DESCRIPTION
Titre de l'invention : conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
Domaine Technique
[0001 ] La présente invention concerne des conjugués cytotoxiques utiles
comprenant une tête d'accroche, un bras de liaison, un espaceur et un agent cytotoxique.
[0002] La présente invention concerne également des nouveaux conjugués
anticorps-médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l'antigène HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0003] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0004] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (II). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0005] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par
transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule.
[0006] Les anticorps anti-HER2 ont déjà été conjugués à des médicaments
cytotoxiques, dont la Monomethyl auristatin E (MMAE). Un conjugué cytotoxique portant la MMAE a été développé sous le nom de « vedotin ». Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament. On peut par exemple citer le brentuximab- vedotin ou le Glembatumumab-vedotin.
[0007] La MMAE a été conjuguée au Trastuzumab comme décrit dans le document Bryant et al., Mol. Pharmaceutics, 2015, 12 (6), pp 1872-1879). Néanmoins, l'efficacité du Trastuzumab-MMAE décrit dans ce document n'est pas
satisfaisante, notamment pour espérer traiter efficacement les cancers HER2+. Ceci peut être dû au faible DAR.
[0008] Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-HER2-médicament cytotoxique plus efficaces et plus stables.
Résumé de l'invention
[0009] Un premier objet de l'invention concerne un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0010] Un second objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante :
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0011 ] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'invention.
[0012] Un quatrième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps- médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation comme médicament.
[0013] Un cinquième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps- médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+.
[0014] Un sixième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
avec un composé de formule
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0015] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à coupler l'acide 6-(2,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque ou l'acide 6-((2,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque avec le valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé.
[0016] Un septième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti- HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0017] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué anticorps- médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti HER-2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
Description détaillée
[0018] Définitions
[0019] Le terme « conjugué cytotoxique » désigne un conjugué qui comprend un médicament cytotoxique.
[0020] Le terme « médicament cytotoxique » désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction des cellules. On entend par « cytotoxique », la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
[0021 ] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament
cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxol®) ou le docetaxel (Taxotère®) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib, la daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine C, l'acide rétinoïque, le méthotrexate, l'ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le
lénalidomide, le pomalidomide.
[0022] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la
calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de
calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu’un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la methopterine, l'actinomycine, la mitomycin A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1 , l'amanitine, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une
pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone deacetylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
[0023] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calichéamicine, monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF),
maytansine, DM1 , DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de
pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone déacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représenté par la formule suivante :
[0024] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1 , CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
[0025] Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas
exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0026] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0027] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0028] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab’, F(ab)'2, Fab'-SFI, scFv-Fc ou Fc.
[0029] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
Le scFv (single Chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie des protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fc pour donner un scFv-Fc.
[0030] Le terme « HER2 » désigne le « Human Epidermal growth factor Receptor 2 », qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. « HER2 » est aussi appelé fréquemment « ErbB2 ».
[0031 ] Le terme « cancer HER2+ » ou « cancer HER2 positif » désigne un cancer impliquant une activation exacerbée de HER2. En particulier, le terme « cancer HER2+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer du tractus génital féminin, tel que le cancer de l'endomètre, le cancer de l'utérus ou le cancer de l'ovaire, le cancer de la vessie, le cancer de l'anus, le cancer colorectal en particulier le carcinome séreux papillaire utérin, le cancer du poumon, en particulier le cancer du poumon qui n'est pas à petites cellules, le cancer du foie, le cancer du rein, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de l'estomac, le cancer du pancréas et le cancer gastrique. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein HER2+, le cancer de l'ovaire HER2+, le cancer de la vessie HER2+, le cancer colorectal HER2+, le carcinome séreux papillaire utérin HER2+ et un cancer gastrique HER2+, de préférence le cancer du sein HER2+.
[0032] Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps selon
l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
[0033] Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une
agence règlementaire fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l'homme. Une
« composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule
pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient
ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique. Les
préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents
émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions
pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des
aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0034] Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou
souhaitable sur les symptômes d'une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
[0035] Conjugué cytotoxique
[0036] L'invention concerne_un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules
suivantes
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
X est Br, Cl, I ou F, avantageusement Br ;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5.
[0037] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le conjugué cytotoxique répond à l'une quelconque des deux formules (la) suivantes :
[0038] Conjugué anticorps-médicament
L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante :
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représenté par l'une quelconque des deux formules suivantes :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules
suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0039] L'anticorps ou le fragment d'anticorps anti-HER2 selon l'invention peut être d'origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l'art antérieur.
[0040] Lorsque A est un anticorps anti-HER2, il s'agit de préférence d'une IgG
humaine, par exemple lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4. Dans un mode de réalisation particulier, A est le trastuzumab.
[0041 ] Trastuzumab est un anticorps anti-HER2 humanisé de type lgG1 de
séquence SEQ ID NO : 1 pour la chaîne légère et SEQ ID NO : 2 pour la chaîne
lourde. Trastuzumab est notamment commercialisé par la société Roche sous le nom Herceptin®.
[0042] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules suivantes :
[0043] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules (l ia) suivantes :
[0044] Le conjugué anticorps-médicament de formule (lia) est identifié dans les exemples sous la référence « McSAF-pyridine » ou « McSAF-pyridine
rétroamide » respectivement.
[0045] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l'invention est purifié (ou isolé) en mettant en oeuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d'affinité.
[0046] Lorsque n est égal à 1 , le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR1 ». Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR2 ». Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps- médicament est communément appelé « DAR3 ». Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR4 ».
[0047] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament présente une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc atténuée. De préférence, la ou les fonctions effectrices médiées par la partie Fc est/sont choisies parmi l'ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) et la CDC (Complement-dependent cytotoxicity). L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à atténuer une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc au regard de l'enseignement de l'art antérieur, par exemple en mutant la partie Fc. De nombreuses mutations sont connues pour diminuer les fonctions effectrices médiées par la partie Fc. Il peut s'agir par exemple d'une mutation visant à déglycosyler la partie Fc, notamment à supprimer la glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0048] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament est déglycosylé au niveau de la partie Fc, par exemple le conjugué anticorps- médicament ne porte plus de glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0049] Composition
[0050] L'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus. Il peut s'agir d'une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs
conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0051 ] La composition selon l'invention a la caractéristique d'être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité, une meilleure efficacité et/ou une diminution des effets secondaires de la composition, par rapport à une composition qui n'est pas homogène.
[0052] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention se caractérise par les caractéristiques suivantes : a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ;
b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, entre 3,9 et 4,1 , entre 3,9 et 4,0, par exemple égal à 4,0 ± 0,2, 4,0 ± 0,1 , par exemple égal à 3,93 ± 0,01. Le DAR moyen est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native. La méthode HIC et la méthode de spectrométrie de masse native sont largement décrites dans la littérature. Il peut être cité par exemple la référence [1 ] pour la méthode HIC et la référence [2] pour la méthode de spectrométrie de masse native ;
c) au moins 95%, par exemple au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC est largement décrite dans la littérature, par exemple dans la référence [3] ;
d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou
e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), b), c) et d).
[0053] Lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention peut comprendre des DARO, c'est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,2%, moins de 0,1 % de DARO, par exemple
environ 0% de DARO. Le pourcentage de DARO peut être déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0054] La composition selon l'invention peut également comprendre des DAR5,
c'est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués
cytotoxiques. De préférence moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5% de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps- médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de l'ensemble des DARs présents dans la composition, c'est-à-dire les DARO, les DAR1 (i.e. n=1 ), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la
composition selon l'invention comprend moins de 1 % de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. De préférence, la composition selon l'invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0055] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,1 % ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 8% ou environ 10% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au
moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% ou environ 70% ± 5% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0056] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9%, entre 9% et 11 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0057] Les ratios de n peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0058] Dans un premier mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, par exemple environ 0,1 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, par exemple environ 0,5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 10% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 70% ± 5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0059] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 9% et 1 1 % des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0060] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,1 % ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1 %, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1 %, par exemple environ 8% des
conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0061 ] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1 % des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0062] Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l'invention présente le profil HIC de la Figure 1 ou le profil HIC de la Figure 19, ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 5 ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 21.
[0063] Utilisation thérapeutique
[0064] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de
formule (II) selon l'invention ou une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, tel que le cancer du sein HER2+.
[0065] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale ou intramusculaire. Le terme « administré par voie parentérale », tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l'administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra- articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale. L'administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0066] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l'état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut
facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps- médicament peuvent être de 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg ou plus. L'administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma d'administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d'entretien, par exemple
hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
[0067] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l'intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut s'agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du
cyclophosphamide, d'un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole, ou d'un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1.
[0068] La description concerne également une méthode de traitement d'un cancer HER2+ chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutique efficace d'un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention ou d'une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention.
[0069] Procédé de préparation
[0070] La description concerne également un procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention.
[0071 ] La description concerne également un procédé de préparation anticorps- médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique de formule (I) tel que défini ci-dessus avec un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0072] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
avec un composé de formule
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0073] La tête d'accroche est décrite plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que la tête d'accroche mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction acide carboxylique terminale.
[0074] Le bras de liaison est décrit plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que le bras de liaison mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction amine terminale.
[0075] L'espaceur est décrit plus en détail dans la partie « conjugué cytotoxique » et
« conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0076] Le médicament cytotoxique est décrit plus en détail dans la partie « conjugué cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0077] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à coupler de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque
(référence (7) dans l'exemple 1 A) ou de l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin- 4-yl)amino)-6-oxohexanoïque (référence (16) dans l'exemple 1 B) avec le valine- citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé. Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention permet d'obtenir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin- 4-yl)amido-/V-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (8) dans l'exemple 1 A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (17) dans l'exemple 1 B), respectivement.
[0078] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti- HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0079] L'anticorps anti-HER2 est décrit plus en détail dans la partie « conjugué
cytotoxique » et « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0080] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un
conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-/V- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (8) dans l'exemple 1A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
(référence (17) dans l'exemple 1 B) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
Brève description des figures
[0082] [Fig. 1 ] représente le profil HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 69% de DAR4.
[0083] [Fig. 2] représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de monomère.
[0084] [Fig. 3] représente la répartition des DAR de 14 bioconjugaisons
indépendantes à l'échelle 1 mg. Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0085] [Fig. 4] représente la répartition des DAR de différentes bioconjugaisons à différentes échelles (échelles 1 mg, 2,5 mg et 5 mg). Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour l'obtention du conjugué anticorps- médicament McSAF-pyridine indépendamment de l'échelle.
[0086] [Fig. 5] représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 80% de DAR4.
[0087] [Fig. 6] représente la reconnaissance de l'antigène HER2 par McSAF- pyridine, T-DM1 et trastuzumab.
[0088] [Fig. 7] représente la cytotoxicité in vitro de McSAF-pyridine sur des cellules exprimant HER2, ou des cellules n'exprimant pas HER2, par rapport à T-DM1 et MMAE seul.
[0089] [Fig. 8] représente la quantité de de MMAE libérée dans le plasma humain par LC-MS/MS, en comparant McSAF-pyridine avec un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0090] [Fig. 9] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 37 °C de McSAF- pyridine par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps- médicament McSAF-pyridine.
[0091 ] [Fig. 10] représente l'évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Sérum Albumin) à 37 °C de McSAF-pyridinepar rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0092] [Fig. 1 1 ] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0093] [Fig. 12] représente l'évolution du pourcentage de DAR4 en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF- pyridine.
[0094] [Fig. 13] représente l'évolution du pourcentage de monomère en solution à 40 °C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapporté un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel ) mesurée par la méthode SEC.
[0095] [Fig. 14] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0096] [Fig. 15] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète l'homogénéité de la réponse anti-tumorale au conjugué anticorps-médicament à 5 mg/kg.
[0097] [Fig. 16] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0098] [Fig. 17] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou d'un
véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète les différentes réponses anti- tumorales au conjugué anticorps-médicament et au T-DM1 à 1 mg/kg.
[0099] [Fig. 18] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du
conjugué McSAF-pyridine. La figure montre la présence d'espèce complètement reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0100] [Fig. 19] représente le profil HIC (Flydrophobic Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 68% de DAR4.
[0101 ] [Fig. 20] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du
conjugué McSAF-pyridine rétroamide. La figure montre la présence d'espèce complètement reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0102] [Fig. 21 ] représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison
représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF- pyridine rétroamide par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 75% de DAR4.
[0103] [Fig. 22] représente la répartition des DAR de 5 bioconjugaisons
indépendantes à l'échelle 250 mg. Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide.
Exemples
[0105] Exemple 1A : synthèse d'un conjugué cytotoxique selon l'invention
(pyridine)
[0106] Schéma réactionnel général
[0107] (a) BnOH, SOCI2, DCM, 18 h, 75 °C; (b) APS, MeOH, HA H2S04, 1 h, 50 °C;
(c) H2, Pd/C, MeOH, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMe, 15h, 0 °C, puis TA; (e) PBr3, MeCN, 2h, 45 °C; (f) LiOH, THF, HA 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 °C.
[0108] Schéma réactionnel détaillé
[0109] Préparation de l'isonicotinate de benzyle (2)
[01 10] L'acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1 ,0 eq) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à reflux
pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l'excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 ml_). L'alcool benzylique a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1 ,0 eq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2,
cycl o h exan e/acétate d'éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la forme d'une huile incolore.
[01 1 1 ] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz ; 2H1 ,5), 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz, 2H2,4), 7,56 - 7,29 (m ; 5H9.13), 5,39 (s ; 2H7).
[01 12] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1 C6) ; 151 ,3 (2C1 ,5) ; 137,2 (1 C3) ; 136,1 (1 C8) ; 129,0 (2C10,12) ; 128,8 (1 C11) ; 128,6 (2C9,13) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1 C7).
[01 13] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C13H11NO2 [M] : 213,0790 ;
observée 213,0796.
[01 14] Préparation de 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3)
[0115] L' isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 1 1 ,630 mmol ; 1 ,0 eq) a été
solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °Cet de l'acide sulfurique concentré (320 mL ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d'ammonium (26,500 g ; 1 16,000 mmol ; 10,0 eq) dans l'eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s'emballe jusqu’à 75 ° C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à
50 ° C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 ml_ d'acétate d'éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée
d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3)
(1 ,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige.
[01 16] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55 - 7,32 (m ; 5H9.13) ; 5,60 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H15,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H14, 1 6).
[01 17] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1 C6) ; 162,8 (2C1 ,5) ; 138,0 (1 C3) ; 135,7 (1 C8) ; 128,6 (2C-10,12) ; 128,4 (1 Cn) ; 128,3 (2C9,13) ; 1 1 7,0 (2C2,4) ; 66,9 (1 C7) ; 63,9 (2C14,16).
[01 18] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15N04 [M] : 273,1001 ;
observée 273,1001 .
[01 19] Préparation de l'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4)
[0120] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1 ,33 g ; 4,867
mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d'un solide beige.
[0121 ] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,78 (s ; 2H2,4) ; 5,54 (s large ; 2H9,11) ; 4,59 (s ;
4H8,10)·
[0122] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 166,7 (1 C6) ; 162,5 (2C,15) ; 1 39,4 (1 C3) ; 1 1 7,3 (2C2,4) ; 64,0 (2C8,10).
[0123] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C8H9N04 [M] : 183,0532 ; observée 183,0526.
[0124] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
[0125] L'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans le N, N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0 ° C, puis le HATU (156 mg ; 0,410mmol ; 1 ,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 mL ; 1 ,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d'activation a été agitée à 0 ° C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1 ,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL de N,N-diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans l'acétate d'éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91 %) sous la forme d'un solide blanc cassé.
[0126] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 8,79 (t ; J = 5,6 Hz ; 1 H7) ; 7,71 (s ; 2H2,4) ; 5,50 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H16,18) ; 4,57 (d ; J = 5,8 Hz ; 4H15,17) ; 3,57 (s ; 3H14) ; 3,25 (m ; 2H8) ; 2,30 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ; 1 ,62 - 1 ,45 (m ; 4H9,11) ; 1 ,37 - 1 ,21 (m ; 2H10).
[0127] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1 C13) ; 165,1 (1 C6) ; 161 ,8 (21 ,5) ; 142,9 (1 C3) ; 1 15,8 (2C2,4) ; 64,1 (2C15,17) ; 51 ,2 (1 C14) ; 38,5 sous le DMSO (1 C8) ; 33,2 (1 C12) ; 28,6 (1 C9) ; 25,9 (1 C11) ; 24,2 (1 C10).
[0128] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H22N2O5 [M] : 310,1529 ;
observée 310,1526.
[0129] Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6)
[0130] Le 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
(55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l'acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 mL ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0°C, neutralisée avec del'eau (10 mL) et extraite à l'acétate d'éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de
magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cycl oh exan e/acétate d'éthyle 60:40) pour donner (6) (57 mg ; 74%) sous la forme d'un solide blanc.
[0131 ] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 8,83 (t, J= 5,6 Hz ;1 H7) ; 7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,I6) ; 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 - 3,20 (m ; 2H8) ; 2,31 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ;
1 ,64 - 1 ,45 (m ; 4H9,11) ; 1 ,39 - 1 ,22 (m, 2H10).
[0132] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1 C13) ; 163,8 (1 C6) ; 157,5 (2C1 ,5) ; 144,2 (1 C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 51 ,2 (1 C14) ; 38,9 sous le DMSO (1 C8) ; 34,1 (2C15, 16); 33,2 (1 C12) ; 28,5 (1 C9) ; 25,9 (1 C11) ; 24,2 (1 C10).
[0133] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H20Br2N2O3 [M] : 433,9841 ;
observée 433,9832.
[0134] Préparation de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amidohexanoïque (7)
[0135] Le 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6) (57 mg ; 0,131 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 N et extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash
(dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme d'un solide blanc.
[0136] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 12,00 (s ; 1 H14) ; 8,83 (t ; J= 5,5 Hz ; 1 H7) ;
7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,I7) ; 3,31 - 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H12) ; 1 ,60 - 1 ,46 (m ; 4H9,11) ; 1 ,39 - 1 ,25 (m ; 2H10).
[0137] RMN 13C (75 MHz ; DMSO) d 174,4 (1 C13) ; 163,8 (1 C6) ; 157,5 (2C1 ,5) ; 144, 1 (1 C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 39,0 sous le DMSO (1 C3) ; 34 ,1 (2C15,16) ; 33,6 (1 C12) ;
28,6 (1 C9) ; 26,0 (1 C11) ; 24,2 (1 C10).
[0138] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C14H19Br2N203 [M+H]+ : 420,9757 ; observée 420,9752.
[0139] Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (8)
[0140] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6- (2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1 ,2 ml_) puis la N- éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1 ,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21 ,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1 ,0 eq), solubilisé dans du N,N- diméthylformamide anhydre (300 mL) en présence de N,N-diisopropyléthylamine (9,4 mL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du N,N-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050
[ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 ° C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 pm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d'un solide blanc.
[0141 ] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1 H) ; 8,94 - 8,79 (m ;
1 H) ; 8,20 - 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 - 7,87 (m ; 1 H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1 H) ;
7,70 - 7,61 (m ; 1 H); 7,58 (d ; J = 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 - 7,1 1 (m ; 6H) ; 6,07 - 5,92 (m ; 1 H) ; 5,47 - 5,37 (m ; 1 H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1 H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 - 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1 H) ; 4,05 - 3,92 (m ; 1 H) ; 3,30 - 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 - 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 - 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 - 2,1 1 (m ; 3H) ; 2,02 - 1 ,88 (m ; 1 H) ; 1 ,60 - 1 ,44 (m ; 5H) ; 1 ,36 - 1 ,13 (m ; 4H) ; 1 ,08 - 0,93
(m ; 6H) ; 0,93 - 0,67 (m ; 28H).
[0142] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C72Hiii Br2N12014 [M+H]+ : 1525,6704 ;
observée 1525,6700.
[0143] Exemple 1 B : synthèse d' un conjugué cytotoxique selon l'invention
(pyridine rétroamide)
[0144] Schéma réactionnel général
[0145] (a) TBDMSOTf, 2,6-lutidine, DCM, 19 h, 0 °C, puis TA; (b) H2, Pd/C, MeOH, AcOEt, 5 h, TA; (c) chloroformate d'éthyle, triéthylamine, THF, 1 h 15, -10 ° C, NaN3, H20, 1 h 45, 0 °C, BnOH, toluène, 18 h, 90 °C; (d) H2, Pd/C, MeOH, 16 h,
TA; (e) CICO-(CH2)4-COOMe, triéthylamine, 21 h, 0 °C, puis TA; (f) TFA 17 h, 30 °C; (g) RBr3, MeCN, 2 h, 45 ° C; (h) LiOH, H2O THF, 3 h, TA; (i) TFA.H2N- VCPABC-MMAE, IIDQ, DIPEA, DMF, MeCN, 1 h 20, 25 °C.
[0146] Schéma réactionnel détaillé
[0147] Préparation du 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (9)
[0148] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1 ,56 g ; 5,708 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (12 mL), la 2,6- lutidine (3,6 mL ; 28,542 mmol ; 5,0 eq) a été ajoutée et la solution a été refroidie à 0 °C. Le trifluorométhanesulfonate de tert-butyldiméthylsilyle (5,5 mL ; 23,974 mmol ; 4,2 eq) a été ajouté goutte à goutte en 10 min, puis le milieu réactionnel a été agité sous argon à température ambiante (20 °C) pendant 19 h. Le milieu a été refroidit à 0 °C puis neutralisé par ajout d'une solution saturée
d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle, 90:10) pour donner (9) (2,50 g ; 87%) sous la forme d'un solide beige.
[0149] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 7,83 (s ; 2H2,4) ; 7,50 - 7,36 (m, 5H9.13) ; 5,38 (s ; 2H7) ; 4,79 (s ; 4H-|4 2-|) ; 0,90 (s ; 18H 18-20,25-27) ; 0,09 (s ; 12H-I6, 15,22,23)·
[0150] Préparation de l'acide 2,6-bis {{{tert- butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (10)
[0151 ] Le 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (9) (2,50 g ; 4,982 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans 60 mL d'un mélange m éthanol/acétate d'éthyle (5:1 ) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (250 mg, 10 % m/m) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) sous atmosphère d'hydrogène pendant 5 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (10) (1 ,93 g ; 94%) sous la forme d'un solide blanc.
[0152] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 7,78 (s ; 2H2,4) ; 4,78 (s ; 4H8,15), 0,92 (s ; 18H12.
14,19-21 ) ; 0,10 (s ; 12Hg -10,16,17)·
[0153] Préparation du (2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- yl)carbamate de benzyle (11 )
[0154] L'acide 2,6-bis(((ferf-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (10)
(519,4 mg ; 1 ,262 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane anhydre
(4 mL). La solution a été refroidie à -10 °C. La tiiéthylamine (227,0 mL ; 1 ,637 mmol ; 1 ,3 eq) puis le chloroformiate d'éthyle (180,7 mL ; 1 ,890 mmol ; 1 ,5 eq) ont été ajoutés sous agitation. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à -10 °C pendant 1 h 15. Puis une solution d'azoture de sodium (139,8 mg ; 2,142 mmol ; 1 ,7 eq) dans l'eau (300 pL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à 0 °C pendant 1 h 45. Les sels de triéthylamine ont été filtrés, puis le filtrat a été concentré sous pression réduite (température maximum du bain à 40 °C, vide maximum 100 mbar). Le résidu a ensuite été repris dans 10 mL d'eau et le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Pour donner l'azoture d'acyle sous forme d'une huile jaune. Il a été solubilisé dans du toluène (14 mL), puis l'alcool benzylique (522 mL ; 5,044 mmol ; 4,0 eq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité à 90 °C pendant 18 h. Le toluène a été évaporé sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclo hexane/acétate d'éthyle 90:10) pour donner (11) (535,6 mg ; 82%) sous la forme d'une huile jaune.
[0155] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 7,50 - 7,32 (m ; 7H2, 4,1 0-1 4) ; 6,85 (s ; 1 H6) ; 5,23 (s ; 2Hb) ; 4,75 (s ; 4H-i5,22) ; 0,96 (s ; 18H19-21 ,26-2s) ; 0,12 (s ; 12H 16,17,23,24)·
[0156] Préparation du 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- amine (12)
[0157] Le (2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-yl)carbamate de benzyle (11) (528,6 mg ; 1 ,020 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans du méthanol
(30 mL). La solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Puis du palladium sur charbon 10% wt (57,4 mg, 10% m/m) a été ajouté. La milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante (20 ° C) pendant 16 h. Le palladium sur charbon a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol) puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit a été obtenu sous forme salifiée (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau (160 mL), puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été ajoutée à 0 °C jusqu’à l'obtention d'un pH de 9. Leproduit a ensuite été extrait avec du dichlorométhane (5x50 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (12) (312,2 mg ; 80%) sous la forme d'une huile jaune.
[0158] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 6,44 (s ; 2H2,4) ; 6,04 (s ; 2H6) ; 4,47 (s ; 4H7,14) ; 0,91 (s ; 18H1 1-1 3,18-20) ; 0,07 (s ; 12H8,9,15;16)·
[0159] Préparation du 6-((2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (13)
[0160] Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-amine (12) (146,7 mg ; 0,383 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans du dichlorométhane anhydre (2,8 mL). La solution a été refroidie à 0 º C et la triéhylamine (106,7 mL ; 0,765 mmol ; 2,0 eq) puis le chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 mL ; 0,383 mmol, 1 ,0 eq) ont été ajoutés goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 15 h 30. Du dichlorométhare anhydre (1 mL) a ensuite été ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle
(26,8 mI_ ; 0,172 mmol ; 0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 1 h 30. Puis du dichloromâhane anhydre (1 mL) a été ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 mL ; 0,383 mmol ; 1 ,0 eq) et de la triétylamine (26,7 mL ; 0,191 mmol ; 0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 4 h. La réaction a été arrêtée par l'ajout d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (3 mL) à 0 °C et extraite avec du dichlororréthane (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cycl oh exan e/acétate d'éthyle, 50:50) pour donner (13) (144,0 mg ; 72%) sous la forme d'une huile incolore.
[0161 ] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 10,25 (s ; 1 H6) ; 7,58 (s ; 2H2,4) ; 4,63 (s ;
4H14,21) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,41 - 2,28 (m ; 4H8,11) ; 1 ,62 - 1 ,51 (m ; 4H9,10) ; 0,92 (s, 18H 18-20,25-27) ; 0,09 (s ; 12H15 ,16,22, 23)·
[0162] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (14)
[0163] Le 6-((2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (13) (136,9 mg ; 0,261 mmol ; 1 ,0 eq) a été solubilisé dans l'acide trifluoroacétique (3 mL). Le milieu réactionnel a été agité à 30 °C pendant 17 h. L'acide trifluoroacétique a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans de l'acétate d'éthyle (10 mL) et une solution
d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (10 mL) a été ajoutée. L'émulsion a été agitée vigoureusement. Le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (5x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par
chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 80:20) pour donner (14) (72,2 mg ; 93%) sous la forme d'une huile incolore.
[0164] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 10,24 (s ; 1 H6) ; 7,57 (s ; 2H2,4) ; 5,37 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H15,17) ; 4,45 (d ; J = 5,8 Hz ; 4H14,16) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,40 - 2,29 (m ; 4H8,11) ; 1 ,72 - 1 ,45 (m ; 4H9,10).
[0165] Préparation du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoate de méthyle (15)
[0166] Le 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (14) (93,5 mg ; 0,316 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (6 mL) puis du tribromure de phosphore (90 mL ; 0,958 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté lentement. Le milieu réactionnel a été agité à 45 ° C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l'eau (5 mL) et extraite à l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été obtenu sous forme salifié (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau, puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été ajoutée à 0 °C jusqu’à l'obtention d'un pH de 9. Le produit a ensuite été extrait avec du dichlorométhane (3x20 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (15) (80,8 mg ; 62%) sous la forme d'un solide légèrement rose.
[0167] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 7,87 (s ; 1 H6) ; 7,64 (s ; 2H2,4) ; 4,49 (s ; 4H14,IS)
; 3,71 (s ; 3H13) ; 2,53 - 2,32 (m ; 4H8 11) ; 1 ,84 - 1 ,66 (m ; 4H9,10).
[0168] Préparation de l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanoïque (16)
[0169] Le 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de
méthyle (15) (35,2 mg ; 0,083 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le
tétrahydrofurane (2,2 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8,7 mg ; 0,208 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (2,1 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 °C) pendant 3 h. Le milieu réactionnel a été acidifié à 0 °C avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,1 N puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x20 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (16) (33,4 mg ; 99%) sous la forme d'un solide cristallin blanc.
[0170] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 12,06 (s ; 1 H13) ; 10,46 (s ; 1 H6) ; 7,66 (s ; 2H2,4) ; 4,63 (s ; 4H14,15) ; 2,39 - 2,33 (m ; 2H8) ; 2,26 - 2,20 (m ; 2H11) ; 1 ,67 - 1 ,45 (m ; 4H9,10)·
[0171 ] Préparation de 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6- oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17)
[0172] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6- ((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque (16) (3,1 mg ; 7,60 pmol ; 1 ,8 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1 10 mI_) puis le 1 ,2- dihydro-2-isobutoxy-1 -quinoline carboxylate d'isobutyle (Il DQ) (2,28 mI_ ; 7,68 pmol ; 1 ,8 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,3 mg ; 4,28 pmol ; 1 ,0 eq), solubilisé dans du N,N-diméthylformamide anhydre (200 pL) en présence de N,N- diisopropyléthylamine (2,98 mL ; 17,11 pmol ; 4,0 eq) préalablement agitée à température ambiante (20 °C) pendant 30 min, a étéajoutée au milieu
d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Le mélange a été dilué par 2 avec de l'acétonitrile et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 23,5 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)j détection UV à 254 nm à 25 ° C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 mm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 30 à 60% de B sur 26 min puis de 60% à 100% de B sur 2 min et 100% de B sur 3 min à 17,1 mL/min) pour donner (17) (2,7 mg ; 42%) sous la forme d'un lyophilisat blanc.
[0173] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : d 7,97 (s ; 1 H) ; 7,58 - 7,41 (m ; 1 H) ; 7,40 - 7,29 (m ; 5H) ; 5,42 - 5,14 (m ; 1 H) ; 5,00 - 4,85 (m ; 2H) ; 4,76 - 4,64 (m ; 1 H) ; 4,63 - 4,45 (m ; 5H) ; 4,23 - 4,01 (m ; 1 H) ; 4,02 - 3,72 (m ; 2H) ; 3,60 - 3,43 (m ; 3H) ; 3,43 - 3,35 (m ; 3H) ; 3,34 - 3,25 (m ; 4H) ; 3,23 - 3,08 (m ; 4H) ; 3,07 - 2,97 (m ; 3H) ; 2,95 - 2,81 (m ; 3H) ; 2,62 - 2,29 (m ; 6H) ; 1 ,84 - 1 ,40 (m ; 21 H)
; 1 ,35 - 1 ,1 1 (m ; 6H) ; 1 ,10 - 0,92 (m ; 17H) ; 0,93 - 0,69 (m ; 16H) ; 0,71 - 0,53 (m ; 3H).
[0174] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C71H109Br2N12O14 [M+H]+ : 151 1 ,6547 ;
observée 151 1 ,6557.
[0175] Exemple 2A : synthèse d' un conjugué anticorps-médicament selon
l'invention (pyridine)
[0176] Code du produit synthétisé: McSAF-pyridine (correspondant à la formule (lia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l'invention » ou de manière générale « ADC »).
[0177] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0178] Préparation des solutions
[0179] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1 X, par exemple phosphate,
borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminomethane, acide 4-(2- hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCI comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM. Par exemple, tampon phosphate 1 X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI à 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0180] Trastuzumab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le
tampon de bioconjugaison, par exemple 5 mg/mL.
[0181 ] Réducteur : Solution d'un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le b- mercaptoéthanol, l'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la
tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison. Par exemple, une solution à 1 mM
d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine dans le tampon de
bioconjugaison.
[0182] Solution de linker : conjugué cytotoxique (8) à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le N,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l'actéonitrile, le N,N-diméthylacétamide, le dioxane. Par exemple, une solution à 1 mM dans un mélange de solvants organiques composé de 20% de N,N- diméthylformamide et 80% de méthanol.
[0183] Réaction de bioconiugaison
[0184] Sous atmosphère inerte, au trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (2,5 mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq, par exemple 8 éq) et le milieu réactionnel a été incubé entre 15 et 40 °C, par exemple 37 °C, pendant 0,25 à 3 h, par exemple 2 h, puis la solution de linker (4 à 100 éq, par exemple 12 éq) a
été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C, par exemple 37 °C, pendant 0,5 à 15 h, par semple 2,5 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d'ADC final souhaitée, i.e. cinq fois.
[0185] Purification de l'ADC
[0186] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du
tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois.
[0187] Résultat
[0188] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d'obtenir 7,43 mg de McSAF- pyridine (57%).
[0189] Exemple 2B : synthèse d' un conjugué anticorps-médicament selon
l'invention (pyridine rétroamide)
[0190] Code du produit synthétisé : McSAF-pyridine rétroamide (correspondant à la formule (lia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l'invention » ou de manière générale « ADC »).
[0191] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0192] Préparation des solutions
[0193] Tampon de bioconjugaison : Tampon borate 1 X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI à 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0194] Trastuzumab à une concentration de 5 mg/mL dans le tampon de
bioconjugaison.
[0195] Réducteur : Solution d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
[0196] Solution de linker : conjugué cytotoxique (17) à une concentration de 2 mM dans un mélange de solvants organiques composé de 70% de N,N- diméthylformamide et 30% de méthanol.
[0197] Réaction de bioconjugaison
[0198] La solution de trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (0,25 mg ; 1 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 ° C pendant 2 h. Puisla solution de linker (17 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 °C pendant 2 h 30.
[0199] Exemple 3A : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF- pyridine)
[0200] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
[0201 ] Matériel et méthode
[0202] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 mm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 mm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. L'ADC McSAF-pyridine a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0203] Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0204] [Table 1 ]
[0205] Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography)
[0206] Matériel et méthode
[0207] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 mm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm, d'un détecteur MALLS Wyatt (miniDawn™) et d'un détecteur d'indice de réfraction Wyatt (Optilab® T-rEX). L'ADC McSAF-pyridine été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0208] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0209] [Table 2]
[0210] Reproductibilité
[0211 ] Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 3 (reproductibilité sur 14 bioconjugaisons indépendantes (échelle 1 mg de trastuzumab engagé), analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles, analyse HIC).
[0212] Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles.
[0213] Analyse MS native (native Mass Soectrometry)
[0214] Matériel et méthode
L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l'analyse MS, les échantillons (20 ug) ont été dessalés sur une colonne de dessalage BEH SEC 2,1 x 150 mm 300 À par un gradient isocratique (50 mM d'acétate d'ammonium, pH 6,5) à 40 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le spectromètre entre 6,5 et 9,5 min seulement. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 8000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9 et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution.
[0215] Les résultats sont présentés à la Figure 5 et dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0216] [Table 3]
[02171 1 : masse moléculaire d e la alvcoforme G0F/G0F
[0218] 2 : non observé
[0219]
[0220] Analyse HRMS dénaturante (denaturing Hight Resolution Mass Soectrometrv)
[0221 ] L'analyse spectrométrique de masse de l'ADC McSAF-pyridine a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex
Ultimate 3000 RSLC. Avant l'analyse MS, les échantillons (5 pg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1 x10 mm, Waters), chauffés à 80°C en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1 % comme solvant A et une solution à 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile comme solvant B à 500
mL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1 ,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR par espèce a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics observés.
[0222] Les résultats sont présentés à la Figure 18 et dans le Tableau 4 ci-dessous.
[Table 41
[0223] L'espèce H n'a pas été observée. [0224] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
[0225] 2 : non observé
[0226]
[0227] Exemple 3B : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF- pyridine rétroamide) [0228] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
[0229] Matériel et méthode
[0230] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le
protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0231 ] Les résultats sont présentés à la Figure 19 et dans le Tableau 5 ci-dessous.
[0232] [Table 5]
[0233] 1 : non observé
[0234] Analyse FIRMS dénaturante (dénaturing Hight Resolution Mass Soectrometry)
[0235] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le
protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0236] Les résultats sont présentés à la Figure 20 et dans le Tableau 6 ci-dessous.
[0238] Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées.
[0239] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
[0240] 2 : non observé
[0242] Analyse MS native (native Mass Soectrometrv)
[0243] Matériel et méthode
[0244] L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée comme décrit à l'Exemple 3A.
[0245] Les résultats sont présentés à la Figure 21 et dans le Tableau 7 ci-dessous.
[0246] [Table 7]
[0247] 1 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G1 F
[0248] 2 : masse moléculaire de la glycoforme G0F/G0F
[0249] 3 : non observé
[0250] Reproductibilité
Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 22 (reproductibilité sur 5 bioconjugaisons indépendantes (échelle 250 pg de trastuzumab engagé), analyse par HIC).
G02511 Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament
(McSAF-pyridine)
[02521 Liaison à l'antigène FIER-2 : reconnaissance de l'antigène FIER2 sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7), comparaison avec un conjugué Trastuzumab-Médicament cytotoxique de référence décrit dans l'art antérieur, appelé trastuzumab emtansine (ci-après « T-DM1 »).
[0253] Matériel et méthode
[0254] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37° C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 mg/mL de penicillin G de sodium, 100 mg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une
densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0255] Ensuite, les cellules ont été collectées et 100 000 à 500 000 cellules dans 80 pL ont été incubées avec 20 pL d'ADCs (McSAF-pyridine ou T-DM1 ) pendant 0,5 - 1 h à 4°C à des concentrations d'ADCs allant de 0,1 à 20 mg/mL (8
concentrations - 0,1 ; 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 mg/mL) ou avec un anticorps ciblant HER2 (trastuzumab, contrôle positif) aux mêmes concentrations. Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon de marquage (PBS 1 X-EDTA 2mM-BSA 0.5%) à 0°C et incubées avec un anticorps secondaire (100 pL au 1/100eme, F(ab')2-chèvre anti-IgG humaine Fc-PE, Life Technologies, # H10104) pendant 0,5 - 1 h à 4°C. Après incubation avec lesanticorps secondaires, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon de marquage à 0°C.
[0256] Après lavage, les cellules ont été centrifugées et resuspendues dans 100 - 500 pL de tampon de coloration à 0°C avant analyse par cytométrie en flux.
L'émission de fluorescence moyenne relative (MFI) des sondes utilisées a été déterminée pour chaque échantillon sur une cytomètre en flux et analysée par un logiciel comme FCS Express 5 Flow Cytometry (De Novo Software).
[0257] Résultats
[0258] Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent que la reconnaissance de HER2 par McSAF-pyridine est similaire à la reconnaissance de HER2 par l'anticorps natif (trastuzumab) et T-DM1 , et dépendante de la présence de HER2.
[0259] Cytotoxicité (MTS assav) : effet cytotoxique de McSAF-pyridine sur une lignée positive et une lignée négative comparé à T-DM1.
[0260] Matériel et méthode
[0261 ] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37°C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 mg/mL de L-glutamine, 100 mg/mL de penicillin G de sodium, 100 mg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules
ont été maintenues à 37° C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0262] Ensuite, les cellules ont été collectées et déposées dans des plaques 96-puits à des densités entre 1 ,25 et 2,5.103 cellules par puit pour les essais de
cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 48 h à 37 °C avant l'addition des ADCs testées et du véhicule (PBS). Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé 0,5%. Les ADCs testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes :
225 ; 75 ; 25 ; 8,33 ; 2,78 ; 0,926 ; 0,309 ; 0,103 ; 0,034 ; 0,011 nM ; et incubés pendant 72 h (+/- 2 h).
[0263] La viabilité cellulaire a été déterminée au dépôt des cellules (D-2), avant
l'ajout des ADCs testés (D0) et 72 h après l'ajout des composés testés (D3) en mesurant la quantité d'ATP cellulaire en utilisant le kit CelITiter-GIo®
Luminescent Cell Viability Assay (Promega) selon les recommandations d'utilisation du fournisseur. L'activité luciférase a été mesurée sur un luminomètre (PerkinElmer® EnVisionTM).
[0264] Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux
expériences indépendantes ont été conduites.
[0265] Résultats
[0266] Les résultats, présentés à la Figure 7, montrent un effet cytotoxique supérieur du McSAF-pyridine par rapport au T-DM1 et dépendant de la présence de HER2.
[0267] Exemple 5 : stabilité de la bioconjugaison
[0268] Stabilité plasmatique : quantification par LC-MS/MS de la quantité de MMAE libérée après incubation dans du plasma humain à 37 °C. Comparaison entre McSAF-pyridine et un ADC produit avec une tête d'accroche maléimide (une
seule liaison) McSAF-maléimidel de formule :
[0269] Matériel et méthode
[0270] Courbe de calibration MMAE
[0271 ] A 25 mL d'échantillons (standard MMAE-ds ou gamme de concentration
MMAE) ont été ajoutés 25 mI_ de RP424 (H2O+0,1 % FA) puis le mélange a été agité. 75 mI_ d'une solution de standard « MMAE-d8 » à 0,04 gg/mL ont été ajoutés avant d'agiter pendant 30 secondes. Le mélange a été centrifugé à 20 000 g à 4°C pendant 10 minutes. Le surnageant a été prélevé et transféré dans des flacons en polypropylène. Une nouvelle centrifugation a été réalisée à 2500 g à 4°C pendant 5 min avant injection en LC-MS/MS. Les échantillons ont été injectés sur une colonne Acquity BEH UPLC C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 mm
connectée à une chaîne LC-20AD et LC-20ADXR (Shimadzu) couplée à un détecteur de masse Shimadzu (8060) avec une source ESI+. L’élution a été réalisée par gradient de 75% de tampon D (acétate d'ammonium 10 mM) dans 25% de tampon E (acétonitrile) à 5% de tampon D dans 95% de tampon E sur 5 minutes suivi d'une augmentation jusqu’à 75% de tampon D dans 25% de tampon E sur 5,1 minutes. Les résultats ont été traités avec le logiciel
Labsolution 6.60.
[0272] Incubation en plasma humain
[0273] Les échantillons ont été incubés en plasma humain stérile EDTA-2K (BiolVT) à une concentration initiale de 100 mg/mL. 3 échantillons ont été collectés juste après avoir agité le mélange (T0) puis après 6 h, 12 h, 24 h, 48 h et 96 h d'incubation à 37 °C. Les échantillons ont été conservés à -80 °C avant leur analyse LC-MS/MS comme décrit ci-dessus.
[0274] Résultats
[0275] Les résultats, présentés à la Figure 8, montrent que McSAF-pyridine libère moins de MMAE dans le plasma par rapport à McSAF-maléimidel . McSAF- pyridine est donc plus stable que McSAF-maléimidel dans des conditions physiologiques.
[0276] Stabilité à 37° C en présence ou non de FISA Albumine sérique humaine)
[0277] Matériel et méthode
[0278] La concentration de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel , dans un
tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Douze (12) échantillons de 20 pL de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fisher scientific, 0,6 mL) puis 20 pL de tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) ou 20 pL d'une solution de HSA à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37° C dans un incubateur (VWR NCU-line IL23). Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur conservés à -80 °C après 1 minutes (T0), 24 h, 48 h et 120 h.
[0279] Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC. Pour McSAF-pyridine, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium
monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 100% de tampon B (50 mM
phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes. La température a été maintenue à 25 °C toutau long de la séparation.
[0280] Pour McSAF-maléimidel , 50 mg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 60 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
[0281] Résultats
[0282] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 37 °C est présenté à la Figure 9. Les résultats mortrent une parfaite stabilité à 37 °C de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pourMcSAF-maléimidel . Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0283] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 10. Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pour McSAF-maléimidel . Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0284] Stabilité à 40 °C
[0285] Matériel et méthode
[0286] La concentration de McSAF-pyridine et McSAF-maléimidel , dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 1 mg/mL. Six (6) échantillons de 150 pL de McSAF-pyridine et de McSAF- maléimidel , ont été déposés dans six flacons en polyproprylène (Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL). Après agitation, les échantillons ont été incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 °C. Les flacons ont été retirés trois par
trois de l'incubateur, centrifugé 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1 minutes et 4 semaines.
[0287] Le contenu de chacun des 6 flacons a été filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC et SEC.
[0288] HIC
[0289] L'ADC McSAF-pyridine a été analysé en mettant en oeuvre le protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0290] Pour McSAF-maléimidel , 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1 ,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 45 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
[0291] SEC
[0292] 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les ADCs ont été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0293] Résultats
[0294] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 1 1 (N=3). Les résultats montrent que le DAR moyen de McSAF-maléimidel varie de 4,00 (à tO) à 2,61 (à t28) attestant d'un manque de stabilité dans les conditions stressantes simulées alors que celui de McSAF-pyridine varie peu (3,93 (à tO) à 3,98 (à t28)) démontrant sa
stabilité améliorée par rapport à McSAF-maléimidel utilisant la technologie maléimide.
[0295] Le suivi de l'évolution du pourcentage de DAR4 par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté àla Figure 12 (N=3). Les résultats montrent que le pourcentage de DAR4 diminue au cours du temps pour McSAF-maléimidel (30 % à tO contre 20% à t28) alors que celui de McSAF- pyridine varie peu (67% à tO contre 63% à t28). Cela démontre la stabilité accrue et la meilleure conservation du pourcentage de DAR4 de McSAF-pyridine par rapport à McSAF-maléimidel utilisant la technologie maléimide.
[0296] Le suivi de l'évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 13 (N=3). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue de la même manière pour McSAF-maléimidel (77% à t28) et pour McSAF-pyridine (80% à t28).
[0297] Exemple 6 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament
(McSAF-pyridine)
[0298] Matériel et méthode
[0299] Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux recommandations des autorités françaises (Agrément N° B 21 231 01 1 EA) et de la FELASA. L'étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe BT-474. Une suspension de cellules tumorales a été implantée en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées BALB/c nude (Charles River) 24 à 72 h après une irradiation complète avec une source y (2 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, France). Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=8) une fois le volume moyen ayant atteint 150-200 mm3. Les ADCs (McSAF-pyridine ou la référence T-DM1 ) ont été administrés aux jours 1 et 26 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 5 mg/kg. Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur2)/2. Les animaux ont été euthanasiés quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 mm3.
[0300] Résultats
[0301 ] Les résultats de l'administration d'une dose de 5 mg/kg sont présentés à la Figure 14 et à la Figure 15. Les résultats de l'administration d'une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 16 et à la Figure 17. Les résultats montrent qu’aux deux doses, 1 et 5 mg/kg, McSAF-pyridine est plus efficace que T-DM1. A 5 mg/kg de McSAF-pyridine, une régression tumorale complète et durable a été observée avec 8 souris guéries sur 8 souris traitées.
[0302] Une analyse complémentaire de type immunohistochimie (IHC) sur les souris, à la fin de l'étude, a été réalisée. Elle a permis de confirmer la complète éradication des cellules HER2+ dans la zone correspondant à la xénogreffe pour l'ADC McSAF-pyridine, pour toutes les souris traitées à 5 mg/kg, confirmant ainsi la régression tumorale complète.
Listage de séquences
Références citées sous le format « [numéro de référence] » :
1. Fekete, S. ét al., J. Pharm. Biomed. Anal., 130, 3-18, 2016
2. Barran, P. ét al., EuPA Open Proteomics, 1 1 , 23-27, 2016
3. Goyon, A ét al., J. Chromatogr. B, 1065-1066, 35-43, 2017