JPH05227999A - 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH05227999A JPH05227999A JP3075592A JP3075592A JPH05227999A JP H05227999 A JPH05227999 A JP H05227999A JP 3075592 A JP3075592 A JP 3075592A JP 3075592 A JP3075592 A JP 3075592A JP H05227999 A JPH05227999 A JP H05227999A
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Abstract
を検出することを目的とする。 【構成】毒素原性大腸菌の産生するSThまたはSTp
遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ド(配列番号1〜8)を作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす毒素原性大腸菌のみを選択的に検出することを特
徴としている。
Description
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのSTh及び
/またはSTpを産生する毒素原性大腸菌の検出に関す
るものである。
は拭き取り材料の場合、STh、またはSTpを産生す
る毒素原性大腸菌が検出・同定されるまでには、まず、
増菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行
う必要がある。さらに、血清学的検査、生化学的試験、
およびエンテロトキシン産生試験を行って、はじめて耐
熱性エンテロトキシンを産生する毒素原性大腸菌である
と同定される。
段階で要する時間は、18〜24時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると1週間以上もの長時間を
要する。耐熱性エンテロトキシンの産生を試験する方法
は、乳のみマウス法が唯一のもので、これには、生後2
〜3日のマウスを用意しなければならず、操作も煩雑で
熟練を要するものである。しかも、3匹以上のマウスを
用いて試験し、その平均値を求める必要があるなど、再
現性、信頼性に欠ける点がある。
いたDNAプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、毒素原性大腸菌由来のSTh、またはST
p遺伝子を検出するもので、簡便、迅速、かつ高感度な
検査法を食中毒検査、または下痢症検査に提供すること
にある。
菌のSThおよび/又はSTp遺伝子と選択的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食
中毒症状を起こす病原大腸菌のうちSTh、またはST
pを産生する毒素原性大腸菌のみを選択的に検出するこ
とを特徴としている。
ドは、STh遺伝子およびSTp遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−TGTAATTTTCTCTTTTGAAGACTC−(3’) ・・・・(a:配列番号1) (5’)d−ATTACAACACAGTTCACAGCAG−(3’) ・・・・(b:配列番号2) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−CCTCAGGATGCTAAACCAG−(3’) ・・・・(c:配列番号3) (5’)d−AGGATGCTAAACCAGTAGAG−(3’) ・・・・(d:配列番号4) (5’)d−AATTCACAGCAGTAATTGCTAC−(3’) ・・・・(e:配列番号5) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG−(3’) ・・・・(f:配列番号6) (5’)d−GTCAACTGAATCACTTGACTC−(3’) ・・・・(g:配列番号7) (5’)d−TCACAGCAGTAAAATGTGTTG−(3’) ・・・・(h:配列番号8) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
たPolymerase Chain Reaction 法(以下、略してPCR
法; Science 230 1350(1985))をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域(本発明の
場合は毒素原性大腸菌のSTh遺伝子、またはSTp遺
伝子)を検出する場合、その領域の両端の一方は+鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意する。それを
熱変性により1本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依
存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能さ
せ、生成した2本鎖核酸を再び1本鎖に分離し、再び同
様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すこと
で2つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでに
コピー数が増大してくる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をPCRの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば,PCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCRを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ている毒素原性大腸菌のSTh、またはSTp遺伝子の
ヌクレオチド配列における増幅領域は、50塩基から
2, 000塩基、望ましくは100塩基から1, 000
塩基となればよい。
熱性DNAポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については90〜95℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は90〜95
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を1サイクルとした
PCRを20から42サイクル行って、検体中に含まれ
るSTh、またはSTp遺伝子を増幅させる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままSTh、または
STp遺伝子をもつ病原大腸菌の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。また、
上記の(a)〜(h)の配列の1つを有するオリゴヌク
レオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはその
他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出して
もよい。この場合、オリゴヌクレオチドは標識物で修飾
するのが好ましい。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
伝子の検出] (実験例1)検体の調製 下痢症患者から分離された病原大腸菌は表1〜22の縦
の見出しに示した総計492株を用い、それぞれの菌株
を適当な増菌培地に接種し、37℃の好気的条件下で終
夜培養を行った。各菌株培養液を10mMトリスー塩酸
緩衝液pH7.5(以下TE緩衝液)で希釈し、95℃
で10分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、そ
の上清を検体とした。
列(Moseley, S.L.,etal,Infect. Immun.39, 1167-1174
(1983) )から、請求項第1項に示した配列((a),およ
び(b) )を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。化学合成はサイクロンプラスDN
A合成装置(ミリジェン/バイオリサーチ社製)を用
い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はC18逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
μl 、10x反応用緩衝液3μl、dNTP溶液4.8
μl、プライマー(1) 1.5μl、プライマー(2) 1.
5μl、および耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μl
を加えて、全量30μlの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA 社製)を50
μl加え、反応液上に重層した。
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10x反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン dNTP溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
各水溶液(濃度5 OD/ml ) プライマーの組合せ: プライマー(1) ;配列(a) プライマー(2) ;配列(b) 耐熱性DNAポリメラーゼ: Taq DNAポリメラー
ゼ(5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製)。
サイクル(所要時間5.7 分)とし、これを35サイクル
(総所要時間約3時間)行った。これらの操作は、DN
Aサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus社製)に上
記反応条件をプログラムして行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
し、臭化エチジウム(0.5 μl/ml)を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧100V、30分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第2版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
p遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーがPCRに
より増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定でき
る。それによるとプライマー(a) と(b) の組合せを用い
た場合には、120塩基の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。これらの推定値と増幅されたヌク
レオチドの長さが一致した場合、各プライマーはST
h、またはSTp遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していると判断し、表1〜22中に”+”と記入し
た。一方、ヌクレオチドの増幅がみられなかったものに
は”−”を記入した。
結果を示す。表1〜22からわかるように、使用したプ
ライマーは、病原大腸菌のうち、STh、またはSTp
遺伝子をもっているとコロニーハイブリダイゼーション
法で確認された菌のみを正しく検出していることを示し
ている。
Th、またはSTp遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、
選択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査におい
て病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌等について
比較検討した。方法は検体の調製法を除いて、実験例1
で示したものと同じである。
種し、37℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った(このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表
中のClostridium perfringens 、Campylobacter jejun
i、Bacteroides flagilis、Bacteroides vulgatus、およ
びLactobacillus acidophilus である)。
り、菌体を回収し、TE緩衝液で菌体を1回洗浄した。
この菌体に50mMリン酸緩衝液pH7. 5に溶解した
N−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が50μg/ml、および1mg
/mlとなるように加え、37℃で10分間処理し、溶
菌した。TE緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液(混合比1:1)を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を1ml
のTE緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来DNA(Human placenta DNA)は、1μg/mlの濃
度のものを調製し、これも同様にPCRを行わせた。
症菌DNAをはじめとする種々のDNAの全てについ
て、それらのDNAを増幅することはなかった。したが
って、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマ
ーはSTh、またはSTp遺伝子をもつ病原大腸菌にの
み、選択的に反応するものと断言できる。
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、100塩基対
以下のヌクレオチドであれば、5から10塩基対、ま
た、100から500塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、10から20塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、STh、またはSTp遺伝子の選択的検
出における信頼度は、さらに高まるものと考えられる [実施例2:毒素原性大腸菌のSTh遺伝子の検出] (実験例1)検体の調製 実施例1と同様の手法で検体を調整した。
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) )
から、請求項第2項に示した配列((c), (d),および(e)
)を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例1と同様の方法で行った。
は、実施例1と同様の手法で行った。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがPCRにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
び(d) と(e) の各組合せを用いた場合には、それぞれ1
37、127塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはSTh遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表1中に”+”と記入した。一方、ヌクレオチドの増幅
がみられなかったものには”−”を記入した。表1〜2
2に病原大腸菌492株で調べた結果を示す。
ライマーは、病原大腸菌のうち、STh遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
Th遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例1と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
マーは下痢症菌DNAをはじめとする種々のDNAの全
てについて、それらのDNAを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはSTh遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
子の検出] (実験例1)検体の調製 実施例1と同様の手法で検体を調整した。
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) )
から、請求項第3項に示した配列((f), (g),および(h)
)を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例1と同様の方法で行った。
は、実施例1と同様の手法で行った。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがPCRにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
び(g) と(h) の各組合せを用いた場合には、それぞれ1
43、123塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはSTh遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表1〜22中に”+”と記入した。一方、ヌクレオチド
の増幅がみられなかったものには”−”を記入した。表
1に病原大腸菌492株で調べた結果を示す。
ライマーは、病原大腸菌のうち、STp遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
Tp遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例1と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
マーは下痢症菌DNAをはじめとする種々のDNAの全
てについて、それらのDNAを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはSTp遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
よび病原性と最も関連の深いSTh、またはSTp遺伝
子を標的とするプライマーを用いたことにより、ST
h、またはSTp遺伝子を有する毒素原性大腸菌の検出
において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、2
つ、あるいは、それ以上のプライマーで反応が規定され
ることによる高い選択性とが得られる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間3時間、検出にかかる操作が3
0分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅さ
れた核酸の長さを確認できるので結果の信頼性が高いも
のとなる。
(Esherichia coli )に同定・分類されたもののなか
に、ヒトへの病原性を有するもの、また、そうでないも
の等、種々の型の菌株が含まれていることが明かになっ
てきた。
して大腸菌を同定する際には、その大腸菌株が毒素等の
病原因子を産生するかどうかを調べないと原因菌として
の正確な判定ができなくなってきた。したがって本発明
は、このような状況の中で大腸菌病原因子の一つである
STh、またはSTpの遺伝子を選択的に検出すもので
あるので、病原大腸菌の選択的検出が可能となる。
Claims (4)
- 【請求項1】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のヒト型耐熱性エンテロ
トキシン(以下、STh)遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列、およびブタ型耐熱性エンテロトキシン(以
下、STp)遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを
標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群、 (5’)d−TGTAATTTTCTCTTTTGAAGACTC−(3’) ・・・・(a) (5’)d−ATTACAACACAGTTCACAGCAG−(3’) ・・・・(b) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項2】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のヒト型耐熱性エンテロ
トキシン(以下、STh)遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−CCTCAGGATGCTAAACCAG−(3’)・・(c) (5’)d−AGGATGCTAAACCAGTAGAG−(3’)・(d) (5’)d−AATTCACAGCAGTAATTGCTAC−(3’) ・・・・(e) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項3】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のブタ型耐熱性エンテロ
トキシン(以下、STp)遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG−(3’)・(f) (5’)d−GTCAACTGAATCACTTGACTC−(3’)・(g) (5’)d−TCACAGCAGTAAAATGTGTTG−(3’)・(h) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項4】請求項1〜3項に記載された各オリゴヌク
レオチドの配列のうち、少なくとも1つを有するオリゴ
ヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能させ、
標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを特徴
とする方法であって、 (a )検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、4種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 (b )得られた2本鎖標的ヌクレオチド配列を1本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる同
時の鎖長反応の鋳型として機能し、 (c )これら2種のプライマーによる同時の鎖長反応、
プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
とにより、特定のヌクレオチド配列が増幅され、増幅さ
れたヌクレオチド断片を検出し、 (d )その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでSTh及び/または
STpを産生する毒素原性大腸菌の検出を行うことを特
徴とする毒素原性大腸菌の検出方法。
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EP00125530A EP1085099A3 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
EP00125531A EP1085100A1 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
EP00125532A EP1085101A3 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
US08/379,295 US5516898A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-27 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection method using same |
US08/379,296 US5525718A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-27 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection method using same |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH05227999A true JPH05227999A (ja) | 1993-09-07 |
JPH07102158B2 JPH07102158B2 (ja) | 1995-11-08 |
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