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Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von hochaktiven Biokatalysatoren durch Quervernetzung von Enzym-hältigen Mikroorganismen oder deren Zelltrümmern in einem nicht-wassermischbaren Lösemittel unter Zusatz von einem Amin-hältigen Polymer und einem bifunktionellen Reagenz, in Anwesenheit von Enzymstabilisatoren, wobei eine hohe Stabilität der Biokatalysatoren bzw. der Zielenzyme auch durch den Zusatz von einer nicht-enzymschädigenden, wassermischbaren organischen Verbindung und/oder Feststoffen ermöglicht wird.
Die Herstellung und der Einsatz von Biokatalysatoren ist in vielen Publikationen und Patenten beschrieben. Sämtliche Biokatalysatoren (z. B. die D-Aminosäure-Oxidase zur Oxidation von Cephalosporin C) zeigen jedoch entweder die Nachteile einer geringen Enzymstabilität und einer schwachen spezifischen Enzymaktivität oder werden durch aufwendige, oft kostspielige Isolier- und Reinigungsverfahren durch Immobilisierung des Zielenzyms auf einen Träger erhalten, wodurch technische und/oder wirtschaftliche Nutzung erschwert werden.
Gemäss AT 389 933 erfolgt die Herstellung eines Biokatalysator durch Inkontaktbringen eines enzymatisch aktiven Zellmaterials mit einem wasserlöslichen, chemisch reaktiven Polymer, das durch Umsetzung einer wasserlöslichen Substanz mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül mit einem oder mehreren Dialdehyden hergestellt wurde. Gemäss EP 133 531 A1 (siehe z. B.
Beschreibung Seite 4, Seite 5, Zeilen 16 bis Seite 7, Zeile35, Beispiele 1 bis 43, Anspruch 1) erfolgt die Herstellung immobilisierter Enzyme durch Zugabe einer wässrigen Polyethylenimin (PEI) lösung eines PEI mit einem Molekulargewicht von mindestens 500 Dalton und einem Primäramingehalt von mindestens 10 Gew%, zu einem wässrigen Medium enthaltend ein Enzym oder bakterielle Zellen enthaltend intermediär ein Enzym ; Zugabe von Glutarldehyd und einer wässriger Lösung von Chitosan zu der Mischung erhalten in i), wobei ein vernetztes immobilisiertes Enzym gebildet wird ; und Gewinnung des Reaktionsproduktes erhalten in ii) aus dem wässrigen Medium.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren durch Vernetzung von enzymhältigen Mikroorganismenzellen in Gegenwart eines aminhältigen Polymers, zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass i) eine enzymhältige Mikroorganismenzellmasse mit einem aminhältigen Polymer versetzt wird, ii) die in i) erhaltenen Mischung in einem Inerten, nicht wassermischbaren Lösemittel verteilt wird, und iii) Mikroorganismenzellen in der in ii) erhaltenen Mischung durch Zugabe eines bifunktionel- len Reagens vernetzt werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht nun einerseits eine technisch sehr einfache und besonders kostengünstige Herstellung von Biokatalysatoren und andererseits trotzdem die erforderliche hohe spezifische Aktivität und eine ausreichende Stabilität des Zielenzyms bzw. der Zielenzyme.
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ter für Hydantoinase und N-Decarbamoylase, Rhodotorula glutinis für Esterase und Oxidase, Escherichea coli für rekombinante Glutaryl-ACA-Acylase und Trigonopsis variabilis für D-Aminosäure-Oxidase.
Die D-Aminosäure-Oxidase (= Oxidase) katalysiert die oxidative Desaminierung von Cephalosporin C (= Ceph C) mit Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und o. -Ketoadipoyl-7-Aminocephalospo- ransäure (= KA-ACA), welches durch Wasserstoffperoxid zu Glutaryl-7-ACA (= GI-ACA) und CO2 oxidiert wird. GI-7-ACA ist ein Zwischenprodukt bei der zweistufigen enzymatischen Herstellung der 7 -Aminocephalosporansäure (= 7-ACA) aus Ceph C.
Ein derartiger Biokatalysator (z. B. Oxidase) kann erhalten werden, indem man einen Fermentationsbrei (z. B. Trigonopsis variabilis ATCC 58536) oder dessen Breihomogenat mit einem bifunktionellen Reagenz (z.B. Glutardialdehyd, Dimethylpimelimidat, Epichlorhydrin, N,N'-Carbonyidiimi- dazol, 1, 4-Butandioldiglycidylether, Maleinsäureanhydrid, Dicyclohexylcarbodiimid, Hexamethylen- diisocyanat) vorbehandelt, mittels Mikrofiltration oder Zentrifugation vom Fermentationsüberstand befreit und bis zur Verwendung eingefroren oder kühl lagert.
Die so erhaltene Zellmasse kann mittels Mikrofiltration gewaschen und aufkonzentriert werden.
Zur Inaktivierung der unerwünschten Nebenaktivitäten (z. B. Esterase oder Katalase) wird die Zellmasse mit einem wasserlöslichen Amin-hältigen Polymer (= Polymer) (z. B. Polyethylenimine, Poly-
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usive speziTetraessigsäure = EDTA) versetzt und 20 Minuten oder länger unter alkalischen Bedingungen (pH 9, 0 bis 12, 0) behandelt, ohne dass dabei die Zellmasse an Aktivität des Zielenzyms bzw. der Zielenzyme verliert.
Das Zellmasse-Polymer-Gemisch wird dann durch laminare Rührung in ein inertes, nicht-wassermischbares Lösemittel (z. B. n-Tributylphosphat, höhere Alkane, (n-Hexan, n-Heptan) Toluol, Öle (Sojaöl, Sillikonöl, Dieselöl) gleichmässig verteilt und anschliessend durch Zugabe eines bifunktionellen Reagenz (z. B. Glutardialdehyd, Epichlorhydrin, N, N'-Carbonyldiimidazol, 1, 4-Butandioldi- glycidylether, Maleinsäureanhydrid, Dicyclohexylcarbodiimid, Hexamethylendiisocyanat) vernetzt, sodass feste, sphärische Partikel in Suspension entstehen.
Durch Zugabe einer nicht-enzymschädigenden, wassermischbaren organischen Verbindung (z. B. Alkohole, Ketone, Polyethylenglykole, Glycerin) in diese Suspension, bzw. Ablassen der Suspension in diese organische Verbindung, erfolgt nun eine sorfortige Phasentrennung, wobei sich die festen sphärischen Partikel in die wässrige Unterphase absetzen, und sich die obere Lösemittelphase komplett abtrennen lässt. Nach Einwirkung der organischen Verbindung auf die Partikel, wobei eine mechanische Stabilisierung auftritt, werden sie durch Waschen mit Brunnenwasser komplett von dieser Verbindung und Reste vom Lösemittel befreit.
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Parameter (z. B. Dichte, Viskosität) unabhängig von der verwendeten Zellmasse einstellen lassen.
Die nach der Vernetzung erhaltenen sphärischen Katalysatorpartikel lassen sich so besonders leicht von der Lösemittelphase abtrennen und weisen eine sehr enge Perigrössenverteilung und eine überdurchschnittlich gute mechanische Stabilität auf, sodass der Katalysator für den technischen Einsatz in einem gerührten Tankreaktor besonders geeignet ist.
Der so erhaltene Biokatalysator wird bis zur Verwendung in einem geeigneten Puffer kühl gelagert, bzw. durch Filtration von dessen Flüssigkeit befreit und eingefroren oder Iyophilisiert.
Das verbesserte Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren besitzt die Vorteile der einfachen und daher besonders kostengünstigen Herstellung im Vergleich zur Enzymisolierung und -Immobilisierung und ermöglicht trotzdem im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der Zellimmobilisierung eine besonders hohe spezifische Aktivität und mechanische Stabilität des Zielenzyms.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1 (Heranführung der Biomasse) :
Zellen von Trigonopsis variabilis ATCC 58536 (535 g Feuchtgewicht, 25. 970 U Oxidase = 100 %) werden in der Fermentationsbrühe (2. 7 kg) durch Einrühren von GDA (21 g Glutardialdehyd 25 % ig) 1 Stunde bei Raumtemperatur, pH 7. 5 zur Stabilisierung vorbehandelt, anschlie- ssend mittels Zentrifugation abgeerntet und eingefroren gelagert.
Nach der Lagerung wird mittels Mikrofiltration mit Brunnenwasser gewaschen und aufkonzentriert (735 ml). Die Oxidaseaktivität beträgt : 26. 350 U (= 102 %) (1 U = die Bildung von 1 (imot pro min KA-ACA bzw GI-ACA in einer sauerstoffgesättigten Ceph-C-Lösung (20 mM) bei pH 8. 0, 250).
Beispiel 2 (Coaten mit Polymer) :
Die so gewonnene Zellmasse (735 ml, 100 g Trockensubstanz) wird mit ss-Mercaptoethanol (5 mM), EDTA (2 mM) und mit PEI (40 g, Polyethylenimin 50 %ig, Molmasse 600. 000 - 1, 000. 000) versetzt, mit Wasser suspendiert (800 ml Gesamtvolumen) und anschliessend 90 Minuten bei pH 11 (Natronlauge) und Raumtemperatur langsam gerührt. Danach wird der pH-Wert des Zell- masse-Polymergemisches mit Phosphorsäure auf 9 gestellt. Die Oxidaseaktivität beträgt : 24. 360 U (= 94 %).
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das Zellmasse-Polymergemisch unter gleichmässiger Rührung zugesetzt wird.
Sobald sich eine homogene Verteilung der Biomasse in TBP eingestellt hat (30 Minuten) erfolgt eine rasche Zugabe von GDA (40 g, Glutardialdehyd 25 %ig), wodurch eine Vernetzung der Zellmasse innerhalb von wenigen Minuten erfolgt. Nach Zugabe von Glycerin (2000 g Glycerin, 15-200) erfolgt eine sofortige Phasentrennung zwischen der TBP- und wässrigen Biokatalysator/Glycerinphase.
Die untere Biokatalysator/Glycerinphase wird durch den Bodenauslass in ein Gefäss mit Siebboden abgelassen. Die obere TBP-Phase (2900 ml) verbleibt im Rührgefäss und kann für einen weiteren Ansatz wiederverwendet werden. Nach Einwirkung von 90 Minuten wird durch ausreichendes Durchfluten des Siebbodengefässes mit Brunnenwasser der Biokatalysator von Glycerin und TBPResten befreit.
Es werden so 580 9 Oxidase Feuchtgewicht, entspricht 121 g Trockensubstanz, erhalten. Die spezifische Aktivität beträgt 32 U/g Feuchtgewicht (153 U/g Trockensubstanz), d. h. Gesamtaktivl- twat=18.560 U (= 71 %).
Beispiel 4 (PMSF-Behandlung) :
Die Im Beispiel 3 erhaltene Oxidase (580 g Feuchtgewicht) wird in Brunnenwasser (2000 ml) suspendiert und bei Raumtemperatur langsam gerührt. PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid, 20 mg) wird in Ethanol (20 ml, absolut) gelöst und der Oxidasesuspension innerhalb von 2 Minuten zugesetzt. Nach 3 Stunden Einwirkung wird die Oxidase durch Waschen mit verdünntem Ethanol (1000 ml, 10 % ig) und mit Brunnenwasser von Reaktionsrückständen befreit
Es werden so 563 g Oxidase Feuchtgewicht, entspricht 118 g Trockensubstanz erhalten. Die spezifische Aktivität beträgt 31 U/g Feuchtgewicht (148 U/g Trockensubstanz), d. h. Gesamtaktivi- tät=17.450 U (67 %). Es wird so eine besonders esterasefreie Oxidase erhalten.
Beisoiel S (Feststoffzusatz):
Das Zellmasse-Polymergemisch wird hergestellt wie in Beispiel 1-2 beschneben. Nachdem mit Phosphorsäure auf pH 9. 0 gestellt wird, erfolgt der Zusatz von Aluminiumoxid (80 g). Die Zeliquervernetzung erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben.
Es werden so 630 9 Oxidase Feuchtgewicht, entspricht 193 g Trockensubstanz erhalten. Die spezifische Aktivität beträgt 26 U/g Feuchtgewicht (85 U/g Trockensubstanz), d. h. Gesamtaktivl- tät=16 440 U (=63 %). Es wird eine besonders enge Perigrössenverteilung (240-500 11m) erhalten.
Beispiel 6 (Zellquervernetzung, ohne wassennischbare organische Verbindung) :
Das Zellmasse-Polymergemisch wird hergestellt wie in Beispiel 1-2 beschrieben.
Die Zellquervernetzung erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben.
Nach Zugabe von GDA (20 g, Glutardialdehyd 25 %ig) erfolgt kein Zumischen der wassermischbaren organischen Verbindung, sondern wird die Suspension 60 Minuten nachgerührt und dann m ein Siebbodengefäss abgelassen. Über den Bodenauslass wird anschliessend die TBPPhase (2680 ml) erhalten. Durch ausreichendes Durchfluten des Siebbodengefässes mit Brunnenwasser, wird die Oxidase von TBP-Resten befreit.
Es werden so 610 g Oxidase Feuchtgewicht, entspricht 126 g Trockensubstanz erhalten. Die spezifische Aktivität betragt 36 U/g Feuchtgewicht (174 U/g Trockensubstanz), d. h Gesamtaktivl- tät=21. 960 U (=85 %). Es wird so eine besonders hohe Aktivitätsausbeute erhalten.
Beispiel 7 (Oxidation von Cephalosporin-C) :
Die im Beispiel 4 erhaltene Oxidase (81 g Feuchtgewicht, 2. 500 U) wird in einen Rührreaktor mit Siebboden, pH-Regelung und Druckregelung vorgelegt, mit einer Ceph-C Lösung (1 Liter, 75 mmol, pH 7. 2) versetzt und bel 200 mit Luft (5 bar Überdruck) begast. Nach 80 Minuten wird der Reaktor über den Siebboden ausgelassen. Die Produktlösung wird mittels HPLC analysiert : sie enthält 0. 6 mmol Ceph-C, 70. 7 mmol GI-ACA und 0.3 mol KA-ACA.
Zur Beurteilung der Stabilität dieser Oxidase wird die Reaktion mehrmals automatisch wiederholt, bei Zyklus 142, nach 308 h
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Einsatz der Oxidase, ergibt die HPLC-Analyse der Produktlösung nach 160 Minuten : 0. 5 mmol Ceph-C, 69. 8 mmol GI-ACA und 0.4 mol KA-ACA.
Es werden 93 g Oxidase Feuchtgewicht, entspricht 24 g Trockensubstanz, im Reaktor aufgefunden. Die spezifische Aktivität beträgt 12 U/g Feuchtgewicht (47 U/g Trockensubstanz), d. h.
Gesamtaktivität=1. 120 U (45 %).
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren durch Vernetzung von enzymhältigen
Mikroorganismenzellen in Gegenwart eines aminhältigen Polymers, dadurch gekennzeich- net, dass i) eine enzymhältige Mikroorganismenzellmasse mit einem aminhältigen Polymer versetzt wird, ii) die in i) erhaltenen Mischung in einem inerten, nicht wassermischbaren Lösemittel ver- teilt wird, und iii) Mikroorganismenzellen in der in ii) erhaltenen Mischung durch Zugabe eines bifunktio- nellen Reagens vernetzt werden.