JPH09512423A

JPH09512423A - エラスターゼ阻害活性を有するα−１−アンチキモトリプシンアナログ

Info

Publication number: JPH09512423A
Application number: JP7525637A
Authority: JP
Inventors: エス．クーパマン，バリー; ルービン，ハービー; ノーマンシェクター; メイワン，ジ
Original assignee: ザトラスティーズオブザユニバーシティオブペンシルベニア
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1997-12-16
Also published as: AU696995B2; CA2186908A1; LV11747B; EP0754228A1; NO964022L; US5674708A; WO1995027055A1; FI963891A; NZ269619A; HU9602674D0; AU7393694A; FI963891A0; PL316433A1; LV11747A; CN1145637A; EP0754228A4; SK138196A3; CZ281796A3; BG100939A; HUT74901A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルファ−１−アンチキモトリプシンのアナログを提供し、ここに、その３５８位のアミノ酸は、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択される。本発明のアルファ−１−アンチキモトリプシンアナログは、ヒト好中球エラスターゼの有効な阻害剤である。本発明は又、該アナログをコードする核酸配列、発現ベクター、トランスフォームした宿主細胞、及びこれらのアナログの製造方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】エラスターゼ阻害活性を有する α−１−アンチキモトリプシンアナログ産業上の利用分野この発明は、組換えＤＮＡ技術により産生される蛋白質の分野に関する。さらに詳しくは、本発明はエラスターゼを阻害できる蛋白質に関する。発明の背景アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）及びα１−プロテアーゼ阻害剤（α１−ＰＩ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤スーパーファミリーの一員であり、密接に関連した一次アミノ酸配列及び三次元構造を有する。しかし、アンチキモトリプシンは、狭い阻害活性スペクトルを持っている。特に、α１−ＰＩはヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）の有効な阻害剤であるが、アンチキモトリプシンはこの酵素の基質であり、この酵素により不活性化される。ポテンパ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，２１４８２を参照。ヒト好中球エラスターゼが多くの炎症の分子的及び細胞的機構を媒介するに際して有意義な役割を果たすことはよく認識されている。トラビス及びフリッツ、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．１９９１，４３，１４１２を参照。炎症のいくつかのメディエーターは、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤によって調節されているものと思われる。ひとつの例は、ＴＮＦ媒介による好中球からのカテプシンＧ（ｃａｔＧ）の放出による、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）増強された血小板の活性化であり、アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）によりブロックされた効果である。Ｐ．レネスト他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，１４６，２３０５を参照。また、ＴＮＦにより刺激された好中球でのロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成及び放出はα１−プロテイナーゼ阻害剤（α１−ＰＩ）及びＡＣＴによりブロックされ、ｃａｔＧ及びヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）により高められた。Ｇ．カムシ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８８，１６８，１２９３及びＧ．カムシ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９，１８２，６６１を参照。炎症反応の血管及び組織の微細環境は、内在性の又は投与された抗炎症因子の接近を制限することによって有効な応答を加減するように働くことができる。例えば、小さい（１１．７ｋＤ）塩基性ポリペプチドである分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）は、付着性の好中球の下にある微細環境に対して接近することができ、中性親和顆粒エラスターゼによる蛋白質分解から局所組織を保護するものと思われる。α１−ＰＩ、血清又は血漿ではなくてエラスターゼ特異性クロルメチルケトン阻害剤はヒト微細血管傷害のモデルにおいてインビトロで好中球により媒介された内皮の損傷を阻止した。ナザン氏は、付着性好中球が浮遊状態の好中球と明確に異なった動力学を有するフリーラジカル酸素を発生させることを示した。ナザン、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８０，８０，１５５０を参照。しかし、非常に反応性のフリーラジカル酸素種及びその生成物が付着性好中球と下にある組織との間に蓄積するかどうかは不明である。ヒト好中球は、組織化学又は超微細構造組織化学により識別される二つの明確な種類の顆粒を含有する。ベイントン他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９６８，３９，２８６及びベイントン他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９６８，３９，２９９を参照。アズール親和性（即ち、第一の）顆粒は通常大きく、緻密でミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）及び中性プロテアーゼを含有する。これよりも小さくて、緻密ではなく、特異的な（即ち、第二の）顆粒はペルオキシダーゼ陰性であり、リゾチーム及びラクトフェリンを含有する。ウェインバウム氏他は、好中球内にはアズール親和性顆粒について少なくとも三つの明確な集団があることを報告した。一つの集団は全てエラスターゼ抗原を有するがＭＰＯ活性はほとんどない。アズール親和性顆粒は不均質であり、脱顆粒剌激に対して様々に応答する。また、特異的顆粒も不均質であって、カルシウムで誘発されるラクトフェリンの放出に対して異なった感受性を持っている。プロテインキナーゼＣの選択的阻害はアズール親和性脱顆粒を阻害しないが特異的顆粒の内容物の放出を阻害する。従って、炎症性応答を特徴づける微細環境における好中球からのヒト好中球エラスターゼ、ｃａｔＧ及びプロテイナーゼ３の放出を刺激させるには多重の協調されたシグナルが要求されよう。これらのシグナルに対する結合及び応答の動力学は炎症に対する生理学的応答を調節するのにも重要であろう。肺におけるヒト好中球エラスターゼの放出は、好中球が循環から去ったずっと後に肺胞の間質内で起こることがわかっている。血管外遊出の間の好中球脱顆粒についてはほとんど知られていない。呼吸上皮細胞は増大されたＩＬ−８の発現によってヒト好中球エラスターゼに応答し、そして更に、ＩＬ−８は上皮細胞を通過する移動を媒介する。従って、ＨＮＥの放出、次いで強調された好中球の移動を伴う好中球循環の動的で有害なサイクルが確立される。付着性細胞による好中球プロテアーゼの放出は充分に研究されていないが、好中球のホルボルミリステートアセテート（ＰＭＡ）による刺激が下にある細胞外マトリックスを消化するプロテアーゼを放出させることになることが知られている。キャンベル他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８２，７０，８４５及びウェイズ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６，１３６，６３６を参照。マトリックス蛋白質（例えば、ラミニン、フィブロネクチン又はビトロネクチン）に付着性の好中球はＴＮＦ又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＴ）のような生理学的シグナルによって刺激されたが、浮遊細胞はそうではなかった。付着性細胞はレスピラトリーバーストを発現し、それはＰＭＡに対するよりもＴＮＦ及びＧ−ＣＳＦに対して１０〜５０倍感受性であり、またｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ又はＣ５ａに対するよりも５０〜２５０倍感受性であった。さらに、これらは、浮遊細胞とは著しく異なった動力学でもって応答した。従って、蛋白質分解酵素の阻害剤は、治療的に投与されたときは、炎症の分子的及び細胞的機構を制限し、しかして組織の損傷を減少させることができる。従って、動物に臨床適用するための安全で有効なエラスターゼ阻害剤に対する要望が存在する。多機能プロテアーゼ阻害剤に基づく治療剤は、フリーラジカルやプロテアーゼが成人の呼吸症候群、膵炎、炎症性皮膚傷害及び再潅流損傷のような傷害の機構に関連してきた疾病の治療を臨床的に進歩させるであろう。発明の概要本発明は、ヒト好中球エラスターゼの有効な阻害剤であるヒトα１−アンチキモトリプシンのアナログを提供する。本発明のヒトα１−アンチキモトリプシンアナログは、それらがヒト好中球エラスターゼの基質であることを止め、且つ、ヒト好中球エラスターゼの阻害剤となるように巧みに扱われる。本発明は、３５８位のアミノ酸ロイシンがメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるアミノ酸で置換されたヒトα−１−アンチキモトリプシンのアナログを提供する。このアナログは更に、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位のアミノ酸の位置の少なくとも一つにプロリンを有し得る。本発明のアナログは、ヌクレオチド配列から産生されるヒトα−１−アンチキモトリプシンであって、野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のアミノ酸Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）に相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンを包含する。本発明の他の点は、新規なα−１−アンチキモトリプシンポリペプチドを提供することである。本発明の新規なポリペプチドは、成熟ヒト野生型α−１−アンチキモトリプシンの全アミノ酸配列（図１参照）をコードするヌクレオチド配列の３５６〜３６１位のアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヌクレオチド配列から産生される。また、本発明は、３４９及び３５０位に相当するアミノ酸Ａｌａ−ＡｌａがＧｌｙ−Ｔｈｒに変えられ且つ３６８位のアミノ酸ＶａｌがＴｈｒに変えられた、ヌクレオチド配列から産生されたヒト野生型α−１−アンチキモトリプシンのアナログを提供する。また、前記の置換を有するα−１−アンチキモトリプシンの新規なポリペプチドアナログも本発明の主題である。さらに、３５６〜３６１位でのアミノ酸置換並びに３４９、３５０及び３６８位でのアミノ酸置換もα−１−アンチキモトリプシンのさらに新規なアナログを生成させるように同じヌクレオチド及びアミノ酸配列内で起こり得るであろう。本発明の新規なポリペプチドはＮ−末端伸長部Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）及びＭｅｔ− Ａｌａ−Ｓｅｒを含み、そのいずれも野生型α−１−アンチキモトリプシン並びに本発明の新規なα−１−アンチキモトリプシンアナログに付加することができる。Ｎ−末端伸長部をコードするヌクレオチド配列及びＮ−末端伸長部を有する α−１−アンチキモトリプシンは本発明の範囲内である。また、本発明は、本発明のα−１−アンチキモトリプシンアナログをコードする核酸配列、この核酸配列を含む発現ベクター、本発明の核酸配列を発現させることができるトランスフォームされた宿主細胞、本発明のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる細胞培養物及び本発明のヒトα −１−アンチキモトリプシンアナログを含む蛋白質製剤を提供する。さらに本発明の他の点は、本発明のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる宿主細胞を培養してヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログ含有細胞を生成することを含むヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの生産方法を提供する。適宜、ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含有する細胞と培地との混合物を精製してヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを精製された形態で生産することができる。本発明のさらに他の主題は、エラスターゼを阻害剤として有効な量の本発明のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログと接触させることからなる好中球エラスターゼを阻害する方法に関する。本発明は以下の記載からさらに明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１は野生型ヒトα−１−アンチキモトリプシンの完全ヌクレオチド配列及び予測されたアミノ酸配列を示す。この全長の遺伝子はヌクレオチド残基１〜１２０９によりコードされている。発明の具体的な説明本発明者は、驚いたことに、ヒトα−１−アンチキモトリプシンをコードする配列中のある種のアミノ酸の置換が、α−１−アンチキモトリプシンをヒト好中球エラスターゼの基質からヒト好中球エラスターゼの有効な阻害剤に変化させる一方キモトリプシンを阻害する能力を保持することを予期せずして見出した。本発明は、ヒト野生型α−１−アンチキモトリプシンのヌクレオチド配列であって、その野生型α−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）に相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）により置換されているものを提供する。また、３５６〜３６１位のアミノ酸の置換をコードする新規なヌクレオチド配列も本発明に包含される。さらに本発明では、相当する３４９、３５０及び３６８位の対応アミノ酸の置換をコードするヌクレオチドを有するヒト野生型α−１−アンチキモトリプシンのヌクレオチド配列アナログも提供される。このアナログのこれらの位置におけるヌクレオチドはそれぞれＧｌｙ、Ｔｈｒ及びＴｈｒをコードする。これらの置換を有するポリペプチド配列も本発明の範囲内にある。野生型α−１−アンチキモトリプシンの３４９及び３５０位のアラニン−アラニンに相当するアミノ酸がそれぞれグリシン−トレオニンで置換され、ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、且つ、野生型α−１−アンチキモトリプシンの３６８及び３６９位のバリン−アルギニンに相当するアミノ酸がそれぞれトレオニン−アルギニンで置換され、ＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する本発明のアナログは、エラスターゼ阻害活性を示す。Ｎ−末端伸長部は本発明の新規なアナログ又は野生型α−１−アンチキモトリプシンに付加することができる。これらのＮ−末端新頂部には、ポリペプチド配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）及びＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒのためのヌクレオチド配列が含まれる。本発明のアナログをセリンプロテアーゼ阻害剤とセリンプロテアーゼとの間の相互作用の性質を分析するために使用した。アンチキモトリプシンの反応中心のＰ１位及びその反応中心の周囲にある残基は、エラスターゼと本発明のα−１− アンチキモトリプシンアナログとの間の安定な複合体形成を生じさせた。野生型α−１−アンチキモトリプシン中に置換されるアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）はα−１− プロテイナーゼ阻害剤の相当セグメント、即ち、Ｐ３からＰ３’位までのα−１ −プロテイナーゼ阻害剤の反応中心から選択した。本明細書で使用される命名は、シェヒター及びベルガー両氏により報告されたものと一致している。シェヒター及びベルガー、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７，２７，１５７を参照。野生型α−１−アンチキモトリプシンとは、ヒト α−１−アンチキモトリプシンの天然の成熟型を意味する。Ｍｅｔ−ＳｅｒがＰ１−Ｐ１’残基であるα−１−プロテイナーゼ阻害剤は１０×１０⁶Ｍ^-1Ｓ^-1の二次速度定数でＨＮＥを阻害する。α−１−アンチキモトリプシンは、相当する位置に４４．５％の同一残基を有するα−１−プロテイナーゼ阻害剤と高度に相同性である。しかし、反応中心でＰ１−Ｐ１’Ｌｅｕ−Ｓｅｒ残基に隣接する配列は全く異なる。野生型α−１−アンチキモトリプシンはキモトリプシンの優秀な阻害剤であるが、ＨＮＥの有効な阻害剤ではない。事実、ＨＮＥはα−１−アンチキモトリプシンを少なくともＰ４−Ｐ３位（Ｉｌｅ３５５−Ｔｈｒ３５６）において開裂させ、その阻害特性の不活性化を生じさせる。しかして、本発明は、ヒトα−１−アンチキモトリプシンの小部分のみを変化させることによって、その特異性を、α−１−アンチキモトリプシンアナログのキモトリプシンを阻害する能力を保持しながらそれが完全に異なる酵素、即ちエラスターゼの有効な阻害剤であるように、驚くほどに変化させるものである。一般に、本発明のα−１−アンチキモトリプシンアナログは、特定の蛋白質をコードする核酸配列を含む発現ベクターによりトランスフォームされた宿主細胞内で産生される。トランスフォームされた細胞は、その特定の蛋白質をコードする核酸配列が発現される条件下で培養される。蛋白質が蓄積するのに適した所定の時間の後に、蛋白質はトランスフォームされた細胞から精製される。 α−１−アンチキモトリプシンをコードするヒト遺伝子は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。好適なライブラリーは、ＣｌｏｎｔｅｃｈＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡのような商業的な供給源から得ることができる。次いで、陽性クローンをＤＮＡ配列決定に付してα−１−アンチキモトリプシンをコードするＤＮＡ配列の存在を決定する。ＤＮＡ配列決定は、サンガー他のチェーンターミネーション法を使用して容易に達成される。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４，５４６３を参照。次いでα−１−アンチキモトリプシンをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞における後の発現のために発現ベクター内に挿入する。本発明のα−１−アンチキモトリプシンのアナログは、米国特許第５，０７９，３３６号（参考として本明細書中に援用する）に開示されたα−１−アンチキモトリプシンカセットアナログを使用して製造することができる。例えば、３５６〜３６１位のアミノ酸置換Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）をコードするＤＮＡ配列をカセットに挿入し、次いでこれをα−１−アンチキモトリプシンをコードする配列中に挿入する。さらに、３５６〜３６１位のアミノ酸置換を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列並びに３４９、３５０及び３６８位のアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をカセットベクターによって製造することができる。別法として、 α−１−アンチキモトリプシンのアナログをコードするＤＮＡ配列はＰＣＲにより製造することができる。最終的に、α−１−アンチキモトリプシンのポリペプチドアナログを産生させることができる。発現ベクター及び宿主細胞は、α−１−アンチキモトリプシン又はアナログを合成できる発現系を形成するように選択される。本発明で使用するのに好適な宿主細胞には、米国特許第５，０７９，３３６号に開示されるように、α−１−アンチキモトリプシンを安定して含有し且つ発現させるようにトランスフォームすることができる原核細胞及び真核細胞が含まれる。例えば、組換えα−１−アンチキモトリプシン又はアナログをコードする核酸は、組換え蛋白質産生用の最も普通に使用されている宿主細胞Ｅ．ｃｏｌｉを含めて原核細胞又は真核細胞内で発現させることができる。しかし、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ等の他の微生物菌株、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉｓｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのようなその他の腸内細菌科、各種のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、或いはその他の細菌株も使用することができる。普通に使用される真核細胞系には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、Ｅ３Ｃ／Ｏ及びＳＬ−２９のようなニワトリ細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ−７またはＭＤＣＫ細胞などのような哺乳類細胞が含まれる。上記のリストは例示に過ぎず、本発明の核酸配列を発現させるために好適な宿主細胞のタイプを何ら制限するものではない。発現ベクターとは、本明細書で使用するときは、組換えα−１−アンチキモトリプシンをコードする核酸配列を含有するように操作することができる任意のタイプのベクター、例えば、プラスミッド発現ベクター及びウイルスベクターをいう。発現ベクターの選択は、組換えα−１−アンチキモトリプシンをコードする核酸の発現が生じるように所望の宿主細胞との適合性に基づいて決める。プラスミッド発現ベクターは、プロモーターのような少なくとも１種の発現調節要素と機能的に結合された本発明の核酸配列を含む。一般に、プラスミッドベクターは、宿主細胞と適合性の種から誘導されたレプリコン及び調節配列を含有する。本発明の核酸配列を含有するプラスミッドの選択を容易にするためには、プラスミッドベクターは、抗生物質耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカーも含有することができる。好適な例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール又はカナマイシン耐性をコードする遺伝子がある。好適な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現調節要素は当分野で知られており、サムブルック他、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：実験室マニュアル」第二版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、１９８９）に見出される。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＺＭＳ、ｐＺＭのようなプラスミッド及び実施例に記載のプラスミッドはＥ．ｃｏｌｉで発現させるために使用することができる。プラスミッドＹＲｐ７は、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅで発現させるのに使用することができる。ｐＭＴ２及びｐＭＳＧのようなプラスミッドは哺乳類細胞で発現させるのに使用することができる。好適なウイルスベクターにはバキュロウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスが含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉでα−１−アンチキモトリプシン又はアナログを発現させるためには、スタジール及びモファットによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８６，１８９，１１３（その記載内容は本明細書に含めるものとする）に開示されたようなバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを基にした遺伝子発現系を使用することができる。この系においては、選択した生成物をコードするＤＮＡ配列と機能的に結合されたバクテリオファージＴ７プロモーターを含有するプラスミッドによりトランスフォームされたＥ．ｃｏｌｉ細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現可能な遺伝子を有するλファージを感染させる。このプラスミッドの十分なコピーが宿主細胞内に存在した後に細胞にファージを感染させ、感染後間もなく蛋白質の合成が始まる。発現ベクターは、好ましくは、ヒトα−１−アンチキモトリプシンをコードする核酸酸配列に機能的に結合された少なくとも１個の転写及び翻訳調節要素を含む。例えば、上流の位置には、プロモーターの後に、リボソーム結合部位と間始コドンを含む翻訳開始シグナルが続き、下流の位置には、転写終結シグナルが続いていてよい。転写調節要素と翻訳調節要素は任意の機能的な組合せ又は順序で結合され得る。本発明の特定の具体例において使用される転写調節要素と翻訳調節要素は、発現系が造られるように、発現ベクターが導入される細胞型を参考にして選択される。α−１−アンチキモトリプシン又はアナログをコードする核酸配列を組み入れた発現ベクターを宿主細胞に導入することは、斯界で知られた種々の方法、例えば、塩化カルシウム又は塩化リチウム共沈法又は電気穿孔法により達成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉは、現在、α−１−アンチキモトリプシン又はアナログを発現させるのに好ましい宿主細胞である。クローニング及び発現は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて迅速に得ることができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生は、コスト的に有効な大規模の発酵及び蛋白質精製に容易に順応できる。 α−１−アンチキモトリプシンアナログをコードするＤＮＡ配列を含有するトランスフォームされた宿主細胞は、次いで、宿主のための適当な培地中で成育させることができる。誘導可能なプロモーターが使用される場合には、宿主細胞は高密度に成育させることができ、そしてプロモーターをα−１−アンチキモトリプシン又はアナログを発現させるために始動させることができる。プロモーターが誘導可能でない場合は、蛋白質生成物の構成的な産生が起こる。宿主細胞に対して実質的に毒性でない場合にはα−１−アンチキモトリプシン又はアナログの構成的な産生が好ましい。次いで、細胞を生成物の蓄積が所望のレベルになるまで成育させ、その時点で細胞を収穫し、蛋白質生成物を慣用の技術により精製する。好適な精製方法にはイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、透析及び斯界で知られたその他の蛋白質精製方法があるが、これらに限られない。従って、本発明は、ヒトα−１−アンチキモトリプシン又はアナログを発現させることができる宿主細胞を培養してヒトα−１−アンチキモトリプシン又はアナログを含有する細胞を産生し、適宜、その混合物を精製してヒトα−１−アンチキモトリプシン又はアナログを精製された形態で製造することからなるヒトα −１−アンチキモトリプシン又はアナログの製造方法を提供する。しかして、宿主細胞により産生された精製又は未精製の組換えα−１−アンチキモトリプシンアナログの蛋白質調製物が生産され、それは蛋白質の精製の度合いに応じてα−１−アンチキモトリプシン並びに宿主細胞成分及び／又は細胞培地のようなその他の物質を含む。用語「精製された」とは、この発明の核酸配列の状態を記述するために使用するときは、ヒトα−１−アンチキモトリプシンをコードしない核酸を実質的に含まず又は非組換え細胞中で即ちその「天然状態」において核酸と通常会合しているその他の物質を実質的に含まない核酸配列をいう。用語「精製された」又は「精製された形態の」とは、α−１−アンチキモトリプシン蛋白質又はアナログ蛋白質の状態を説明するために使用するときは、その天然状態でそれと通常会合している細胞物質又はその他の物質を少なくともある程度までは含まないα−１−アンチキモトリプシン又はアナログをいう。好ましくは、α−１−アンチキモトリプシン又はアナログは少なくとも約２５〜１００％の純度（均質性）を有する。さらに好ましくは、純度は少なくとも約５０％である。本発明のα−１−アンチキモトリプシン、アナログ及び蛋白質調製物は、敗血症性ショック、膵炎、凝固障害、肝臓病、微生物のキモトリプシン様酵素を合成することにより皮膚を透過する微生物に起因するある種の疾病及びヒトを含む哺乳動物における皮膚の炎症を治療するのに有用であることが期待される。本発明の組成物は、ヒトを含む哺乳動物に、静脈内、筋肉内及び腹腔内経路を含む種々の経路で、また皮膚の患部には局所的に投与することができる。本発明の組成物は、また、次の疾病：リューマチ性関節炎、糸球体腎炎、成人呼吸困難及び膿胸のような肺病、心臓及び脳組織への再潅流傷害及び移植の結果としての傷害、老化、敗血症、膵炎の治療に、アドリアマイシンのような化学療法剤との同時投与に、並びに皮膚の問題、粘膜炎（mucositis）及び毛髪の損失のような電離放射線の副作用の予防に有用である。従って、本発明は、エラスターゼを、阻害剤として有効量のヒトα−１−アンチキモトリプシンのアナログであってその野生型α−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）に相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ− Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）により置換されているものと接触させ、又はエラスターゼを阻害剤として有効量の本発明の蛋白質調製物と接触させることからなる、エラスターゼの阻害方法を提供する。さらに、本発明は、ヒトα−１−アンチキモトリプシンのアナログの利用方法を提供し、ここに、該アナログは、エラスターゼ活性を阻害するように野生型α −１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）に相当するアミノ酸がＩｌｅ −Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）により置換されており、該方法はエラスターゼを阻害剤として有効量のこのようなヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログと接触させる工程からなる。用語「有効量の」及び「阻害剤として有効な量の」とは、天然又は合成の基質に対するエラスターゼの活性を減少させるような本発明のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの濃度をいう。本発明のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログは好中球エラスターゼ阻害活性を示し、しかして天然又は野生型のα−１−アンチキモトリプシンと同じように有用である。これらのアナログは、好中球エラスターゼの阻害剤として有用であり、また再潅流傷害、肺の炎症、炎症性の腸の疾病、皮膚の炎症、膵炎、糸球体腎炎及び敗血症の治療及び予防に有用である。肺の炎症の場合には、炎症は、酸性物質、例えば胃の内容物、煙など（これらに限らない）の吸引、感染、例えばグラム陰性菌（例えば、大腸菌属及びシュードモナス属）による感染を含む病原体感染により起きるであろう。再潅流傷害に関しては、本発明のアナログは、血餅を除去し又は溶解させるための潅流中の傷害を予防するために投与することができる。本発明のアナログは、製薬上許容できるキャリアー又は希釈剤、例えば生理食塩水又はその他の緩衝剤と共に投与することができる。好適な製薬上許容できるキャリアーは斯界で周知であり、例えば、この分野において標準的な参考文献であるジェナンロ−アルフォンソ編「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」１８版（１９９０、マーク・パブリッシングＣｏ、イースタン、ＰＡ）に記載されている。キャリアーは投与経路及び標準的な製薬上のプラクチスに関して選択することができる。投薬量は、患者の体重及び臨床的状況に関して決定される。活性成分対キャリアーの比は、アナログの化学的性状、溶解度及び安定性並びに意図した投薬量に当然左右される。本発明のアナログは、本発明の方法において単独で又は本発明の他のアナログを含むその他の化合物（これらに限られれない）と組合せて使用することができる。また、本発明の方法は、抗体、トキシン及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（これらに限られれない）他の治療剤と組合せて使用することができる。イン・ビボで適用するためには、投与量はやはり患者の年齢、体重及び臨床的な状況のような因子に左右されよう。本発明のアナログは、任意の適当な経路で、例えば、接種及び注射、例えば静脈内、口腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、局所注射により、上皮又は粘膜内層、例えば鼻、口、膣、直腸及び胃腸への吸収により投与することができる。本発明のアナログ、薬剤及び組成物の投与の方法は、そのアナログを送達できる生体における部位を決定しよう。例えば、局所適用は、クリーム、軟膏、ゲル、オイル、乳液、ペースト、ローションなどで投与することができる。非経口的投与については、アナログを無菌水溶液として使用することができ、それは他の溶質、例えば溶液を等張にするのに十分な量の塩類、グルコース又はデキスロースを含有することができる。経口投与のためには、本発明のアナログは、錠剤、カプセル、飴錠剤、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル、水溶液及び懸濁液として投与することができる。種々の崩壊剤例えば澱粉及び滑剤を使用することができる。カプセルの形態で経口投与するためには、有用な希釈剤はラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールである。経口用に水性懸濁液が必要なときは、ある種の甘味料及び／又は香料を添加することができる。また、好中球エステラーゼを阻害する方法、皮膚の炎症、肺の炎症、糸球体腎炎、膵炎、敗血症及び炎症性の腸の疾病を治療する方法、再潅流による損傷を治療し予防する方法も提供され、この方法では３５８位にアミノ酸置換を有し又は３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有し且つ３５８位が前記のアミノ酸から選択されるａ−１−アンチキモトリプシンのアナログ、或いはヒト野生型α−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ＬｅｕがＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏにより置換されている該アナログが治療すべき状況を示すサンプルに添加される。本発明は又、この発明のα−１−アンチキモトリプシンアナログ及び製薬上許容し得るキャリアー又は希釈剤を含む製薬組成物をも提供する。この発明の組成物は、好ましくは、生理学的に許容し得るキャリアー又は希釈剤例えば塩溶液又はその他の緩衝液と組み合わせて病気の哺乳動物に送達する。適当な製薬用キャリアーは、この技術分野で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences，E.W．Martin（この分野における標準的参考テキスト）に記載されている。皮膚の炎症の治療のために、この発明の組成物を生理学的に許容し得る軟膏又はクリームと組み合わせて冒された領域に適用することができる。任意の特定の健康状態に対して哺乳動物に投与されるこの発明の組成物の特定の量は、病気の型、及び他の因子例えば体重及び患者の年齢及び送達の経路に依存する。局所適用のためには、この発明の組成物を、皮膚の炎症の悪化を緩和し又は阻止するのに有効な量で適用する。実施例組換えα−１−アンチキモトリプシンアナログの生成及び精製材料キモトリプシンを、Sigma 及びBoehringer-Mannheimより得た。すべての発色性のプロテアーゼの基質はBachemから得たが、それは、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）であった。ヒト血清α−１−アンチキモトリプシンを、Tsuda等、Tokai，J.Exp.Clin.Med .，1982,7,201の仕事に基づく手順を用いて調製した。この方法は、３工程、ＤＮＡセルロースからのバッチ式の溶出、Ｇ−１５０クロマトグラフィー及びＤＮＡセルロースからのＣａＣｌ勾配溶出で純粋なα−１−アンチキモトリプシンを与える。プラスミッド構築及びＤＮＡ操作を、Sambrook等、Molecular Cloning: A Lab oratory Manual，第二版、Cold Spring Harbor Loboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨーク（1989）に従って行なった。ヒトアンチキモトリプシンからの遺伝子の同定及び配列決定 Mitchell Weiss（ペンシルベニア大学、ヒト遺伝学科）により与えられたファージ発現ベクターラムダ−ｇｔ−１１中のヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、Yo ung 及びDavis，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.，1977,74,5463 の方法に従って、関連セリンプロテアーゼ阻害剤であるＣ１エステラーゼ阻害剤（カリフォルニア、Santa Barbara 在、DAKO）に対して高められたポリクローナル抗体を用いてスクリーニングした。陽性クローンを選び取り、再スクリーニングしてプラーク精製した。ＤＮＡ配列決定を、Sanger等、Proc.Natl.Acad.Sci.,1977,74,5463のチェーンターミネーション法により、Nucleic Acid Synthesis Center of the Wis tar Institute（ペンシルベニア、Philadelphia 在）から得たオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行なった。陽性ラムダ−ｇｔ１１ｃＤＮＡクローンの１つからのＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列及び誘導したアミノ酸配列は、図１に示すように、成熟ヒトα−１−アンチキモトリプシンの完全なコード領域を含んだ。この構築物は又、配列5'−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ− （ＳＥＱＩＤＮＯ：５）からなる７アミノ酸をコードする５’末端の２１ヌクレオチド伸長をも含んだ。この成熟蛋白質は、アミノ末端の第１位のＡｓｎから始まる３９８アミノ酸（Ｍ_r４５，０３１）を含み且つ２３６位に単一のシステイン残基を含んでいる。３５６〜３６１位のアミノ酸に置換を有するα−１−アンチキモトリプシンのＰＣＲによる調製３５６〜３６１位のアミノ酸に置換を有するα−１−アンチキモトリプシンアナログをＰＣＲにより調製した。市販のプラスミッドｐＫＣ３０をＢａｍＨＩにより切断し、食い違いになった末端をクレノー反応により満たした。この両端が鈍端化された直線状プラスミッドをセルフライゲートし、E．coli Ｎ４８３０− １をこのライゲーション反応混合物によりトランスフォームした。このトランスフォーマントから精製したプラスミッドはｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）であったが、これはＢａｍＨＩ部位のみを取り除いたｐＫＣ３０を示す。このｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）をＨｐａＩにより消化して次のライゲーション工程のための２つの鈍端を造った。ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶを用いて、リボソーム結合部位を含む０．２ｋｂの断片を、プラスミッドｐＡＲ３０３８、ｐＡＲ３０３９及びｐＡＲ３０４０から切り出した。ＥｃｏＲＶ切断は鈍端を造った。ＸｂａＩにより造られた食い違いになった末端を、クレノー反応により満たした。鈍端化した両端を用いて、これらの３つの０．２ｋｂ断片を、ＨｐａＩ消化したｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）に別々にライゲートした。これらの３つのライゲーション混合物を用いてＮ４８３０ −１を別々にトランスフォームした。３つのベクターをこれらのトランスフォーマントから得た。それらは、３つのリーディングフレームに対応してｐＺＭ３０３８、ｐＺＭ３０３９及びｐＺＭ３０４０と命名した。これらのｐＺＭベクターは、ｐＫＣ３０からのｐＬプロモーターを含み、ｐＡＲベクターからシャイン−ダルガノ配列を受けた。これらのベクターのユニークなクローニング部位は、ｐＡＲからの断片中に位置するＢａｍＨＩである。ｐＺＭ３０３８、ｐＺＭ３０３９又はｐＺＭ３０４０の１つをＮｈｅＩにより切断して約５．９ｋｂと約０．７５ｋｂの２つの断片を生成した。この５．９ｋｂ断片をゲル精製し、ライゲートして再環状化した。Ｎ４８３０−１を、このライゲーション反応物を用いてトランスフォームした。これらのトランスフォーマントから単離したプラスミッドをｐＺＭｓと命名した。ｐＺＭｓは、ｐＬプロモーター、シャイン−ダルガノ配列及び開始コドンの下流にユニークなクローニング部位、ＮｈｅＩを有する。表１に示したプライマー１、２、３及び４を、Sambrook等、Molecular Clonin g: A Laboratory Manual，第二版、Cold Spring Harbor Loboratory Press，Col d Spring Harbor，ニューヨーク(1989)に示された標準的技術により調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコールで使用して、Ｐ３−Ｐ３’をコードする塩基をα−１−アンチキモトリプシンをコードする配列中に導入した。標準的ＰＣＲプロトコールは、当業者には公知である。この完全長ヌクレオチド配列は、２つの部分、断片Ａ及びＢに造り、これらを合わせて完全長ヌクレオチド配列を生成した。断片Ａを構築するために、２つのプライマーを使用した。プライマー１は、α −１−アンチキモトリプシンをコードする鎖即ちセンス鎖の５’配列（表１に下線を付けて示したＮｈｅＩクローニング部位を含む伸長した５’テールを有する）を含む。プライマー２は、Ｎ末端方向へ伸びるアミノ酸に対応する塩基を含む。次いで、プライマー１及び２をポリメラーゼ連鎖反応で用いて、α−１−アンチキモトリプシンのこの部分をコードする配列をｐＵＣ１９中にサブクローン化して断片Ａを生成した。標準的ＰＣＲ法に従って、断片Ａを生成した。１μｌ（１００ｎｇ／μｌ）のプライマー１及び１μｌ（１００ｎｇ／μｌ）のプライマー２、１０μｌの１０ ×ＰＣＲ緩衝液、１０μｌの２ｍＭｄＮＴＰ及び０．５μｌのＴａｑ酵素を１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、α−１−アンチキモトリプシン遺伝子を含むｐＵＣ１９に加えた（反応容積を１００μｌにする蒸留水を伴う）。ＰＣＲの３工程、９４℃で１５秒間、５２℃で１５秒間及び７２℃で１秒間を行なった。これらの３工程は１サイクルに等しく、３０サイクルを実施した。断片Ｂを構築するために、２つの異なるプライマーを用いた。プライマー３は、Ｃ末端方向に伸びるアミノ酸に対応する塩基を含む。プライマー４は、表１に下線を付けて示したＮｈｅＩクローニング部位を含む伸長した５’テールを含む。次いで、プライマー３と４をポリメラーゼ連鎖反応で用いて、α−１−アンチキモトリプシンをコードする配列のこの部分をｐＵＣ１９中にサブクローン化して断片Ｂを生成した。断片Ｂの生成も又、断片Ａの生成のために上に示したＰＣＲプロトコールに従った。次いで、この完全長配列を、断片Ａのために上に示したプロトコール（断片Ａ及び断片Ｂの各々の５〜１０ｎｇの置換を有する）によって生成した。これらの断片を変性して再アニールした。これらの断片を再アニールして、プライマー２及び３により造られた３５６〜３６１位をコードする配列にて重複する断片Ａ及びＢのヘテロ二本鎖を生成した。これらの断片Ａ及びＢのヘテロ二本鎖を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマーとして働く断片ＡとＢの重複部分を用いて伸長させて、野生型のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）の代わりにＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）を有するα−１−アンチキモトリプシンをコードする完全長配列を生成した。次いで、これらの完全長配列を、プライマー１及び４を用いて増幅した。次いで、この増幅した完全長配列をＮｈｅＩで消化して、ＮｈｅＩで消化した発現ベクターｐＺＭｓに挿入した。次いで、E．coli をこの完全長遺伝子を含むｐＺＭｓでトランスフォームした。こうして、３５６〜３６１位に改変アミノ酸を有するα−１−アンチキモトリプシンアナログが発現された。このアナログは、ここでは、ｒＡＣＴ−Ｐ３−Ｐ３’ＰＩと表わす。本発明の野生型ヒトアンチキモトリプシンの他のアナログを同様にして調製することができる。Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＳｅｒＮ末端伸長を有する組換えα−１−アンチキモトリプシンの調製Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＳｅｒＮ末端伸長を有するα−１−アンチキモトリプシン（野生型又はアナログ）をコードするヌクレオチド配列を生成するために、野生型及びアナログα−１−アンチキモトリプシンのヌクレオチド配列内にコードされているＮ末端配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）内のＬｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）をコードするヌクレオチドの欠失によりＮ末端システイン残基を除去することによって安定なモノマーを、直接発現させた。こうして、野生型又はアナログα−１−アンチキモトリプシンのアミノ酸の−４〜−１位のアミノ酸ロイシン、システイン、ヒスチジン及びプロリンを欠失させることができる。Ｎ末端伸長は、アミノ酸の−３〜−１位でメチオニン−アラニン−セリンになる。かかる伸長は、上に示したように、Ｎ末端プライマー 5'-CCCCATATGGCTAGCAACAGCC CACTTG-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を用いる完全なコード鎖のＰＣＲ増幅により達成することができる。Ｃ末端プライマー 5'-TTTCATATGGCTAGCGCTCTAGGCTT GC-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（下線を引いた配列 GCTAGC は挿入部位として働く）を用いることができる。下線を引いたCTA 配列は、このベクターのセンス鎖中にTAG終止コドンを造る。この配列をｐＺＭｓ中にクローン化することができる。この増幅した完全長配列を、ＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩで消化した発現ベクターｐＺＭｓ中に挿入することができる。次いで、E．coli を、改変したＮ末端伸長を有するこの遺伝子を含むｐＺＭｓでトランスフォームすることができる。こうして、α−１−アンチキモトリプシンのアナログを、アミノ酸ロイシン、システイン、ヒスチジン及びプロリンが欠失するようにアミノ酸の−４〜−１位を変えることにより生成することができる。同様に、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒを用いて、７ヌクレオチドのＮ末端伸長を造ることができる。Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ伸長の生成のために上に示した方法及び手順に従ってこのＮ末端伸長を造ることができる。３５６〜３６１並びに３４９、３５０及び３６１位にアミノ酸置換を有するヒト α−１−アンチキモトリプシンのアナログのカセットベクター調製ヒトα−１−アンチキモトリプシンをコードする核酸配列を、米国特許第５，０７９，３３６号（本明細書中に参考として援用する）に開示された方法に従って得た。野生型α−１−アンチキモトリプシンのアミノ酸の３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）に対応するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）で置換されたヒト α−１−アンチキモトリプシンアナログを、米国特許第５，０７９，３３６号に開示されたα−１−アンチキモトリプシンカセットアナログから調製した。カセット蛋白質を、α−１−アンチキモトリプシンをコードするＤＮＡ配列の位置指定突然変異導入法によって生成した。これは、市販のキット（カリフォルニア、R ichmond在、BioRad）を用いて、製造者の指図に従って、合成ＤＮＡプライマー 5'-GTTGAAACGCGTAATGGTCCTT-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）（ＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ部位構築用）及び 5'-ACTGCTGTGGTACCAGATGCTTC-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）（ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位作成用）を用いて行なった。これらの合成プライマーは、標準的技術を用いて合成した。この改変遺伝子を二本鎖Ｍ１３からＥｃｏＲＩで切り出し、ヤエナリヌクレアーゼで処理して鈍端を形成した。次いで、この生成物を鈍端化したｐＺＭベクターに挿入して、組換えの示したｐＡＣＴＣＡＳを生成した。これらのＫｐｎＩ及びＭｌｕＩ制限部位は、このＤＮＡ配列についてユニークである。位置指定突然変異導入法は、Ｋｐｎ制限部位を図１に示すようにアミノ酸３４９及び３５０に対応する位置に造ってＡｌａ−ＡｌａをＧｌｙ−Ｔｈｒに変え且つＭｌｕＩ制限部位を３６８及び３６９に対応する位置に造ってＶａｌ− ＡｒｇをＴｒｈ−Ａｒｇに変えた。これらの制限部位間の領域即ちカセットは、 α−１−キモトリプシンの活性部位を含み且つＫｐｎＩ及びＭｌｕＩで取り出して所望のＤＮＡ配列に挿入することができる。この配列のカセット部分を、ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩで切り出した。慣用技術を用いて合成により調製した配列ATTCCAATGTCTATTCCT（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）を含む対応カセットをカセット部位にライゲートして、野生型α−１−アンチキモトリプシンのアミノ酸３５６〜３６１にＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ− Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）をコードする塩基を与えた。この形成したベクターは、ここでは、ｐＡＣＴ−Ｐ３−Ｐ３’ ＰＩと表示する。陽性のラムダ−ｇｔ１１ｃＤＮＡクローンの一つからの挿入物のＤＮＡ配列及び導いたアミノ酸配列は、成熟ヒトα−１−アンチキモトリプシンの完全なコード領域を含んだ。この挿入物は又、成熟蛋白質の前駆体中に現われる４アミノ酸をコードする５’末端の１２ヌクレオチドの伸長をも含んだ。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩの発現 E．coli Ｎ４８３０−１を、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，ニューヨーク(1989)により記載された標準的塩化カルシウム法により、ｐＡＣＴ−Ｐ３Ｐ３’ＰＩを用いてトランスフォームした。小規摸生育条件及び抽出ｐＡＣＴ−Ｐ３Ｐ３’ＰＩでトランスフォームしたE．coli Ｎ４８３０−１株の新鮮な一晩培養物を、アンピシリン（Ｎａ⁺塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢブロス中で１．５％に希釈し、震盪インキュベーター中で３０℃で０．１８のＡ_600nmまで生育させ、温度を４２℃に上げることにより誘導し、更に５〜８時間生育させた。これらの細胞を遠心分離してフレンチプレスにて粉砕した。このトランスフォームした細胞から精製したα−１−アンチキモトリプシン蛋白質は、ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩと表示する。組換えα−１−アンチキモトリプシンの精製及び特性決定 E．coli の大規摸生育ｐＡＣＴ−Ｐ３Ｐ３’ＰＩでトランスフォームしたE．coli Ｎ４８３０−１株を、アンピシリン（Ｎａ⁺塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地にて、酸素バブラーを備えた１５Ｌの箱入り大型ガラス瓶中で、０．１８のＡ_600nmになるまで３０℃で生育させた。これらの細胞を、温度を４２℃に上げることにより誘導し、約０．９〜１．０の最終Ａ_600nmまで更に６時間生育させた。抽出及びカラムクロマトグラフィーすべての精製工程を４℃で行なった。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩの典型的調製において、細胞ペーストを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．９（２５ｍｌ）中に分散させ、１０，０００ｐｓｉ及び４℃でフレンチプレスを３回通すことにより溶解させた。細胞残渣を４℃で３０分間、３０，０００×ｇで遠心分離することにより除去した。この上清（２５ｍｌ）を、５０ｍＭＫＣｌを含む５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）に平衡化した Sepharose Fast Q（Pharmacia）のカラム（４．９ｃｍ²×３７ｃｍ）に載せた。蛋白質を、５０ｍＭトリス− Ｃｌ（ｐＨ７．５）中でＫＣｌの直線状勾配（２Ｌ中の５０〜５００ｍＭ）を用いて溶出した。画分（１５ｍｌ）を、Ａ_280nmによりモニターし且つここに記載したようにアンチキモトリプシン活性についてアッセイした。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３ ’ＰＩは、約２００ｍＭＫＣｌにて溶出した。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩを含む画分を合わせて２倍容の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）に対して４８時間にわたって透析した。この透析した溶液を、次いで、１０ｍＭＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．９）で予備平衡化したＤＮＡ−セルロースカラム（１．７ｃｍ²×２０ｃｍ）に加えた。載せた後に、カラムを先ず同じ緩衝液（２０ｍｌ）で洗った。このカラムを、同じ緩衝液中のＫＣｌの直線状勾配（１０〜５００ｍＭ、３００ｍｌ）を用いて溶出した。画分（８ｍｌ）を、ここに記載したように、蛋白質及びアンチキモトリプシン活性についてアッセイした。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩは、約３５０ｍＭＫＣｌにて溶出した。アンチキモトリプシン活性を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について分析した。それは、Laemmli，Nature（Londo n）1970，227，680に従って行なった。各蛋白質を、Amicon YM-10膜を用いて限外濾過により濃縮し且つ５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５（５００ｍｌ）に対して一晩透析した。幾つかの場合には、更に、組換え蛋白質を、上記の条件を用いて、FPLC Mono Q アニオン交換カラムにて精製した。アンチキモトリプシン活性アッセイ画分（１．０ｍｌ）を集め、アンチキモトリプシン活性についてアッセイした。該活性を、基質Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（９０％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液の０．１ｍｌ）のキモトリプシン触媒による加水分解の阻害として測定した（DelMar等、Anal.Biochem．1979，99，31 6）。典型的キモトリプシンアッセイは、１００ｍＭトリス−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、０．００５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、ウシ膵臓キモトリプシン（１８ｋモル）及びカラム溶出物（０．００５〜０．５ｍｌ）を含んだ（１．０ｍｌ中）。このアッセイ混合物を、室温で５分間予備インキュベートし、基質（９０％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液の０．０１ｍｌ）を加えて残留キモトリプシン活性を、ｐ−ニトロアニリンの遊離により引き起こされるＡ_410nmの変化の割合によって測定した。光学的な吸光度の測定を、温度調節された試料コンパートメントを備えた分光光度計（Hewlett Packard 84 52A）を用いて、２５℃で行なった。存在する活性なｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩの量を、既知濃度のキモトリプシン溶液の滴定及び部分精製したｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩ画分の量を変えた活性の滴定によって測定した。次いで、阻害剤含有溶液と共にインキュベートした後に存在する活性なキモトリプシンの量を、キモトリプシン活性アッセイを用いて測定した。キモトリプシンの濃度を、Ardelt及びLaskowski，Biochemistry，1985，24 ，5313の活性部位滴定法を用いて測定した。ヒト好中球エラスターゼの阻害材料及び方法ＨＮＥ及びα１ＰＩは、CalBiochemより得た。基質は、Sigma Chemical Co．（ミズーリ、St.Louis）より得た。ＳＤＳゲル用の標準蛋白質は、BioRadより得た。阻害剤及びプロテアーゼ濃度の測定ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩ及びα１ＰＩ濃度を、ウシキモトリプシンを用いてる活性部位滴定により測定した。キモトリプシン濃度を、Schnbaum等、J.Biol.Chem.，1961,236,2930 の方法に従って、活性滴定剤、Ｎ−トランス−シンナモイルイミダゾールを用いる滴定により標準化した。ＨＮＥ濃度を、標準化したα１ＰＩを用いる滴定により測定した。この値を用いて、１ｎモルのＨＮＥ当たり毎分０．６１ｎモルの生成物というＨＮＥの比活性を測定した。ＨＮＥは、Nakajima等、J．Biol.Chem.,1979,254,4 027 により記載された標準的アッセイ条件下で測定した（０．１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、９％Ｍｅ₂ＳＯ₄、１ｍＭＮ−ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ）。形成されたパラニトロアニリンをｅ₄₁₀＝８８００Ｍ^-1ｃｍ^-1を用いて定量した。滴定及びタイムコース研究滴定反応を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ＭＮａＣｌ、０．０１％トリトンＸ−１００を含む０．５０ｍｌ中で行なった。ＨＮＥ濃度は、１５０〜４００ｎＭにわたった。インキュベーションは、通常、２５℃で３０分間行なった。残留活性を、対照の初期加水分解速度が０．４〜０．７５Δ吸光度単位４１０／分となるような１ｍｌの標準緩衝液中の試料アリコートの希釈により測定した。加水分解速度を、Beckman DU又はGilford 260 分光光度計にて、連続的に３分間モニターした。タイムコース研究を同様に行なったが、同じ反応混合物から時間経過につれてアリコートを繰り返し取り出せるように反応容積を増大させた。不活性化速度定数の測定速度定数を、Petersen及びClemmensen，Biochem．J.，1981,199,121に記載されたように、基質（０．５〜１ｍＭ）の存在下で、擬一次条件下で測定した。進行曲線を１０〜１５分間モニターし、変化を１０秒間隔で測定した。瞬間速度を、１分間の間隔で集めた吸光度測定値の線形最小二乗当てはめにより測定した。ｋ’（基質の存在下での見掛けの速度定数）をデータ（速度対時間のプロット）の指数Ａｅ^-ktへの最小二乗当てはめにより測定した。この見掛けの速度定数を、次いで、基質濃度に関して、ｋ_obs＝ｋ’（Ｋｍ／Ｋｍ＋Ｓ）という関係（ここに、Ｋｍ測定値は、０．１ＭＮａＣｌを含む反応物中では０．４０ｍＭであり、０．５ｍＭＮａＣｌで実施した反応物では０．１４であった）によって修正した。イオン強度はｋ_obsに有意の影響を及ぼさなかった；報告された値は、両イオン強度において行なった測定の平均及び標準偏差である。ＳＤＳゲル電気泳動反応を、３０分後に、ＰＭＳＦの添加（終濃度０．５ｍＭ）により停止させた。１０分間のインキュベーション期間の後に、２％ＳＤＳ及び５ｍＭＤＴＴ（２４）を含む変性用緩衝液を加え、試料を１０分間９０ ℃に加熱した。蛋白質を７．５％ゲル上で分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色することにより可視化した。組換えアンチキモトリプシン（ｒＡＣＴ）のＨＮＥとの反応ＨＮＥの、米国特許第５，０７９，３３６号に開示されたように調製した組換えヒトα−１−アンチキモトリプシンとの相互作用は、安定な阻害を示さなかった。高い阻害剤のエラスターゼに対する（Ｉ／Ｅ）比率（２５〜３０：１）では、加水分解の初期速度は対照よりも低く、時間及び塩に依存して、酵素活性の対照レベルまで増加した。時間の関数として採取した反応生成物のＳＤＳゲル分析は、安定な複合体の証拠を伴わない開裂したｒＡＣＴの遅い蓄積を示した。対照実験において、α１ＰＩによるＨＮＥの滴定は、１の阻害化学量論（ＳＩ）まで直線的であり、すべてのＩ／Ｅ比で形成された複合体は、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）中で、少なくとも２４時間安定であった。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩのＨＮＥ及びアンチキモトリプシンとの反応ＨＮＥのｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩによる阻害のタイムコースは、即時の活性の損失とその後約２０時間にわたって０．１ＭＮａＣｌ中で起きる遊離酵素の遅い再生（これは、非常に安定な酵素／阻害剤複合体の形成を示している）を示した。比較すると、０．４ＭＮａＣｌ中では、この変形物は、ＨＮＥを同じ時間にわたって完全に遊離させた。ＳＩはイオン強度に依存せず且つ１．４まで滴定された。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩ／ＨＮＥ複合体の安定性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析による高分子量の反応生成物の検出により示した。擬一次条件下で、ＨＮＥについての見掛けの秒のオーダーの速度定数、１０⁵Ｍ^-1Ｓ^-1（ｎ＝６）が得られ、ｒＡＣＴＬ３５８Ｍ／キモトリプシン相互作用についての３．０×１０⁵ Ｍ^-1Ｓ^-1と比較してキモトリプシンについての１．８×１０⁴Ｍ^-1Ｓ^-1が得られた（ｒＡＣＴＬ３５８Ｍはα−１−アンチキモトリプシンアナログであり、アミノ酸の３５８位のロイシンがメチオニンで置換されている）。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３ ’ＰＩのキモトリプシンでの１：１滴定は、カセットベクターから生じる位置Ｐ１０、Ｐ９及びＰ１０’における変化が、この酵素に関するセルピン（serpin）のＳＩ値を変えないことを示した。ｒＡＣＴＰ３Ｐ３’ＰＩは、ＨＮＥの効率的な阻害剤としての多くの特性を有したが、それは、α１ＰＩのＨＮＥとの速度定数（〜１０⁷Ｍ^-1Ｓ^-1）を達成せず、この複合体は同程度の安定性を有しなかった。ここに示し且つ説明したものに加えて、この発明の種々の改変物は、上述の記載から当業者には明白であろう。かかる改変物も又、添付の請求の範囲の範囲内に入るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/55 ＡＤＳ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＡＤＺ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥＣ０７Ｋ 14/81 ＡＣＤＣ１２Ｎ 1/21 ＡＤＺ 9/99 ＡＤＳＣ１２Ｐ 21/02 ＡＣＶ // Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＣＪ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ特許法第30条第１項適用申請有り (72)発明者ルービン，ハービーアメリカ合衆国 19103 ペンシルベニア, フィラデルフィア，マニングストリート 1925 (72)発明者シェクターノーマンアメリカ合衆国 19131 ペンシルベニア, フィラデルフィア，シティーアベニュー 6100，アパートメント 708 (72)発明者ワン，ジメイアメリカ合衆国 19104 ペンシルベニア, フィラデルフィア，サウスフォーティエスストリート 316

Claims

【特許請求の範囲】１．３５８位のアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１ −アンチキモトリプシンアナログであって、好中球エラスターゼ阻害活性を有するアナログ。２．３５８位のアミノ酸がメチオニンである請求項１に記載のアナログ。３．３５８位のアミノ酸がイソロイシンである請求項１に記載のアナログ。４．３５８位のアミノ酸がバリンである請求項１に記載のアナログ。５．３５８位のアミノ酸がアラニンである請求項１に記載のアナログ。６．３５８位のアミノ酸がアスパラギン酸である請求項１に記載のアナログ。７．３５８位のアミノ酸がトレオニンである請求項１に記載のアナログ。８．３５８位のアミノ酸がグルタミン酸である請求項１に記載のアナログ。９．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログであって、好中球エラスターゼ阻害活性を有するアナログ。１０．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３４９及び３５０位のＡｌａ− Ａｌａに相当するアミノ酸がＧｌｙ−Ｔｈｒにより置換されており且つ野生型の α−１−アンチキモトリプシンの３６８及び３６９位のＶａｌ−Ａｒｇに相当するアミノ酸がＴｈｒ−Ａｒｇにより置換されている請求項９に記載のヒトα−１ −アンチキモトリプシンアナログ。１１．ヒトα−１−アンチキモトリプシンが図１に記載のアミノ酸配列からなる（ただし、３５６〜３６１位のアミノ酸はＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されている）請求項１０に記載のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログ。１２．３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つに、適宜、プロリンを有する請求項１に記載のアナログ。１３．ヒトα−１−アンチキモトリプシンが図１に記載のアミノ酸配列からなり（ただし、３５８位のアミノ酸はメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択される）、適宜、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つにプロリンを有する請求項１に記載のアナログ。１４．３５８位のアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択され、適宜、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つにプロリンを有するヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログをコードする精製された核酸配列。１５．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ− Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログをコードする精製された核酸配列。１６．３５８位のアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択され、適宜、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つにプロリンを有し、且つ、野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ −Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログをコードする精製された核酸配列。１７．請求項１４に記載の核酸配列を含む発現ベクター。１８．請求項１５に記載の核酸配列を含む発現ベクター。１９．請求項１６に記載の核酸配列を含む発現ベクター。２０．請求項１０に記載の核酸配列を含む発現ベクター。２１．請求項１４に記載の核酸配列を発現させることができる宿主細胞。２２．請求項１５に記載の核酸配列を発現させることができる宿主細胞。２３．請求項１６に記載の核酸配列を発現させることができる宿主細胞。２４．請求項１０に記載の核酸配列を発現させることができる宿主細胞。２５．３５８位のアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択され、適宜、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つにプロリンを有するヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現し得る細胞培養物。２６．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ− Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる細胞培養物であって、請求項１８に記載の発現ベクターにより細胞をトランスフォームすることにより得られた細胞培養物。２７．３５８位のアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択され、適宜、３５６、３５７、３５９、３６０及び３６１位の少なくとも一つにプロリンを有し、且つ、野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ −Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる細胞培養物であって、請求項１９に記載の発現ベクターにより細胞をトランスフォームすることにより得られた細胞培養物。２８．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ− Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されており、且つ野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３４９及び３５０位のＡｌａ−Ａｌａに相当するアミノ酸がＧｌｙ−Ｔｈｒにより置換されており且つ野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３６８及び３６９位のＶａｌ−Ａｒｇに相当するアミノ酸がＴｈｒ−Ａｒｇにより置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる細胞培養物であって、請求項２０に記載の発現ベクターにより細胞をトランスフォームすることにより得られた細胞培養物。２９．図１に記載のアミノ酸配列を含むヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる細胞培養物であって、核酸配列を含む発現ベクターにより細胞をトランスフォームすることにより得られた細胞培養物。３０．請求項１に記載のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含む蛋白質製剤。３１．請求項９に記載のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含む蛋白質製剤。３２．請求項１０に記載のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含む蛋白質製剤。３３．野生型のα−１−アンチキモトリプシンの３５６〜３６１位のＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに相当するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ− Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換されているヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを製造するにあたり、該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる宿主細胞を培養して該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含有する細胞と培地との混合物を生成させることを含むヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの製造方法。３４．さらに該混合物を精製してヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを精製された形で製造することを包含する請求項３３に記載の方法。３５．ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログがＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ− Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される）により置換された３５６〜３６１位のアミノ酸を有する図１に記載の核酸配列によりコードされる請求項３３に記載の方法。３６．好中球エラスターゼを阻害剤として有効な量の請求項１、９又は１０に記載のヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログと接触させることからなる好中球エラスターゼを阻害する方法。３７．ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログであってアミノ酸メチオニン、アラニン及びセリンからなるＮ−末端伸長部を有するものを製造するにあたり、該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる宿主細胞を培養して該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含有する細胞と培地との混合物を生成させることを含む該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの製造方法。３８．さらに該混合物を精製してヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログであってアミノ酸メチオニン、アラニン及びセリンからなるＮ−末端伸長部を有するものを精製された形で製造することを包含する請求項３７に記載の方法。３９．ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログが、前記のＮ−末端部をコードする核酸配列をさらに含む図１に記載の核酸配列によりコードされる請求項３７に記載の方法。４０．ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログであってアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＰｒｏからなるＮ−末端伸長部を有するものを製造するにあたり、該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを発現させることができる宿主細胞を培養して該ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログを含有する細胞と培地との混合物を生成させることを含む該ヒトα−１ −アンチキモトリプシンアナログの製造方法。４１．さらに該混合物を精製してヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログであってアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＰｒｏからなるＮ−末端伸長部を有するものを精製された形で製造することを包含する請求項４０に記載の方法。４２．ヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログが、前記のＮ−末端伸長部をコードする核酸配列をさらに含む図１に記載の核酸配列によりコードされる請求項４０に記載の方法。４３．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、肺の炎症の治療用薬剤の製造における利用。４４．炎症が酸性物質の吸引により生じるものである請求項４３に記載の利用。４５．酸性物質が胃の内容物である請求項４４に記載の利用。４６．酸性物質が煙である請求項４４に記載の利用。４７．炎症が病原体の感染により生じるものである請求項４３に記載の利用。４８．病原体がグラム陰性細菌である請求項４７に記載の利用。４９．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、炎症性の腸の疾病の治療用薬剤の製造における利用。５０．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、皮膚の炎症の治療用薬剤の製造における利用。５１．炎症が乾癬から生じる請求項５０に記載の利用。５２．炎症が慢性の創傷から生じる請求項５０に記載の利用。５３．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒト α−１−アンチキモトリプシンアナログの、膵炎の治療用薬剤の製造における利用。５４．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、糸球体腎炎の炎症の治療用薬剤の製造における利用。５５．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、再潅流による傷害の治療用薬剤の製造における利用。５６．３５８位に相当するアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン及びグルタミン酸よりなる群から選択されるヒトα−１−アンチキモトリプシンアナログの、敗血症の治療用薬剤の製造における利用。