WO2020234541A1 - Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie - Google Patents

Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie Download PDF

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drug
cytotoxic
mcsaf
drug conjugate
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Christine BALTUS
Ludovic JUEN
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Definitions

  • the present invention relates to useful cytotoxic conjugates
  • the present invention also relates to new conjugates
  • antibody-drugs comprising an antibody directed against the HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) antigen coupled to a cytotoxic drug and their use as a drug, in particular in anti-cancer therapy.
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • An antibody-drug conjugate (in English "Antibody Drug Conjugate” or “ADC”) constitutes a means of selective delivery of a cytotoxic drug.
  • ADC Antibody Drug Conjugate
  • the antibody-drug conjugate therefore makes it possible to combine the specificity of targeting by the antibodies with new powerful effector functions by the agents which are conjugated to them.
  • the general structure of an antibody-drug conjugate is that of formula (II).
  • the part that binds the antibody and the drug is called a linker arm or linker. It can be grafted onto the antibody via at least one of the eight cysteines forming the 4 inter-chain disulfide bridges.
  • the number of cytotoxic drug molecules grafted onto the antibody determines a ratio called the Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
  • DAR Drug-to-Antibody Ratio
  • the antibody After binding to its target antigen, the antibody is internalized in the cell by endocytosis mediated by receptors. The vesicles fuse with lysosomes where the cytotoxic drug is released from the antibody via different mechanisms. The active cytotoxic drug then acts directly on the cell causing it to die and sometimes on neighboring cancer cells by transport or diffusion in the environment.
  • the antibody is therefore mainly used as a vector and delivers the cytotoxic drug into the cell.
  • cytotoxic agents including Monomethyl auristatin E (MMAE).
  • MMAE Monomethyl auristatin E
  • vedotin This cytotoxic drug has been used with various monoclonal antibodies for the preparation of antibody-drug conjugates.
  • MMAE Monomethyl auristatin E
  • vedotin This cytotoxic drug has been used with various monoclonal antibodies for the preparation of antibody-drug conjugates.
  • MMAE was conjugated with Trastuzumab as described in the document Bryant et al., Mol. Pharmaceutics, 2015, 12 (6), pp 1872-1879). However, the efficacy of Trastuzumab-MMAE described in this document is not
  • a first subject of the invention relates to a cytotoxic conjugate of formula (I) below:
  • the attachment head is represented by any one of the following two formulas:
  • the link arm is a cleavable link arm chosen from the formulas following:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • X is Br, Cl, I or F
  • n is an integer ranging from 1 to 10, preferably equal to 4 or 5.
  • a second object of the invention relates to an antibody-drug conjugate of formula (II) below:
  • A is an anti-HER2 antibody or antibody fragment
  • the attachment head is represented by any one of the following two formulas:
  • the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • n is an integer ranging from 1 to 10, preferably equal to 4 or 5;
  • n is an integer ranging from 1 to 4.
  • a third subject of the invention relates to a composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) according to the invention.
  • a fourth subject of the invention relates to an antibody-drug conjugate according to the invention or a composition according to the invention, for use as a drug.
  • a fifth subject of the invention relates to an antibody-drug conjugate according to the invention or to a composition according to the invention, for use in the treatment of HER2 + cancer.
  • a sixth object of the invention relates to a process for preparing a cytotoxic conjugate according to the invention comprising a step which consists in coupling a bonding head of formula:
  • the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • X is Br, Cl, I or F
  • n is an integer ranging from 1 to 10, preferably equal to 4 or 5.
  • the process for preparing a cytotoxic conjugate according to the invention comprises a step which consists in coupling the 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amidohexanoic acid or the 6 - ((2,6- bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanoic acid with valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE or a salt thereof.
  • a seventh object of the invention relates to a process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprising the following steps:
  • step (ii) reacting the cytotoxic conjugate obtained in step (i) with an anti-HER2 antibody or an anti-HER2 antibody fragment.
  • the process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprises a step which consists in reacting 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido-N -hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyl carbamate from MMAE or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE with an anti HER-2 antibody or an anti-HER2 antibody fragment.
  • cytotoxic conjugate refers to a conjugate which comprises a cytotoxic drug.
  • cytotoxic drug designates any natural or synthetic molecule capable of inhibiting or preventing cell function.
  • cytotoxic is understood to mean the property for a chemical or biological agent of altering cells, possibly to the point of destroying them.
  • the medicament in a particular embodiment of the invention, the medicament
  • cytotoxic agent is chosen from any compound which has obtained Marketing Authorization and which is used in anti-cancer or anti-inflammatory therapy, any molecule undergoing clinical evaluation in anti-cancer or anti-inflammatory therapy.
  • the cytotoxic drug will be chosen, for example, from paclitaxel (Taxol®) or docetaxel (Taxotère®) or one of its derivatives, topotecan, bortezomib, daunorubicin, daunorubicin analogues, vincristine, mitomycin C, retinoic acid, methotrexate, ilomedine, aspirin, IMIDs,
  • lenalidomide lenalidomide, pomalidomide.
  • the cytotoxic drug is selected from the group consisting of duocarmycin and its analogues, dolastatins, combretastatin and its analogues,
  • CMC N-acetyl-y-calicheamycin
  • calicheamycin maytansine and its analogues, such as a maytansinoid derivative, eg DM1 and DM4, auristatins and their derivatives, such as auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), tubulysin, disorazole, epothilones, echinomycin, estramustine, cemadotine, eleutherobin, methopterin, actinomycin , mitomycin A, camptothecin, a derivative of camptothecin, SN38, TK1, amanitine, a pyrrolobenzodiazepine, a pyrrolobenzodiazepine dimer, a
  • the drug M is selected from pseudomonas exotoxin (PE), deBouganin, Bouganin, diphtheria toxin (DT) and ricin.
  • the cytotoxic drug is chosen from methotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatin, calicheamicin, monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, pyrrolobenzodiazepine dimer, pyrrolopyridodiazepine, dimer of
  • pyrrolopyridodiazepine a histone deacetylase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, and ricin, preferably MMAE, represented by the following formula:
  • antibody also called “immunoglobulin” denotes a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (called the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each ( say L chains for Light), linked together by intra- and inter-chain disulfide bridges.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain.
  • chimeric antibody is meant an antibody in which the sequences of the variable regions of the light chains and of the heavy chains belong to a different species from that of the sequences of constant regions of the light chains and of the heavy chains.
  • the sequences of the variable regions of the heavy and light chains are preferably of murine origin, while the sequences of the constant regions of the heavy and light chains belong to a non-murine species.
  • all species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular man, monkey, suidae, bovidae, equidae, felidae, canidae or even birds, this list not being exhaustive.
  • the chimeric antibodies according to the invention contain sequences of constant regions of heavy and light chains of human origin and sequences of variable regions of heavy and light chains of murine origin.
  • humanized antibody is meant an antibody of which all or part of the sequences of the regions involved in the recognition of the antigen (the hypervariable regions or CDR: Complementarity Determining Region) and sometimes certain amino acids of the FR regions (regions Framework) are of non-human origin while the sequences of constant regions and variable regions not involved in antigen recognition are of human origin.
  • human antibody is meant an antibody containing only human sequences, both for the variable and constant regions of the light chains and for the variable and constant regions of the heavy chains.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least one disulfide bridge, for example Fab, Fab ', F (ab)' 2 , Fab ' -SFI, scFv-Fc or Fc.
  • the enzymatic digestion of the immunoglobulins by papain generates two identical fragments, which are called the Fab fragments (Fragment antigen binding), and an Fc fragment (Crystallizable fragment).
  • Enzymatic digestion of immunoglobulins by pepsin generates an F (ab ') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides.
  • F (ab ') 2 is formed from two Fab' fragments linked by inter-chain disulfide bridges.
  • the Fab parts consist of the variable regions and the CH1 and CL domains.
  • the Fab 'fragment consists of the Fab region and a hinge region.
  • Fab'-SH refers to an Fab 'fragment in which the cysteine residue of the hinge region carries a free thiol group.
  • the scFv (single Chain Fragment variable) is a fragment resulting from protein engineering which consists only of the variable domains VH and VL. The structure is stabilized by a short flexible peptide arm, called a linker, which is placed between the two domains.
  • the scFv fragment can be linked to an Fc fragment to give an scFv-Fc.
  • HER2 denotes "Human Epidermal growth factor Receptor 2", which is a membrane protein of the family of receptors for human epidermal growth factor. "HER2" is also frequently referred to as "ErbB2".
  • HER2 + cancer or "HER2 positive cancer” denotes a cancer involving an exacerbated activation of HER2.
  • the term “HER2 + cancer” designates any case of cancer for which cancer cells exhibit deregulation of the HER2 gene.
  • the HER2 + cancer is chosen from breast cancer, cancer of the female genital tract, such as endometrial cancer, cancer of the uterus or cancer of the breast. ovary, bladder cancer, anal cancer, colorectal cancer especially serous papillary uterine carcinoma, lung cancer especially non-small cell lung cancer, liver cancer , kidney cancer, gastroesophageal cancer, stomach cancer, pancreatic cancer and gastric cancer.
  • the HER2 + cancer is selected from HER2 + breast cancer, HER2 + ovarian cancer, HER2 + bladder cancer, HER2 + colorectal cancer, HER2 + papillary serous carcinoma of the uterus and HER2 + gastric cancer. , preferably HER2 + breast cancer.
  • the antibody is present in the substantial absence of other biological macromolecules of the same type.
  • purified as used herein preferably means at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, still more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight of antibody, relative to all the macromolecules present.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a vehicle for example, a vehicle
  • diluent such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil. , sesame oil, etc. Water is a preferred vehicle when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid vehicles, particularly for injectable solutions.
  • compositions include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene glycol, l water, ethanol and the like.
  • tablets or capsules can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (eg, pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (eg, magnesium stearate, talc or silica); disintegrants (eg potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate).
  • binding agents eg, pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose
  • fillers eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg potato starch or sodium starch glycolate
  • wetting agents eg, sodium lauryl sulfate
  • Liquid preparations for oral administration may take the form, for example, of solutions, syrups or suspensions, or may be presented as a dry product to be reconstituted with water or other suitable vehicle before use.
  • Such liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable vehicles such as suspending agents (eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); agents
  • emulsifiers eg, lecithin or acacia
  • non-aqueous vehicles eg almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils
  • preservatives eg methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid
  • compositions may also contain buffer salts, flavorings, colors and sweeteners, as appropriate.
  • the composition according to the invention is preferably a pharmaceutical composition.
  • treat or “treatment” encompasses any beneficial effect or
  • Treatment may, for example, involve either reducing or ameliorating the symptoms of the pathology or condition, or delaying the progression of the disease or condition.
  • treatment does not necessarily mean complete eradication or cure of the condition, or of associated symptoms.
  • the invention relates to a cytotoxic conjugate of formula (I) below:
  • the attachment head is represented by any one of the two formulas
  • the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • X is Br, Cl, I or F, preferably Br;
  • n is an integer ranging from 1 to 10, advantageously ranging from 2 to 7, from 3 to 6, advantageously equal to 4 or 5.
  • the cytotoxic conjugate corresponds to any one of the following two formulas (la):
  • the invention also relates to an antibody-drug conjugate of the following formula (II):
  • A is an anti-HER2 antibody or antibody fragment
  • the attachment head is represented by any one of the following two formulas:
  • the link arm is a cleavable link arm chosen from the formulas following:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • n is an integer ranging from 1 to 10, advantageously ranging from 2 to 7, from 3 to 6, advantageously equal to 4 or 5;
  • n is an integer ranging from 1 to 4.
  • the antibody or the anti-HER2 antibody fragment according to the invention can be of mammalian (eg human or mouse), humanized or chimeric origin. It is preferably a monoclonal antibody produced recombinantly by cells genetically modified according to techniques widely described in the prior art.
  • A is an anti-HER2 antibody, it is preferably an IgG
  • A is trastuzumab.
  • Trastuzumab is a humanized anti-HER2 antibody of the IgG1 type from
  • Trastuzumab is marketed in particular by the company Roche under the name Herceptin®.
  • the antibody-drug conjugate of the invention has any one of the following two formulas:
  • the antibody-drug conjugate of the invention has any one of the following two formulas (l ia):
  • the antibody-drug conjugate of formula (IIa) is identified in the examples under the reference “McSAF-pyridine” or “McSAF-pyridine
  • the antibody-drug conjugate according to the invention is purified (or isolated) using known purification techniques, such as purification on a chromatography and / or affinity column.
  • the antibody-drug conjugate When n is equal to 1, the antibody-drug conjugate is commonly called “DAR1". When n is 2, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as “DAR2”. When n is 3, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as “DAR3”. When n is 4, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as "DAR4".
  • the antibody-drug conjugate exhibits one or more effector functions mediated by the attenuated Fc part.
  • the effector function (s) mediated by the Fc part is / are chosen from ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) and CDC (Complement-dependent cytotoxicity).
  • ADCC Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC Complement-dependent cytotoxicity
  • Those skilled in the art will have no difficulty in attenuating one or more effector functions mediated by the Fc part with regard to the teaching of the prior art, for example by mutating the Fc part.
  • Many mutations are known to decrease the effector functions mediated by the Fc part. It may, for example, be a mutation aimed at deglycosylating the Fc part, in particular at suppressing glycosylation at the level of asparagine 297.
  • the antibody-drug conjugate is deglycosylated at the level of the Fc part, for example the antibody-drug conjugate no longer carries glycosylation at the level of asparagine 297.
  • the invention also relates to a composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) of formula (II) as defined above. It may be a pharmaceutical composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) of formula (II) as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition according to the invention has the characteristic of being particularly homogeneous, which can result in better stability, better efficiency and / or a reduction in the side effects of the composition, compared to a composition which does not is not homogeneous.
  • the composition according to the invention is characterized by the following characteristics: a) at least 50%, preferably at least 55%, at least 60%, at least 65 %, for example at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least less than 99% of the antibody-drug conjugates of the composition have an n equal to 4;
  • the average Drug-to-Antibody Ratio is between 3.5 and 4.5, preferably between 3.8 and 4.2, between 3.9 and 4.1, between 3.9 and 4.0, for example equal to 4.0 ⁇ 0.2, 4.0 ⁇ 0.1, for example equal to 3.93 ⁇ 0.01.
  • the average DAR is generally determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • the HIC method and the native mass spectrometry method are widely described in the literature. Reference may be cited, for example, [1] for the HIC method and reference [2] for the native mass spectrometry method;
  • c) at least 95%, eg at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the antibody-drug conjugates are present as a monomer.
  • the percentage of monomer is generally determined by the SEC (Size Exclusion Chromatography) method. The SEC method is widely described in the literature, for example in reference [3];
  • the composition according to the invention can comprise DAROs, that is to say antibodies without cytotoxic conjugate.
  • DAROs that is to say antibodies without cytotoxic conjugate.
  • the percentage of DARO can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • composition according to the invention can also comprise DAR5,
  • DAR5 cytotoxic.
  • cytotoxic Preferably less than 25%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, less than 9%, less than 8%, less than 7%, less than 6%, less than 5% of DAR5.
  • the presence of DAR5 in antibody-drug conjugate compositions is widely described in the literature, however the exact structure of DAR5 is little studied.
  • A is an antibody
  • composition according to the invention comprises less than 1% of DAR greater than DAR5, for example DAR6, DAR7, etc.
  • the composition according to the invention does not comprise a DAR greater than DAR5, for example DAR6, DAR7, etc.
  • the percentages of DAR5 and above can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n below:
  • the antibody-drug conjugates of the composition have an n equal to 4.
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n below:
  • n 4 or 5 or 6 or 75% of the antibody-drug conjugates of the composition.
  • the ratios of n can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method below:
  • the antibody-drug conjugates of the composition have a n equal to 2,
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method below:
  • n 4 or 5 or 6 or 75% of the antibody-drug conjugates of the composition.
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n determined by native mass spectrometry below:
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n determined by native mass spectrometry below:
  • n 4 or 5 or 6 or 75% of the antibody-drug conjugates of the composition.
  • the composition according to the invention has the HIC profile of Figure 1 or the HIC profile of Figure 19, or the native mass spectrometry profile of Figure 5 or the profile of Native mass spectrometry of Figure 21.
  • the invention also relates to an antibody-drug conjugate of
  • the antibody-drug conjugate or the composition according to the invention is preferably formulated for parenteral administration, for example intravascular (intravenous or intraarterial), intraperitoneal or intramuscular administration.
  • parenterally administered refers to modes of administration other than enteral and topical administration, generally by injection, and includes, without limitation, intravascular, intravenous, intramuscular, intravenous administration.
  • Intravenous administration is preferred in the context of the present invention, for example by intravenous infusion.
  • the dose of antibody-drug conjugate administered to a subject in need thereof will vary depending on several factors including, without limitation, the route of administration, the type and severity of the condition being treated, the condition. of the patient, the build of the patient, the age of the patient, etc.
  • a person skilled in the art can determine the amount of the condition being treated, the condition. of the patient, the build of the patient, the age of the patient, etc.
  • the appropriate dose can also be determined with animal models or with clinical trials.
  • typical doses of antibody-drug conjugate may be 1 mg / kg, 2 mg / kg, 3 mg / kg, 5 mg / kg, 6 mg / kg, 7 mg / kg, 8 mg / kg or more .
  • the administration can be done in one go or, more generally, in several times.
  • the administration schedule may include an initial loading dose followed by maintenance doses, for example
  • the duration of treatment may vary depending on the pathology treated and the subject.
  • the antibody-drug conjugate or the composition according to the invention can be used in monotherapy or in combination with drugs whose therapeutic interest is recognized in the pathology considered.
  • drugs whose therapeutic interest is recognized in the pathology considered.
  • These can be, for example, paclitaxel, docetaxel, doxorubicin,
  • the description also relates to a method of treating HER2 + cancer in a subject comprising the administration to the subject of an effective therapeutic amount of an antibody-drug conjugate of formula (II) according to the invention or of a composition comprising an antibody-drug conjugate of formula (II) according to the invention.
  • the description also relates to a process for preparing a cytotoxic conjugate according to the invention.
  • the description also relates to an antibody-drug preparation process of formula (II) as defined above, in which a cytotoxic conjugate of formula (I) as defined above is reacted with an antibody or a anti-HER2 antibody fragment.
  • Another object of the invention relates to a process for preparing a
  • cytotoxic conjugate comprising a step which consists in coupling a bonding head of formula:
  • the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula:
  • X is Br, Cl, I or F
  • n is an integer ranging from 1 to 10, preferably equal to 4 or 5.
  • cytotoxic ”and“ antibody-drug conjugate ”above with the difference that the attachment head used in the process comprises a terminal carboxylic acid function.
  • cytotoxic ”and“ antibody-drug conjugate ”above with the difference that the linking arm used in the process comprises a terminal amine function.
  • cytotoxic conjugate according to the invention comprises a step which consists in coupling 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amidohexanoic acid
  • the process for preparing a cytotoxic conjugate according to the invention makes it possible to obtain 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido- / V-hexanamide-valine -citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (reference (8) in Example 1 A) or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine- MMAE citrulline-p-aminobenzoyl carbamate (reference (17) in Example 1B), respectively.
  • Another object of the invention relates to a process for preparing a
  • step (ii) reacting the cytotoxic conjugate obtained in step (i) with an anti-HER2 antibody or an anti-HER2 antibody fragment.
  • antibody-drug conjugate according to the invention comprises a step which consists in reacting 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido- / V-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (reference (8) in Example 1A) or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6- oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE
  • FIG. 1 represents the HIC (Hydrophobicity Interaction Chromatography) profile of a McSAF-pyridine antibody-drug conjugate composition according to the invention. The figure shows that the composition is enriched in DAR4, with about 69% of DAR4.
  • FIG. 2 represents a SEC (Size Exclusion Chromatography) analysis of a McSAF-pyridine antibody-drug conjugate composition according to the invention. The figure shows that the composition is extremely homogeneous, with more than 99% monomer.
  • FIG. 3 represents the distribution of the DAR of 14 bioconjugations
  • FIG. 4 represents the distribution of the DARs of different bioconjugations at different scales (1 mg, 2.5 mg and 5 mg scales). This demonstrates the high reproducibility of the bioconjugation to obtain the antibody-drug McSAF-pyridine conjugate regardless of scale.
  • FIG. 5 represents the distribution of the DARs of a representative bioconjugation for obtaining the antibody-drug conjugate McSAF-pyridine by analysis of native mass spectrometry.
  • the figure demonstrates the chemical nature of the conjugate and shows that the composition is enriched in DAR4, with about 80% DAR4.
  • FIG. 6 represents the recognition of the HER2 antigen by McSAF-pyridine, T-DM1 and trastuzumab.
  • FIG. 7 represents the in vitro cytotoxicity of McSAF-pyridine on cells expressing HER2, or cells not expressing HER2, compared to T-DM1 and MMAE alone.
  • FIG. 8 represents the amount of MMAE released into human plasma by LC-MS / MS, comparing McSAF-pyridine with an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel). This figure reflects the stability of the McSAF-pyridine antibody-drug conjugate.
  • FIG. 9 represents the change in the average DAR in solution at 37 ° C. of McSAF-pyridine relative to an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel). This figure reflects the stability of the McSAF-pyridine antibody-drug conjugate.
  • FIG. 10 represents the evolution of the average DAR in solution in the presence of HSA (Human Serum Albumin) at 37 ° C. of McSAF-pyridine compared to an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel). This figure reflects the stability of the McSAF-pyridine antibody-drug conjugate.
  • HSA Human Serum Albumin
  • FIG. 1 1 represents the evolution of the average DAR in solution at 40 ° C. for 28 days of McSAF-pyridine, relative to an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel) measured by the HIC method. This figure reflects the stability of the McSAF-pyridine antibody-drug conjugate.
  • FIG. 12 represents the change in the percentage of DAR4 in solution at 40 ° C. for 28 days of McSAF-pyridine, relative to an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel) measured by the HIC method. This figure reflects the stability of the McSAF-pyridine antibody-drug conjugate.
  • FIG. 13 represents the change in the percentage of monomer in solution at 40 ° C. for 28 days of McSAF-pyridine, compared with an ADC prepared with maleimide coupling chemistry (McSAF-maleimidel) measured by the SEC method.
  • FIG. 14 represents the change in tumor volume of mice treated with 5 mg / kg of McSAF-pyridine, 5 mg / kg of T-DM1 or a vehicle without ADC.
  • FIG. 15 represents the distribution of tumor volumes of all the mice treated with 5 mg / kg of McSAF-pyridine, 5 mg / kg of T-DM1 or of a vehicle without ADC on day 70. This figure reflects the homogeneity. of the anti-tumor response to the antibody-drug conjugate at 5 mg / kg.
  • FIG. 16 represents the change in tumor volume of mice treated with 1 mg / kg of McSAF-pyridine, 1 mg / kg of T-DM1 or a vehicle without ADC.
  • FIG. 17 represents the distribution of tumor volumes of all the mice treated with 1 mg / kg of McSAF-pyridine, 1 mg / kg of T-DM1 or a vehicle without ADC at day 70. This figure reflects the different anti-tumor responses to the antibody-drug conjugate and to T-DM1 at 1 mg / kg.
  • FIG. 18 represents the denaturing mass spectrometry profile of
  • McSAF-pyridine conjugate The figure shows the presence of completely reconstructed and conjugated species (LHHL DAR4).
  • FIG. 19 represents the HIC (Flydrophobic Interaction Chromatography) profile of a McSAF-pyridine retroamide antibody-drug conjugate composition according to the invention. The figure shows that the composition is enriched in DAR4, with about 68% of DAR4.
  • FIG. 20 represents the denaturing mass spectrometry profile of
  • McSAF-pyridine retroamide conjugate The figure shows the presence of completely reconstructed and conjugated species (LHHL DAR4).
  • FIG. 21 represents the distribution of the DARs of a bioconjugation
  • Example 1A synthesis of a cytotoxic conjugate according to the invention
  • the walls of the flask were rinsed with 2 mL of anhydrous N, N-dimethylformamide and the reaction medium was stirred at room temperature for 15 h.
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed three times with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the product was purified by flash chromatography
  • Example 1 B synthesis of a cytotoxic conjugate according to the invention
  • the product was obtained in salified form (nitrogen of pyridine). It was taken up in water (160 mL), then a 10% solution of sodium hydroxide in water was added at 0 ° C until a pH of 9. The product was obtained. was then extracted with dichloromethane (5x50 mL). The combined organic phases were washed with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure to give (12) (312.2 mg; 80%) as a yellow oil.
  • the reaction was quenched by adding a saturated sodium hydrogencarbonate solution (3 mL) at 0 ° C and extracted with dichlorororethane (3x10 mL). The combined organic phases were dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. The product was purified by flash chromatography (SiO 2 , cycl oh exan e / ethyl acetate, 50:50) to give (13) (144.0 mg; 72%) as a colorless oil.
  • the combined organic phases were washed with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • the product was obtained in salified form (nitrogen of pyridine). It was taken up in water, then a 10% sodium hydroxide solution in water was added at 0 ° C until a pH of 9. The product was then obtained. extracted with dichloromethane (3x20 mL). The combined organic phases were washed with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • the product was purified by flash chromatography (SiO 2 , dichloromethane / methanol, 90:10) to give (15) (80.8 mg; 62%) as a slightly pink solid.
  • Example 2A synthesis of an antibody-drug conjugate according to
  • McSAF-pyridine (corresponding to formula (IIa), also called hereafter “antibody-drug conjugate according to the invention” or generally “ADC”).
  • Antibody used trastuzumab.
  • Bioconjugation buffer 1 X saline buffer, for example phosphate,
  • borate acetate, glycine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, 4- (2- hydroxyethyl) -1 -piperazineethanesulfonic acid in a pH range between 6 and 9, with a final NaCl concentration between 50 and 300 mM and a concentration final in EDTA between 0.1 and 10 mM.
  • bioconjugation buffer for example 5 mg / mL.
  • Reducing agent Solution of a reducing agent chosen from dithiotreitol, b-mercaptoethanol, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride,
  • tris (hydroxypropryl) phosphine at a concentration between 0.1 and 10 mM in the bioconjugation buffer.
  • a concentration between 0.1 and 10 mM in the bioconjugation buffer For example, a 1 mM solution
  • Linker solution cytotoxic conjugate (8) at a concentration of between 0.1 and 10 mM in a mixture of organic solvents chosen from dimethylsulfoxide, N, N-dimethylformamide, methanol, tetrahydrofuran, acteonitrile , N, N-dimethylacetamide, dioxane.
  • organic solvents chosen from dimethylsulfoxide, N, N-dimethylformamide, methanol, tetrahydrofuran, acteonitrile , N, N-dimethylacetamide, dioxane.
  • a 1 mM solution in a mixture of organic solvents composed of 20% N, N-dimethylformamide and 80% methanol.
  • reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with
  • Example 2B synthesis of an antibody-drug conjugate according to
  • McSAF-pyridine retroamide (corresponding to formula (IIa), also called hereinafter “antibody-drug conjugate according to the invention” or generally “ADC”).
  • Antibody used trastuzumab.
  • Bioconjugation buffer 1 X borate buffer at a pH of 8.3, with a final NaCl concentration of 25 mM and a final EDTA concentration of 1 mM.
  • Reducing agent solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride at a concentration of 1 mM in the bioconjugation buffer.
  • Linker solution cytotoxic conjugate (17) at a concentration of 2 mM in a mixture of organic solvents composed of 70% of N, N-dimethylformamide and 30% of methanol.
  • trastuzumab in the bioconjugation buffer (0.25 mg; 1 eq) was placed under argon.
  • the reducing agent (8 eq) was then added and the reaction medium was incubated at 37 ° C. for 2 h.
  • the linker solution (17 eq) was added under argon and the reaction medium was stirred at 37 ° C. for 2 h 30 min.
  • Example 3A analyzes of the antibody-drug conjugate (McSAF-pyridine)
  • the McSAF-pyridine ADC was diluted to 1 mg / mL with PBS pH 7.4 before being filtered through 0.22 mm. 50 pg of products were injected onto a MAbPac HIC-Butyl column, 5 mm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (e2998) set for detection at 280 nm.
  • McSAF-pyridine ADC was eluted at a flow rate of 1 mL / min by gradient from 100% buffer A (1.5 M ammonium sulfate, 50 mM sodium phosphate monobasic, 5% isopropanol (v / v ), pH 7.0) up to 20% buffer B (50 mM sodium phosphate monobasic, 20% isopropanol (v / v), pH 7.0) in 2 minutes then up to 85% buffer B in 30 minutes then this gradient was maintained for 1 min. The temperature was maintained at 25 ° C throughout the separation.
  • the McSAF-pyridine ADC was diluted to 1 mg / mL with PBS pH 7.4 before being filtered through 0.22 mm. 50 ⁇ g of products were injected onto an AdvanceBio SEC 2.7 ⁇ m, 7.8 x 300 mm column (Agilent Technologies), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (2998) set for detection at 280 nm, a MALLS Wyatt detector (miniDawn TM) and a Wyatt refractive index detector (Optilab® T-rEX).
  • McSAF-pyridine ADC eluted at a flow rate of 1 mL / min with isocratic buffer C (1 mM sodium phosphate monobasic, 155 mM sodium chloride, 3 mM sodium phosphate dibasic, 3 mM azide sodium, pH 7.0) over 24 minutes. The temperature was maintained at 25 ° C throughout the separation.
  • Example 3B analyzes of the antibody-drug conjugate (McSAF-pyridine retroamide) [0228] HIC analysis (Hydrophobia Interaction Chromatography)
  • T-DM1 trastuzumab emtansine
  • the cells were obtained from ATCC (BT-474 and MCF-7). An aliquot of frozen cells was thawed rapidly in a 37 ° C water bath and washed twice with culture medium (F12 / DMEM supplemented with 8% FCS, 100 mg / mL penicillin G sodium, 100 mg / mL streptomycin sulfate) and placed in a 150 cm 2 cell culture flask at a density of at least 10,000 cells / cm 2 . The cells were kept at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO 2 for at least a week.
  • culture medium F12 / DMEM supplemented with 8% FCS, 100 mg / mL penicillin G sodium, 100 mg / mL streptomycin sulfate
  • the cells were washed three times with labeling buffer (PBS 1 X-EDTA 2 mM-BSA 0.5%) at 0 ° C and incubated with a secondary antibody (100 ⁇ L at 1/100 th , F (ab ') 2 - goat anti-human IgG Fc-PE, Life Technologies, # H10104) for 0.5 - 1 h at 4 ° C. After incubation with the secondary antibodies, the cells were washed twice with 0 ° C labeling buffer.
  • labeling buffer PBS 1 X-EDTA 2 mM-BSA 0.5%) at 0 ° C and incubated with a secondary antibody (100 ⁇ L at 1/100 th , F (ab ') 2 - goat anti-human IgG Fc-PE, Life Technologies, # H10104
  • the cells were centrifuged and resuspended in 100-500 ⁇ L of staining buffer at 0 ° C. before analysis by flow cytometry.
  • the relative mean fluorescence emission (MFI) of the probes used was determined for each sample on a flow cytometer and analyzed by software such as FCS Express Flow Cytometry (De Novo Software).
  • Cytotoxicity (MTS assav): cytotoxic effect of McSAF-pyridine on a positive line and a negative line compared to T-DM1.
  • the cells were obtained from ATCC (BT-474 and MCF-7). An aliquot of frozen cells was thawed quickly in a 37 ° C water bath and washed twice with culture medium (F12 / DMEM supplemented with 8% FCS, 100 mg / mL L-glutamine, 100 mg / mL of sodium penicillin G, 100 mg / mL of streptomycin sulfate) and deposited in a 150 cm 2 cell culture flask at a density of at least 10,000 cells / cm 2 . Cells were kept at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO 2 for at least one week.
  • culture medium F12 / DMEM supplemented with 8% FCS, 100 mg / mL L-glutamine, 100 mg / mL of sodium penicillin G, 100 mg / mL of streptomycin sulfate
  • the cells were incubated 48 hours at 37 ° C. before the addition of the ADCs tested and of the vehicle (PBS). The percentages of DMSO never exceeded 0.5%.
  • the ADCs tested were added at the following final concentrations:
  • Luminescent Cell Viability Assay Promega according to supplier's recommendations for use. Luciferase activity was measured on a luminometer (PerkinElmer® EnVisionTM).
  • MMAE methyl methacrylate
  • RP424 H 2 O + 0.1% FA
  • 75 ml of a solution of standard “MMAE-d8” at 0.04 gg / ml were added before stirring for 30 seconds.
  • the mixture was centrifuged at 20,000g at 4 ° C for 10 minutes.
  • the supernatant was removed and transferred to polypropylene vials.
  • a new centrifugation was carried out at 2500 g at 4 ° C. for 5 min before injection in LC-MS / MS.
  • the samples were injected onto an Acquity BEH UPLC C18 column, 50 x 2.1 mm, 1.7 mm
  • PBS buffer (1mM sodium phosphate monobasic, 3mM sodium phosphate dibasic, 155mM sodium chloride, 1mM sodium azide, pH 7.4), was adjusted to 2mg / mL. Twelve (12) 20 ⁇ L samples of McSAF-pyridine and McSAF-maleimidel were placed in twelve polyproprylene flasks (fisher scientific, 0.6 mL) then 20 ⁇ L of PBS buffer (1 mM sodium phosphate monobasic, 3 mM dibasic sodium phosphate, 155 mM sodium chloride, 1 mM sodium azide, pH 7.4) or 20 pL of a 20 mg / mL solution of HSA in PBS buffer (1 mM phosphate sodium monobasic, 3mM sodium phosphate dibasic, 155mM sodium chloride, 1mM sodium azide, pH 7.4) was added to each vial.
  • each of the 12 flasks is centrifuged for 30 seconds at 5000 g before incubation at 37 ° C. in an incubator (VWR NCU-line IL23).
  • the vials were removed three by three from the incubator stored at -80 ° C after 1 min (T0), 24 h, 48 h and 120 h.
  • the McSAF-pyridine ADC was analyzed using the protocol described in Example 3A.
  • Example 6 in vivo evaluation of the antibody-drug conjugate
  • the ADCs (McSAF-pyridine or the T-DM1 reference) were administered on days 1 and 26 by the intravenous route (IV, bolus) into the caudal vein of the mice at 1 or 5 mg / kg. Tumor volume as a function of time was calculated twice a week using the following formula: (Length x thickness 2 ) / 2. The animals were euthanized when the tumor volumes reached 10% of their weight, or approximately 2000 mm 3 . [0300] Results

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Abstract

L'invention concerne des conjugués cytotoxiques et des conjugués anticorps- médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers HER2+.

Description

DESCRIPTION
Titre de l'invention : conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
Domaine Technique
[0001 ] La présente invention concerne des conjugués cytotoxiques utiles
comprenant une tête d'accroche, un bras de liaison, un espaceur et un agent cytotoxique.
[0002] La présente invention concerne également des nouveaux conjugués
anticorps-médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l'antigène HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0003] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0004] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (II). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0005] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule.
[0006] Les anticorps anti-HER2 ont déjà été conjugués à des médicaments
cytotoxiques, dont la Monomethyl auristatin E (MMAE). Un conjugué cytotoxique portant la MMAE a été développé sous le nom de « vedotin ». Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament. On peut par exemple citer le brentuximab- vedotin ou le Glembatumumab-vedotin.
[0007] La MMAE a été conjuguée au Trastuzumab comme décrit dans le document Bryant et al., Mol. Pharmaceutics, 2015, 12 (6), pp 1872-1879). Néanmoins, l'efficacité du Trastuzumab-MMAE décrit dans ce document n'est pas
satisfaisante, notamment pour espérer traiter efficacement les cancers HER2+. Ceci peut être dû au faible DAR.
[0008] Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-HER2-médicament cytotoxique plus efficaces et plus stables.
Résumé de l'invention
[0009] Un premier objet de l'invention concerne un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000003_0002
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000004_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000004_0002
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0010] Un second objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante :
Figure imgf000004_0003
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000005_0003
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000005_0004
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0011 ] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'invention.
[0012] Un quatrième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps- médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation comme médicament. [0013] Un cinquième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps- médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+.
[0014] Un sixième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
Figure imgf000006_0001
avec un composé de formule
Figure imgf000006_0003
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000006_0002
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000007_0001
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0015] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à coupler l'acide 6-(2,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque ou l'acide 6-((2,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque avec le valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé.
[0016] Un septième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti- HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0017] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué anticorps- médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti HER-2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
Description détaillée
[0018] Définitions
[0019] Le terme « conjugué cytotoxique » désigne un conjugué qui comprend un médicament cytotoxique. [0020] Le terme « médicament cytotoxique » désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction des cellules. On entend par « cytotoxique », la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
[0021 ] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament
cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxol®) ou le docetaxel (Taxotère®) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib, la daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine C, l'acide rétinoïque, le méthotrexate, l'ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le
lénalidomide, le pomalidomide.
[0022] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la
calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de
calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu’un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la methopterine, l'actinomycine, la mitomycin A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1 , l'amanitine, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une
pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone deacetylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
[0023] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calichéamicine, monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF), maytansine, DM1 , DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de
pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone déacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représenté par la formule suivante :
Figure imgf000009_0001
[0024] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1 , CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
[0025] Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0026] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0027] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0028] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab’, F(ab)'2, Fab'-SFI, scFv-Fc ou Fc.
[0029] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
Le scFv (single Chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie des protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fc pour donner un scFv-Fc. [0030] Le terme « HER2 » désigne le « Human Epidermal growth factor Receptor 2 », qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. « HER2 » est aussi appelé fréquemment « ErbB2 ».
[0031 ] Le terme « cancer HER2+ » ou « cancer HER2 positif » désigne un cancer impliquant une activation exacerbée de HER2. En particulier, le terme « cancer HER2+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer du tractus génital féminin, tel que le cancer de l'endomètre, le cancer de l'utérus ou le cancer de l'ovaire, le cancer de la vessie, le cancer de l'anus, le cancer colorectal en particulier le carcinome séreux papillaire utérin, le cancer du poumon, en particulier le cancer du poumon qui n'est pas à petites cellules, le cancer du foie, le cancer du rein, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de l'estomac, le cancer du pancréas et le cancer gastrique. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein HER2+, le cancer de l'ovaire HER2+, le cancer de la vessie HER2+, le cancer colorectal HER2+, le carcinome séreux papillaire utérin HER2+ et un cancer gastrique HER2+, de préférence le cancer du sein HER2+.
[0032] Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps selon
l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
[0033] Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une
agence règlementaire fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l'homme. Une
« composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule
pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique. Les
préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents
émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions
pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0034] Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou
souhaitable sur les symptômes d'une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
[0035] Conjugué cytotoxique
[0036] L'invention concerne_un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules
suivantes
Figure imgf000013_0002
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000014_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000014_0002
X est Br, Cl, I ou F, avantageusement Br ;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5.
[0037] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le conjugué cytotoxique répond à l'une quelconque des deux formules (la) suivantes :
Figure imgf000014_0003
ou
Figure imgf000015_0001
[0038] Conjugué anticorps-médicament
L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante :
Figure imgf000015_0002
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représenté par l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000015_0003
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000016_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000016_0002
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0039] L'anticorps ou le fragment d'anticorps anti-HER2 selon l'invention peut être d'origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l'art antérieur.
[0040] Lorsque A est un anticorps anti-HER2, il s'agit de préférence d'une IgG
humaine, par exemple lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4. Dans un mode de réalisation particulier, A est le trastuzumab.
[0041 ] Trastuzumab est un anticorps anti-HER2 humanisé de type lgG1 de
séquence SEQ ID NO : 1 pour la chaîne légère et SEQ ID NO : 2 pour la chaîne lourde. Trastuzumab est notamment commercialisé par la société Roche sous le nom Herceptin®.
[0042] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000017_0001
[0043] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules (l ia) suivantes :
Figure imgf000017_0002
[0044] Le conjugué anticorps-médicament de formule (lia) est identifié dans les exemples sous la référence « McSAF-pyridine » ou « McSAF-pyridine
rétroamide » respectivement.
[0045] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l'invention est purifié (ou isolé) en mettant en oeuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d'affinité.
[0046] Lorsque n est égal à 1 , le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR1 ». Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR2 ». Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps- médicament est communément appelé « DAR3 ». Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR4 ».
[0047] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament présente une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc atténuée. De préférence, la ou les fonctions effectrices médiées par la partie Fc est/sont choisies parmi l'ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) et la CDC (Complement-dependent cytotoxicity). L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à atténuer une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc au regard de l'enseignement de l'art antérieur, par exemple en mutant la partie Fc. De nombreuses mutations sont connues pour diminuer les fonctions effectrices médiées par la partie Fc. Il peut s'agir par exemple d'une mutation visant à déglycosyler la partie Fc, notamment à supprimer la glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0048] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament est déglycosylé au niveau de la partie Fc, par exemple le conjugué anticorps- médicament ne porte plus de glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0049] Composition
[0050] L'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus. Il peut s'agir d'une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0051 ] La composition selon l'invention a la caractéristique d'être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité, une meilleure efficacité et/ou une diminution des effets secondaires de la composition, par rapport à une composition qui n'est pas homogène.
[0052] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention se caractérise par les caractéristiques suivantes : a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ;
b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, entre 3,9 et 4,1 , entre 3,9 et 4,0, par exemple égal à 4,0 ± 0,2, 4,0 ± 0,1 , par exemple égal à 3,93 ± 0,01. Le DAR moyen est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native. La méthode HIC et la méthode de spectrométrie de masse native sont largement décrites dans la littérature. Il peut être cité par exemple la référence [1 ] pour la méthode HIC et la référence [2] pour la méthode de spectrométrie de masse native ;
c) au moins 95%, par exemple au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC est largement décrite dans la littérature, par exemple dans la référence [3] ;
d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou
e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), b), c) et d).
[0053] Lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention peut comprendre des DARO, c'est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,2%, moins de 0,1 % de DARO, par exemple environ 0% de DARO. Le pourcentage de DARO peut être déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0054] La composition selon l'invention peut également comprendre des DAR5,
c'est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués
cytotoxiques. De préférence moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5% de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps- médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de l'ensemble des DARs présents dans la composition, c'est-à-dire les DARO, les DAR1 (i.e. n=1 ), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la
composition selon l'invention comprend moins de 1 % de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. De préférence, la composition selon l'invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0055] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,1 % ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 8% ou environ 10% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% ou environ 70% ± 5% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0056] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9%, entre 9% et 11 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0057] Les ratios de n peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0058] Dans un premier mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, par exemple environ 0,1 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, par exemple environ 0,5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 10% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 70% ± 5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0059] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 9% et 1 1 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0060] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,1 % ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 8% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0061 ] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0062] Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l'invention présente le profil HIC de la Figure 1 ou le profil HIC de la Figure 19, ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 5 ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 21.
[0063] Utilisation thérapeutique
[0064] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de
formule (II) selon l'invention ou une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, tel que le cancer du sein HER2+. [0065] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale ou intramusculaire. Le terme « administré par voie parentérale », tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l'administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra- articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale. L'administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0066] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l'état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut
facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps- médicament peuvent être de 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg ou plus. L'administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma d'administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d'entretien, par exemple
hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
[0067] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l'intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut s'agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du
cyclophosphamide, d'un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole, ou d'un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1. [0068] La description concerne également une méthode de traitement d'un cancer HER2+ chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutique efficace d'un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention ou d'une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention.
[0069] Procédé de préparation
[0070] La description concerne également un procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention.
[0071 ] La description concerne également un procédé de préparation anticorps- médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique de formule (I) tel que défini ci-dessus avec un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0072] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
Figure imgf000025_0001
avec un composé de formule
Figure imgf000025_0002
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000026_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000026_0002
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0073] La tête d'accroche est décrite plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que la tête d'accroche mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction acide carboxylique terminale.
[0074] Le bras de liaison est décrit plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que le bras de liaison mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction amine terminale.
[0075] L'espaceur est décrit plus en détail dans la partie « conjugué cytotoxique » et
« conjugué anticorps-médicament » ci-dessus. [0076] Le médicament cytotoxique est décrit plus en détail dans la partie « conjugué cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0077] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à coupler de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque
(référence (7) dans l'exemple 1 A) ou de l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin- 4-yl)amino)-6-oxohexanoïque (référence (16) dans l'exemple 1 B) avec le valine- citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé. Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention permet d'obtenir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin- 4-yl)amido-/V-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (8) dans l'exemple 1 A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (17) dans l'exemple 1 B), respectivement.
[0078] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti- HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0079] L'anticorps anti-HER2 est décrit plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0080] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-/V- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (8) dans l'exemple 1A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
(référence (17) dans l'exemple 1 B) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2. Brève description des figures
[0082] [Fig. 1 ] représente le profil HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 69% de DAR4.
[0083] [Fig. 2] représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de monomère.
[0084] [Fig. 3] représente la répartition des DAR de 14 bioconjugaisons
indépendantes à l'échelle 1 mg. Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0085] [Fig. 4] représente la répartition des DAR de différentes bioconjugaisons à différentes échelles (échelles 1 mg, 2,5 mg et 5 mg). Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour l'obtention du conjugué anticorps- médicament McSAF-pyridine indépendamment de l'échelle.
[0086] [Fig. 5] représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 80% de DAR4.
[0087] [Fig. 6] représente la reconnaissance de l'antigène HER2 par McSAF- pyridine, T-DM1 et trastuzumab.
[0088] [Fig. 7] représente la cytotoxicité in vitro de McSAF-pyridine sur des cellules exprimant HER2, ou des cellules n'exprimant pas HER2, par rapport à T-DM1 et MMAE seul.
[0089] [Fig. 8] représente la quantité de de MMAE libérée dans le plasma humain par LC-MS/MS, en comparant McSAF-pyridine avec un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine. [0090] [Fig. 9] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 37 °C de McSAF- pyridine par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps- médicament McSAF-pyridine.
[0091 ] [Fig. 10] représente l'évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Sérum Albumin) à 37 °C de McSAF-pyridinepar rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0092] [Fig. 1 1 ] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0093] [Fig. 12] représente l'évolution du pourcentage de DAR4 en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF- pyridine.
[0094] [Fig. 13] représente l'évolution du pourcentage de monomère en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapporté un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode SEC.
[0095] [Fig. 14] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0096] [Fig. 15] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète l'homogénéité de la réponse anti-tumorale au conjugué anticorps-médicament à 5 mg/kg.
[0097] [Fig. 16] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0098] [Fig. 17] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète les différentes réponses anti- tumorales au conjugué anticorps-médicament et au T-DM1 à 1 mg/kg.
[0099] [Fig. 18] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du
conjugué McSAF-pyridine. La figure montre la présence d'espèce complètement reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0100] [Fig. 19] représente le profil HIC (Flydrophobic Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 68% de DAR4.
[0101 ] [Fig. 20] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du
conjugué McSAF-pyridine rétroamide. La figure montre la présence d'espèce complètement reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0102] [Fig. 21 ] représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison
représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF- pyridine rétroamide par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 75% de DAR4.
[0103] [Fig. 22] représente la répartition des DAR de 5 bioconjugaisons
indépendantes à l'échelle 250 mg. Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide.
Exemples
[0105] Exemple 1A : synthèse d'un conjugué cytotoxique selon l'invention
(pyridine)
[0106] Schéma réactionnel général
Figure imgf000031_0001
[0107] (a) BnOH, SOCI2, DCM, 18 h, 75 °C; (b) APS, MeOH, HA H2S04, 1 h, 50 °C;
(c) H2, Pd/C, MeOH, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMe, 15h, 0 °C, puis TA; (e) PBr3, MeCN, 2h, 45 °C; (f) LiOH, THF, HA 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 °C.
[0108] Schéma réactionnel détaillé
[0109] Préparation de l'isonicotinate de benzyle (2)
Figure imgf000031_0002
[01 10] L'acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1 ,0 eq) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à reflux pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l'excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 ml_). L'alcool benzylique a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1 ,0 eq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2,
cycl o h exan e/acétate d'éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la forme d'une huile incolore.
[01 1 1 ] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz ; 2H1 ,5), 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz, 2H2,4), 7,56 - 7,29 (m ; 5H9.13), 5,39 (s ; 2H7).
[01 12] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1 C6) ; 151 ,3 (2C1 ,5) ; 137,2 (1 C3) ; 136,1 (1 C8) ; 129,0 (2C10,12) ; 128,8 (1 C11) ; 128,6 (2C9,13) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1 C7).
[01 13] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C13H11NO2 [M] : 213,0790 ;
observée 213,0796.
[01 14] Préparation de 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3)
Figure imgf000032_0001
[0115] L' isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 1 1 ,630 mmol ; 1 ,0 eq) a été
solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °Cet de l'acide sulfurique concentré (320 mL ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d'ammonium (26,500 g ; 1 16,000 mmol ; 10,0 eq) dans l'eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s'emballe jusqu’à 75 ° C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50 ° C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 ml_ d'acétate d'éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée
d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3)
(1 ,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige.
[01 16] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55 - 7,32 (m ; 5H9.13) ; 5,60 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H15,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H14, 1 6).
[01 17] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1 C6) ; 162,8 (2C1 ,5) ; 138,0 (1 C3) ; 135,7 (1 C8) ; 128,6 (2C-10,12) ; 128,4 (1 Cn) ; 128,3 (2C9,13) ; 1 1 7,0 (2C2,4) ; 66,9 (1 C7) ; 63,9 (2C14,16).
[01 18] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15N04 [M] : 273,1001 ;
observée 273,1001 .
[01 19] Préparation de l'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4)
Figure imgf000033_0001
[0120] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1 ,33 g ; 4,867
mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d'un solide beige.
[0121 ] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,78 (s ; 2H2,4) ; 5,54 (s large ; 2H9,11) ; 4,59 (s ;
4H8,10)· [0122] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 166,7 (1 C6) ; 162,5 (2C,15) ; 1 39,4 (1 C3) ; 1 1 7,3 (2C2,4) ; 64,0 (2C8,10).
[0123] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C8H9N04 [M] : 183,0532 ; observée 183,0526.
[0124] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
Figure imgf000034_0001
[0125] L'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans le N, N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0 ° C, puis le HATU (156 mg ; 0,410mmol ; 1 ,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 mL ; 1 ,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d'activation a été agitée à 0 ° C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1 ,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL de N,N-diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans l'acétate d'éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91 %) sous la forme d'un solide blanc cassé.
[0126] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 8,79 (t ; J = 5,6 Hz ; 1 H7) ; 7,71 (s ; 2H2,4) ; 5,50 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H16,18) ; 4,57 (d ; J = 5,8 Hz ; 4H15,17) ; 3,57 (s ; 3H14) ; 3,25 (m ; 2H8) ; 2,30 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ; 1 ,62 - 1 ,45 (m ; 4H9,11) ; 1 ,37 - 1 ,21 (m ; 2H10).
[0127] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1 C13) ; 165,1 (1 C6) ; 161 ,8 (21 ,5) ; 142,9 (1 C3) ; 1 15,8 (2C2,4) ; 64,1 (2C15,17) ; 51 ,2 (1 C14) ; 38,5 sous le DMSO (1 C8) ; 33,2 (1 C12) ; 28,6 (1 C9) ; 25,9 (1 C11) ; 24,2 (1 C10). [0128] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H22N2O5 [M] : 310,1529 ;
observée 310,1526.
[0129] Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6)
Figure imgf000035_0001
[0130] Le 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
(55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l'acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 mL ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0°C, neutralisée avec del'eau (10 mL) et extraite à l'acétate d'éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de
magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cycl oh exan e/acétate d'éthyle 60:40) pour donner (6) (57 mg ; 74%) sous la forme d'un solide blanc.
[0131 ] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 8,83 (t, J= 5,6 Hz ;1 H7) ; 7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,I6) ; 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 - 3,20 (m ; 2H8) ; 2,31 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ;
1 ,64 - 1 ,45 (m ; 4H9,11) ; 1 ,39 - 1 ,22 (m, 2H10).
[0132] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1 C13) ; 163,8 (1 C6) ; 157,5 (2C1 ,5) ; 144,2 (1 C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 51 ,2 (1 C14) ; 38,9 sous le DMSO (1 C8) ; 34,1 (2C15, 16); 33,2 (1 C12) ; 28,5 (1 C9) ; 25,9 (1 C11) ; 24,2 (1 C10).
[0133] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H20Br2N2O3 [M] : 433,9841 ;
observée 433,9832. [0134] Préparation de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amidohexanoïque (7)
Figure imgf000036_0001
[0135] Le 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6) (57 mg ; 0,131 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 N et extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme d'un solide blanc.
[0136] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 12,00 (s ; 1 H14) ; 8,83 (t ; J= 5,5 Hz ; 1 H7) ;
7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,I7) ; 3,31 - 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H12) ; 1 ,60 - 1 ,46 (m ; 4H9,11) ; 1 ,39 - 1 ,25 (m ; 2H10).
[0137] RMN 13C (75 MHz ; DMSO) d 174,4 (1 C13) ; 163,8 (1 C6) ; 157,5 (2C1 ,5) ; 144, 1 (1 C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 39,0 sous le DMSO (1 C3) ; 34 ,1 (2C15,16) ; 33,6 (1 C12) ;
28,6 (1 C9) ; 26,0 (1 C11) ; 24,2 (1 C10).
[0138] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C14H19Br2N203 [M+H]+ : 420,9757 ; observée 420,9752. [0139] Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (8)
Figure imgf000037_0001
[0140] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6- (2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1 ,2 ml_) puis la N- éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1 ,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21 ,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1 ,0 eq), solubilisé dans du N,N- diméthylformamide anhydre (300 mL) en présence de N,N-diisopropyléthylamine (9,4 mL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du N,N-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050
[ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 ° C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 pm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d'un solide blanc.
[0141 ] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1 H) ; 8,94 - 8,79 (m ;
1 H) ; 8,20 - 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 - 7,87 (m ; 1 H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1 H) ; 7,70 - 7,61 (m ; 1 H); 7,58 (d ; J = 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 - 7,1 1 (m ; 6H) ; 6,07 - 5,92 (m ; 1 H) ; 5,47 - 5,37 (m ; 1 H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1 H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 - 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1 H) ; 4,05 - 3,92 (m ; 1 H) ; 3,30 - 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 - 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 - 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 - 2,1 1 (m ; 3H) ; 2,02 - 1 ,88 (m ; 1 H) ; 1 ,60 - 1 ,44 (m ; 5H) ; 1 ,36 - 1 ,13 (m ; 4H) ; 1 ,08 - 0,93
(m ; 6H) ; 0,93 - 0,67 (m ; 28H).
[0142] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C72Hiii Br2N12014 [M+H]+ : 1525,6704 ;
observée 1525,6700.
[0143] Exemple 1 B : synthèse d' un conjugué cytotoxique selon l'invention
(pyridine rétroamide)
[0144] Schéma réactionnel général
Figure imgf000038_0001
[0145] (a) TBDMSOTf, 2,6-lutidine, DCM, 19 h, 0 °C, puis TA; (b) H2, Pd/C, MeOH, AcOEt, 5 h, TA; (c) chloroformate d'éthyle, triéthylamine, THF, 1 h 15, -10 ° C, NaN3, H20, 1 h 45, 0 °C, BnOH, toluène, 18 h, 90 °C; (d) H2, Pd/C, MeOH, 16 h, TA; (e) CICO-(CH2)4-COOMe, triéthylamine, 21 h, 0 °C, puis TA; (f) TFA 17 h, 30 °C; (g) RBr3, MeCN, 2 h, 45 ° C; (h) LiOH, H2O THF, 3 h, TA; (i) TFA.H2N- VCPABC-MMAE, IIDQ, DIPEA, DMF, MeCN, 1 h 20, 25 °C.
[0146] Schéma réactionnel détaillé
[0147] Préparation du 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (9)
Figure imgf000039_0001
[0148] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1 ,56 g ; 5,708 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (12 mL), la 2,6- lutidine (3,6 mL ; 28,542 mmol ; 5,0 eq) a été ajoutée et la solution a été refroidie à 0 °C. Le trifluorométhanesulfonate de tert-butyldiméthylsilyle (5,5 mL ; 23,974 mmol ; 4,2 eq) a été ajouté goutte à goutte en 10 min, puis le milieu réactionnel a été agité sous argon à température ambiante (20 °C) pendant 19 h. Le milieu a été refroidit à 0 °C puis neutralisé par ajout d'une solution saturée
d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle, 90:10) pour donner (9) (2,50 g ; 87%) sous la forme d'un solide beige.
[0149] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,83 (s ; 2H2,4) ; 7,50 - 7,36 (m, 5H9.13) ; 5,38 (s ; 2H7) ; 4,79 (s ; 4H-|4 2-|) ; 0,90 (s ; 18H 18-20,25-27) ; 0,09 (s ; 12H-I6, 15,22,23)· [0150] Préparation de l'acide 2,6-bis {{{tert- butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (10)
Figure imgf000040_0001
[0151 ] Le 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (9) (2,50 g ; 4,982 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans 60 mL d'un mélange m éthanol/acétate d'éthyle (5:1 ) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (250 mg, 10 % m/m) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) sous atmosphère d'hydrogène pendant 5 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (10) (1 ,93 g ; 94%) sous la forme d'un solide blanc.
[0152] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 7,78 (s ; 2H2,4) ; 4,78 (s ; 4H8,15), 0,92 (s ; 18H12.
14,19-21 ) ; 0,10 (s ; 12Hg -10,16,17)·
[0153] Préparation du (2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- yl)carbamate de benzyle (11 )
Figure imgf000040_0002
[0154] L'acide 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (10)
(519,4 mg ; 1 ,262 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane anhydre (4 mL). La solution a été refroidie à -10 °C. La tiiéthylamine (227,0 mL ; 1 ,637 mmol ; 1 ,3 eq) puis le chloroformiate d'éthyle (180,7 mL ; 1 ,890 mmol ; 1 ,5 eq) ont été ajoutés sous agitation. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à -10 °C pendant 1 h 15. Puis une solution d'azoture de sodium (139,8 mg ; 2,142 mmol ; 1 ,7 eq) dans l'eau (300 pL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à 0 °C pendant 1 h 45. Les sels de triéthylamine ont été filtrés, puis le filtrat a été concentré sous pression réduite (température maximum du bain à 40 °C, vide maximum 100 mbar). Le résidu a ensuite été repris dans 10 mL d'eau et le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Pour donner l'azoture d'acyle sous forme d'une huile jaune. Il a été solubilisé dans du toluène (14 mL), puis l'alcool benzylique (522 mL ; 5,044 mmol ; 4,0 eq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité à 90 °C pendant 18 h. Le toluène a été évaporé sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclo hexane/acétate d'éthyle 90:10) pour donner (11) (535,6 mg ; 82%) sous la forme d'une huile jaune.
[0155] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 7,50 - 7,32 (m ; 7H2, 4,1 0-1 4) ; 6,85 (s ; 1 H6) ; 5,23 (s ; 2Hb) ; 4,75 (s ; 4H-i5,22) ; 0,96 (s ; 18H19-21 ,26-2s) ; 0,12 (s ; 12H 16,17,23,24)·
[0156] Préparation du 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- amine (12)
Figure imgf000041_0001
[0157] Le (2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-yl)carbamate de benzyle (11) (528,6 mg ; 1 ,020 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans du méthanol (30 mL). La solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Puis du palladium sur charbon 10% wt (57,4 mg, 10% m/m) a été ajouté. La milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante (20 ° C) pendant 16 h. Le palladium sur charbon a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol) puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit a été obtenu sous forme salifiée (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau (160 mL), puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été ajoutée à 0 °C jusqu’à l'obtention d'un pH de 9. Leproduit a ensuite été extrait avec du dichlorométhane (5x50 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (12) (312,2 mg ; 80%) sous la forme d'une huile jaune.
[0158] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 6,44 (s ; 2H2,4) ; 6,04 (s ; 2H6) ; 4,47 (s ; 4H7,14) ; 0,91 (s ; 18H1 1-1 3,18-20) ; 0,07 (s ; 12H8,9,15;16)·
[0159] Préparation du 6-((2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (13)
Figure imgf000042_0001
[0160] Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-amine (12) (146,7 mg ; 0,383 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans du dichlorométhane anhydre (2,8 mL). La solution a été refroidie à 0 º C et la triéhylamine (106,7 mL ; 0,765 mmol ; 2,0 eq) puis le chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 mL ; 0,383 mmol, 1 ,0 eq) ont été ajoutés goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 15 h 30. Du dichlorométhare anhydre (1 mL) a ensuite été ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle (26,8 mI_ ; 0,172 mmol ; 0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 1 h 30. Puis du dichloromâhane anhydre (1 mL) a été ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 mL ; 0,383 mmol ; 1 ,0 eq) et de la triétylamine (26,7 mL ; 0,191 mmol ; 0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 4 h. La réaction a été arrêtée par l'ajout d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (3 mL) à 0 °C et extraite avec du dichlororréthane (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cycl oh exan e/acétate d'éthyle, 50:50) pour donner (13) (144,0 mg ; 72%) sous la forme d'une huile incolore.
[0161 ] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 10,25 (s ; 1 H6) ; 7,58 (s ; 2H2,4) ; 4,63 (s ;
4H14,21) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,41 - 2,28 (m ; 4H8,11) ; 1 ,62 - 1 ,51 (m ; 4H9,10) ; 0,92 (s, 18H 18-20,25-27) ; 0,09 (s ; 12H15 ,16,22, 23)·
[0162] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (14)
Figure imgf000043_0001
[0163] Le 6-((2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (13) (136,9 mg ; 0,261 mmol ; 1 ,0 eq) a été solubilisé dans l'acide trifluoroacétique (3 mL). Le milieu réactionnel a été agité à 30 °C pendant 17 h. L'acide trifluoroacétique a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans de l'acétate d'éthyle (10 mL) et une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (10 mL) a été ajoutée. L'émulsion a été agitée vigoureusement. Le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (5x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 80:20) pour donner (14) (72,2 mg ; 93%) sous la forme d'une huile incolore.
[0164] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 10,24 (s ; 1 H6) ; 7,57 (s ; 2H2,4) ; 5,37 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H15,17) ; 4,45 (d ; J = 5,8 Hz ; 4H14,16) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,40 - 2,29 (m ; 4H8,11) ; 1 ,72 - 1 ,45 (m ; 4H9,10).
[0165] Préparation du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (15)
Figure imgf000044_0001
[0166] Le 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (14) (93,5 mg ; 0,316 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (6 mL) puis du tribromure de phosphore (90 mL ; 0,958 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté lentement. Le milieu réactionnel a été agité à 45 ° C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l'eau (5 mL) et extraite à l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été obtenu sous forme salifié (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau, puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été ajoutée à 0 °C jusqu’à l'obtention d'un pH de 9. Le produit a ensuite été extrait avec du dichlorométhane (3x20 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (15) (80,8 mg ; 62%) sous la forme d'un solide légèrement rose.
[0167] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 7,87 (s ; 1 H6) ; 7,64 (s ; 2H2,4) ; 4,49 (s ; 4H14,IS)
; 3,71 (s ; 3H13) ; 2,53 - 2,32 (m ; 4H8 11) ; 1 ,84 - 1 ,66 (m ; 4H9,10). [0168] Préparation de l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoïque (16)
Figure imgf000045_0001
[0169] Le 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de
méthyle (15) (35,2 mg ; 0,083 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le
tétrahydrofurane (2,2 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8,7 mg ; 0,208 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (2,1 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 3 h. Le milieu réactionnel a été acidifié à 0 °C avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,1 N puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x20 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (16) (33,4 mg ; 99%) sous la forme d'un solide cristallin blanc.
[0170] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 12,06 (s ; 1 H13) ; 10,46 (s ; 1 H6) ; 7,66 (s ; 2H2,4) ; 4,63 (s ; 4H14,15) ; 2,39 - 2,33 (m ; 2H8) ; 2,26 - 2,20 (m ; 2H11) ; 1 ,67 - 1 ,45 (m ; 4H9,10)·
[0171 ] Préparation de 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17)
Figure imgf000045_0002
[0172] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6- ((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque (16) (3,1 mg ; 7,60 pmol ; 1 ,8 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1 10 mI_) puis le 1 ,2- dihydro-2-isobutoxy-1 -quinoline carboxylate d'isobutyle (Il DQ) (2,28 mI_ ; 7,68 pmol ; 1 ,8 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,3 mg ; 4,28 pmol ; 1 ,0 eq), solubilisé dans du N,N-diméthylformamide anhydre (200 pL) en présence de N,N- diisopropyléthylamine (2,98 mL ; 17,11 pmol ; 4,0 eq) préalablement agitée à température ambiante (20 °C) pendant 30 min, a étéajoutée au milieu
d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Le mélange a été dilué par 2 avec de l'acétonitrile et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 23,5 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)j détection UV à 254 nm à 25 ° C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 mm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 30 à 60% de B sur 26 min puis de 60% à 100% de B sur 2 min et 100% de B sur 3 min à 17,1 mL/min) pour donner (17) (2,7 mg ; 42%) sous la forme d'un lyophilisat blanc.
[0173] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : d 7,97 (s ; 1 H) ; 7,58 - 7,41 (m ; 1 H) ; 7,40 - 7,29 (m ; 5H) ; 5,42 - 5,14 (m ; 1 H) ; 5,00 - 4,85 (m ; 2H) ; 4,76 - 4,64 (m ; 1 H) ; 4,63 - 4,45 (m ; 5H) ; 4,23 - 4,01 (m ; 1 H) ; 4,02 - 3,72 (m ; 2H) ; 3,60 - 3,43 (m ; 3H) ; 3,43 - 3,35 (m ; 3H) ; 3,34 - 3,25 (m ; 4H) ; 3,23 - 3,08 (m ; 4H) ; 3,07 - 2,97 (m ; 3H) ; 2,95 - 2,81 (m ; 3H) ; 2,62 - 2,29 (m ; 6H) ; 1 ,84 - 1 ,40 (m ; 21 H)
; 1 ,35 - 1 ,1 1 (m ; 6H) ; 1 ,10 - 0,92 (m ; 17H) ; 0,93 - 0,69 (m ; 16H) ; 0,71 - 0,53 (m ; 3H).
[0174] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C71H109Br2N12O14 [M+H]+ : 151 1 ,6547 ;
observée 151 1 ,6557.
[0175] Exemple 2A : synthèse d' un conjugué anticorps-médicament selon
l'invention (pyridine) [0176] Code du produit synthétisé: McSAF-pyridine (correspondant à la formule (lia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l'invention » ou de manière générale « ADC »).
[0177] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0178] Préparation des solutions
[0179] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1 X, par exemple phosphate,
borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminomethane, acide 4-(2- hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCI comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM. Par exemple, tampon phosphate 1 X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI à 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0180] Trastuzumab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le
tampon de bioconjugaison, par exemple 5 mg/mL.
[0181 ] Réducteur : Solution d'un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le b- mercaptoéthanol, l'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la
tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison. Par exemple, une solution à 1 mM
d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine dans le tampon de
bioconjugaison.
[0182] Solution de linker : conjugué cytotoxique (8) à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le N,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l'actéonitrile, le N,N-diméthylacétamide, le dioxane. Par exemple, une solution à 1 mM dans un mélange de solvants organiques composé de 20% de N,N- diméthylformamide et 80% de méthanol.
[0183] Réaction de bioconiugaison
[0184] Sous atmosphère inerte, au trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (2,5 mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq, par exemple 8 éq) et le milieu réactionnel a été incubé entre 15 et 40 °C, par exemple 37 °C, pendant 0,25 à 3 h, par exemple 2 h, puis la solution de linker (4 à 100 éq, par exemple 12 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C, par exemple 37 °C, pendant 0,5 à 15 h, par semple 2,5 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d'ADC final souhaitée, i.e. cinq fois.
[0185] Purification de l'ADC
[0186] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du
tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois.
[0187] Résultat
[0188] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d'obtenir 7,43 mg de McSAF- pyridine (57%).
[0189] Exemple 2B : synthèse d' un conjugué anticorps-médicament selon
l'invention (pyridine rétroamide)
[0190] Code du produit synthétisé : McSAF-pyridine rétroamide (correspondant à la formule (lia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l'invention » ou de manière générale « ADC »).
[0191] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0192] Préparation des solutions
[0193] Tampon de bioconjugaison : Tampon borate 1 X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI à 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0194] Trastuzumab à une concentration de 5 mg/mL dans le tampon de
bioconjugaison.
[0195] Réducteur : Solution d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
[0196] Solution de linker : conjugué cytotoxique (17) à une concentration de 2 mM dans un mélange de solvants organiques composé de 70% de N,N- diméthylformamide et 30% de méthanol. [0197] Réaction de bioconjugaison
[0198] La solution de trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (0,25 mg ; 1 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 ° C pendant 2 h. Puisla solution de linker (17 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 °C pendant 2 h 30.
[0199] Exemple 3A : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF- pyridine)
[0200] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
[0201 ] Matériel et méthode
[0202] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 mm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 mm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. L'ADC McSAF-pyridine a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0203] Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0204] [Table 1 ]
Figure imgf000049_0001
[0205] Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography)
[0206] Matériel et méthode
[0207] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 mm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm, d'un détecteur MALLS Wyatt (miniDawn™) et d'un détecteur d'indice de réfraction Wyatt (Optilab® T-rEX). L'ADC McSAF-pyridine été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0208] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0209] [Table 2]
Figure imgf000050_0001
[0210] Reproductibilité
[0211 ] Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 3 (reproductibilité sur 14 bioconjugaisons indépendantes (échelle 1 mg de trastuzumab engagé), analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles, analyse HIC).
[0212] Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles.
[0213] Analyse MS native (native Mass Soectrometry)
[0214] Matériel et méthode L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l'analyse MS, les échantillons (20 ug) ont été dessalés sur une colonne de dessalage BEH SEC 2,1 x 150 mm 300 À par un gradient isocratique (50 mM d'acétate d'ammonium, pH 6,5) à 40 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le spectromètre entre 6,5 et 9,5 min seulement. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 8000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9 et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution.
[0215] Les résultats sont présentés à la Figure 5 et dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0216] [Table 3]
Figure imgf000051_0002
[02171 1 : masse moléculaire d e la alvcoforme G0F/G0F
[0218] 2 : non observé
[0219]
Figure imgf000051_0001
[0220] Analyse HRMS dénaturante (denaturing Hight Resolution Mass Soectrometrv)
[0221 ] L'analyse spectrométrique de masse de l'ADC McSAF-pyridine a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex
Ultimate 3000 RSLC. Avant l'analyse MS, les échantillons (5 pg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1 x10 mm, Waters), chauffés à 80°C en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1 % comme solvant A et une solution à 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile comme solvant B à 500 mL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1 ,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR par espèce a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics observés.
[0222] Les résultats sont présentés à la Figure 18 et dans le Tableau 4 ci-dessous.
[Table 41
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
[0223] L'espèce H n'a pas été observée. [0224] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
[0225] 2 : non observé [0226]
Figure imgf000053_0001
[0227] Exemple 3B : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF- pyridine rétroamide) [0228] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
[0229] Matériel et méthode
[0230] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le
protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0231 ] Les résultats sont présentés à la Figure 19 et dans le Tableau 5 ci-dessous.
[0232] [Table 5]
Figure imgf000053_0002
[0233] 1 : non observé
[0234] Analyse FIRMS dénaturante (dénaturing Hight Resolution Mass Soectrometry)
[0235] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le
protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0236] Les résultats sont présentés à la Figure 20 et dans le Tableau 6 ci-dessous.
[0237] [Table 6]
Figure imgf000054_0002
[0238] Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées.
[0239] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
[0240] 2 : non observé
[0241 ]
Figure imgf000054_0001
[0242] Analyse MS native (native Mass Soectrometrv)
[0243] Matériel et méthode
[0244] L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée comme décrit à l'Exemple 3A.
[0245] Les résultats sont présentés à la Figure 21 et dans le Tableau 7 ci-dessous.
[0246] [Table 7]
Figure imgf000054_0003
[0247] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G1 F
Figure imgf000055_0001
[0248] 2 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
Figure imgf000055_0002
[0249] 3 : non observé
[0250] Reproductibilité
Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 22 (reproductibilité sur 5 bioconjugaisons indépendantes (échelle 250 pg de trastuzumab engagé), analyse par HIC).
G02511 Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament
(McSAF-pyridine)
[02521 Liaison à l'antigène FIER-2 : reconnaissance de l'antigène FIER2 sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7), comparaison avec un conjugué Trastuzumab-Médicament cytotoxique de référence décrit dans l'art antérieur, appelé trastuzumab emtansine (ci-après « T-DM1 »).
[0253] Matériel et méthode
[0254] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37° C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 mg/mL de penicillin G de sodium, 100 mg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0255] Ensuite, les cellules ont été collectées et 100 000 à 500 000 cellules dans 80 pL ont été incubées avec 20 pL d'ADCs (McSAF-pyridine ou T-DM1 ) pendant 0,5 - 1 h à 4°C à des concentrations d'ADCs allant de 0,1 à 20 mg/mL (8
concentrations - 0,1 ; 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 mg/mL) ou avec un anticorps ciblant HER2 (trastuzumab, contrôle positif) aux mêmes concentrations. Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon de marquage (PBS 1 X-EDTA 2mM-BSA 0.5%) à 0°C et incubées avec un anticorps secondaire (100 pL au 1/100eme, F(ab')2-chèvre anti-IgG humaine Fc-PE, Life Technologies, # H10104) pendant 0,5 - 1 h à 4°C. Après incubation avec lesanticorps secondaires, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon de marquage à 0°C.
[0256] Après lavage, les cellules ont été centrifugées et resuspendues dans 100 - 500 pL de tampon de coloration à 0°C avant analyse par cytométrie en flux.
L'émission de fluorescence moyenne relative (MFI) des sondes utilisées a été déterminée pour chaque échantillon sur une cytomètre en flux et analysée par un logiciel comme FCS Express 5 Flow Cytometry (De Novo Software).
[0257] Résultats
[0258] Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent que la reconnaissance de HER2 par McSAF-pyridine est similaire à la reconnaissance de HER2 par l'anticorps natif (trastuzumab) et T-DM1 , et dépendante de la présence de HER2.
[0259] Cytotoxicité (MTS assav) : effet cytotoxique de McSAF-pyridine sur une lignée positive et une lignée négative comparé à T-DM1.
[0260] Matériel et méthode
[0261 ] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37°C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 mg/mL de L-glutamine, 100 mg/mL de penicillin G de sodium, 100 mg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37° C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0262] Ensuite, les cellules ont été collectées et déposées dans des plaques 96-puits à des densités entre 1 ,25 et 2,5.103 cellules par puit pour les essais de
cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 48 h à 37 °C avant l'addition des ADCs testées et du véhicule (PBS). Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé 0,5%. Les ADCs testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes :
225 ; 75 ; 25 ; 8,33 ; 2,78 ; 0,926 ; 0,309 ; 0,103 ; 0,034 ; 0,011 nM ; et incubés pendant 72 h (+/- 2 h).
[0263] La viabilité cellulaire a été déterminée au dépôt des cellules (D-2), avant
l'ajout des ADCs testés (D0) et 72 h après l'ajout des composés testés (D3) en mesurant la quantité d'ATP cellulaire en utilisant le kit CelITiter-GIo®
Luminescent Cell Viability Assay (Promega) selon les recommandations d'utilisation du fournisseur. L'activité luciférase a été mesurée sur un luminomètre (PerkinElmer® EnVisionTM).
[0264] Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux
expériences indépendantes ont été conduites.
[0265] Résultats
[0266] Les résultats, présentés à la Figure 7, montrent un effet cytotoxique supérieur du McSAF-pyridine par rapport au T-DM1 et dépendant de la présence de HER2.
[0267] Exemple 5 : stabilité de la bioconjugaison
[0268] Stabilité plasmatique : quantification par LC-MS/MS de la quantité de MMAE libérée après incubation dans du plasma humain à 37 °C. Comparaison entre McSAF-pyridine et un ADC produit avec une tête d'accroche maléimide (une seule liaison) McSAF-maléimidel de formule :
Figure imgf000058_0001
[0269] Matériel et méthode
[0270] Courbe de calibration MMAE
[0271 ] A 25 mL d'échantillons (standard MMAE-ds ou gamme de concentration
MMAE) ont été ajoutés 25 mI_ de RP424 (H2O+0,1 % FA) puis le mélange a été agité. 75 mI_ d'une solution de standard « MMAE-d8 » à 0,04 gg/mL ont été ajoutés avant d'agiter pendant 30 secondes. Le mélange a été centrifugé à 20 000 g à 4°C pendant 10 minutes. Le surnageant a été prélevé et transféré dans des flacons en polypropylène. Une nouvelle centrifugation a été réalisée à 2500 g à 4°C pendant 5 min avant injection en LC-MS/MS. Les échantillons ont été injectés sur une colonne Acquity BEH UPLC C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 mm
connectée à une chaîne LC-20AD et LC-20ADXR (Shimadzu) couplée à un détecteur de masse Shimadzu (8060) avec une source ESI+. L’élution a été réalisée par gradient de 75% de tampon D (acétate d'ammonium 10 mM) dans 25% de tampon E (acétonitrile) à 5% de tampon D dans 95% de tampon E sur 5 minutes suivi d'une augmentation jusqu’à 75% de tampon D dans 25% de tampon E sur 5,1 minutes. Les résultats ont été traités avec le logiciel
Labsolution 6.60.
[0272] Incubation en plasma humain
[0273] Les échantillons ont été incubés en plasma humain stérile EDTA-2K (BiolVT) à une concentration initiale de 100 mg/mL. 3 échantillons ont été collectés juste après avoir agité le mélange (T0) puis après 6 h, 12 h, 24 h, 48 h et 96 h d'incubation à 37 °C. Les échantillons ont été conservés à -80 °C avant leur analyse LC-MS/MS comme décrit ci-dessus.
[0274] Résultats [0275] Les résultats, présentés à la Figure 8, montrent que McSAF-pyridine libère moins de MMAE dans le plasma par rapport à McSAF-maléimidel . McSAF- pyridine est donc plus stable que McSAF-maléimidel dans des conditions physiologiques.
[0276] Stabilité à 37° C en présence ou non de FISA Albumine sérique humaine)
[0277] Matériel et méthode
[0278] La concentration de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel , dans un
tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Douze (12) échantillons de 20 pL de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fisher scientific, 0,6 mL) puis 20 pL de tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) ou 20 pL d'une solution de HSA à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37° C dans un incubateur (VWR NCU-line IL23). Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur conservés à -80 °C après 1 minutes (T0), 24 h, 48 h et 120 h.
[0279] Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC. Pour McSAF-pyridine, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium
monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 100% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes. La température a été maintenue à 25 °C toutau long de la séparation.
[0280] Pour McSAF-maléimidel , 50 mg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 60 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
[0281] Résultats
[0282] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 37 °C est présenté à la Figure 9. Les résultats mortrent une parfaite stabilité à 37 °C de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pourMcSAF-maléimidel . Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0283] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 10. Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pour McSAF-maléimidel . Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0284] Stabilité à 40 °C
[0285] Matériel et méthode
[0286] La concentration de McSAF-pyridine et McSAF-maléimidel , dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 1 mg/mL. Six (6) échantillons de 150 pL de McSAF-pyridine et de McSAF- maléimidel , ont été déposés dans six flacons en polyproprylène (Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL). Après agitation, les échantillons ont été incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 °C. Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur, centrifugé 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1 minutes et 4 semaines.
[0287] Le contenu de chacun des 6 flacons a été filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC et SEC.
[0288] HIC
[0289] L'ADC McSAF-pyridine a été analysé en mettant en oeuvre le protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0290] Pour McSAF-maléimidel , 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 45 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
[0291] SEC
[0292] 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les ADCs ont été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0293] Résultats
[0294] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 1 1 (N=3). Les résultats montrent que le DAR moyen de McSAF-maléimidel varie de 4,00 (à tO) à 2,61 (à t28) attestant d'un manque de stabilité dans les conditions stressantes simulées alors que celui de McSAF-pyridine varie peu (3,93 (à tO) à 3,98 (à t28)) démontrant sa stabilité améliorée par rapport à McSAF-maléimidel utilisant la technologie maléimide.
[0295] Le suivi de l'évolution du pourcentage de DAR4 par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté àla Figure 12 (N=3). Les résultats montrent que le pourcentage de DAR4 diminue au cours du temps pour McSAF-maléimidel (30 % à tO contre 20% à t28) alors que celui de McSAF- pyridine varie peu (67% à tO contre 63% à t28). Cela démontre la stabilité accrue et la meilleure conservation du pourcentage de DAR4 de McSAF-pyridine par rapport à McSAF-maléimidel utilisant la technologie maléimide.
[0296] Le suivi de l'évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 13 (N=3). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue de la même manière pour McSAF-maléimidel (77% à t28) et pour McSAF-pyridine (80% à t28).
[0297] Exemple 6 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament
(McSAF-pyridine)
[0298] Matériel et méthode
[0299] Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux recommandations des autorités françaises (Agrément N° B 21 231 01 1 EA) et de la FELASA. L'étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe BT-474. Une suspension de cellules tumorales a été implantée en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées BALB/c nude (Charles River) 24 à 72 h après une irradiation complète avec une source y (2 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, France). Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=8) une fois le volume moyen ayant atteint 150-200 mm3. Les ADCs (McSAF-pyridine ou la référence T-DM1 ) ont été administrés aux jours 1 et 26 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 5 mg/kg. Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur2)/2. Les animaux ont été euthanasiés quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 mm3. [0300] Résultats
[0301 ] Les résultats de l'administration d'une dose de 5 mg/kg sont présentés à la Figure 14 et à la Figure 15. Les résultats de l'administration d'une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 16 et à la Figure 17. Les résultats montrent qu’aux deux doses, 1 et 5 mg/kg, McSAF-pyridine est plus efficace que T-DM1. A 5 mg/kg de McSAF-pyridine, une régression tumorale complète et durable a été observée avec 8 souris guéries sur 8 souris traitées.
[0302] Une analyse complémentaire de type immunohistochimie (IHC) sur les souris, à la fin de l'étude, a été réalisée. Elle a permis de confirmer la complète éradication des cellules HER2+ dans la zone correspondant à la xénogreffe pour l'ADC McSAF-pyridine, pour toutes les souris traitées à 5 mg/kg, confirmant ainsi la régression tumorale complète.
Listage de séquences
Figure imgf000064_0001
Références citées sous le format « [numéro de référence] » :
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3. Goyon, A ét al., J. Chromatogr. B, 1065-1066, 35-43, 2017

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1 ] Conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
. T~
Figure imgf000066_0003
Figure imgf000066_0004
Figure imgf000066_0005
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000066_0001
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000067_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000067_0002
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10.
[Revendication 2] Conjugué cytotoxique selon la revendication 1 , dans
lequel X est Br et m est égal à 4 ou 5.
[Revendication 3] Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des
revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de
pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.
[Revendication 4] Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des
revendications 1 à 3 de formule (la) suivante :
Figure imgf000067_0003
Figure imgf000068_0003
[Revendication 5] Conjugué anticorps-médicament de formule (II)
suivante :
Figure imgf000068_0001
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
Figure imgf000068_0002
le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante :
Figure imgf000069_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000069_0002
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[Revendication 6] Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 5, dans lequel X est Br et m est égal à 4 ou 5.
[Revendication 7] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de
pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.
[Revendication 8] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel A est Trastuzumab.
[Revendication 9] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 de formule (lia) suivante :
Figure imgf000070_0001
[Revendication 10] Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9.
[Revendication 1 1 ] Composition selon la revendication 10, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 65%, des conjugués anticorps- médicament ont un n égal à 4.
[Revendication 12] Composition selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11 , dans laquelle A est un anticorps et le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et
4,2, par exemple égal à 4,0 ±0,2.
[Revendication 13] Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole et / ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu'un anti-PDl.
[Revendication 14] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation comme médicament.
[Revendication 15] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, de préférence le cancer du sein HER2+.
[Revendication 16] Procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
Figure imgf000071_0001
avec un composé de formule
Figure imgf000071_0003
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000072_0001
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000072_0002
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[Revendication 17] Procédé de préparation d'un conjugué anticorps- médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de la revendication 16, et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
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