JP3141976B2 - 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検疫、臨床検査、
とくに食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるい
は食品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
とくに食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるい
は食品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】赤痢菌の検出は、種々の医学および公衆
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。先ず、検査材料の患者糞便および食品
からＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分
離培養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等
を用いた鑑別培養である。
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。先ず、検査材料の患者糞便および食品
からＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分
離培養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等
を用いた鑑別培養である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来法
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌 41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。そこで、本発明は、簡便、迅速かつ高感度な新
規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提供す
ることにある。
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌 41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。そこで、本発明は、簡便、迅速かつ高感度な新
規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提供す
ることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌の
志賀毒素遺伝子を検出するものある。
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌の
志賀毒素遺伝子を検出するものある。
【０００５】本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、志
賀毒素遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的であり、増幅される
べきヌクレオチド配列の両端を規定するように化学合成
されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチド
が以下の配列（ａ）（ｂ）及びこれらに対応する相補的
配列の少なくとも連続した１０塩基以上を含む配列から
選ばれてなることを特徴とする一対のオリゴヌクレオチ
ドである。 （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・・・(ａ；配列番号１） （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・・・(ｂ；配列番号２）
賀毒素遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的であり、増幅される
べきヌクレオチド配列の両端を規定するように化学合成
されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチド
が以下の配列（ａ）（ｂ）及びこれらに対応する相補的
配列の少なくとも連続した１０塩基以上を含む配列から
選ばれてなることを特徴とする一対のオリゴヌクレオチ
ドである。 （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・・・(ａ；配列番号１） （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・・・(ｂ；配列番号２）
【０００６】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた領
域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌の志賀毒素遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた領
域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【０００７】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また食品材料
でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また食品材料
でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【０００８】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
【０００９】プライマーが規定している赤痢菌の遺伝子
のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２、０００塩基、望ましくは、１００塩基から１、００
０塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この
酵素の起源については９０〜９５℃、プライマーをハイ
ブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５
℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとし
たＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。
のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２、０００塩基、望ましくは、１００塩基から１、００
０塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この
酵素の起源については９０〜９５℃、プライマーをハイ
ブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５
℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとし
たＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。
【００１０】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま志賀毒素遺伝子の有無
を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド断片の
検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有
効である。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま志賀毒素遺伝子の有無
を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド断片の
検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有
効である。
【００１１】
【実施例】［実験例１］ 検体の調製 使用した赤痢菌（Shigella dysenteriae）の菌株は、患
者等から由来したもので、表１の総計４２株を用いた。
各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、
３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各
菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５
（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分
間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を
検体とした。
者等から由来したもので、表１の総計４２株を用いた。
各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、
３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各
菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５
（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分
間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を
検体とした。
【００１２】プライマーの合成 赤痢菌の志賀毒素遺伝子は、腸管出血性大腸菌（entero
hemorrhagicEscherichia coli;EHEC ）またはベロ毒素
産生性大腸菌（Verocytotoxin-producing Escherichia
coli; VTEC）の有するＶＴ１遺伝子とわずか数塩基が異
なるだけであり、同一の遺伝子とみなされている。そこ
で、文献（Takao, T etal., Microb. Pathog.,5:357-36
9 (1988））の中から請求項第１項に示した各配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、β−シア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
hemorrhagicEscherichia coli;EHEC ）またはベロ毒素
産生性大腸菌（Verocytotoxin-producing Escherichia
coli; VTEC）の有するＶＴ１遺伝子とわずか数塩基が異
なるだけであり、同一の遺伝子とみなされている。そこ
で、文献（Takao, T etal., Microb. Pathog.,5:357-36
9 (1988））の中から請求項第１項に示した各配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、β−シア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
【００１３】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。 10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 , 0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたもので各終濃度が 1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の水溶液 （濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のとおりに組合せて使用し た。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (b) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer cetus 社製）
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。 10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 , 0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたもので各終濃度が 1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の水溶液 （濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のとおりに組合せて使用し た。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (b) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer cetus 社製）
【００１４】反応条件は、次のとおりである。 熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１５】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１６】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販の大腸菌ベロトキシン検出用ＲＰＬＡキット（デン
カ生研製）を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調
製して、試験を行った。
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販の大腸菌ベロトキシン検出用ＲＰＬＡキット（デン
カ生研製）を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調
製して、試験を行った。
【００１７】結果 前述したように、赤痢菌の志賀毒素遺伝子は、すでに塩
基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌ
クレオチドの大きさは容易に推定できる。それによると
プライマー(a) と(b)の組合せでは、３４９塩基（また
は３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、
志賀毒素遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅し
ており、かつ、当該菌株は志賀毒素遺伝子を有している
と判断した。被験菌株３４株で調べた結果を表１に示
す。
基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌ
クレオチドの大きさは容易に推定できる。それによると
プライマー(a) と(b)の組合せでは、３４９塩基（また
は３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、
志賀毒素遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅し
ており、かつ、当該菌株は志賀毒素遺伝子を有している
と判断した。被験菌株３４株で調べた結果を表１に示
す。
【００１８】本発明のプライマーは、ＲＰＬＡ試験で、
ベロ毒素すなわち志賀毒素陽性と判断された菌株のＤＮ
Ａのみを増幅し、志賀毒素遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは
全く反応しなかった。すなわち、志賀毒素遺伝子を正し
く増幅し、志賀毒素遺伝子をもつ赤痢菌を正確に検出し
ていることを示している。
ベロ毒素すなわち志賀毒素陽性と判断された菌株のＤＮ
Ａのみを増幅し、志賀毒素遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは
全く反応しなかった。すなわち、志賀毒素遺伝子を正し
く増幅し、志賀毒素遺伝子をもつ赤痢菌を正確に検出し
ていることを示している。
【表１】
【００１９】［実験例２］ 実験例１で得られた結果が志賀毒素遺伝子に対して、選
択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査において
検査対象となる、赤痢菌以外の下痢症菌等の遺伝子につ
いて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。
方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと
同じである。
択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査において
検査対象となる、赤痢菌以外の下痢症菌等の遺伝子につ
いて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。
方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと
同じである。
【００２０】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Campyl
obacter coli、Bacteroides flagilis、Bacteroides vu
lgatus、Lactobacillus acidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Campyl
obacter coli、Bacteroides flagilis、Bacteroides vu
lgatus、Lactobacillus acidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
【００２１】結果 表２にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、志賀毒素産生性赤痢菌お
よびベロ毒素１型産生性大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、志
賀毒素遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応するもの
と断言できる。
発明のプライマーの組合せは、志賀毒素産生性赤痢菌お
よびベロ毒素１型産生性大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、志
賀毒素遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応するもの
と断言できる。
【００２２】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向
上させることができ、志賀毒素遺伝子の選択的検出にお
ける信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向
上させることができ、志賀毒素遺伝子の選択的検出にお
ける信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【表２】
【００２３】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび赤痢菌の一病原因子である志賀毒素の遺伝子を標的
とするプライマーを用いたことにより、志賀毒素遺伝子
を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い
検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライマ
ーで反応が規定されることによる高い選択性とが得られ
る。また、検出感度が高いので、多量の検体を必要とせ
ず、検体の前処理も簡便で済む。本発明における実施例
では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３０分であ
った。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳動法と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅されたヌ
クレオチドの長さを確認できるので、試験結果の信頼性
は高いものとなる。
よび赤痢菌の一病原因子である志賀毒素の遺伝子を標的
とするプライマーを用いたことにより、志賀毒素遺伝子
を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い
検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライマ
ーで反応が規定されることによる高い選択性とが得られ
る。また、検出感度が高いので、多量の検体を必要とせ
ず、検体の前処理も簡便で済む。本発明における実施例
では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３０分であ
った。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳動法と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅されたヌ
クレオチドの長さを確認できるので、試験結果の信頼性
は高いものとなる。
【００２４】赤痢菌の検査には、発見患者の迅速・適切
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つである志賀毒素の遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、起因菌としての赤痢菌
の検出を正確に行うことが可能となる。
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つである志賀毒素の遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、起因菌としての赤痢菌
の検出を正確に行うことが可能となる。
【００２５】
【配列表】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae type 1 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡ
Ｇ
Ｇ
【００２６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae type 1 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 合議体 審判長 田中 久直 審判官 徳廣 正道 審判官 田村 明照 (56)参考文献 Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅ ｎｅｓｉｓ（1988）Ｖｏｌ．５，ｐ. 357−369
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在するＡ亜群赤痢菌血清型１
（Shigella dysenteriae type 1)の菌株が産生する毒素
の遺伝子（志賀毒素遺伝子）をコードするヌクレオチド
配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的であ
り、増幅されるべきヌクレオチド配列の両端を規定する
ように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合
成ヌクレオチドが以下の配列（ａ）（ｂ）及びこれらに
対応する相補的配列の少なくとも連続した１０塩基以上
を含む配列から選ばれてなることを特徴とする一対のオ
リゴヌクレオチド。 （５’）−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・(ａ） （５’）−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’）・・・(ｂ） - 【請求項２】 請求項第１項に記載されたオリゴヌクレ
オチドの組合せにより、増幅されるべきヌクレオチド配
列の両端を規定して鎖長反応のプライマーとして機能さ
せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを
特徴とする赤痢菌の検出方法であって。 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチ
ドの重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合、その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機
能し、 （ｃ）前記プライマーによる鎖長反応、鎖長生成物の鋳
型からの分離、そして更なるプライマーによるハイブリ
ダイゼーションを繰り返すことにより、特定のヌクレオ
チド配列を増幅させ、 （ｄ）前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列を
持つ核酸が存在しているか否かを判定することで赤痢菌
の検出を行う方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06048174A JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP00111578A EP1036846A3 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| DE69433201T DE69433201T2 (de) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien |
| EP94116416A EP0669399B1 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| US08/328,710 US5795717A (en) | 1994-02-28 | 1994-10-25 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US08/968,046 US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 1997-11-12 | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| US10/138,381 US20030064388A1 (en) | 1994-02-28 | 2002-05-06 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-30276 | 1994-02-28 | ||
| JP3027694 | 1994-02-28 | ||
| JP06048174A JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22499998A Division JP3331977B2 (ja) | 1994-02-28 | 1998-08-07 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07284400A JPH07284400A (ja) | 1995-10-31 |
| JP3141976B2 true JP3141976B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=26368602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06048174A Expired - Lifetime JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3141976B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662994B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-06-02 | 嘉兴市疾病预防控制中心 | 一种基于荧光pcr技术的志贺氏菌检测和分型用引物组、试剂盒及其应用 |
-
1994
- 1994-03-18 JP JP06048174A patent/JP3141976B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９８８）Ｖｏｌ．５，ｐ．３５７−３６９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07284400A (ja) | 1995-10-31 |
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