CS203607B1 - Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase - Google Patents

Abstract

Bonded cells with penicillin acylase (I) activity are made by (a) crosslinking the cell contents of a (I)-producing microorganism with a dialdehyde (II); (b) making the crosslinked cells permeable by treating at high temp., and/or with organic solvent and/or with surfactant; (c) reacting the cells in aq. medium with a water-soluble cpd. having >=2 primary and/or sec. amino gps. and (II). Process further comprises (d) sepg. the bonded cells and improving their mechanical strength by partial dehydration at 0 to -30 degrees C with organic water-miscible solvent (opt. mixed with water); and (e) converting to enzymatically-active form by reconstituting with aq. media of pH 7-8, esp. a phosphate buffer. Pref. (II) is glutardialdehyde; the dehydrating solvents are pref. acetone or propanol and stage (c) is either at below mixt. freezing pt. or at 15-25 degrees C, opt. with stirring at 40-60 r.p.m. The bonded cells are used for continuous hydrolysis of natural penicillins to 6-APA which is used to make semi-synthetic penicillins. The 6-APA formed is free of potentially-allergenic protein impurities. The cells can be treated directly after sepn. from the culture liq. and there is no need for a carrier or autolysis. The cells have high specific activity (up to 90% that of native cells); good sedimentation properties and esp. good hydrodynamic properties.

Description

Vynález se týká způsobu výroby vázaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou bez použití nosiče. Vázané buňky jsou použitelné k výrobě 6-aminopenicilánové kyseliny, základního meziproduktu výroby rady klinicky užívaných po-losyntetických penicilinů, enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpemcilhnu.The invention relates to a process for the production of bound cells with penicillin acylase activity without using a carrier. The bound cells are useful for the production of 6-aminopenicillanic acid, a basic intermediate in the production of a number of clinically used post-synthetic penicillins, by enzymatic hydrolysis of penicillin, especially benzylpemcilhn.

Běžně známé způsoby vazby buněk využívají různých ye vodě nerozpustných organický, anorganických nebo- přírodních nosičů k zdokonalení sedimentačních a tím separačních vlastností buněčných preparátů. Například se využívá pro vazbu buněk sférických částic syntetických polymerů získaných cíleně vedenou polymerací na bázi methakrylaldehydu, glyčidylmethakrylátu, hydro-xyalkylmethakrylátu apod, které se nejprve musí předem chemicky modifikovat připojením distálních prostorových spojek s koncovými aminoskupinami a poté teprve buňky na -takto modifikované polymerní částice vázat pomocí polyfunkčních činidel. Podobně postup vazby buněk podle NSR patentového spisu DOS 2 513 929 spočívá v reakci buněk s reaktivním monomerem a v následné polymeraci nebo kopolymeraci nebo s glycidylmethakrylátovým polymerem, popřípadě s kombinaci s kovalentní fixací enzymu uvnitř buněk b.ifunkčním činidlem.Conventionally known cell binding methods utilize a variety of water-insoluble organic, inorganic or natural carriers to enhance the sedimentation and thus separation properties of the cell preparations. For example, it is used to bind cells of spherical particles of synthetic polymers obtained by targeted polymerization based on methacrylaldehyde, glycidyl methacrylate, hydroxyalkyl methacrylate and the like, which must first be chemically modified by attaching distal spatial junctions with terminal amino groups and only then bind the cells to such modified polymer particles with polyfunctional agents. Similarly, the process of cell binding according to German Patent Specification No. 2,513,929 consists in reacting cells with a reactive monomer and subsequent polymerization or copolymerization or with a glycidyl methacrylate polymer, optionally in combination with a covalent fixation of the enzyme inside the cells with a bifunctional agent.

kladné přípravky, jejichž cena limituje průmyslové využití vázaných buněčných preparátů. Jistým pokrokem ve vývoji technologie vazby buněk s průmyslovým významem je způsob, jehož princip spočívá ve vazbě produkčních. buněk na buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou buň celé, neporušené a/nebo- fyzikálně, chemicky nebo biochemicky ošetřené buňky nebo jejich nerozpustné fragmenty, chemicky, kovalentní vazbou, použitím polyfunkčních činidel. U tohoto způsobu vazby buněk -odpadá rovněž ekonomický limit ceny nosiče, neboť používanými nosiči jsou odpadní buňky (odpadní buněčná hmota) po různých fermentačních výrobách, jejichž cena je převážně zanedbatelná, resp. nulová. Rovněž je popsán způsob výroby produkčních buněk navzájem, tedy bez po-užií nosiče, avšaik při popsaném způsobu vazby musí být buňky do- značné -míry přirozeně nebo· uměle autolyzované, aby k jejich vzájemné vazbě došlo, nehledě na skutečnost, že takto připravené vázané buňky mají horší mechanické a sedimentační vlastnosti a v důsledku předchozí parciální auto-lýzy i nižší specifickou aktivitu. Tuto· nevýhodu řeší způsob kovalentnílio· zesítění individuálních produkčních buněk pomocí polyfunkčních činidel použitelných pro ³ ' semikontinuální ^výrobu B-aminopenicilánové kyseliny. Při zmíněném· způsobu se vsak při výrobě musí používat velkokapacitních odstředivek k separaci zesítěných buněk po jejich opakovaném použití, neboť rozměry jednotlivých zesítěných buněk jsou velmi malé [přibližně kolem 1 μπι), z čehož vyplývají i jejich špatné sedimentační vlastnosti a nutnost využití vsádkové technologie výroby, · vsádkového míchaného reaktoru, pro přípravu 6-aminopenicilánové kyseliny.Positive preparations whose price limits the industrial use of bound cell preparations. A certain advance in the development of cell-binding technology with industrial significance is the method whose principle lies in the binding of production cells. cells to cell carriers of various kinds of organisms which are whole cells, intact and / or physically, chemically or biochemically treated cells, or insoluble fragments thereof, chemically, by covalent binding, using polyfunctional agents. In this method of cell binding, the economic limit of the cost of the carrier is also eliminated, since the carriers used are waste cells (waste cell mass) after various fermentation processes, the cost of which is largely negligible, respectively. zero. Also described is a method of producing producer cells with each other, i.e. without using a carrier, but in the described binding method, the cells must be largely naturally or artificially autolysed in order to bind to each other, despite the fact that the thus prepared bound the cells have inferior mechanical and sedimentation properties and, due to previous partial autolysis, also lower specific activity. This disadvantage is solved by a method of covalent cross-linking of individual production cells using polyfunctional agents useful for ³ 'semi-continuous production of β-aminopenicillanic acid. However, in this process, large-capacity centrifuges must be used in the manufacture to separate the cross-linked cells after their repeated use, since the dimensions of the individual cross-linked cells are very small (about 1 μπι), which also implies their poor sedimentation properties and A batch stirred reactor for the preparation of 6-aminopenicillanic acid.

Zjistili jsme nyní, že čerstvé nativní buňky produkčních organismů obsahujících penicilinacylázu lze· ihned po jejich separaci z fermentační kapaliny vázat bez použití nosiče a bez požadavku na ·jejch částečnou umělou nebo·' samovolnou autolýzu. · Postupem podle vynálezu rezultují vázané produkční buňky s vysokou specifickou aktivitou · · .penicilinacylázy, velmi dobrými sedimentačními «především hydrodynamickými vlastnostmi. Částice vázaných buněk jsou pevné, pískovité, připomínající ' pryskyřici tmavohnědého až černého· zbarvení, umožňující jejich ' využití pro kontinuální technologii. výroby 6-ami^!nopenicilánové kyseliny. Způsob a princip výroby vázaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou bez použití nosiče podle vynálezu se skládá z následujících technologických operací výroby:We have now found that fresh native cells of production organisms containing penicillin acylase can be bound immediately after separation from the fermentation liquid without the use of a carrier and without the requirement for partial artificial or self-lysis. By the process according to the invention, bound production cells with a high specific activity of penicillin acylase result in very good sedimentation properties, in particular hydrodynamic properties. The bound cell particles are solid, sandy, resembling a dark brown to black resin, allowing their use in continuous technology. production 6-ami ^! nopenicillanic acid. The method and principle of the production of bound cells with penicillin acylase activity without using the carrier according to the invention consists of the following technological production operations:

ChemicRá reakce produkčních buněk v míchané vodné suspenzi s bifunkčními síťovacími činidly, čímž dojde ke kovalentnímu zesítění-prokřížení vnttrobuněčného obsahu individuálních buněk producenta a tím k fixaci a stabilizaci penicilinacylázy obsažené v jednotlivých buňkách a dolnosti těchto· buněk· vůči autolýze.Chemical reaction of producer cells in a mixed aqueous suspension with bifunctional crosslinking agents, thereby covalently cross-linking the intracellular content of the individual producer cells and thereby fixing and stabilizing the penicillin acylase contained in the individual cells and the maturity of these cells against autolysis.

Zředění suspenze buněk pro reakci vodou, jejich · zahuštění na velkokapacitních odstředivkách a •následná permeabilizace individuálních zesítěných buněk v míchané vodné suspenzi vlivem teploty, . přídavku organického·· rozpouštědla a/nebo smáčedla,' popřípadě· kombinací těchto vlivů, čímž dojde k · vyplavení nezreagovaných povrchových a vnňirobuněčných. komponent převážně lipldického· · charakteru, zlepšení· difúzních vlastností · zesítěných buněk a odkrytí dalších reakce schopných · skupin jejich povrchu a vnitrobuněčného prostoru.Diluting the cell suspension for reaction with water, concentrating it in large - capacity centrifuges and subsequent permeabilization of the individual cross - linked cells in the stirred aqueous suspension under the influence of temperature. the addition of an organic solvent and / or a wetting agent, or a combination of these, thereby leaching unreacted surface and extracellular cells. components of predominantly lipldic · character, improvement · diffusion properties · cross-linked cells and uncovering other reaction-capable groups of their surface and intracellular space.

Zředění suspenze zesítěných· a vypraných buněk vodou po· jejich permeabilizaci, jejich zahuštění na velkokapacitních ' odstředivkách a jejich následná chemická reakce prováděná v přítomnosti ve vodě rozpustné sloučeniny obsahující nejméně dvě · primární a/ /nebo sekundární aminové skupiny spolu s bifunkčnmi síťovacími činidly při zchlazení reakční směsi pod teplotu tání, čímž dojde k těsnému kontaktu buněk a po· určité době k vytvoření navzájem vázaných, kovalentních · prokřížených buněčných částic. · Po vazbě buněk se zmrzlý materiál nechá samovolně rozmrazit a suspenduje za míchání ve vodě, · několikrát se dekantuje vodou a odsaje se · přes textilní nebo· jiný materiál.Diluting the suspension of cross-linked and washed cells with water after their permeabilization, their concentration on large-capacity centrifuges and their subsequent chemical reaction carried out in the presence of a water-soluble compound containing at least two primary and / or secondary amine groups together with bifunctional crosslinking agents upon cooling of the reaction mixture below the melting point, which results in intimate contact of the cells and, over a period of time, formation of bound, covalent, cross-linked cell particles. After binding the cells, the frozen material is allowed to thaw spontaneously and suspended under stirring in water, decanted several times with water and sucked off through textile or other material.

Dobře odsátý vlhký materiál vázaných buněk se za míchání· vpraví do vychlazeného acetonu · nebo jeho směsi s vodou, krátkou dobu mírně míchá a dobře odsaje, čímž dojde k rychlé částečné dehydrataci vázaných buněk a k mechanickému , zpevnění částic. Materiál se pak nechá botnat' ve vodném prostředí, po jeho · nabotnání. se odsaje a popřípadě suší při · přibližně 60%' vlhkosti vzduchu do- jeho· konstantní hmoty.The well-aspirated damp bound cell material is stirred into the cooled acetone or its mixture with water while stirring, gently stirred for a short period of time and well sucked off, resulting in rapid partial dehydration of the bound cells and mechanical, solidification of the particles. The material is then swelled in an aqueous medium after swelling. it is suctioned off and optionally dried at about 60% air humidity to its constant mass.

Postupem podle vynálezu lze · vyrobit · vázané buňky s penicilinacylázovou aktivitou bez použití nosiče s vysokou specifickou aktivitou tohoto enzymu, která činí až 90 % hodnoty specifické aktivity nativních buněk, vysokým výtěžkem zachycené enzymové · aktivity, který činí až 70 ·% vztaženo · na hmotu nativních buněk producenta pod vazbou, s vynikajícími sedimentačními· a především hydrodynamickými vlastnostmi a dobrou stabilitou enzymové aktivity při dlouhodobém používání, přičemž velikost částic lze v určitém · rozsahu regulovat koncentrací buněk · a podmínkami reakce. Materiál se rovněž · vyznačuje · dobrou stabilitou na mechanický otěr vlivem míchání a tření částic a lze jej využít pro· vsádkovou a zejména kontinuální technologii · výroby 6-amlnopenicilánové kyseliny hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenicilinu.Bound cells with penicillin acylase activity without carrier having a high specific activity of this enzyme of up to 90% of the specific activity of native cells can be produced by high yield of captured enzyme activity of up to 70% by weight native producer cells under binding, with excellent sedimentation and, above all, hydrodynamic properties and good stability of enzyme activity in long-term use, the particle size of which can be controlled to some extent by cell concentration and reaction conditions. The material is also characterized by good mechanical abrasion stability due to the mixing and friction of the particles and can be used for batch and especially continuous technology for the production of 6-amlnopenicillanic acid by the hydrolysis of penicillin, especially benzylpenicillin.

Pro enzymovou hydrolýzu využitím materiálu připraveného podle vynálezu, lze použít vodného· roztoku sodné nebo· draselné soli benzylpenicilinu, popřípadě surového roztoku benzylpenicilinu ve formě kyseliny, získaného při · zpracováni vyfermentované živné půdy po· ukončené kultivaci. Získaná 6-aminopenicilánová kyselina · je čistá, prostá balastních bílkovinných příměsí a polosyntetické peniciliny z ní připravené nenavozují alergické reakce v živém organismu.For enzymatic hydrolysis using the material prepared according to the invention, an aqueous solution of benzylpenicillin sodium or potassium, or a crude acid solution of benzylpenicillin, obtained by treating the fermented broth after the cultivation, can be used. The 6-aminopenicillanic acid obtained is pure, free of ballast protein and the semi-synthetic penicillins prepared from it do not induce allergic reactions in the living organism.

Předmětem vynálezu je způsob výroby · vázaných buněk s penicilinacylázovou · aktivitou bez ' použití' nosiče · ·k přípravě ·- '6-a(minopenicilánové kyseliny ' enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenicilinu, vyznačující se tím, že buněčný obsah jednotlivých produkčních buněk se zesítí bifunkčními aldehydy, s výhodou glutardialdehydem, zesítěné buňky se po reakci permeabilizují účinkem teploty, přídavku organického rozpouštědla a/nebo smáčedla, popřípadě kombinací těchto vlivů, promyjí a ponechají reagovat v přítomnosti ve vodě rozpustné sloučeniny obsahující nejméně dvě primární a/nebo·, sekundární aminové skupiny spo-lu s bifunkčním aldehydem, s výhodou glutardialdehydem, při zchlazení reakční směsi pod teplotu tání a po· vzniku vázaných buněčných ·částic se tyto· promyjí, dekantují, · odsají a suspendují ve zchlazeném· acetonu či jeho směsi s · vodou, popřípadě s jiným dehydratačním činidlem nebo· jeho· · vodné směsi, odsají, ne203607 chají bótnat ve vodném prostředí a pák popřípadě odsáté, suší, s výhodou při dostatečné vlhkosti vzduchu.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a process for the production of bound cells with penicillin acylase activity without using a carrier for the preparation of 6-a (minopenicillanic acid) by enzymatic hydrolysis of penicillin, especially benzylpenicillin, characterized in that the cell content of individual production cells is cross-linked with bifunctional aldehydes, preferably glutardialdehyde, the crosslinked cells are permeabilized after reaction by the action of temperature, addition of organic solvent and / or wetting agent, or a combination of these, washed and reacted in the presence of water-soluble compounds containing at least two primary and / or secondary amino of the bifunctional aldehyde group, preferably glutardialdehyde, upon cooling of the reaction mixture below the melting point and formation of bound cell particles, these are washed, decanted, aspirated and suspended in cooled acetone or a mixture thereof with water, optionally p with another dehydrating agent or its aqueous mixtures are suctioned but not allowed to swell in an aqueous medium and dried, optionally sucked, preferably with sufficient air humidity.

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby vázaných buněk bez použití nosiče, vyznačující se tím,· že · namísto' zchlazení · reakční -směsi pod bod tání se, tato- mírně · míchá a/nebo· ·ponechá- v klidu ' · při ·teplotách · vyšších než 0°C.The present invention further provides a carrier-free process for the production of bound cells, characterized in that, instead of cooling the reaction mixture below the melting point, it is stirred gently and / or left to stand at temperatures. · Higher than 0 ° C.

K způsobu výroby vázaných buněk s penicilinacylázovou · aktivitou bez · použití · nosiče podle vynálezu lze použít v · podstatě kteréhokoliv producenta · penicilinacylázy, u něhož je enzym lokalizován v periplasmatickém- nebo· vnitr-obuněčném , prostoru, např. druhů Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Próteus rettgeri apod. Je pochopitelně výhodné, využít pro vazbu · buněk podlé' vynálezu m-ntan-tních organismů, získaných cíleně vedenou genetickou manipulací, které obsahují vysoké množství penicilinacylázy, neboť získané vázané buňky pak mají · vysokou specifickou aktivitu enzymů. Je samozřejmé, že použitím · jiného· mikroorganismu (kmene) · lze podle vynálezu připravit · vázáné · buňky bez použití nosiče s odlišným kvalitativním a kvantitativním zastoupením· enzymových · aktivit.Essentially any penicillin acylase producer in which the enzyme is located in the periplasmic or intracellular space, e.g. of the species Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, can be used to produce bound cells with penicillin acylase activity without using the carrier. Proteus rettgeri and the like. Of course, it is advantageous to employ, for the binding of the cells according to the invention, mutant organisms obtained by targeted genetic manipulation which contain a high amount of penicillin acylase, since the obtained bound cells then have a high specific enzyme activity. Of course, using another microorganism (strain), bound cells can be prepared according to the invention without the use of a carrier with different qualitative and quantitative representation of enzyme activities.

Velikost vázaných buněčných částic byla posuzována mikroskopicky (optickým mikroskopem) s · použitím kalibrovaného měrného· okuláru při různém zvětšení. K analýze velikosti částic bylo· rovněž použito kovových sít pro sítovou- analýzu a vázané buněčné částice byly · děleny podle · velikosti použitím tří sad těchto· šít, přičemž velikost otvorů těchto sít byla v rozmezí ·0,03 až 2,0 milimetru.The size of the bound cell particles was assessed microscopically (by optical microscope) using a calibrated specific eyepiece at various magnifications. Metal sieve analysis was also used for particle size analysis and bound cell particles were sized according to size using three sets of sieves, the mesh size of these sieves ranging from 0.03 to 2.0 millimeters.

Aktivita penicilinacylázy . byla hodnocena spi^l^t^irOE^^^o^f^ttricky barevnou reakcí p-dimethylaminobenzaldehydu s 6-APK podle čs. patentového· . spisu č. 116 959 v modifikaci podle Balasinghama a sp. (Biochim. Biophys. Acta, 276, '2'50, 1972), při 42 °C a hodnotě pH · 7,6 v oblasti · reakční klnetiky nultého řádu. Počáteční koncentrace substrátu, K nebo· Na-so-li benzy^enícilínu při · stanovení byla 2 % (w/v). Jednotka.enzymové aktivity je takové · množství enzymu, které katalyzuje vznik jednoho ^nmHu 6-APK z benzylpenicilinu, respektive · jeho solí za · hodinu.Penicillin acylase activity. was evaluated by Spectrum Color Reaction of p-dimethylaminobenzaldehyde with 6-APK according to U.S. Pat. patent ·. No. 116,959, modified by Balasingham et al. (Biochim. Biophys. Acta, 276, 2'50, 1972), at 42 ° C and a pH of 7.6 in the region of the zero-order reaction cleat. The initial substrate concentration, K, or Na-benzylicillin was 2% (w / v) in the assay. The enzyme activity unit is the amount of enzyme that catalyses the formation of 1 nmHu of 6-APK from benzylpenicillin or its salts per hour.

V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž se jimi omezuje.In the following, the invention is illustrated in more detail by way of non-limiting examples.

PřikladlHe did

K 25 kg vlhké buněčné pasty produkčního kmene · Escherichia coli (specifická · -aktivita penicilinacylázy činila 9,0 μπιοί 6-APK/hod./ /mg vlhké hmoty buněk) bylo- ·přidáno 50 · litrů pitné vody a pomocí vibračního· míchadla 1 · hodinu mícháno·. Homogenní suspenze buněk byla přečerpána do· nerezového míchaného kotle a pH suspenze bylo upraveno· z hodnoty 5,9 na hodnotu 7,0 2 N roztokem · NaOH; celkový objem suspenze čiβ nil 75 litrů. Po úpravě pH byly přidány za nepřetržitého· míchání 3 litry 25% vodného roztoku glutardi-aldehydu a 3 - hodiny mícháno· · při teplotě místnosti. Po· této době byla reakční směs za míchání zředěna pitnou vodou na · celkový objem 300 litrů a · odstředě na na separátoru Sharples. · Bylo· získáno celkem 24 kg vlhké · pasty jednotlivě z-esítěných buněk producenta..To 25 kg of wet cell paste of the production strain · Escherichia coli (specific · activity of penicillin acylase was 9.0 μπιοί 6-APK / hour / mg wet cell mass) was added · 50 liters of drinking water and using a vibrating stirrer 1 Stirred for 1 hour. The homogeneous cell suspension was pumped into a stainless steel stirred tank and the pH of the suspension was adjusted from 5.9 to 7.0 with a 2 N NaOH solution; the total volume of the suspension was 75 liters. After adjusting the pH, 3 liters of a 25% aqueous solution of glutardaldehyde were added under continuous stirring and stirred at room temperature for 3 hours. After this time, the reaction mixture was diluted with drinking water to a total volume of 300 liters with stirring and centrifuged on a Sharples separator. A total of 24 kg of wet paste of individually produced cross-linked cells was obtained.

K 24 · kg pasty zesítěných buněk bylo· přidáno 45 litrů pitné vody a pomocí vibračního míchadla byla · suspenze homogenizována po· dobu 1 hodiny; objem suspenze činil 70 litrů. · Homogenní suspenze zesítěných buněk byla přečerpána ·do ex-trakčnfho míchaného kotle a přidáno · 7 litrů butylacetáťu a intenzívně mícháno po dobu · 3 hodin při teplotě místnosti. Po této době byla za · míchání suspenze zředěna přidáním 33 litrů pitné vody a přidáno· · 2,68 litru 25% vodného roztoku Slovafplu 909. Po přidání smá.čedla byla, suspenze ještě po· dobu · 30 minutmíchána, · poté · zředěna pitnou vodou na celkový objem 300· _ litrů a zesítěné buňky separovány na odstředivce· Sharplés. Bylo získáno· celkem · 22' kg · zesítěných a · částečně permeabilizovaných buněk (vlhké buněčné. pasty). · K · 22 kg této- pasty bylo· předloženo· 88 · litrů pitné vody a pomocí vibračního míchadla hyla pasta homogenizována po dobuTo 24 · kg of cross-linked cell paste · 45 liters of drinking water were added and the suspension was homogenized for 1 hour using a vibrating stirrer; the suspension volume was 70 liters. The homogeneous cross-linked cell suspension was pumped to an extraction agitator and added 7 liters of butyl acetate and stirred vigorously for 3 hours at room temperature. After this time, the stirring of the suspension was diluted by adding 33 liters of drinking water and 2.68 liters of a 25% aqueous solution of Slovafplu 909. After the addition of the wetting agent, the suspension was stirred for 30 minutes, then diluted with drinking water. water to a total volume of 300 liters and the cross-linked cells separated on a Sharplés centrifuge. A total of 22 kg of cross-linked and partially permeabilized cells (wet cell pastes) were obtained. · K · 22 kg of this paste · · submitted · 88 · liters of drinking water and homogenized with hyla paste

1. hodiny. Po· této době · byla homogenní suspenze přečerpána do nerezového míchaného· kotle, vytemperována na teplotu 40 °C a po dobu 72 hodin při této teplotě ostře míchána.1st hour. After this time, the homogeneous suspension was pumped into a stainless steel stirred tank, allowed to warm to 40 ° C and stirred vigorously for 72 hours at this temperature.

Po· této· době byla suspenze zesítěných a permeabilizovaných buněk ochlazená na teplotu +20 °C, doplněna pitnou vodou na celkový objem 100 litrů, upraveno pH suspenze na hodnotu 7,0 2 N roztokem NaOH a za míchání · přidáno 0,5 · kg polyethyleniminu (Sedipur KA). Suspenze byla ještě cca 15 minut míchána · a poté byly přidány 4 litry 25% vodného· roztoku glutardialdehydu · a míchaná reakční směs ihned rozdělena do polyethylenových sáčků po 750· ml a · sáčky zataveny. Ihned po· naplnění byly · polyethylenové sáčky umístěny · ve vodorovné poloze' do· předchlazených nerezových táců a umístěny po dobu 5 hodin do mrazicího· boxu při teplotě · · —25 °C. Po této· době byly · sáčky vyňaty, zmrzlý obsah · v sáčcích mechanicky rozlámán na menší kousky, sáčky · rozstříženy a jejich obsah postupně vsypáván do 150 litrů · pitné vody, předložené v nerezovém kotli při teplotě místnosti. Po· vsypání obsahu všech sáčků · byly vázané buňky ponechány · v předložené vodě v klidu po dobu 2 hodin. Po této době byly rozmražené částice vázaných buněk·zamíchány a · čerpány na nuč s předloženou terylenovou plachetkou, vakuově odsáty a · · 3krát dekantovány ve 120 litrech pitné vody. Po poslední dekantaci byly částice popsaným · způsobem vakuově dobře odsáty a zváženy.At this time, the suspension of cross-linked and permeabilized cells was cooled to + 20 ° C, made up to a total volume of 100 liters with potable water, adjusted the pH of the suspension to 7.0 with 2 N NaOH, and added 0.5 · kg with stirring. polyethyleneimine (Sedipur KA). The suspension was stirred for about 15 minutes and then 4 liters of a 25% aqueous solution of glutardialdehyde was added and the stirred reaction mixture was immediately dispensed into polyethylene bags of 750 ml and sealed. Immediately after filling, the polyethylene bags were placed horizontally in pre-cooled stainless steel trays and placed in a freezer at 5 ° C for 5 hours. After this time, the bags were removed, the frozen contents were broken mechanically into smaller pieces, the bags were shredded and their contents were gradually poured into 150 liters of drinking water presented in a stainless steel boiler at room temperature. After pouring the contents of all bags, the bound cells were left in the submitted water for 2 hours. After this time, the thickened bound cell particles were · mixed and pumped with a terylene sheet, vacuum-aspirated and · decanted three times in 120 liters of drinking water. After the last decantation, the particles were well aspirated and weighed in a vacuum-like manner.

kg vlhké hmoty · vázaných buněk · bylokg wet mass · bound cells · was

203807 suspendováno· za . míchání v předložených 50 litrech směsi aceton/voda (1:1), ' vychlazené předem na teplotu — 20 °C, a 3 . minuty byla suspenze míchána,. Po· této· době byly částice ihned .ostře -vakuově odsáty a na nuči ještě prosévány - po dobu 30 minut, ·načež byly suspendovány v 50 litrech . 0,05 M fosfátového* pufru podle .Sorensena - o pH 7,6 a ponechány botnat. přes - noc . -při teplotě +8°C - a po·, nabotnání opět dobře vakuově odsáty a prúsávány ještě po - dobu cca 30 minut. - Částice byly. uloženy - do polyethylenového boku, zváženy -a - sušeny při teplotě +8^qC při vlhkosti vzduchu 57 - - % (40%203807 suspended · za. stirring in the present 50 liters acetone / water (1: 1) mixture, pre-cooled to -20 ° C, and 3. The suspension was stirred for 1 minute. At this time, the particles were immediately sucked off under vacuum and sieved on the suction for 30 minutes, then suspended in 50 liters. 0.05 M phosphate buffer according to Sorensen - pH 7.6 and allowed to swell. overnight . - at a temperature of + 8 ° C - and after this, the swelling is again well sucked out by suction and sucked for about 30 minutes. - The particles were. stored - in polyethylene flank, weighed - and - dried at +8 ^q C at 57 - -% humidity (40%)

H2SO4) po dobu 72 hodin. 'H2SO4) for 72 hours. '

Bylo získáno- celkem 15,5 kg vlhké hmoty vázaných buněk, což je 6,2 kg suché hmoty a - - 62% výtěžek - hmoty vztaženo· na nativní buňky; vlhkost vázaného buněčného· preparátu činila 60 -%. Specifická -aktivita penícíllnacylázy - vázaných buněk činila 7,8 ^molů 6-APK/h/mg vlhké hmoty, což jest 86,7% výtěžek specifické enzymové -aktivity, vztaženo· na - -nativní buňky. -2,5 g vlhké hmoty vázaných buněk -suspendovaných -v 25 ml - vody, sedimentovalo- - . kvantitativně ža 3 minuty; - toto množství v - uvedeném - objemu zaujímalo po- sedimentaci objem 8 ml. Distribuce velikosti částic se- pohybovala v rozmezí 150 áž 250- pm (0,15 - až 0,225 - mm). Materiál - sestával - z drobných destiček tmavohnědého· zbarvení, pískovitého charakteru. Stabilita materiálu byla testována při jeho -skladování při teplotě +2 -až -+8 °C - ' ve formě popsaným způsobem- získané vlhké hmoty částic, uložených v polyethylenových uzavřených lahvích. V průběhu 2 měsíců za uvedených podmínek skladování -nedošlo k poklesu enzymové -aktivity částic vázaných buněk. Stabilita částic na mechanický otěr byla zkoumána - po dobu 2 měsíců -suspendováním 20- g vlhké hmoty materiálu ve 100 - ml destilované vody; suspenze byla nalita do skleněných varných baněk o -obsahu 500 ml, překryta hliníkovou fólií a baňky umístěny -na rotační třepací stroj o počtu - otáček 260/min při teplotě 30 °C. Specifická -aktivita částic - po 2 měsících nepřetržitého třepání za uvedených . podmínek činila 93,8 % aktivity výchozí při - celkovém zůstatku vlhké hmoty částic 16,5 g (82,5 %). .A total of 15.5 kg wet mass of bound cells was obtained, which is 6.2 kg dry mass and - 62% yield - mass based on native cells; the moisture of the bound cell preparation was 60 -%. The specific activity of the foamed acylase-bound cells was 7.8 [mu] moles of 6-APK / h / mg wet, which is a 86.7% yield of specific enzyme activity relative to the native cells. -2.5 g of wet mass of bound cells - suspended - in 25 ml - water, sedimented -. quantitatively for 3 minutes; - this amount in the - stated - volume occupied a sedimentation volume of 8 ml. The particle size distribution ranged from 150 to 250 µm (0.15-0.225 mm). Material - consisted of - small plates of dark brown · color, sand-like character. The stability of the material was tested when stored at a temperature of +2 to +8 ° C in the form of the wet mass of particles deposited in polyethylene sealed bottles as described above. The enzyme activity of the bound cell particles did not decrease within 2 months under the stated storage conditions. The stability of the particles to mechanical abrasion was investigated - for 2 months - by suspending 20 g of wet material in 100 ml of distilled water; The suspension was poured into 500 ml glass flasks, covered with aluminum foil and the flasks placed on a rotary shaker at 260 rpm at 30 ° C. Specific -activity of particles - after 2 months of continuous shaking under the indicated. conditions, 93.8% of the initial activity at a total wet mass balance of 16.5 g (82.5%). .

Dále byly zkoumány hydrodynamické vlastnosti materiálu. -50- g . vlhké hmoty vávaných buněk bylo naplněno· -do skleněného sloupce o průměru 2,6 cm -s temperovaným pláštěm - při teplotě 37 °C. Materiálem byl čerpán 0,05 M fosfátový pufr pH 7,6 směrem zdola nahoru rychlostí 1846 ml/h. Objem· -materiálu ve- vznosu- při této· průtokové rychlosti činil 220,3 cm·³, výška - materiáluFurther, the hydrodynamic properties of the material were investigated. -50- g. the wet mass of the cells to be filled was filled into a 2.6 cm diameter glass column with a tempered jacket at 37 ° C. 0.05 M phosphate buffer pH 7.6 was pumped from bottom to top at a rate of 1846 ml / h. The volume of the material at elevation at this flow rate was 220.3 cm @ ³ , the height of the material

41,5 cm. Za tohoto.uspořádání bylo- provedeno 5 opakovaných konverzí 0,5 litru 6,5% . roztoku K-soli benzylpenicilinu na 6-APK recirkulací reakční -směsi při kontinuální úpravě pH zředěnou čpavkovou vodou v skleněné míchané nádobě umístěné - mimo sloupec. Průměrná hodnota konverze činila 95,2-% za 2,5 hodiny.41,5 cm. In this arrangement, 5 repeated conversions of 0.5 liter of 6.5% were performed. solution of benzylpenicillin K-salt to 6-APK by recirculating the reaction mixture while continuously adjusting the pH with dilute ammonia water in a glass stirred vessel placed - outside the column. The average conversion value was 95.2% over 2.5 hours.

P ř í k - 1 a d- 2Example - 1 and d-2

Zesítění jednotlivých buněk (25 kg - buněčné pasty) -E coli bylo - provedeno podle - příkladu 1.· Po· skončení reakce, naředění -a separaci buněk byly zesítěné buňky homogenizovány- ve stejném objemu, -přečerpány do nerezového míchaného - kotle - - a suspenze temperována - na teplotu 40 °C. - Po- - vytemperování -suspenze -na uvedenou teplotu - bylo k .ostře míchané suspenzi, jejíž celkový -objem, činil 70 litrů, přidáno- 7 litrů butylac-etátu, 0,5 kg - Slovafolu· 910 -a směs- míchána při- teplotě 40 °C po dobu 10 hodin. - Po- této době byla suspenze zesítěných- a permeabilizovaných buněk zředěna - pitnou vodou na celkový -objem 500 - litrů a - odstředěna na separátoru Sharples. - Bylo získáno celkem 20 kg - vlhké hmoty zesítěné -a permeabilizované buněčné pasty.Single cell cross-linking (25 kg - cell paste) -E coli was carried out according to Example 1. After completion of the reaction, dilution and cell separation, the cross-linked cells were homogenized in the same volume, pumped into a stainless steel stirred tank. and the suspension was tempered to 40 ° C. After tempering the suspension at this temperature, 7 liters of butyl acetate, 0.5 kg of Slovafol · 910, were added to the sharply stirred suspension, the total volume of which was 70 liters, and the mixture was stirred at - a temperature of 40 ° C for 10 hours. At this time, the suspension of cross-linked and permeabilized cells was diluted with drinking water to a total volume of 500 liters and centrifuged on a Sharples separator. A total of 20 kg of crosslinked wet mass and permeabilized cell paste was obtained.

Pasta- byla - h-omogenizována,. přečerpána do- nerezového míchaného. - kotle; zředěna na celkový objem 100 litrů - á. při teplotě 20 °C přidán -Sediput KA - -a glutardialdehyd ve stejných koncentracích jako v příkladu - 1 - a dále bylo ve způsobu přípravy postupováno rovněž, - jak - je uvedeno- v příkladu 1.The pasta was - h-omogenised. pumped into stainless steel mixer. - boilers; diluted to a total volume of 100 liters - á. at 20 ° C, -Sediput KA - and glutardialdehyde were added at the same concentrations as in Example 1, and the preparation was also carried out as described in Example 1.

Bylo· - získáno celkem 17 kg vlhké - hmoty vázaných buněk při výtěžku 68 - % - - ' hmoty, vztaženo- -na nativní buňky. Specifická aktivita- penicilinacylázy činila 8,0 μΐηοΐύ 6-APK/h/mg vlhké hmoty, což jest 88,9% výtěžek specifické -enzymové - aktivity, vztaženo na nativní buňky. - Velikost částic se pohybovala mezi 300 až 450 μΐη (0,3- až 0,45 milimetru). Materiál sestával z destiček tmavohnědého. -až černého zbarvení pískovitého charakteru a za stejných podmínek, jak je uvedeno v příkladu 1, ke kvantitativní sedimentaci materiálu došlo- za 2 minuty.A total of 17 kg of wet bound cell mass was obtained at a yield of 68% by mass relative to the native cell. The specific activity of penicillin acylase was 8.0 μΐηοΐύ 6-APK / h / mg wet mass, which is 88.9% yield of specific -enzyme activity relative to native cells. - The particle size was between 300 and 450 μΐη (0.3 to 0.45 millimeters). The material consisted of dark brown plates. Up to a black color of sand-like character and under the same conditions as in Example 1, quantitative sedimentation of the material occurred in 2 minutes.

Příklad - 3Example - 3

Zesítění a permeabilizace jednotlivých buněk E.coli (25 - kg buněčné pastý) bylo provedeno - podle příkladu 2. Bylo získáno opět 20- kg vlhké buněčné pasty. Pasta byla stejným způsobem homogenizována a zředěna na celkový objem 100 -litrů v nerezovém· míchaném kotli při teplotě +20 °C. Poté namísto Sedipuru - KA bylo přidáno 0,5 kg hexamethylendiaminu a poté za- jinak stejných podmínek přidán glutardialdehyd ve stejné koncentraci jako· v příkladu 1 a dále postupováno- za -stejných podmínek, -rovněž jak je uvedeno v příkladu 1.Cross-linking and permeabilization of single E. coli cells (25-kg cell paste) was performed according to Example 2. Again, 20-kg wet cell paste was recovered. The paste was homogenized in the same way and diluted to a total volume of 100 liters in a stainless steel stirred tank at +20 ° C. Subsequently, 0.5 kg of hexamethylenediamine was added in place of Sedipur-KA, and then, under otherwise identical conditions, glutardialdehyde was added at the same concentration as in Example 1, followed by the same conditions as in Example 1.

Bylo získáno - celkem 16,8 kg vlhké hmoty vázaných buněk při výtěžku 67,2 - % hmoty, vztaženo- -na nativní buňky. Specifická -aktivita penicilinacylázy činila 5,4 pimolů 6-APK/ /h/mg vlhké hmoty, což jest 60% výtěžek specifické enzymové aktivity, vztaženo na nativní buňky. 283A total of 16.8 kg of wet mass of bound cells was obtained at a yield of 67.2% of mass relative to native cells. The specific activity of penicillin acylase was 5.4 pimoles of 6-APK / h / mg wet, which is a 60% yield of specific enzyme activity relative to native cells. 283

Velikost částic „ se pohybovala v rozmezí 75 až 1'50 μτα (0,075 až 0,15' mm). .Materiál . sestával z nepravidelných destiček červeho• hnědého· zbarvení, pískovitého· . charakteru a za stejných podmínek, jak je uvedeno v příkladu 1, ke kvantitativní sedimentaci materiálu došlo za 4 minuty.The particle size "ranged from 75 to 1'50 μτα (0.075 to 0.15" mm). .Materiál. consisted of irregular plates of red • brown · color, sandy ·. of character and under the same conditions as in Example 1, quantitative sedimentation of the material occurred in 4 minutes.

příklad 4Example 4

Zesítění jednotlivých buněk, jejich permeabilizacé a vazba produkčních buněk by% la provedena podle příkladu 2 s tím. rozdílem, že namísto Sedipuru KA byl použit ethylendiamin v množství '0,75 kg.Single cell cross-linking, permeabilization, and production cell binding would be performed according to Example 2 accordingly. except that 0.75 kg of ethylenediamine was used instead of Sedipur KA.

Bylo· získáno 13,8 kg vlhké hmoty vázaných buněk při 'výtěžku 55,2 % hmoty, vztaženo na nativní buňky. Specifická aktivita penicilinacylázy činila 3,9 ^molů 6-APK/h/mg vlhké hmoty, což jest 43,3% výtěžek specifické . enzymové aktivity, vztaženo na nativní buňky. Velikost částic se pohybovala v rozmezí ' 50 'až 150 μη ' (0,05 až 0,15 mm). Materiál sestával z nepravidelných destiček hnědého· zbarvení, pískovitého charakteru a za 'stejných podmínek, jak je uvedeno v příkladu 1, ke kvantitativní sedimentaci došlo . za '5 minut.13.8 kg of wet mass of bound cells were obtained at a yield of 55.2% of mass based on native cells. The specific activity of penicillin acylase was 3.9 µmol of 6-APK / h / mg wet mass, which is a 43.3% specific yield. enzyme activity relative to native cells. The particle size ranged from '50' to 150 μη '(0.05 to 0.15 mm). The material consisted of irregular plates of brown color, sandy character and under the same conditions as in Example 1, quantitative sedimentation occurred. in 5 minutes.

P ř í k 1 .a d 5Example 1 and d 5

Zesítění jednotlivých buněk a jejich permeabilizace byla provedena podle příkladuCross-linking of individual cells and their permeabilization was performed according to the example

2. 20 kg vlhké hmoty zesítěné a permea-bilizované buněčné pasty bylo homogenizováno v 50 litrech vody a poté přečerpáno· do· nerezového míchaného· kotle, zředěno· na celkový objem 100· litrů při teplotě v rozsahu 20 až 25 °C, úpravě pH na 7,0,' a přidáno 100 g Sedipuru KA, promícháno·, . . míchadlo zastaveno. a reakční směs ponechána 30 minut v klidu, aby došlo. ' ke' kvantitativnímu vyvločkování buněk. Poté byla reakční směs • pomalu míchána a k vyvločkované· suspenzi přidány 4 litry 25% vodného roztoku. glutardialdehydu. Reakční směs byla pomalu míchána (50 ot/min) po' dobu 2 hodin při teplotě 20' °C. Po této' době byla reakční směs zředěna přidáním 400 litrů pitné vody a2. 20 kg of the wet mass of cross-linked and permeabilized cell paste was homogenized in 50 liters of water and then pumped into a stainless steel stirred tank, diluted to a total volume of 100 liters at a temperature in the range of 20-25 ° C, pH adjustment to 7.0, and added 100 g Sedipur KA, mixed. . stirrer stopped. and the reaction mixture was allowed to stand for 30 minutes to effect. 'to' quantitatively flocculate cells. The reaction mixture was stirred slowly and 4 L of a 25% aqueous solution was added to the flocculated suspension. glutardialdehyde. The reaction mixture was slowly stirred (50 rpm) for 2 hours at 20 ° C. After this time, the reaction mixture was diluted by adding 400 liters of drinking water and

7 částice vázaných buněk' odstředěny na separátoru Sharples. Separované vlhké částice byly dvakrát dekantovány pitnou vodou a . posléze vakuově odsáty, jak je uvedeno v příkladu 1. Dobře odsáté částice vázaných buněk byly. suspendovány ve 30 litrech čistého acetonu, vychlazeného' na teplotu '—25° Celsia, a 3 minuty byla suspenze míchána. Dále bylo' postupováno, jak je uvedeni· ' v příkladu 1.7 particles of bound cells were centrifuged on a Sharples separator. The separated wet particles were decanted twice with drinking water and. then vacuum aspirated as shown in Example 1. The well-aspirated bound cell particles were. suspended in 30 liters of pure acetone cooled to -25 ° C and stirred for 3 minutes. The procedure of Example 1 was followed.

Bylo· získáno celkem 8,9 kg . vlhké hmoty vázaných buněk, |Což jest 35,6% výtěžek hmoty, vztaženo. na nativní buňky··; specífická aktivita penicilinacylázy činila . 6,l· μηοlů 6-APK/h/mg. vlhké hmoty, což .. jest . 67'% výtěžek specifické enzymové . aktivity, .vztaženo. na nativní buňky. Velikost ' .částic se. pohybovala v rozmezí 25 až .100 . μπτ .(0,025 až '0,1 mm). Materiál sestával z . nepravidel' ných útvarů hnědého zbarvení . a . za.stejných podmínek, jak je uvedeno v příkladu '1, k jeho kvantitativní sedimentaci .'došlo. za 6,5 minuty. . .g: ' 'A total of 8.9 kg was obtained. the wet mass of bound cells, which is a 35.6% mass yield based on. on native cells ··; the specific activity of penicillin acylase was. 6,1 l · 6-APK / h / mg. damp matter, which is. 67% yield of specific enzyme. activities. to native cells. The particle size is. ranged from 25 to 100. μπτ (0.025 to 0.1 mm). The material consisted of. irregular brown formations. a. under the same conditions as in Example 1, it was quantitatively sedimented. in 6.5 minutes. . .g: ''

Pík -ladePeak -lade

Zesítění jednotlivých buněk a jejich . permeabilizace byly provedeny- podle příkladuCrosslinking of individual cells and theirs. permeabilizations were carried out according to the example

2. Dále bylo postupováno podle příkladu .5 s ' 'tím rozdílem,, že po. přidání 100 g Sedipuru KA, zamíchání a vyvločkování suspenze, přidání glutardialdehydu a . krátkodobého zamíchání probíhala reakce v klidu (bez míchání) po dobu 3 hodin. Po' této době byla reakční směs mírně - míchána a ' materiál ihned zpracován postupem uvedeným v příkladu 5. ~2. The procedure of Example 5 was followed, with the difference that after. adding 100 g of Sedipur KA, stirring and flocculating the suspension, adding glutardialdehyde and. brief stirring, the reaction was allowed to stand still (without stirring) for 3 hours. After this time, the reaction mixture was gently stirred and the material immediately worked up as outlined in Example 5. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight

Bylo získáno celkem 5 kg vlhké hmoty vázaných buněk při výtěžku 20 % hmoty, vztaženo. na nativní buňky. Specifická aktivita penicilinacylázy činila 4,5 μιηοΐύ 6-APK/h/mg vlhké hmoty, což jest 50% výtěžek specifické enzymové aktivity, vztaženo na nativní buňky. Velikost ' částic se pohybovala v rozmezí 25 až 100 μη (0,025 až 0,1 mm). Materiál sestával z nepravidelných drobných útvarů hnědého· zbarvení a za ' stejných podmínek, . jak je uvedeno· ' v příkladu 1, k jeho kvantitativní sedimentaci došlo za 10 minut.A total of 5 kg of wet mass of bound cells was obtained in a yield of 20% by mass. to native cells. The specific activity of penicillin acylase was 4.5 μιηοΐύ 6-APK / h / mg wet mass, which is a 50% yield of specific enzyme activity relative to native cells. The particle size ranged from 25 to 100 μη (0.025 to 0.1 mm). The material consisted of irregular small formations of brown color and under the same conditions. as shown in Example 1, its quantitative sedimentation occurred in 10 minutes.

Claims (3)

PŘEDMĚT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION 1. Způsob výroby ' vázaných buněk s ' .penicilinacylázovou aktivitou určených k přípra-.CLAIMS 1. A process for the production of 'bound cells with penicillin acylase activity to be prepared. vě 6-ami-nopenicilánové ' kyseliny enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenlcilinu, vyznačující se tím, že ' obsah jednotilvých ' buněk produkčního - - - mikroorganismu se .-zesítí - reakcí s bifunkčním aldehydem, š výhodou - - glutardialdehydem, - po -této· reakci se' - - žesítěné buňky ' permé-abilizují účinkem teploty, -organického , rozpouštědla a/nebo smáčedla, popřípadě kombinací těchto faktorů, potom se nechají reagovat ve vodném prostředí -s rozpustnou sloučeninou - obsahující - nejméně dýě primární a/nebo sekundářní -aminové - skupiny -a - s -bifunkčním· ' aldehy- . dem, - -s výhodou glutařdialdehydem, vzniklé vázané buněčné - částice se po· oddělení mechanicky.··· zpevní za -současné parciální de hydratace působením organických, s vodou mísitelných -rozpouštědel, s výhodou acetopu nebo- propanolu, popřípadě jejich směsí, za -teploty 0 až —30 °C, a uvádějí se do· - enzymově aktivní formy rehydratací ve 'vodném prostředí s hodnotou- pH 7 až 8, s výhodou ve fosfátovém pufru.in 6-aminopenicillanic acid by enzymatic hydrolysis of penicillin, in particular benzylpenilcillin, characterized in that the 'single cell' content of the producing microorganism is crosslinked by reaction with a bifunctional aldehyde, preferably glutamialialdehyde, The crosslinked cells are permeabilized by the action of a temperature, an organic solvent and / or a wetting agent, or a combination of these factors, then reacted in an aqueous medium with a soluble compound containing at least one primary and / or secondary amine - and - bifunctional aldehyde groups. The resulting cell-bound particles, after separation, are mechanically solidified upon simultaneous partial dehydration by the action of organic, water-miscible solvents, preferably acetone or propanol, or mixtures thereof, temperatures of from 0 to -30 ° C, and are introduced into the enzymatically active form by rehydration in an aqueous medium having a pH of 7 to 8, preferably in a phosphate buffer. 2. Způsob podle - bodu 1 vyznačující se tím, že se reakce zesítěných a permeabilizovaných - buněk s - rozpustnou sloučeninou, obsahující nejméně dvě primární -a/nebo sekundární aminové skupiny, a s bifunkčním - aldehydem, s výhodou glutardialdehydem, provádí při teplotě pod bodem tání reakční směsi. ’ '2. A process according to claim 1, wherein the reaction of the cross-linked and permeabilized cells with a soluble compound containing at least two primary and / or secondary amine groups and a bifunctional aldehyde, preferably glutardialdehyde, is carried out at a temperature below. melting of the reaction mixture. ' 3. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že - - se reakce provádí při teplotě 15 až 25 °C za -míchání 40 až 60 -ot/min nebo v klidu.3. The process according to claim 2, wherein the reaction is carried out at a temperature of 15 to 25 [deg.] C. with stirring at 40 to 60 rpm or at rest.