JPH0341095A - 遺伝子操作により産生されたアルツハイマープロテアーゼ阻害因子の相同体、それらの産生のための宿主菌株および発現ベクターおよび薬物としてのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルツハイマープロテアーゼ阻害因子（ＡＰ
Ｉ）の相同体、それらのアミノ酸配列およびまた遺伝子
操作法を使用するそれらの産生方法および薬物としての
それらの使用に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：自然配列の少
なくとも１つのアミノ酸が他の自然アミノ酸で置換され
ている、アルツハイマープロテアーゼ阻害因子（ＡＰＩ
）のアミノ酸配列からなるペプチド。このようなペプチ
ドはプロテアーゼ阻害因子として有用である。

アミロイドタンパク質凝集体は、アルツハイマー病をも
つ患者において神経炎の斑および脳血管の沈着物中に見
いだされた［Ｃ，Ｌ、マスターズ（Ｍａｓｔｅｒｓ）ら
、プロシーデインダス・オプ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８２，４２４５−４２４９．１
９５８］。

ヒトの脳組織からの対応するｃＤＮＡの分子生物学の研
究により、アミロイドタンパク質が６９５アミノ酸の前
駆体タンパク質の構成成分であることが示された［Ｊ、
カンノ（Ｋ　ａ　ｎ　ｇ）ら、ネイチャー　（Ｎａ　ｔ
　ｕ　ｒｅ）、３２５．７３３−７３６；１９８７］。

末梢組織からのｃＤＮＡつぃての連続的研究は関係する
ｃＤＮＡ種の発見に導き、これらの種はアミロイド前駆
体タンパク質の遺伝子中の１６８塩基対（ｂ　ｐ）［Ｐ
、ポンチ（Ｐ。

ｎｔｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３土、５
２５−５２７およびＲ，Ｅ、タング（Ｔａｎｚｔ）ら、
または２２５ｂｐ　　［Ｎ、キタグチ（Ｋｉｔａｇｕｃ
ｈｉ）ら、ネイチャ　　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３３１，
５３０−５３２　；、１９８８］の追加のＤＮＡセグメ
ントにより区別される。

アミロイド前駆体タンパク質のリーディングフレーム内
の１６８または２２５ｂｐのＤＮＡセグメントから誘導
されるアミノ酸配列は、クニツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型のプ
ロテアーゼ阻害因子、例えば、インター−σ−トリプシ
ン阻害因子（ｔｒｙ）または基本的膵臓トリプシン阻害
因子（ＢＰＴＩまたはアプロチニン）の阻害活性ドメイ
ンと強い相同性を示す。キタグチ（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ
）らは、ＣＯ５−１細胞をアミロイド前駆体のほぼ２２
５ｂｐだけ長いｃＤＮＡでトランスフエフシランした後
、トリプシン阻害活性を検出することができＩ；。アミ
ロイドの斑の形成およびアルツハイマー病の病原性につ
いての記載されたアルツハイマープロテアーゼ阻害因子
（ＡＰＩ）の機能および重要性は知られていない。

プロテアーゼ阻害因子、例えば、関連するアプロチニン
（ウシ器官からの基本的トリプシン阻害因子）は、広い
阻害特異性を有し、そして病気の治療における薬物とし
て多午にわたって使用されてきており、これらの病気は
、なかでも、自然プロテアーゼの欠損により区別される
〔参照、Ｈ１７リツソ（Ｆｒｉｔｚ）およびＧ、ウンツ
デレル（Ｗｕｎｄｅｒｅｒ）、アルツネイミッテルフォ
ルシュング（Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕ
ｎｇ）３３．４７９−４９４　；　１９８３］。

しかしながら、多数の病気は、阻害因子、例えば、アプ
ロチニンにより阻害することができない酵素の解放によ
り引き起こされる。これらはリンソームの酵素、例えば
、白血球エラスターゼを包含する。通常、これは、細胞
外の空間中への解放の間に、天然に産出する阻害因子、
例えば、σ１−グロテアーゼ阻害因子（α１−ＰＩ）と
の複合化により　〔Ｊ、トラビス（Ｔｒａｖｉｓ）およ
びＧ、Ｓ、サルベセン（Ｓａｌｖｅｓｅｎｚｌ　、Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、６５５−７０９；１９８
３］、抗ロイコプロテアーゼ（ＨＵＳＩ−Ｉ）により　
［Ｈ，ジ−スラー（ＳｃｈｉｅｓｓＩｅｒ）ら、ヒト多
形核白血球の中性プロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐ
ｒｏｔｅａｓｅ　　ｏｆＨｕｍａｎ　　Ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（１９
７８）１９５２０７：に、ヘイブマン（Ｈａｖｅｍａｎ
ｎ）およびＡ、ジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）編、Ｕｒｂａ
ｎ　　＆　　Ｓｃｈｗａ　ｒｚｅｎｂｅ　ｒｇ）または
σ、−マクログロブリン（σ２−Ｍ）［Ｇ、サルベセン
（Ｓａｌｖｅｓｅｎ）、Ｄ、ビル力（Ｖｉｒｃａ）およ
びＪ、）ラビス（Ｔｒａｖｉｓ）、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、４２１．３１６−３２６　；　１９
８３］不活性化される。遺伝性ａｒＰ１欠損、または阻
害因子の参加的不活性化【Ｊ、トラビス（Ｔｒａｖｉｓ
）およびＧ８サルベセン（Ｓａ　Ｉｖｅｓｅｎ）、Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、６５５−７０９；１９８３］、または
とくに白血球エラスターゼのプロテアーゼの大量の解放
は、結合組織および体液タンパク質の広範な劣化に導き
、次の重大な臨床的症候を伴う：肺の気腫、ショック肺
、大人の呼吸窮迫症候群、腎臓大人の肝臓の不全［参照
、Ｍ、ジョクム（Ｊｏｃｈｕｍ）ら、炎症の診断におけ
る新しい通路、ＰＭＮエラスターゼ（Ｎｅｕｅ　　Ｗｅ
ｇｅｉｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｎｔｚ（ｉｎｄｕｎｇｓｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｋ、ＰＭＮ　　Ｅｌａｓｔａｓｅ）（１
９８５）、ＧＩＴ−Ｖｅｒｌａｇ％Ｄａｒｍｓｔａ　ｄ
　ｔ　；Ｗ、　Ｗ、カフグアイア−（ＭｃＧｕａｉｅｒ
ｅ）ら、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、ｆｎｖ、６９．５４３；１９
８２およびＣ，Ｔ、　　リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎ、Ｅｎｇ
！、Ｊ、Ｍｅｄ、３０４．１９２−１９６；１９８１１
゜また、急性および慢性の炎症、例えば、慢性関節リウ
マチにおいて、白血球エラスターゼが決定的な役割を演
することは確実である［Ｋ、フレシェフ（ｋ　Ｉ　ｅ　
ｓ　ｉ　ｅ　ｋ）ら、炎症の診断における新しい通路、
ＰＭＮエラスターゼ（Ｎｅｕｅ　　Ｗｅｇｅ　　ｉｎ　
　ｄｅｒ　　Ｅｎｔｚｕｎｄｕｎｇｓｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｋ、ＰＭＮＥｌａｓｔａｓｅ）（１９８５）７１　８
２、ＧＩＴ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ］。

合皮エラスターゼ阻害因子［Ｊ、Ｃ，ワワーズ（Ｐｏｗ
ｅｒｓ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、Ｉ
２７．５５４−５５８　；　１９８３］および遺伝子操
作により産生されたエラスターゼ阻害因子ニグリンＣの
治療的有用性［Ｈ，Ｊ、シュネルビ（Ｓｃｈｎｅｂｌｉ
）ら、Ｅｕｒｏｐ、Ｊ。

Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、６６．５ｕｐｐ１．６６−７０
；１９８５］は、実験のセプシスおよび気腫のモデルを
示した。しかしながら、とくに長期間の治療において、
ヒト由来の安定な酸化不惑受性エラスターゼ阻害因子の
使用は、かなりの利点を提供して、毒性副作用およびこ
とにアレルギー性反応を回避する。

組み換えＤＮＡ技術により、ＡＰＩの阻害スペクトルを
位ｆｔ１３（ｐ■）においてアミノ酸置換により選択的
に変更することができること（第１図）および、位置１
５および３７においてアミノ酸置換と組み合わせてセリ
ンプロテアーゼ、例えば、エラスターゼ、カリクレイン
およびカテプシンＧに対する特異的阻害因子が得られる
ことが発見された。

そのうえ、阻害因子および解放されたエラスターゼの効
率よい排除は、腎臓を経て、白血球エラスターゼと複合
化したＡＰＩ相同体が低分子量であるために、起こる。

ＡＰＩタンパク質がヒト由来であるという事実をその低
分子量と組み合わせると、ＡＰＩ相同体の臨床的応用は
耐性に関する複雑さおよびアレルギー性合併症の危険を
回避することが期待される。

ＡＰＩ相同体のそれ以上の利点は、位置１５におけるＭ
ｅｔのアミノ酸置換後、σｒＰＩおよびロイコプロテア
ーゼに比較して、強く酸化性の物質が産生されかつ解放
される、炎症プロセスにおける酸化的不活性化に対して
それらが不感受性であるということである。このために
、ａｌ−ＰＩおよびロイコプロテアーゼに比較して、よ
り低い投与量のＡＰＩ相同体を使用して匹敵するプロテ
アーゼに対する保護を達成することができる。

本発明の目的は、変更された選択的および改良された阻
害効率とともにプロテアーゼ阻害活性を有する、薬理学
的に有用なペプチドを提供することである。遺伝子操作
により産生されるこれらのペプチドは、自然配列の少な
くとも１つのアミノ酸が他の自然アミノ酸で置換されて
いる、アルツハイマープロテアーゼ阻害因子（ＡＰＩ）
のアミノ酸配列からなる。本発明により阻害因子は、さ
らに、それらの阻害特異性を変更しないで、変更された
Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸配列を有するこ
とができる。これらのうちで次のものを理解すべきであ
る：ｌまたは２以上のアミノ酸の欠失、またはアミノ酸
、例えば、単一のペプチドまたはＭｅｔのＮＨ，末端へ
の付加、またはリンカ−配列としてオリゴペグチドのＣ
０ＯＨまたはＮＨ，への付加、これらは構成的に関連す
るか、あるいはそれらを使用して、より高い発現、また
はタンパク質の精製の改良を達成することができる。同
様に、酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）または塩基性（Ａｒｇ、
Ｌ’ｙｓ）のアミノ酸残基の位置（Ｐ、を排除する）に
アミノ酸置換を有する阻害因子を、本発明によるＡＰＩ
相同体の下で、目的は、阻害特異性を変更しなで、阻害
因子の酸性を特異的に変更し、こうして阻害因子の薬力
学的性質を変更することである。同一の目的は、また、
ＡＰＩの柔軟な領域における中性のアミノ酸残基を塩基
性または酸性のアミノ酸で置換することによって、例え
ば、位置３７〜３９をＡｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓで置換す
ることによって達成することができ、２つの塩基性アミ
ノ酸を特異性を変化させないでＡＰＩ中に導入すること
ができる。

非常に一般に、本発明による阻害因子はＡＰＩ変異型を
意味すると理解すべきであり、それらの種々の位置１３
における置換後、白血球エラスターゼ、カリクレインま
たはカテプシンＧの阻害因子となり、そしてさらに、こ
の阻害特異性を変更しない１，２またはそれ以上のアミ
ノ酸置換を含有することができる。

本発明は、位置１３（活性中心）に加えて、分子中の他
の□置に１または２以上のアミノ酸残基を置換すること
ができる、操作したＡＰＩ相同体に関する。置換のため
に好ましい位置は、次の位置である； 位Ｒ１３（Ｐ、−活性中心）： Ｖａ、Ｉ、Ｉ　ｌ　ｅ　−、Ｌ　ｅ　ｕ　１Ａ　］　ａ
　ｓ　Ｍ　ｅ　ｔ　％Ａ　ｓｎ％Ｇ１ｎ５Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒまたはＴｒｐ。

位置１５： Ｌｅｕｘ　Ｇ１３７％　Ａｌａｓ　Ｐｈｅｓ　Ａｒｇ、
Ｖａｌ、ｒｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

Ａｓｎ％ＧｉｎまたはＴｙｒ。

位置３７： Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅ　ｔ、Ａｓｎ
、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈ
ｒ。

位置５０： Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ％Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、
Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇ０本発明は、一般
に、本発明によるＡＰＩ相同体をエンコードする、合成
デオキシリポ核１！Ｅ！（ＤＮＡ）に関する。個々のア
ミノ酸残基の置換は、知られているように、対応する遺
伝子の部位特異的突然変異または合成により、可能であ
る。微生物または真核生物の細胞中の異種Ｄ　Ｎ　Ａの
発現の方法は、また、知られている。こうして、アプロ
チニンまたは相同体は組み換え微生物中で、Ｍｅｔアプ
ロチニン［Ｂ、ｖ、ウィルケン−バーブマン（Ｗｉ　　
Ｉ　ｃｋｅｎ−Ｂｅ　ｒｇｍａｎ）ら、Ｅ　ＭＢＯＪ、
、５．３２１９；３２１９］　として、またはβ−ガラ
クトシダーゼとの融合タンパク質［Ｅ、Ａ、アクエルス
ワルド（Ａｕ　ｅ　ｒｗａ　ｌ　ｄ）ら、欧州特許出願
第２３８，９９３号、１９８６年３月２６日］として、
合成遺伝子を使用して発現することができることが示さ
れた。さらに、プロテアーゼ阻害因子は前駆体タンパク
質、例えば、アルカリ性ホスファターゼのシグナル配列
をもつアプロチニン［Ｓ、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ）；’ロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　１
．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８０．６３８６　；
　１９８３］およびＯＭＰＡシグナル配列をもつ膵臓分
泌トリグシン阻害因子（ＰＳＴＩ）［Ｆ、マヤワルド（
Ｍａｙａｗａｌｄ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６８−１３
５７−３６９　；１９８８］として産生ずることができ
ることは、また、知られている。

遺伝子発現の他の可能性は、ＭＳ２　　ＤＮＡポリメラ
ーゼの部分的配列との融合タンパク質として、ヒトのア
プロチニンの産生について示された［Ｅ、シュナベル（
Ｓｃｈｎａｂｅｌ）ら、欧州特許出願第２９７，３６２
号またはドイツ国公開明細書３，７２４，５７０号１゜
所望のプロテアーゼ阻害因子は、融合タンパク質の酵素
または化学的切断により、例えば、融合成分への結合が
メチオニンバイアル起こる場合、そして、同時に、この
アミノ酸がプロテアーゼ阻害因子中に存在しないか、あ
るいは置換することができる場合、ＢｒＣＮの切断によ
り得ることができる。

そのうえ、また、本発明によるプロテアーゼ阻害因子は
真核生物の有機体（例えば、酵母菌、フィラメント状菌
類なと）中で発現することができる。

本発明は、とくに、第２図における合成ＤＮＡ配列およ
び同一アミノ酸のためのコドンを交換することによって
誘導されるその誘導体に関し、その翻訳により本発明に
よる阻害因子が得られる。

発現系の型に依存して、本発明によるＡＰＩ相同体の遺
伝子は、さらに、Ｍｅｔのための開始コドン、あるいは
シグナルペプチド、リンカ−ペプチドまたは融合タンパ
ク質をエンコードするＤ　ＮＡを含有することができる
。

さらに、本発明は、本発明によるＡＰＩ相同体のための
ＤＮＡ配列が挿入されている、酵母菌の発現ベクターに
関し、そしてこのベクターは適当な宿主菌株の形質転換
に使用される。

発現系の性質に依存して、本発明によるプロテアーゼ阻
害因子の発現のだめの遺伝子は、Ｍｅｔのための開始コ
ドン、あるいはシグナルペプチドをエンコードする、導
入された中性配列を、さらに、有することができる。

プロテアーゼ阻害因子のための好ましい融合成分は、微
生物のタンパク質の分泌シグナル配列、例えば、ｏｍｐ
Ａ［ブレイド（Ｇｈｒａｙｅｄ）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒ
ｎａｌ　　３．２４３−２４４２；１９８４）またはｐ
ｈｏ　　Ａ［グレイ（Ｇｒａｙ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ
）３９．２４７−２５４；１９８５］である。酵母菌中
の発現の場合において、それは交配因子アルファ（ＭＦ
σ）［クルシャン（Ｋｕｒｊａｎ）、細胞（Ｃｅｌｌ）
、３０．９３３；１９８２］のシグナル配列であること
ができる。

融合タンパク質は、発酵の間にベリプラズマまたは培地
中に分泌され、そして培養物濾液から分離される。適当
な分泌系を選択することによって、プロテアーゼ阻害因
子は自然タンパク質として分泌される。臭化シアンの切
断後の再生［Ｅ、グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびＢ、ウィ
トコツプ（Ｗｉｔｋｏｐ）、ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ
。

Ｓｏｃ、）、８３．１５１０−１５１１；１９６１Ｊは
、膜の通過のときの正しい処理の場合において不必要で
ある。本発明によるプロテアーゼ阻害因子は、培地から
、この分野において知られている方法により精製し、そ
して特性決定する。

遺伝子の発現の別の可能性は、本発明によるプロテアー
ゼ阻害因子の場合において、融合タンパク質が細胞中に
「封入体」の形態で沈着される場合、達成することがで
きる。不溶性融合タンパク質のこのような封入体は、例
えば、ＡＰＩ遺伝子をバクテリオ７アージＭＳ２のＤ　
Ｎ　ＡポリメラーゼのＤＮＡの部分的配列ＣＥ、レマウ
ルト（Ｒｅｍａｕ　ｌ　ｆ）　、Ｐ、サンッセンス（Ｓ
ｔａｎｓｓｅｎｓ）′８よびＷ、７フイアース（Ｆｉｅ
ｒｓ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１５−１８１（１９８１）
］　と融合することによって、および阻害因子の遺伝子
をバクテリオファージラムダのｃｌｌ遺伝子の部分的配
列［Ｋ、ナガイ（Ｎａｇａｉ）およびＨ７Ｃ，トルゲル
セン（Ｔｈｏｒｇｅｒｓｅｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）３Ｑ９．８１０；１９８４］と融合することによ
って、産生ずることができる。

封入体を経る本発明によるプロテアーゼ阻害因子の産生
は、次の工程からなる： １１宿主菌株を適当な条件下に増殖および誘発する： ２、封入体を宿主細胞から分離する； ３、融合タンパク質を精製する； ４、融合タンパク質を切断する； ５、阻害因子を再生する： ６、阻害剤を１＃製および特性決定する。

可溶性融合タンパク質の精製のために、ある数の酸性ま
たは塩基性のアミノ酸を切断すべき融合ペプチド中に組
み込み、こうしてイオン交換クロマトグラフィーによる
分離が促進する。

本発明によるプロテアーゼ阻害因子の最終の精製は、こ
の分野において知られている方法、例えば、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィーまたは親和クロマトグラ
フィーおよび電気泳動により実施する。

現在、発酵に適しかつ培養または発酵ブロス中で増殖す
ることができる、多数の異なる微生物が知られている。

形質転換に好ましい有機体は、バクテリア、酵母菌およ
び菌・かびを包含する。

本発明は、無毒の不活性製剤学的に適当な賦形剤に加え
て、１種または２種以上の本発明の化合物を含有する製
剤学的配合物を包含する。

本発明は、また、投与単位の製剤学的配合物を包含する
。これは、配合物が個々の部分、例えば、錠剤、被覆し
た錠剤、カプセル剤１、大薊、座薬およびアンプルの形
態で存在し、その活性化合物は個々の投与量の分画また
は多数に相当する。投与単位は、例えば、個々の投与量
の１．２．３または４倍または１／２、ｌ／３またはｌ
／４を含有することができる。個々の投与量は、好まし
くは、１回の投与で与えられかつ通常１日の投与量の全
体、ｌ／２、ｌ／３またはｌ／４に相当する量の活性化
合物を含有する。

無毒の不活性の製剤学的に適当な賦形剤とは、すべての
タイプの固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤およ
び配合助剤である理解すべきである。

述べることのできる好ましい製剤学的配合物は、錠剤、
被覆しｔ：錠剤、カプセル剤、大薊、顆粒剤、座薬、溶
液、懸濁液および乳濁液、パスタ、軟膏、ゲル、クリー
ム、ローション、粉剤およびスプレーである。

錠剤、糖剤、カプセル剤、大割および顆粒剤は、慣用の
賦形剤に加えて活性化合物を含有することができ、賦形
剤の例は次のとおりである：　（ａ）充填剤および増量
剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコー
ス、マンニトールおよヒサリチル酸、（ｂ）結合剤、例
えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼ
ラチンおよびポリビニルピロリドン、（Ｃ）保温剤、例
えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭
酸カルシウムおよび炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤
、例えば、パラフィンおよび（ｆ）吸収促進剤、例えば
、第四アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セ
チルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、
（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトお
よび（ｉ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシ
ウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリエチ
レングリコール、またはすぐ上に列挙した（ａ）〜（＋
）の物質の混合物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、大割および顆粒剤は、必要に
応じて不透明化剤を含有する、慣用の被膜および外殻を
有することができ、そして、また、活性化合物のみを放
出するか、あるいは必要に応じて遅延した方法で、腸管
のある部分において優先的に活性化合物を放出するよう
な組成をを有することができる。使用できる埋め込み組
成物の例は、ポリマーの物質およびろうである。

活性化合物は、また、マイクロカプセル化された形態で
存在することができ、適当ならば１種または２種以上の
前述の賦形剤を含有することができる。

座薬は、活性化合物に加えて、慣用の水溶性または水不
溶性の賦形剤、例えば、ポリエチレングリコール、油脂
、例えば、カカオ脂および高級エステル（例えば、Ｃ１
４−アルコールおよびＣ＋ａ脂肪酸のエステル）、また
はこれらの物質の混合物を含有することができる。

軟膏、パスタ、クリームおよびゲルは、活性化金物に加
えて、慣用の賦形剤、例えば、動物および植物の油脂、
ろう、パラフィン、澱粉、トラガ力ント、セルロース誘
導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナ
イト、ケイ酸、タルりおよび酸化亜鉛、またはこれらの
物質の混合物を含有することができる。

粉剤およびスプレーは、活性化合物に加えて、慣用の賦
形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化ア
ルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、
またはこれらの物質の混合物を含有することができる。

スプレーは、さらに、慣用の噴射剤、例えば、クロロフ
ルオロ炭化水素を含有することができる。

溶液および乳濁液は、活性化合物に加えて、慣用の溶媒
、例えば、可溶化剤および乳化剤、例えハ、水、エチル
アルコール、イソグロビルアルコール、炭酸エチル、酢
酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート
、プロピレングリコール、ｌ、３−ブチレングリコール
、ジメチルホルムアミド、油類、とくに綿実油、グラ°
ウンドナ・ノ）　（ｇｒｏｕｎｄｎｕ　ｔ）油、トウモ
ロｍｌ　’７胚油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油
、グリセロール、グリセロールホルマール、テトラヒド
ロフル７リルアルコール、ポリエチレングリコールおよ
びソルビタンの脂肪酸エステル、まＩ；はこれらの物質
の混合物を含有することができる。

非経口的投与のために、溶液および乳濁液は、また、血
液と等張である無菌の形態であることができる。

懸濁液は、活性化合物に加えて、慣用の賦形剤、例えば
、液状希釈剤、例えば、水、エチルアルコールまたはプ
ロピレングリコールおよび懸濁剤、例えば、エトキシル
化インステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソル
ビトールおよびソルビタンエステル、微結晶質セルロー
ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒
天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物を
含有することができる。

述べた配合物の形態は、また、着色剤、防腐剤、匂いお
よび味の改良剤、例えば、ペパーミント油およびユーカ
リ油および甘味剤、例えば、サッカリンを含有すること
ができる。

本発明の活性化合物は、好ましくは、前述の製剤学的配
合物中に、合計の混合物の約０．１〜９９．５重量％、
好ましくは約０．５〜９５重量％の濃度で存在すべきで
ある。

前述の製剤学的配合物は、また、他の製剤学的に活性な
化合物を本発明の化合物に加えて含有することができる
。

前述の製剤学的配合物は、慣用の方法で、既知の方法、
例えば、活性化合物を賦形剤と混合することによって調
製される。

活性化合物または配合物は、局所的に、経口的に、非経
口的に、腹腔内におよび／または経直腸的に投与するこ
とができ、好ましくはこれは経口的または非経口的に、
例えば、静脈内または筋肉内に実施する。

一般に、ヒトおよび動物の両者の医学において、本発明
の活性化合物を、約０．５〜５００１好ましくは５〜１
００ｍｇ／ｋｇ体重の合計量で、２４時間毎に、適当な
らばいくつかの個々の投与の形態で投与して、所望の結
果を達成することは有利である。個々の投与量は、本発
明による活性化合物を好ましくは約１〜約２５０、とく
に３〜６０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の量で含有する。

しかしながら、前述の投与量から逸脱することが必要で
あることがあり、とくに処置すべき患者の性質および体
重、病気の性質およびひどさ、配合の性質および薬物の
投与の性質および投与を行う期間または間隔に依存して
そのようにすることが必要なことがある。

こうして、ある場合において、前述の量より少ない活性
化合物と管理することが十分であることがある。活性化
合物の必要な最適な投与量および投与時間は、専門家に
より彼の経験に基づいて容易に決定することができる。

本発明による活性化合物は、急性炎症、例えば、慢性関
節リウマチ、遺伝性血管神経性浮腫、肺炎、膵臓炎およ
びショックの処理において非常によく使用される。さら
に、Ｌｙｓ−１３およびＡｒｇ−１３は、合成膜の助け
による透析において、般に体外循環（関心術）において
保護の機能を有する。臨床的発見により、フィブリン溶
解および凝固により引き起こされる「関心術」において
血液の損失は血漿のカリクレインおよびプラスミンの阻
害因子により減少することができる［Ｄ、ロイストン（
Ｒｏｙｓｔｏｎ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、Ｉ
Ｉ、ｐ、１２８９−１２９１；１９８７およびＣ，Ｆ、
スコツト（Ｓｃｏｔｔ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、Ｖｏｌ
、６９．１４３１−１４３６　；　１９８７］。

材料： 試薬および酵素 分子生物学および微生物学の実験のための試薬は、バイ
オラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ）ＢＲＬ、７アーマシア（Ｐ
ｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）　、ベーリンガー（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）（マンハイム）、デイ７コ（Ｄ　ｉ　ｒ
　ｃ　ｏ）　、メルク（Ｍｅｒｋ）、サーバ（Ｓ　ｅ　
ｒ　ｖ　ａ　）　、シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）そしてバ
イオアト（Ｂｉｏｒａｄ）から得た。

放射性同位元素 アデノシン−５′−σ［０Ｓ］−チオトリホスフェート
はアマ−ジャム・ブヒラー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　　Ｂｕ
ｃｈｌｅｒ）から得た。

ＮＡ 遺伝子およびベクターの構成のためのプラスミドおよび
７アージのＤＮＡおよびまたＤＮＡりンカーは、ベーリ
ンガー、バイオラプス、ＢＲＬおよびファーマシアから
、次の例外の除いて、得た。

例外ニ プラスミドｐＵＲ２７８：Ｕ、　リュータ−（Ｒｔｉｔ
ｈｅｒ）およびＢ、ミュラー−ヒル（Ｍｔｉｌｌｅｒ−
Ｈｉｌｌ）、ＥＭＢＯｊｏｕｒｎａ１２．１７９１−１
７９４　　（１９８３）；プラスミドｐＥｘ　　３１．
ｂ、：Ｅ、ペック（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋ）、ＥＭＢ　Ｌ　　
ハイデルベルグ。

Ｅ、ｃｏｌｉ菌株 Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ　　ＲＲＩＡＭ１５　（ＡＴＣＣＮｏ
、３５１０２）：Ｕ、　　リュータ−（Ｒｔｌｔ　ｈ　
ｅｒ）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）　、　ｌ　０１５７６５−５７７２（１
９８２）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　５３７−Ｗ６、ラムダ　ｒ
ｅｘ：Ｗ、ファイアース（Ｆｉｅｒｓ）ゲント大学（Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｔ）、ベルギー
［Ｅ、レマウルト（Ｒｅ　ｍ　ａ　ｕＩｔ）ら、（１９
８１）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）土５．８１−９３］。

培地および抗生物質 ＬＢ、Ｍ９ｓおよびＫａｐｐａ　　１７７６培地の処方
は、Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｊａｒ　　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ
　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ　ｏ　ｒ　）　、米国（
１９８２）に記載されているものに相当する。１５ｇの
バクト寒天を寒天平板のための培地に添加した。選択培
地の調製のために、次の抗生物質を使用した：ベーリン
ガーからのクロランフェニコールおよびカナマイシン；
サーバからのアンピシリンおよびテトラサイクリン。

方法 分子クローニングの実験のための日常の技術、例えば、
プラスミドＤＮＡの単離および精製、制限分析、アガロ
ースゲルおよびアクリルアミドゲルによるＤＮＡ断片の
分離および単離、バクテリアの形質転換などは、次の文
献に記載されている：Ｔ、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ
　ｔ　ｉ　ｓ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ）、（１９８２および１９８８）。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学的合成プロテアーゼ阻
害因子の遺伝子の構成に要求されるＤＮＡオリゴヌクレ
オチドは、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓ　ｔ　ｅｍｓ）からの自動化ＤＮ
Ａ合或合皮、３８０型を使用して合皮した。−本鎖ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドの精製は、ＨＰＬＣカラムを経る
か、あるいは調製用アクリルアミドゲルの電気泳動によ
り実施した。

ＤＮＡの配列決定 ＤＮＡ断片をｐＵＣベクター中でクローニングし、そし
てＤＮＡ配列をベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）からのプロトコル［
迅速かつ簡単なプラスミドの配列決定へのガイド（Ｇｕ
ｉｄｅ　　ｔｏ　　ｒａｐｉｄ　　ａｎｄ　　ｓｉｍｐ
ｌｅ　　ｐｌａｓｍｄ　　５ｅｑｕｅｎｃ　ｉｎｇ）；
　１９８６］。

ＡＰＩ相同体の標準の発現 細胞質の封入体の産生のための分泌ベクターおよび発現
ベクターの両者は、次の文献に記載されているように、
ＡＰＩ相同体の発現のために使用した：Ｆ、？イワルド
（Ｍａｙｗａｌｄ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６８．３５
７−３６９　（１９８８）およびＥ、シュナベル（Ｓｃ
ｈｎａｂｅｌ）ら、欧州特許出願第２９７，３６２号そ
してドイツ国公開明細書３，７２４．５７０号。

組み換え分泌ベクターをＥ、ｃｏｌｉ菌株ＲＲＩ　ＡＭ
　ｌ　５中に導入し、そしてＭＳ２プラスミドベクター
をＥ、ｃｏｌｉ菌株５３７中に導入した。

ａ）分泌ベクターの誘導 形質転換されｔ：Ｅ、ｃｏｌｉ菌株の新鮮な一夜の培養
物を、培地（３％のビーフエキス、１．５％の酵母エキ
ス、０．５％のＫ　！　ＨＰ　０４　）中でｌ：１００
に希釈した。

培養物をエルレンツイヤフラスコ中で２８°Ｃまたは３
８°Ｃにおいて、ＯＤ、、。、、−１，０となる′まで
、震盪した。Ｉａｃプロモーターの誘発は、ｌミリモル
のＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）の添加に
より実施した。

３７°Ｃにおいて１６〜２４時間の誘発後、培養物を遠
心（１０分；１５〜２０．０００ｇ；４°Ｃ）により収
穫した。分泌ベクターを使用するとき、培養物の上澄み
液および細胞をグロテアーゼ阻害活性について試験した
（参照、方法Ｂ）。

ｂ）λＦ、−ＭＳ２ポリメラーゼベクター７アージＭＳ
２のＤＮＡポリメラーゼの部分的配列を有する融合タン
パク質としてのＡＰＩ相同体の発現は、ｐＥｘベクター
［Ｅ、ペック（Ｂｅｃｋ）、ＥＭＢＬ　　ハイデルベル
グ］を使用してファージラムダのＰＬププローターの制
御下に実施した。

形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ菌株（Ｅｃ５３７の誘導体
）の増殖は、ＬＢ培地中で１００．ｕｇ／ｍＱのアンピ
シリンを使用して２００ｒｐｍおよび２８℃において実
施した［Ｅ、シュナベル（Ｓｃｈｎａｂｅｌ）ら、欧州
特許出願第２９７，３６２号そしてドイツ国公開明細書
３，７２４．５７０号に記載されているように］。ＯＤ
□。、５＝１．０において、温度を４２°Ｃに増加しく
熱の誘発）、そして３体積の新鮮な培地の添加後、培養
物をさらに３時間２００ｒｐｍにおいてインキュベーシ
ョンした。

細胞を遠心（上を参照）により収穫し、ＳＤＳ試料緩衝
液中で崩壊し、そしてアリコートをＳＤＳポリアクリル
アミドゲルの電気泳動により分離し　ｔこ　。

蓄積した融合タンパク質はゲルをクーマツシー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ）プル・−で染色することによって検出し
、そして融合タンパク質の百分率をデンシトメトリーに
より測定した。

材料 酵素 ヒト顆粒球エラスターゼ（ＳＥ５６３）およびヒト力テ
プシンＧ（ＳＧ４５）は、エラスチン・プロダクツ社（
Ｅｌａｓｔｉｎ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ、Ｉｎｃ、、米国マサチュセッツ州６３０６９、バシ
フイック、Ｐ、０．Ｂｏｘ１４７）から得た。トリプシ
ン（ウシ）はＥ、メルク（Ｍｅｒｃｋ、ダーマシュタッ
ト）から得た。

ヒト血漿カリクレイン（８０−１３−１１０１）はプロ
トゲン社（Ｐｒｏｔｇｅｎ　　ＡＧ％　スイス国し−フ
エルフインゲン、ウェイデンマットウエグ４、Ｐ、Ｏ，
Ｂｏｘ　　ＣＨ−４４４８）から得た。ヒト尿カリクレ
インはＲ，ゲイゲル（Ｇｅｉｇｅ　ｒ）博±［ミュンヘ
ンの外科臨床大学の臨床化学および臨床生物化学学部、
Ｎｕｓｓｂａｕｍｓｔｒ、２０，８０００　　Ｍｕｎｉ
ｃｈ　　２）から入手し、ヒトのプラスミンはＫＡＢ　
Ｉ社（ストックホルム）から入手し、ヒトのアニオン性
およびカチオン性のトリプシンは、Ｋ、オールソン（Ｏ
ｈｌｓｓｏｎ）［±（マルメ・ジェネラル・ホスピタル
（ＭａｌｍｃＪ　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｈｏ５ｐｉｔａ＋
）、臨床化学および外科部、スイス国Ｓ−２１４０マル
メ］から入手した。

基ｌ ５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ｐＮＡおよびＭｅＯ
５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−ｐＮＡ　
（ＨＣＧ）は、ベイケム（Ｂ　ｃ　ｈ　ｅ　ｍ）ファイ
ン・ケミカルレス社（Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
　　ＡＧ）、スイス国ブベンドル７ＣＨ−４４１６ハウ
ブター１４４、から入手し、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡｘ２ＨｃＩ＝ｓ−２３０２（血漿カリクレイ
ン）、Ｄ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡｘ２Ｈｃ
ｌ−ｓ−２２６０（器官カリクレイン）およびＰｙｒ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡｘ２ＨＣＩ−３−２４４４Ｃト
　リプンン）はドイツ国カビ社（Ｋａ　ｂ　ｉ　　Ｇｍ
ｂＨ。

Ｄ−８０００ミユンヘン８０、レー７エリンストラッセ
１８）から購入した。ＴＯｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−ｐＮＡ−ＣＨ，−ＣＯＯＨ（クロモザイムＰＬ）（プ
ラスミン）はベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ％Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。

ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣ 調製用および分析用ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣクロマトグ
ラフィーは、適当なカラムを使用して実施した。

アミノ酸配列の決定 本発明によるプロテアーゼ阻害因子のアミノ酸配列を決
定するために、０．５〜２μモルの基質はポリブレン（
Ｐｏｌｙｂｒｅｎ■）で予備処理したガラス繊維のフィ
ルター上に配置し、そして配列の分析は気相タンパク質
配列決定装置［アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７０１　を使用
して実施した。各サイクルにおいて解放されたアミノ酸
の７工ニルチオヒダントインは、ペイレウテル［Ｋ、Ｂ
ｅｙｒｅｕｔｈｅｒＳＢ、Ｂｉｅｓｌｅｒ、Ｊ。

Ｂｏｖｅｎｓ、Ｒ，Ｄｉ　Ｉｄｒｏｐ％に、Ｎｅ　１ｆ
ｅｒ、に、５ｔｕｂｅｒ、Ｓ、Ｚａｉｓ、Ｒ。

Ｅｈ　ｒ　ｉ　ｎｇおよびＰ、Ｚａｂｅｌ、タンパク質
化学における現代の方法（Ｍｏｄｅｒｎ　　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　ｉｎ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈｅｍｉｓｔ　
ｒｙ）ｐ、３０３−３２５　；　１９８３、ベルリン、
ワルター・デ・グルイテル）に従い、イソクラティック
溶離によりゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＣＮカラムの
ＨＰＬＣにより、同定および定量　し　Ｉこ　。

定量的アミノ酸組成の　定 各場合において、約ｌμモルの阻害因子を密閉排気した
パイレックス管中で、０．０５％のメルカプトエタノー
ルを含有する２００μＱの一定の沸騰する塩酸とともに
２２時間１００　”０に加熱した［Ｊ、Ｔ、ポック（Ｐ
ｏｔｔｓ）Ｊｒ、、アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１３１．１−１５　（１９６９）
］。蒸発残留物を１５０μＱの０．２モルのクエン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ２，２中に取り、そして不溶性成分
を濾過により除去した。加水分解中に存在するアミノ酸
は、バイオトロニック（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ）ＬＣ５０
００アミノ酸分析器（フルオレセイン検出器およびシマ
ズＣＲ２ＡＣ積分器）で分離した。定量は０−フェニル
アルデヒドで誘導化後実施した［Ｊ、Ｒ，ベンツン（Ｂ
ｅｎｓｏｎ）およびＰ、Ｅ、ヘアー（Ｈａｒｅ）、プロ
シーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７２，６１９　６２２（１９７５
）に記載されているように］。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 ＳＤＳ電気泳動は、ラエムリ　［Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７７．６８０　（
１９７０）に従い実施した。タンパク質のバンドは、Ｊ
、Ｌ、ステファン（Ｓｔｅｐｈａｎｏ）、Ｍ、ゴウルド
（Ｇｏｕｌｄ）およびり。

ロジャスーガリシア（Ｒｏｊａｓ−Ｇａ　ｌ　ｉｃ　ｉ
ａ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
ｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５２．３０８　（１９８
６）に記載されているように染色した。

臭化シアンの切断後の不活性阻害因子の再生臭化シアン
の切断後の不活性阻害因子の再生は、アプロチニンにつ
いて記載されている方法により実施した［Ｔ、Ｅ、クイ
トン（Ｃｒｅｉｇｈｔ。

ｎ）、分子および細胞の生物学的についてのＵＣＬＡシ
ンボジア（ＵＣＬＡ　　Ｓｙｍｐｏｓｉａｏｎ　　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｔａｒ　　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）３９，２４９−２５７；　１９８６、Ｄ
、Ｌ、オキセンダー（Ｏｘｅｎｄｅｒ）編、Ａ、Ｒ，Ｌ
ｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、ニューヨーク１゜ 酵素の試験 発酵バッチ中の阻害因子含量の決定 発酵ブロスの試料を遠心により透明にし、そして阻害活
性を上澄み液および細胞中で、次のようにして決定した
： ａ）培養物の濾液：ｌＯμＱのツイーン８０の５％水溶
液および４０μＱの過塩素酸（７０％）を混合しながら
１ｍ１２の培養物濾液に添加した。

この混合物を室温に３０分間に保持し、そして形成した
沈澱を遠心により分離した。透明の上澄み液を１８０μ
Ｑの飽和トリス溶液を添加して中和した。８０ｐＱのヒ
ト白血球エラスターゼの新しく調製された溶液（０，０
５モルの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，５エチレングリ
コールｌ：１の１ｍ（２当たり１ｍｇの原溶液を試験緩
衝液で１００倍に希釈して調製した）および、ｌ系列の
濃度において、沈澱からの所望の体積の中和した上澄み
液を４２０μＱの０．２モルのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐ
Ｈ８，０（これは０．５％のアジ化ナトリウムおよび０
．１％のツイーン８０を含有する）に添加した。次いで
、各試料の体積を試験緩衝液で５５０μＱにし、１００
％の試料は試験緩衝液のみを含有する。室温において３
０分間予備インキュページ３ン後、各場合において、１
００μ（の試験緩衝液および６．５μαのジメチルスル
ホキシド中のＭｅＯＳｕ　ｃ−Ａ　ｌ　ａ−Ａ　Ｉ　ａ
−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡのＯ，１モルの溶液を添加
し、モしてｎ−ニトロアニリンの酵素の解放により引き
起こされる４０５ｎｍにおける吸光の増加を決定した。

阻害百分率は、次式により計算する：阻害％−１００Ｘ
Ｎ−（阻害因子を添加したΔ。Ｄ／阻害因子を添加しな
いΔ。ｏ）　］阻阻害子の濃縮の定量は、Ｖａｌ−１５
アプロチニンを使用してプロットした標準曲線を使用し
て実施した。

ｂ）細胞：培養ブロスを遠心して得られた細胞を、もと
の体積の１／１０の５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝
液ｐＨ７，５（これはツイーン８０中の０．０５％であ
った）中に懸濁した。

細胞を超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎ　　５ｏｎｉｆｉｅ
ｒ、Ｃｅ１ｌ　　Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ　　Ｂ１５）を使
用して４℃において崩壊した（４００ワツト、超音波処
理、１分／１ｍＱの試料体積）。前述の方法で過塩素酸
を使用して内因性阻害因子を沈澱した後、阻害因子含量
は同様に決定した。

純粋な物質をグロテアーゼ様力テプシンＧ１白血球エラ
スターゼ、器官（ｖ！、）カリクレイン、血漿カリクレ
インについて、および］・リプシンについて試験する条
件を表１に要約する。酵素活性の決定および酵素の阻害
は、この分野において知られている方法により実施した
。

酵母菌中のＡＰＩ相同体の発現のためのベクターの構成 ｐＭＴ１５の構成のための出発プラスミドは、カイザー
［Ｃ，Ａ、Ｋａｉｓｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、マサチュセッツ州ケンブリッジ１から得た。プラ
スミドはＡｍｐ”およびＵＲＡ３を選択マーカーとして
ならびにｐＢＲ３２２の複製起源および２μのセグメン
トを有し、それらにより、このプラスミドはサツカロミ
セス・セレビンアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で複製することができ、そし
てＥ、ｃｏｌｉ　　ｐＣＧＳ６５は全体の５ＵＣ２（イ
ンベルターゼ）のｃＤＮＡを含有する。インベルターゼ
のＣ００Ｈ−末端をＢａｍＨＩ切断により欠失し、モし
てＵＲＡ３からの１６０ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｂｇ　ｌ　
Ｉ　Ｉ断片により置換した（これは酵母菌中の転写ター
ミ、ネーターとして作用する［ヤーガー（Ｍａｒｇｅｔ
）も、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏ１．Ｃｅ１　　！、Ｂｉｏ１．）、　　６、１０
９５−１１０１　　；１９８６］。こうして得られたプ
ラスミドｐｌＴ１８をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを使
用して切断し、これにより５ＵＣ２プロモーターの１７
００ｂｐの断片およびインベルターゼのＮＨ，末端の半
分を欠失した。この部分をｐＪｓ１２からの１２００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片［Ｒ。

Ｃ，ダス（Ｄａｓ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティツクス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ　ｉｃ、）１９８９；２１８．２４０−２４８］　
　（この断片はＭＦσｌプロモーターおよびα−因子の
ｐｒｅ−ｐｒｏ−リーダー配列ならびにインベルターゼ
の３４ＮＨ１末端アミノ酸を含有する）で置換した。こ
れからｐＭＴ１５は酵母菌中でＡＰＩ相同体の発現のた
めの出発ベクターとして生ずる。ＡＰＩ相同体の遺伝子
は、ｐＭＴ１５のＨｉｎｄｌＩＩ切断部位において１８
０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングされた
（参照、変法１１第２図）。

１００ｍＱの５ｃ１０６の酵母菌細胞［カリフォルニア
大学のイースト・ジェネティックス・ストック奉センタ
ー（Ｙｅａｓｔ　　ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｔｏｃｋ　　Ｃ
ｅｎｔｅｒ）、カリフォルニア州９４７２０、バークレ
イ、からの３２２０７Ａ］を、２０ｍｇ／１２のスレオ
ニン、メチオニンおよびヒスチジンを補充したＳＤ培地
（０，６７％の酵母菌窒素塩基、アミノ酸を含まない、
および２％のグルコース）中で３０℃において２ＸｌＯ
’細胞／ｍＱまで増殖する。細胞を遠心により収穫し、
５ｍｆ２のＴＥ（１０ミリモルのトリス−ＨＣ＋、ｐＨ
７，５，１ミリモルのＥＤＴＡ）で１回そして５ｍ１２
のＴＥ＋Ｏ，１モルの酢酸リチウムで１回洗浄し、そし
て３０℃において１時間インキュベーションした。能力
細胞は４℃において２日まで保持することができる。１
０μＱのプラスミドのＤＮＡ　（３ｍｇ／ｍ（２）をＯ
，１ｍ４の細胞に添加する。３０°Ｃにおいて３０分後
、０．７ｍＱのＴＥ（４０％のＰＥＧ３３５０．Ｏ，１
モルのＬｌｏＡｃ）を添加し、そしてこの混合物を３０
℃において１時間インキュベーションする・次いで、細
胞の沈澱を０−５ｒｎ（２のＴＥで２回洗浄する。細胞
の沈澱を０．１ｍ（２のＴＥ中に懸濁し、そして選択培
地を含有する寒天平板上にストリーキングする。形質転
換は２〜３日後現れる。

培養条件 形質転換された酵母菌細胞をＳＤ培地（２０ｍｇ　／　
Ｑの各スレオニン、ヒスチジンおよびメチオニンを補充
した）中の２８℃または３０℃において９６時間まで発
酵する。細胞を遠心により収穫し、そしてＡＰＩ相同体
の阻害活性を培地中で測定する。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、自然配列の少なくとも１つのアミノ酸が他の自然ア
ミノ酸で置換されている、アルツハイマープロテアーゼ
阻害因子（ＡＰＩ）のアミノ酸配列からなるペプチド。

２、位置１３および／または１５．３７．５０にアミノ
酸置換を有する、上記第１項記載のベブチド。

３、次のアミノ酸置換： （ａ）位置１３： Ｖａｌ、　　Ｉ　　Ｉｅ、　　Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ
％　Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ。

（ｂ）位置１５： Ｌｅｕ、　　ＧＩＹｓ　　Ａｌａｑ　　Ｐｈｅ、Ａｒｇ
、Ｖａｌ、　Ｉ　　ｌｅ、　　Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ
、Ｇｌｕ。

Ａｓｎ、ＧｉｎまたはＴｙ　ｒ。

（ｃ）位置３７： Ａｒ　ｇｓ　　Ｖ　ａ　　Ｉ　、　Ｉ　　Ｉ　　ｅ、　
　Ｌｅ　　ｕ、Ｍｅ　　ｔＸ　Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ａｓｐ
、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈ　ｒ。

（ｄ）位置５０： Ｖａ　　ｌ、　　Ｉ　　ｌｅ、Ｌｅ　ｕ、Ｇｉｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇ。

のｌまたは２以上を有する、上記第１項記載のペプチド
。

４、上記第１項記載のペプチドをエンコードするデオキ
シリポ核酸。

５、上記第２項記載のペプチドをエンコードするデオキ
シリポ核酸。

６、上記第３項記載のペプチドをエンコードするデオキ
シリポ核酸。

７、上記第４項記載のデオキシリポ核酸を含有する発現
ベクター ８、上記第５項記載のデオキシリポ核酸を含有する発現
ベクター ９、上記第６項記載のデオキシリポ核酸を含有する発現
ベクター １０、製剤学的に許容されうる担体と混合してグロテア
ーゼ阻害有効量の上記第１項記載のペプチドからなる組
成物。

１１、錠剤、カプセル剤またはアンプルの形態の、上記
第１０項記載の組成物の単位投与量。

１２、患者に有効抗炎症量の上記第１項記載のペプチド
を投与することからなる、急性炎症に悩まされる患者を
処置する方法。

１３、急性炎症は、慢性関節リウマチ、遺伝性血管神経
性浮腫、肺炎、膵臓炎およびンヨック状態である、上記
第１２項記載の方法。

１４、患者に有効保護量の上記第２項記載のＬｙ５−１
３またはＡｒｇ−１３の変異型ペプチドを投与すること
からなる、患者の透析において保護機能を与える方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルツハイマープロテアーゼ阻害因子のアミ
ノ酸配列の略図である。 第２図は、酵母菌の発現ベクター（変法１）およびＥ、
ｃｏｌｉの発現ベクター（変法２）についてのアルツハ
イマープロテアーゼ阻害因子の合成遺伝子を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、自然配列の少なくとも１つのアミノ酸が他の自然ア
   ミノ酸で置換されている、アルツハイマープロテアーゼ
   阻害因子（ＡＰＩ）のアミノ酸配列からなるペプチド。