JPH03257349A

JPH03257349A - レーザー暗視野斜光顕微鏡装置と運動計測方法

Info

Publication number: JPH03257349A
Application number: JP2056281A
Authority: JP
Inventors: Shigefumi Kudo; 成史工藤; Yukio Magariyama; 幸生曲山; Shinichi Aizawa; 相沢　慎一; Keiichi Nanba; 啓一難波; Haruto Nakayama; 治人中山
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1990-03-07
Filing date: 1990-03-07
Publication date: 1991-11-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉この発明は、レーザー暗視野斜光顕微鏡装置とこれを用
いた運動計測方法に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、バクテリアのべん毛等の
微細高速運動を高精度、かつ高時間分解能で観測するこ
とのできる斜光レーザー暗視野顕微鏡と、この斜光レー
ザー光を照射しての微細高速運動体の回転計測方法に関
するものである。

（従来の技術とその課題）近年、長足に進歩している遺伝子操作をはじめとするバ
イオテクノロジーは、バイオエレクトロニクス、バイオ
コンピータ−１そしてバイオメカニクスという生体物質
や生体システムの持つユニークな特性、高度な機能、あ
るいはその動作原理や構築方法を電子技術、あるいは機
械技術として応用しようとすることを現実的なものとし
つつある。たとえば従来の機械は剛体で作られ、速さ、
強さ、正確さが追及されてきたが、生体の運動システム
は柔らかいタンパク質分子による高度に制御された技術
体系として注目されるものであり、この生体の運動シス
テムの本質を人為的に再現利用することへの関心が高ま
ってきている。

このようなタンパク質分子から成る生体運動シヌ４テム
として注目されるものの一つに、バクテリアのべん毛モ
ーターかある。このべん毛モーターは、生物界に存在す
る唯一の回転分子機械、すなわちバイオモーターとして
ン主目されるものでもある。たとえばこのような生体の
運動メカニズムを知ることができるならば、分子レベル
からのエネルギー変換や運動メカニズムに基づいた全く
新しい機械の出現も夢ではない。べん毛モーターの運動
は、新しいモーターの原理として応用することも考えら
れる。

べん毛モーターの運動を調べるには、べん毛の動きを調
べればよいが、べん毛が非常に微細であるために、運動
メカニズム解析の基礎となるその回転計測は極めて困難
である。べん毛の太さは約２０ｎ１１１と、光学顕微鏡
の分解能の１０分の１以下であるため、当然ながら通常
の光学顕微鏡では見ることができない。１本毎のべん毛
を観察できるのは、今のところ暗視野顕微鏡を用いた場
合のみである。しかしながらこの場合にも、べん毛の回
転が速すぎるため、肉眼ではもちろんのこと、高速度ビ
デオによる観察でもべん毛の回転する様子は把握できな
い。電子顕微鏡の場合にはべん毛を見ることはできるも
のの真空環境下に送かれるためにバクテリアが死んでし
まい、結局のところべん毛の回転を観察し、その回転状
態を計測することはできない。

このような顕微鏡による直接的観察の困難さを解消する
ために、様々な工夫がなされてきてもいる。たとえばｔ
ｅｔｌ＋ｅｒｅｄ　ｃｅｌｌ法という観察法では、べん
毛をスライドグラス表面に固定し、バクテリアの体の回
転を計測するようにしている。あるいは、バクテリアが
泳ぐときの体の微小な振れの周期を光散乱で求め、べん
毛の回転数を推定する方法もある。しかしながら、べん
毛の固定による観察法では、べん毛に比べてバクテリア
の体が大きいためバクテリアへの負荷が大きすぎ、また
、後者の方法では多くの菌体からの散乱光を一度に測る
ため、べん毛モーターの特性を正確に知ることはできな
い。このため、たとえばこのように、本のべん毛のよう
な微小、微細な運動体の回転状態までを的確に観察し、
しかもその状態を正確に計測することのできる手段の開
発が望まれていた。

この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、従来法の欠点を克服し、微小回転分子機械の実現
に向けて欠かせないばかりか、生物体の組織等の微小・
微細体の運動状態の解析手段として極めて重要な新しい
顕微鏡装置を提供することを目的としている。

またこの発明は、バクテリアのべん毛の回転状態を正確
に、かつ再現性よく定量化する方法を提供することをも
目的としている。

（課題を解決するための手段）この発明は、上記の課題を解決するものとして、回転体
試料への斜光レーザー光の照射部を有し、その試料を一
個あるいは一列に並んだ複数の輝点として結像させてな
ることを特徴とするレーサー暗視野斜光顕微鏡装置を提
供する。また、この発明は、このレーサー暗視野斜光顕
微鏡における輝点の移動にともなう明暗変化を測定する
ことを特徴とする回転体の回転３１測方法をも提供する
。

以下、この発明の構成について詳しく説明する。

まず、この発明においては、生きたバクテリアのべん毛
をも直接観察することのできる手段としての暗視野顕微
鏡をその前提としている。この暗視野顕微鏡は、通常、
試料に照明光を均一に当て、その散乱光や回折光による
試料の像が真暗な背影視野の中に輝いて見えるようにす
ることを特徴としている。たとえばこの顕ｍ鏡において
はバクテリアの暗視野像でべん毛の存在および形が観察
される。しかしながら前記した通り、べん毛の回転か速
すぎるため、この通常の晴視野顕Ｗ１鏡によってはその
回転数までを測定することは不可能である。そこでこの
発明の発明者は、べん毛の回転数の測定を可能とする方
法を鋭意検討した結果、照明光を一方向のみから照明し
てやると、べん毛がらせん状形状を有していることから
、光を多く反射する部分か１列の輝点として観察され、
しがも、べん毛か回転するとこの輝点が見かけ上菌体本
体に対して移動するため、べん毛の回転速度を輝点の移
動速度の変化として観察することが可能となることを見
出した。

この発明は、以上の通りの極めて重要な知見に基づいて
なされたものであり、しかも、また、この発明は、この
観察を可能とするために、電球等を照明光源とする従来
の方法とは異なり、レーザー光を照明光として使用する
ことを大きな特徴としている。通常、レーザー光は、顕
微鏡にそのまま導入すると明るい干渉縞か視野を埋め尽
くし、観察不能とするが、この発明においては、レーザ
ー光を顕微鏡視野のごく狭い領域に照射するため、余分
な散乱光が少なく、干渉縞の問題は無視することができ
る。すなわち、レーザー光は電球等を光源とする光線に
比べて著しく輝度が高く、単色性、直進性に優れている
ため、この発明の暗視野斜光照明の光源としては理想的
であり、試料像をより明瞭な輝点として観察することを
可能にしている。

バクテリアの暗視野像では、べん毛は輝点の列として観
察される。

また、この発明では、べん毛の像を光学スリット上に結
像させ、このスリットを通過した光量の変化をフォトン
・カウンティングなどの測光手段により測定することが
できる。輝点列の移動速度、あるいはスリットを通過す
る光量の変化はべん毛の回転速度に対応するため、スリ
ット内の光量を経時的に測定することにより、べん毛回
転を高精度、高時間分解能で計測することができる。

以下、実施例を示し、この発明のレーザー暗視野斜光顕
微鏡装置と、これを用いた運動計測方法についてさらに
詳しく説明する。

実施例１（レーザー暗視野斜光顕微鏡装置によるべん毛の観察）添付した図面の第１図は、この発明のレーザー暗視野斜
光顕微鏡の一実施例を示したものである。

この暗視野顕微鏡（１）を用い、サルモネラ菌のべん毛
を観察する。まずサルモネラ菌の菌体をスライドグラス
に付着させ固定し、これを暗視野顕微鏡（１）の対物レ
ンズ（２）下の試料台（３）に設置する。レーザー光源
（４）からのレーザー光（Ｌ）を暗視野コンデッサ（４
０）下方より導入し、数μｍに収束させて、菌体から延
びている数本のべん毛の一本に照射し、暗視野像を得る
。

このようにして得られるべん毛の像は一列の輝点となる
が、この輝点列を光電子増倍管（５）の入射スリット（
６）上に結像させ、この入射スリット（６）を通過した
光の量を光電子を増倍管（５）により検出し、フォトン
カウンティングシステム（７〉に入力する。

また同時に、スリット像を含む顕微鏡視野全体を高感度
カメラ（８）により撮影し、モニタービデオ記録装置（
９）に入力する。この映像により試料とスリットの位置
調節を行う。

第２図は、このようにして得られたサルモネラ菌の暗視
野像を、べん毛回転が遅い場合について、経時的な連続
図として示したものである。

サルモネラ菌（１０）の暗視野（ｔ、　（１１）は、菌
体像（１２）とべん毛像（１３）が−列の輝点として観
察される。このうち、菌体像（１２）は、常に同一視野
（実線Ｂ）上に結像するのに対し、べん毛像（１２）の
各輝点はべん毛の回転にともない菌体からべん毛先端方
向へと移動する。すなわち、この連続図に示す通りべん
毛１Ｊｉｌ（１３）の任意の輝点（１４）は、矢印（Ａ
）で示す時間経過にともない、点線（Ｃ）上に観察され
る。

実施例２（べん毛の回転状態の計測）レーザー暗視野斜光顕微鏡により得られたサルモネラ菌
のべん毛像を、この発明の運動計測システムに入力する
ことにより、べん毛の回転状態を計測した。

すなわち、上記した通り第１図に示すように、べん毛像
である輝点列を、光電子増倍管（５）の入射スリット（
６）上に結像させ、この入射スリット（６）を通過した
光の量を光電子増倍管（５）により検出し、フォトンカ
ウンティングシステム（７）に入力する。

その結果、フォトンカウンティングシステム（７）のデ
ータを、プリンターにより描き出すと、第３図に示した
ように、べん毛の回転に対応してスリットを通過する光
量の、高いＳ／Ｎ比を有する増減記録が得られた。

この第３図から、サネモネラ菌のべん毛は、１秒間に約
１４０回の回転数を有することが明らかになった。

さらに、サルモネラ菌のべん毛の周期毎の平均回転スピ
ードは必すしも一定ではなく、±１０％以下のゆらぎ幅
を有することも明らかになった。

バクテリアのような微生物の住む世界は、熱振動が直接
影響を及ぼずブラウン運動の世界であり、このような大
きな外乱のもとての±１０％のゆらぎ幅はきわめて高い
安定度であるといえる。

実施例３（べん型回転状態の高時間分解能計測）べん毛の回転状
態をさらに詳しく分析するため、高時間分解能の計測を
行なった。その結果を第４図に示した。

この図から明らかなように、サルモネラ菌のべん毛の回
転状態には、−時的減速（Ｓ）が観察された。また、こ
の減速は１ｍｓ以内の極めて短時間に起こることも明ら
かになった。

実施例４（突然変異体のべん型回転状態の計測）べん毛モータの
部品のうちスイッチコンプレックスに変異のあるサルモ
ネラ菌の突然変異体を用い、そのべん毛の回転状態を計
測した。　その結果を第５図に示した。

この図から明らかなように、べん毛モータのスイッチコ
ンプレックス部に変異を有するサルモネラ菌のべん毛の
回転状態には、回転スピードの一時的減少（Ｓ）や、−
時停止（Ｐ）、あるいは回転方向の一時的逆転（Ｒ）な
どの異常が観察された。

さらに、第４図に示した一時的減速の場合と同様、これ
らの結果にみちれるような、べん毛モータの回転速度の
変化は、１ｍｓ以内に生じており、この発明のレーザ暗
視野斜光顕Ｒ鏡と、これを用いた運動計測システムによ
って始めて分析することのできる現象である。

もちろん、この発明は以上の例によって限定さ１れるものではない。種々の微小、微細回転の回転状態の
観察と計測が、様々な態様において可能となる。

（発明の効果）以上詳しく説明した通り、この発明のレーサー暗視野斜
光顕微釦とそれを用いた測定系を用いることにより、バ
クテリアのべん毛等の超微小、超微細な運動体の回転状
態を、高精度、高時間分解能で観察および計測すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のレーサー暗視野斜光顕微鏡装置の一
実施例を示した構成図である。第２図は、暗視野像を例示した経時的連続図である。第３図は、べん電数乱光の固定スリットへの入射量の増
減記録例示図である。第４図もまた、べん毛の散乱光の固定スリットへの入射
量の増減記録例示図である。第５図は、突然変異体のべん毛についての散乱光の固定
スリットへの入射量増減記録図である。２１・・・暗視野顕微鏡２・・・対物レンズ３・・・試　料　台４・・・レーザー光源５・・・光電子増倍管６・・・入射スリット７・・・フォトカウンティングシステム８・・・高感度
カメラ９・・・ビデオ記録装置・モニター１０・・・サルモネラ菌１１・・・暗視野像１２・・・菌　体　像１３・・・べん電像１４・・・任意の輝点４０・・・暗視野コンデンサＬ・・・レーザー光

Claims

【特許請求の範囲】

（１）回転および振動する微小物体へのレーザー光の照
射部を有し、その試料の運動を明暗の変化として把える
ことを特徴とするレーザー暗視野斜光顕微鏡装置。
（２）バクテリアのべん毛等のらせん形試料を一列の輝
点として結像させる請求項（１）記載のレーザー暗視野
斜光顕微鏡
（３）請求項（１）または（２）記載の顕微鏡における
明暗変化を測定することを特徴とする回転および振動す
る微小物体の運動計測方法。