-
Celluläre Biokatalysatoren und ihre Herstellung
-
Die Erfindung betrifft celluläre Biokatalysatoren für Biotransformationen
auf der Basis immobilisierter prokaryonter und eukaryonter Zellen von Mikroorganismen
und Pflanzen mit verschiedener Enzymaktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
-
Die erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren eignen sich für
biotechnische Umwandlungen in industriellem Maßstab und ermöglichen bei diskontinuierlicher
oder kontinuierlicher Verfahrensführung die Erzeugung insbesondere pharmazeutisch,
landwirtschaftlich oder für die Lebensmittelherstellung bedeutender Produkte oder
Zwischenprodukte.
-
Die bekannten Verfahren der Immobilisierung von Zellen können allgemein
in physikalische, physikalisch-chemische und chemische Verfahren unterteilt werden.
In Abhängigkeit davon, ob die Bindung der Zellen mit dem Träger
zB
mechanisch wie bei in ein Gel eingebrachten Zellen, durch van-der-Waals-Kräfte,
durch polare Wechselwirkung oder durch kovalente Bindung erfolgt.
-
Üblicherweise werden verschiedene in Wasser unlösliche synthetische
oder natürliche, organische oder anorganische Träger verwendet, die vor allem die
hydrodynamischen und Sedimentations- und damit auch die Separations-Eigenschaften
der immobilisierten Zellen verbessern und zur Stabilisierung der gewünschten Enzymaktivität
beitragen.
-
Verschiedene bekannte Arten der Immobilisierung von Zellen, ihre
Vorteile und Nachteile sowie wirtschaftliche Angaben hierzu sind in Form von übersichtsartikeln
veröffentlicht (vgl beispielsweise Vandamme, Chem. Ind. 24 (1976), 1072; Abbot,
Advances Appl. Microbiol. (Hrsg. D.
-
Perlman) 20, 203, Acad. Press. New York, San Francisco, London 1976);
Jack und Zajic, Advances Biochem. Eng. 5 (1977), 126; Durand und Navarro, Proc.
Biochem. 13, Nr. 9 (1978), 14 und Vojtisek et ab,Biologicke' listy 44 (1979), 192).
-
Die physikalische Immobilisierung von Zellen ist beispielsweise in
der CS-PS 113 908 (in Agar), der IT-PS 836 462 (mit Cellulosetriacetatfasern), der
US-PS 3 791 926 und der SU-PS 659 611 (Einbau der Zellen in das bei der radikalischen
Copolymerisation von Acrylamid mit Methylenbis (acrylamid) entstehende Netzwerk)
beschrieben.
-
Die chemische Immobilisierung von Zellen ist Gegenstand zahlreicher
Patentschriften, die sich beispielsweise auf die kovalente Bindung von Zellen an
verschiedene synthetische oder natürliche Polymere nach vorhergehender
chemischer
Modifizierung und Aktivierung durch verschiedene Reagentien beziehen. Als Träger
dienen hierbei zahlreiche synthetische oder natürliche organische Materialien bzw
inerte oder chemisch aktive Polymere, beispielsweise auf der Basis von Methacrylaldehyd,
Glycidylmethacrylat, Hydroxyalkylmethacrylaten, natürlichen Polymeren wie etwa Cellulose
und deren Derivaten, Collagen, Gelatine, anorganischen Materialien wie Glas sowie
etwa Verbindungen von Titan, Zirkonium, Vanadium udgl.
-
Abgesehen davon, daß Präparate von in dieser Weise immobilisierten
Zellen nur eine geringe spezifische Aktivität besitzen und ihre Teilchen mechanisch
wenig verschleißfest sind, sind hierfür verwendete Träger dieses Typs teuer, wobei
der Preis von der Zugänglichkeit und der angewandten Technologie bei der vorhergehenden
chemischen Modifizierung und Aktivierung durch oftmals sehr aggressive und toxische
Reagentien abhängt; hierdurch wird die Herstellung und damit auch die industrielle
Ausnutzung immobilisierter Zellen limitiert.
-
Ein gewisser Fortschritt bei der Zellimmobilisierung mit technischer
Bedeutung geht aus dem Verfahren der CVS PS 197 101 hervor. Das Prinzip dieser Verfahrensweise
besteht in der Bindung nativer Produktionszellen mit Penicillinacylaseaktivität
an Zellenträger verschiedener Organismenarten, wobei entweder ganze unverletzte
und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch behandelte Zellen oder deren nichtlösliche
Fragmente chemisch durch kovalente Bindung unter Verwendung polyfunktioneller Reagentien,
vor allem Glutaraldehyd, nach vorangehender physikalischchemischer Flockung vorzugsweise
mit Flockungsmitteln mit Verbindungen mit mindestens zwei primären und/
oder
sekundären Aminogruppen im Molekül gebunden werden.
-
Bei dieser Art der Immobilisierung der Zellen werden niedrigere Gestehungskosten
des Trägers erzielt, da als Träger Abfallzellen oder des integrierte Mischungen
davon oder etwa celluläre Abfallbiomasse verschiedener Fermentationsprozesse verwendet
werden, deren Kosten meistens sehr gering sind.
-
Eine weitere, noch vorteilhaftere Art der chemischen Bindung von
Produktionszellen ohne Benutzung von Trägern ist im CS-Urheberschein 203 607 beschrieben;
diese Verfahrensweise eignet sich universell für die gegenseitige Immobilisierung
von Zellen ohne Verwendung eines Trägers für prokaryonte und eukaryonte Zellen von
Mikroorganismen mit verschiedener Enzymaktivität (vgl. auch den tS-Urheberschein
209 265). Bei dieser Verfahrensweise werden sehr stabile Präparate von wechselseitig
kovalent aneinander gebundenen Zellen verschiedener Mikroorganismen erhalten, die
die angestrebte Enzymaktivität aufweisen und integrale Einheiten gut sedimentierender
Teilchen aufweisen. Prinzipiell werden hierbei native Produktionszellen mit bifunktionellen
vernetzenden Reagentien, vor allem Glutaraldehyd, chemisch umgesetzt, wodurch eine
kovalente Bindung des Zellinhalts der individuellen Zellen und eine kovalente Fixierung
der angestrebten Enzymaktivität der Produktionszellen sowie Beständigkeit dieser
Zellen gegen natürliche oder künstliche Autolyse erzielt wird. In einer weiteren
Stufe werden die vernetzten Zellen durch einzelne oder kombinierte Einwirkung von
physikalischen, physikalisch-chemischen oder chemischen Einflüssen permeabilisiert,
wodurch die Diffusionsbarriere der vernetzten Zellen gegen das Ausschwemmen makromolekularer
Materialien beseitigt wird, die Bestandteile der Oberflächenstrukturen
der
Zellen sind und nicht mit Glutaraldehyd reagiert haben, beispielsweise von Lipiden.
In der letzten Verfahrensstufe werden die vernetzten und permeabilisierten Zellen
in Gegenwart eines freien Vernetzungsreagens, vor allem Glutaraldehyd, im Gemisch
mit damit reagierenden, wasserlöslichen Substanzen mit mindestens zwei primären
und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül, vor allem Polyethylenimin und Hexamethylendiamin,
unter Bedingungen, die den gegenseitigen Kontakt der Zellen während der Reaktion
begünstigen, beispielsweise Tiefkühlung, Einwirkung von Zentrifugalfeldern, von
Filtrationsdruck etc, kovalent aneinander gebunden.
-
Aufgrund der erläuterten Verfahrensschritte bei der Herstellung solcher
immobilisierter Zellen könnte unterstellt werden, daß die Erzeugung cellulärer Biokatalysatoren
bereits in hinreichend wirtschaftlicher Form ausgearbeitet ist. Dies gilt jedoch
keineswegs generell und vor allem deswegen nicht, weil bei einigen in den Zellen
von Produktionsorganismen vorliegenden Enzymen bei der einfachen Penetration aggressiver,
niedermolekularer Vernetzungsmittel wie beispielsweise Glutaraldehyd auch bei sehr
niedrigen Konzentrationen im intracellulären Raum rasch eine irreversible Inaktivierung
der Enzyme eintritt, wodurch bei einigen empfindlichen Enzymen eine erhebliche Verringerung
des enzymatischen Wirkungsgrads, wahrscheinlich durch kovalente Bindungen und dadurch
hervorgerufene Änderungen der Raumstruktur der aktiven Stelle der Enzyme, die nicht
wieder in die ursprüngliche natürliche Konformation zurückgeführt werden kann, resultiert.
Dieser Umstand wurde vor allem bei einigen Produktionszellen mit racemisierender
oder lytischer Aktivität festgestellt.
-
Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, celluläre
Biokatalysatoren und ein Verfahren zu ihrer Herstellung anzugeben, bei denen die
oben angegebenen Nachteile des Stands der Technik nicht auftreten.
-
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
-
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
-
Die erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren bestehen aus ganzen
unbeschädigten, enzymatisch aktiven, nativen oder ggf vorher permeabilisierten Zellen
oder deren Fragmenten und subcellulären Teilchen und/oder ganzen, individuell vernetzten
und permeabilisierten Zellen, die mit einem chemisch reaktiven wasserlöslichen Polymer
immobilisiert sind, das durch Umsetzung einer wasserlöslichen Substanz mit mindestens
zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül wie beispielsweise Polyethyleniminen,
Hexamethylendiamin, Lysin und Polylysin mit bifunktionellen Aldehyden wie beispielsweise
Glutaraldehyd erhalten ist, wobei die cellulären Biokatalysatoren anschließend ggf
weiter permeabilisiert und/oder mechanisch verfestigt sein können.
-
Die erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren enthalten als Zellmaterial
prokaryonte oder eukaryonte Zellen von Organismen und insbesondere grampositiven,
gramnegativen und gramlabilen Bakterien, säureresistenten Bakterien, Actinomyceten,
Hefen und anderen mikroskopischen Pilzen sowie höheren, vor allem parasitären Pilzen
und Pflanzenzellen, ggf auch deren Fragmente und subcelluläre Teilchen, die Enzymaktivität
tragen, insbesondere Hydrolasen, Isomerasen Lyasen, Decarboxylasen, Oxidoreductasen
und andere Enzyme
und/oder Teile von Enzymsequenzen oder gesamte
Enzymsequenzen von biochemischen Reaktionsfolgen, insbesondere des degradativen
Metabolismus, der Glycolyse, von Hormonbiotransformationen sowie Enzymen der Alkaloidproduktion,
insbesondere von Solanum-Alkaloiden und Phytosterinen sowie Mutterkorn-Alkaloiden.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Immobilisierung des
oben angegebenen Zellmaterials durch Inkontaktbringen mit einem in Wasser löslichen,
chemisch reaktiven Polymer, das durch Umsetzung einer wasserlöslichen Substanz mit
mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül, vorzugsweise
Polyethylenimin, mit Dialdehyden, vorzugsweise Glutaraldehyd, bei einer Temperatur
von 0 bis 60 °C in einem wässerigen Medium bei pH-Werten zwischen 4,0 und 12,0 erhalten
ist, wobei die Reaktion des Zellmaterials mit dem Polymer bei einer 0 Temperatur
von -30 bis +50 C in einem wässerigen Medium und bei pH-Werten zwischen 5,0 und
9,0, ggf in Anwesenheit von Flockungsreagentien, durchgeführt wird; die entstandenen
Zellaggregate werden nach Abtrennung aus dem Reaktionsgemisch mit Wasser oder Pufferlösung
gewaschen und können danach ggf permeabilisiert und/oder mechanisch verfestigt werden.
-
Es ist erfindungsgemaß vorteilhaft, zur Herstellung des wasserlöslichen
Polymers sowie zur eventuellen vorhergehenden Ausflockung des Zellmaterials eine
wässerige Lösung eines Polyethylenimins mit einem Molekulargewicht im Bereich von
100.000 bis 800.000 zu verwenden.
-
Die Umsetzung des Zellmaterials mit dem Polymer wird vorzugsweise
bei einer Temperatur von 0 bis 45 OC, einer relativen Zentrifugalkraft von 1 bis
50.000 g und/oder einem
Filtrationsdruck von 0 bis 50.000 kPa unter
Stehenlassen, langsamem Rühren oder Rühren mit Unterbrechungen und Stehenlassen
des Reaktionsgemischs durchgeführt.
-
Die Permeabilisierung der nativen Zellen vor der Immobilisierung
oder der erhaltenen Zellaggregate nach der Immobilisierung kann durch Rühren der
entsprechenden Suspension des Zellmaterials in einem wässerigen Medium 0 bei Temperaturen
von 0 bis 70 C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0 in Gegenwart eines Tensids und/oder
organischen, mit Wasser mischbaren und/oder nicht-mischbaren Lösungsmitteln durchgeführt
werden, insbesondere mit Aceton, Ether, Isopropanol, Petrolether, Butylacetat, Chloroform,
Dioxan, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, wobei ggf gleichzeitig oder anschließend
die Ionenstärke der Suspension durch Zugabe von Salzen starker Säuren und/ oder
Alkalien geändert wird.
-
Die Teilchen der immobilisierten Zellen werden ggf durch teilweise
Dehydratation durch Einwirkung organischer Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, sowie
ggf mit Lösungen von Klebemitteln in organischen Lösungsmitteln oder deren Gemischen
mit Wasser bei Temperaturen von -25 bis +20 OC weiter mechanisch verfestigt; die
entstandenen Teilchen können ferner abgesaugt und in einem trockenen oder feuchten
Medium teilweise getrocknet sowie ggf in geeigneter Weise nachgeformt werden.
-
Die erfindungsgemäß erzielten Vorteile liegen wesentlich darin, daß
mit Hilfe des chemisch reaktiven, wasserlöslichen Polymers (im folgenden kurz als
reaktives Polymer bezeichnet) celluläre Biokatalysatoren mit
immobilisierten
Zellen mit hoher spezifischer Aktivität, guten Sedimentationseigenschaften und hoher
Immobilisierungsausbeute zugänglich sind, und zwar auch in Fällen hochempfindlicher
Enzyme, in denen nicht gemäß den dS-Urheberscheinen 197 101, 203 607 und 209 265
verfahren werden kann, da im Gegensatz zu diesen bekannten Verfahrensweisen, bei
denen freie, niedermolekulare Vernetzungsmittel angewandt werden, das reaktive Polymer
im erfindungsgemäßen Fall zwar in Wasser löslich ist, jedoch bereits ein so hohes
Molekulargewicht besitzt, daß es nicht mehr in die Zellen penetrieren kann und eine
kovalente Bindung zwischen der Zellenoberfläche und reaktiven Aldehydgruppen des
aktivierten reaktiven Polymers unter Immobilisierung erzielt wird.
-
Der eigentliche Mechanismus der Bildung chemisch reaktiver und in
Wasser löslicher Polymerer, beispielsweise unter Verwendung von Polyethylenimin
und bifunktionellen Vernetzungsreagentien und insbesondere Glutaraldehyd, beruht
wahrscheinlich auf der internen Vernetzung der Fraktionen des Polyethylenimins unter
bevorzugter Bildung farbiger Schiffscher Basen durch Reaktion der Aldehydgruppen
des Glutaraldehyds mit primären oder sekundären Aminogruppen des Polyethylenimins
(C=N-Bindung), was zu einem Anstieg des Molekulargewichts dieser Fraktionen und
zur gleichzeitigen chemischen Aktivierung einiger primärer oder sekundärer Aminogruppen
führt, die in verzweigten und wahrscheinlich endständigen Ketten des Polyethylenimins
vorhanden sind, ferner durch Kettenübertragung auf reaktive Aldehydgruppen, wobei
das entstehende vernetzte, chemisch reaktive Polymer in einer wässerigen Lösung
gelöst bleibt und die resultierende Lösung des reaktiven Polymers eine klare, durchsichtige
gelbbraune bis rotbraune Flüssigkeit darstellt.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt prinzipiell zwei Verfahrensschritte:
In einem ersten Schritt wird das chemisch reaktive, wasserlösliche Polymer vorzugsweise
durch Umsetzung handelsüblicher Flockungsmittel mit einem Gehalt einer Fraktion
von Polyethylenimin, wie sie zur Abwasserreinigung verwendet werden, beispielsweise
Sedipur KA oder Sedipur CL-930, mit einem bifunktionellen Vernetzungsmittel, insbesondere
Glutaraldehyd, in einem wasserhaltigen Medium und vorzugsweise unter Rühren des
Reaktionsgemischs hergestellt. Die Geschwindigkeit der Polyreaktion kann zB anhand
der Konzentrationszunahme der farbigen Schiffschen Basen im sichtbaren Spektralgebiet,
beispielsweise bei 550 nm, durch die Änderung der Absorption ermittelt werden, wobei
die Konzentration vor allem vom Verhältnis der beiden Reaktionskomponenten, also
dem Vernetzungsmittel und der damit umgesetzten Verbindung, sowie der Reaktionsdauer
und der Reaktionstemperatur abhängig ist. Die Reaktion kann hierbei kinetisch durch
ein Zeitgesetz erster Ordnung beschrieben werden.
-
In der zweiten Reaktionsstufe werden in die teilweise oder quantitativ
umgesetzte Lösung des reaktiven Polymers native, frische, vorher vom Kultivierungsmedium
abgetrennte mikrobielle oder pflanzliche Zellen mit der gewünschten Enzymaktivität
und/oder vernetzte und permeabilisierte Zellen in Fällen, wenn die Empfindlichkeit
des betreffenden Enzyms die vorhergehende Anwendung einer freien Lösung des Vernetzungsmittels
ermöglicht, und ggf Gemische ganzer nativer Zellen und des integrierter Zellen in
Form einer Suspension mit den Zelldesintegrationsfragmenten eingemischt, wobei Größe,
Form, Art, Porosität und spezifische Aktivität der immobilisierten Zellmaterialien
durch das angewandte Immobilisationsverfahren,
insbesondere Tiefkühlung,
Stehenlassen, schwaches Rühren, Einwirkung eines Filtrationsdrucks, eines Zentrifugalfeldes,
Auspressen der Suspension oder der entstandenen Teilchen durch geeignete Einrichtungen
und anschließende partielle Trocknung der Teilchen in einem trockenen oder feuchten
Medium, eingestellt werden können.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt ferner auch die Permeabilisation
der Zellen vor der Immobilisierung bzw der entstandenen Zellaggregate nach der Immobilisierung
sowie ggf angeschlossene weitere Verfahrensschritte insbesondere in den Fällen,
in denen als Ausgangsmaterial ganze native Zellen eingesetzt wurden, wobei ggf die
erhaltenen immobilisierten Teilchen zur Erhöhung ihrer mechanischen Stabilität und
Festigkeit einer Nachbehandlung unterzogen werden können, insbesondere durch teilweise
Dehydratation der Teilchen durch Behandlung mit Aceton oder anderen organischen
Lösungsmitteln, die nach der teilweisen Eintrocknung eine schützende Mikroschicht
eines wasserunlöslichen Films auf der Oberfläche der Teilchen bilden; hierbei werden
die Nachbehandlungsbedingungen im Hinblick auf die Limitierung der enzymatischen
Reaktionsgeschwindigkeit durch Diffusion individuell gewählt.
-
Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren können
prinzipiell nicht nur verschiedene Arten und Stämme prokaryonter und eukaryonter
mikrobieller Zellen mit verschiedener Enzymaktivität, sondern auch Pflanzenzellen,
und zwar mikrobielle wie auch eigentliche pflanzliche Zellen, verwendet werden ohne
Rücksicht darauf, ob die Enzyme mit der gewünschten Enzymaktivität im periplasmatischen
oder intracellulären Raum (im Cytoplasma der Zelle) lokalisiert sind.
-
Das Erfindungskonzept ist entsprechend in sehr breitem Rahmen anwendbar,
wie aus den Ausführungsbeispielen hervorgeht, wobei die Art des Enzyms bzw der Typ
der angestrebten enzymkatalysierten biochemischen Reaktion nicht prinzipiell entscheidend
ist. Für einen gegebenen Typ prokaryonter oder eukaryonter Zellen ist es im Hinblick
auf die Lokalisation des angestrebten Enzyms in der Zelle und die Qualität des Enzyms
bzw den Typ der enzymkatalysierten biochemischen Reaktion und die bekannte oder
vorausgesetzte chemische Zusammensetzung der Zelloberfläche (Peptidoglucan, Lipoprotein,
Lipopolysaccharid, Chitin, Chitosan udgl) erforderlich, die Verfahrensweise der
Immobilisierung beispielsweise unter Tiefkühlung, Stehenlassen, Rühren ect und vor
allem die Verfahrensweise bei der Permeabilisation der Zellen vor und/oder nach
ihrer Bindung in geeigneter Weise speziell zu wählen, insbesondere, wenn als Ausgangsmaterial
für die Immobilisierung frische, unbeschädigte, native lebende Zellen eingesetzt
werden.
-
Die eigentliche erfindungsgemäße Immobilisierung ist ferner auch
im Hinblick auf die vorausgesetzte Häufigkeit und Zugänglichkeit reaktiver Gruppen,
die Bestandteile der Zelloberfläche sind und auch durch Art und physiologischen
Zustand der immobilisierten Zellpopulation bestimmt sind, zu wählen. In Fällen,
in denen bekannt oder vorausgesetzt ist, daß bei den eingesetzten Zellen die Häufiykeit
und Zugänglichkeit der reaktiven Gruppen auf der Zelloberfläche nur gering ist,
insbesondere bei pflanzlichen Zellen, kann die erfindungsgemäße Verfahrensweise
vorteilhaft mit einer vorhergehenden Flokkulation der nativen Zellsuspension mit
solchen Flockungsmitteln kombiniert werden, die Verbindungen mit
mindestens
zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen enthalten; auf diese Weise werden
zuvor physikalisch-chemisch gebildete Aggregate entweder nach Absaugen oder direkt
in die Lösung des reaktiven Polymers eingemischt, womit einerseits der wechselseitige
Kontakt der Zellen miteinander erleichtert und andererseits die Zelloberfläche an
in die Reaktion eintretenden Gruppen angereichert wird.
-
Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren können
Produktionszellen verwendet werden, die verschiedene Enzyme enthalten, und zwar
verschiedene Arten und Stämme von Bakterien, Actinomyceten, Hefen, Fungi imperfecti,
höheren parasitischen Pilzen und Pflanzenzellen. Dabei ist es ferner vorteilhaft,
für die Immobilisierung solche Zellen zu verwenden, die durch Züchtung, Selektion,
Konzentrierungsverfahren oder genetische Manipulation gewonnene mutante Organismen
darstellen, da dann die gewonnenen immobilisierten Präparate eine hohe spezifische
Aktivität aufweisen.
-
Die Größe der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Teilchen
aus gebundenen Zellen wurde lichtmikroskopisch mit einem speziellen Meßokular ermittelt.
-
Einige Präparate wurden ferner rasterelektronenmikroskopisch untersucht.
Die Sedimentationseigenschaften wurden in der Weise ermittelt, daß 2,5 g nasse Präparatmasse
in insgesamt 25 ml entmineralisiertem Wasser in einem Meßzylinder suspendiert wurden
und die zur quantitativen Sedimentation der Teilchen erforderliche Zeit ermittelt
wurde. Zur Ermittlung der Teilchengröße wurden ferner metallische Siebe zur Siebanalyse
herangezogen, wobei die gebundenen Zellen je nach Größe mit drei Sätzen dieser Prüfsiebe
mit Maschenweiten von 0,03 bis 2,00 mm fraktioniert
wurden.
-
Die enzymatische Aktivität der immobilisierten Materialien wurde
unter Rühren und Temperierung einer definierten Menge der Teilchen der gebundenen
Zellen in einer Substratlösung im Gebiet der Kinetik Nullter Ordnung der Enzymreaktion
ermittelt, wobei die Enzymaktivität in Form der spezifischen Aktivität als Menge
,umol Produkt(e) pro mg bzw g nasse Präparatmasse in den Beispielen angegeben ist,
sofern nichts anderes erwähnt ist. Die Erhaltung der gesamten Enzymreaktionssequenz
in den immobilisierten Zellen wurde manometrisch (die anhand der Gesamtproduktion
von CO zu während einer festgesetzten Zeit aus Saccharose gebildet wurde, bestimmt.
-
Im Fall der Produktion verschiedener Alkaloide, insbesondere Solanum-Alkaloiden
und Phytosterinen, wurden diese Stoffe durch HPLC-Chromatographie bestimmt.
-
Die erhaltenen Teilchen der erfindungsgemäßen cellulären Biokatalysatoren
aus immobilisierten Zellen können nach ggf erfolgter mechanischer Verfestigung durch
teilweise Dehydratation durch Einwirkung organischer Lösungsmittel, vorzugsweise
von Aceton, ggf mit Lösungen handelsüblicher Klebstoffe in organischen Lösungsmitteln
nach Absaugen und partieller Trocknung unter trockenen oder feuchten Bedingungen
in geeigneter Weise nachgeformt werden, wodurch Größe, Form, Art, Porosität, spezifische
Aktivität und Sedimentationseigenschaften der immobilisierten Materialien eingestellt
werden können.
-
In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen sind als Substanzen mit
mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül die handelsüblichen
Flockungsmittel Sedipur CL-930 bzw Sedipur-KA verwendet, die Polyethylenimine
mit
Molekulargewichten von 200.000 bis 300.000 in einer Konzentration von etwa 30 Gew.-%
enthalten.
-
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.
-
Beispiel 1 Es wurden je 100 ml einer Lösung von Sedipur CL-930 (BASF
AG) in entmineralisiertem Wasser mit einer Konzentration von 1,0 % (G/V) bzw 2,0
% (G/V) hergestellt. Die Lösungen wurden in 500-ml-Siedekolben umgegossen, die auf
eine Rotationsschüttelmaschine (260 U/min) gebracht wurden. In diese Lösungen, deren
pH 6,1 betrug, wurde eine 25 %ige wässerige Lösung von Glutaraldehyd in der Weise
zugegeben, daß seine Konzentration im Reaktionsgemisch im ersten Fall 0,5 Vol-%
und im zweiten Fall 1,0 Vol-% betrug. Die Kolben mit den Reaktionsgemischen wurden
mit einer Aluminiumfolie abgedeckt; nach Einschalten der Schüttelmaschine wurde
in vorgegebenen Zeitabständen die Polymerisationsgeschwindigkeit spektrophotometrisch
bei 550 nm verfolgt (Gerät Unicam SP-500, eckige Glasküvetten 10 x 10 mm). Die Reaktion
wurde unter ununterbrochenem Rühren bei einer Temperatur von 20 OC durchgeführt.
Die Absorptionswerte der einzelnen, zeitabhängig gezogenen Proben wurden gegen entmineralisiertes
Wasser gemessen. Die Ergebnisse, die den Konzentrationsanstieg der Schiffschen Basen
für beide Reaktionsgemische zeigen, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
-
Tabelle 1 1,0 % Sedipur + 0,5 z 2 % Sedipur + 1,0 z Reaktionsgemisch
Glutaraldehyd Glutaraldehyd Zeit (h) 0 0,5 0,8 0,15 0,25 0,81 0,30 0,36 0,75 1,0
0,54 1,05 (*) 2,0 0,60 1,20 3,0 0,64 1,26 4,0 0,68 1,28 5,0 0,70 (+) 1,32 6,0 0,72
1,36 7,0 0,75 1,40 24,0 0,90 1,60 (o) Diese Absorptionswerte wurden nach Verdünnung
der Proben mit entmineralisiertem Wasser berechnet, stellen also absolute Absorptionswerte
nach Umrechnung dar.
-
Nach 24 h Reaktionsdauer lagen rotbraun gefärbte Lösungen mit einem
pH-Wert von 4,9 vor.
-
In die in der oben angegebenen Weise hergestellten umgesetzten Lösungen
des reaktiven Polymers wurden unter intensivem Rühren jeweils 25 g (Naßgewicht)
ganze unbeschädigte Bakterienzellen von Alcaligenes metalcaligenes in Form einer
nicht gewaschenen nassen Zellpaste mit Aspartatammoniak-Lyaseaktivität eingemischt,
die durch Zentrifugieren nach der Kultivierung gewonnen war.
-
Die spezifische Aktivität der Zellen betrug 550 /umol
L-Asparaginsäure/min.g,
bezogen auf das Naßgewicht, bei 0 37 C, pH 8,5 und Verwendung einer 1,35 M Lösung
von Ammoniumfumarat als Substrat.
-
Nach dem Einmischen der Zellen in jedes der Reaktionsgemische wurden
die homogenen Suspensionen in zwei Aluminiumschalen mit einem Durchmesser von 20
cm umgegossen, wobei die Füllhöhe etwa 1,5 cm betrug, und danach 4 h bei -20 OC
in einer Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde der gefrorene Schaleninhalt mit etwa
100 ml entmineralisiertem Wasser übergossen, worauf die Schalen 1 h bei Raumtemperatur
langsam auftauen gelassen wurden.
-
Im Anschluß daran wurden die erhaltenen Aggregate in Glasgefäße umgegossen,
die 1 1 entmineralisiertes Wasser enthielten; nach langsamem Durchmischen und quantitativer
Sedimentation nach Stehenlassen wurde das Waschwasser abgegossen und das erhaltene
Produkt noch dreimal mit 1 1 Leitungswasser dekantiert. Die erhaltenen Teilchen
wurden dann auf einer Fritte mit Textilauf lage im Vakuum gut abgenutscht und gewonnen.
Vom ersten Reaktionsgemisch wurden 16,0 g und vom zweiten Reaktionsgemisch 18,2
g immobilisierte Zellen (jeweils Naßgewichte) erhalten.
-
Die biochemische und weitere Charakterisierung der beiden immobilisierten
Materialien wurde wie oben erläutert durchgeführt; die erhaltenen Ergebnisse sind
in Tabelle 2 zusammengefaßt:
Tabelle 2
| Reaktsives Polymer 1 2 |
| spez. Aktivität |
| (umol L-Asparagin- |
| såure/min g) |
| (Naßgewicht) |
| Teilchengrößen- 100 - 450 300 - 600 |
| bereich (/um) |
| mikroskopisches Bild begrenzte begrenzte |
| Plättchen Plättchen |
| Sedimentation quantitativ quantitativ |
| in 10 min in 5 min |
Beispiel 2 Es wurde eine Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 1 hergestellt
(Anfangskonzentrationen 2,0 % Sedipur CL-930 und 1,0 % Glutaraldehyd).
-
In 100 ml der Lösung des reaktiven Polymers wurden 25 g Bakterienzellen
wie in Beispiel 1 intensiv eingemischt; anschließend wurde wie in Beispiel 1 verfahren.
-
Es wurden 17,2 g (Naßgewicht) gut abgesaugte Aggregate mit einer
spezifischen Aktivität von 512 /umol L-Asparaginsäure/min g gewonnen.
-
Das erhaltene Material wurde in 50 ml einer 5 %igen Lösung von Kanagon
in Aceton, die vorher auf -20 OC abgekühlt wurde, suspendiert; nach 3 min Rühren
bei Raumtemperatur wurde das Material in der oben angegebenen Weise im Vakuum scharf
abgesaugt und noch etwa 15 min auf der
Fritte weiter abgesaugt,
um eine teilweise Trocknung des Klebemittels auf der Oberfläche der einzelnen Teilchen
zu erzielen.
-
Danach wurden 10,5 g Material abgewogen und in 100 ml einer 1,35
M Lösung von Ammoniumfumarat mit pH 8,5 suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur
bei +8 OC gelagert. Nach erneutem Absaugen im Vakuum wurde das Material auf der
Fritte mit 1 1 Wasser gewaschen und nach gutem Absaugen gewogen (13,0 g).
-
Die spezifische Aktivität des Materials betrug 180 umol L-Asparaginsäure/min-g
(Naßgewicht). Das Material bestand aus festen, rauhen, begrenzten Plättchen mit
einer Teilchengröße im Bereich von 400 bis 600 /um. Nach 2 min Stehenlassen lag
quantitative Sedimentation vor.
-
Beispiel 3 Es wurde eine Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel
1 und 2 hergestellt mit dem Unterschied, daß unter sonst identischen Bedingungen
die Reaktionsdauer 3 h betrug.
-
In 100 ml dieser Lösung des reaktiven Polymers wurden 25 g Bakterienzellen
wie in Beispiel 1 und 2 eingemischt; anschließend wurde zur Herstellung der immobilisierten
Zellen wie in Beispiel 2 verfahren mit dem Unterschied, daß vor der Behandlung das
Material mit der Lösung des Klebemittels in Aceton die Aggregate durch 3 h Rühren
auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 260 U/min bei 30 OC in 100 ml einer L,0
M wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat mit pH 8,5 und d einem Gehalt von 0,1 % eines
Tensids (Slovafol 909) permeabilisiert wurden. Anschließend wurde das Material in
der oben angegebenen Weise im Vakuum gut abgesaugt, mit 1 1 Wasser gewaschen, erneut
abgesaugt, gewogen (16,0 g) und dann wie in Beispiel 2 weiterbehandelt.
-
Es wurden 10 g immobiliserte Zellen (Naßgewicht) mit einer spezifischen
Aktivität von 250 pmol L-Asparaginsäure/min-g (Naßgewicht) gewonnen; das Material
bestand aus festen, rauhen, begrenzten Plättchen mit einer mittleren Teilchengröße
von 300 bis 550 um; durch 3 min Stehenlassen trat quantitative Sedimentation ein.
-
Beispiel 4 300 y einer frischen nassen Paste aus nativen ganzen Bakterienzellen
von Escherichia coli, die nach der Kultivierung durch Zentrifugieren abgetrennt
worden waren und eine spezifische Aktivität an Penicillinacylase von 8,0 pmol 6-APK/h-mg
(Naßgewicht) (42 OC, pH 7,6, Substrat Kaliumsalz von Benzylpenici ilin) aufwiesen,
wurden in 1 1 einer Lösung
eines reaktiven Polymers, das durch
Umsetzung einer 2-%igen Lösung von Sedipur KA und einer 1-%igen Lösung Glutaraldehyd
bei 30 QC während einer Reaktionsdauer von 24 h nach der Verfahrensweise von Beispiel
1 hergestellt worden war, in Form einer homogenen Suspension durch intensives Rühren
mit einem Stahipropellermischer suspendiert. Die Suspension wurde anschließend in
vier etwa gleiche Volumteile (zu 320 ml) aufgeteilt; jeder Teil wurde separat in
Igelitsäcke eingebracht, die mehrfach umgefalzt und mit Metaliklammern verschlossen
wurden; die Säcke wurden in horizontaler Lage in einer Tiefkühlbox bei -20 bis -25
°C etwa 5 h gelagert, wobei die Schichtdicke des Reaktionsgemischs bei der horizontalen
Lagerung der Säcke etwa 1,5 bis 2 cm betrug.
-
Nach dieser Zeit wurden die Säcke aus der Tiefkühlbox entnommen;
der gefrorene Inhalt wurde in den Säcken mechanisch zerkleinert; die Säcke wurden
anschließend zerschnitten und ihr Inhalt in 10 1 vorgelegtes, entmineralisiertes,
25 OC warmes Wasser in einem Glasgefäß eingebracht. Das Material wurde dann während
1 bis 2 h durch mildes, unterbrochenes Rühren aufgetaut, nach quantitativer Sedimentation
der gebildeten Teilchen vom Waschwasser abdekantiert und danach noch dreimal mit
5 1 Leitungswasser dekantiert. Anschließend wurden die Aggregate auf einer Nutsche
mit Textilbelag im Vakuum scharf abgesaugt, auf der Nutsche noch mit 5 1 Leitungswasser
gewaschen und danach in Form des nassen Filterkuchens nochmals gut abgesaugt.
-
215 g der nassen Präparatmasse des gut abgesaugten Materials wurden
dann unter Rühren in 500 ml eines zuvor auf -15 OC abgekühlten Aceton-Wasser-Gemischs
(1:1) suspendiert und 3 min bei Raumtemperatur in verdünntem Aceton intensiv durchgemischt;
danach wurde das Material scharf im Vakuum abgesaugt, noch 5 bis 10 min auf der
Nutsche durchgesaugt und anschließend mit etwa 5 1 Leitungswasser gewaschen, erneut
gut abgesaugt, in 1 1 0,05 M Phosphatpuffer mit pH 7,6 suspendiert
und
über Nacht bei +8 OC quellen gelassen.
-
Insgesamt wurden 180 g immobilisierte Zellen (Naßgewicht) mit einer
spezifischen Aktivität an Peni ci lli nacylase von 6,5 umol 6-APK/h-mg (Naßgewicht)
gewonnen; das Material bestand aus begrenzten Plättchen mit einer Teilchengröße
im Bereich von 150 bis 450 um; durch 5 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation
erzielt.
-
Beispiel 5 250 g (Naßgewicht) vernetzte und permeabilisierte Bakterienzellen
von Escherichia coli mit Peni ci iii nacylaseakti vi tät (spezifische Aktivität
7,0 pmol 6-APK/h-mg (Naßgewicht)), die gemäß dem Verfahren des CS-Urheberscheins
203 607 vernetzt und permeabilisiert worden waren, wurden in 1 1 einer Lösung eines
reaktiven Polymers eingemischt, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden war mit
dem Unterschied, daß die Reaktionsdauer 5 h betrug.
-
Nach dem Vermischen der Zellen in der Lösung des reaktiven Polymers
zu einer homogenen Suspension wurde die Immobilisierung der Zellen gemäß Beispiel
4 einschließlich der Behandlung des Materials mit dem Aceton-Wasser-Gemisch vorgenommen.
-
Es wurden insgesamt 166 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit
Peni ci lli nacylaseakti vi tät erhalten, deren spezifische Akti vi -tät 6,0 umol
6-APK/h-mg (Naßgewicht) betrug; das Material bestand aus begrenzten braunschwarzen
Plättchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 180 bis 400 um; durch 3 min Stehenlassen
wurde quantitative Sedimentation erzielt.
-
Beispiel 6 40,0 g (Naßgewicht) frische native Zellen von Escherichia
coli mit Penicillinacylaseaktivität gemäß Beispiel 4 wurden in
150
ml einer wie in Beispiel 4 hergestellten Lösung eines reaktiven Polymers homogen
suspendiert; das Gemisch wurde auf 10 ml/Polyethylenküvetten verteilt. Die Bildung
von Aggregatteilchen der immobilisierten Zellen wurde durch die Einwirkung unterschiedlicher
relativer Zentrifugalkräfte beeinflußt. Die Reaktion wurde 3 h bei 20 OC durchgeführt.
Nach der Reaktion wurden die Präparate zweimal mit Wasser dekantiert, -über Textilmaterial
im Vakuum abgesaugt und wie in Beispiel 4 mit einem Aceton Wasser-Gemisch behandelt
und über Nacht quellen gelassen.
-
Anschließend wurden die Präparate wieder im Vakuum abgesaugt, abgewogen
und weiter charakterisiert.
-
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
-
Tabelle 3
| Relative Zentrifugalkraft 600 1100 4500 10200 |
| (g) |
| Mittlere Teilchengröße der 0,2 - 0,45 0,4-0,85 0,55-1,20,8-2,0 |
| Teilchen (mm) |
| Sedimentationsgeschwindig- 5 3 1 1 |
| keit der Teilchen (min/l.kg |
| Spezifische [\ktivität |
| (umol 6-APK/h.mg (Naßge- |
| wjcht)) |
| Mjkroskopjsches Bjld unbegrenzte Formen mjt unregel- |
| mäjgen Rändern |
| i Makroskopisches Bild braune amorphe Teilchen |
Anmerkung: Die Bewertung der immobilisierten Präparate erfolgte wie oben beschrieben.
-
Beispiel 7 28 g (Naßgewicht) einer frischen Paste von nativen Zellen
von Escherichia coli, die das Enzym Galactosidase enthielten, wurden in 100 ml einer
Lösung eines reaktiven Polymers intensiv suspendiert, das durch 24 h Umsetzung gemäß
Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied erhalten worden war, daß die anfängliche
Konzentration der beiden Reaktionskomponenten 5 % (G/V) Sedipur CL-930 bzw 2,8 Vol-%
Glutaraldehyd betrug Die spezifische Aktivitätsder frischen nativen Zellen in der
Paste betrug 0,42 umol Glucose + Galactose/min-g (Naßgewicht) der Nativzellen (37
OC, pH 7,0, Lösung von Lactose als Substrat).
-
Die homogene Zellsuspension wurde durch 2 h Stehenlassen bei Raumtemperatur
umgesetzt. Danach wurde das entstandene schwammige Präzipitat der Zellaggregate
in der in den obigen Beispielen beschriebenen Weise im Vakuum abgesaugt und die
erhaltene Masse in Form eines nassen Kuchens in einen Gewebebeutel (Kalolisgewebe)
eingebracht; die Öffnung des Beutels wurde umgefalzt und mit Metallklammern verschlossen;
der Beutel wurde in horizontaler Lage zwischen Metallplatten eingebracht und mit
einer hydraulischen Presse bei Raumtemperatur 2 h lang einem Filtrationsdruck von
1,25 104 kPa ausgesetzt. Danach wurde die dunkle, feste Masse in Form einer Platte
mechanisch durch Zerbrechen zu kleineren Stücken zerkleinert, die in 100 ml in einem
Haushaltsmixer vorgelegtes Wasser eingetragen und darin bei der niedrigsten Drehzahl
und unterbrochenem Einschalten zu kleineren Teilchen desintegriert wurden.
-
Nach der Desintegration und Homogenisation wurde das Material dreimal
mit 0,5 1 Wasser dekantiert, im Vakuum gut abgesaugt, gewogen (16,2 g) und in 100
ml einer 1 M NaCl-Lösung eingebracht, die 0,2 % Tensid (Slovafol 910) und 1 % Dimethylsulfoxid
enthielt.
-
Die Suspension wurde auf 40 OC temperiert und 3 h bei dieser Temperatur
ununterbrochen gerührt. Nach der Permeabilisation wurden die Teilchen dreimal mit
1 1 Leitungswasser dekantiert, in der oben angegebenen Weise im Vakuum gut abgesaugt,
dann in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 eingetragen und über Nacht quellen gelassen.
-
Nach Absaugen und Waschen der immobilisierten Zellen wurden insgesamt
30,2 g (Naßgewicht) unregelmäßige, dunkle, amorphe Teilchen in Form sehr schnell
sedimentierender Klumpen erhalten, deren spezifische Aktivität 0,12 umol Glucose
+ Galactose/min-g (Naßgewicht) betrug; die Teilchengröße lag im Bereich von 0,5
bis 2,6 mm.
-
Beispiel 8 30 g (Naßgewicht) native ganze Zellen von Escherichia coli
mit p-Galactosidaseaktivität wie in Beispiel 7 wurden in 100 ml 0,5 M NaCl-Lösung
eingebracht, die 0,5 % Tensid (Slovafol 910) enthielt; die Suspension wurde durch
intensives Rühren gründlich homogenisiert und anschließend in einen 500-ml-Siedekolben
umgegossen, der mit einer Aluminiumfolie abgedeckt und auf eine Rotationsschüttelmaschine
mit 260 U/min gesetzt wurde. Die Suspension der nativen Zellen wurde 20 min unter
ununterbrochenem Rühren bei einer Temperatur von 30 OC permeabilisiert. Die Zellen
wurden anschließend bei 20000 g 10 min zentrifugiert; der Überstand wurde zusammengegossen;
das Sediment der Zellpaste wurde gewogen.
-
26 g (Naßgewicht) der in der angegebenen Art behandelten Zellen wurden
in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers, die wie in Beispiel 2 hergestellt
worden war, zu einer homogenen Suspension suspendiert; die Immobilisierung der Zellen
wurde durch Tiefkühlung des Reaktionsgemischs sowie Behandlung der
entstandenen
Teilchen nach der Immobilisierung wie in Beispiel 2 vorgenommen mit dem Unterschied,
daß 17 g (Naßgewicht) der entstandenen Teilchen in 50 ml vorher auf -20 OC abgekühltem
reinem Aceton suspendiert wurden und die Behandlung mit Aceton bei intensivem Rühren
3 min lang vorgenommen wurde, worauf das Material schnell und scharf auf einer Fritte
im Vakuum abgesaugt, mit Wasser gewaschen und über Nacht in einem Medium von 0,1
M Phosphatpuffer pH 7,0 bei +8 OC quellen gelassen wurde.
-
Insgesamt wurden 12,6 g (Naßgewicht) Masse der immobilisierten Zellen
mit einer spezifischen Aktivität an ,ß-Galactosidase von 0,38 umol Glucose + Galactose/min.g
(Naßgewicht) erhalten; die Teilchengröße betrug 85 bis 400 um.
-
Das Material bestand aus Plättchen mit unregelmäßigen Rändern; durch
5 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.
-
Beispiel 9 2,5 kg (Naßgewicht) frische native Zellen von Bacillus
megatherium, die vor Beendigung der exponentiellen Wachstumsphase geerntet worden
waren und eine proteolytische Aktivität von 38 Azocaseineinheiten/g (Naßgewicht)
(37 OC, pH 7,5, Substrat Azocasein) aufwiesen, wurden in 10 1 entmineralisiertem
Wasser suspendiert; die Suspension wurde durch intensives Rühren homogensiert und
auf +5 OC abgekühlt. Die Suspension wurde anschließend durch dreifachen Durchgang
durch einen mechanischen Schlitzdesintegrator bei einem Druck von 253 bar (250 atm)
desintegriert. Die Suspension wurde zwischen den einzelnen Desintegrationsschritten
laufend so gekühlt, daß eine maximale Temperatur des desintegrierten Gemischs von
35 OC nicht überschritten wurde.
-
Zu 1 1 der desintegrierten Suspension der nativen Zellen, deren pH-Wert
mit 20-%iger NaOH-Lösung unter ununterbrochenem Rühren auf 7,5 geregelt wurde, wurde
Sedipur KA als Flockungsmittel in einer solchen Menge zugegeben, daß die Konzentration
in der desintegrierten Suspension 0,25 Vol-% betrug. Die Suspension wurde nach gründlichem
Mischen bei Raumtemperatur etwa 1 h ruhig stehengelassen, bis quantitative Ausflockung
des desintegrierten Zellmaterials festgestellt wurde.
-
Anschließend wurden zu 1 1 der Suspension 2 1 einer Lösung eines
reaktiven Polymers zugesetzt, die durch 24 h Umsetzung nach der Verfahrensweise
von Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt worden war, daß die anfängliche Konzentration
der beiden Reaktionskomponenten 4 YO (G/V) Sedipur KA und 2 Vol-% Glutaraldehyd
betrug. Das Einmischen der 2 1 Lösung des reaktiven Polymers wurde durch langsames
Rühren mit der Hand mit einem Stab aus rostfreiem Stahl in der Weise durchgeführt,
daß die vorher flokkulierten Teilchen nicht beschädigt wurden. Nach 2 h Stehenlassen
wurde die stark viskose ausgeflockte und teilweise abreagierte Suspension langsam
durchgemischt und auf 10 Polyethylensäcke von etwa 0,3 1 Inhalt verteilt; anschließend
wurde wie in Beispiel 4 weiter verfahren mit dem Unterschied, daß die immobilisierten
Teilchen nach der Immobilisierung mit reinem, zuvor auf -20 °C abgekühltem Aceton
3 min unter intensivem Rühren behandelt wurden, worauf sie im Vakuum scharf abgesaugt,
einige Male mit Wasser dekantiert und in 1 1 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5 eingebracht
wurden, in dem sie über Nacht bei +8 OC quellen gelassen wurden.
-
Insgesamt wurden durch die oben angegebene Verfahrensweise 1,28 kg
immobilisierte Teilchen (Naßgewicht) durch die stufenweise Bearbeitung der Ausgangssuspension
erhalten, wobei die spezifische Aktivität des Materials 3,62 Azocaseineinheiten/g
(Naßgewicht) betrug; die Teilchengröße lag im Bereich von 0,4 bis2Dmm; durch 2 min
Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.
-
Beispiel 10 In 100 ml einer 0,05 M wäßrigen NaCl-Lösung, deren pH-Wert
mit 20-%iger NaOFi-Lösung auf 7,0 geregelt wurde, wurden 50 g (Naßgewicht) frische,
ganze native Zellen von Bacillus megatherium mit proteolytischer Aktivität wie in
Beispiel 9 suspendiert. Nach der Homogenisierung der Suspension wurde der pH-Wert
erneut in del oben angegebenen Weise auf den Wert 7,0 geregelt; anschließend wurde
lyophilisiertes Eierlysozym in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration in der
Suspension 100 um/l00 ml betrug; nach 30 min Stehenlassen wurde der pH-Wert der
Suspension vorsichtig mit der NaOH-Lösung unter Rühren auf 8,6 eingestellt und die
Suspension einige min auf 50 °C erwärmt, bis sich aufgrund der enzymatischen Lyse
der Zellwände die Viskosität der Suspension plötzlich veränderte.
-
Im Anschluß daran wurden zu der Suspension ohne vorhergehende Flokkulatjon
100 ml der Lösung des reaktiven Polymers mit ei ner Konzentration der Reakti onskomponenten
gemäß Beispiel 9 zugegeben, worauf die Suspension intensiv gemischt wurde. Danach
wurde zur Immobilisierung einschließlich der Behandlung der Teilchen mit Aceton
nach der Immobilisierung gemäß Beispiel 8 (Tiefkühlung des Reaktionsgemischs) verfahren.
-
Es wurden 30 g (Naßgewicht) immobilisierte Teilchen gewonnen, deren
spezifische Aktivität 2,4 Azocaseineinheiten/g (Naßgewicht) betrug; die Teilchengröße
lag im Bereich von 0,2 bis 1,0 mm; 3 min Stehenlassen führte zur quantitativen Sedimentation.
-
Beispiel 11 30 g (Naßgewicht) einer frischen nativen Paste von Zellen
der
Hefe Kluyveromyces fragilis, die das Enzym p-Galactosidase mit einer spezifischen
Aktivität von 0,017 umol Glucose + Galactose/min-g (Naßgewicht) (3/ OC, pH 6,0,
Substrat Lactose) enthielten, wurden in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert,
der 0,1 % Tensid (Slovafol 910) und 1 % Dimethylsulfoxid enthielt; nach Erwärmen
auf 40 OC wurde die Suspension bei dieser Temperatur ununterbrochen 30 min gerührt.
Danach wurden die permeabilisierten Zellen zentrifugiert (500 g, 10 min); nach Abgießen
des Uberstands wurde das Sediment der Zellpaste gewogen.
-
25 g (Naßgewicht) der in dieser Weise permeabilisierten Zellen wurden
wie in Beispiel 8 immobilisiert und weiterbehandelt mit dem Unterschied, daß die
Teilchen nach der Immobilisierung mit einer 1-%igen Lösung von Kanagon in Aceton
unter sonst identischen Bedingungen wie in Beispiel 8 behandelt und gequollen wurden.
-
Es wurden 15 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen
Aktivität von 0,02 umol Glucose + Galactose/min.mg (Naßgewicht) der Teilchen gewonnen;
die Teilchengröße lag im Bereich von 0,2 bis 1,5 mm; durch 2 min Stehenlassen sedimentierten
die watteartigen Aggregate quantitativ zu einem relativ umfangrei chen Sediment.
-
Beispiel 12 25 g (Naßgewicht) frische ganze Zellen der Hefe Cryptococcus
laurenti i mit L- a -Ami no- e - anj nocaprolactamhydrolaseakti vi tät mit einer
spezifischen Aktivität von 5,9 umso1 L-Lysin/h.mg (Naßgewicht) (37 OC, pH 7,5, Substrat
wäßriges - L-oC-Amino-6-caprolactam) wurden unter intensivem Rühren in 100 ml einer
Lösung eines reaktiven Polymers, die wie in Beispiel 2 hergestellt
war,
suspendiert; nach langsamem Rühren während 1 h wurde die stark viskose watteartige
Suspension wie in Beispiel 2 durch Tiefkühlen einschließlich Behandlung der Aggregate
nach der Immobilisierung durch Behandlung mit einem in Aceton gelösten Klebstoff
verfestigt. Die erhaltenen abgesaugten Aggregate wurden über Nacht in Phosphatpuffer
pH 7,0 bei +8 °C quellen gelassen.
-
Es wurden 15 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen
Aktivität von 3,2 umol L-Lysin/h.mg (Naßgewicht) mit einer Teilchengröße im Bereich
von 0,125 bis 1,5 mm gewonnen; durch 2 min Stehen wurde quantitative Sedimentation
erzielt. Makroskopisch hatte das Material amorphes, watteartiges Aussehen; die mikroskopische
Untersuchung ergab unregelmäßig geformte Teilchen mit unregelmäßigen Rändern.
-
Beispiel 13 30 g (Naßgewicht) einer Paste aus frischen nativen Zellen
von Mycobacterium sp., die das Enzym L-Asparaginsäuredecarboxylase mit einer spezifischen
Aktivität von 7,1 E/g (Naßgewicht) enthielten (1 Einheit E der Enzymwirksamkeit
entspricht der Enzymmenge, die 100 u1 C02 bei 30 °C und pH 5,5 während 5 min aus
L-Asparaginsäure freisetzt), wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers
wie in Beispiel 2 zu einer homogenen Suspension suspendiert; anschließend wurde
durch Tiefkühlung des Reaktionsgemischs einschließlich Dekantation, Waschen und
Absaugen wie in Beispiel 2 weiter verfahren.
-
Es wurden 19,6 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen gewonnen.
-
Diese Teilchenmenge wurde i n 100 ml 1 M NaC1-Lösung mit
pH
6,5 suspendiert, in der 0,5 % Tensid (Slovafol 910) gelöst war. In diese Suspension
wurde Chloroform zu einer Konzentration von 5 Vol-% zugegeben; die Suspension wurde
dann unter Rühren auf 35 OC erwärmt und bei dieser Temperatur 1 h intensiv gerührt.
Anschließend wurde die Suspension mit 1 1 Wasser verdünnt und dreimal mit 1 1 Wasser
dekantiert; die permeabilisierten Teilchen wurden auf die in den obigen Beispielen
beschriebene Weise im Vakuum abgesaugt, nach dem Absaugen in 50 ml zuvor auf -25
OC abgekühltem Aceton suspendiert und 3 min bei Raumtemperatur intensiv gerührt.
Danach wurden die Teilchen erneut abgesaugt, auf der Fritte gründlich mit Wasser
gewaschen, in 50 ml 0,05 M Acetatpuffer mit pH 6,0 suspendiert und zur Quellung
über Nacht bei +8 OC stehengelassen.
-
Es wurden 14,2 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen
Aktivität von 4,0 E/g (Naßgewicht) gewonnen.
-
Die Teilchengröße Lag im Bereich von 75 bis 800 um; bei makroskopischer
Beurteilung bildeten die Teilchen graugelbe watteartige Gebilde mit schlecht benetzbarer
Oberfläche.
-
Die immobilisierten Zellen zeigten eine schlechte spontane Sedimentation,
dh hielten sich im oberen Teil der Flüssigkeit im Auftrieb; sie konnten jedoch leicht
filtriert und abgesaugt werden.
-
Beispiel 14 30 g (Naßgewicht) frischer nativer Zellen von Bacterium
cadaveris, die das Enzym L-Lysindecarboxylase mit einer spezifischen Aktivität von
16,4 E/g (Naßgewicht) enthielten (1 Einheit E der Enzymaktivität entspricht derjenigen
Enzymmenge, die 100 u1 C02 bei 30 OC und pH 5,5 aus L-Lysin freisetzt), wurden in
100 ml Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 2 zu einer homogenen Suspension
suspendiert; danach wurde
durch Tiefkühlung einschließlich Dekantation,
Waschen und Absaugen wie in Beispiel 2 weiter verfahren.
-
Es wurden 24 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen gewonnen.
-
Diese Menge der abgesaugten Teilchen wurde in 100 ml 1 M NaCl-Lösung
mit pH 6,5 suspendiert, die 0,1 % Tensid (Slovafol 909) enthielt; die Suspension
wurde bei 37 °C 1 h ununterbrochen gerührt.
-
Die weitere Behandlung der immobilisierten und permeabilisierten
Zellen geschah wie in Beispiel 13.
-
Es wurden 19,1 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen
Aktivität von 11,8 E/g (Naßgewicht) mit einer Teilchengröße im Bereich von 180 bis
600 um gewonnen; die Teilchen erschienen makroskopisch als amorphe, braune Partikel;
die mikroskopische Untersuchung ergab Teilchen in Form begrenzter Plättchen; durch
3 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.
-
Beispiel 15 20 g (Naßgewicht) einer Paste aus frischen nativen Zellen
der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die das Enzym Invertase mit einer spezifischen
Aktivität von 148 E/g (Naßgewicht) (30 OC, pH 4,75, Substrat Saccharose) enthielten,
wurden in 100 ml Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 2 zu einer homogenen
Suspension suspendiert; die weitere Immobilisierung mit Tiefkühlung einschließlich
der weiteren Verfahrensschritte geschah wie in Beispiel 2. Die Behandlung der Zellen
mit Aceton wurde wie in Beispiel 8 durchgeführt.
-
Es wurden 12,1 g (Naßgewicht) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen
Aktivität von 90 E/g (Naßgewicht) mit einer Teilchengröße im Bereich von 0,32 bis
2,0 mm gewonnen; die Teilchen bildeten makroskopisch hellbraune bis beige amorphe
Partikel; die mikroskopische Untersuchung ergab unbegrenzte Formationen von Teilchen
mit unregelmäßiger Morphologie und zerrissenen Rändern; durch 2 min Stehenlassen
wurde quantitative Sedimentation erzielt.
-
Bei spiel 16 1 1 Nährboden, der submers kultiviert worden war und
eine frische Kultur der Hefe Saccharomyces coreanus enthielt, wurde zentrifugiert
(Janetzki S-70, 3000 g, 10 min); nach dem Abgießen des Uberstands (Nährboden nach
der Fermentation, der aufbewahrt worden war) wurden 28 g (Naßgewicht) frische native
Zellen gewonnen.
-
Diese Menge der frischen Hefen in Form der Zellpaste wurde in 100
ml einer Lösung eines reaktiven Polymers suspendiert, die gemäß Beispiel 2 hergestellt
worden war; nach gründlicher Homogenisierung der Suspension durch intensives Rühren
wurde das Reaktionsgemisch auf ein Laborschüttelgerät aufgesetzt und 1 h bei Raumtemperatur
mit 50 Schwingungen/min geschüttelt. Danach wurde das Mischen eingestellt und die
Suspension 3 h bei der angegebenen Temperatur in Ruhe belassen. Anschließend wurde
der stark viskose, schwammige Brei aus den erzeugten Aggregaten in 500-ml-Polyethylenbehälter
umgegossen und in der oben angegebenen Weise zentrifugiert; der Überstand wurde
abgegossen und das Sediment in entmineralisiertem Wasser suspendiert und dreimal
mit 250 ml Wasser unter mildem Rühren dekantiert. Nach der Dekanttion und der quantitativen
Sedimentation wurde das Matrja im Vakuum abgesaugt, mit etwa 100 ml/gewaschen und
gewogen (14 g).
-
Im Anschluß daran wurde das Material in 25 ml zuvor auf -25 OC abgekühltem
Aceton suspendiert und 2 min intensiv gerührt.
-
Danach wurde das Material auf der Fritte scharf im Vakuum abgesaugt
und gewogen (9 g). Die gewonnene feuchte Masse aus immobilisierten Zellen wurde
in der oben angegebenen, zentrifugierten Überstandsflüssigkeit suspendiert (Nährboden
für die Hefefermentation) und einige Stunden bei Raumtemperatur quellen gelassen.
-
Das Material wurde anschließend nochmals im Vakuum gut abgesaugt.
100 mg (Naßgewicht) der Teilchen wurden in ein Warburggefäß eingewogen; danach wurden
2 ml zentrifugierte, klare Fermentationsflüssigkeit mit pH 4,6 zugegeben; in den
Arm des Warburggefäßes wurden 0,5 ml 12,5-%ige Saccharoselösung einpipettiert; in
eines der Referenzgefäße wurden die nativen, nichtimmobilisierten Zellen (100 ml
der nativen feuchten Paste) gegeben und mit 2 ml zentrifugierter Fermentationsflüssigkeit
versetzt; in das zweite Referenzgefäß wurde der eigene Überstand (ohne Zellen) und
in die Arme die Saccharoselösung zugegeben. Nach Einsetzen der Manometer wurde das
Warburggefäß 15 min bei 30 OC geschüttelt. Anschließend wurden die Manometer entlüftet;
nach Übergießen der Saccharoselösung aus den Armen begann die eigentliche Messung
der CO2-Entwicklung.
-
Bei der ersten Kontrollmessung (nichtimmobilisierte separate native
Zellen) wurden 3064 ul C02 entwickelt; bei der zweiten Kontrollmessung (Uberstand
ohne Zellen) trat keine C02-Entwicklung auf; bei der dritten Kontrollmessung (immobilisierte
Zellen mit gleicher Konzentration an feuchter Masse wie bei der ersten Kontrollmessung)
wurden 165 ul C02 bei einer Rate von 165 u1 C02/h entwickelt, was etwa 5,4 % der
ursprünglichen (nichtimmobilisierten) gesamten metabolischen Zellaktivität entspricht.
-
Das Material der immobilisierten Hefezellen erschien bei der makroskopischen
Beurteilung beige mit amorphen Teilchen; die mikroskopische Untersuchung ergab begrenzte
Teilchen mit unregelmäßiger Form. Die Teilchengröße lag im Bereich von 300 bis 900
um; 1 min Stehenlassen führte zur quantitativen Sedimentation.
-
Beispiel 17 35 g (Naßgewicht) einer frischen Paste aus nativen Zellen
von Bakterien Erwinia aridea, die das Enzym L-Asparaginami dohydrolase mit einer
spezifischen Aktivität von 109 umol L-Asparaginsäure/min.g (Naßgewicht) (37 OC,
pH 5,0, Substrat L-Asparagin) enthielten, wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven
Polymers, die wie in Beispiel 7 hergestellt war, suspendiert. Anschließend wurde
die Suspension durch intensives Rühren homogenisiert, 30 min wie in Beispiel 16
schwach gerührt und danach 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen.
-
Nach dieser Zeit wurde die viskose, schwammartige Masse in 500-ml-Polyethylenbehälter
umgegossen und bei 500 g 30 min zentrifugiert. Im Anschluß daran wurde der Überstand
abgegossen und das Sediment mit einem Filtrationsdruck wie in Beispiel 7 beaufschlagt
mit dem Unterschied, daß die Masse kurzfristig, etwa 5 min, zur Beseitigung des
flüssigen Teils der Lösung des reaktiven Polymers auf einer hydraulischen Presse
gepreßt wurde; das erhaltene brüchige Material wurde zerkleinert und durch einen
Fleischwolf mit einem speziellen Stahleinsatz mit 1 mm großen Öffnungen gedreht,
über die das Material in Form eines walzenförmigen Granulats herausgedrückt wurde,
das dann etwa 3 h bei 25 OC an Luft getrocknet, dann dreimal mit Wasser dekantiert
und schließlich über Nacht in entmineralisiertem Wasser quellen gelassen wurde.
-
Insgesamt wurden 8 g granuliertes festes Material aus
immobilisierten
Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 64 umol L-Asparaginsäure/g (Naßgewicht)
und unregelmäßiger Größe der walzenförmigen Teilchen im Bereich von 1 bis 3 mm gewonnen.
Das Material sedimentierte bereits während einiger Dutzend Sekunden quantitativ.
-
Beispiel 18 50 g (Naßgewicht) einer Paste aus frischen nativen Zellen
von Streptomyces phaechromoqenes mit dem Enzym Glucoseisomerase mit einer spezifischen
Aktivität von 0,21 umol Fructose/min.g (Naßgewicht) (60 OC, pH 6,85, Substrat Glucose)
wurden in 200 ml 0,1 M NaCl-Lösung mit pH 7,0 suspendiert; die Suspension wurde
kurzfristig unter ununterbrochenem Rühren 10 min auf 70 OC erwärmt. Anschließend
wurde die Suspension abgekühlt und zentrifugiert (5000 9, 15 min). Danach wurde
der Uberstand abgegossen und das Sediment in 150 ml Lösung des reaktiven Polymers
suspendiert, die wie in Beispiel 7 hergestellt war.
-
Anschließend wurde zur Immobilisierung wie in Beispiel 17 einschließlich
Zentrifugieren, kurzfristiger Pressung, Mahlen und Trocknung verfahren mit dem Unterschied,
daß die entstandenen, nachgeformten Granuli aus immobilisierten Zellen mit 50 ml
vorher auf -28 OC abgekühlter 2-%iger Klebstofflösung (Kanagon) in Aceton 3 min
behandelt wurden. Anschließend wurden die Granuli scharf abgesaugt und auf der Fritte
noch etwa 15 min weiter abgesaugt, danach mit etwa 1 1 0,05 M Phosphatpuffer gewaschen,
erneut abgesaugt, in 100 ml dieser Pufferlösung suspendiert und über Nacht bei +8
OC stehengelassen.
-
Insgesamt wurden 20 g (Naßgewicht) des granulierten festen.
-
Materials aus immobilisierten Zellen mit einer spezifischen Aktivität
von 0,1 umol Fructose/g (Naßgewicht) mit Teilchen unregelmäßiger Größe im Bereich
von 0,5 bis 3,0 mm gewonnen.
-
Das Material sedimentierte nach einigen Dutzend Sekunden quantitativ.
-
Beispiel 19 45 g (Naßgewicht) einer Paste aus frischen nativen Zellen
von Aspergillus nu gar mit den Enzymen Glucoseoxidase und Katalase mit einer spezifischen
Aktivität von 0,1 umol H202/min.mg (Naßgewicht) wurden in 150 ml einer wie in Beispiel
7 hergestellten Lösung des reaktiven Polymers eingebracht. Danach wurde zur Immobilisierung
wie in Beispiel 7 verfahren mit dem Unterschied, daß die erhaltenen nachgeformten
Granula bei 40 % relativer Feuchte (H2S04) und Raumtemperatur 24 h trocknen gelassen
wurden.
-
Danach wurden die immobilisierten Zellen in entmineralisiertes Wasser
eingebracht und 24 h bei +8 OC quellen gelassen.
-
Insgesamt wurden 29 g (Nar3gewicht) immobilisierte Zellen mit einer
spezifischen Aktivität von 0,045 umol H202/ml (feucht) und unregelmäßiger Größe
der Teilchen in Form von Walzen im Bereich von 0,5 bis 3,0 mm gewonnen. Das Material
sedimentierte während einiger Dutzend Sekunden quantitativ.
-
Beispiel 20 20 g (Naßgewicht) frische, gewaschene Pflanzenzellen
von Solanum aviculare (Einzellenkultur), die in hypertonischem Milieu von Saccharose-Lösung
Solanum-Alkaloide und Phytosteri ne synthetisieren, wurden in 100 ml einer wie in
Beispiel 2 hergestellten Lösung eines reaktiven Polymers suspendiert; die nach intensivem
Rühren erhaltene homogene Suspension wurde in eine Alumi ni umschale mit einem Durchmesser
von 15 cm umgegossen und 4 h bei -19 OC in einer Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde
das gefrorene Reaktionsgemisch aus der Tiefkühlbox entnommen und mit etwa 50 ml
1 M Phosphatpuffer mit pH 5,7 und 0,75 M KCl übergossen; nach 2 h Stehenlassen wurden
die bei Raumtemperatur entstandenen Pflanzenzellaggregate in 1 1 des obigen Puffers
übertragen und einige Male mit diesem Puffer.
-
jeweils nach quali tati ver Sedimentation der Teilchen, dekantiert.
-
Anschließend wurden die immobilisierten Zellen im Vakuum abgesaugt,
auf der Fritte nochmals mit Pufferlösung gewaschen und erneut im Vakuum abgesaugt
sowie gewogen (18 g).
-
Anschließend wurden die Teilchen in 100 ml einer 8-%igen (G/V) sterilen
wäßrigen Saccharose-Lösung eingebracht und die Suspension dreimal 24 h bei 20 OC
mit einem Magnetrührer gerührt, wobei in 24-h-Intervallen in der Saccharose-Lösung
nach Abtrennen der Aggregate die extracelluläre Produktion von Solanum-Alkaloiden
und Phytosteri n durch HPLC-Chromatographi e ermittelt wurde (vgl Jirku et al.,
Biotechnol. Letters 3, Nr. 8 (1981) 447).
-
Dabei wurde festgestellt, daß in drei wiederholten 24-stündigen Intervallen
die Produktion der obigen Komponenten bei gleichem Einsatz an immobilisierten Zellen
erhalten bleibt.
-
Die Teilchen wurden ferner rasterelektronenmi kroskopi sch untersucht,
wobei die gegenseitige Bindung der Pflanzenzellen nachgewiesen wurde.
-
Beispiel 21 30 g (Naßgewicht) frische, gewaschene Pflanzenzellen wie
in Beispiel 20 wurden in 100 ml 0,05 M Phosphatpuffer mit pH 6,0 und 0,75 M KC1
suspendiert. Zur homogenen Suspension der Zellen wurde unter Rühren ein Flockungsmittel
(Sedipur KA) in einer Menge von 0,5 Vol-% zugegeben. Nach Durchrühren wurde die
Suspension 1 h bei Raumtemperatur ruhig stehengelassen, bis eine visuell feststellbare
Ausflockung der Zellen vorlag.
-
Anschließend wurde die Suspension vorsichtig, um die präformierten
Zellen nicht zu beschädigen, auf eine Fritte übergegossen und über Textilmaterial
langsam aber gründlich im Vakuum abgesaugt. Nach Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit
wurde
das Material ohne Waschen in 100 ml einer wie in Beispiel 10 hergestellten Lösung
eines reaktiven Polymers eingebracht und die erhaltene Suspension durch vorsichtiges,
langsames Rühren homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurde die Suspension 1
h bei Raumtemperatur stehengelassen, die weitere Immobilisierung geschah wie in
Bei spiel 20 mit dem Unterschied, daß die Temperatur bei der Tiefkühlung -25 OC
betrug.
-
Nach 4 h Tiefkühlung wurde das Material aus der Tiefkühlbox entnommen
und gemäß Beispiel 20 weiterverarbeitet mit dem Unterschied, daß die Auftauzeit
bei Raumtemperatur 1 h betrug. Dabei wurden 20 g immobilisierte, gewaschene und
gut abgesaugte Zellen gewonnen.
-
Im Anschluß daran wurden die Teilchen aus immobilisierten Zellen
in das gleiche Medium wie in Beispiel 20 übertragen mit dem Unterschied, daß die
Biosynthese der Solanum-Alkaloide und von Phytosterin unter Rezirkulation der Saccharose-Lösung
in einem Fließbett des Biokatalysators 5 x 24 h durchgeführt wurde, wobei in 24-h-Intervallen
in der Saccharose-Lösung die Produktion der Solanum-Alkaloida und von Phytosterin
wie in Beispiel 20 ermittelt wurde.
-
Dabei wurde festgestellt, daß in fünf wiederholten 24-h-Intervallen
die Produktion sowie der Produktionsrhythmus der angegebenen Komponenten bei gleichem
Einsatz an immobilisierten Zellen erhalten bleibt.
-
Beispiel 22 Es wurden zwei Lösungen von je 25 ml hergestellt, die
0,1 YO (G/V) Polylysin.HCl mit einem Molekulargewicht von 40000 bis 50000 bzw 1
% (G/V) Polylysin mit einem Molekulargewicht von 26200 enthielten. Zur Auflösung
des Polylysins
mit dem Molekulargewicht von 40000 bis 50000 wurde
destilliertes Wasser und zur Lösung des Polylysins mit Molekulargewicht 26200 0,1
M Tris-Puffer mit pH 8,0 verwendet. In jede der beiden Polylysinlösungen wurde eine
25-%ige Lösung von Glutaraldehyd in Wasser in der Weise zugegegeben, daß ihre Konzentration
im Reaktionsgemisch 0,3 Vol-% im Fall des Polylysins mit Molekulargewicht von 40000
bis 50000 bzw 0,5 Vol-% im Fall des Polylysins mit Molekulargewicht 26200 betrug.
-
Die Gefäße mit dem Reaktionsgemisch wurden dann auf eine Rotationsschüttelmaschine
gebracht, mit der die Reaktionsgemische 10 h ununterbrochen bei 30 OC gemischt wurden.
Die Geschwindigkeit der Polymerisation bzw der Bildung der gefärbten Schiffschen
Basen wurde wie in Beispiel 1 spektrophotometri sch verfolgt mit dem Unterschied,
daß bei einer Wellenlänge von 430 nm gemessen wurde.
-
Nach der angegebenen Zeitdauer wurden in jede der Lösungen des reaktiven
Polymers 6 g (Naßgewicht) frische native Hefen Saccharomyces cerevisiae mit Invertaseakti
vi tät und einer spezifischen Aktivität von 14 umol Glucose/min.mg (Trockengewicht)
der Zellen (30 OC, pH 4,8, Substrat Saccharose) zu einer homogenen Suspension suspendiert.
Die Suspensionen wurden 1 h auf einem Laborshaker gemischt und anschließend 2 h
stehengelassen, worauf die Teilchen abzentrifugiert wurden (5000 g, 10 min); die
Sedimente wurden getrennt in eine Injektionsspritze ohne Nadel eingebracht und die
feste Paste in Walzenform auf eine Aluminiumfolie ausgepreßt. Die nicht gewaschenen
nachgeformten Teilchen wurden bei Raumtemperatur 6 h trocknen gelassen und danach
mechanisch zu Teilchen von ungefähr gleicher Größe homogenisiert und über Nacht
in Wasser bei + 5 OC quellen gelassen. Die gequollenen Teilchen wurden dann im Vakuum
filtriert, einige Male mit Wasser gewaschen, gründlich abgesaugt und gewogen.
-
Es wurden 5,6 g (Naßgewicht) Teilchen mit einer spezifischen Aktivität
von 276 umol Glucose/min-9 (Naßgewicht) jm ersten Fall bzw 3,6 g (Naßgewicht) Teilchen
mit einer spezifischen Aktivität von 387,2 umol Glucose/min.g (Naßgewicht) im zweiten
Fall gewonnen. Die Teilchen lagen in beiden Fällen in Form fester Walzen mit einem
Durchmesser von 1,2 mm und einer Größe im gequollenen Zustand im Bereich von 1,45
bis 4 mm vor. Das Material sedimentierte während einiger Sekunden quantitativ.
-
5 g (Naßgewicht) der immobilisierten Zellen mit der spezifjschen
Aktivität von 387,2 cymol Glucose/min 9 wurden in 50 ml 0,5 M Saccharose-Lösung
in 0,05 M Acetatpuffer mit pH 4,9 suspendiert, wobei unter ununterbrochenem Rühren
mit einem langsam laufenden Ankerrührer bei einer Drehzahl von 100 U/min und einer
Temperatur von 30 OC die enzymatische Inversion der Saccharose zu einem Gemisch
von Glucose und Fructose durchgeführt wurde. Die enzymatische Umwandlung war unter
den angegebenen Reaktionsbedingungen in 3 h quantitativ. Dieser Vorgang wurde insgesamt
zehnmal bei gleichem Einsatz an Biokatalysatoren wiederholt, wobei nach jedem beendeten
Zyklus der wiederholten enzymatischen Inversion die Teilchen durch Sehen durch ein
Polyami dsi eb abgetrennt, mit dem angegebenen Puffer gewaschen und erneut in der
angegebenen Art eingesetzt wurden. Der mittlere Grad der enzymatischen Inversion
bei zehn Zyklen der wiederholten Verwendung des gleichen Ansatzes an immobilisierten
Zellen betrug 92,6 %.
-
Beispiel 23 Es wurden 50 ml einer 10-%igen Lösung von technischem
L-Lysin (Wirkstoffgehalt 88 %) in 0,1 M Tris-Puffer pH 8,2 hergestellt. In diese
Lösung wurde eine 25-%ige Lösung von Glutaraldehyd in Wasser in der Weise zugegeben,
daß seine Konzentration im Reaktionsgemisch 5 Vol-% betrug. Das Reaktionsgemisch
wurde
dann unter den Bedingungen und in der Art von Beispiel 22 ununterbrochen gerührt,
wobei die Reaktionsdauer jedoch 24 h betrug.
-
Nach dieser Zeit wurden in 50 ml der dunkelbraunen Lösung des reaktiven
Polymers 12 g (Naßgewicht) frische native Zellen des gleichen Mikroorganismus mit
der gleichen enzymatischen Aktivität wie in Beispiel 22 suspendiert. Die Suspension
wurde mit einem schnellaufenden Fibrationsmischer homogenisiert und danach in eine
aus einer Aluminiumfolie hergestellte Schale gegossen und 24 h bei -20 OC in einer
Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde die Schale aus der Tiefkühlbox herausgenommen
und ihr Inhalt bei Raumtemperatur spontan auftauen gelassen. Anschließend wurde
die stark viskose, schwammige Mischung zentrifugiert (10000 g, 15 min); der Überstand
wurde abgegossen und das Sediment in eine Injektionsspritze eingebracht und wie
in Beispiel 22 weiterverarbeitet mit dem Unterschied, daß die Trocknung der nachgeformten
Teilchen an Luft 10 h dauerte.
-
Nach Filtration, Waschen und Quellen des Materials wie in Beispiel
22 wurden 2,8 g (Naßgewicht) Teilchen mit einer spezifischen Aktivität an Invertase
von 180 umol Glucose/min.g (Naßgewicht) und einer Teilchengröße im Bereich von 1,2
bis 3,7 mm gewonnen. Das Material bestand nach dem Quellen aus schwammigen, halbweichen
Walzen, die während einiger Sekunden quantitativ sedimentierten.