um 530 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 825,3 (M+H)+-Boc, 925,2 (M+H)+
  • Beispiel 10
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 10
  • Figure DE112018007259T5_0019
  • 530 mg (0,57 mmol) von Zusammensetzung 9 und 13,5 mg (0,1 mol) HOBT wurden in 5 mL DMF gelöst, 0,17 mL (1,04 mmol) DIEA zugegeben, und nach 1 h Aktivierung bei Raumtemperatur wurden 373 mg (0,52 mmol) MMAE zugegeben und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die HPLC-Überwachung zeigte, dass das rohe Ausgangsmaterial MMAE vollständig reagiert hatte. Die Reinigung wurde mit einer HPLC-Flüssigphase durchgeführt.
    (Säule: YMC-C18, 50 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 50 mL/min, Nachweis bei λ = 205 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 90%A, 10 bis 25 min, 90 bis 45% A, 25 bis 55min, 45 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 34 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 200 mg des Produkts zu erhalten; LC-MS m/z (ES+): 1503,2 (M+H)+
  • Beispiel 11
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 11
  • Figure DE112018007259T5_0020
  • 70 mg von Zusammensetzung 10 wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan gelöst, 4 mL Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, gefolgt von einer Reinigung mittels HPLC.
    (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 25 mL/min, Nachweis bei λ = 205 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 95%A, 10 bis 30 min, 95 bis 80% A, 30 bis 50min, 80 bis 50%A
  • Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 33 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 34 mg des Produkts zu erhalten; LC-MS m/z (ES+): 1347,8 (M+H)+
  • Beispiel 12
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 12
  • Figure DE112018007259T5_0021
  • Di-tert-butyl-L-glutamat (8 g, 30,8 mmol) wurde in 150 mL Acetonitril gelöst, DIEA (6 mL, 37 mmol) wurde hinzugefügt und 2-Brom-N-(benzyloxycarbonyl)-L-alaninbenzylester (10,2 g, 26.1 mmol) in einem Eiswasserbad tropfenweise zugegeben; nach der tropfenweisen Zugabe ließ man die Reaktion 40 Minuten lang ablaufen, wonach die Reaktionslösung auf Raumtemperatur gebracht wurde und weiter reagieren konnte, während die TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 10:1) durchgeführt wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 100:1) abgetrennt, um 8,1. g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 571,2 (M+H)+
  • Beispiel 13
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 13
  • Figure DE112018007259T5_0022
  • 8,1 g der Zusammensetzung 12 (14,2 mmol), 50 mL 1,4-Dioxan und 50 mL Wasser wurden in einen Reaktionskolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von 3,5 mL DIEA (21,3 mmol) und der tropfenweisen Zugabe von 14,5 g Boc-Anhydrid (66,7 mmol) bei Raumtemperatur; die resultierende Reaktionslösung war gelb, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur zu Ende geführt, während der die TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 30:1) durchgeführt wurde. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde Dioxan durch Konzentration unter vermindertem Druck entfernt und DCM hinzugefügt, um eine Extraktion durchzuführen, gefolgt von einer Konzentration unter vermindertem Druck, um ein gelbes öliges Rohprodukt zu erhalten; dieses wurde dann einer Trennung mittels Kieselgelsäulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 300:1) unterzogen, um 8,55 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 471,1 (M+H)+-Boc, 571,3 (M+H)+
  • Beispiel 14
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 14
  • Figure DE112018007259T5_0023
    8,5 g von Zusammensetzung 13 wurden in 70 mL Methanol gelöst, 1,7 g von 5% Pd/C hinzugefügt und der Wasserstoffgasaustausch wurde zwei- bis dreimal durchgeführt, während die Mischung bei Raumtemperatur reagierte und die TLC-Überwachung (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1) durchgeführt wurde. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung filtriert und unter reduziertem Druck bei 40°C konzentriert, um 5 g Produkt zu erhalten, das direkt in der nächsten Reaktion verwendet wurde.
  • Beispiel 15
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 15
  • Figure DE112018007259T5_0024
  • 5 g (11,2 mmol) von Zusammensetzung 14 wurden in 40 mL Eisessig gelöst, 2,19 g (22,4 mmol) Maleinsäureanhydrid hinzugefügt und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde mittels TLC überwacht (DCM: MeOH = 3:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck konzentriert und der entstandene Rückstand mit einer HPLC-Flüssigphase gereinigt.
    (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 215 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 90%A, 10 bis 25 min, 90 bis 45% A, 25 bis 55min, 45 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 48 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 2,3 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 445,2 (M+H)+-Boc, 545,3 (M+H)+
  • Beispiel 16
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 16
  • Figure DE112018007259T5_0025
  • 2 g der Zusammensetzung 15 (2,88 mmol) wurden in 25 mL trockenem Toluol und 2,5 mL DMA-Lösung gelöst und 1,58 mL Triethylamin (11,4 mmol) zugegeben, der Stickstoffgasaustausch wurde durchgeführt und die Mischung wurde auf 120°C erhitzt, während die Reaktion mittels TLC überwacht wurde (Entwickler: DCM: MeOH = 3:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan:Methanol von 20:1 bis 10:1) getrennt, um 1,19 g Produkt zu erhalten; LC-MS m/z (ES+): 427,1 (M+H)+-Boc, 527,3 (M+H)+.
  • Beispiel 17
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 17
  • Figure DE112018007259T5_0026
  • 1,19 g (1,7 mmol) der Zusammensetzung 16 wurden in 3,5 mL DMF gelöst, danach wurden 531 mg (2,11 mmol) EEDQ und 733 mg (1,93 mmol) Val-Cit-PABOH zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan: Methanol von 50:1 bis 25:1) aufgetrennt, um 753 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 788,5 (M+H)+-Boc, 888,4 (M+H)+
  • Beispiel 18
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 18
  • Figure DE112018007259T5_0027
  • 753 mg (0,849 mmol) von Zusammensetzung 17 und 1,28 g (4,24 mmol) NCP wurden nacheinander in einen Reaktionskolben gegeben, 15 mL DMF zur Auflösung der Feststoffe und 0,35 mL (2,55 mmol) DIEA wurden zugegeben, wonach die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen konnte. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 5:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan:Methanol = 25:1) aufgetrennt, um 762 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1053,6 (M+H)+
  • Beispiel 19
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 19
  • Figure DE112018007259T5_0028
  • 762 mg (0,71 mmol) der Zusammensetzung 18 und 13,5 mg (0,1 mol) HOBT wurden in 8 mL DMF gelöst, 0,23 mL (1,42 mmol) DIEA zugegeben, und nach 1 h Aktivierung bei Raumtemperatur wurden 463 mg (0,645 mmol) MMAE zugegeben und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die HPLC-Überwachung zeigte, dass das rohe Ausgangsmaterial MMAE vollständig reagiert hatte. Die Reinigung wurde mit einer HPLC-Flüssigphase durchgeführt.
    (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 215 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 90%A, 10 bis 25 min, 90 bis 45% A, 25 bis 55 min, 45 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 30 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 300 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1631,6 (M+H)+
  • Beispiel 20
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 20
  • Figure DE112018007259T5_0029
  • 100 mg der Zusammensetzung 19 wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan gelöst, 4 mL Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, gefolgt von einer Reinigung mittels HPLC.
    (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 25 mL/min, Nachweis bei λ = 215 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 95%A, 10 bis 25 min, 95 bis 80% A, 25 bis 55min, 80 bis 55%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 30 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 45 mg des Produkts zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1419,1 (M+H)+
  • Beispiele 21 bis 29
  • Synthese der Zusammensetzungen 21 bis 29
  • Figure DE112018007259T5_0030
  • Beispiel 21
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 21
  • Figure DE112018007259T5_0031
  • 15 g 3-Nitro-4-Aminobenzoesäure wurden in 100 ml Methanol gelöst, 3 g 5%ige Pd/C hinzugefügt und fünf Stunden lang bei Atmosphärendruck hydriert und anschließend filtriert; der resultierende Filterkuchen wurde zweimal mit Methanol gewaschen, bei Raumtemperatur unter Hochvakuum weiter konzentriert, bis er trocken war, und ohne weitere Reinigung direkt in der nächsten Reaktion verwendet.
  • Beispiel 22
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 22
  • Figure DE112018007259T5_0032
  • 3,4-Diaminobenzoesäure (10 g, 65,7 mmol) wurde in 100 mL DMF gelöst, Kaliumcarbonatpulver (13,6 g, 98,55 mol) und Kaliumjodid (2,2 g, 1,31 mmol) wurden zugegeben, und tert-Bromessigsäure wurde unter Stickstoffgas tropfenweise zugegeben, woraufhin Butylester (12,8 g, 65,7 mol) tropfenweise zugegeben wurde, während die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen konnte. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 10:1). Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde Wasser zugegeben, eine Ethylacetat-Extraktion durchgeführt und der Extrakt mit der organischen Phase vereinigt; danach wurde mit gesättigter Sole gewaschen, anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert, und der resultierende Rückstand wurde einer Trennung mittels Kieselgel-Säulenchromatographie-Reinigung (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 150:1 bis 100:1) unterzogen, um 3,46 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 267,4 (M+H)+; 1H NMR: 7.51-7,53, dd, 1H: 7,44-7,45, d, 1H: 6,66-6,69, d, 1H; 4,69, s, 2H: 1,49, s, 9H.
  • Beispiel 23
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 23
  • Figure DE112018007259T5_0033
  • 3 g (11,2 mmol) der Zusammensetzung 22, 15 mL Eisessigsäure und Maleinsäureanhydrid (0,55 g, 5,6 mmol) Wasser wurden in einen Reaktionskolben gegeben, und die resultierende Reaktion wurde bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und mittels HPLC überwacht. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Konzentration unter reduziertem Druck durchgeführt, um die Eisessigsäure zu entfernen, und die Reinigung wurde durchgeführt. (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 bis 5 min 80%A, 5 bis 35 min, 80 bis 65%A, 35 bis 45min, 65 bis 60%A, die Fraktion mit einer Retentionszeit von 37 bis 42 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 2 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 365,4 (M+H)+, 309,3 (M+H)+-tBU. 1H-NMR: 10,48, s, 1H; 7,41-7,44, dd, 1H; 7,35-7,36, d, 1H; 6,92, s, 2H; 6,70-6,72, d, 1H; 4,68, s, 2H; 1,42, s, 9H.
  • Beispiel 24
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 24
  • Figure DE112018007259T5_0034
  • Die Zusammensetzung 23 (2 g, 5,49 mmol) wurde in 30 ml THF und Boc-Anhydrid (1,44 g, 6,59 mmol), DMAP (1,32 g, 10,9 mmol) und DIEA (1,8 mL, 10,98 mmol) gelöst und die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 10:1). Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Lösung mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 100:1 bis 20:1) getrennt, um 2,2 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+); 365,4 (M+H)+-Boc 1H NMR : 10,50, s, 1H; 7,46-7,48, dd, 1H; 7,41-7,42, d, 1H; 6,95, s, 2H; 6,73-6,75, d, 1H; 4,69, s, 2H; 1,48, s, 9H; 1,40, s, 9H.
  • Beispiel 25
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 25
  • Figure DE112018007259T5_0035
  • 2 g (4,31 mmol) von Zusammensetzung 24 wurden in 15 mL Toluol und 2 mL DMA gelöst, Triethylamin (1,2 mL, 8,62 mmol) hinzugefügt und die resultierende Reaktion bei 120°C ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde mittels TLC überwacht (DCM: MeOH = 10:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert, und der entstandene Rückstand wurde mit Hilfe einer säulenchromatographischen Kieselgelsäulenreinigung (Elutionsmittel: Dichlormethan:Methanol von 100:1 bis 50:1) getrennt, um 1 zu erhalten.63 g des Produkts; LC-MS m/z (ES+): 347,4 (M+H)+-Boc 1H NMR: 7,50-7,51, dd, 1H; 7,43-7,44, d, 1H; 6,97, s, 2H; 6,75-6,77, d, 1H; 4,67, s, 2H; 1,48, s, 9H; 1,40, s, 9H.
  • Beispiel 26
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 26
  • Figure DE112018007259T5_0036
  • 1,6 g (3,58 mmol) der Zusammensetzung 25 wurden in 10 mL DMF gelöst, danach wurden 1,77 g (7,17 mmol) EEDQ und 2,98 g (7,89 mmol) Val-Cit-PABOH zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 10:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter reduziertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan: Methanol von 100:1 bis 25:1) getrennt, um 2,1 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 709,8 (M+H)+-Boc, 809,7 (M+H) +.
  • Beispiel 27
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 127
  • Figure DE112018007259T5_0037
  • 2 g (2,47 mmol) der Zusammensetzung 26 und 3,71 g (12,3 mmol) NCP wurden nacheinander in einen Reaktionskolben gegeben, 20 mL DMF zur Auflösung der Feststoffe und 1,2 mL (7,41 mmol) DIEA wurden zugegeben, wonach die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen konnte. Die Überwachung erfolgte mittels TLC (Entwickler: DCM: MeOH = 15:1). Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert und der entstandene Rückstand mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Eluent: Dichlormethan: Methanol = 100:1) getrennt, um 2,1 g Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 973,3 (M+H)+
  • Beispiel 28
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 28
  • Figure DE112018007259T5_0038
  • 1 g (1 mmol) der Zusammensetzung 27 und 13,5 mg (0,1 mol) HOBT wurden in 8 mL DMF aufgelöst, 0,33 mL (2 mmol) DIEA zugegeben, und nach 1 h Aktivierung bei Raumtemperatur wurden 646 mg (0,9 mmol) MMAE zugegeben und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die HPLC-Überwachung zeigte, dass das rohe Ausgangsmaterial MMAE vollständig reagiert hatte. Die Reinigung wurde mit einer HPLC-Flüssigphase durchgeführt.
    (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 90%A, 10 bis 25 min, 90 bis 45% A, 25 bis 55 min, 45 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 30 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 560 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1551,7 (M+H)+
  • Beispiel 29
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 29
  • Figure DE112018007259T5_0039
  • 100 mg der Zusammensetzung 28 wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan gelöst, 4 mL Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen lassen, gefolgt von einer Reinigung mittels HPLC.
    (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 25 mL/min, Nachweis bei A = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 95%A, 10 bis 25 min, 95 bis 80% A, 25 bis 55 min, 80 bis 55%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 30 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 45 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1395,7 (M+H)+
  • Beispiele 30 bis 39
  • Synthese der Zusammensetzung 30 bis 39
  • Figure DE112018007259T5_0040
  • Beispiel 30
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 30
  • Figure DE112018007259T5_0041
  • Unter Verwendung eines 500-mL-Rundkolbens wurde Kaliumcarbonat (24,7 g, 179,24 mmol) in 220 mL reinem Wasser gelöst, woraufhin (S)-3-Amino-2-(benzyloxycarbonylamino)propionsäure (16 g, 67.16 mmol) zugegeben wurde und die Mischung bis zur fast vollständigen Auflösung gerührt wurde; anschließend wurde 2-Bromethyldiethylphosphat (10,98 g, 44,81 mmol) zugegeben, und nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung in ein Ölbad bei 80°C gegeben und sechs Stunden lang gerührt, bis die Reaktion abgeschlossen war. Die Reaktionsflüssigkeit wurde mit einer HPLC-Flüssigphase gereinigt. (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 15 min, 15%B, 15 bis 25 min, 15 bis 20%B, 25 bis 50 min, 20 bis 30%B, 50 bis 55 min, 30 bis 50%B, 55 bis 65 min, 50 bis 90%B. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 42 bis 49 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 8,38 g eines farblosen, öligen Produkts mit einer Ausbeute von 46,5% zu erhalten. 1H-NMR-Daten (CDC13, 400MHz): 7,39-7,28 (m, 5H), 6,54-6,41 (m, 1H), 5,12-5,01 (m, 2H), 4,63-4,53 (m, 1H), 4,16-4,03 (m,4H), 3.48-3,36 (m,2H), 3,35-3,25 (m,2H), 2,35-2,23 (m,2H), 1,29 (t, J = 6.8Hz, 6H) ; LCMS[M+H]+ m/z 403.3 (berechnet für C17H27N2O7P, 402.16).
  • Beispiel 31
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 31
  • Figure DE112018007259T5_0042
  • In einem 100-mL-Dreihalskolben wurde Zusammensetzung 30 (8,3 g, 20,85 mmol) mit 50 mL Dichlormethan-Lösungsmittel gelöst und die Lösung in einen auf 0°C eingestellten Niedertemperatur-Reaktor unter Stickstoffgas gegeben, woraufhin DIEA-Base (6,7 g, 52,11 mmol) unter Rühren tropfenweise unter Zugabe von Boc-Anhydrid (5.0 g, 22,935 mmol) über eine halbe Stunde tropfenweise zugegeben; sobald die tropfenweise Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur gebracht und 2 Stunden lang gerührt und die TLC-Überwachung durchgeführt, bis die Reaktion abgeschlossen war (Entwickler: DCM: MeOH = 4:1). Nachbearbeitung: Der Reaktionslösung wurde Wasser zugegeben, um sie dreimal zu waschen, die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert, und der entstandene Rückstand wurde mittels HPLC gereinigt. (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 min, 40%B, 0 bis 10 min, 40%B, 10 bis 20 min, 40 bis 45%B, 20 bis 30 min, 45%B, 30 bis 45min, 45 bis 80%B, 45 bis 50min, 80 bis 95%B. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 26 bis 29,5 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 4,02 g einer farblosen öligen Flüssigkeit mit einer Ausbeute von 38,3% zu erhalten. 1H-NMR-Daten (CDCI3, 400MHz): 7.36-7.28 (m, 5H) , 5.09(s, 2H), 4.63-4.43 (m, 1H), 4..14-4.01 (m, 4H), 3.92-3.65 (m, 2H), 3.61-3,29 (m, 2H), 2,34-1,95 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,36-1,22 (m, 6H); LCMS[M+H]+m/z 503,4 (berechnet für C22H35N2O9P, 502.21).
  • Beispiel 32
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 32
  • Figure DE112018007259T5_0043
  • In einem 150-mL-Rundbodenkolben wurden 50 mL Methanol verwendet, um die Zusammensetzung 31 (4,0 g, 8,0 mmol) zu lösen, danach wurden 800 mg Pd/C (mit 5% Pd) zugegeben und Wasserstoffgas ausgetauscht, danach wurde die Reaktionslösung vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt; die TLC-Überwachung (Entwickler: DCM:MeOH = 4:1) wurde durchgeführt, bis die Reaktion abgeschlossen war und die Reaktion gestoppt wurde. Zur Entfernung des Palladiumkohlenstoffs wurde eine organische Membranfiltration verwendet und die Konzentration unter reduzierter Pressung durchgeführt, wobei ein Rückstand entstand, der ohne Notwendigkeit einer Reinigung direkt in den nächsten Schritt geleitet wurde. LCMS[M+H]+m/Z 369,4 (berechnet für C14H29N2O7P, 368,17).
  • Beispiel 33
  • Zubereitung der Zusammensetzung 33
  • Figure DE112018007259T5_0044
  • In einem 100-mL-Rundbodenkolben wurden 30 mL Eisessig zur Auflösung der ungereinigten Zusammensetzung 32 zugegeben, danach Maleinsäureanhydrid (1,57 g, 16,0 mmol) unter Rühren zugegeben und die Reaktion über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Am nächsten Tag wurde die Reaktion gestoppt, und die Eisessigsäure wurde durch Konzentration unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C entfernt; der entstandene Rückstand wurde dann mittels HPLC gereinigt. (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 min, 5%B, 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 20 min, 15 bis 30%B, 20 bis 35 min, 30 bis 55%B, 35 bis 45 min, 55%B, 45 bis 55 min, 55 bis 80%B, 55 bis 60 min, 80 bis 98%B. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 25 bis 26,5 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 3,35 g einer öligen Substanz zu erhalten, für eine zweistufige Ausbeute von 90%. 1H-NMR-Daten (CDC13, 400MHz): 6,40 (d, J=12Hz, 1H), 6,35 (d, J=12Hz, 1H), 4,96 bis 4,82 (m,1H), 4,19-3,99 (m, 4H), 3,98-3,61 (m, 2H), 3,60-3.36 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,33 (t, J=7.0Hz, 3H), 1,32 (t, J=7.0Hz, 3H); LCMS[M+H]+m/z 467.3 (berechnet für C18H31N2O10P, 466.17).
  • Beispiel 34
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 34
  • Figure DE112018007259T5_0045
  • In einem 100-mL-Rundbodenkolben wurde die Zusammensetzung 33 (3,3 g, 7,07 mmol) mit 40 mL Toluol und 4 mL DMA unter Rühren gelöst, danach wurde Triethylamin (2,1 g, 21,2 mmol) zugegeben, eine Wasserfalle und ein Rückflusskühler installiert und die Reaktion unter Rückflussbedingungen und Rühren bei 120°C für 3 Stunden ablaufen gelassen, bis die TLC-Überwachung zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war (Entwickler: DCM:MeOH = 4:1). Nachbearbeitung: Die Reaktionslösung wurde unter reduziertem Druck bei 45°C konzentriert, um Toluol zu entfernen, und der entstandene Rückstand wurde mittels HPLC gereinigt. (Säule: YMC-C18, 100 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 200 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 min, 5%B, 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 20 min, 15 bis 30%B, 20 bis 35 min, 30 bis 55%B, 35 bis 45 min, 55%B, 45 bis 55 min, 55 bis 80%B, 55 bis 60 min, 80 bis 98%B. Die Fraktion mit einer Verweilzeit von 27 bis 29 min wurde gesammelt und lyophilisiert, um 2,12 g eines weißen pulverförmigen Feststoffs (der schnell Feuchtigkeit aus der Luft aufnahm und zu einem viskosen Ö1 wurde) mit einer Ausbeute von 67% zu erhalten. LCMS[M+H]+m/z 449,3 (berechnet für C18H29N2O9P, 448,16).
  • Beispiel 35
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 35
  • Figure DE112018007259T5_0046
  • Ein 100-mL-Rundbodenkolben, der die Zusammensetzung 34 (2,1 g, 4,69 mmol) enthielt, wurde mit einer Ölpumpe entleert, 20 mL trockenes DMF hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde bis zur vollständigen Auflösung gerührt; dann wurde DIEA (1,8 g, 14,07 mmol) hinzugefügt, gefolgt von EDCI (1,81 g, 9.38 mmol) und HoAt (1,28 g, 9,38 mmol), und die aktivierte Zusammensetzung wurde fünfeinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, danach wurde Zusammensetzung 6 (2,66 g, 7,03 mmol) hinzugefügt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt, bevor sie am nächsten Tag gestoppt wurde. Nach der Verarbeitung: Das DMF-Lösungsmittel wurde durch Konzentration unter vermindertem Druck bei 45°C mit einer Ölpumpe entfernt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 20:1 bis 10:1 bis 5:1) gereinigt, um 1,01 g eines weißen pulverförmigen Feststoffs mit einer Ausbeute von 26,6% zu erhalten. LCMS[M+H]+m/z 810,4 (berechnet für C36H56N7O12P, 809,37).
  • Beispiel 36
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 36
  • Figure DE112018007259T5_0047
  • In einem 50-mL-Rundbodenkolben wurden 15 mL trockenes DMF verwendet, um Zusammensetzung 35 (1,0 g, 1,24 mmol) unter Rühren aufzulösen, danach DIEA (961 mg, 7,44 mmol) und NPC (1,88 g, 6.2 mmol) zugegeben wurden und das Reaktionsgemisch über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur reagieren ließ; am Morgen des nächsten Tages zeigte die TLC-Überwachung, dass die Reaktion abgeschlossen war (Entwickler: Dichlormethan:Methanol = 5:1), und die Reaktion wurde gestoppt. Nachbearbeitung: Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck mit einer Ölpumpe bei 45°C konzentriert, und der entstandene Rückstand wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Entwickler: Dichlormethan: Methanol = 6:1) gereinigt, um 1,02 g eines weißen pulverförmigen Feststoffs mit einer Ausbeute von 84,5% zu erhalten. LCMS [M+H] +m/z 975,3 (berechnet für C43H59N8O16P, 974,38).
  • Beispiel 37
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 37
  • Figure DE112018007259T5_0048
  • In einem 100-mL-Rundbodenkolben wurden 10 mL trockenes DMF verwendet, um die Zusammensetzung 36 (1,0 g, 1,03 mmol) aufzulösen. Danach wurden HoBt (28 mg, 0,21 mmol) und DIEA (266 mg, 2,06 mmol) zugegeben und die resultierende Reaktion eine halbe Stunde lang unter Rühren ablaufen gelassen; anschließend wurde MMAE (740 mg, 1,03 mmol) zugegeben und die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Nach der Verarbeitung: Die Reaktionslösung wurde mittels Flüssigphasenpräparation gereinigt. (Säule: YMC-C18, 50 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 50 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 min, 5%B, 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 20 min, 15 bis 30%B, 20 bis 35 min, 30 bis 55%B, 35 bis 45 min, 55 bis 70%B, 45 bis 55 min, 70%B, 55 bis 60 min, 70 bis 98%B.
  • Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 38 bis 40 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 320 mg eines weißen, pulverförmigen Feststoffs mit einer Ausbeute von 20% zu erhalten. LCMS[M+H]+m/z 1553,8 (berechnet für C76H121N12020P, 1552,85).
  • Beispiel 38
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 38
  • Figure DE112018007259T5_0049
  • Die Zusammensetzung 37 (260 mg, 0,17 mmol) wurde in einem 25-mL-Rundkolben mit 5 mL destilliertem Dichlormethan aufgelöst, danach wurde Bromtrimethylsilan (78 mg, 0.51 mmol) in einem Eisbad unter Stickstoffgas zugegeben wurde; die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren ablaufen gelassen und am nächsten Morgen 1 mL Methanol zugegeben, woraufhin die Reaktion eine Stunde lang unter Rühren bei Raumtemperatur ablaufen ließ und eine Flüssigphasenanalyse durchgeführt wurde, um zu bestätigen, dass Zusammensetzung 37 vollständig reagiert hatte. Nach der Verarbeitung: Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert, und der entstandene Rückstand wurde mittels HPLC gereinigt. (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 25 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 min, 5%B, 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 20 min, 15 bis 30%B, 20 bis 35 min, 30 bis 55%B, 35 bis 45 min, 55 bis 70%B, 45 bis 55 min, 70%B, 55 bis 60 min, 70 bis 98%B.
  • Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 20 bis 23 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 140 mg eines weißen, pulverförmigen Feststoffs mit einer Ausbeute von 55% zu erhalten.
  • Beispiel 39
  • Zubereitung von Zusammensetzung 39
  • Figure DE112018007259T5_0050
  • In einem 25-mL-Rundkolben wurden 2 mL Dichlormethan verwendet, um die Zusammensetzung 38 (120 mg, 0,08 mmol) unter Rühren aufzulösen. Danach wurden 800 Mikrol Trifluoressigsäure tropfenweise in einem Eisbad zugegeben; nach der tropfenweisen Zugabe wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur gebracht und die Reaktion unter Rühren eine Stunde lang bis zum Abschluss der Reaktion fortgesetzt. Nachbehandlung: Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der entstandene Rückstand wurde mittels HPLC gereinigt. (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Flussrate 25 mL/min, Nachweis bei λ = 214 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
  • Gradient: 0 min, 5%B, 0 bis 10 min, 5 bis 15%B, 10 bis 20 min, 15 bis 30%B, 20 bis 35 min, 30 bis 55%B, 35 bis 45 min, 55 bis 70%B, 45 bis 55 min, 70%B, 55 bis 60 min, 70 bis 98%B.
  • Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 18 bis 19,5 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 55 mg eines weißen, pulverförmigen Feststoffs mit einer Ausbeute von 49% zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1397,8 (M+H) +
  • Beispiel 40
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 40
  • Figure DE112018007259T5_0051
  • Zusammensetzung 7 (332 mg, 0,836 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan gelöst, Pentafluorphenol (184 mg, 1 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (2 mmol) wurden zugegeben, und es wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bis Zusammensetzung 7 eliminiert war. MMAF (460 mg, 0,585 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,27 mL, 1,67 mmol) wurden zugegeben und in 15 mL trockener Dichlormethanlösung gelöst, und die resultierende Reaktion wurde bei Raumtemperatur vier Stunden lang unter Stickstoffgas ablaufen gelassen. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und der resultierende Rückstand wurde einer Trennung mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 50:1) unterzogen, um 290 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1168,8 (M+H)+
  • Beispiel 41
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 41
  • Figure DE112018007259T5_0052
  • 100 mg der Zusammensetzung 39 wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan gelöst, 4 mL Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen lassen, gefolgt von einer Reinigung mittels HPLC.
    (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 25 mL/min, Nachweis bei λ = 215 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 95%A, 10 bis 25 min, 95 bis 70% A, 25 bis 55min, 70 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 33 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 50 mg des Produkts zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 956,6 (M+H)+
  • Beispiel 42
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 42
  • Figure DE112018007259T5_0053
  • Zusammensetzung 16 (400 mg, 0,76 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan gelöst, Pentafluorphenol (184 mg, 1 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (2 mmol) wurden zugegeben, und es wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bis Zusammensetzung 16 eliminiert war. MMAF (389 mg, 0,49 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,25 mL, 1,52 mmol) wurden zugegeben und in 15 mL trockenem Dichlormethan gelöst, und die resultierende Reaktion wurde bei Raumtemperatur vier Stunden lang unter Stickstoffgas ablaufen gelassen. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und der resultierende Rückstand wurde einer Trennung mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (Elutionsmittel: Dichlormethan: Methanol = 50:1) unterzogen, um 330 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1296,8 (M+H)+
  • Beispiel 43
  • Vorbereitung von Zusammensetzung 43
  • Figure DE112018007259T5_0054
  • 100 mg der Zusammensetzung 41 wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan gelöst, 4 mL Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, gefolgt von einer Reinigung mittels HPLC.
    (Säule: YMC-C18, 30 mm × 450 mm, 10 µm, Acetonitril/Wasser (0,2% TFA), Durchflussrate 25 mL/min, Nachweis bei X = 215 nm)
    Lösungsmittel A: 0,2% TFA-Wasser
    Lösungsmittel B: Acetonitril
    Gradient: 0 bis 10 min, 95%A, 10 bis 25 min, 95 bis 70% A, 25 bis 55min, 70 bis 40%A
    Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 30 Minuten wurde gesammelt und lyophilisiert, um 48 mg Produkt zu erhalten. LC-MS m/z (ES+): 1028,5 (M+H)+
  • Beispiel 44
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-11 wurde nach dem allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 7,2 betrug.
  • Beispiel 45
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-20 wurde nach dem allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 7,2 betrug.
  • Beispiel 46
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-29 wurde nach der allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 6,8 betrug.
  • Beispiel 47
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-39 wurde nach der allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 7,0 betrug.
  • Beispiel 48
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-41 wurde nach der allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 7,5 betrug.
  • Beispiel 49
  • Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat H-43 wurde nach der allgemeinen Vorgehen B hergestellt, und die Umkehrphasen-HPLC zeigte, dass das durchschnittliche Wirkstoff/Antikörper-Verhältnis (DAR) 7,7 betrug.
  • Beispiel 50
  • Die Synthese wurde fortgesetzt, um die folgenden Wirkstoff-Anbindungs-Binder zu erhalten:
    Figure DE112018007259T5_0055
    Figure DE112018007259T5_0056
    wobei Ac für eine nicht-basische Aminosäure oder ein Oligopeptid steht und die Aminogruppe in der Aminosäure mit einer Alkylgruppe verbunden ist; n = 1,2, 3...;
  • Die folgende Tabelle 1 fasst die Synthese und die Eigenschaften von Wirkstoff-Anbindungen, die verschiedene Aminosäuren und Oligopeptide enthalten, zusammen. In der Tabelle ist in der ersten Spalte von links die Nummer der Zusammensetzung, in der zweiten Spalte die Klasse der Aminosäure, in der dritten Spalte der Wert von n, in der vierten Spalte die allgemeine Syntheseverfahren und in der fünften und sechsten Spalte die berechnete und massenspektrometrisch bestimmte Masse der Wirkstoff-Anbindungen angegeben. Tabelle 1
    Nummer der Zusammensetzung Anbindung SyntheseVerfahren Theoretisches Molekulargewicht Tatsächliches Molekulargewicht
    Aminosäure Ac n Wert
    42 Gly 2 Allgemeine Formel I 1360.7 1360.3
    43 Ala 1 Allgemeine Formel II 969.5 969.2
    44 Phe 1 Allgemeine Formel II 1045.6 1045.8
    45 Trp 1 Allgemeine Formel I 1452.7 1452.8
    46 Asp 2 Allgemeine Formel I 1418.7 1418.5
    47 Ser 2 Allgemeine Formel II 999.5 999.4
    48 Val 1 Allgemeine Formel II 997.5 999.6
    49 Pyrazol 2 Allgemeine Formel I 1470.7 1470.5
    50 Für 1 Allgemeine Formel II 1023.5 1023.3
    51 Gly-Ala 1 Allgemeine Formel I 1431.4 1431.4
  • Abkürzungen:
    • Gly: L-Glycin, Ala: L-Alanin, Phe: L-Phenylalanin, Trp: L-Tyrosin, Asp: L-Asparaginsäure, Ser: L-Serin, Val: L-Valin
    Figure DE112018007259T5_0057
  • Beispiele 52 bis 56
  • Zur Bewertung der Stabilität, Hydrophilie und pharmakologischen Aktivität von ADCs, die unter Verwendung einer säurebildenden Selbststabilisierungs-Anbindungen hergestellt wurden, haben wir nach den Beispielen Wirkstoff-Anbindungs-Bindungen mit säurebildenden Stabilisierungs-Abindungen hergestellt. Diese Bindungen hatten alle eine säurebildende Stabilisierungsstelle, die über einen spaltbaren oder nicht spaltbaren Binder mit dem zytotoxischen Wirkstoff MMAE oder MMAF verbunden war. Zum Vergleich wurde eine typische nicht-selbststabilisierende Wirkstoff-Anbindungs-Bindung bzw. drug-junction linkage (im Folgenden als MC-VC-PAB-MMAE bezeichnet) nach den in der Literatur angegebenen Verfahren und eine Wirkstoff-Anbindungs-Bindung mit einer grundlegenden selbststabilisierenden Anbindung, wie sie im aktuellen Patent beschrieben ist (im Folgenden als DPR-VC-PAB-MMAE bezeichnet), erhalten.
    Figure DE112018007259T5_0058
    Figure DE112018007259T5_0059
  • Beispiel 52: Plasma-Stabilität in vitro
  • Die Ergebnisse der Plasmastabilitätsstudien, die nach dem im allgemeinen Vorgehen D beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden, waren in der nachstehenden Tabelle aufgeführt: ADCs mit säurebildenden Stabilisierungs-Anbindungen verloren während der Plasmainkubation fast kein Wirkstoff, wohingegen die typischen MC-Anbindungs-ADCs nach 72 Stunden Inkubation eine sehr signifikante Reduktion der DAR zeigten. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass eine säurebildende Stabilisierungs-Anbindung die Plasmastabilität von ADCs signifikant verbessern kann.
    Zielkonjugat 0 h DAR 72 h DAR
    H-11 7.2 6.8
    H-20 7.2 7.1
    H-29 6.8 6.4
    H-39 7.0 6.8
    H-41 7.5 6.9
    H-43 7.7 6.4
    MC-VC-PAB-MMAE 7.2 2.3
  • Beispiel 53: SEC-HPLC-Erkennung
  • Die durch Konjugation gewonnenen ADC-Proben wurden fünf Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde zur Analyse entnommen.
    • Instrument: Gewässer e2695 (2489UV/Vis)
    • Chromatographie-Säule: TSKgel G3000SWXL (7,8 × 300 mm, 5 µm)
    • Mobile Phase: A: 50 mM PB, 300 mM NaCl, 200 mM Arg, 5% IPA, pH 6,5
  • Die mobile Phase A wurde 30 Minuten lang isokratisch eluiert; Flussrate: 0,714 ml/min, Säulentemperatur: 25°C, Detektionswellenlänge: 280 nm.
  • Der Aggregationsgrad jedes ADCs wurde mittels SEC-HPLC und SEC-HPLC-Peak-Plots erhalten, die in den 2A bis 2H dargestellt sind; die entsprechenden Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, wobei die Monomerrate bei ADCs, die eine säurebildende Stabilisierungs-Anbindung enthielten, signifikant erhöht und der Aggregationsgrad signifikant reduziert wurde.
    Zielkonjugat Monomer-Verhältnis Aggregationsrate
    H-11 96.25% 3.75%
    H-20 98.85% 1.15%
    H-29 98.26% 1.74%
    H-39 98.86% 1.14%
    H-41 97.02% 2.98%
    H-43 96.54% 3.46%
    MC-VC-PAB-MMAE 67.51% 32.46%
    DPR-VC-PAB-MMAE 79.10% 20.90%
  • Beispiel 54
  • In-vivo-PK-Experimente an der Maus
  • Die PK-Eigenschaften von ADCs (mit einer Belastung von 8) wurden mit Hilfe eines Mausmodells bestimmt. Der Wirkstoff wurde durch eine einzige intravenöse Injektion in das Hinterteil in einer Dosis von 2 mg/kg verabreicht, und die Gesamtantikörperkonzentration (Total Ab) im Blut wurde nach dem allgemeinen Vorgehen B bestimmt; die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die Ergebnisse des Experiments zeigen, dass in einem Mausmodell die säurebildenden Stabilisierungs-Anbindungs-ADCs signifikant verbesserte PK-Eigenschaften zeigten, wobei die Gesamtantikörper über einen längeren Zeitraum in einer höheren Konzentration gehalten wurden.
  • Beispiel 55
  • Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)-Untersuchung
  • Nach vollständiger Reduktion des IgG1-Antikörpers auf 8 Thiole pro Antikörper gemäß dem allgemeinen Vorgehen A wurden entsprechende Antikörper-Wirkstoff-Konjugate durch unspezifische Kopplung hergestellt. ADCs mit säurebildenden Stabilisierungs-Anbindungen und herkömmliche ADCs (d.h. MC-VC-PAB-MMAE) mit acht Wirkstoffeinheiten pro Antikörper wurden weiter aufgetrennt und mittels hydrophober Interaktionschromatographie aufgereinigt, und es wurde eine ADC-Analyse nach dem allgemeinen Vorgehen C durchgeführt. ADCs mit größerer Hydrophobie oder größeren Wirkstoff/Molekül-Verhältnissen, die bei späteren Retentionszeiten eluiert wurden, wurden verwendet. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt: ADCs mit säurebildenden Anbindungen zeigten relativ kurze Retentionszeiten bei der HIC, wobei das Antikörperkonjugat MC-VC-PAB-MMAE die längste Retentionszeit zeigte. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass ADC-Moleküle mit einer säurebildenden Stabilisierungs-Anbindung eine bessere Hydrophilie aufweisen.
  • Beispiel 56
  • In-vivo-Wirksamkeitsexperimente für Arzneimittel (Zellproliferationstest)
  • Humane Adenokarzinomzellen des Pankreas (BxPc3) wurden in vitro kultiviert und subkutan in den Rücken von BALB/c-Nacktmäusen bei einer Inokulationszellzahl von 5 × 106 inokuliert. Nachdem die Tumore auf 100 bis 200 mm3 angewachsen waren, wurden die Tiere gruppiert und erhielten eine Einzeldosis ADC von 3 mg/kg (injiziert über die Schwanzvene), während gleichzeitig eine Vehikel-Kontrollgruppe etabliert wurde; Die Mäuse wurden regelmäßig gewogen und das Tumorvolumen gemessen, und die Wirksamkeit des Wirkstoffs im Hinblick auf das BxPc3-Modell wurde bewertet, indem die Wirksamkeit der ADCs zur Tumorunterdrückung sowie andere Indikatoren untersucht wurden. Die experimentellen Ergebnisse sind in den 5 und 6 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass ADCs mit einer säurebildenden Stabilisierungs-Anbindung eine ähnliche Wirksamkeit wie Dpr-MC-VC-PAB-MMAE bei DAR=2 aufweisen und in dieser Hinsicht Mc-VC-PAB-MMAE signifikant überlegen sind. Bei einer hohen Wirkstoffzugabe von DAR = 8 zeigten dieselben ADCs eine gute Wirksamkeit in einem BxPc3-Tumormodell für die subkutane Transplantation von Mäusen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2016025752 [0006]
    • US 20130309256 [0007, 0011]
    • WO 2015057699 [0007]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
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Claims (17)

  1. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon, wie in Formel I gezeigt:
    Figure DE112018007259T5_0060
    wobei: der Kreis ein Gerüst darstellt, wobei das Gerüst eine C1-8-Alkylidengruppe, eine C1-8-Heteroalkylidengruppe, eine C6-10-Arylidengruppe oder eine C4-10-Heteroarylidengruppe aufweist; L einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Protein aufweist; M eine Succinimidgruppe oder eine hydrolytische Succinimidgruppe mit geöffnetem Ring aufweist; Ac über eine Aminogruppe mit dem Gerüst verbunden ist, wobei Ac eine säurebildende Einheit aufweist, die zur Stabilisierung des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats dient, und wobei Ac ein Fragment aufweist, das aus mindestens einer Aminogruppe und mindestens einer säurebildenden Gruppe, oder einer Oligopeptidgruppe besteht, die aus einer Vielzahl von Aminosäureeinheiten besteht; D eine Wirkstoffeinheit aufweist; A einen Binder aufweist; m eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; und n 1 oder 2 ist.
  2. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei der Antikörper einem Antikörper für einen Zelloberflächenrezeptor und ein tumorassoziiertes Antigen entspricht.
  3. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die säurebildende Einheit von Ac aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Carbonsäure-, Phosphorsäure-, Phosphit- und Sulfonsäuregruppen besteht.
  4. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei Ac eine säurebildende Aminosäuregruppe oder eine säurebildende Oligopeptidgruppe umfaßt.
  5. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 4, wobei die Oligopeptidgruppe 2 bis 5 natürliche Aminosäureeinheiten, 2 bis 5 unnatürliche Aminosäureeinheiten oder 2 bis 5 natürliche und unnatürliche Aminosäureeinheiten umfasst.
  6. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Heteroalkylidengruppe ein oder mehrere Heteroatome aufweist, die aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus O-, S-, N- oder P-Atomen besteht; wobei die Arylidengruppe aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Phenyl, Naphthyl oder Diphenyl besteht; wobei die Heteroarylidengruppe aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Pyridyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Indolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Isothiazolyl, Pyrazolyl, Indazolyl, Pteridyl, Imidazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiadiazolyl, Pyrrol, Thiazolyl, Furanyl und Thiophen besteht.
  7. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei A einen spaltbaren Binder oder einen nichtspaltbaren Binder umfasst.
  8. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Wirkstoff-Einheit D einen zytotoxischen Wirkstoff, einen Wirkstoff zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder einen entzündungshemmenden Wirkstoff umfasst.
  9. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 8, wobei die Wirkstoff-Einheit D aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Maitansin-Wirkstoffen, Australin-Wirkstoffen, Benzodipyrrol-Wirkstoffen, Pyrrolozodiazol-Wirkstoffen, Amantin- und Camptothecin-Zusammensetzungen, deren pharmazeutisch verwertbaren Salzen oder Derivaten davon besteht.
  10. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 7, wobei A eine Struktur wie in der folgenden Formel gezeigt hat:
    Figure DE112018007259T5_0061
    wobei C eine erweiterbare Einheit am Ende darstellt, E eine spaltbare Einheit darstellt, F eine Abstandseinheit darstellt, die Indizes e und f jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, die Wellenlinie auf der linken Seite eine Verbindungsstelle zum Gerüst und die Wellenlinie auf der rechten Seite eine Verbindungsstelle zur Wirkstoffeinheit darstellt.
  11. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 10, wobei E so konfiguriert ist, dass es durch eine tumorassoziierte Protease oder unter einem sauren pH-Wert von der Wirkstoffeinheit D oder der Abstandseinheit F abgespaltet wird.
  12. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 10, wobei F aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus p-Aminobenzylalkohol, Ethylendiamin-Einheiten und deren Derivaten besteht.
  13. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 6, wobei das Gerüst C1-8-Alkyliden oder C1-8-Heteroalkyliden aufweist.
  14. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 13, wobei das Gerüst ein C1-3-Alkyliden aufweist.
  15. Antikörper-Wirkstoff-Konjugat oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon nach Anspruch 1, wobei Ac aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus (D/L)-Glycin, (D/L)-Alanin, (D/L)-Leucin, (D/L)-Isoleucin, (D/L)-Valin, (D/L)-Phenylalanin, (D/L) Prolin, (D/L) Tryptophan, (D/L) Serin, (D/L) Tyrosin, (D/L) Cystein, (D/L) Methionin, (D/L) Asparagin, (D/L) Glutamin, (D/L) Threonin, (D/L) Asparaginsäure, (D/L) Glutaminsäure oder den folgenden Strukturformeln besteht:
    Figure DE112018007259T5_0062
    wobei eine Wellenlinie eine Verknüpfungsstelle zum Gerüst darstellt und R eine beliebige Struktur zwischen einer Aminogruppe und einer Phosphatgruppe darstellt.
  16. Anbindungs-Wirkstoff-Bindung mit der folgenden Struktur:
    Figure DE112018007259T5_0063
    wobei Ac über eine Aminogruppe an die Kohlenwasserstoffgruppe gebunden ist, und wobei Ac ein Fragment aufweist, das aus mindestens einer Aminogruppe und mindestens einer säurebildenden Gruppe, oder einem Oligopeptid besteht, das aus einer Vielzahl von Aminosäureeinheiten besteht; D eine Wirkstoffeinheit aufweist; A einen Binder aufweist; q eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist, und n 1 oder 2 ist.
  17. Verfahren zur Verwendung des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats oder eines pharmazeutisch verwertbaren Salzes davon nach Anspruch 1, aufweisend die Schritte: Herstellung eines Wirkstoffs zur Behandlung von Krebs, Immunkrankheiten oder Entzündungen durch Einnahme des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats oder eines pharmazeutisch verwertbaren Salzes davon nach Anspruch 1.
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