SU659611A1 - Способ получени -аспарагиновой кислоты - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L -АСПАРАГННОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относитс  к технике получени  L -аспарагиновой кисло и может быть использовано в микробиологии , медицине и пищевой промышленности . Известен способ получени  U -ас рагиновой кислоты путем смещени  с пензии клеток микроорганизмов,например Реей domona 6 Eit ultaciens , с 1 М (11,6%) водньлм раствором фумар та аммони - и толуолом с последующей инкубацией в течение 48 ч при Э7°С, Недостатком известного, способа  вл етс  его длительность, загр знение целевого продукта примес ми и периодичность. Известен также способ получени  Ь -аспарагиновой кислоты путем куль тивировани  микроорганизмов - продуцентов аспартазы с последующим выделением аспартазы из клеток, иммобилизацией фермента на ионообменниках и пропусканием через них водного раствора фумарата аммони . Недостатком этого способа  вл етс  необходимость выделени  фермента из клеток и быстрое снижение активности L -аспарагиновой кислот Известен также способ получени  L -аспарагиновой кислоты путем культивировани  продуцирующих ее микроорганизмов вида Esche.HcH-ia соБ( на питательной среде, отделени  суспензии клеток от культуральной жидкости, промывки, иммобилизации клеток путем включени  их в полиакР21ламидный гель, измельчени  гел , активации клеток и промывки их фума ратом аммони ,- Этот способ  вл етс  наиболее близким к предлагаемому -по технической сущности и достигаемому результату . Недостатком известного способа  вл етс  его длительность и недостаточна  эффективность за счет снижени  активности аспартаэы при иммобилизации клеток. Цель изобретени  - ускорить процесс и повысить его эффективность. Это достигаетс  тем, что в предлагаемом способе получени  L -аспарагиновой . кислоты в качестве микроорганизмов из вида Eechei tch ia coEi используют штамм Escherichiа 83 или Escher-ichia coEi AH 52, или Escherichi о coSi 85, при этом активацию клеток осуществл ют после

отделени  их от культуралыюй жидкости путем1 нагревани  суспензии клеток при 45-55с в течение 40-60 мин, а .иммобилизацию -провод т в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9% по весу с последующим охлаждением смеси до 0-10°С при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 510 мин.

Способ осуществл ют следующим образом.

Продуцирующие L -аспарагиновую кислоту микроорганизмы вида Esche ricbia co6i штаммы Ah 52, 83 или 85 культивируют 6 ч на питательной среде (МПБ) при 30-37°С, затем клетки отдел ют,активируют их нагреванием при 45-55с, преимущественно при ., в течение 40-60 мин и далее промывают.

Последующую иммобилизацию провод т в присутствии одной из солей

Показатель

Длительность процесса, ч

Удельна  активность аспартазы ,включенных

в гель нативных , клеток,

Eschenichia co6i ед.

активности

Удельна  активность аспартазы иммобилизированных нативных клеток Eschenichia coEi , % от свободных клеток

Удельна  активность аспартазы включенных активированньис клеток EschePich4a coEi,

Результаты таблицы показывают, что уменьшение времени культивировани  микроорганизмов - продуцентов аспартазы и времени активации сокращает длительность процесса примерно в 8 раз.

Пример, односутрчные клетк Eschef chia co8i штамм В o влвaют с поверхности м со-пептонного агара (МПА) 1-2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стерильной пипетки перенос т в посевную жидкую стерильную

аспарагиновой, кислоты в количестве 3-9 Еес,% и смеси,содержащей вес.%: акриламид 10-20, метиленбисакриламид 0,33-0,66;N,N,N; N -тетраметилэТилендиамин 0,00025-0,0005; персульфат аммони  0,0375; .рибофлавин

0,005. Клетки вместе со смесью освещают светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс с одновременным охлаждением до 0-10®С в течение 5-1-0 мин.

Затем гель измельчают и пропускают через него водный раствор фумарата аммони  со скоростью злюции 0,5-1,0. при 25-37 с.

Получают чистый продукт с выходом 88-95% потребленного фумарата.

Продукт кристаллизуют подкислением раствора до рН 2,5-3,0, кристаллы отдел ют фильтрованием, осадок промрлвают этиловым спиртом и высушивают

на воздухе.

Данные сравнительных испытаний по предлагаемому способу и известному (контроль) приведены в таблице.

Предлагаемый способ

74

187

13,1

77

173

среду того же состава.Культуру вырщивают 12-18 ч глубинным способом при ЗО-ЗБ С в качалочных колбах 750 мл (объем среды 50 мл).

Затем посевной материал в количестве 2-3% внос т в среду того же состава и выращивают тем же способом 6 ч в аналогичных услови х в качалочных колбах с Ьбьемом среды по 125 мл. Клетки отдел ют от среды на центрифуге С-44. Из 4 л среды получают 50 мл исходной суспензии клеток E5cher chta coEi штам;. В, которые содержат 56, 92 мг белка в 1 мл (определение по методу Лоури и имеют удельную и общую аспартазну активность, соответственно равные 57 ед на 1 мг белка за 1 ч и 161500 ед (1 ед равна 1 микромолю образованной, аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 ч). После трехкратной промывки суспе зии клеток порци ми по 230 мл стери ной водопроводной водаа или 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0 последующего центрифугировани  в течение 10 мин при б тыс об/мин получают 50 мл промытой суспензии клеток ЕесЬ pia coEi штамм В с содержанием белка 29,70 мг в 1 мл и удельной и общей активностью, равной соответственно 180 ед на 1 мг белка за 1 ч и 154850 е . Аспартазную активность свободных клеток определ ют следующим образом К 1,7 МП суспензии клеток добавл ют 13 мл 0,1 М фосфатного буфера с pri 8,0 и 15 мл 1 М 11,6%) раство фумарата агфюни , приготовленного добавлением к 116 г фумаровой кисло ты концентрированного раствора амми ака до рН 8,5 и воды до 1 л. В 1 М раствор фумарата аммони  ввод т хлористый магний в количестве 0,001 (0,002032%). К реакционной смеси добавл ют 0,3 мл толуола. Реакционн смесь инкубируют при посто нном пер мешивании при 37°С, отбира  аликвоты по 3 мл через 30 мин в течение 2 ч. Реакцию в аликвотах останавливают, отдел   клетки бактерий центрифугиро ванием в течение 10 мин при Ютыс. об/мин. В надсадочной жидкости опре дел ют содержание фумаровой кислоты по поглощению при 240 нм и аспарагиновой кислоты нингидриноБЫМ методом по общеприн той методике. При включении клеток Escher-ich a coBi в полиакриламидный гель к 2,0 мл 50%-ного раствора акриламнда добавл ют 1,1 мл 3%-ного раствора метиленбисакриламида, 0,1 мл О,025%-ного раствора рибофлавина, 0,1 мл 0,1875%-ного раствора персульфата аммони , 0,1 мл 5%-ного раствораN,N,N; М -тетраметилэтил ендиаМина , 150 мг дикалиевой соли аспарагиновой кислоты и 1,7 мл суспензии отмытых от балластных белков клеток Escherich co6i штамм В содержащих 80,7& мг белка и имеющих удельную и общую аспартаэную активность , соответственно равные 108 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 9500 ед. Смес быстро перемешивают, став т в чзтакан со льдом и водой и освещают лампой 300 вТ, помещенной на рассто нии 14 см ,в течение 5-10 мин. Блок полиакриламидного гел  с включенными в него клетками бактерий 16 весом 6 г растирают в ступке 2 ми;;, получа  частицы гел  размером от 0,2 до 2,0 мм, Нх отмывают от свободных клеток микроорганизмов, добавл ют последовательно четыре раза по 30 мл дистиллированной воды и отдел ют промывные воды декантацией после отстаивани  осадка 5 мин. Промывные воды собирают вместе, получа  90 мл с -общим содержанием белка 33,0 MFf т.е. 41% от внесенного 5 оличества. В полиакриламидный гель включены клетки Eschenichia coSi штамм В в количестве, соответствующем 47,87 мг белка или 59%. Удельна  активность иммобилизованных клеток повышаетс  до 187 ед;-на 1 мг белка за 1 ч, обща  активность равна 950 ед., что составл ет 94,5% от внесенной общей активности. Объем суспензии частиц полиакриламйдного гел , равный 15 мл, с включенными клетками Eschernclua coEi штамм В после последнего промывани  количественно перенос т в 15 мл 1 М (11,6%) раствора фумаратг аммони , приготовленного, как указано выше с 0,3 мл. толуола. Реакционную смесь выдерживают при З7с при посто нном перемешивании и через 30 мин в течение 2 ч отбирают аликвоты по 5 мл. Реакцию в аликвотак останавливают фильтрованием через бумажный ;уфильтр частиц гел  с включенными клетками бактерий. В фильтрате определ ют содержание фумаровой и аспарагиноэой кислот методом, описанным выше. Во всех случа х провод т идентификацию образовавшейс  аспарагиновой кислоты при помсмци тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол в системах растворителей хлороформметаноламмиак- вода в соотношении 40:40:7:3 и на пластинках .Фиксиом при использовании 0,4 М цитратного буфера рН 3,3. Стандартом служит L -аспарагинова  кислота хроматографически чиста  фиргж Реанол (ВНР) . Приготавливают три одинаковых образца полиакрила1мидного гел  с включенными в него клетками Е.coBi штамм 83, отличие мезвду которыми состоит только в том, что полимеризацию одного гел  провод т.обычным способом при освещении светом видимой области с интенсивностью 1520 тыс.люкс и при охлаждении в стакане с водой и льдом, второй освещают в воде при комнатной температуре , а в третьем провод т полимеризацию без освещени  и при охлаждении. Иммобилизованные при освещении и охлаждении до 8с клетки E, 83 имеют удельную и общую аспартазт ную активность, соответственно равные 187 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 8950 ед. (94,5% от внесенной), при освещении без охлаждени , соответственно равные 21,6 ед. на 1 мг белка 7 за 1 ч к 1100.ед, (16,55 от BViecsH ной) , а без освещени  - 5 ед, па 1 мг белка .за 1 ч к 230 ел, (3, внесенной) и полниеризаци  Б зто случае протекает 60 мик. П р и м е р 2., штамм АН 52 выращивают, н готов т суспензию согласно примеру .1,. Содержание белка равно 39f368 мг в 1, мл суспензии клеток, удельна  а.ктивность - 25 ед, на 1 мг белка за 1 ч. Иммобилизацию клеток бактерий провод т., как в примере 1, в двух одинаковых образцах, внос  в каждый по 67,5 мг белка с общей активностью аспартазы 1685 ед, От личие между образцами состоит в том, что в одном случае в смесь дл  фотополимеризации полиакрилакидаю го гел  добавл ют 150 мг дикалиевой соли5аспара1  ковай кислоты, а Е другом не добавл ют. Аспартазную актиг ность включенных в полиакриламидный гель клеток бактерий определ ютf как в примере Клетки бактерий, иммобилизованны в присутствии соли аспарагиновой кислоты, имеют удельную и общую активность срответствекно 74,0 ед. .на 1 мг белка за 1 ч и 3530.ед,, т..е.. 210% от исходной; без соли аспарагиновой кислоты соответственн 2,58 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 130 ед., т.е. 8,7% от исходной обще активности. Примерз, Клетки -EvCpEJ штамм Кр выращивают, как з примере 40 мл суспензии непромытых клеток е содержанием белка 57,0 мг в 1.мл удельной активностью 57 ед, на 1 мг белка за 1 ч раздел ют на две равны дозы, 20 мл этой суспензии промываю от балластных белков, как в. примере и получают 20 мл суспензии клеток .бактерий с обозначением нативны  и содерлсанием белка 29,7 мг в 1 мл Другие 20 мл суспен.зии неотмытых бактериальных клеток вначале нагре .вают 40 мин при , а затем oTivibiв .ают от балластных белков, как в пр мере 1, 20 мл суспензии : клеток с обозначением активирован ных С содержанием белка 27,06 мг в 1 мл. Включение бактериальных кле в полиакриламидный .гель осуществл ю как в примере 1. . Затем определ ют;аспартазную ак ность, свободных и включенных,в.; полиакриламидный гель нативньк и активированных клеток Е-соВ штамм Кр, как в примере 1. Полу1аю свободные и иммобилизованные нз,тивные клетки E.coEi Кр с уде ной аспартазной , активностью, соот-ветственно равной 108 и 187 ед. на 1 м.г белка за 1 ч, а также свободн и иммобилизованные активированны клетки . соВ4 Кр с удельной ас . :1о, соответственно ед., на 1 мг белка U р и .: е р 4, К.гетки Е.со2| та;.а/ Кр выращива;от, как в примере 1, 10 мл суспе-зии клеток нагревают 10 vjii до 50°С, а затем отмывают l балластных , как в примере 1. получа  10 мл суспензии актиБЗчрсЕапиых клеток содерлсащих 35,2 мгм .;ел;-;а в 1 мл и имеющих удельную акТ;-:БНОСТЬ аспсштазы 27,8 ед.на 1 мг белка за 1 ч, 5,1 MJI этой суспензии с со ержан1-5ем 179 мг белка с общей аспартазной активностью 4999 ед. добавл.чют к тройному количеству всех составных частей дл  фотополимеризации полиакркламидного гел , указанных в - примере 1. У1:;лоБИ5т фото к л ;-тмеризации и измельчени  полиакриламидного гел ,, как s 1, Часгицы измельченного 1ел  промьвают 4 раза порци ми Of 01 М фосфатного буфера рЫ 7,0 по .50 MJ; и собирают 150 мл промывных BCvi , которые содержат 69мг б.елка и 1940. ед общей актнвности аспартаВ полиакриламидмый гель включают. j-:j.r.ei. , сой Кр, количество кото:рь;х соответствует 110 мг белка или GljO-J исходного количества. ВключенHi: .;e в гель клетки имеют удельную аспаотазкуш активность 119 -ед. на )- ivii ;3с,:-:ч. за 1 .ч и общую 13200 ед. (263 о-г рлшсенной) , Все полученное 1:ол-ГчестЕО частиц полиакриламидного rajrw с вклю-ч:екиьГ.1и в него-клетками; Е, coEj Кр перенос т в колонку 1,. 8x7,5 см к объемом 19,1 см. Через колонку термостатированную при пропускают 1 л 1 М раствора фумарата а -1мани , приготовленного, как в npravtepc 1, со скоростью 10 мл/ч, что соответствует удельной скорости элютки 0,525, Собирают 1 л элюата, з ко :ором содер к 1ние аспарагиновой ;:ислоаы равно 0,865 М, а фумаровой 0,012 М, .Tie мол рный выход образоЕэ .в.шейс  аспарагиновой кислоты по отношению к потребленному фумарату равен 88%. К 1 л элюата добавл ют концентрированную серную кцслоту до рН 3,0, выпавший обильный осадок о.тдел ют фильтро.ванием, промывают последовательно двум  порци ми холодной воды до 50 мл и 50 мл 96%-ного этилового спирта и сушат до посто нного веса на воздухе, получа  110 г аспарагиновой кислоты, котора  в б г НС8имеет (а)| +25,. Это указывает на 100%-ное содержание L -формы в целевом продукте. В целевом продукте не обнаруживают фумс1ровой кислоты - исходного сырь . Полученна  L -аспарагинова  KiscjpTa дает одно п тно при хроматографировании на пластинках

Силуфол и Фиксион, как указано в примере 1, и один пик на аминокислотном анализаторе фирмы Хитачи (Япони ), точно соответствующий стандартной L -аспарагиновой кислоте. Целевой продукт не загр знен клетками микроорганизмов. Элементарный микроанализ содержит,%:s 4,90% Н, 36,48% С, 10,49%N, что соответствует теоретическому содержанию этих элементов в аспарагиновой кислоте (5,301% И; 36,.0-95% С; 10,52%N),

Предлагаемый способ:получени  Lаспарагиновой кислоты по сравнению с известным техническим решением той же задачи обеспечивает повышение эффективности процесса за счет сокращени  времени активации клеток микроорганизмов и .повышени  их активности перед иь«мобилизацией, а также увеличени  скорости элюции исходного- сырь  через колонку.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  L -аспарагиновой кислоты путем культивировани  пррдуЦирующих ее микроорганизмов вида EscheгiCh O( Co6i на питательной среде, отделени  суспензии клеток от культуральной жидкости,промывки, иммобилизации клеток путем включени  их в полиакриламидный гель, измельчени  гел , активации клеток и промывки их фумаратом аммони , отличающийс  тем, что, с целью ускорени  процесса и повышени  его эффективности, в качестве микроорганизмов из вида Escher chia coEi используют штаммы Eschepichia со6 83 или Escher( coBi АН 52, или EscherMchia coEj 85, при этом активацию клеток осуществл ют после отделени  их от культуральной жидкости путем нагревани  суспензии клеток при 45-55°С в течение 4060 мин, а иммобилизацг1ю провод т в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9 вес.% с последующим охлаждением смеси до при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 5-10 мин.