JP2527540B2 - 蛍光信号の解析と画像表示のための装置 - Google Patents

蛍光信号の解析と画像表示のための装置

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JP2527540B2 JP61175465A JP17546586A JP2527540B2 JP 2527540 B2 JP2527540 B2 JP 2527540B2 JP 61175465 A JP61175465 A JP 61175465A JP 17546586 A JP17546586 A JP 17546586A JP 2527540 B2 JP2527540 B2 JP 2527540B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光信号の解析、中でもそのような信号の減
衰挙動の解析のため及び映像的な描写のために用いるこ
とができ、これは例えば生物細胞の中の種々の物質への
染料の結合の研究において利用される。
〔従来の技術〕
対象物全体が励起用輻射線によって継続的に照射され
るような微小対象物の蛍光解析用の種々の装置が公知で
ある。この場合にその対象物から発生する蛍光光線によ
って対象物の構造の像が作り出され、このものは通常の
如くに接眼レンズを用いて観測するか、またはフォトメ
ーターを用いて調べることも可能である。これらの従来
技術はその蛍光強度が観測の間に減衰するので前後して
測定された各測定値を直接に比較することができないと
いう欠点を有している。その蛍光発生過程の短時間的な
解析の可能性は全く存在しない（H.Beyer;“Handbuch d
er Mikroskopie"−1977年、ベルリン）。短時間解析は
その観測しようとする対象物が波長分散性媒体によって
背景の蛍光輻射線と充分に分離することができないよう
な蛍光幅射線を放射するときに必要であり、これは例え
ばドイツ特許第2818841 C2号に記述されているとおりで
ある。
更にまた、きわめて短い光パルスをマイクロ対物レン
ズによって試料の上に焦点合わせして照射し、そしてそ
の露光された対象物の部分から出てくる蛍光パルスを迅
速光電受光装置を用いてその時間的経過を記録し、そし
て次にグラフ的に描写し、及び／又は数学的に解析する
ような極めて小さな対象物部分を短時間に蛍光解析する
ための別な種々の装置が知られている［F.Docchio等、J
ourn.Microsc.,134（1984）151］。これらの装置はいわ
ゆるフェージングがなく、そして時間的に分解されたフ
ルオロメトリーの可能性を提供する。これらの装置を用
いれば繰返して使用することにより時間的に異なった蛍
光応答を有する種々の物質の空間的分布についての眺望
を得ることが原理的には可能であるけれども、しかしな
がらこれは多大の時間を費やしてしか行なえない。
このような難点を除くために、ドイツ特許第3037983
C2号において、走査顕微鏡の像面内の走査方向に設けた
受光用ダイオードのアレイを用いることが提案されてい
る。これもまた低い時間的分解能しか保証せず、そして
比較的ゆっくりと減衰する蛍光の場合にしか使用するこ
とができないために、生物細胞の殆どの重要な固有蛍光
或はその他の通常的な蛍光色において用いることができ
ない。
米国特許第4284897号公報に記述されている技術手段
はフェージングを著しく少なくしているけれども、これ
は蛍光発生過程の時間的解析のための手段を全く含んで
いない。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明の目的は、上述のような従来技術の諸欠点を時
間の節約のもとにできるだけ除くような、定量的フルオ
ロメトリー用の装置を提供することである。
本発明の課題は、今や、レーザー光により試料を励起
する場合に発生する蛍光光線のラスター式検出および映
像を実現する課題から出発しており、ナノ秒領域におけ
る時間的解析により表われ、試料表面の蛍光特性の空間
的分布の異なる映像表示形式を許容するとともに、特性
的な各パルスに基づいて特定の対象物像を浮き上がら
せ、または位置に依存する各パルスの継続的な変化が明
確に解析できるように表示されるような、上記の減衰挙
動の空間的分布についての描写方式を作り出すことを課
題とするものである。
〔問題点を解決するための手段〕
上述の課題は、有利にはレーザーから発せられるパル
スの励起する輻射線を対物レンズによって試料の上に焦
点合わせさせ、そしてこの試料が例えばラスターなどに
基づく適当な手段によってスライドさせることができる
ようにすることによって、蛍光信号の解析と映像描写の
ための装置により解決される。試料の照射された部分か
ら出てくる蛍光光は迅速に反応する光電的手段を通して
記録され、その際この手段は電子的ゲート回路、同時計
数手段又はストリークカメラを含んでいることができ、
これらによってその全体的な蛍光パルスまたはこのもの
の一定的な時間的に限定された部分を更に処理してそれ
らの部分をその開始点と終点との各時点の選択により確
定させることができる。
更にまた、この蛍光パルスまたは上述の一つ以上の部
分のエネルギーあるいはそれから導き出された各指標値
を試料の照射された部分に従属する数値または適当な物
理量として記憶装置中に記憶させ、そしてその観測され
るべき対象物域の、例えばラスもーに従う一群の点につ
いての測定の上述の過程を繰返すことができ、それによ
って結局その試料の領域の特定の蛍光の時間的差異を映
像として描写することが可能となる。
上述の蛍光パルスの時間的に限定された部分は、蛍光
の特定的な減衰挙動を有する各対象物の点が映像的な描
写のために浮き出されるように選ばれ、及び／又は数学
的及び／又は論理的演算子と結合され、その際上記した
結合の特別な態様の一つは、蛍光パルスのエネルギー値
またはその幾つかの部分のエネルギー値が色モニターの
基本色の制御のために利用できるということより成るこ
とができる。
全過程を何度も繰返すこと及び記憶装置の中でそれら
の値の平均値を継続的に作り出すことによって信号／ノ
イズ比に好ましい影響がもたらされる。
〔実施例〕
以下本発明を添付の図面の参照のもとに更に詳細に説
明する。
第１図において、レーザー１が短い光パルスの列を送
り出し、これらのパルスの波長は試料17の対象点におけ
る蛍光発生用励起に適したものである。これらのパルス
は適合化光学手段２を通過し、そして光線分割器６、フ
ィルター４、適合化光学手段５、光線分割器７及び顕微
鏡対物レンズ８を通して試料17へ到達し、この試料は顕
微鏡対物レンズの焦点面内に存在している。試料17の照
射された対象位置から対応する蛍光パルスが送り出さ
れ、これらのパルスは顕微鏡対物レンズ８の後で光線分
割器７、光学手段結合系16及びフィルター15を通過し、
そして迅速に反応する光線検出器10の上に入射する。こ
の光線検出器10から発信された電気的パルスはパルスア
ナライザー11に送り込まれる。このパルスアナライザー
11は更に迅速にフォトダイオード３から別な電気的パル
スを受取り、このフォトダイオードは光線分割器６から
各励起用パルスの一部を受け取る。
パルスアナライザー11のところのそれぞれの操作部
材、操作ボード12を備えたコンピューター19及び計数並
びに制御用ユニット18によってパルスアナライザー11
は、全体的蛍光パルスのエネルギーまたはこのパルスの
時間的な１つ以上の区間内のエネルギーを更に処理する
ことを許容するような異なった操作形式に合致させるこ
とができる。それぞれのパルス部分の始点と終点とは、
フォトダイオード３からの電気的パルスの到着から所望
の時点までの調節可能な時間間隔によって選ぶことがで
きる。
パルスアナライザー11はまた、ある選択可能な、前後
して続く常に等しい数の励起用パルスに相当するそれ
ら、さらに処理されるべきエネルギー部分を、その処理
に先立ってそれらの平均値が作り出されるように調節す
ることも可能である。
試料の或るピクセルに属するそれら蛍光エネルギーの
平均値化された、または平均値化されていない部分は記
憶装置13の一つ以上の、そのピクセルに従属されている
要素の中に数値として記憶される。その選んだ作業形態
に従って、或る一つのピクセルによって常に等しい数の
一連の蛍光パルスまたは一個のパルスが評価されたとき
に、コンピューター19によって制御された試料スライド
装置９によって試料17は常に１ステップだけスライドさ
れる。
この試料17のステップの方向と大きさとはコンピュー
ター19によって任意に制御することができ、そして有利
にはラスターの方式で行われる。即ち試料17の所望の全
対象域が評価され、そして対応する蛍光エネルギーの値
が記憶装置13に記憶される。
この過程と並列に、またはこれに引き続いて、記憶装
置13の内容がディスプレー14の上に映像として描き出さ
れる。この場合にこれはパルスアナライザー11、コンピ
ューター19、記憶装置13及びディスプレー14の次のよう
な作動態様、即ちその観察した試料の像が選択的にその
蛍光パルスの全エネルギーに従って、または時間的なエ
ネルギー部分に従って、あるいはその数学的な結合に従
って表わされることができるような作動態様を許容す
る。中でもそれらエネルギー部分またはそれらの数学的
結合はディスプレー14において映像の疑似着色のために
用いることができる。第２図には、フォトダイオード３
の電気的パルスによって代表される励起用パルス20、及
びこの励起用パルス20よりも時間間隔22だけ遅延して開
始されかつ励起用パルス20よりも時間間隔23だけ遅延し
て終了するような蛍光パルス21並びにパルス部分24の経
過の可能な例が示されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に従う装置の一具体例の構造を図式的に
示し、第２図はその励起用パルスと蛍光パルスとの時間
的経過を示す。 １……レーザー ２、５……適合化用光学手段 ３……フォトダイオード ４、15……フィルター ６、７……光線分割器 ８……顕微鏡対物レンズ ９……試料スライド装置 10……光線検出器 11……パルスアナライザー 12……操作ボード、13……記憶装置 14……ディスプレー、16……光学手段結合系 17……試料、18……制御ユニット 19……コンピュータ、20……励起用パルス 21……蛍光パルス、24……パルスの部分

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】レーザー光による試料の励起の際に発生す
    る蛍光光線を光電装置および画像記録装置により解析
    し、画像表示する方法において、試料と励起光源は、相
    対的にラスター式によりスライドされ、発生する蛍光パ
    ルスの空間的分布が検出され、試料の各々の励起箇所の
    ために、光電装置により検出された蛍光信号の全時間経
    過または選択可能な限定時間部分の電気パルス列として
    記録し、連続処理のため個々に制御可能であり、蛍光信
    号の経過の設定時間部分に対応した記憶素子が各々のパ
    ルス部分のため、記録装置に配列され、前記記憶装置内
    で、限定時間部分により、その都度検出される励起パル
    スに対応した計数値が記憶され、試料表面の少なくとも
    一部分を検出後、個々の蛍光信号の限定時間部分に対応
    し、読出しおよび連続処理により決められた記憶装置に
    記憶されたデータを記録及び画像表示する方法。
  2. 【請求項２】多数の励起箇所のそれぞれの蛍光信号の継
    時的な変化に対応する記憶素子が配列されていることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】少なくとも一つの励起箇所を画像表示する
    ため多数の記憶素子を読出し、数学的に処理し、試料表
    面の少なくとも一部分のため、処理の結果を画像表示す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】少なくとも一つの励起箇所のため、蛍光信
    号の選択可能な前後して続く常に等しい数の励起用パル
    スに相当するエネルギー値の平均値が形成され、画像表
    示されることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】試料面は、繰返しラスター式により検出さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項
    の内の１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】個々のパルス部分または全パルス部分のた
    め、多数の測定値の平均値が決定され、表示されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項の内の１
    項に記載の方法。
  7. 【請求項７】色飽和および信号ノイズ比を改善するた
    め、各測定過程を繰返すこと、および記憶素子中でそれ
    らの平均値を、継続的に作り出すことを特徴とする特許
    請求の範囲第１項乃至第６項の内の１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】読出される蛍光パルスのエネルギー値ある
    いはそのいくつかの部分のエネルギー値が色モニターの
    基本色の制御のために利用できることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項乃至第６項の内の１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】レーザー光による試料の励起の際に発生す
    る蛍光光線を光電装置や画像記録装置により解析し、画
    像表示する装置において、試料とパルス光線は相対的に
    ラスター式に移動可能であり、発生する蛍光パルスの空
    間的分布が検出され、蛍光パルスの蛍光信号の時系列的
    に解析される光電装置の電気的パルスの強度を測定する
    手段が設けてあり、蛍光信号の継続的な限定時間部分に
    関連し、その都度検出されたパルス部分に応じて強度を
    記憶する記憶装置が設けてあり、個々の記憶装置は強度
    測定並びに制御用ユニットと連結され、強度測定並びに
    制御用ユニットは、個々のパルス部分のため、決定され
    た記憶装置に記憶されたデータを読出し、連続処理し、
    画像記録装置の表示のため送ることを特徴とする前記装
    置。
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