JPH025869A - Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子及びリポコルチン類３、４、５並びに６の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ＤＮＡ配列及びリポコルチン類Ｉ［１，ＩＶ
。

■と■をコード付けする組換えＤＮＡ分子、並びにこれ
らのポリペプチドの製造方法に関するものである。

これらのポリペプチドはこれらのＤＮＡ配列で形質変換
された宿主中のタンパク質である。

本発明のＤＮＡ配列は、λ１ＩＬｉｐｏ　１１１−５、
とλＨＬｉｐｏ　Ｖ−１を含み、またＤＮＡ配列はこれ
らのＤＮＡ挿入断片でハイブリッド形成し、かつヒトの
リポコルチン類を発現にコード付けし、更に先行ＤＮＡ
配列のいずれにもより発現に対して発現にコード付けし
たポリペプチドを発現にコード付けする所のＤＮＡ配列
である。本発明のＤＮＡ配列はまた、リポコルチン類■
と■をコード付けし、またリポコルチン類に対してハイ
ブリッド形成し、かつリポコルチンをコード付けするも
のであり、更にこれらの配列のどれに対しても縮重され
る。

これらの配列を含む組換えＤＮＡ、ＤＮＡ配列で形質変
換された宿主、及びリポコルチン■、■、■と■も本発
明の部分である。

本発明のＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ分子、宿主及び方法
は、関節炎、アレルギー疾患、皮膚疾患、目疾患、及び
膠原病並びに炎症性過程を含む疾患の治療における使用
されるリポコルチン■、■、■、及び■の製造を可能と
する。

（従来の技術） リポコルチン類はタンパク質類の系統であり、これは、
炎症の各種症状の調整に関係するとされて来た［Ｒ，Ｊ
、フラワー等、「マクロコルチン及ヒグルフコルチコイ
ドの作用機構」、アドバ第６１−９頁（１９８４）：　
Ｍ、デローザ、「グルココルチコイド−誘導ホスホリパ
ーゼ抑制タンパク質」、登、Ｍ　５５−６２頁（１９８
５）］。リポコルチンはホスホリパーゼＡ、を抑制する
ことにより抗炎症作用を及ぼすと信じられている［Ｆ、
平田等、［グルココルチコイドにより誘発されるウサギ
好中球におけるホスホリパーゼＡ、抑制タンパク質］、
プロワｌｎ属、第５号、第２５３３−３６頁（１９８０
）］。酵素ホスホリパーゼＡ、は、膜ホスホリパーゼに
作用して、炎症応答に含まれるプロスタグランジン類、
ヒドロキシ酸及びロイコトリエン類の先駆物質であるア
ラキシン酸を放出する。

多くの研究は粗製タンパク質調製により実施されて来た
が、精製リポコルチン類による最近の研究は、これらの
タンパク質は、炎症の媒介物質の生成の強い抑制物であ
ることが確認された［Ｂ、ロスハツト等、「ヒト抹消血
液単核細胞からのＡ３２ｋＤａホスホリパーゼＡ、抑制
タンパク質（リポコルチン）の精製及び特性付け」、エ
フイーピーニス　レター　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）
、第２１９巻、第１６９７５頁（１９ｇ？）］。更に、
組換えリポコルチンが、生体外の検定においてホスホリ
パーゼの作用を抑制することが示された［Ｇ、シリン等
、「モルモット分離潅流した肺からの組換えヒトリポコ
ルチン１抑制トロンボキサン放出」、ネイチャー■紅旦
ユ、第３２８巻、第２７０−２頁（１９ｇ？）；　Ｇ、
シリンとＲ，Ｊ、フラワー、「生体外におけるヒトＨ動
脈によるヒト組換えリポコルチン１抑制プロスタサイク
リン生成」、プロスタグランジン（ＰｒｏｓｔａＬＬＬ
Ｑ土匡属、第３４巻、第５９−６２頁（１９ｇ？）コ、
及び炎症応答の生体内のモデルにおいて、［Ｇ、シリン
等、［ラット　パラ　オエデマ試験におけるヒト組換え
リポコルチン１の抗炎症作用］、ネイチャーＵ■肛迫、
（提出中）。

彼らの立証した抗炎症作用の結果として、リポコルチン
は、炎症過程に特徴付けされる疾患の治療に有用である
ことが証明されたとすべきである。実例は、関節炎、ア
レルギー疾患、皮膚疾患、目疾患、及び膠原病を包含す
る。更に、リポコルチン類の使用は、現在利用出来る抗
炎症治療に関連する副作用を削除出来るだろう。

今日迄、分子１約７０．５５．４０．３０及び１５ｋｄ
の関連リポコルチンタンパク質が、各種動物組織に検出
されている。［Ｋ−Ｓハング等、「ホスホリパーゼＡ、
の２つのヒト３５ｋｄ抑制物質はｐｐ６０ｖ−ｓｒｃと
ＥＧＦレセプター７キナーゼの基質に関係する」、セＬ
Ω虱旦、１す属、第１９１−９９頁（１９８６）］。し
かし構造的研究の不足は、リポコルチン類系統の正確な
描写を妨げている。

組換えＤＮＡ技術は、この分野における進歩に対して重
要な期待を担っている。先ず、この技術は、体部の一次
構造の解明を許すことにより、リポコルチン類の系統の
範囲を決めるのに役立つだろう。第二に、組換えＤＮＡ
技術を使用してリボフルチン類を多量に製造可能にする
ことが望ましい。しかし生物源からのりボッルチン類を
精製することは可能であるが、Ｘ１換え方法による製造
はより経済的である。更に、組換え方法は、望みの断片
の大規模合成、又は天然りボッルチン類の別の改良され
た見方を許すものである。

２つのリポコルチン遺伝子が前にクローン化された［ワ
ルナー等、「ヒトリポコルチンのクローン化と発現、潜
在的抗炎症活性を持ったホスホリパーゼＡｔＪ、ネイチ
＋　　　Ｎａｔｕｒｅ　、第３２０巻、第７７−８０頁
（１９８６）；ハング等、１９８６；　Ｃ，Ｊ、Ｍ、サ
リース等、「タンパク質キナーゼ基質に対するｃＤＮＡ
の配列、第３６頁、内部反復を有する多領域タンパり質
の解明」、セル（Ｃｅ１１）、第４６巻、第２０１−１
２頁（１９８６）］。両方共、５０％アミノ酸類似体を
有する類似体３８ｋｄタンパク質を符号付けする。これ
らの２つのタンパク質は、ハング等によりリポコルチン
−１とリポコルチンー！Ｉと名ずけられた（１９８６）
。

（発明が解決しようとする課題） 各種の選択とＤＮＡクローン化技術は、本発明のＤＮＡ
配列の単離とクローン化に潜在的に利用されたかもしれ
ないが、本発明の一つの実施態様において、本発明者等
はラットリポコルチン類に基づく選択計画を採用した。

従って、本発明者等は、ラット腹膜浸出性細胞の細胞外
上澄みからのラットリポコルチン■と■を精製し、これ
らのタンパク質の各種断片のアミノ酸配列を決定した。

これらのタンパク質配列に基づいて、本発明者等は、最
小量のヌクレオチド縮重を有した精製ラットタンパク質
のこれらの範囲に相当する幾つかのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡプローブを合成した。次いで、これ
らのプローブを使用して、ファージクローン化ベクター
中に挿入されたｃＤＮＡ配列を含むｆｆｌ細胞を含むラ
ットｃＤＮＡライブラリーをスクリーンした。

スクリーンニングする為に、本発明者等は、プラークハ
イブリッド形成スクリーンニング検定を利用して、ラッ
ト肺ｃＤＮ＾ライブラリーに対して、オリゴヌクレオチ
ドプローブにハイブリッド形成させ、かつ多くのプロー
ブに対してハイブリッド形成するクローンを選択した。

プラスミド中への選択されたラットｃＤＮＡ挿入断片を
単離しサブクローン化の後、本発明者等は、これらのヌ
クレオチド配列を決定し、かつこれらを精製ラットリポ
コルチンのペプチドからのアミノ酸配列と比較した。　
この比較の結果、本発明者等は、単離したクローンのヌ
クレオチド配列が、本発明者等の精製したラフトリポコ
ルチンのアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列をコード付
けしたことを見いだした。次いで、本発明者等は、ハイ
ブリッド形成プローブとしてラットｃＤＮＡからの各種
制限断片を使用して、各々のヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーンした。

本発明者等は、正しい読み枠における出発コドンと終止
コドンの位置を検査し、かつタンパク質の予想大きさを
考慮することにより、ヒトリポコルチン！とＩＩの公知
配列と比較して、単離したクローンが、ヒトリポコルチ
ンＩＩＩとＶに符号付けする完全な長さを含むことを確
認した。

本発明のｃＤＮＡ配列は、発現制御配列に作°用的に結
合され得、かつ各種動物又は他の真核的又は原核的宿主
細胞に使用して、これらによりこれらをコード付けした
ヒトリポコルテンポリペプチドを製造出来る。

本発明の第二の実施態様によると、本発明者等は、ウシ
間質粘膜からリポコルチン■と■を単離した。本発明者
等は、これらのポリペプチドのトリプシン断片のアミノ
酸配列を決定した。合成りＮＡプローブを、アミノ酸配
列データに基づいて作成出来、かつプローブを、リポコ
ルチン■と■をコード付けするｃＤＮＡに対するウシラ
イブラリーをスクリーンニングするのに使用出来た。ヒ
トｃＤＮＡを、リポコルチン■とＶに対して記載したと
同じ方法で、プローブとしてウシｃＤＮ＾を使用して単
離することが出来た。次いで、ヒトリポコルチン■と■
の完全な配列を、かくして単離したｃＤＮＡを配列決定
することにより決定出来た。更に、ｃＤＮＡを真核的と
原核的宿主細胞に使用して、リポコルチンタンパク質を
発現出来る。

（用語の定ａ） 明細書の記載において、次の用語が使用される： ヌクレオチド・・糖部分（ペントース）、リン酸基、及
び含窒素複素環式塩基から成るＤＮＡ又はＲＮＡの単量
体単位。塩基は配糖体の炭素（ペントースの１゛炭素）
を介して糖部分に結合され、塩基と糖の組合わせはヌク
レオシドと呼ばれる。

４個のＤＮＡ塩基はアデニン（“Ａ“）、グアニン（”
Ｇ“）、シトシン（Ｃ″）、及びチミン（”Ｔ”）であ
る。４個のＲＮ＾塩基はＡ、　Ｇ、　Ｃ，及びウラシル
（“Ｕ”）である。

旺琢ｌ・・隣接ペントースの３′と５°炭素の間のリン
酸ジエステル結合により互いに結合したヌクレオチドの
直鎖配列。

コドン・・３個のヌクレオチドのＤＮＡ配列（トリプレ
ット）で、これはｍＲＮ＾を介してアミノ酸、翻訳開始
シグナル又は翻訳終止シグナルを符号つけする。例えば
、ヌクレオチドトリフレットＴＴＡ、　ＴＴＧ、　ＣＴ
Ｔ、　ＣＴＣ，ＣＴＡ及びｅＴＧは、アミノ酸ロイシン
（“Ｌｅｕ″）を符号付けし、ＴＡＧ、　ＴＡＡ及びＴ
Ｇ＾は、翻訳停止シグナルを符号付けし、かつ＾ＴＧは
、翻訳開始シグナルを符号付けする。

読み枠・・アミノ酸配列中のｌｌｌＲＮＡの翻訳してい
る間のコドンの配置。翻訳の間、正しい読み枠が保持さ
れなければならない。例えば、ＤＮＡ配置装ＣＴＧＧＴ
ＴＧＴＡＡＧは３個の読み枠又は位相中に発現されなけ
ればならず、これらの各々は、異なるアミノ酸配列を与
える： ＧＣＴ　ＧＧＴ　　ＴＧＴ　　ＡＡＧ・・＾！ａ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＣＴＡ
　＾Ｇ・・Ｌｅｕ−Ｍａｌ−ＶａｌＧＣＴＧＧ　ＴＴＧ
　ＴＡＡ　Ｇ・・Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止）ポリペプチ
ド・・隣接アミノ酸のα−アミン基トカルボキシ基の間
のペプチド結合により互いに結合されるアミノ酸の直鎖
配列。

ペプチダーゼ・・ペプチド結合を加水分解する酵素。

ゲノム・・細胞又はウィルスの総てのＤＮＡ０これは、
シネーダルガルノ配列のような配列を含めて、オペレー
ター　プロモーター、及びリポソーム結合と相互作用配
列のみならず、エヱムニ　アリア、物質のポリペプチド
をコード付けする構造遺伝子を包含する。

遺伝子・・その鋳型又は伝令１？ＮＡ（“ｍＲＮ＾”）
を介して特定ポリペプチドのアミノ酸特性の配列に符号
付けするＤＮＡ配列。

（互・・遺伝子又はＤＮＡ配列からのｍＲＮ＾を生成す
るプロセス。

姓」・・ｌｌｌＲＮＡからポリペプチドを生成するプロ
セス。

１浬・・ポリペプチドを生成する為に遺伝子又はＤＮＡ
配列により受けるプロセス。

プラスミド・・プラスミドが宿主細胞中で複製されるよ
うな無傷「レプリコン」から成る非染色体性二本鎖ＤＮ
Ａ配列。プラスミドが単細胞生物体内に置かれる場合、
この生物体の特性は、プラスミドのＤＮＡによって変化
されるか又は形質変換されるに違いない。例えば、テト
ラサイクリン抵抗性に対する遺伝子（ＴＥＴ”）を担持
するプラスミドは、前にテトラサイクリンに敏感な細胞
を、テトラサイクリン抵抗性の細胞へ形質変換する。プ
ラスミドにより形質変換された細胞を「形質変換体（ト
ランスホーマント）」と称される。

ハアージ又はバクテリオハアージ・・細菌ウィルス。こ
の多くは、タンパク質外皮又は被覆（“キャプシド”）
中にカプセル入りされたＤＮＡ配列から成る。

コスミド・・バクテリオハアージλの相補末端ビコス（
ｃｏｓ）”］部位を含むプラスミド。フスミドは、フス
部位の存在の為に、λ被覆タンパク質中に詰め込まれ、
適当な宿主を感染するのに使用される。外来性ＤＮＡの
大きな断片に対する容量の為に、フスミドはクローニン
グ用運搬体として有用である。

クローニング用運搬体・・宿主細胞中に複製可能なプラ
スミド、ファージＤＮＡ、コスミド又は他のＤＮＡで、
一つ又は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし
、この部位において、このようなりＮＡ配列は、ＤＮＡ
の本質的に生物学的機能、例えば、複製、被覆タンパク
の生成又はプロモーター又は結合部位の損失の付随損失
無しに確定可能な方式で切断され、かつクローニング用
運搬体は形質変換された細胞の同定の使用に適したマー
カー、例えばテトラサイクリン抵抗性又はアンピシリン
抵抗性を含む。クローニング用運搬体はしばしばベクタ
ーと称される。

クローニング・・無性生殖により一つのこのような生物
体又は配列から誘導された集団生物体又はＤＮＡ配列を
得るプロセス。

ｉｎ、を江ｘユ又はハイブリッドＤＮＡ・・生細胞の外
部で端一対一端結合され、かつ生細胞中に保持可能な異
なるゲノムからのＤＮＡ断片から成る分子。

１１且皇Ｅ　Ｗｌ・・遺伝子へ作用的に結合される時に
、これら遺伝子の発現を制御しかつ調節するヌクレオチ
ドの配列。これらは、Ｉａｃシステム、β−ラクタマー
ゼシステム、虫システム、ｔａｃとｔｒｃシステム、フ
ァージλの主オペレーターとプロモーター領域、「ｄ被
覆タンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期と後期プロモ
ーター　ポリオーマウィルスとアデノウィルスから誘導
されタプロモーター、金属チオエンプロモーター３−ホ
スホグリセリン酸キナーゼ塩又は他の解糖酵素、酸性ホ
スファターゼのプロモーター例えば、Ｐｂｏ２、イース
トα−交配因子のプロモーター、及び原核の又は真核の
細胞とこれらのウィルス又はこれらの組合わせの遺伝子
の発現を制御することの公知の他の配列を包含する。

哺乳動物細胞に対して、遺伝子は真核のプロモーターへ
結合出来、例えばジヒドロ葉酸還元酵素を符号付けする
遺伝子へ結合し、かつチャイニーズハケスター卵巣細胞
中で選択的に増幅されて活性的に転写された真核遺伝子
の多くのコピーを含む細胞系統を生成するＳＶ４０初期
領域に対しての真核プロモーターである。

リポコルチン・・酵素ホスホリパーゼ＾、を阻害し、か
つ実質的にアミノ酸配列：　ＭｅｔＬｙｓＧｌｙＬｅｕ
ＧＩｙＬｅｕＧＩｙＴｈｒＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｈｒＬ
ｅｕｌｌｅＧｌｕｌｌｅＬｅｕＴｈｒＳｅｒＡｒｇから
成る共通配列の少なくとも一つのコピーを有するタンパ
ク質。

（課題を解決するための手段） 各種の宿主／クローニング用運搬体組合わせが、本発明
に係るヒドリコボルチンをコード付けするＤＮＡ配列を
クローニング又は発現するのに使用されて良い。例えば
、有用なりローニング又は発現用運搬体は、ＳＶ４０と
既知細菌プラスミドの各種既知誘導体のような、染色体
ＤＮＡと合成りＮＡの配列の断片から成って良く、前記
プラスミドは例えば、ｃｏｌＥｌ、　ｐｃＲｌ、　ｐＢ
Ｒ３２２゜ｐＭＢ９及びこれらの誘導体を含むｇ；　よ
り広い宿主範囲のプラスミド、例えば、ＲＰ４．　ファ
ージＤＮＡ５．例えばファージλ、例えばＮＭ９８９　
、他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３とａｍ状単鎖ＤＮ
ＡファージとプラスミドとファージＤＮＡ５の組合わせ
から誘導されたベクター　ファージＤＮＡ又は他の発現
制御配列又は２μプラスミド又はこの誘導体のようなイ
ーストプラスミドである。

各々の特定クローニング又は発現用運搬体の内に、各種
部位が、本発明に係るヒドリコボルチンタンパク質ＤＮ
Ａ配列の挿入断片に対して選択されて良い。これらの部
位は、これらを切断しかつ当業者により充分に認識され
る制限エンドヌクレアーゼにより普通指摘される。これ
らの部位の中にＤＮＡ配列挿入して組換えＤＮＡ分子を
形成する各種゛の方法はまた周知のことである。

これらは、例えば、ｄＧ−ｄＣ又はｄＡ−ｄＴ尾テーリ
ング、直接的連結反応、合成的リンカ−エキソヌクレア
ーゼ、及び連結反応、又はＤＩＩＡポリメラーゼでＤＮ
Ａ鎖の延長に続くポリメラーゼ−結合反応、及び連結反
応に続く適当な単鎖鋳型を含む。勿論、本発明に有用な
りローニング又は発現用運搬体は、選択されたＤＮＡ断
片の挿入の為の制限エキソヌクレアーゼ部位を有する必
要は無いことを理解されるべきである。それよりむしろ
、運搬体は、別の手段により断片に結合され得るだろう
。

各種発現制限配列がまた、本発明のＤＮＡ配列の発現を
達成する為に選択されて良い。これらの発現制限配列は
、例えばｍシステム、匡システム、Ｌｒｃシステム、フ
ァージλの主オペレーターとプロモーターの領域、ｆｄ
被覆タンパク質の制限領域、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ又は他の解糖酵素に対するプロモーター、酸性ホ
スファターゼのプロモーター、例えばＰｂｏ２、イース
トα−交配因子又はアクチンのプロモーター’、ＳＶ４
０初期プロモーター　アデノウィルス後期プロモーター
、及び金属チオニンのような哺乳動物細胞の為のプロモ
ーター、及び原核細胞又は真核細胞、これらのウィルス
とこれらの各種組合わせの遺伝子の発現を制御する既知
の他の配列を包含する。、哺乳動物細胞において、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素に対する発現単位の為の遺伝子を連結
し、かつ宿主チャイニーズハムスター卵巣細胞に対する
選択を適用することにより発現単位を更に増幅可能であ
る。

本発明のＤＮＡ配列の発現に対して、これらのＤＮＡ配
列は、発現ベクター中の上記発現制御配列の一つ又はそ
れ以上に作用的に連結され、これは、選択ヒトリポコル
チンＤＮＡ配列がクローニング用運搬体中に挿入される
前に又は後に腐されて、発現制御配列がＤＮＡ配列の発
現を制御しかつ促進可能とするであろう。

ベクター即ち発現用運搬体と、特に、選択されたＤＮＡ
断片の挿入に対して選択された運搬体中の部位、及び本
発明に使用される発現制御配列とは、各種要素、例えば
、特別の制限酵素に敏感な多くの部位、発現されるべき
タンパク質の部位、ベクター配列に関する開始と停止コ
ドンの位置のような発現特性、及び当業者により認識さ
れる他の要素により決定される。特別のりポフルチン配
列の為のベクター、発現制御配列、及び挿入部位の選択
は、これらの要素の均衡により決定され、総ての選択が
既定の場合に対して等しく効果的であるとは限らない。

クローニング又は発現用運搬体の選択部位に挿入される
本発明のリポコルチンタンパク質をコード付けするＤＮ
Ａ配列は、望みのリポコルチンをコード付けする真の遺
伝子の一部でないヌクレオチドを含んで良く、又はこの
タンパク質に対する全遺伝子の断片のみを含んでも良い
ことも理解されるべきである。どのＤＮＡ配列が使用さ
れようとも、形質変換された宿主はりボコルチンタンパ
ク質を生成するであろうことのみが必要である。例えば
、本発明のりボッルチンＤＮＡ配列は、少なくとも一つ
の真核又は原核担体タンパク質又は少なく七も一つの真
核又は原核シグナル配列をコード付けするＤＮＡ配列、
又はこれらの組合わせに対して、本発明の発現用ベクタ
ー中の同じ読み枠中に融合されて良い。

このような構成は、望みのりボッルチンＤＮＡ配列の発
現を助け、かつ宿主細胞からのリポコルチンの精製を向
上し、又は選択、及び好適には成熟を許す。リポコルチ
ンＤＮＡ配列は、成熟自然のリポコルチンの第一アミノ
酸を符号付けする配列へ直裁に融合する＾ＴＧ開始コド
ンを、二者択一的に単独に又は他のコドンと共に含でも
良い。このような構成は、例えば、本発明の一部である
メチオニル又は他のペプチジルリポコルチンの製造を可
能にする。次いで、ト末端メチオニン又はぺ°ブチドは
、各種の既知方法又は本発明の抗炎症組成物と方法にお
けるペプチドに結合するメチオニンと共に使用されるポ
リペプチドにより、細胞内的に又は細胞外的に開裂さり
て良い。リポコルチンはまた、開裂無しに又は他のペプ
チド前配列無しに直接使用されて良い。

本発明の配列をコード付けするリポコルチンを含むクロ
ーニング用運搬体又は発現用ベクターは、本発明によっ
て利用されて、宿主がコード付けするリポコルチンタン
パク質を発現するのを許すように、適当な宿主を形質変
換する。

有用なりローニング又は発現宿主は、大腸菌Ｙ３１１Ｑ
ＩＱ、大腸菌Ｊａ２２１．大腸菌ＥＤ８７６７、大腸菌
Ｄ１１１．大腸菌ＬＥ３９２．大腸菌１１ＢＩＯＩ、大
腸菌Ｘ１７７６゜２ＵＬ！４Ｘ　２２　ｓ　２のような
大腸菌属、及び昆虫細胞、ストレプトマイセスｉ・の株
、イースト及びたの真菌、Ｃ１１０細胞又はマウス細胞
のような動物宿主、他の動物（ヒトを含めて）宿主、培
養中の植物細胞又は他の宿主を含む。

適当な宿主の選択もまた、この分野で認識される多（の
要素により制御される。これらは、例えば、選択された
ベクターとの適合性、ハイブリッド形成プラスミドによ
り符号付けされたタンパク質の毒性、宿主細胞酵素によ
るタンパク質分解に対する希望タンパク質の感受性、精
製の間除去困難な宿主細胞タンパク質により発現される
べきタンパク質の汚染又は結合、希望タンパク質の回収
の容易性、発現特性、生物学的安全性及びコストを含む
。これらの要素の均衡は、総ての宿主ベクター組合わせ
が、特別の組換えＤＮＡ分子のクローニング又は発現の
いずれに対しても等しく効果的であるとは限らないこと
を理解されねばならない。

本発明による調製されたヒトリポコルチンは、融合タン
パク質（例えば、直接的排出に対する原核、真核又は組
合わせＮ−末端断片へ連結される、安定性を改善する、
精製を改善する、Ｎ−末端断片の可能な開裂を改善する
）融合タンパク質の形態で、リポコルチンタンパク質の
先駆物質（例えば、リポコルチンシグナル配列の総て又
は一部、又は他の真核又は原核シグナル配列で開始する
）の形態で、成熟リボフルチンの形態で、又はｒ−ｍｅ
Ｌ−リポコルチン（即ち、開始メチオニンが除去されて
なかったりボコルチン）の形態でポリペプチドを含む。

本発明によるタンパク質の一つの特に有用な形態、又は
少なくともこれらの先駆物質は、アミノ末端に結合する
容易に開裂されるアミノ酸又は一連のアミノ酸を有する
成熟リポコルチンである。このような構成は、適切な宿
主中にタンパク質の合成を許し、宿主中で、成熟リポコ
ルチン中に存在しない開始シグナルが必要とされ、かつ
外部アミノ酸の生体内又は生体外の開裂が成熟リポコル
チンを生成するのを許す。このような方法は、この分野
に存在する。例えば、米国特許第４，３３２，８９２；
　４，３３８．３９７；及び４、４２５．４３７の各号
の公報を参照されたい。ポリペプチドはまた、グリコシ
レート化、非グリコシレート化されて良く、または自然
リポコルチンのポリペプチドと異なるグリコシレージョ
ンパターンを有する。このようなグリコシレージョンパ
ターンは、特別のリポコルチンに対して選択された宿主
細胞又は宿主発現処理に結果するだろう。

本発明のタンパク質はまた、プロテアーゼにより又はリ
ポコルチンをコード付けするＤＮＡ配列の断片の発現に
よりリポコルチンから誘導された生物学的に活性ポリペ
プチド断片を含む。

本発明のタンパク質もまた、存在ＤＮＡ配列のコドンの
幾つか又は全部に対する異なるコドンにより特徴付けさ
れるＤＮＡ配列により発現を発現にコード付けされるリ
ポコルチンを含む。これらの置換コドンは、置換コドン
によりコード付けされるアミノ酸と同じアミノ酸をコー
ド付けし、高収率でポリペプチドを与える。別室として
、アミノ酸置換へ又はより長い又は短いリポコルチンへ
導（コドンの一つ又は組合わせの置換は、普通の方法で
その性質を変更しても良い。例えば、変更は安定性を増
大し、溶解性を増大し、又は治療効果を増大するだろう
。

（発明の効果） 本発明の方法で製造したヒトリボフルチンは、抗炎症剤
として、及び抗炎症方法と治療に有用である。例えば、
このような組成物は、炎症を削減するのに薬学的に有効
なリポコルチン量及び薬学的に許容出来る担体から成っ
て良い。このような治療は、一般にこれらの組成物を使
用して薬学的に許容出来る方法で患者を治療する方法か
ら成る。

本発明をより良く理解される為に、次の実施例を説明す
る。これらの実施例は説明のみの目的のもので、いかな
る方法においても発明の範囲を制限するよう構成されて
いない。

実」Ｌ皿 ＾、ララッリボフルチン■と■の ラット腹膜洗浄液を前に記載した通りに調製した［Ｒ，
Ｂ、ペビンスキー等、［ラット腹膜浸出液からのホスホ
リパーゼＡ、活性を阻害する３７−ｋＤａタンパク質の
精製と部分配列分析」、ジャーナルビオロジカルケミス
トリー　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ。

第２６１巻、第４２３９−４６頁（１９８６）］。透析
した洗浄液を液体窒素で急速凍結させ、−７０’Ｃで保
存した。

１２５ラツト洗浄液を表すバッチを処理した。粒状物を
、３０分間遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ−ＧＳ八へ転
子）により除去し、分離液を、ｐｌ＋７．７で２５ｍＭ
　トリス−１１ｃＩ中でＤＥＡＥ−セルロースカラムク
ロマトグラフィーにかけた。結合タンパク質を同じ緩衝
液中でＮａＣ１（０−０，３Ｍ）の勾配で溶出した。１
８ｍ１の両分を集め、ペビンスキー等、１９８６に記載
の通りに、２ｇ０ｒ＋ｎ＋の吸光度に対してホスホリパ
ーゼへ、抑制活性をモニターした。ＮａＣ１で溶出した
タンパク質の抑制ピークを検出した。ＮａＣｌで溶出し
たタンパク質の２つの抑制ピークを検出した。両方をゲ
ル濾過とモノＳカチオン交換樹脂（ＩＩＲ５１５，ハル
マシア）上で急速タンパク質液体クロマトグラフィー（
ＦＰＬＣ）を含む連続クロマトグラフィー段階を受けさ
せた。ゲル濾過に対して、抑制ピークを限外濾過により
５ｍｌまで濃縮し、９１１７．７で２５１１Ｍトリス刊
ＩＣＬ中のＰ１５０カラム（ビオラド、２．５Ｘ４０ｃ
ｍ＋）に負荷した。５１の画分を集めた。両方の抑制物
を単一ピークとして溶出した。リポコルチン−■は３０
ｋｄの明らかなマスで溶出し、一方リポコルチンー■は
あたがもただ２０ｋｄのように不規則に移動した。活性
ゲル濾過画分を、ファ／グ等１９８６により記載と本質
的に同じにＦＰＬＣにより処理した。リポコルチン−■
はカチオン交換マトリックスを介して流れたが、リポコ
ルチン−■はモノＳマトリックスと結合し、かつ１００
ｍＭ　ＮａＣｌで溶出された。代表的に、■バッチのう
、ト洗浄液から５０μｇのりボコルチン−■と２００μ
ｇのりボコルチン−■を回収した。

構造的研究の為に、ＦＰＬＣ−精製試料を凍結乾燥し、
０．１％ＳＤＳで透析し、次いでＳＤＳ中で予（ｉｆｆ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。適切なバン
ドを剃刀刃で切り取り、かつタンパク質をゲルから電気
溶出した［Ｍ、　Ｗ、バンカピラーと１４．Ｅ）−ド「
超感度傾斜高性能液体クロマトグラフィーによるフェニ
ルチオヒダントインの分析」、メソッド　エンツィモロ
ギーＭｅｔｈ、Ｅｎｚ　−凹上ユ、第９１巻、第４８６
−９３頁（１９８５）］。］ペピンスキー等１９８６記
のように、６０μｇの量の各調製物を２０％トリクロロ
酢酸で沈澱させ、次いで洗浄した。乾燥ペレットを４０
０μＩの０．１Ｍ炭酸アンモニウム、０．ｌＪ　ＣａＣ
Ｉｔ中に分散し、３７°Ｃで１６時間３μｇのトリブン
ンと共に培養した。トノリブシンを３つの等量アリコー
トで添加し、最初はゼロ時間に、第二は４時間後に、第
三は１２時間後に添加した。消化物は蟻酸で２０％まで
酸性とされ、断片は流速１．４ｍｌ／分で３９°Ｃにテ
Ｃ，，カラム（０，４６Ｘ２５ｃｎ、　　スベクトロフ
ィズークス）上で逆相高圧液体クロマトグラフィーによ
り分別された。ペプチドを０．１％トリフロロ酢酸中の
アセトニトリル（０−７５％）の勾配で溶出した。カラ
ム溶出液は２１４ｎｍでモニターされた。ピーク分別ハ
、ホリブレンの存在下にアプライド　ビオシステムズ４
７０Ａガス相シーケンサ−でシーケンス分析に付したし
ヘビツク等、「ガスー液固体相ペプチドとタンパク質シ
ークエネイター」、ジャーナル　ビオロジカルケミスト
リー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）、第２５６巻、第７９９０−７頁（１９
８１）］。］ＰＴＩ＋−アミノは、アプライド　ビオシ
ステムズ１２０Ａ　ＰＴＩ＋分析機を使用するオンライ
ンで同定された。

Ｂ　リポコルチン抗ｌＩ′［１１ 組換えヒトリポコルチン−１に対する、及びヒト胎盤リ
ポコルチン−Ｈに対する抗面清を前に記載したようにし
て調製した［ハング等、１９８６；　Ｒ，Ｂ、ペピンス
キー、及びり、　Ｋ、シンクレア、「表皮成長因子−リ
ポコルチンの依存リン酸化」、ネイチ−ｐ　　（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、第３２１巻、第８１−４頁（１９８６）］。

］ラットリポコルチンーに対する抗匍清をリンパ節免疫
方法を使用；−でウサギ中に生成させた［Ｍ、　Ｂ、ジ
ゲル等、「リンパ節中の接種による抗原の生成」、メソ
ッド　エンツィモロギ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＩＥｎｚｙ
ｍｏ＋、）、第９３巻、第３−１２頁（１９８３）］。

電気溶出したリポコルチンー■（ウサギ当たり５０μｇ
）を完全に乳化し、免疫原としてフロインドアジュバン
トを使用した。

Ｃ，ラットリポフルチン■と■の　外付はラット腹膜洗
浄液調製物をＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー
に付した時に、ホスホリバ−ゼＡ、抑制活性の５つのピ
ークが観察された。

第１図はこのような分析の結果を示す。主活性ヒークハ
、フロースルー画分であり、こレバ以前リポコルチン−
１ｓｄｖ使用された（ペピンスキー等、１９８６）。４
つの他のピークを塩を使用して溶出した。ここで、本発
明者等は、１２５ｍＭ　ＮａＣ１（１）と２２５ｎＭ　
ＭａＣｌ（ｕ　）で溶出した２つの活性ピークを詳細に
研究した。ピーク１とＨの両方は、タンパク質を含み、
これは前に既知のりポフルチン配列（リポコルチン１と
■）を類似アミノ酸配列と共有するための配列決定する
ことにより見いたさ゛れた。本発明者等は、ピークＩ抑
制物をリポコルチン−■、及びビーク■抑制物をリポコ
ルチン−Ｖと称した。ピーク１とＨの活性の調製的精製
の間のＤＥＡ工程の効率を改善する為に、抑制物を０〜
０．３Ｍ　ＮａＣｌの浅塩勾配で溶出した。次いで、各
々の抑制ピークをゲル線過とモノＳ　ＥＰＬＣマトリッ
クスを使用する連続クロマトグラフィー工程に付した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、両方の最終調製物は単
一主３５ｋｄタンパク質を含んだ。酵素源としてブタの
膵臓ホスホリパーゼＡ２を使用して生体外ホスホリパー
ゼＡ２抑制検定における抑制の特異活性は、両方とも１
０．０００ユニット／ｍｇであり、かくして以前リポコ
ルチン■と■に対して観察された特異活性に匹敵した［
ハング等、１９８６；ペピンスキー等、１９８＆］。

第２図はクーマシーブルーで着色した精製う・ノドリポ
コルチン−Ｉ［１（レーン３）とラットリポコルチン−
■（レーン４）のゲル側面図を示している。

比較の目的で、ラットリポコルチン−！（レーンＩ）と
ウシリポコルチン■と■（レーン２と５）を示している
。パネルの残りは、リポコルチン刊（α−Ｌｌ）、リポ
コルチン−１１（α−１，２）、及びリポコルチン−■
（α−Ｌ５）に対して抗血清で調べた同じ調製の斑点を
示している。リポコルチン−■抗血清がリポコルチン−
Ｖに対して特異的であるのに、リポコルチン＝ｌ！を認
識する抗原の低力価を有し、かつリボフルチン＝Ｉ！抗
血清はリポコルチン−１を認識する抗原の低力価を有す
る。

組換えタンパク質に対して上げられたりポフルチンー１
抗血清は、ラッドリポコルチン−ＩＩＩに向かって高い
力価タイターを有する。リポコルチン−１１１における
免疫反応性成分がリポコルチン１１１でありリポコルチ
ン−１の断片でないことを立証する為に、ラットリポコ
ルチン１とＩＩＩをＣＮＢｒ地図作成に付し、この地図
には、開裂生成物がリポコルチン−■抗血清を使用して
ウェスタンプローティング法により免疫反応断片を可視
可能として検出された。２つの側面図は異なった。総て
のリポコルチンー１１１断片がこの方法で比較され、同
じであることが分かった。

昼、第３１８５−９１頁（１９８１）コ。オリゴヌクレ
オチドをポリヌクレオチドキナーゼと［γ−”　”　Ｐ
］　−ＡＴＰで末端標識付けし、次いでゲル電気泳動で
精製した［Ａ、マクサムと胃、ギルバート、「塩基−特
異化学的開裂で末端標識付けＤＮＡの配列決定」、メソ
ード　エンチモロギ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　、第
６５巻、第４９９−５６０頁（１９８０）］。オリゴヌ
クレオチドプローブ　ブールＲＬｉｐ４−６はラットリ
ポコルチン−ＶのトリプシンペプチドＴ２６°（Ａｓｐ
ＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｓｐＭｅｔＬｙｓ）に基づ＜２５
６折畳縮重の２０−ｍａｒである。プローブの縮重を減
少する為に、これらを各々６４折畳縮重の４サブプール
中で合成した。

オリゴヌクレオチドプローブをアブライドビオシステム
ズ３ｇ０Ａ　ＤＮＡ合成機も合成し、ゲル電気泳動で精
製した［Ｍ、　Ｄ、マチウシとＭ、Ｉ！、カルテルス、
「ポリマー担体上でデオキシオリゴヌクレオチドの合成
」、ジャーナルアメリカンケミカル　ソサイエティＪ、
ＡＭ、Ｃｈｅｍ、５ｏｃ属、第１０３“Ｔ”は、前に記
載した通り、Ｃ１１ｌカラム上の逆相１１ＰＬｃにより
単離した精製ラットリポコルチンのトリプシン断片を表
す。断片は前にも記載した通りに、ガス相配列決定装置
で続いて配列決定された。

個々のサブプールをワルナー等、１９０８６により前に
記載したようにして、ノーザンプロット分析において、
ラット肺ポリ（Ａ）ＲＮＡに対してハイブリッド形成さ
せた。ラットリポコルチン−！！１に対して、２組のプ
ローブプール、ＥＬｉｐｉ４とＥＬｉｐ５−８を使用し
た。ＥＬｉｐ１４はトリプシンペプチドＴ２　（ＧＩｙ
ＡＩａＧｌｙＴｈｒＡｓｐＧＩｕＰｈｅＴｈｒＬｅｕＡ
ｓｎＡｒｇ）に基づ＜１２８折畳縮重での１７−ｍａｒ
であり、ＥＬｉｐ１５−８は断片Ｔ３（ＧｌｕｌｌｅＳ
ｅｒＧｌｎＡＩａＴｙｒＴｙｒＴｈｒＡｌａＴｙｒＬｙ
ｓ）に基づ＜５１２折畳縮重であるところの２０１ｅｒ
である。両方ともウサブプール中で合成した。両方のタ
ンパク質に対して、緊縮条件下に約１８００ヌクレオチ
ドの転写産物に対してハイブリッド形成された個々のサ
ブプールは、本質的に前に記載したようにラット肺ポリ
（Ａ）ＲＮＡがら構成したラット肺λｇｔｌｏ　ｃＤＮ
Ａをスクリーンするのに使用した［ワルナー等、１９８
６］。ラブトリボフルチン１１１に対する正のファージ
、λＲＬｉｐｏｌｌｉ５とラフトリポコルチン−Ｖに対
するλＲＬｉｐｏＶ−１，これらは夫々の全長さのｃＤ
ＮＡを含み、夫々プラスミドｐＮＮＯ１とｐＮＮＯ９中
にサブクロー　７　サレ、ＤＮＡ配列は、マクスマとギ
ルバート（１９８０）の方法により、及びＧ、　Ｍ、チ
ャーチと胃、ギυＳＡ　Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
　Ｓｃ　属、　ＵＳＡ）、第８１巻、第１９９１９５頁
（１９８４）の関係方法により決定された。

ヒトリポコルチン−Ｉｌｌを、ハイブリッド形成プロー
ブとしてλＲＬｌｐｏｌ　ｌｌ−５の完全ラットリポコ
ルチン−１１１ｃＤＮＡ挿入断片挿入用することによる
クーロンチク　ラボラトリーズから得たλｇｔｌｌヒト
肺ｃＤＮ＾ライブラリーから単離した。

ヒトリポコルチン−■を、λＲＬｌｐｏＶ−１の完全ラ
ットリポフルチン−ＶｃＤＮＡ挿入断片でλｇｔｌＯヒ
ト末梢血液リンパ球ｃＤＮＡライブラリーをスクリーン
することにより単離した。

ｃＤＮ＾ライブラリーをリンパ球ポリ（Ａ）ＲＮＡから
構成した（細胞はインターフェロン−γｓフィトへマグ
ルチニンで刺激された）。スクリーン操作を、洗浄と濾
過の温度を５５℃に保持して交差様ヌクレオチドを不適
合とした以外は、本質的にワルナー等、１９８６により
記載の通りに実施した。リポコルチン−ｌ１ｌ（γ肛１
ｐａｌｌｌ−５）とリポコルチン−Ｖ（７ＨＬｉｐｏＶ
−１）に対するヒトｃＤＮＡクーロンの完全ＤＮＡ配列
を、前に記載した通りに決定し、夫々第３図と第４図に
示している。

両方のヒトリポコルチンＩＩＩとＶに対する全長配列を
示す以外に、第３図と第４図はまた、対応タンパク質に
対する推定アミノ酸配列を表している。ヒトリポコルチ
ン−１１１（１３３９ｂｐ）に対するｃＤＮＡクローン
は、５°翻訳しない配列の４６ｂｐと３゜翻訳しない配
列の３２４ｂｐを含み、３２３アミノ酸のタンパク質を
符号付けする。リポコルチン−Ｖ（ｔｓ７４ｂｐ）に対
するクローンは、５°翻訳しない配列の１４２ｂｐと３
°翻訳しない配列の４７２ｂｐを含み、３２０アミノ酸
のタンパク質を符号付けする。本発明者等は、成熟タン
パク質のアミン末端を、これらが阻害されているので決
定してないが、本発明者等は、リポコルチンＩＩＩ中の
開始メチオニンがヒト遺伝子の４７位置のＡＴＧにより
ＡＴＧをコード付けされていると信じる。このことは、
リポコルチン］とリポコルチン１１のアミノ酸配列とヒ
トリポコルチンＩｌ＋に対して推定されるアミノ酸配列
の比較に基づいており、これにより開始メチオニンの位
置が決定された。同じ理由に対して、本発明者等は、リ
ポコルチン−Ｖの開始メチオニンはヒト遺伝子の１４３
４３位置ＴＧによりＡＴＧをコード付けされていると信
じる。

本発明者等は、７１１Ｌｉｐｏｌｌｌ−５と７１１Ｌｉ
ｐｏＶ−１を大腸菌ｐｕＣプラスミドｐＮＮＯ１とｐＩ
ＩＮＯ９中にサブクローンして、夫々１）ｌｌＬｉｐｏ
ｌｌｌ−３−５とｐＨｊｉｐｏＶ−３ｂを示すプラスミ
ドを創造した。ここに記載する方法で調製した微生物を
、生体外の培養物コレクション、インターナショナル、
リンチカム、Ｍｄに預けられた培養物により認証されて
いる。培養物は１９８８年２月１８日に預けられ、次の
ように示される：大腸菌ＭＣ１０６１：　ｈＬｉｐｏ　
ｌ１ｌ−３−５１ＶＩ　（１０、１０１５ｇ（リポコル
チンＩＩ＋） 友且菌ＭＣ１０６１：　ｈＬｉｐｏ　Ｖ−３ｂ　ＩＶＩ
　（１０、　１０１５９（リポコルチンＶ） ウシ腸　　からのりボコルチンの 本発明者等は、ウシ源からリポコルチンを単離し、かつ
ペプチド地図作製と配列分析により特性付けした。ウシ
タンパク質を、■、ゲルヶとＸ、ウニベル（１９８４）
の方法を使用して子ウシ腸から抽出した。「刷子縁から
精製したタンパク質でラウス肉腫ウィルス形質変換によ
るリン酸化ｐ３６にの同定：非赤血球スペクトリンとＦ
−アクチンに結合するカルシウム−依存」エムボ　ジャ
ー九丑１１但東上ユ、！１血、第２２７−３３頁（１９
８４）。ＥＧＴＡ抽出物を、１０ｍＭイミダゾール−Ｈ
Ｃｌ　ｐＨ７，５，１ｍＭＮａＮｚ、Ｏ，ＩｍＭ　ＥＤ
ＴＡに対して透析し、次いでＤＥＡＲ−セルロースクロ
マトグラフィーに付シた。帯タンパク質を同じ緩衝液中
でＮａＣ１（０−０，３Ｍ）の勾配で溶出した。ホスホ
リパーゼＡ、抑制活性の３つのピークを検出し、これら
は、ラット腹膜洗浄液からのフロースルー画分及びピー
ク１と１１に相当した。各々のピークを迅速フローＳ−
セファ０−ス（ファルマシア）上でカチオン交換クロマ
トグラフィーに付した。結合タンパク質を５０ａ＋Ｍ　
ＭＥＳ　ｐＨ６、ｓ、　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ中の０−０
．２Ｍ　ＮａＣｌで溶出した。ＤＥＡＥ−セルロースフ
ロースルーのピークのファストＳクロマトグラフィーに
対して、調製物は限外濾過により最初１０倍に濃縮され
、次いで５０５Ｍ　ＭＥＳ　ｐ＋Ｉ６．　Ｏでｌ：ｌに
希釈された。活性の単一ピークを塩で溶出した。ピーク
ｌと日活性の画分に対して、抑制画分を２５１１＋Ｍ　
Ｍｅｓ　ｐＨ６，０で４倍に希釈した。両方の調製物は
２つの抑制因子を含み、一つは、イオン交換マトリック
スを通過し、他の物はファストＳに結合し、塩で溶出さ
れた。各々の抑制因子はペプチド地図作成と免疫学的分
析により独特のタンパク質であることが示された。

以前、本発明者等は、ウシ腸からのＤＥＡＥフロースル
ー画分における主抑制因子はリポコルチンー■であった
ことを確認した［ハング等、１９８６１゜ここで、おな
し基準で、本発明者等は、ファストＳマトリックスに結
合したウシピーク！抑制因子は、ラットリポコルチン−
１１１に対応し、ファストＳを通過したピークＩＩ抑制
因子はラフトリポコルチン−■に対応することを決定し
た。簡単にする為に、本発明者等は、ファス）Ｓを通過
したピークＩ抑制因子をリポフルチン−ＩＶと称し、か
つファストＳに結合したピーク１■抑制因子をリポコル
チン−Ｖｌと称する。下記の図は、ウシリポフルチンの
精製に使用した工程を総括している。

車　リポ、：リボコルレチン 構造的研究の為に、かつ純度の最終的測定として、各種
抑制因子を０４力ラム上逆相高圧液体クロマトグラフィ
ーに付した。各々の抑制因子は異なる溶出プロフィルを
示し、本発明者等は、今や同定の方法として使用してい
る。第５図は精製抑制因子のゲルプロフィルを示してい
る。ウシリポコルチン−Ｉ＋（レーン２）とウシリポコ
ルチア　１１１−Ｖ（Ｌ／　−：ｙ　３−５）（７）　
３３ｋｄ断片は、総て同じ電気泳動的移動を有した。組
換えヒトリポコルチン−１（レーン１）とヒトリポコル
チン−１（レーン１）３３ｋｄ断片もまた示しである。

本発明者等は、レーン５中の２つの帯が単一タンパク質
から誘導されると推論し、その理由は、両方の種はラッ
トリポコルチン−Ｖ免疫血清と反応し、かつ両方はＣＮ
Ｂｒ地図作成に付すと同じペプチド地図を有するから。

第６図は、ウシタンパク質の各々に対する、及びヒトリ
ポコルチン−１の３３ｋｄだんぺんに対するＣＮＢｒペ
プチド地図を示している。各プロフィルは明瞭で、従っ
て個々の系統メンバーの同定に使用出来る。リポコルチ
ン−■の小さな形態に対する開裂プロフィルのみが示し
てある。

第７図は、５つのウシタンパク質のトリプシンベプチド
地図を示している。ＣＮＢｒ開裂プロフィルのように、
・トリブシンペブチド地図は、５つの明瞭なりポフルチ
ンがウシの腸粘膜がら単離されたことが裏付けられる。

クロマトグラフィー的性質は各種タンパク質の同定を示
しており、その複雑性の為に、各タンパク質は更に配列
決定分析により特性付けされた。第１表は、第７図に示
されたトリプシン断片を使用してリポフルチン＋Ｖとリ
ポコルチンＶｌに対する配列の典型的な組みを示してい
る。個々の断片メンバーは、第７図に示した両分メンバ
ーに関係スる。

１国 ａ．リポコルチン−１ｖ： Ｔ６０＋ Ｔ６８： Ｔ６９： Ｔａ７二 ＳａｒＡｓｐＴｈｒＳａｒＥ’ｈａＭａｔＰｈａＧＬｎ
ＡｒｇＡｓｐＧｌｕＳ＊ｒＡｓｎＴｙｒＬｅｕＡｓｐＡ
ｓｐＡｌａ［，ａｕＭｅｔＡｒｇＡｓｎＨｉｓＬｅｕＬ
ａｕＨｉｓＶａｌＰｈｅＡｓｐＣ；ｌｕＴｙｒＬｙｓＡ
ｒｇＧｌｙＬａｕＧＬｙＴｈｒＡｓｐＧｌｕＡａｐＡｌ
ａＩｌｅＩｌｅＡｓｎＶａＬＬａｕＡｌａＴｈｒＡｒｇ Ｔ８９：　　ＳｅｒＧｌｕ［，ｅｕＳｅｒＧｌｙＡｓｎ
ＰｈｅＧ１ｕＧｌｎＶａｌＩＬｅＬａｕＧＬｙＴ１１２
：　ＳａｒＧｌｕＬａｕＳｅｒＧｌｙＡｓｎＰｈｅＧｌ
ｕＧｌｎＶａｌＩｌｅＬｅｕＧｌｙＭｅｔＭａｔＴｈｒ
ＰｒｏＴｈｒＶａＬＬｅｕＴｙｒＡｓｐＶａｌＧ１ｎＧ
ｌｕｂ　リポフルチン−ｖ１： Ｔ５０：　　ＳｅｒＴｈｒＡｌａ（；ｌｕＴｙｒＰｈａ
ＡｌａＧｌｕＡｒｇＴＳ１二　　Ｇ１ｙＴｈｒＶａｌＡ
ｒｇＰｒｏＡＬａＧ１ｙＡｓｐＥ’ｈｅＡｓｎＰｒｏＡ
ｓｐＡｌａＡｓｐＡｌａＶａｌＬｙｓ ＴＳ２：　　ＭｅｔＴｈｒＡｓｎＴｙｒＡｓｐＶａｌＣ
；ｌｕＨｉｓＴｈｒＩｌｅＬｙｓＴ５９：　　ＶａＬＰ
ｈｅＧｌｎＧＬｕＰｈｅＶａｌＬｙｓＴ６１；　　Ａｒ
ｇＶａｌＰｈｅＧ１ｎＧＬｕＰｈｅＶａｌＬ！，ＩｇＴ
７０：　　ＣｌｎｆｌｌｅｔＴｒｐＧＬｕＬｅｕＳａｒ
八ｌａＶａＬＡｌａＡｒｇＴ８１：　　八ｓｐＶａＬＰ
ｈｅＶａｌＡＬａＩｌｅＶａＬＧｌｎｓｅｒＶａｌＬｙ
ｓＧＬｕＡｌａｌ１ｅＬｓｕＧｌｕＬｅｕｌ１ｅＴｈｒ
Ｔ８３：　　Ｌｅｕ工１ｅＬｅｕＩｌｅＬｅｕＭｅｔＭ
ｅｔＰｒｏｌｌｅＡＬａ工１ｅＴｙｒＡｓｎＡｌａ Ｔ８６：　　ＡｓｐＰｈｅＰｒｏＡｓｐＰｈｅＡｓｎＰ
ｒｏＳｅｒＧ１ｎＡｓｐＡｌａＧｌｕＴｈｒＬｅｕＴｙ
ｒＡｓｎＡＬａＭｅｔＬｙｓＴ８８：　　Ｇｌｙ［，ａ
ｕＧｌｙＴｈｒＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｈｒＩＬｅＩｌｅ
ＡｓｐＩＬｅＩ１ａＡｌａＨｉｓ Ｔ９８：　　ＭｅｔＬｅｕＶａｌＶａＬＬｅｕＬｅｕＧ
ＬｎＧｌｙＴｈｒＡｒｇＧＬｕＣ；ｌｕＡｓｐＡｓｐＶ
ａＬＶａｌＳｅｒＧｌｕＡｓｐＬｅｕＶａｌＧ１ｎＧｌ
ｎ本発明者等は、リポコルチンＶｌの第一構造の約２５
％を説明する、リポコルチンｖ１に対する配列情報の１
５０個のアミノ酸を同定した。リポコルチ７１−■に対
する配列のように、リポコルチン−ＶＩ＋７３一部の配
列は、他のりボコルチンと相同性を分かち合うことを明
らがに示している。

配列の同定は、リポコルチンーＩＩ１に関して２７％か
らりボコルチンーＶに関して３７％までに亙ってしる。

同じ領域に亙って、リポコルチン！とりポフルチンＩ１
の配列は、４９％の同定を示した。

特に、画分Ｔ８ｇのアミノ酸配列は、共通配列に一致し
、これにつき、本発明者等は、リポコルチン系統の特性
であることを見いだした。［Ｍ．　Ｊ．ゲイソウとＪ．
　Ｈ．ウォルヵー、「カルシウムとホスホリピッドによ
る細胞調節を含む新規タンパク質」、生化学の　　　Ｔ
ｒｅｎｄｓ　ｉｎ旧ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　）、第１１巻
、第４２０−２３頁（１９８６）；　Ｒ．＋！．クレチ
ンガートＣ．Ｅ．クレクッ、「細胞開口分泌におけるコ
ンセンサス」、１髭ロ■と旦、第３２０巻、第５７３頁
（１９８６）］ウシリポフルチンＩ１からｖ１までのア
ミノ酸配列の、対応するヒトとラットリポコルチンとの
比較は、高いレベルの変換を立証している。リポコルチ
ンＩ，　　ＩＩＩとＶは、種を越えて約８５％保存され
ているが、リポコルチン■１は約９８％保存されている
。更に、ホスホリパーゼＡ，抑制の機能特性と結合する
りポフルチンの一定領域のアミノ酸配列の類似性は、こ
れらのタンパク質が単系統のメンバーであり、かつその
系統が進化論的に保存されていることの強刀な証拠であ
る。

ヒトリポコルチン１ｖとｖ１の完全配列は、本発明者等
がこの明細書中に開示したトリブシン断片のアミノ酸配
列を使用して得られるだろう。

リポコルチンタンパク質の特性は、これらが種系統を越
えて保存を示すことである。配列データがヒトと他の一
つの種に対して得られる４つのりポフルチンのヌクレオ
チド配列の共通の比較は、リポコルチ７１，　　ＩＩ＋
，及びＶに対して約８５−９０％の、かつソポコルチン
目に対して約９８％の類似性のレベルを立証する［Ｒ．
　Ｂ．ペビンスキイ一等、「タンパク質を結合する認識
可能なカル７ウムとホスホリビッドがリポコルチン１と
相同性を共有する」、細胞（Ｃｅｌｌ）、に没稿中］。

この保存の程度の為に、明細書に開示したトリブンン断
片のアミノ酸配列を直接に使用して、リポコルチン＋ｙ
とＶｌに対する対応するヒト遺伝子を単離することが出
来る。

ワルナー等、１９８６に開示される方法を使用して、本
発明者等が得たトリプシン断片のアミノ酸配列を、ウシ
リポコルチン１ｖとＶ目こ対してアンチセンスプローブ
を合成するのに使用することが出来る。好適には、これ
らのプローブは、ラットリポコルチンｃＤＮＡの単離に
対して以前記載した緊縮条件下に、完全ウシｃＤＮＡラ
イブラリーにオリゴヌクレオチドプローブをハイブリッ
ド形成することにより、これらの２つのりポフルチンに
対する完全ウシ遺伝子を単離するのに使用され得る。好
適には、次いでウシｃＤＮＡ断片は、普通の条件で軍ヒ
トｃＤＮＡライブラリーへウシｃＤＮＡプローブをキイ
ブリッド形成することにより対応するヒトｃＤＮＡを単
離するのに使用出来る［ペビンスキー等、投稿中］。

１　普通のハイブリッド形成条件は、６８°Ｃにおける
２　Ｘ　５ＥＴ（又は当量緩衝液）として定義されて良
い。

別室として、トリプシン断片の配列に基づ（アンチセン
スプローブは、ハング等、１９Ｈにより記載されたよう
に、対応ウシ遺伝子を最初単離すること無く、直接にヒ
トｃＤＮＡライブラリーを証明するのに使用することが
出来る。

リポコルチンＩＶとｖｌに対する開始コドンは、明細書
中でリポコルチンＩＮとＶに対してなされたように、全
長分子の為のヌクレオチド配列から推論されて良い。リ
ポコルチン系列の総てのメンバーは、ヌクレオチド配列
ＭｅｔＡｌａＷｅｔで始まる。従って、対応コドンの最
初の始まりは、翻訳開始の点に標識を付ける。

Ｆ、大　菌　にヒトリポコルチンＶの発現本発明者等は
、ＰＣＴ出願１０第８６１０４０９４号に記載したよう
に、発現ベクターｐｋｋ２３３−２を使用して大腸菌中
にヒトリポコルチンＶを発現した。

この構成において、リポコルチンＶは、ｔｒｃプロモー
ターの制御下に発現された。プロモーターの誘導は、２
ｍＭ　ＩＰＴＧで惹起される。ｐＨＬｉｐｏＶ−ａｂの
Ｎｃｏｌ／旧ｎｄｌｌｌ制限断片は、標準方法を使用し
て？ｊｃｏ＋／ｌ１ｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐｋｋ
２３３−２中に挿入された。このプラスミドの構造は、
略図的に第８図に示される。得られたプラスミドは、大
腸ｍ　株ＪＡ２２１中に形質転換された。リポコルチン
Ｖを発現する為に、細胞は、（Ｌ　Ｄ、　５ｓｏ１．０
まで増殖され、かつ培養前に２時間２１１Ｍトリス−１
１ＣＩ中に再分散させた。細胞を１２．０００ｐ、　ｓ
、　属、でフリンチプレシャーセルに通し、次いでタン
パク質をクロマトグラフィー工程の組合わせを介して精
製され、最初にＤＥＡＰ、セルロース、次いでｐ１５Ｇ
カラムのよるゲル濾過にっだ。精製タンパク質は、ベピ
ント牛−等、１９８６により記載されたホスホリバーセ
１．抑制検定において、　１０，０００単位／ｒａｇの
特異活性を有して、活性であった。

本発明により製造されるヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドの収率と活性の　上 タンパク質の製造のレベルは、３つの主な因子により支
配される：細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝子コ
ピーが転写される効率、及びこれらが翻訳される効率で
ある。転写と翻訳（これらは共同で発現からなる）の効
率は、望みのコード付は配列の前に普通位置するヌクレ
オチド配列により順々に決まる。これらのヌクレオチド
配列又は発現制御配列は、とりわけ、ＲＮＡポリメラー
ゼが転写（プロモーター配列）を開始することに相互反
応し、かつリポソームが翻訳開始に対してｍＲＮＡと結
合しかつ相互反応する位置を規定する。総てのこのよう
な発現制御配列が、等しい効率で機能するとは限らない
。

従って、本発明の配列をコード付けする特定リポコルチ
ンを、これらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、かつ
他の既知発現制御配列への代わりに、より高いレベルの
発現とりポフルチン様ポリペプチドの生成を助けるよう
に融合するのが便利である。このことが達成されたので
、新規工学的ＤＮＡ断片は、細胞内遺伝子コピー数を増
大し、かつそれにより更に発現リポコルチンポリペプチ
ドの収率を向上する為に、より高いコピー数プラスミド
又はバクテリオファージ誘導体中に挿入され得るだろう
。

幾つかの発現制御配列が、前記のようにして利用されて
良い。これらは、オペレーター　プロモーター、及び大
腸菌のラクトースオペロン（“ｌａｃシステム”）のリ
ボツム結合と相互反応配列（シネーダルガルノ配列のよ
うな配列を含めて）、大腸菌のトリプトファン合成酵素
システム（”Ｊシステム′）、ファージλの主オペレー
ターとプロモーター領域（前記Ｏｔ、Ｐｔ、と０ＲＰＲ
）、繊維状−本鎖ＤＮＡファージの制御領域、匡と匡シ
ステム、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖
酵素、酸性ホスファターゼ、例えばＰｂｏ２のプロモー
ター　イーストα−交配因子のプロモーター、ＳＶ４０
初期と後期プロモーターのような哺乳動物細胞の為のプ
ロモーター　アデノウィルス後期プロモーターと金属チ
オニンプロモーター、及び原核又は真核細胞とこれらの
ウィルス又はこれらの組合わせの遺伝子の発現を制御す
る他の配列を含む。

従って、　本発明のリポコルチン様ポリペプチドの製造
を向上する為に、これらのポリペプチドに対するＤＮＡ
配列は、前記のようにして調製して良く、前の発現制御
配列に近接する、又は前記向上した発現制御配列の一つ
の制御下の組換えＤＮＡ分子中に挿入されて良い。この
ような方法はこの分野で既知の技術である。

翻訳の効率を向上するのに有用な他の方法は、本発明の
りボコルチン関係ＤＮＡ配列の開始コドンの前に化学的
又は酵素的に調製したオリゴヌクレオチドの挿入、又は
これらの化学的又は酵素的に調製したオリゴヌクレオチ
ドを有するＤＮＡ配列のＮ−末端におけるコドンの置換
を含む。この方法により、伝令ＲＮＡのより最適の一次
と高次オーダーの構造を得ることが出来る。

更に特別に、配列がこのように設計出来るので、開始Ａ
ＴＧコドンは、ヘアピン領域の頭部における又は他の１
本鎖領域における容易に受は入れ易い位置（即ち、二次
構造により被覆されない）で起こる。前記シネーダルガ
ルノ断片の位置と配列は、同様に最適化され得る。伝令
ＲＮＡの一般的構造（折り畳み）ｋ重要性は、証明され
ている［Ｄ、イセレンタントと１．フィー・エル、ｒｍ
ＲＮ＾の二次構造と翻訳開始の効率」、ｌ孟ユ（Ｇｅｎ
ｅ）、Ｆ　９９　、第１−１２頁（１９８０）］。

本発明のリポコルチン様ポリペプチドの細胞収率におけ
るより大きな増大は、細胞中で利用可能な遺伝子の数を
増大することにより達成されるだろう。このことは、リ
ポコルチン遺伝子（その転写と翻訳制御要素の有る又は
無い）を、より高いコピー数プラスミド中に又は温度制
御コピー数フラスミド（即ち、プラスミドのコピー数が
温度を変えた後に増大するような変異を担うプラスミド
）中に挿入することにより達成され得る［８．ニーリン
等、［クローン化遺伝子の増幅の為の温度−依存コピー
数を有するプラスミドとこれらの生成物Ｊ、”’　（’
ｍ　　（Ｇｅｎｅ）、ｍｌ、第９１−１０６頁（１９７
９）］。

別案として、遺伝子量における増大は、例えば、前記工
学的方法で、温度バクテリオファージλ中に、組換えＤ
ＮＡ分子の挿入により、最も簡単に制限酵素でプラスミ
ドの消化により達成して、繊維状分子を与え、次いでこ
れを、制限されたファージスクローン化用運搬体〔例え
ば、Ｎ、　Ｅ、ムレイ等、「生体外組換えの回収を簡易
化するラムドイドファージ」、モル、ゲン、ジェ不ッ）
　、　（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、　）、第１
５０巻、第５３−６１頁（１９７７）、及びＮ、　Ｅ、
ムレイ等、「バクテリオファージＴ４からのＤＮＡリガ
ーゼ遺伝子の分子クローン化」、ジャーナルモレキュラ
ル　ビオロギ−（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、　）、第
１３２巻、第４９３−５０５頁（１９７９）］と混合さ
れ、ＤＮＡリガーゼと培養することにより生成した組換
えＤＮＡ分子とを混合される。次いで、望みの組換えフ
ァージが選択され、かつ友里１の宿主株を溶原化するの
に使用される。

従って、本発明のりコボルチン様ポリペプチドコード化
配列は開示ベクターから除去され、かつ（上記）前に記
載したように、他の発現ベクター中に挿入され、かつこ
れらのベクターを（上記）前に記載したように各種宿主
中に使用して本発明のヒドリコボルチン様ポリペプチド
の製造を向上することが理解されるべきである。

以上、本発明者等は、本発明の多くの実施態様を示して
来たが、本発明の基本的構成を変更して本発明の方法と
組成物を利用する他の実施態様を付与することが出来る
ことは明らかである。従って、この発明の範囲は、実施
例により示した特定実施態様によるよりも、特許請求の
範囲により定義されるべきことは理解されるであろう。

Ｑ

【図面の簡単な説明】

第１図は、プールしたラット腹膜洗浄液からの非粒状抽
出物を負荷したＤＥＡＥ−セルロースカラムから集めた
両分の吸光度のプロットで、実線はホスホリパーゼＡ、
抑制活性を示し、破線は総タンパク質を示しており、 第２図は、精製ラット腹膜タンパク質が５ＤＳ（”５Ｄ
Ｓ−）７−ジ″）中でのポリアクリルアミド電気泳動に
よるホスホリパーゼＡ、の抑制効果を有することを示す
分析を表し、タンパク質はクーマシーブルーで着色され
るか、又はリコポルチンに対する抗血清によるウェスタ
ンプロット法に付され、レーン１．３及び４はラットリ
コポルチンＩ、　　Ｉｌｌ及びＶを夫々負荷され、レー
ン２と５はウシリコボルチン１１とＭｌが負荷されたも
のであり、 第３図は、λＨＬｉｐｏ　ｌｌｌ−５の分析により決定
されたヒドリコボルチン−Ｉｌｌの全ヌクレオチド配列
、及び相当タンパク質の予測アミノ酸配列を示し、 第４図は、λ１ｌＬｉｐｏ　Ｌｌの分析により決定され
たヒドリコボルチン−Ｖの全ヌクレオチド配列、及び相
当タンパク質の予測アミノ酸配列を示し、第５図は、５
ＤＳ−ファージによるウシ腸粘膜から単離されたりコボ
ルチンの分析を表し、↑ レーン　は組換えヒドリコボルチン夏の無傷かつ３３ｋ
ｄ（レーンｌ）形態のゲルプロフィルヲ示し、レーン２
からレーン６までは５つの精製ウシタンパク質（リコポ
ルチン１１からＶｌまで）のゲルプロフィルを示し、レ
ーン数は個々の系統メンバーを同定しており、 第６図は、第５図に示されるゲルからのヒトとウシの腸
すコボルチンの臭化シアン断片のペプチド地図を示し、
ペプチド断片は鍛着色により可視化されており、レーン
数は個々の系統メンバーを同定しており、 第７図は、ウシリコポルチンのトリプシン地図を表し、
ＩＩＰＬＣ−精製ウシリコポルチンがハング等、１９８
６により記載されるようにトリプシンで消化されかつ細
孔Ｃ，カラムの逆相ＨＰＬＣにより分離されたもので□
あり、個々のりコボルチンの同定が図に示され、 第８図は、ｐＨＬｉｐｏ−３ｂのＮｃｏｌ／Ｈｉｎ旧Ｉ
Ｉ制限断片をＮｃｏ１／旧ｎｄ１１１消化プラスミドＩ
）ｋｋ２３３−２中に挿入したプラスミドの構造の略図
である。 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆ／６．１ 画分数 特許出願人　　バイオジエン　インコーポレイテッドＦ
ｌｏ、２ ｔｆ 画 分 数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リポコルチンをコード付けするＤＮＡ配列を特徴
   とし、かつ： （ａ）λＨＬｉｐｏ　ＩＩＩ−５のｃＤＮＡ挿入断片、 （ｂ）通常の条件下に先行ＤＮＡ挿入断片に対してハイ
   ブリッド形成しかつ発現にリポコルチンをコード付けす
   るＤＮＡ配列、及び （ｃ）先行ＣＤＮＡ挿入断片又はＤＮＡ配列により発現
   に対して発現にコード付けされたリポコルチンを発現に
   コード付けするＤＮＡ配列の群から選択される組換えＤ
   ＮＡ分子。（２）リポコルチンをコード付けするＤＮＡ
   配列を特徴とし、かつ： （ａ）λＨＬｉｐｏ　Ｖ−１のｃＤＮＡ挿入断片、 （ｂ）通常の条件下に先行ＤＮＡ挿入断片に対してハイ
   ブリッド形成しかつ発現にリポコルチンをコード付けす
   るＤＮＡ配列、及び （ｃ）先行ＣＤＮＡ挿入断片又はＤＮＡ配列により発現
   に対して発現にコード付けされたリポコルチンIIIを発
   現にコード付けするＤＮＡ配列の群から選択される組換
   えＤＮＡ分子。 （３）ＤＮＡ配列が （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 から成る群から選択される請求項１記載の組換えＤＮＡ
   分子。 （４）ＤＮＡ配列が： （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 から成る群から選択される請求項２記載の組換えＤＮＡ
   分子。 （５）リポコルチンをコード付けするＤＮＡ配列を特徴
   とし、かつ： （ａ）トリプシン断片： 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 を含むアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドをコード
   付けするＤＮＡ配列、 （ｂ）通常の条件下に先行ＤＮＡ挿入断片に対してハイ
   ブリッド形成しかつ発現にリポコルチンをコード付けす
   るＤＮＡ配列、及び （ｃ）先行ＣＤＮＡ挿入断片又はＤＮＡ配列により発現
   に対して発現にコード付けされたリポコルチンを発現に
   コード付けするＤＮＡ配列の群から選択される組換えＤ
   ＮＡ分子。（６）リポコルチンをコード付けするＤＮＡ
   配列を特徴とし、かつ： （ａ）トリプシン断片： 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 を含むアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドをコード
   付けするＤＮＡ配列、 （ｂ）通常の条件下に先行ＤＮＡ挿入断片に対してハイ
   ブリッド形成しかつ発現にリポコルチンをコード付けす
   るＤＮＡ配列、及び （ｃ）先行ＣＤＮＡ挿入断片又はＤＮＡ配列により発現
   に対して発現にコード付けされたリポコルチンを発現に
   コード付けするＤＮＡ配列の群から選択される組換えＤ
   ＮＡ分子。（７）前記ＤＮＡ配列が分子中で発現制御配
   列に作用的に連鎖される請求項１〜６のいずれか１項に
   記載の組換えＤＮＡ分子。 （８）前記発現制御配列が、ラックシステム、β−ラク
   タマーゼシステム、主オペレーターとファージλのプロ
   モーター領域、ｆｄコートタンパク質、３−ホスホグリ
   セリン酸キナーゼ塩又は他の解糖酵素類、イーストα交
   配因子のプロモーター、アクチンプロモーター、哺乳類
   細胞、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、アデノウィ
   ルス後期プロモーターと金属チオニンプロモーター、原
   核又は真核細胞とこれらのウィルス、並びにこれらの組
   合わせから成る群から選択される請求項７記載の組換え
   ＤＮＡ分子。 （９）請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子の少なくとも
   一つで形質変換された単細胞宿主。 （１０）￥大腸菌属￥、￥シュードモナス属￥、￥バシ
   ラス属￥、￥ストレプトミセス属￥、昆虫細胞、イース
   ト、他の菌類、マウス又は他の動物宿主、植物宿主、及
   びヒト組織細胞から成る群から選択される請求項９記載
   の形質変換された宿主。 （１１）（ａ）成熟リポコルチンIII、 （ｂ）ｆ−メット−リポコルチンIII （ｃ）成熟リポコルチンIV （ｄ）ｆ−メット−リポコルチンIV （ｅ）成熟リポコルチンＶ （ｆ）ｆ−メット−リポコルチンＶ （ｇ）成熟リポコルチンVI、及び （ｈ）ｆ−メット−リポコルチンVI から成る群から選択される少なくとも一つのヒトリポコ
   ルチンの実質的に純粋な調製。 （１２）請求項９記載の形質変換された宿主により製造
   されたヒトリポコルチン。 （１３）次のトリプシン断片： 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 を含む実質的に純粋なリポコルチン、又は少なくとも約
   ８５％の類似体を有するリポコルチン。 （１４）次のトリプシン断片： 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】 を含む実質的に純粋なリポコルチン、又は少なくとも約
   ８５％の類似体を有するリポコルチン。 （１５）アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 （１６）アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むヒトリポコルチン。 （１７）（ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】 の群から選択されるＤＮＡ配列の一つを含む単離された
   ポリヌクレオチド鎖。 （１８）請求項９記載の組換えＤＮＡ分子により形質変
   換された宿主を培養し、次いでポリペプチドを収集する
   工程から成るヒトリポコルチンポリペプチドの製造方法
   。 （１９）請求項１２、１３、１４、１５、１６、又は１
   ７のいずれか１項に記載の少なくとも一つのポリペプチ
   ドの薬学的に有効量含み、関節炎、アレルギー疾患、皮
   膚疾患、目疾患、及び膠原病並びに炎症性過程を含む疾
   患の治療に有益な薬学的に許容出来る組成物。 （２０）請求項１９記載の組成物の薬学的に有効量を与
   えることから成り、関節炎、アレルギー疾患、皮膚疾患
   、目疾患、及び膠原病並びに炎症性過程を含む疾患の治
   療方法。