JPH0349697A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は臨床検査、殊に食中毒にががる検査、あるいは
、食品検査での腸炎ビブリオ菌（　Ｖｉｂｒｌｏｐａｒ
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　）の検出に関すものであ
る．〔従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取りＮ
料の場合、脳炎ビプリオ菌と同定するまでには、増菌培
養、分離培養を経て鑑別培養に至る操作を行わなければ
ならない．各培養段階に要する時間は，増菌培養で１０
〜１６時間、分離培養でｌ８〜２４時間、鑑別培養で１
８〜２４時間かかり、総所要時間にすると２〜４日間と
なり，長時間を要する．鑑別培養における試験では、Ｎ
ａＣｔ加寒天培地での発育試験，ダラム染色、オキシダ
ーゼ試験等を行う必要があり、操作的にも煩雑で、時間
や費用もがかる．＝ｉた、腸炎ビブリオ菌が産生ずる耐
熱性溶血毒の検出法として、抗毒素血清より得た特異免
疫グロブリンを用いた逆受身赤血球凝集反応があるが、
結果を得るまでに２０〜２４時間を要する．一方、最近
では、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ１ローブ法あ
るいはハイブリダイゼーション法が試みられるようにな
ってきた．しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾した
プローブにより膜上、あるいは他の支持体上でパイプリ
ダイゼイションを行い、これを検出する場合、細菌検査
において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい． ［発明の目的〕 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により腸炎ビブリ
オ菌由来のｔｄｈ遺伝子を検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供するこ
とにある． ［問題点を解決するための手段および作用］本発明は、
腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ３ｊｌ伝子と選択的にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、腸炎
ビブリオ菌を選択的に検出することを特徴としている．
遺伝子増幅は、Ｓ＆ｉｋｉらが、開発したＰｏｌｙ＋＋
ｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（以下、
略してＰＣＲ法；　　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０．１３５
０（１９８５））をもとに行っている．この方法は、あ
る特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は腸炎ビ
ブリオ菌のｔｄｈ遺伝子〉を検出する場合、その領域の
両端の一方は十鎖を他方は一鎖をそれぞれ認識してハイ
プリダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用
意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試ｆ４核酸
に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーと
して機能させ、生戒した２本Ｍ核酸を再び１本鎖に分離
し、再び、同様な反応を起こさせる．この一連の操作を
繰り返すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検
出できるまでにコピー数が増大してくる．検体としては
、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジ
ェネートなど、また、食品材料でもよい．これら材料を
ＰＣＨの試料として用いるには、材料中に存在する菌体
から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要とな
る．しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が
数分子から数史 十分子以上存在すればＰＣＲは進ので、検査材料を溶菌
酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけで
ＰＣＲを進行させるに十分な核酸量を持った試利液が調
製できる．本発明でプライマーとして用いられるオリゴ
ヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から考
えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを
持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のど
ちらでもよい．また、プライマーは、特に検出用として
標識されていなくてもよい．プライマーが規定している
腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列にお
ける増Ｉ！領域は、５０塩基から２，０００塩基、望ま
しくは、１００＠基から１．　　０００塩基となればよ
い．鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いているが、この酵素の起源につい
ては９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、どの
生物種由来でもよい．ｐＡ変性温度は、９　０＝９　５
℃、プライマーをパイプリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル
行って増幅させる．検出は酵素反応液をそのまま、アガ
ロースゲル電気泳動におけることで増幅されたヌクレオ
チド断片の存在、およびその長さが砿認できる．その結
果から、検体中に、プライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる．この判定は、そのまｔ腸炎ビブリオ菌の有無を
判定するものとなる．増幅されたヌクレオチド断片の検
出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効
である． 〔実施例〕 （実施例１） 炙坐△盟玉 腸炎ビブリオ菌は表１の縦の見出しに示した５株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、３７℃、好気的
条件下で終夜培養を行い、その培地、　１．５ｍｌから
遠心操作により菌体を回収した，１０ｍＭ｝リスー塩酸
＃Ｉｌ衝液（　ｐ　Ｈ　７．　　５　）で１回洗浄後、
同Ｍ衝液にリゾチームをｌｍｇ／ｍ＋となるように溶か
した液、０．５ｍｌで懸濁させ、３７℃、１０分で溶菌
させた．溶菌液に前記ｙ１衝液で飽和させたフェノール
を同容量加え、よく攬はんした．遠心後、上層液を回収
し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ、
その沈澱物を前記′ＭＩ衝液、ｌｍｌに溶かして、これ
を検体と９した． −　マー　Ａ 腸炎ビブリオ菌のｔｄｈｌｌ伝子の塩基配列（　Ｎｉｓ
ｉ−ｂｕｃｈｉ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｋａｐｅｒ，　Ｊ．
　Ｂ．　；Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６２，　５
５８−５６４　（１９８５）　）から、特許請求範囲第
２項に示した配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した．化学合成は島津ＤＮＡ合
成機ＮＳ−１を用い、トリエステル法により行った．合
成したオリゴヌクレオチド断片の精製はＣ１８逆相カラ
ムを用いて行った． Ｌ呈上 前記検体液を３μ１を用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μ！、１０×反応用バッファ−３μ！、ｄＮＴＰ溶液４
．８μ１、プライマー（ａ）．１．　　５μｌ、プライ
マー（ｂＨ．５μ１そして耐熟性ＤＮＡポリメラーゼ０
．　１５μ１を加え、３０μ１の反応液を調製した．　
　この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭ
Ａ社製）を５０μ１加え反応液上に重層する．各添加さ
れた液の内容を下記に示す． １０Ｘ反応用バッフｙ−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ，
１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８．３）１　
５ｍＭ　　ＭｇＣ　Ｉ２，　　０．　　１％（　ｗ　／
　ｖ　）ゼラチｄＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ
，　　ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを混合させたもので各終濃度
が１．２５ｍＭ． プライマー（ａ）および（ｂ〉；　前述した化学合成１
ｌＩ製品の各水溶液（５０Ｄυ／ｍ１） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：　　Ｔａｑ　　ＤＮＡポリ
メラーゼ（　５　ｕｎｉｔ／　ｍｌ；　Ｐｅｒｋｉｎ　
Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製）． 反応条件は、次の通りである． 熱変性：　９４℃　１分 アニーリング＝　３７℃　１分 重合反応；　６０℃　１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分〉とし、これを４２サイク
ル（総所要時間約４時間）行った．これらの操作は、Ｐ
ｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製　ＤＮ＾Ｔｈ
ｅｒａ＋ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反応条件をプログラ
ムすることにより行った． 権皿 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル濃度２％（ｗ／ｖ）とし，臭化エ
チジウム（０．５μｇ／ｍ　Ｉ　）を含むものを用いた
．泳動の電気的条件は、定電圧１　０　０　Ｖ，時間は
３０分行った．操作方法ならびに他の条件はＭａｎｉａ
ｔｌｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｔｎｇ（１９
８２）に記載されている技法で行った．反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ヌクレオチド断片の長さを算出した．Ｕ 前述したように、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより、増幅さ
せてくるヌクレオチドの大きさは推定できる．それによ
ると、１ライマー（ａ）と（ｂ）では、４３９塩基の長
さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである．表１に
示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌクレオチド
の長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対である．同
表からわかるように、各プライマーの組合せとも、推定
されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらが、
ｔｄｈ遺伝子の標的としている領域を正しく増幅してき
ていることを示している． 表　　１ （実施Ｍ２） 実施例１で得られた結果が、腸炎ビブリオ菌に対し選択
的なものかどうか確かめるため、臨床検査において腸炎
ビブリオ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較
検討した． 方法は、実施例１に示したものと同じであるが、（１３
），　（１４）．　（１５）の株については嫌気的条件
下、３７℃で一晩培養を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試
料を調製してきた．検体の調製において培養した菌は，
表２の縦の見出しに示した１６ｍ株である．また，ヒト
胎盤由来ＤＮＡは１μｇ　／　ｍ　ｌの濃度のものを調
製し、これも同様にＰＣＲを行わせた．結果を表２に示
す．表１と同様、欄内の数値の単位はキロ塩基対である
．一部の菌種においてＰＣＲ反応の副次的産物とみられ
る、増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが，どれ
もｔｄｈ遺伝子の配列から推定される→ヌクレオチド断
片の長さとは異なっている．！炎ビブリオ菌と同じｔｄ
ｈ遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実施例１の結果
と同じ長さのヌクレオチド断片が検出されるはずクレオ
チドは腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ遺伝子を認識して生戒さ
れたものではないことが明らかであり、腸炎ビブリオ菌
を容易に区別し、検出できることがわかる．なお、本発
明の実施例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳
動条件で行えば、１００塩基対以下の範囲であれば５か
ら１０塩基対、１００から５００塩基対の範囲であれば
１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別
することができる．また、アクリルアミドなどをゲルに
用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を向上さ
せれば、選択的検出における信頼度はさらに高まるもの
と考えられる． （以下余白） 表 ２ Ｖｉｂｒｊｏ ｐａｒａｈａｅａｏｌｙｔｉｃｕｓ　（ＩＦＯ１２７１
１）０．４４ Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉ！ｌａｒｕｓ＋（３） ０．３５ ［発明の効果　〕 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、腸炎ビブリオ菌
の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と
５　２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性を得ることができる．また
、高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の
前処理が簡便で済む．しかも、反応時間が短く、検出も
簡単な機材だけで行え、操作ら容易なため同定までの時
間を大幅に短縮できる．以下の実施例に示すが、反応時
間が４時間、検出にかかる操作が３０分である．また、
検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる
核酸染色法をもちいることで、プライマー等に標識せず
に検出が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結
果の信頼性が高いものとなる． 腸炎ビブリオ菌は、一般に感染性食中毒の原因菌として
知られ、事実この菌による健康障害のほとんどは、下痢
、腹痛等を主徴とする胃腸炎である．この病原因子とし
て最も注目されているのは耐熱性溶血１　（　ｔｈｅｒ
ＩＩｏｓｔａｂｌｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｈｅｉ＋ｏｌｙＳ
ｉｎ；ＴＤＨ　）である．従って、プライマーが標的と
するヌクレオチド配列にｔｄｈ遺伝子をもちいることで
食中毒原因菌としての腸炎ビブリオ菌を選択的に検出す
ることができる．

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中に存在する腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ
   ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を選択的に検出す
   るためのオリゴヌクレオチド、または、腸炎ビブリオ菌
   の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ遺伝子）をコードするヌ
   クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相
   補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
   あつて、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＧＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣ
   （３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＣＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡ
   Ｇ（３’）…（ｂ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された各オリゴヌクレオチド
   の配列のうち、少なくとも連続した１０塩基以上を含む
   オリゴヌクレオチド。
3. （３）請求項第１項に記載された配列のうち、少なくと
   も１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
   マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
   増幅させることを特徴とする方法であつて、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
   分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
   長反応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
   プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
   とにより特定のヌクレオチド配列が増幅され、電気泳動
   、クロマトグラフィーで増幅されたヌクレオチド断片を
   検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することで腸炎ビブリオ菌の検
   出を行うことを含む方法。
4. （４）請求項第３項記載の方法における反応物から電気
   泳動、ないしクロマトグラフィーにより増幅されたヌク
   レオチド配列を分離し、この分子量を決定することによ
   り腸炎ビブリオ菌の検出を行うことを含む方法。
5. （５）請求項第３項記載の方歩における反応物を用いア
   ガロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色
   を行うことによる検出方法。
6. （６）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはそ
   の他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出す
   る方法。
7. （７）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドが標識物で修飾されていることを特徴とする
   請求項第６項記載の方法。