JPH05227999A - 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH05227999A JPH05227999A JP3075592A JP3075592A JPH05227999A JP H05227999 A JPH05227999 A JP H05227999A JP 3075592 A JP3075592 A JP 3075592A JP 3075592 A JP3075592 A JP 3075592A JP H05227999 A JPH05227999 A JP H05227999A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ＳＴｈまたはＳＴｐを産生する毒素原性大腸菌
を検出することを目的とする。 【構成】毒素原性大腸菌の産生するＳＴｈまたはＳＴｐ
遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ド（配列番号１〜８）を作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす毒素原性大腸菌のみを選択的に検出することを特
徴としている。
を検出することを目的とする。 【構成】毒素原性大腸菌の産生するＳＴｈまたはＳＴｐ
遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ド（配列番号１〜８）を作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす毒素原性大腸菌のみを選択的に検出することを特
徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのＳＴｈ及び
／またはＳＴｐを産生する毒素原性大腸菌の検出に関す
るものである。
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのＳＴｈ及び
／またはＳＴｐを産生する毒素原性大腸菌の検出に関す
るものである。
【０００２】
【従来技術】検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品また
は拭き取り材料の場合、ＳＴｈ、またはＳＴｐを産生す
る毒素原性大腸菌が検出・同定されるまでには、まず、
増菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行
う必要がある。さらに、血清学的検査、生化学的試験、
およびエンテロトキシン産生試験を行って、はじめて耐
熱性エンテロトキシンを産生する毒素原性大腸菌である
と同定される。
は拭き取り材料の場合、ＳＴｈ、またはＳＴｐを産生す
る毒素原性大腸菌が検出・同定されるまでには、まず、
増菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行
う必要がある。さらに、血清学的検査、生化学的試験、
およびエンテロトキシン産生試験を行って、はじめて耐
熱性エンテロトキシンを産生する毒素原性大腸菌である
と同定される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、各培養
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると１週間以上もの長時間を
要する。耐熱性エンテロトキシンの産生を試験する方法
は、乳のみマウス法が唯一のもので、これには、生後２
〜３日のマウスを用意しなければならず、操作も煩雑で
熟練を要するものである。しかも、３匹以上のマウスを
用いて試験し、その平均値を求める必要があるなど、再
現性、信頼性に欠ける点がある。
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると１週間以上もの長時間を
要する。耐熱性エンテロトキシンの産生を試験する方法
は、乳のみマウス法が唯一のもので、これには、生後２
〜３日のマウスを用意しなければならず、操作も煩雑で
熟練を要するものである。しかも、３匹以上のマウスを
用いて試験し、その平均値を求める必要があるなど、再
現性、信頼性に欠ける点がある。
【０００４】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
【０００５】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、毒素原性大腸菌由来のＳＴｈ、またはＳＴ
ｐ遺伝子を検出するもので、簡便、迅速、かつ高感度な
検査法を食中毒検査、または下痢症検査に提供すること
にある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、毒素原性大腸菌由来のＳＴｈ、またはＳＴ
ｐ遺伝子を検出するもので、簡便、迅速、かつ高感度な
検査法を食中毒検査、または下痢症検査に提供すること
にある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、毒素原性大腸
菌のＳＴｈおよび／又はＳＴｐ遺伝子と選択的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食
中毒症状を起こす病原大腸菌のうちＳＴｈ、またはＳＴ
ｐを産生する毒素原性大腸菌のみを選択的に検出するこ
とを特徴としている。
菌のＳＴｈおよび／又はＳＴｐ遺伝子と選択的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食
中毒症状を起こす病原大腸菌のうちＳＴｈ、またはＳＴ
ｐを産生する毒素原性大腸菌のみを選択的に検出するこ
とを特徴としている。
【０００７】プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ドは、ＳＴｈ遺伝子およびＳＴｐ遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣ−（３’） ・・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｂ：配列番号２） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
ドは、ＳＴｈ遺伝子およびＳＴｐ遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とする場合は、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣ−（３’） ・・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｂ：配列番号２） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００８】また、ＳＴｈ遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧ−（３’） ・・・・（ｄ：配列番号４） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｅ：配列番号５） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧ−（３’） ・・・・（ｄ：配列番号４） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｅ：配列番号５） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００９】更に、ＳＴｐ遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴＣ−（３’） ・・・・（ｇ：配列番号７） （５’）ｄ−ＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧ−（３’） ・・・・（ｈ：配列番号８） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴＣ−（３’） ・・・・（ｇ：配列番号７） （５’）ｄ−ＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧ−（３’） ・・・・（ｈ：配列番号８） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１０】ここで、遺伝子増幅は、Saiki らが開発し
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子、またはＳＴｐ遺
伝子）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意する。それを
熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依
存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能さ
せ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同
様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すこと
で２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでに
コピー数が増大してくる。
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子、またはＳＴｐ遺
伝子）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意する。それを
熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依
存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能さ
せ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同
様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すこと
で２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでに
コピー数が増大してくる。
【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
【００１２】本発明でプライマーとして用いられる上記
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ている毒素原性大腸菌のＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子の
ヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２, ０００塩基、望ましくは１００塩基から１, ０００
塩基となればよい。
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ている毒素原性大腸菌のＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子の
ヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２, ０００塩基、望ましくは１００塩基から１, ０００
塩基となればよい。
【００１３】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
るＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子を増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
るＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子を増幅させる。
【００１４】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
【００１５】その結果から、検体中にプライマーが認識
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままＳＴｈ、または
ＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。また、
上記の（ａ）〜（ｈ）の配列の１つを有するオリゴヌク
レオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはその
他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出して
もよい。この場合、オリゴヌクレオチドは標識物で修飾
するのが好ましい。
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままＳＴｈ、または
ＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。また、
上記の（ａ）〜（ｈ）の配列の１つを有するオリゴヌク
レオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはその
他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出して
もよい。この場合、オリゴヌクレオチドは標識物で修飾
するのが好ましい。
【００１６】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
【００１７】
［実施例１：毒素原性大腸菌のＳＴｈ、またはＳＴｐ遺
伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 下痢症患者から分離された病原大腸菌は表１〜２２の縦
の見出しに示した総計４９２株を用い、それぞれの菌株
を適当な増菌培地に接種し、３７℃の好気的条件下で終
夜培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリスー塩酸
緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で希釈し、９５℃
で１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、そ
の上清を検体とした。
伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 下痢症患者から分離された病原大腸菌は表１〜２２の縦
の見出しに示した総計４９２株を用い、それぞれの菌株
を適当な増菌培地に接種し、３７℃の好気的条件下で終
夜培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリスー塩酸
緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で希釈し、９５℃
で１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、そ
の上清を検体とした。
【００１８】プライマーの合成 毒素原性大腸菌のＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子の塩基配
列（Moseley, S.L.,etal,Infect. Immun.39, 1167-1174
(1983) ）から、請求項第１項に示した配列（(a),およ
び(b) ）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮ
Ａ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用
い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
列（Moseley, S.L.,etal,Infect. Immun.39, 1167-1174
(1983) ）から、請求項第１項に示した配列（(a),およ
び(b) ）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮ
Ａ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用
い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００１９】ＰＣＲ 前記検体液３μl を用い、それに滅菌蒸留水１６．０５
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
【００２０】各使用した溶液の内容、およびプライマー
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
各水溶液（濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: プライマー(1) ；配列（ａ） プライマー(2) ；配列（ｂ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
各水溶液（濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: プライマー(1) ；配列（ａ） プライマー(2) ；配列（ｂ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
【００２１】反応条件は、次のとおりである。 熱変性: ９４℃、１分 アニーリング: ５５℃、１分 重合反応: ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
【００２２】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２３】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μｌ/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
し、臭化エチジウム（0.5 μｌ/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
【００２４】結果 前述したように、毒素原性大腸菌のＳＴｈ、またはＳＴ
ｐ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲに
より増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定でき
る。それによるとプライマー(a) と(b) の組合せを用い
た場合には、１２０塩基の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。これらの推定値と増幅されたヌク
レオチドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴ
ｈ、またはＳＴｐ遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していると判断し、表１〜２２中に”＋”と記入し
た。一方、ヌクレオチドの増幅がみられなかったものに
は”−”を記入した。
ｐ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲに
より増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定でき
る。それによるとプライマー(a) と(b) の組合せを用い
た場合には、１２０塩基の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。これらの推定値と増幅されたヌク
レオチドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴ
ｈ、またはＳＴｐ遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していると判断し、表１〜２２中に”＋”と記入し
た。一方、ヌクレオチドの増幅がみられなかったものに
は”−”を記入した。
【００２５】表１〜２２に病原大腸菌４９２株で調べた
結果を示す。表１〜２２からわかるように、使用したプ
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｈ、またはＳＴｐ
遺伝子をもっているとコロニーハイブリダイゼーション
法で確認された菌のみを正しく検出していることを示し
ている。
結果を示す。表１〜２２からわかるように、使用したプ
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｈ、またはＳＴｐ
遺伝子をもっているとコロニーハイブリダイゼーション
法で確認された菌のみを正しく検出していることを示し
ている。
【００２６】（実験例２）実験例１で得られた結果がＳ
Ｔｈ、またはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、
選択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査におい
て病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌等について
比較検討した。方法は検体の調製法を除いて、実験例１
で示したものと同じである。
Ｔｈ、またはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、
選択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査におい
て病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌等について
比較検討した。方法は検体の調製法を除いて、実験例１
で示したものと同じである。
【００２７】検体の調製 表２３〜２５中の各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接
種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表
中のClostridium perfringens 、Campylobacter jejun
i、Bacteroides flagilis、Bacteroides vulgatus、およ
びLactobacillus acidophilus である）。
種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表
中のClostridium perfringens 、Campylobacter jejun
i、Bacteroides flagilis、Bacteroides vulgatus、およ
びLactobacillus acidophilus である）。
【００２８】各菌株培養液０. ５ｍｌから遠心操作によ
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
【００２９】遠心後、上層液を回収し、エタノール処理
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００３０】結果 表２３〜２５に示すように、使用したプライマーは下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てについ
て、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。したが
って、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマ
ーはＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌にの
み、選択的に反応するものと断言できる。
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てについ
て、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。したが
って、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマ
ーはＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌にの
み、選択的に反応するものと断言できる。
【００３１】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
【００３２】さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子の選択的検
出における信頼度は、さらに高まるものと考えられる ［実施例２：毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝子の選択的検
出における信頼度は、さらに高まるものと考えられる ［実施例２：毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００３３】プライマーの合成 毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子の塩基配列（Moseley,
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) ）
から、請求項第２項に示した配列（(c), (d),および(e)
）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) ）
から、請求項第２項に示した配列（(c), (d),および(e)
）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００３４】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００３５】 プライマー(1) プライマー(2) (a) (c) (b) (c) 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００３６】結果 前述したように、毒素原性大腸菌のＳＴｈ遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００３７】それによるとプライマー(c) と(e) 、およ
び(d) と(e) の各組合せを用いた場合には、それぞれ１
３７、１２７塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴｈ遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表１中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増幅
がみられなかったものには”−”を記入した。表１〜２
２に病原大腸菌４９２株で調べた結果を示す。
び(d) と(e) の各組合せを用いた場合には、それぞれ１
３７、１２７塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴｈ遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表１中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増幅
がみられなかったものには”−”を記入した。表１〜２
２に病原大腸菌４９２株で調べた結果を示す。
【００３８】表１〜２２からわかるように、各２組のプ
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｈ遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｈ遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
【００３９】（実験例２）実験例１で得られた結果がＳ
Ｔｈ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
Ｔｈ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
【００４０】表２３〜２５に示すように、各組のプライ
マーは下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全
てについて、それらのＤＮＡを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはＳＴｈ遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
マーは下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全
てについて、それらのＤＮＡを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはＳＴｈ遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
【００４１】［実施例３：毒素原性大腸菌のＳＴｐ遺伝
子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００４２】プライマーの合成 毒素原性大腸菌のＳＴｐ遺伝子の塩基配列（Moseley,
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) ）
から、請求項第３項に示した配列（(f), (g),および(h)
）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
S.L., et al, Infect.Immun. 39, 1167-1174(1983) ）
から、請求項第３項に示した配列（(f), (g),および(h)
）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００４３】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００４４】 プライマー(1) プライマー(2) (f) (h) (g) (h) 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００４５】結果 前述したように、毒素原性大腸菌のＳＴｐ遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００４６】それによるとプライマー(f) と(h) 、およ
び(g) と(h) の各組合せを用いた場合には、それぞれ１
４３、１２３塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴｈ遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表１〜２２中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチド
の増幅がみられなかったものには”−”を記入した。表
１に病原大腸菌４９２株で調べた結果を示す。
び(g) と(h) の各組合せを用いた場合には、それぞれ１
４３、１２３塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてく
るはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオチ
ドの長さが一致した場合、各プライマーはＳＴｈ遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断し、
表１〜２２中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチド
の増幅がみられなかったものには”−”を記入した。表
１に病原大腸菌４９２株で調べた結果を示す。
【００４７】表１〜２２からわかるように、各２組のプ
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｐ遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
ライマーは、病原大腸菌のうち、ＳＴｐ遺伝子をもって
いるとコロニーハイブリダイゼーション法で確認された
菌のみを正しく検出していることを示している。
【００４８】（実験例２）実験例１で得られた結果がＳ
Ｔｐ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
Ｔｐ遺伝子をもつ病原大腸菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で、臨床
検査において病原大腸菌以外の検査対象となる下痢症菌
等について比較検討した。
【００４９】表２３〜２５に示すように、各組のプライ
マーは下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全
てについて、それらのＤＮＡを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
マーは下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全
てについて、それらのＤＮＡを増幅することはなかっ
た。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーはＳＴｐ遺伝子をもつ病原大腸菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
【００５０】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【００５１】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび病原性と最も関連の深いＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝
子を標的とするプライマーを用いたことにより、ＳＴ
ｈ、またはＳＴｐ遺伝子を有する毒素原性大腸菌の検出
において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つ、あるいは、それ以上のプライマーで反応が規定され
ることによる高い選択性とが得られる。
よび病原性と最も関連の深いＳＴｈ、またはＳＴｐ遺伝
子を標的とするプライマーを用いたことにより、ＳＴ
ｈ、またはＳＴｐ遺伝子を有する毒素原性大腸菌の検出
において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つ、あるいは、それ以上のプライマーで反応が規定され
ることによる高い選択性とが得られる。
【００５２】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅さ
れた核酸の長さを確認できるので結果の信頼性が高いも
のとなる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅さ
れた核酸の長さを確認できるので結果の信頼性が高いも
のとなる。
【００５３】最近の細菌学の進歩により、同じ大腸菌
（Esherichia coli ）に同定・分類されたもののなか
に、ヒトへの病原性を有するもの、また、そうでないも
の等、種々の型の菌株が含まれていることが明かになっ
てきた。
（Esherichia coli ）に同定・分類されたもののなか
に、ヒトへの病原性を有するもの、また、そうでないも
の等、種々の型の菌株が含まれていることが明かになっ
てきた。
【００５４】そこで、食中毒事件や、下痢症の原因菌と
して大腸菌を同定する際には、その大腸菌株が毒素等の
病原因子を産生するかどうかを調べないと原因菌として
の正確な判定ができなくなってきた。したがって本発明
は、このような状況の中で大腸菌病原因子の一つである
ＳＴｈ、またはＳＴｐの遺伝子を選択的に検出すもので
あるので、病原大腸菌の選択的検出が可能となる。
して大腸菌を同定する際には、その大腸菌株が毒素等の
病原因子を産生するかどうかを調べないと原因菌として
の正確な判定ができなくなってきた。したがって本発明
は、このような状況の中で大腸菌病原因子の一つである
ＳＴｈ、またはＳＴｐの遺伝子を選択的に検出すもので
あるので、病原大腸菌の選択的検出が可能となる。
【００５５】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２４塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣ
【００５６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧ
【００５７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧ
【００５８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧ
【００５９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣ
【００６０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧ
【００６１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴＣ
【００６２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 尾崎 博子 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内 (72)発明者 西村 直行 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内
Claims (4)
- 【請求項１】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のヒト型耐熱性エンテロ
トキシン（以下、ＳＴｈ）遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列、およびブタ型耐熱性エンテロトキシン（以
下、ＳＴｐ）遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを
標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣ−（３’） ・・・・（ａ） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｂ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のヒト型耐熱性エンテロ
トキシン（以下、ＳＴｈ）遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧ−（３’）・・（ｃ） （５’）ｄ−ＡＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧ−（３’）・（ｄ） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｅ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 検体中に存在する毒素原性大腸菌(enter
otoxigenicEsherichia coli )のブタ型耐熱性エンテロ
トキシン（以下、ＳＴｐ）遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧ−（３’）・（ｆ） （５’）ｄ−ＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴＣ−（３’）・（ｇ） （５’）ｄ−ＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧ−（３’）・（ｈ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項４】請求項１〜３項に記載された各オリゴヌク
レオチドの配列のうち、少なくとも１つを有するオリゴ
ヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能させ、
標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを特徴
とする方法であって、 （a ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （b ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる同
時の鎖長反応の鋳型として機能し、 （c ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
とにより、特定のヌクレオチド配列が増幅され、増幅さ
れたヌクレオチド断片を検出し、 （d ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでＳＴｈ及び／または
ＳＴｐを産生する毒素原性大腸菌の検出を行うことを特
徴とする毒素原性大腸菌の検出方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075592A JPH07102158B2 (ja) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| US07/932,379 US5468852A (en) | 1992-02-18 | 1992-08-19 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
| EP92307606A EP0556504B1 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting Vibrio parahaemolyticus |
| DE69231961T DE69231961T2 (de) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotide zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus |
| EP00125530A EP1085099A3 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
| EP00125531A EP1085100A1 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
| EP00125532A EP1085101A3 (en) | 1992-02-18 | 1992-08-20 | Oligonucleotides for detecting bacteria |
| US08/379,295 US5516898A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-27 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection method using same |
| US08/379,296 US5525718A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-27 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection method using same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075592A JPH07102158B2 (ja) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227999A true JPH05227999A (ja) | 1993-09-07 |
| JPH07102158B2 JPH07102158B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=12312506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3075592A Expired - Fee Related JPH07102158B2 (ja) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07102158B2 (ja) |
-
1992
- 1992-02-18 JP JP3075592A patent/JPH07102158B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07102158B2 (ja) | 1995-11-08 |
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