JPH0789959B2 - ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH0789959B2 JPH0789959B2 JP18568489A JP18568489A JPH0789959B2 JP H0789959 B2 JPH0789959 B2 JP H0789959B2 JP 18568489 A JP18568489 A JP 18568489A JP 18568489 A JP18568489 A JP 18568489A JP H0789959 B2 JPH0789959 B2 JP H0789959B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査、殊に食中毒検査、または食品検査
において、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）
を検出する。
において、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）
を検出する。
［従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、ウェルシュ菌と同定するまでには、増菌培
養、確認培養に至る操作を行わなければならない。各培
養段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間に
すると約２日間となり、長時間を要する。確認培養で
は、好気培養試験、運動性試験、ゼラチン液化試験、炭
水化物分解試験、レシチナーゼ反応抑制試験ならびに牛
乳凝固消化試験を行う必要があり、時間的、コスト的に
負担が大きい。さらに、ウェルシュ菌の腸炎起病性、す
なわち、食中毒を起こさせるenterotoxinが産生されて
いるかどうかを調べる必要がある。enterotoxinの検査
法としては、ウサギ結さつ腸管反応、マウス致死反応、
モルモットあるいはウサギ皮内反応、培養細胞致死活性
などの生物学的な方法、およびゲル内沈降反応、カウン
ター免疫電気泳動法、ラテックス凝集反応、ELISA法、
ラジオイムノアッセイ法などの免疫学的な方法とがあ
る。ラテックス凝集反応の１つで逆受身ラテックス凝集
反応で直接検出する方法がこれまで最も有効方法であっ
たが、結果を得るまでに20〜24時間を要する。
料の場合、ウェルシュ菌と同定するまでには、増菌培
養、確認培養に至る操作を行わなければならない。各培
養段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間に
すると約２日間となり、長時間を要する。確認培養で
は、好気培養試験、運動性試験、ゼラチン液化試験、炭
水化物分解試験、レシチナーゼ反応抑制試験ならびに牛
乳凝固消化試験を行う必要があり、時間的、コスト的に
負担が大きい。さらに、ウェルシュ菌の腸炎起病性、す
なわち、食中毒を起こさせるenterotoxinが産生されて
いるかどうかを調べる必要がある。enterotoxinの検査
法としては、ウサギ結さつ腸管反応、マウス致死反応、
モルモットあるいはウサギ皮内反応、培養細胞致死活性
などの生物学的な方法、およびゲル内沈降反応、カウン
ター免疫電気泳動法、ラテックス凝集反応、ELISA法、
ラジオイムノアッセイ法などの免疫学的な方法とがあ
る。ラテックス凝集反応の１つで逆受身ラテックス凝集
反応で直接検出する方法がこれまで最も有効方法であっ
たが、結果を得るまでに20〜24時間を要する。
最近では、オリゴヌクレオチドを用いたDNAプローブ法
あるいはハイブリダイゼーション法が試みられるように
なってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾し
たプローブにより膜上、あるいは他の支持体上でハイブ
リダイゼーションを行い、これを検出する場合、細菌検
査において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
あるいはハイブリダイゼーション法が試みられるように
なってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾し
たプローブにより膜上、あるいは他の支持体上でハイブ
リダイゼーションを行い、これを検出する場合、細菌検
査において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりウェルシュ
菌のenterotoxin遺伝子を検出するもので、食中毒検査
において簡便、迅速かつ高感度なウェルシュ菌について
の検出法を提供することにある。
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりウェルシュ
菌のenterotoxin遺伝子を検出するもので、食中毒検査
において簡便、迅速かつ高感度なウェルシュ菌について
の検出法を提供することにある。
［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
た遺伝子増幅法により、ウェルシュ菌を選択的に検出す
ることを特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌク
レオチドは、本発明者の当該分野におけるこれまでの幅
広い経験と総合的な知識の集積から、先ず次の〜の
観点に基づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
た遺伝子増幅法により、ウェルシュ菌を選択的に検出す
ることを特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌク
レオチドは、本発明者の当該分野におけるこれまでの幅
広い経験と総合的な知識の集積から、先ず次の〜の
観点に基づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
それぞれのオリゴヌクレオチドが19〜25個程度の塩基
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。遺伝子増幅技術は、Saikiらが、開発したP
olymerase Chain Reaction法（以下、略してPCR法;Scie
nce.230,1350（1985））をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は
ウェルシュ菌のenterotoxin遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした
試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプラ
イマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本
鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで２つのプライマーにはさまれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。検体
としては、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組
織ホモジェネートなど、また、食品材料でもよい。これ
ら材料をPCRの試料として用いるには、材料中に存在す
る菌体から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必
要となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできる
核酸が数分子から数十分子以上存在すればPCR反応は進
むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等
で短時間処理するだけでPCRを進行させるに十分な核酸
量を持った試料液が調製できる。本発明でプライマーと
して用いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感
度および再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15
塩基以上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成
あるいは天然のどちらでもよい。また、プライマーは、
特に検出用として標識されていなくてもよい。プライマ
ーが規定しているウェルシュ菌のenterotoxin遺伝子に
おける増幅領域は、50塩基から2,000塩基、望ましく
は、100塩基から1,000塩基となればよい。鋳型依存性ヌ
クレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを用
いているが、この酵素の起源については90〜95℃の温度
で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱
変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさ
せるアニーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は50
〜75℃で、これを１サイクルとしたPCRを20から42サイ
クル行って増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、
アガロースゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸
断片の存在およびその長さが確認できる。その結果か
ら、検体中に、プライマーが認識すべき配列を持った核
酸が存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままウェルシュ菌の有無を判定するものと
なる。増幅された核酸断片の検出には、その他の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。遺伝子増幅技術は、Saikiらが、開発したP
olymerase Chain Reaction法（以下、略してPCR法;Scie
nce.230,1350（1985））をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は
ウェルシュ菌のenterotoxin遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした
試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプラ
イマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本
鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで２つのプライマーにはさまれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。検体
としては、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組
織ホモジェネートなど、また、食品材料でもよい。これ
ら材料をPCRの試料として用いるには、材料中に存在す
る菌体から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必
要となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできる
核酸が数分子から数十分子以上存在すればPCR反応は進
むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等
で短時間処理するだけでPCRを進行させるに十分な核酸
量を持った試料液が調製できる。本発明でプライマーと
して用いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感
度および再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15
塩基以上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成
あるいは天然のどちらでもよい。また、プライマーは、
特に検出用として標識されていなくてもよい。プライマ
ーが規定しているウェルシュ菌のenterotoxin遺伝子に
おける増幅領域は、50塩基から2,000塩基、望ましく
は、100塩基から1,000塩基となればよい。鋳型依存性ヌ
クレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを用
いているが、この酵素の起源については90〜95℃の温度
で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱
変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさ
せるアニーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は50
〜75℃で、これを１サイクルとしたPCRを20から42サイ
クル行って増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、
アガロースゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸
断片の存在およびその長さが確認できる。その結果か
ら、検体中に、プライマーが認識すべき配列を持った核
酸が存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままウェルシュ菌の有無を判定するものと
なる。増幅された核酸断片の検出には、その他の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。
［実施例］ （実施例１） 検体の調製 ウェルシュ菌は表１の縦の見出しに示した11株を用いて
それぞれを適当な増菌培地に接種し、40℃、嫌気的条件
下で一晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作に
より菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとな
るように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で
溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノー
ルを同容量加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を回
収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱さ
せ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを
検体とした。
それぞれを適当な増菌培地に接種し、40℃、嫌気的条件
下で一晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作に
より菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとな
るように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で
溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノー
ルを同容量加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を回
収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱さ
せ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを
検体とした。
プライマーの合成 ウェルシュ菌のenterotoxin遺伝子のヌクレオチド配列
に関する情報は、enterotoxinのアミノ酸配列（Richard
son M.and Granum P.E.;FEBS Lett−ers182:479−484
（1985））より逆翻訳して得られた情報を用い、特許請
求範囲第１項に示した配列を選び、それと同じ配列を持
つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は島津
DNA合成機NS−１を用い、トリエステル法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相
カラムを用いて行った。
に関する情報は、enterotoxinのアミノ酸配列（Richard
son M.and Granum P.E.;FEBS Lett−ers182:479−484
（1985））より逆翻訳して得られた情報を用い、特許請
求範囲第１項に示した配列を選び、それと同じ配列を持
つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は島津
DNA合成機NS−１を用い、トリエステル法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相
カラムを用いて行った。
PCR 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水16.05μ
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）0.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）0.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
10×反応用バッファー:500mM KCl,100mM Tris−HCl
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン． dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので各終
濃度が1.25mM. プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml）． プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項に示した配
列（（ａ）〜（ｃ））より、次の組合せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Taq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製）． 反応条件は、次の通りである。
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン． dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので各終
濃度が1.25mM. プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml）． プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項に示した配
列（（ａ）〜（ｃ））より、次の組合せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Taq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製）． 反応条件は、次の通りである。
熱変性:94℃ １分 アニーリング:37℃ １分 重合反応:60℃ １分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（5.7分）とし、これを42サイクル（総所要時
間約４時間）行った。これらの操作は、Perkin Elmer C
etus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件をプログラ
ムすることで行った。
サイクル（5.7分）とし、これを42サイクル（総所要時
間約４時間）行った。これらの操作は、Perkin Elmer C
etus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件をプログラ
ムすることで行った。
検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
アガロースゲルはゲル濃度２％（w/v）とし、臭化エチ
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
結果 前述したように、逆翻訳したウェルシュ菌のenterotoxi
n遺伝子のヌクレオチド配列から、本発明のオリゴヌク
レオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増幅さ
れてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。それによ
ると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、728塩基、
（ａ）と（ｃ）では、602塩基の長さのヌクレオチドが
増幅されてくるはずである。表１に示した数値は、上記
方法で増幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結
果で、単位はキロ塩基対である。同表では（５）、
（７）、（11）の株を除き、各プライマーの組合せと
も、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、こ
れらの株にはenterotoxin遺伝子が存在し、標的として
いる領域を正しく増幅してきていることを示している。
n遺伝子のヌクレオチド配列から、本発明のオリゴヌク
レオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増幅さ
れてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。それによ
ると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、728塩基、
（ａ）と（ｃ）では、602塩基の長さのヌクレオチドが
増幅されてくるはずである。表１に示した数値は、上記
方法で増幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結
果で、単位はキロ塩基対である。同表では（５）、
（７）、（11）の株を除き、各プライマーの組合せと
も、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、こ
れらの株にはenterotoxin遺伝子が存在し、標的として
いる領域を正しく増幅してきていることを示している。
（実施例２） 実施例１で得られた結果が、ウェルシュ菌に対し選択的
なものかどうか確かめるため、臨床検査においてウェル
シュ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討
した。
なものかどうか確かめるため、臨床検査においてウェル
シュ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討
した。
方法は、実施例１に示したものと同じであるが、
（６）、（７）、（９）は嫌気的条件下、40℃で、それ
以外の株は好気的条件下、37℃で一晩培養を行った。検
体の調製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示
した10菌株である。また、ヒト胎盤由来DNAは１μg/ml
の濃度のものを調製し、これも同様にPCRを行わせた。
結果を表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキ
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCR反応の副次的
産物とみられる増幅されたヌクレオチド断片が検出され
たが、どれもenterotoxin遺伝子の塩基配列から推定さ
れるヌクレオチドの長さとは異なっている。ウェルシュ
菌と同じenterotoxin遺伝子をこれらの菌種が持ってい
れば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはずで
ある。従って、これら菌種由来の増幅されたヌクレオチ
ドはenterotoxin遺伝子を認識して生成されたものでは
ないことが明かであり、ウェルシュ菌とは容易に区別し
検出できることがわかる。なお、本発明の実施例に用い
ているアガロース電気泳動を前述の泳動条件で行えば10
0塩基対以下の範囲であれば５から10塩基対、100から50
0塩基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチド
の長さの違いを区別することができる。さらに、アクリ
ルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオチドの長さ
の測定の精度を向上させれば、選択的検出における信頼
度はさらに高まるものと考えられる。
（６）、（７）、（９）は嫌気的条件下、40℃で、それ
以外の株は好気的条件下、37℃で一晩培養を行った。検
体の調製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示
した10菌株である。また、ヒト胎盤由来DNAは１μg/ml
の濃度のものを調製し、これも同様にPCRを行わせた。
結果を表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキ
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCR反応の副次的
産物とみられる増幅されたヌクレオチド断片が検出され
たが、どれもenterotoxin遺伝子の塩基配列から推定さ
れるヌクレオチドの長さとは異なっている。ウェルシュ
菌と同じenterotoxin遺伝子をこれらの菌種が持ってい
れば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはずで
ある。従って、これら菌種由来の増幅されたヌクレオチ
ドはenterotoxin遺伝子を認識して生成されたものでは
ないことが明かであり、ウェルシュ菌とは容易に区別し
検出できることがわかる。なお、本発明の実施例に用い
ているアガロース電気泳動を前述の泳動条件で行えば10
0塩基対以下の範囲であれば５から10塩基対、100から50
0塩基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチド
の長さの違いを区別することができる。さらに、アクリ
ルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオチドの長さ
の測定の精度を向上させれば、選択的検出における信頼
度はさらに高まるものと考えられる。
（実施例３） 実施例１で用いたウェルシュ菌（Clostridium perfring
ens）11株についてenterotoxinの産生能について検討し
た。
ens）11株についてenterotoxinの産生能について検討し
た。
方法 ラテックス凝集法を用いた市販のenterotoxin検出用キ
ット（PET−RPLA:デンカ生研）により、そのマニュアル
に従って各ウェルシュ菌についてのenterotoxin活性を
調べた。
ット（PET−RPLA:デンカ生研）により、そのマニュアル
に従って各ウェルシュ菌についてのenterotoxin活性を
調べた。
結果 表３はその結果である。＋，−の判定は、同マニュアル
の判定基準に則って行った。なお、PCRによる結果は、
実施例１と同じ方法によるものである。
の判定基準に則って行った。なお、PCRによる結果は、
実施例１と同じ方法によるものである。
表に示した結果から明らかなように、市販キットによる
ラテックス凝集法で＋とでている株については、PCR法
でも正確な長さのヌクレオチド断片が生成されている。
−となった株については、PCR反応による増幅ヌクレオ
チド断片が生成されないか、生成しても長さが大きく異
なっている。このように、市販キットによるラテックス
凝集法と本発明の方法と結果は一致しており、このこと
は、ウェルシュ菌のenterotoxin産生能がenterotoxin遺
伝子の有無で検査できることを示している。したがっ
て、enterotoxin遺伝子の存在を直接、検出すること
は、enterotoxin産生能を持ったウェルシュ菌を検出し
ていることと同じ意味を持つ。本発明は、ウェルシュ菌
のenterotoxin遺伝子を直接、検出することで食中毒菌
としてのウェルシュ菌の検出を行うもので、以上の結果
は、本発明の目的に添うものである。
ラテックス凝集法で＋とでている株については、PCR法
でも正確な長さのヌクレオチド断片が生成されている。
−となった株については、PCR反応による増幅ヌクレオ
チド断片が生成されないか、生成しても長さが大きく異
なっている。このように、市販キットによるラテックス
凝集法と本発明の方法と結果は一致しており、このこと
は、ウェルシュ菌のenterotoxin産生能がenterotoxin遺
伝子の有無で検査できることを示している。したがっ
て、enterotoxin遺伝子の存在を直接、検出すること
は、enterotoxin産生能を持ったウェルシュ菌を検出し
ていることと同じ意味を持つ。本発明は、ウェルシュ菌
のenterotoxin遺伝子を直接、検出することで食中毒菌
としてのウェルシュ菌の検出を行うもので、以上の結果
は、本発明の目的に添うものである。
［発明の効果］ 本発明では、PCR法を用いたことで、遺伝子増幅作用に
よる高い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプライ
マーで反応が規定されることによる高い選択性を得るこ
とができる。また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮でき、検査の効率化を図る
ことができる。以下の実施例に示すが、反応時間が４時
間、検出にかかる操作が30分である。また、検出にアガ
ロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法
を用いることで、プライマー等に標識せずに検出が行
え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性
が高いものとなる。
よる高い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプライ
マーで反応が規定されることによる高い選択性を得るこ
とができる。また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮でき、検査の効率化を図る
ことができる。以下の実施例に示すが、反応時間が４時
間、検出にかかる操作が30分である。また、検出にアガ
ロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法
を用いることで、プライマー等に標識せずに検出が行
え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性
が高いものとなる。
プライマーが標的とするヌクレオチド配列にウェルシュ
菌のenterotoxin遺伝子を用いたことによる効果は、次
の通りである。ウェルシュ菌にはenterotoxinを産生す
る株と産生しない株があり、前者のenterotoxin産生株
が、食中毒原因菌となっている。また、ヒトの糞便中に
はenterotoxin非産生の常在性ウェルシュ菌がいる。特
に、糞便を検体として食中毒検査を行う場合、enteroto
xinを産生しているか否かが重要となる。従って、enter
otoxin遺伝子を標的とすることで食中毒原因菌としての
ウェルシュ菌を選択的に検出することができる。
菌のenterotoxin遺伝子を用いたことによる効果は、次
の通りである。ウェルシュ菌にはenterotoxinを産生す
る株と産生しない株があり、前者のenterotoxin産生株
が、食中毒原因菌となっている。また、ヒトの糞便中に
はenterotoxin非産生の常在性ウェルシュ菌がいる。特
に、糞便を検体として食中毒検査を行う場合、enteroto
xinを産生しているか否かが重要となる。従って、enter
otoxin遺伝子を標的とすることで食中毒原因菌としての
ウェルシュ菌を選択的に検出することができる。
Claims (2)
- 【請求項１】検体中において食中毒原因菌となるウェル
シュ菌（Clostridium perfringens）を選択的に検出す
るため、ウェルシュ菌のエンテロトキシン（enterotoxi
na）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、
そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成さ
れたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５′）ｄ−AATACATATTGTCCTGCATC（３′）……（ａ） （５′）ｄ−GTAATAGATAAAGGAGATGG（３′）……（ｂ） （５′）ｄ−GTAGTAGGATTTATACAAGC（３′）……（ｃ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオ
チドの配列のうち増幅されるべきヌクレオチド配列の両
端を規定する２つのオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプ
ライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択
的に増幅させることを特徴とするウェルシュ菌の検出方
法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチド
の重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機能
し、 （ｃ）前記プライマーによる鎖長反応、鎖長生成物の鋳
型からの分離、そして更なるプライマーによるハイブリ
ダイゼーションを繰り返すことにより特定のヌクレオチ
ド配列を増幅させ、 （ｄ）前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列を
持つ核酸が存在しているか否かを判定することでウェル
シュ菌の検出を行う方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568489A JPH0789959B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568489A JPH0789959B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0349699A JPH0349699A (ja) | 1991-03-04 |
| JPH0789959B2 true JPH0789959B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18568489A Expired - Fee Related JPH0789959B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789959B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5538851A (en) * | 1993-12-22 | 1996-07-23 | Institut Pasteur And Cneva | Primers for the amplification of genes coding for the enterotoxin and the lecithinase of Clostridium perfringens and their application to the determination of the presence and numeration of these bacteriae |
| DE69433201T2 (de) | 1994-02-28 | 2004-07-29 | Shimadzu Corp. | Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien |
| JP4894218B2 (ja) * | 2005-10-07 | 2012-03-14 | セイコーエプソン株式会社 | 半導体集積回路 |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18568489A patent/JPH0789959B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0349699A (ja) | 1991-03-04 |
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