JP3331977B2 - 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検疫、臨床検査、
とくに食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるい
は食品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
とくに食中毒または細菌性下痢症にかかる検査、あるい
は食品検査での赤痢菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】赤痢菌の検出は、種々の医学および公衆
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。先ず、検査材料の患者糞便および食品
からＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分
離培養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等
を用いた鑑別培養である。
衛生に関して重要で、従来にあっては次の工程による検
出を行っていた。先ず、検査材料の患者糞便および食品
からＤＨＬ寒天、マッコンキー寒天等の培地を用いた分
離培養を行い、その後、ＴＳＩ寒天、ＬＩＭ寒天培地等
を用いた鑑別培養である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来法
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。
においては各培養段階で要する時間は１８〜２４時間で
あり、総所要時間にすると３〜４日となり、迅速性に乏
しい。また、赤痢菌の志賀毒素に対する特異抗体を用い
た逆受身ラテックス粒子凝集法、赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌の病原性に関与する１４０メガダルトンのプラ
スミド産物に対する特異抗体を用いたＥＩＡ法（伊藤健
一郎ら、日本細菌学雑誌41,414(1986) ）やｉｐａＢ遺
伝子、ｉｐａＣ遺伝子、またはｉｐａＤ遺伝子を検出し
ようとするＤＮＡプローブ法（U.S. patent Applicatio
n No. 888194）があるが、これらの試験法は、試薬およ
び検体の調製が複雑で面倒であり、しかも多大の時間を
要する。
【０００４】そこで、本発明は、簡便、迅速かつ高感度
な新規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提
供することにある。
な新規な検出法を検疫、臨床検査、および食品検査に提
供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥを検出する
ものある。本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、検体
中に存在する赤痢菌（Shigelladysenteriae, Shigella
flexneri,Shigella boydii および Shigella sonnei）
および腸管侵入性大腸菌（enteroinvasive Escherichi
a coli）に選択的に存在しているｉｐａＨ遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列を標的とする場合は、そのヌク
レオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリ
ゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配
列群の少なくとも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌ
クレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’） ・・・・(c；配列番号１) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’） ・・・・・(d；配列番号２) または対応する相補的配列からなる。
決するため、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプラ
イマーとして機能させた遺伝子増幅技術により赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥを検出する
ものある。本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、検体
中に存在する赤痢菌（Shigelladysenteriae, Shigella
flexneri,Shigella boydii および Shigella sonnei）
および腸管侵入性大腸菌（enteroinvasive Escherichi
a coli）に選択的に存在しているｉｐａＨ遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列を標的とする場合は、そのヌク
レオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリ
ゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配
列群の少なくとも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌ
クレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’） ・・・・(c；配列番号１) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’） ・・・・・(d；配列番号２) または対応する相補的配列からなる。
【０００６】検体中に存在する赤痢菌（Shigella dysen
teriae, Shigella flexneri,Shigella boydii, および
Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（enteroinv
asiveEscherichia coli）に選択的に存在しているｉｎ
ｖＥ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする
場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化
学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレ
オチドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以
上を含むオリゴヌクレオチド、 （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・・(e；配列番号３) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・(f；配列番号４) または対応する相補的配列からなる。
teriae, Shigella flexneri,Shigella boydii, および
Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（enteroinv
asiveEscherichia coli）に選択的に存在しているｉｎ
ｖＥ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする
場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化
学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレ
オチドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以
上を含むオリゴヌクレオチド、 （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・・(e；配列番号３) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・(f；配列番号４) または対応する相補的配列からなる。
【０００７】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、
ｉｎｖＥ）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋
鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼー
ションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを
熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで２
つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピ
ー数が増大してくる。
rase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ法とい
う；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ、
ｉｎｖＥ）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋
鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼー
ションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを
熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで２
つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピ
ー数が増大してくる。
【０００８】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【０００９】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
【００１０】プライマーが規定している赤痢菌および腸
管侵入性大腸菌の遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２、０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１、０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。
管侵入性大腸菌の遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２、０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１、０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。
【００１１】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥをもつ赤痢菌の有無を判
定するものとなる。増幅されたヌクレオチド断片の検出
には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効で
ある。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのまま赤痢菌および腸管侵入
性大腸菌のｉｐａＨ、ｉｎｖＥをもつ赤痢菌の有無を判
定するものとなる。増幅されたヌクレオチド断片の検出
には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効で
ある。
【００１２】
（実施例１：赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ
遺伝子の検出） ［実験例１］ 検体の調製 使用した赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株は、患者
等から由来したもので表１の総計３４１株を用いた。各
菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イーストエ
クストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、３
７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各菌
株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以
下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分間の
加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を検体
とした。
遺伝子の検出） ［実験例１］ 検体の調製 使用した赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株は、患者
等から由来したもので表１の総計３４１株を用いた。各
菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イーストエ
クストラクト、および１％塩化ナトリウムに接種し、３
７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各菌
株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以
下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で１０分間の
加熱処理を行った後、これらを遠心し、その上清を検体
とした。
【００１３】プライマーの合成 文献（Hartman, A. B., et al., J. Bacteriol., 172,
1905-1915, 1990 、Venkatesan, M. M.,et al., Mol. M
icrobiol. 5, 2435-2446 1991 ）に記載された赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ遺伝子の塩基配列か
ら、請求項第１項に示した各配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バ
イオリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホ
アミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで行った。
1905-1915, 1990 、Venkatesan, M. M.,et al., Mol. M
icrobiol. 5, 2435-2446 1991 ）に記載された赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌のｉｐａＨ遺伝子の塩基配列か
ら、請求項第１項に示した各配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
は、サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バ
イオリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホ
アミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで行った。
【００１４】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１５】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のと
おりに組合せて使用した。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (ｃ) ＋ (ｄ) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer cetus 社製）
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下記のと
おりに組合せて使用した。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (ｃ) ＋ (ｄ) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer cetus 社製）
【００１６】反応条件は、次のとおりである。 熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１７】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１８】コロニーハイブリダイゼーション試験 ｉｐａＨ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961(1975) ）に
したがって行った。
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961(1975) ）に
したがって行った。
【００１９】結果 前述したように赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｐａ
Ｈ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(c) と(d) の組合せで
は、２４２塩基（または２４２塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｐａＨ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｐａ
Ｈ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表１に示す。
Ｈ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(c) と(d) の組合せで
は、２４２塩基（または２４２塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｐａＨ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｐａ
Ｈ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表１に示す。
【００２０】本発明のプライマーは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ｉｐａＨ遺伝子陽性と判断され
た菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｐａＨ遺伝子陰性の菌
株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわち、ｉｐａＨ
遺伝子を正しく増幅し、ｉｐａＨ遺伝子をもつ赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌を正確に検出していることを示し
ている。
ダイゼーション試験で、ｉｐａＨ遺伝子陽性と判断され
た菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｐａＨ遺伝子陰性の菌
株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわち、ｉｐａＨ
遺伝子を正しく増幅し、ｉｐａＨ遺伝子をもつ赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌を正確に検出していることを示し
ている。
【００２１】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【００２２】［実験例２］実験例１で得られた結果がｉ
ｐａＨ遺伝子に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、赤痢菌およ
び腸管侵入性大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について
本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。方法
は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと同じ
である。
ｐａＨ遺伝子に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、赤痢菌およ
び腸管侵入性大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について
本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。方法
は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと同じ
である。
【００２３】検体の調製 表2中に示した各菌株ををそれぞれ適当な増菌培地に接
種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Camp
ylobactercoli、Bacteroides flagilis、Bacteroides v
ulgatus、Lactobacillusacidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Camp
ylobactercoli、Bacteroides flagilis、Bacteroides v
ulgatus、Lactobacillusacidophilus 、Bifidobacteriu
m adolescentisである）。各菌株培養液０. ５ｍｌから
遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１
回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
【００２４】結果 表2にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｐａＨ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｐａＨ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
【００２５】
【表2】
【００２６】（実施例2：赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のｉｎｖＥ遺伝子の検出） ［実験例１］ 検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表1の３４
１株を用い、実施例１と同様の手法で検体を調整した。
菌のｉｎｖＥ遺伝子の検出） ［実験例１］ 検体の調整 赤痢菌および腸管侵入性大腸菌の菌株として表1の３４
１株を用い、実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００２７】プライマーの合成 文献（Watanabe, H. et al., J. Bacteriol., 172, 619
-629, 1990）に記載された赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列から、請求項第３項に示
した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラス
ＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を
用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
-629, 1990）に記載された赤痢菌および腸管侵入性大腸
菌のｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列から、請求項第３項に示
した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラス
ＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を
用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００２８】ＰＣＲ プライマーの組合せとして、下記の組合せを用いた以外
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (e) ＋ (f)
は、実施例１と同様の反応条件でＰＣＲを行った。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (e) ＋ (f)
【００２９】検出 実施例１と同様の方法で行った。
【００３０】コロニーハイブリダイゼーション試験 ｉｎｖＥ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961(1975) ）に
したがって行った。
を用いて、Grunsteinの方法（Grunstein, M. and Hogne
ss, D., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961(1975) ）に
したがって行った。
【００３１】結果 前述したように赤痢菌および腸管侵入性大腸菌のｉｎｖ
Ｅ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(e) と(f) の組合せで
は、２９３塩基（または２９３塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｎｖＥ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｎｖ
Ｅ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表3に示す。
Ｅ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定で
きる。それによるとプライマー(e) と(f) の組合せで
は、２９３塩基（または２９３塩基対）の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプ
ライマーの組合せは、ｉｎｖＥ遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はｉｎｖ
Ｅ遺伝子を有していると判断した。被験菌株３４７株で
調べた結果を表3に示す。
【００３２】本発明のプライマーは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ｉｎｖＥ遺伝子陽性と判断され
た菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子陰性の菌
株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわち、ｉｎｖＥ
遺伝子を正しく増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子をもつ赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌を正確に検出していることを示し
ている。
ダイゼーション試験で、ｉｎｖＥ遺伝子陽性と判断され
た菌株のＤＮＡのみを増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子陰性の菌
株ＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわち、ｉｎｖＥ
遺伝子を正しく増幅し、ｉｎｖＥ遺伝子をもつ赤痢菌お
よび腸管侵入性大腸菌を正確に検出していることを示し
ている。
【００３３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【００３４】［実験例２］実験例１で得られた結果がｉ
ｎｖＥ遺伝子に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、赤痢菌およ
び腸管侵入性大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について
本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。方法
は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと同じ
である。
ｎｖＥ遺伝子に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、赤痢菌およ
び腸管侵入性大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について
本発明のプライマーが反応するかどうかを調べた。方法
は検体の調製法を除いて、実験例１で示したものと同じ
である。
【００３５】検体の調製 表４中に示した各菌株を実施例１の実験例２と同様の手
法で行った。
法で行った。
【００３６】結果 表４にプライマーの組合せにおける試験結果を示す。本
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｎｖＥ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
発明のプライマーの組合せは、赤痢菌および腸管侵入性
大腸菌のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとす
る種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅するこ
とはなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーは、ｉｎｖＥ遺伝子を有する菌
にのみ、選択的に反応するものと断言できる。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび赤痢菌の一病原因子であるｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝
子を標的とするプライマーを用いたことにより、志賀毒
素遺伝子を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用に
よる高い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数の
プライマーで反応が規定されることによる高い選択性と
が得られる。
よび赤痢菌の一病原因子であるｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝
子を標的とするプライマーを用いたことにより、志賀毒
素遺伝子を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用に
よる高い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数の
プライマーで反応が規定されることによる高い選択性と
が得られる。
【００３９】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
【００４０】赤痢菌の検査には、発見患者の迅速・適切
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つであるｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝子を選択的に検出する
ものである。したがって、本発明により、起因菌として
の赤痢菌の検出を正確に行うことが可能となる。
な治療および防疫措置のために、遅滞のない正確な結果
が要求される。また、本発明は、赤痢菌の病原因子の一
つであるｉｐａＨ、ｉｎｖＥ遺伝子を選択的に検出する
ものである。したがって、本発明により、起因菌として
の赤痢菌の検出を正確に行うことが可能となる。
【００４１】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ
【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ
【００４３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ
【００４４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Shigella dysenteriae, Shigella flexneri,
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ
Shigella boydiiおよび Shigella sonnei 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（1990）Ｖ ｏｌ．172，Ｎｏ．４，ｐ．1905−1915 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（1990）Ｖ ｏｌ．172，Ｎｏ．２，619−629 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 検体中に存在する赤痢菌（Shigella dys
enteriae,Shigella flexneri,Shigella boydii および
Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（enteroinv
asive Escherichia coli）に選択的に存在しているｉ
ｐａＨ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列の少なくとも連続した１０塩基以上を含
むオリゴヌクレオチド （５’）−ＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣ−（３’）・・(c) （５’）−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＧ−（３’）・・・(d) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 検体中に存在する赤痢菌（Shigella dys
enteriae,Shigella flexneri, Shigella boydii, およ
び Shigella sonnei）および腸管侵入性大腸菌（entero
invasiveEscherichia coli）に選択的に存在しているｉ
ｎｖＥ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以上を
含むオリゴヌクレオチド （５’）−ＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＣ−（３’） ・・・・(e) （５’）−ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣ−（３’） ・・・・・・(f) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項第１項〜第２項に記載されたオリ
ゴヌクレオチドの配列のうちの一つを有するオリゴヌク
レオチドの配列を選択的に増幅させることを特徴とする
方法であって、 (a)検体中の１本の鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 (b)得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離し
た場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
の鋳型として機能し、 (c)これら２種のプライマーによる同時鎖長反応、鎖長
生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマーによ
るハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、特定
のヌクレオチド配列を増幅させ、検出し、 (d)その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することで、赤痢菌の検出を行う
ことを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22499998A JP3331977B2 (ja) | 1994-02-28 | 1998-08-07 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-30276 | 1994-02-28 | ||
| JP3027694 | 1994-02-28 | ||
| JP22499998A JP3331977B2 (ja) | 1994-02-28 | 1998-08-07 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06048174A Division JP3141976B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-03-18 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11113585A JPH11113585A (ja) | 1999-04-27 |
| JP3331977B2 true JP3331977B2 (ja) | 2002-10-07 |
Family
ID=26368603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22499998A Expired - Lifetime JP3331977B2 (ja) | 1994-02-28 | 1998-08-07 | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3331977B2 (ja) |
-
1998
- 1998-08-07 JP JP22499998A patent/JP3331977B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．２，６１９−６２９ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．４，ｐ．１９０５−１９１５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11113585A (ja) | 1999-04-27 |
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