JPH03228683A - 生理活性ペプチドLD78α、LD78βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミド - Google Patents
生理活性ペプチドLD78α、LD78βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミドInfo
- Publication number
- JPH03228683A JPH03228683A JP29689690A JP29689690A JPH03228683A JP H03228683 A JPH03228683 A JP H03228683A JP 29689690 A JP29689690 A JP 29689690A JP 29689690 A JP29689690 A JP 29689690A JP H03228683 A JPH03228683 A JP H03228683A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ld78α
- ld78β
- gene
- peptide
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 13
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 24
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 abstract description 46
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 86
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 82
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 6
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 6
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 6
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 6
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 101800003265 Beta-thromboglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 101150055297 SET1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108700021154 Metallothionein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100028708 Metallothionein-3 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- RHMALYOXPBRJBG-WXHCCQJTSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]- Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RHMALYOXPBRJBG-WXHCCQJTSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N Ala-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000013925 CD34 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050003733 CD34 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025835 CDK2-associated and cullin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101000885147 Enterococcus avium D-arabitol-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000983944 Homo sapiens CDK2-associated and cullin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 101000815628 Homo sapiens Regulatory-associated protein of mTOR Proteins 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000652747 Homo sapiens Target of rapamycin complex 2 subunit MAPKAP1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023170 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 description 1
- AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N Phe-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N Pro-Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710167911 Repressible acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002548 cytokinetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004712 metrizoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanoethyl Chemical group 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生理活性ペプチドLD78αおよびLD78
β、これらのペプチドを酵母番こより産生させるための
組換えプラスミド番こ関する。さら(こは、これらのペ
プチドの効率的な製法およびその利用方法に関する。
β、これらのペプチドを酵母番こより産生させるための
組換えプラスミド番こ関する。さら(こは、これらのペ
プチドの効率的な製法およびその利用方法に関する。
ヒトリンパ球を、12−0−テトラデカノイ!レホ!レ
ボルー13−アセテート(TPA)或はファイトへマグ
ルチニン(PHA)等で刺激すると、インターロイキン
2、γ−インターフェロン等の発現が誘導されること力
(知られている[J、 Exp、 Med、、 Vol
163. p922(1986) ] 。
ボルー13−アセテート(TPA)或はファイトへマグ
ルチニン(PHA)等で刺激すると、インターロイキン
2、γ−インターフェロン等の発現が誘導されること力
(知られている[J、 Exp、 Med、、 Vol
163. p922(1986) ] 。
本発明者らは、ヒト扁桃腺リンノく球のcDFIA力)
らTPA、 PI(Aで刺激することにより特異的に発
現が誘導される新規の生理活性ポリペプチドをコードす
ることが予想されるcDNAクローン(pLD78cD
NA)を得た[ J、 Biochemistry、
vol 99.885−894 (1986) ]、
Lかしながら、LD78に相当するヒト由来ポリペプ
チドは未だ同定されていない、そのため、LD78ポリ
ペプチドの生理活性は全(未知のものであった。
らTPA、 PI(Aで刺激することにより特異的に発
現が誘導される新規の生理活性ポリペプチドをコードす
ることが予想されるcDNAクローン(pLD78cD
NA)を得た[ J、 Biochemistry、
vol 99.885−894 (1986) ]、
Lかしながら、LD78に相当するヒト由来ポリペプ
チドは未だ同定されていない、そのため、LD78ポリ
ペプチドの生理活性は全(未知のものであった。
LD78はそのcDNA塩基配列から予想されるアミノ
酸配列より、β−スロンボグロプリンスーパーファミリ
ジー属すると考えられる。β−スロンボグロプリンスー
パーファミリジー属するポリペプチドの機能は、炎症、
損傷治癒、造腫瘍性との関連が示唆されている[ Pr
oc、 Natl、 Acad、 Set。
酸配列より、β−スロンボグロプリンスーパーファミリ
ジー属すると考えられる。β−スロンボグロプリンスー
パーファミリジー属するポリペプチドの機能は、炎症、
損傷治癒、造腫瘍性との関連が示唆されている[ Pr
oc、 Natl、 Acad、 Set。
USA、’、Vol 84.7188−7192(19
87)、 Ce1l、 Vol 49゜321−328
(1987)、 J、 EXp、 Med、、 Vol
166、10841097 (1987) ] 。
87)、 Ce1l、 Vol 49゜321−328
(1987)、 J、 EXp、 Med、、 Vol
166、10841097 (1987) ] 。
以上のような状況の中で、LD78の生理活性を明らか
にするにあたっては、ヒト由来LD7Bポリペプチドが
得られていない現状では大きな制約があり、生化学的に
抗LD78抗体すら得られていないことからその解析は
困難を極めていた。
にするにあたっては、ヒト由来LD7Bポリペプチドが
得られていない現状では大きな制約があり、生化学的に
抗LD78抗体すら得られていないことからその解析は
困難を極めていた。
リンパ球は、リンフ才力インと呼ばれる免疫反応のメデ
イエータ−である生理活性ポリペプチドを産生ずる0分
子生物学および細胞生物学の急速な発達により、各種リ
ンフ才力イン、およびマクロファージにより産生される
モノ力イン(これらを総称してサイト力インと呼ばれて
いる)の生物学的機能、役割が徐々に解明されつつある
。
イエータ−である生理活性ポリペプチドを産生ずる0分
子生物学および細胞生物学の急速な発達により、各種リ
ンフ才力イン、およびマクロファージにより産生される
モノ力イン(これらを総称してサイト力インと呼ばれて
いる)の生物学的機能、役割が徐々に解明されつつある
。
血球系細胞の増殖・分化には種々のサイト力インが関与
し、複雑なネットワークを形成していることが知られて
いる し実験医学、VOL 7.25−30(1989
) 1 、 造血に関与する主なサイト力インは、イ
ンターロイキン(IL−1〜7.9)、顆粒球コロニー
刺激因子(G−C5F)、顆粒球−マクロファージコロ
ニ刺ffi 因子(G!4−C3F)、マクロファージ
コロニー刺激因子(M−C3F)、エリスロボイエチン
(EPO)等である。
し、複雑なネットワークを形成していることが知られて
いる し実験医学、VOL 7.25−30(1989
) 1 、 造血に関与する主なサイト力インは、イ
ンターロイキン(IL−1〜7.9)、顆粒球コロニー
刺激因子(G−C5F)、顆粒球−マクロファージコロ
ニ刺ffi 因子(G!4−C3F)、マクロファージ
コロニー刺激因子(M−C3F)、エリスロボイエチン
(EPO)等である。
それらの多くは、標的となる細胞によって程々の生理活
性をあられす0分化後期の血球系細胞に作用する因子、
たとえばG−C8FやEPOの場合には、それぞれ、好
中球コロニー形成促進および活性化、赤血球産生の調節
といった作用が顕著にあられれ、一部は既に治療薬とし
て用いられている。
性をあられす0分化後期の血球系細胞に作用する因子、
たとえばG−C8FやEPOの場合には、それぞれ、好
中球コロニー形成促進および活性化、赤血球産生の調節
といった作用が顕著にあられれ、一部は既に治療薬とし
て用いられている。
また、IL−3はマルチコロニー刺激因子としても知ら
れ、骨髄細胞から種々のコロニーを産生させることから
、非常に未分化の細胞(骨髄幹細胞)に作用しているも
のと考えられている。これらは、いずれも細胞の増殖、
コロニー形成に対して促進作用をもっており、血球系細
胞の正の制御因子である。
れ、骨髄細胞から種々のコロニーを産生させることから
、非常に未分化の細胞(骨髄幹細胞)に作用しているも
のと考えられている。これらは、いずれも細胞の増殖、
コロニー形成に対して促進作用をもっており、血球系細
胞の正の制御因子である。
一方、血球系細胞の増殖・分化の調節において、血球系
細胞のホメオスタシスを維持するため、負の制御因子も
重要視されている。骨髄m@のコロニー形成を抑制する
ことが知られている因子は、腫瘍増殖因子(TGF−β
)、インターフェロン類、ナチュラルキラー細胞由来因
子等である[ J、 Exp。
細胞のホメオスタシスを維持するため、負の制御因子も
重要視されている。骨髄m@のコロニー形成を抑制する
ことが知られている因子は、腫瘍増殖因子(TGF−β
)、インターフェロン類、ナチュラルキラー細胞由来因
子等である[ J、 Exp。
Med、 Vol 168. 737−750(
1988)、 Exp、 Hematol、。
1988)、 Exp、 Hematol、。
Vol 16.131−138(1988)1. 中
でも、TGF−βは、腫瘍増殖因子として単離されたも
のであるが、血球系細胞に対しては1分化初期の前駆細
胞の増殖と分化を選択的に抑制する。そして、分化後期
の細胞については増殖・分化を抑制しない、このように
、対象となる細胞種によって同一のポリペプチドでも全
く異なる作用を示す例も少なくない。
でも、TGF−βは、腫瘍増殖因子として単離されたも
のであるが、血球系細胞に対しては1分化初期の前駆細
胞の増殖と分化を選択的に抑制する。そして、分化後期
の細胞については増殖・分化を抑制しない、このように
、対象となる細胞種によって同一のポリペプチドでも全
く異なる作用を示す例も少なくない。
一つのポリペプチドが作用する細胞によって種々の活性
を示す例として、白血病細胞増殖抑制因子(LIF)が
あげられる、LIFは、もともとマウスの白血病細胞株
M1細胞の増殖抑制・分化誘導因子として同定された[
J、 Biol、 Ches、 、 Vol 263
9238−9243(1988)]、 Lかしその後
、LIFは以下に示すような様々な生理活性を持つ因子
と同一のポリペプチドであることが判明した。たとえば
、ヒトT細胞が産生ずる、マウス IL−3依存性細胞
DA1aの増殖因子[Nature、 Vol 336
.690−691<1988) ]、肝細胞に作用して
急性期タンパク質を誘導する肝細胞刺激因子m (H8
FIn ) [J、 1w+1iunol。
を示す例として、白血病細胞増殖抑制因子(LIF)が
あげられる、LIFは、もともとマウスの白血病細胞株
M1細胞の増殖抑制・分化誘導因子として同定された[
J、 Biol、 Ches、 、 Vol 263
9238−9243(1988)]、 Lかしその後
、LIFは以下に示すような様々な生理活性を持つ因子
と同一のポリペプチドであることが判明した。たとえば
、ヒトT細胞が産生ずる、マウス IL−3依存性細胞
DA1aの増殖因子[Nature、 Vol 336
.690−691<1988) ]、肝細胞に作用して
急性期タンパク質を誘導する肝細胞刺激因子m (H8
FIn ) [J、 1w+1iunol。
Vol 143.1163−1167(1989)]、
全能性胚性幹細胞ES細胞、テトラカルシノーマ幹細胞
および脂性癌細胞EC細胞に作用してその未分化状態を
保持する因子[Nature、 Vol 336.68
4−687(1988)、 Nature。
全能性胚性幹細胞ES細胞、テトラカルシノーマ幹細胞
および脂性癌細胞EC細胞に作用してその未分化状態を
保持する因子[Nature、 Vol 336.68
4−687(1988)、 Nature。
Vol 336.668−690(1988)] 等テ
アL。
アL。
また、血球系細胞に作用する因子であるからといって、
必ずしもリンパ球のみが産生ずるわけではなく、LIF
をはじめ顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン6
等は繊維芽細胞等によっても産生されることが明かとな
っている。
必ずしもリンパ球のみが産生ずるわけではなく、LIF
をはじめ顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン6
等は繊維芽細胞等によっても産生されることが明かとな
っている。
このように、生体内では、一つの生理活性ポリペプチド
が様々の細胞に対して働きうる可能性が示唆されるよう
になってきた。
が様々の細胞に対して働きうる可能性が示唆されるよう
になってきた。
LD78遺伝子に関しては、その生理活性が明らかにさ
れないうちに、分子生物学的手法によって遺伝子がクロ
ーニングされた。そのような場合、遺伝子産物の同定と
生理活性の探索には困難を極める0通常は、遺伝子操作
技術を用いて適当な宿主にリコンビナントポリペプチド
を産生させ、その物理的、化学的、生物学的性状を検討
することになる。しかし、すべての遺伝子が同様に発現
されるわけではなく、遺伝子発現に用いるベクターおよ
び宿主の選択に一般的な規則性は見いだされてはいない
、また、発現されるタンパク質が、本来生体内に存在す
るタンパク質と同一の生理活性を持つという保証は全く
といってよいほどない。
れないうちに、分子生物学的手法によって遺伝子がクロ
ーニングされた。そのような場合、遺伝子産物の同定と
生理活性の探索には困難を極める0通常は、遺伝子操作
技術を用いて適当な宿主にリコンビナントポリペプチド
を産生させ、その物理的、化学的、生物学的性状を検討
することになる。しかし、すべての遺伝子が同様に発現
されるわけではなく、遺伝子発現に用いるベクターおよ
び宿主の選択に一般的な規則性は見いだされてはいない
、また、発現されるタンパク質が、本来生体内に存在す
るタンパク質と同一の生理活性を持つという保証は全く
といってよいほどない。
多くの場合、タンパク質の二次構造、三次構造の違い、
タンパク質修飾の有無(糖鎖およびアシル化等)が異な
ることが知られている。さらには、サイト力イン類の場
合には、非常に微量でも相乗的に働くことも知られてお
り(J、 Exp、 Med、、Vo1166、185
H1987))、遺伝子発現系に起因する混入物が研究
をさらに困難にしている。
タンパク質修飾の有無(糖鎖およびアシル化等)が異な
ることが知られている。さらには、サイト力イン類の場
合には、非常に微量でも相乗的に働くことも知られてお
り(J、 Exp、 Med、、Vo1166、185
H1987))、遺伝子発現系に起因する混入物が研究
をさらに困難にしている。
本発明者らは、新規のサイト力インをコードすると期待
されるヒトLD78αおよびβをコードする遺伝子をク
ローニングし、これを適当な遺伝子発現プロモーターの
制御下に組み込み、酵母において発現させ、該酵母細胞
を培養することによって、LD78ポリペプチドを純粋
なポリペプチドとして得ることに成功した。さらにこの
ポリペプチドがこれまでに知られていない生理活性を有
することを見いだし本発明を完成するに至った。
されるヒトLD78αおよびβをコードする遺伝子をク
ローニングし、これを適当な遺伝子発現プロモーターの
制御下に組み込み、酵母において発現させ、該酵母細胞
を培養することによって、LD78ポリペプチドを純粋
なポリペプチドとして得ることに成功した。さらにこの
ポリペプチドがこれまでに知られていない生理活性を有
することを見いだし本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、新規な生理活性ペプチドLD78
αおよびLD78β、これらを大量に得る製法を提供し
、さらにこのペプチドの新たな生理活性を明らかにする
ことによりこのペプチドの新たな利用方法を提供するも
のである。
αおよびLD78β、これらを大量に得る製法を提供し
、さらにこのペプチドの新たな生理活性を明らかにする
ことによりこのペプチドの新たな利用方法を提供するも
のである。
本発明のLD78αおよびLD78βポリペプチドは、
骨髄単核細胞の培養において、血液系細胞の源である骨
髄幹細胞の増殖・分化を抑制する物質で、増殖性の高い
細胞を死滅させる抗癌剤等、化学療法剤等の投与時にみ
られる骨髄抑制を軽減する治療薬として利用しうる有用
な物質である。
骨髄単核細胞の培養において、血液系細胞の源である骨
髄幹細胞の増殖・分化を抑制する物質で、増殖性の高い
細胞を死滅させる抗癌剤等、化学療法剤等の投与時にみ
られる骨髄抑制を軽減する治療薬として利用しうる有用
な物質である。
また、LD78αおよびLD78βポリペプチドは自家
骨髄移植や骨髄バンクを構築する上で、骨髄幹細胞を未
分化のままで保存、あるいは培養することを可能にしう
る有用な物質である。
骨髄移植や骨髄バンクを構築する上で、骨髄幹細胞を未
分化のままで保存、あるいは培養することを可能にしう
る有用な物質である。
本発明者らは、上記目的を達成する為に研究を行った結
果、ヒトLD78β遺伝子のクローニング、塩基配列の
決定、LD78α及び該LD78β遺伝子を組み込んだ
プラスミドにより形質転換され、リコンビナントLD7
8α及びLD78βを発現する酵母を培養することによ
り、目的とするリコンビナントLD78α及びLD78
βポリペプチドを大量に製造する方法を確立した。
果、ヒトLD78β遺伝子のクローニング、塩基配列の
決定、LD78α及び該LD78β遺伝子を組み込んだ
プラスミドにより形質転換され、リコンビナントLD7
8α及びLD78βを発現する酵母を培養することによ
り、目的とするリコンビナントLD78α及びLD78
βポリペプチドを大量に製造する方法を確立した。
本発明では、発現されるリコンビナントLD78α及び
LD78βはほとんど#母菌体内に蓄積されることなく
、培養液中に効率的に分泌された。
LD78βはほとんど#母菌体内に蓄積されることなく
、培養液中に効率的に分泌された。
LD78α及びLD78β遠伝子に口伝子されるタンパ
ク質は比較的低分子であって、酵母菌由来のプロテアー
ゼによって分解を受けやすい0分泌発現系は、このよう
なプロテアーゼによる損傷を最小限に抑えることができ
る優れた生産方法である。また、培地中に放出される酵
母由来タンパク質は僅かであるので、目的物質の精製が
容易であるだけでなく、生理活性を探索する上では、微
量タンパク質が混在する可能性が掻めてうすい為、信頼
性の高い結果を得ることが出来るなど、菌体内発現の場
合と比較してきわめて有利である。
ク質は比較的低分子であって、酵母菌由来のプロテアー
ゼによって分解を受けやすい0分泌発現系は、このよう
なプロテアーゼによる損傷を最小限に抑えることができ
る優れた生産方法である。また、培地中に放出される酵
母由来タンパク質は僅かであるので、目的物質の精製が
容易であるだけでなく、生理活性を探索する上では、微
量タンパク質が混在する可能性が掻めてうすい為、信頼
性の高い結果を得ることが出来るなど、菌体内発現の場
合と比較してきわめて有利である。
このようにして初めて、LD78α及びLD78βポリ
ペプチドの生理活性を探索することが可能となった0本
発明者らは、このペプチドの様々な生理活性を検討した
結果、LD78α及びLD78βポリペプチドが、骨髄
単核細胞の培養において、骨髄造血幹細胞に直接的或い
は間接的に作用し、その増殖・分化を抑制することを明
らかにしたことにより、本発明を完成に至らしめた。
ペプチドの生理活性を探索することが可能となった0本
発明者らは、このペプチドの様々な生理活性を検討した
結果、LD78α及びLD78βポリペプチドが、骨髄
単核細胞の培養において、骨髄造血幹細胞に直接的或い
は間接的に作用し、その増殖・分化を抑制することを明
らかにしたことにより、本発明を完成に至らしめた。
本発明の完成によって、純粋なリコンビナントLD78
α及びLD78βポリペプチドが容易にかつ大量に入手
し得る手段が提供され、さらには、リコンビナントLD
78α及びLD78βは白血病などの癌治療に用いられ
る化学療法剤の投与時にみられる骨髄抑制の防止薬とし
て、自家骨髄移植や、骨髄幹細胞移植、骨髄バンクの構
築に必須となる骨髄幹細胞の分化抑制剤として、将来予
想される遺伝子治療の標的細胞となる骨髄幹細胞の培養
技術の開発等に必須な研究試薬として、医学の発達に貢
献するところは大きい。
α及びLD78βポリペプチドが容易にかつ大量に入手
し得る手段が提供され、さらには、リコンビナントLD
78α及びLD78βは白血病などの癌治療に用いられ
る化学療法剤の投与時にみられる骨髄抑制の防止薬とし
て、自家骨髄移植や、骨髄幹細胞移植、骨髄バンクの構
築に必須となる骨髄幹細胞の分化抑制剤として、将来予
想される遺伝子治療の標的細胞となる骨髄幹細胞の培養
技術の開発等に必須な研究試薬として、医学の発達に貢
献するところは大きい。
以下に本発明の組換えプラスミド、形質転ttau母、
それによる純粋なリコンビナントLD78α及びLD7
8βポリペプチドの製造、及びリコンビナントLD78
α及びLD78βポリペプチドの生理活性についてさら
に詳細に説明する。
それによる純粋なリコンビナントLD78α及びLD7
8βポリペプチドの製造、及びリコンビナントLD78
α及びLD78βポリペプチドの生理活性についてさら
に詳細に説明する。
LD α LD7
本発明に用いられるシャトルベクターに組み込むための
LD78α及びLD78β遺伝子は、TPA及びPHA
で刺激した扁桃腺リンパ球より調製したlRN^を出発
材料として常法に従い逆転写酵素により二本鎖cDNA
を合成し、これを大腸直によりクローニングしたもので
ある。
LD78α及びLD78β遺伝子は、TPA及びPHA
で刺激した扁桃腺リンパ球より調製したlRN^を出発
材料として常法に従い逆転写酵素により二本鎖cDNA
を合成し、これを大腸直によりクローニングしたもので
ある。
LD78α遺伝子cDNAは約900塩基対からなり、
アミノ酸をコードする領域の完全な配列を含む、このL
D78α遺伝子cDN^をプローブとしてヒト染色体D
NAのサザン分析を行うと、三本のバンドが検出された
(サイズは、4.2Kb、 4.8Kb、 6.5Kb
)。 ヒトデノミツクDNAライブラリーをLD7
8α遺伝子cDNAをプローブとしてスクリーニングを
行い、4.8)IbのゲノミックDNAを含んだ陽性ク
ローンの塩基配列を決定したところ、LD78αとアミ
ノ酸配列が5個のみ異なるペプチドをコードするLD7
8αと相同性の高い遺伝子の存在を確認した。以下、こ
れをLD78βと呼ぶ。
アミノ酸をコードする領域の完全な配列を含む、このL
D78α遺伝子cDN^をプローブとしてヒト染色体D
NAのサザン分析を行うと、三本のバンドが検出された
(サイズは、4.2Kb、 4.8Kb、 6.5Kb
)。 ヒトデノミツクDNAライブラリーをLD7
8α遺伝子cDNAをプローブとしてスクリーニングを
行い、4.8)IbのゲノミックDNAを含んだ陽性ク
ローンの塩基配列を決定したところ、LD78αとアミ
ノ酸配列が5個のみ異なるペプチドをコードするLD7
8αと相同性の高い遺伝子の存在を確認した。以下、こ
れをLD78βと呼ぶ。
LD78β遺伝子c DNAは、すでに得ていたしD7
8α遺伝子cDNAをプローブとして、LD78α遺伝
子cDNAのクローニングを行ったものと同じcDNA
ライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法に
よって陽性クローンを得、その中からLD78β遺伝子
に特異的な制限酵素の切断部位を持つクローンを得て、
塩基配列を決定することで、LD78β遺伝子cDN^
であることを確認した。
8α遺伝子cDNAをプローブとして、LD78α遺伝
子cDNAのクローニングを行ったものと同じcDNA
ライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法に
よって陽性クローンを得、その中からLD78β遺伝子
に特異的な制限酵素の切断部位を持つクローンを得て、
塩基配列を決定することで、LD78β遺伝子cDN^
であることを確認した。
このようにしてクローニングされたLD78α及びLD
78β遺伝子は、タンパク質をコードする全領域を含み
、その塩基配列も本発明者らにより決定されたもので、
第1a図および第1b図に示す配列を有する0以上のよ
うにして得たLD78α及びLD78β遺伝子c遺伝子
上DNA限酵素Xho I及び旧nd m による消化
によりアミノ酸をコードする全領域のLD78α及びL
D78β遺伝子断片を調製し、後述のプラスミド構築に
供する。
78β遺伝子は、タンパク質をコードする全領域を含み
、その塩基配列も本発明者らにより決定されたもので、
第1a図および第1b図に示す配列を有する0以上のよ
うにして得たLD78α及びLD78β遺伝子c遺伝子
上DNA限酵素Xho I及び旧nd m による消化
によりアミノ酸をコードする全領域のLD78α及びL
D78β遺伝子断片を調製し、後述のプラスミド構築に
供する。
z トルベ −
本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母遺伝子と
大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵母内で機能する外来遺
伝子発現用プロモーターを持ったプラスミドベクターで
ある。
大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵母内で機能する外来遺
伝子発現用プロモーターを持ったプラスミドベクターで
ある。
酵母の遺伝子としては、一般にプラスミドが酵母菌体内
で独立したDNAとして複製、増殖するのに必要なりN
A配列、例えば酵母の染色体DNAの自立複製に必要な
りNA配列(ars>と 2μmDNAの複製に必要な
りNA配列(2μDN^ori)があり、所望によりさ
らに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれ
る。この選択マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、
ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウ
ラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、
これらの一種または二種以上が用いられる。
で独立したDNAとして複製、増殖するのに必要なりN
A配列、例えば酵母の染色体DNAの自立複製に必要な
りNA配列(ars>と 2μmDNAの複製に必要な
りNA配列(2μDN^ori)があり、所望によりさ
らに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれ
る。この選択マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、
ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウ
ラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、
これらの一種または二種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては、大腸菌体内においてプラス
ミドが複製するために必要なりNA配列、たとえばCo
1El系のプラスミドの複製開始点のDNA配列を有し
、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとし
てはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子
、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール
耐性遺伝子などが挙げられる。このような大腸菌DNA
として、アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐
性遺伝子とを有するプラスミドpBR322が一般的に
使用されている。
ミドが複製するために必要なりNA配列、たとえばCo
1El系のプラスミドの複製開始点のDNA配列を有し
、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとし
てはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子
、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール
耐性遺伝子などが挙げられる。このような大腸菌DNA
として、アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐
性遺伝子とを有するプラスミドpBR322が一般的に
使用されている。
LD78α及びLD78β遺伝子を発現させる為の酵母
内で機能するプロモーターとしては、酵母のグリセルア
ルデヒド 3−デヒドロゲナーゼ(GAP−DH)プロ
モーター、抑制性酸性フォスファターゼ(PH05)プ
ロモーター等が好ましい一例として挙げられる。さらに
、このようなプロモーターの下流には外来遺伝子を組み
込むための適当な制限酵素切断部位を有し、この部位に
LD78ペプチドの構造遺伝子を導入することによって
、LD78遺伝子本来の翻訳開始コドンから正確にポリ
ペプチドに翻訳させることができる。
内で機能するプロモーターとしては、酵母のグリセルア
ルデヒド 3−デヒドロゲナーゼ(GAP−DH)プロ
モーター、抑制性酸性フォスファターゼ(PH05)プ
ロモーター等が好ましい一例として挙げられる。さらに
、このようなプロモーターの下流には外来遺伝子を組み
込むための適当な制限酵素切断部位を有し、この部位に
LD78ペプチドの構造遺伝子を導入することによって
、LD78遺伝子本来の翻訳開始コドンから正確にポリ
ペプチドに翻訳させることができる。
本発明の組換えプラスミド、すなわちLD78αまたは
LD78β遺伝子を組み込んだプラスミドの調製は、ま
ず前記シャトルベクターをプロモーター下流の外来遺伝
子挿入部位の制限酵素(Sal■)で消化して開裂させ
、これに上記LD78αまたはLD78βDNAを加え
てDNAリガーゼにより連結させる。これを大腸菌にて
増幅し、各種制限酵素分析によって正しい部位に正しい
方向で組み込まれたクローンを選択し、目的とする組換
えプラスミドを得る。
LD78β遺伝子を組み込んだプラスミドの調製は、ま
ず前記シャトルベクターをプロモーター下流の外来遺伝
子挿入部位の制限酵素(Sal■)で消化して開裂させ
、これに上記LD78αまたはLD78βDNAを加え
てDNAリガーゼにより連結させる。これを大腸菌にて
増幅し、各種制限酵素分析によって正しい部位に正しい
方向で組み込まれたクローンを選択し、目的とする組換
えプラスミドを得る。
用いられるLD78α及びLD78β遺伝子は、構造遺
伝子全領域、或は構造遺伝子の一部、好ましくはLD7
8α及びLD78βポリペプチドのマチュア部分に相当
するDNA断片である。この場合、組み込んだLD78
α或はLD78β遺伝子を発現させる為に、翻訳開始コ
ドン(ATG)を含むDNA配列を付加する必要がある
。そのDNA配列としては、分泌タンパク質の分泌シグ
ナル配列をコードするDNA配列、例えば酵母インベル
ターゼ遺伝子の分泌シグナルをコードするD N A。
伝子全領域、或は構造遺伝子の一部、好ましくはLD7
8α及びLD78βポリペプチドのマチュア部分に相当
するDNA断片である。この場合、組み込んだLD78
α或はLD78β遺伝子を発現させる為に、翻訳開始コ
ドン(ATG)を含むDNA配列を付加する必要がある
。そのDNA配列としては、分泌タンパク質の分泌シグ
ナル配列をコードするDNA配列、例えば酵母インベル
ターゼ遺伝子の分泌シグナルをコードするD N A。
ヒトアミラーゼ遺伝子の分泌シグナルをコードするDN
A等が挙げられる。また、LD78α及びLD78β遺
伝子の分泌シグナル配列内に変異を導入し、発現量の向
上、シグナル配列切断部位の変更等を行うこともできる
。さらには、LD78α或はLD78βマチュアボリベ
プチドのアミノ末端のアミノ酸配列を変更することによ
って、生理活性に影響を及ぼすことなく、産生されるポ
リペプチドの安定化、発現量の向上を図ることもできる
。
A等が挙げられる。また、LD78α及びLD78β遺
伝子の分泌シグナル配列内に変異を導入し、発現量の向
上、シグナル配列切断部位の変更等を行うこともできる
。さらには、LD78α或はLD78βマチュアボリベ
プチドのアミノ末端のアミノ酸配列を変更することによ
って、生理活性に影響を及ぼすことなく、産生されるポ
リペプチドの安定化、発現量の向上を図ることもできる
。
ン
形質転換されるべき酵母としては、プラスミドで担われ
た形質転換の選択マーカー遺伝子によって相補される変
異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株である
サツカロミセス・セレビシェ(Saccharomyc
es cerevisiae) AH22(a
1eu2 his4Can 1 )を用いる。また、
低分子量のポリペプチドを効串よく発現させる為に、プ
ロテアーゼ欠損変異株、例えばサツカロミセス・セレビ
シェJN8906(a 1eu2 ura3 Pep4
:IJRA3)を用いることができる。
た形質転換の選択マーカー遺伝子によって相補される変
異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株である
サツカロミセス・セレビシェ(Saccharomyc
es cerevisiae) AH22(a
1eu2 his4Can 1 )を用いる。また、
低分子量のポリペプチドを効串よく発現させる為に、プ
ロテアーゼ欠損変異株、例えばサツカロミセス・セレビ
シェJN8906(a 1eu2 ura3 Pep4
:IJRA3)を用いることができる。
上記組換えプラスミドを大腸菌にて増幅させた後、該酵
母変異株に常法により作用させ、例えばDNAを菌体内
に取り込みうるように処理した菌体とプラスミドDNA
とを混合して形質転換を起こさせる。このように処理さ
れた酵母をベクタープラスミド上に担われている宿主酵
母の変異を相補する遺伝子、例えばロイシン産生遺伝子
の発現を指標として形質転換酵母を選択し分離する。な
お、酵母としてはロイシン要求性の他に、ヒスチジン要
求性変異株、ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変
異株等が挙げられる。
母変異株に常法により作用させ、例えばDNAを菌体内
に取り込みうるように処理した菌体とプラスミドDNA
とを混合して形質転換を起こさせる。このように処理さ
れた酵母をベクタープラスミド上に担われている宿主酵
母の変異を相補する遺伝子、例えばロイシン産生遺伝子
の発現を指標として形質転換酵母を選択し分離する。な
お、酵母としてはロイシン要求性の他に、ヒスチジン要
求性変異株、ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変
異株等が挙げられる。
の LD の
上記の方法で得られた形質転換酵母を通常の培養条件下
で培養し、培養後、その培養上清中には分泌されたLD
78α及びLD78βポリペプチドが集積される。酵母
で産生じたLD78ポリペプチドの分子量は、精製後、
5DS−ポリアクリルアミドゲルで還元条件下、電気泳
動すると、LD78α及びLD78β共に約8KDであ
る。しかし、分画分子量1.000 (ロミコンHF
l−43−P間1;オルガノ社)の限外濾過膜を用いて
LD78を産生じている酵母の培養上清を濃縮してもL
D78ポリペプチドを回収することはできない、その為
、LD78ポリペプチドの回収は酵母菌培養上清に酢酸
バッファーを加えてPHを調製した後、陽イオン交換カ
ラム〈東ソ、SP)ヨパール)を用いて行う。
で培養し、培養後、その培養上清中には分泌されたLD
78α及びLD78βポリペプチドが集積される。酵母
で産生じたLD78ポリペプチドの分子量は、精製後、
5DS−ポリアクリルアミドゲルで還元条件下、電気泳
動すると、LD78α及びLD78β共に約8KDであ
る。しかし、分画分子量1.000 (ロミコンHF
l−43−P間1;オルガノ社)の限外濾過膜を用いて
LD78を産生じている酵母の培養上清を濃縮してもL
D78ポリペプチドを回収することはできない、その為
、LD78ポリペプチドの回収は酵母菌培養上清に酢酸
バッファーを加えてPHを調製した後、陽イオン交換カ
ラム〈東ソ、SP)ヨパール)を用いて行う。
また、LD78ポリペプチドは高塩濃度下で凝集性があ
ることがわかったので、酵母菌を酢酸アンモニウム存在
下で培養することにより、分画分子量10.000の限
外濾過膜(ミリポア社)を用いて酵母菌培養上清中から
LD78ポリペプチドを濃縮・回収することが可能であ
る。酢酸アンモニウムの存在下で酵母菌を培養しても、
酵母菌の増殖及びLD78ポリペプチドの産生量にほと
んど影響は見られない。
ることがわかったので、酵母菌を酢酸アンモニウム存在
下で培養することにより、分画分子量10.000の限
外濾過膜(ミリポア社)を用いて酵母菌培養上清中から
LD78ポリペプチドを濃縮・回収することが可能であ
る。酢酸アンモニウムの存在下で酵母菌を培養しても、
酵母菌の増殖及びLD78ポリペプチドの産生量にほと
んど影響は見られない。
LD78ポリペプチドの分泌・産生量を向上させるため
には、酵母菌を無機リン酸非存在下で培養し、さらに炭
素源として通常用いられるブドウ糖の代わりに、高濃度
の蔗糖を用いると効果的である。
には、酵母菌を無機リン酸非存在下で培養し、さらに炭
素源として通常用いられるブドウ糖の代わりに、高濃度
の蔗糖を用いると効果的である。
LD78の予想される生理活性の一つとして内在性パイ
ロジエンの可能性があげられる。そのため、LD78の
生理活性を追究するためには、パイロジエンの混入を掻
力避叶る必要がある0本発明においては、宿主として大
腸菌よりはるかに進化の程度が高い真核生物である酵母
を用いており、さらにLD78ポリペプチドが酵母によ
り分泌されることから、例えば外因性パイロジエンとし
て知られるLPSをその成分として有する大腸菌を宿主
とした発現系よりもパイロジエンの混入を大幅に抑える
ことが可能である。 また、動物細胞の培養発現系の
場合には、培養時に通常添加する牛胎児血清中あるいは
培養細胞培養上清中に存在する微量生理活性物質の混入
を避けることは非常に困難である。これらのことから、
酵母を用いた発現系、望ましくは分泌発現系は非常に有
用である。
ロジエンの可能性があげられる。そのため、LD78の
生理活性を追究するためには、パイロジエンの混入を掻
力避叶る必要がある0本発明においては、宿主として大
腸菌よりはるかに進化の程度が高い真核生物である酵母
を用いており、さらにLD78ポリペプチドが酵母によ
り分泌されることから、例えば外因性パイロジエンとし
て知られるLPSをその成分として有する大腸菌を宿主
とした発現系よりもパイロジエンの混入を大幅に抑える
ことが可能である。 また、動物細胞の培養発現系の
場合には、培養時に通常添加する牛胎児血清中あるいは
培養細胞培養上清中に存在する微量生理活性物質の混入
を避けることは非常に困難である。これらのことから、
酵母を用いた発現系、望ましくは分泌発現系は非常に有
用である。
本発明において酵母により分泌発現されるLD78α及
びLD78βポリペプチドは、酵母菌体中で発現され菌
体外へ分泌される際に、そのシグナルペプチド部分が切
断され、本来のLD78α及びLD78βポリペプチド
の形となり培養上清中に蓄積されるものと考えられる。
びLD78βポリペプチドは、酵母菌体中で発現され菌
体外へ分泌される際に、そのシグナルペプチド部分が切
断され、本来のLD78α及びLD78βポリペプチド
の形となり培養上清中に蓄積されるものと考えられる。
このことは、培養上清中から回収されるLD78α及び
LD78βポリペプチドの分子量、そしてそれらのアミ
ノ末端のアミノ酸配列から裏付けられた。
LD78βポリペプチドの分子量、そしてそれらのアミ
ノ末端のアミノ酸配列から裏付けられた。
酵母により産生されるLD78α及びLD78βポリペ
プチドを高純度に精製し、アミノ酸シーケンサ−(AB
I社製)によりアミノ末端のアミノ酸配列を決定した。
プチドを高純度に精製し、アミノ酸シーケンサ−(AB
I社製)によりアミノ末端のアミノ酸配列を決定した。
LD78α及びLD78β構造遺伝子の翻訳開始コドン
から32塩基上流にある制限酵素Xho 1部位から、
構造遺伝子の翻訳終止コドン(TGA)から下流10塩
基にある制限酵素旧nd m部位までのLD78α及び
LD78βの全構造領域を含むDNA断片を酵母で発現
させた場合には、アミノ末端のアミノ酸配列は以下のと
おりである。
から32塩基上流にある制限酵素Xho 1部位から、
構造遺伝子の翻訳終止コドン(TGA)から下流10塩
基にある制限酵素旧nd m部位までのLD78α及び
LD78βの全構造領域を含むDNA断片を酵母で発現
させた場合には、アミノ末端のアミノ酸配列は以下のと
おりである。
LD78α;
^sn Gin Phe Ser Ala Ser L
eu Ala Ala AspLD78β; Ala Pro Leu Ala Ala Asp T
hr Pro Thr^laヒト細胞株由来のLD78
ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列はこれまで知
れれていなかったが、本発明者らは、HTLVI感染T
細胞株が発現するLD78ポリペプチドを酵母産生LD
78ポリペプチドの精製法に準じて精製し、そのアミノ
末端配列を明らかにした。それを以下に示す。
eu Ala Ala AspLD78β; Ala Pro Leu Ala Ala Asp T
hr Pro Thr^laヒト細胞株由来のLD78
ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列はこれまで知
れれていなかったが、本発明者らは、HTLVI感染T
細胞株が発現するLD78ポリペプチドを酵母産生LD
78ポリペプチドの精製法に準じて精製し、そのアミノ
末端配列を明らかにした。それを以下に示す。
Native L D 7 8・
Ala Asp Thr Pro Thr Ala −
−−−−−Phe 5erTyr Thr Ser
Arg GinマチュアLD78ポリペプチドをコ
ードするDNA配列を、種・ンの分泌タンパク質のシグ
ナル配列に相当するDNA配列と結合したLD78α及
びLD78β遺伝子DNA断片、或は実施例2に示すよ
うに、LD78α及びLD78β遺伝子のシグナルペプ
チド配列に相当するDNA配列を改変したLD78α或
はLD78β遺伝子を含むDNA断片を酵母で分泌発現
させると、上記NativeLD78と同じアミノ末端
配列を持つLD78α及びLD78βポリペプチドを得
ることができる。
−−−−−Phe 5erTyr Thr Ser
Arg GinマチュアLD78ポリペプチドをコ
ードするDNA配列を、種・ンの分泌タンパク質のシグ
ナル配列に相当するDNA配列と結合したLD78α及
びLD78β遺伝子DNA断片、或は実施例2に示すよ
うに、LD78α及びLD78β遺伝子のシグナルペプ
チド配列に相当するDNA配列を改変したLD78α或
はLD78β遺伝子を含むDNA断片を酵母で分泌発現
させると、上記NativeLD78と同じアミノ末端
配列を持つLD78α及びLD78βポリペプチドを得
ることができる。
7 たLD a LDベプ の
° ヒ 酵母により分泌発現されたLD78ポリペプチドを酵母
培養上清から濃縮・回収し、イオン交換カラム、ヘパリ
ンカラム、ヒドロキシアパタイトカラム等により高純度
に精製し、精製LD78ポリペプチドの生理活性を検討
した。
° ヒ 酵母により分泌発現されたLD78ポリペプチドを酵母
培養上清から濃縮・回収し、イオン交換カラム、ヘパリ
ンカラム、ヒドロキシアパタイトカラム等により高純度
に精製し、精製LD78ポリペプチドの生理活性を検討
した。
LD78 鳳RNAは、TPA、PHA等の刺激により
種々のT細胞株、ヒト組織球系リンパIIU937、急
性前骨髄白血病細胞株HL60、神経膠腫細胞株U10
5MG、繊維芽細胞等で発現する。アミノ酸配列の比較
から、LD78ポリペプチドはβトロンボグロブリンフ
ァミリーに属すると考えられ、炎症、損傷治癒等に関与
することが示唆される。
種々のT細胞株、ヒト組織球系リンパIIU937、急
性前骨髄白血病細胞株HL60、神経膠腫細胞株U10
5MG、繊維芽細胞等で発現する。アミノ酸配列の比較
から、LD78ポリペプチドはβトロンボグロブリンフ
ァミリーに属すると考えられ、炎症、損傷治癒等に関与
することが示唆される。
高純度に精製した酵母産生LD78ポリペプチドを、1
00μg/Kgの濃度でSPFウサギに投与しても発熱
を誘導しない、また、白血球遊走、H2O2産生誘導も
顕著に示さない、これらの点から、LD78ポリペプチ
ドは、アミノ酸レベルで相同性の高いマウスMIP1ポ
リペプチド(J、 Exp、 Med。
00μg/Kgの濃度でSPFウサギに投与しても発熱
を誘導しない、また、白血球遊走、H2O2産生誘導も
顕著に示さない、これらの点から、LD78ポリペプチ
ドは、アミノ酸レベルで相同性の高いマウスMIP1ポ
リペプチド(J、 Exp、 Med。
、 Vol 167、 570−581(1988
)、 5cience、 Vol 243゜10
66−1068 (1989))とは異なる物質である
と考えられる。
)、 5cience、 Vol 243゜10
66−1068 (1989))とは異なる物質である
と考えられる。
未分化な血球系細胞に対して、LD78ポリペプチドは
順著な作用を示す、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞
株KMT2 (Blood、 Vol 76、501
507 (1990> )に対して、酵母産生LD78
α及びLD78βはヒトインターロイキン3存在下で細
胞の増殖を抑制する。また、正常ヒト骨髄細胞をヒトイ
ンターロイキン3の存在下で培養すると、顆粒球−マク
ロファージコロニー、巨核球コロニー等が形成されるが
、LD78α或はLD78βポリペプチドをこの系に添
加するとコロニー形成は抑制される。
順著な作用を示す、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞
株KMT2 (Blood、 Vol 76、501
507 (1990> )に対して、酵母産生LD78
α及びLD78βはヒトインターロイキン3存在下で細
胞の増殖を抑制する。また、正常ヒト骨髄細胞をヒトイ
ンターロイキン3の存在下で培養すると、顆粒球−マク
ロファージコロニー、巨核球コロニー等が形成されるが
、LD78α或はLD78βポリペプチドをこの系に添
加するとコロニー形成は抑制される。
さらには、正常ヒト骨髄細胞がらCD34陽性細胞をセ
ルンーターにより分離・収集し、これをヒトインターロ
イキン3及びLD78α或いはLD78αとの存在下で
一週問培養しく前培養)、その後、PHAで刺激したリ
ンパ球培養土清(PHA−LCM)とエリスロボイエチ
ン(EPOンとによりコロニーを形成させると、IL3
だけを用いて前培養を行った場合に比べて、形成される
コロニーの数は減少する。
ルンーターにより分離・収集し、これをヒトインターロ
イキン3及びLD78α或いはLD78αとの存在下で
一週問培養しく前培養)、その後、PHAで刺激したリ
ンパ球培養土清(PHA−LCM)とエリスロボイエチ
ン(EPOンとによりコロニーを形成させると、IL3
だけを用いて前培養を行った場合に比べて、形成される
コロニーの数は減少する。
ところが、CD34陽性細胞を前培養することなく、L
D78α或いはLD78β、IL3、EPOlPHA−
LCMの存在下で培養すると、形成されるコロニー数は
LD78α或いはLD78β未添加の場合と比べて変化
はない。
D78α或いはLD78β、IL3、EPOlPHA−
LCMの存在下で培養すると、形成されるコロニー数は
LD78α或いはLD78β未添加の場合と比べて変化
はない。
これらのことは、LD78α及びLD78βポリペプチ
ドは骨髄幹細胞に対して直接的或いは間接的に作用して
、その増殖・分化を抑制することを示している。
ドは骨髄幹細胞に対して直接的或いは間接的に作用して
、その増殖・分化を抑制することを示している。
CD34抗原は赤血球系、顆粒球−マクロファージ系及
び巨核球系細胞のコロニーを形成する未分化な前駆細胞
に発現しており、CD34陽性細胞は骨髄再構築能を持
つCJ、 Cl1n、Invest、、Vol 81、
951−955(1988>)ことから、血液幹細胞を
含むものと考えられている。
び巨核球系細胞のコロニーを形成する未分化な前駆細胞
に発現しており、CD34陽性細胞は骨髄再構築能を持
つCJ、 Cl1n、Invest、、Vol 81、
951−955(1988>)ことから、血液幹細胞を
含むものと考えられている。
造血幹細胞の増殖・分化を抑制する因子としては、他に
TGFβCNature、 Vol 329.539−
541 (1987))MIP 1 (Nature、
Vol 344.442−444(1990))等が
報告に見られる。MIPIとLD78とはアミノ酸配列
のレベルで相同性は高いが、上述したように生理活性が
異なるため、生物学的には異なる種類の物質である。
TGFβCNature、 Vol 329.539−
541 (1987))MIP 1 (Nature、
Vol 344.442−444(1990))等が
報告に見られる。MIPIとLD78とはアミノ酸配列
のレベルで相同性は高いが、上述したように生理活性が
異なるため、生物学的には異なる種類の物質である。
次に実施例を挙げてさらに本発明を具体的に説明する。
LD7 α LD
耳1
LD78αcDNAは0baruらが示した方法で得た
(J、Bioches、 Vol 99.885−8
94<1986))、 本発明者らはLD78β遺伝
子を得るため、常法によりヒト胎盤DNAを調製した後
(Mo1ecular C1on:ng、 280−2
81.Co1d Spring Harbor Lab
oratoryCold Spring Flarbo
r、 NY、 USA(1982))、制限酵素Eco
R1で消化し、ファージベクターCharon 4A
(Gene、 Vol 11.291(1980))に
クローニングした。
(J、Bioches、 Vol 99.885−8
94<1986))、 本発明者らはLD78β遺伝
子を得るため、常法によりヒト胎盤DNAを調製した後
(Mo1ecular C1on:ng、 280−2
81.Co1d Spring Harbor Lab
oratoryCold Spring Flarbo
r、 NY、 USA(1982))、制限酵素Eco
R1で消化し、ファージベクターCharon 4A
(Gene、 Vol 11.291(1980))に
クローニングした。
そして、LD78α cDNAをプローブとしてプラー
クハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得た
。陽性クローンのうち、LD78αゲノミックDNAの
サイズ (4,2Kb)とDNAサイズの異なる挿入D
N A (4,8Kb)について、市販の塩基配列
決定キット(Sequenase; tl、s、 Bi
ochemicalCorp、 C1evefand、
0hto USA)を用いて塩基配列の決定を行った
。その結果、このDNA断片に含まれる遺伝子はLD7
8α遺伝子と相同性は高いが興なる遺伝子(LD78β
)であることを確認した。塩基配列の情報から、LD7
8β構造遺伝子にはLD78α構造遺伝子にないユニー
クな制限酵素部位(Bst Nl)があり、この制限酵
素で消化することで、LD78α遺伝子とLD78β遺
伝子とを区別できる。
クハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得た
。陽性クローンのうち、LD78αゲノミックDNAの
サイズ (4,2Kb)とDNAサイズの異なる挿入D
N A (4,8Kb)について、市販の塩基配列
決定キット(Sequenase; tl、s、 Bi
ochemicalCorp、 C1evefand、
0hto USA)を用いて塩基配列の決定を行った
。その結果、このDNA断片に含まれる遺伝子はLD7
8α遺伝子と相同性は高いが興なる遺伝子(LD78β
)であることを確認した。塩基配列の情報から、LD7
8β構造遺伝子にはLD78α構造遺伝子にないユニー
クな制限酵素部位(Bst Nl)があり、この制限酵
素で消化することで、LD78α遺伝子とLD78β遺
伝子とを区別できる。
次に、LD78βcDN^を得るために、本発明者らは
、上記0baruらが示したcDN^ライブラリーから
、LD78α c DNAをプローブとして陽性クロー
ンをスクリーニングし、制限@素Bst N1部位の有
無によりLD78β cDNAを単離した。
、上記0baruらが示したcDN^ライブラリーから
、LD78α c DNAをプローブとして陽性クロー
ンをスクリーニングし、制限@素Bst N1部位の有
無によりLD78β cDNAを単離した。
LD78α及びLD78β遺伝子のペプチドをコードす
る領域の塩基配列及びアミノ酸配列を第1a図及び第1
b図に示す、LD78α遺伝子とLD78β遺伝子は、
アミノ酸配列において5つのアミノ酸が異なる。
る領域の塩基配列及びアミノ酸配列を第1a図及び第1
b図に示す、LD78α遺伝子とLD78β遺伝子は、
アミノ酸配列において5つのアミノ酸が異なる。
このようにして得られたLD78α及びLD78β遺伝
子cDN^は、いずれも制限酵素Xho I及びHin
d [1切断部位を持ち、これらの酵素で消化すると、
LD78α及びLD78β構造遺伝子を遺伝子発現ベク
ターに結合挿入するためのDNA断片を得ることができ
る。
子cDN^は、いずれも制限酵素Xho I及びHin
d [1切断部位を持ち、これらの酵素で消化すると、
LD78α及びLD78β構造遺伝子を遺伝子発現ベク
ターに結合挿入するためのDNA断片を得ることができ
る。
Native型LD78遺伝子と同じアミノ末端配列を
持つLD78α及びLD78βポリペプチドを発現させ
るために、以下に示すオリゴヌクレオチドを合成し、そ
れらをブライマーとするポリメラーゼチェーン反応(P
CR)によって、LD78α及びLD78β遺伝子の分
泌シグナルDNA配列の改変を行った。
持つLD78α及びLD78βポリペプチドを発現させ
るために、以下に示すオリゴヌクレオチドを合成し、そ
れらをブライマーとするポリメラーゼチェーン反応(P
CR)によって、LD78α及びLD78β遺伝子の分
泌シグナルDNA配列の改変を行った。
オリゴヌクレオチドの合成は、アブライドバイオシステ
ムズ社製DNAシンセサイザーモデル381Aを用い、
β−シアノエチルアミダイト法によリヌクレオチド結合
反応を行った。常法により保護基を除去した後、OPC
(アブライドバイオシステムズ社)を用いて目的とする
オリゴヌクレオチドを精製した。
ムズ社製DNAシンセサイザーモデル381Aを用い、
β−シアノエチルアミダイト法によリヌクレオチド結合
反応を行った。常法により保護基を除去した後、OPC
(アブライドバイオシステムズ社)を用いて目的とする
オリゴヌクレオチドを精製した。
合成したオリゴヌクレオチドを以下に示す。
Pr1s+er #l;
5’ CACTCG AGCCCA CAT TCCG
TC3’Primer #2; 5’ GCCTCG AGG CTT CTG GAC
CCCT 3’Primer #3: 5’ AGCACCAGG GAG GAG GACA
GCAAG GGCA 3゜Primer #4; 5 CCT GGT GCT CTT GCT GC
T GACACG CCG 3″Primer #5; 5’ AGCACCAGG GAG GAG GACG
GCAAG GGCA RPrimer #1は第1a
図の塩基配列上で26〜46塩基、Primer #2
は360〜339塩基に対応し、これらのブライマーを
用いてPCRを行うと、LD78α、LD78β共に、
ポリペプチドをコードする全領域のDNA配列を増幅す
ることができる。
TC3’Primer #2; 5’ GCCTCG AGG CTT CTG GAC
CCCT 3’Primer #3: 5’ AGCACCAGG GAG GAG GACA
GCAAG GGCA 3゜Primer #4; 5 CCT GGT GCT CTT GCT GC
T GACACG CCG 3″Primer #5; 5’ AGCACCAGG GAG GAG GACG
GCAAG GGCA RPrimer #1は第1a
図の塩基配列上で26〜46塩基、Primer #2
は360〜339塩基に対応し、これらのブライマーを
用いてPCRを行うと、LD78α、LD78β共に、
ポリペプチドをコードする全領域のDNA配列を増幅す
ることができる。
シグナル配列切断部位の改変のため、LD78α遠伝子
についてはPrimer #3,4を、LD78βにつ
いてはPrimer #5.4を用いたく第2図)、
pcRは市販のキット(宝酒造)を用いて行った。
についてはPrimer #3,4を、LD78βにつ
いてはPrimer #5.4を用いたく第2図)、
pcRは市販のキット(宝酒造)を用いて行った。
LD78αについては、まずLD78α cDN^全長
を含むプラスミドpLD78αをテンプレートとして、
ブライマー#1と3、ブライマー#2と4によりPCR
を行い、それぞれ約90 hp 、240bpの増幅さ
れたDNA断片を得、ポリアクリルアミド電気泳動によ
り、これら二種のDNAを分離回収した1次に、得られ
た二つのDNA断片を1対1の割合で混合し、沸騰洛中
で5分間、その後室温まで冷却してDNAをアニールさ
せた。そして、T4 DNAポリメラーゼ反応を行い、
さらにブライマー#1と2を加えてPCRを行った。
を含むプラスミドpLD78αをテンプレートとして、
ブライマー#1と3、ブライマー#2と4によりPCR
を行い、それぞれ約90 hp 、240bpの増幅さ
れたDNA断片を得、ポリアクリルアミド電気泳動によ
り、これら二種のDNAを分離回収した1次に、得られ
た二つのDNA断片を1対1の割合で混合し、沸騰洛中
で5分間、その後室温まで冷却してDNAをアニールさ
せた。そして、T4 DNAポリメラーゼ反応を行い、
さらにブライマー#1と2を加えてPCRを行った。
ポリアクリルアミド電気泳動にて、約320bpのDN
A断片が増幅されているのを確認した。この断片を分離
回収して制限酵素Xho Iで消化した後、発現ベクタ
ーに直接クローニングした。クローニングされたDNA
が、シグナル配列部分に相当するDNA配列に変異を持
つLD78α遺伝子であることは、市販のキットを用い
て塩基配列を決定することで確認した。
A断片が増幅されているのを確認した。この断片を分離
回収して制限酵素Xho Iで消化した後、発現ベクタ
ーに直接クローニングした。クローニングされたDNA
が、シグナル配列部分に相当するDNA配列に変異を持
つLD78α遺伝子であることは、市販のキットを用い
て塩基配列を決定することで確認した。
LD78β遺伝子についても、同様な方法で改変を行っ
た。この場合、PCRを行う際、ブライマー#3の代わ
りに1ライマー#5を用いた。
た。この場合、PCRを行う際、ブライマー#3の代わ
りに1ライマー#5を用いた。
酵母−大腸菌シャトルベクターpYG10 と実施例
1.2で得たLD78α及びLD78βcDNAを用い
て、酵母でLD78α及びLD78βポリペプチドを発
現可能な組換えプラスミドを構築した(第3図)。
1.2で得たLD78α及びLD78βcDNAを用い
て、酵母でLD78α及びLD78βポリペプチドを発
現可能な組換えプラスミドを構築した(第3図)。
シャトルベクターpYG10は、酵母の遺伝子としてa
rs 1.2μmDN^or t、 ロイシン産生遺伝
子 (LEU2)、及びGAPDHプロモーターとター
ミネータ−とを有する酵母DNAと、大腸菌プラスミド
pBR322のDNA複製開始点を含む領域及びアンピ
シリン耐性遺伝子DNAとを持つプラスミドベクターで
、GAPDHプロモーターの制御下で外来遺伝子を効率
良く、純粋な形で発現させることができる。このシャト
ルベクターは、制限酵素Sal!で消化することにより
容易にその外来遺伝子組み込み部位を開裂させることが
できるため、所望の遺伝子を組み込むのには最適である
。
rs 1.2μmDN^or t、 ロイシン産生遺伝
子 (LEU2)、及びGAPDHプロモーターとター
ミネータ−とを有する酵母DNAと、大腸菌プラスミド
pBR322のDNA複製開始点を含む領域及びアンピ
シリン耐性遺伝子DNAとを持つプラスミドベクターで
、GAPDHプロモーターの制御下で外来遺伝子を効率
良く、純粋な形で発現させることができる。このシャト
ルベクターは、制限酵素Sal!で消化することにより
容易にその外来遺伝子組み込み部位を開裂させることが
できるため、所望の遺伝子を組み込むのには最適である
。
LD78α及びLD78βポリペプチドをコードする全
領域と、それらの5′及び3′非翻訳領域の一部を含む
DNA断片が挿入されているプラスミド (pLD78
−α、 pLI178−βとその誘導体)を制限酵素X
hOI及びHind IIIで消化し、LD78α及び
LD78β遺伝子部分を切りだした。Hindn[部位
をXho 1部位に変換するために、 AGCTTGG
ATCCTCGAGの配列からなる旧nd m−BaI
IH■−Xho T部位を有するリンカ−DNAを合成
し、これをLD78α及びLD78βcDN^にT4D
NAリガーゼを用いて結合させた。ついで、得られたD
NA断片をXho rで消化して、DNA断片の両末端
がXho 1部位となったDNA断片を得た。
領域と、それらの5′及び3′非翻訳領域の一部を含む
DNA断片が挿入されているプラスミド (pLD78
−α、 pLI178−βとその誘導体)を制限酵素X
hOI及びHind IIIで消化し、LD78α及び
LD78β遺伝子部分を切りだした。Hindn[部位
をXho 1部位に変換するために、 AGCTTGG
ATCCTCGAGの配列からなる旧nd m−BaI
IH■−Xho T部位を有するリンカ−DNAを合成
し、これをLD78α及びLD78βcDN^にT4D
NAリガーゼを用いて結合させた。ついで、得られたD
NA断片をXho rで消化して、DNA断片の両末端
がXho 1部位となったDNA断片を得た。
このDNA断片を、Sal Iで開裂したシャトルベク
ターpYG10の外来遺伝子挿入部位にT4リガーゼを
用いて挿入した。得られた組換えDNAを大腸菌881
01株に導入してアンピシリン耐性株を選択し、得られ
た株からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素による切
断パターンから、LD78α及びLD78β遺伝子がG
APDHプロモーターの下流に正方向に挿入されたプラ
スミド(pYG10LD78α、 pYolo−LD
78β)を選定した。
ターpYG10の外来遺伝子挿入部位にT4リガーゼを
用いて挿入した。得られた組換えDNAを大腸菌881
01株に導入してアンピシリン耐性株を選択し、得られ
た株からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素による切
断パターンから、LD78α及びLD78β遺伝子がG
APDHプロモーターの下流に正方向に挿入されたプラ
スミド(pYG10LD78α、 pYolo−LD
78β)を選定した。
宿主酵母としてサツカロミセス・セレビシェJN890
6 (a Ieu2 ura3 PEP4:OR^3)
を用い、アルカリ金属法により形質転換を行った。酵t
JN8906を10−1のYPD培地(1%酵母エキ
ス、2%ポリペプトン、2%グルコース)で30℃にて
培養し、対数増殖期(600n諺における吸光度0.8
〜1.5)の細胞を3500 rpm、で5分間遠心し
て集めた。滅菌水で一回洗浄した後、1 mlの0.1
M酢酸リチウム溶液に細胞を懇濁し、30℃で30分間
振盪した。
6 (a Ieu2 ura3 PEP4:OR^3)
を用い、アルカリ金属法により形質転換を行った。酵t
JN8906を10−1のYPD培地(1%酵母エキ
ス、2%ポリペプトン、2%グルコース)で30℃にて
培養し、対数増殖期(600n諺における吸光度0.8
〜1.5)の細胞を3500 rpm、で5分間遠心し
て集めた。滅菌水で一回洗浄した後、1 mlの0.1
M酢酸リチウム溶液に細胞を懇濁し、30℃で30分間
振盪した。
細胞懸濁液のうち0.11を取り、実施例3で示したL
D78発現プラスミド1μgを加え、30℃で15分間
振盪しな、これに0.1ml 60 Kポリエチレング
リコール4000溶液を加え、軽く攪拌した後、室温で
90分間靜1した。滅菌水で二回細胞を洗浄した後、0
.11の最小培地(0,67% Bacto yeas
tnitrogen base wlo amino
acid (DIFCO)、2%グルコースンに細胞を
懸濁し、最小培地を含む寒天プレートに塗布した。30
℃で培養してロイシン非要求性となった形質転換酵母の
コロニーを得た。
D78発現プラスミド1μgを加え、30℃で15分間
振盪しな、これに0.1ml 60 Kポリエチレング
リコール4000溶液を加え、軽く攪拌した後、室温で
90分間靜1した。滅菌水で二回細胞を洗浄した後、0
.11の最小培地(0,67% Bacto yeas
tnitrogen base wlo amino
acid (DIFCO)、2%グルコースンに細胞を
懸濁し、最小培地を含む寒天プレートに塗布した。30
℃で培養してロイシン非要求性となった形質転換酵母の
コロニーを得た。
この形質転換酵母がLD78α及びLD78βポリペプ
チドの発現していることは、形質転換酵母を 10■l
の最小培地にて培養し、その培養上清及び菌体をグラス
ビーズで粉砕して得た抽出液について、予め作成した、
LD78αの部分ペプチドに対するウサギ抗体を用いた
EIA及びウェスタンプロット法により確認した。
チドの発現していることは、形質転換酵母を 10■l
の最小培地にて培養し、その培養上清及び菌体をグラス
ビーズで粉砕して得た抽出液について、予め作成した、
LD78αの部分ペプチドに対するウサギ抗体を用いた
EIA及びウェスタンプロット法により確認した。
LD78発現プラスミドで形質転換した#母の培養上清
には、抗LD78α合成ペプチド抗体と明らかに反応す
る物質が確認され、ウェスタンプロットからその分子量
は約8.000であった。 LD78発現プラスミド
で形質転換された酵母菌体白シこは、抗LD78α合成
ペプチド抗体と反応する物質は確認されなかった。
には、抗LD78α合成ペプチド抗体と明らかに反応す
る物質が確認され、ウェスタンプロットからその分子量
は約8.000であった。 LD78発現プラスミド
で形質転換された酵母菌体白シこは、抗LD78α合成
ペプチド抗体と反応する物質は確認されなかった。
実施例4で得られた形質転換酵母を2%グルコースを含
むパークホルダーの最小培地〔A■、J。
むパークホルダーの最小培地〔A■、J。
Bot、、 Vol 30.206(1943>) 1
00 +tlに植菌し、30℃にて定常期まで培養する
。これを8%ショ糖、100mM酢酸アンモニウムを含
む無機リン酸不合バークホルダー最小培地(リン酸カリ
ウムの代わりに塩化カリウムを等量加えたもの)ILに
植菌し、30℃でさらに60時間培養した。
00 +tlに植菌し、30℃にて定常期まで培養する
。これを8%ショ糖、100mM酢酸アンモニウムを含
む無機リン酸不合バークホルダー最小培地(リン酸カリ
ウムの代わりに塩化カリウムを等量加えたもの)ILに
植菌し、30℃でさらに60時間培養した。
遠心により酵母菌体を除き、その培養上清を0、、+5
μ園のフィルター(ファルコン)に通した後、分画分子
量10.000の限外ヂ過M(ミリポア社)により約4
00倍濃縮した。この状態で、LD78α及びLD78
βポリペプチドは凝集体を形成しているので、15,0
00 rp醜、20分間遠心することで、沈澱に回収す
ることができる。得られた沈澱を101の20冒間トリ
スー塩酸緩衝液PH7,5に懸濁し、再度遠心して不溶
物を除いた後に、カラムクロマトゲラフイーによる精製
に処した。
μ園のフィルター(ファルコン)に通した後、分画分子
量10.000の限外ヂ過M(ミリポア社)により約4
00倍濃縮した。この状態で、LD78α及びLD78
βポリペプチドは凝集体を形成しているので、15,0
00 rp醜、20分間遠心することで、沈澱に回収す
ることができる。得られた沈澱を101の20冒間トリ
スー塩酸緩衝液PH7,5に懸濁し、再度遠心して不溶
物を除いた後に、カラムクロマトゲラフイーによる精製
に処した。
LD78ポリペプチドの精製は、ファルマシア社製FP
LCシステムを用いて行った。上記の方法で得たLD7
8α及びLD78β粗精製ポリペプチドを 20−間ト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)−50■間塩化ナトリウ
ムで平衡化したMonoQ 515陰イオン交換カラム
(ファルマシア社製)に添加した後、塩化ナトリウムの
直線濃度勾配(2腸M/腸り、流速1mL/sin、
)によりタンパク質を溶出した。
LCシステムを用いて行った。上記の方法で得たLD7
8α及びLD78β粗精製ポリペプチドを 20−間ト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)−50■間塩化ナトリウ
ムで平衡化したMonoQ 515陰イオン交換カラム
(ファルマシア社製)に添加した後、塩化ナトリウムの
直線濃度勾配(2腸M/腸り、流速1mL/sin、
)によりタンパク質を溶出した。
LD78ポリペプチドは、300〜350腸間の塩化ナ
トリウム濃度で溶出された。この画分のピークをSDS
ポリアクリルアミド電気泳動で分析すると、クマシーブ
リリアントブルー(CBB)染色により分子量的8.0
00のバンドが唯一検出された。
トリウム濃度で溶出された。この画分のピークをSDS
ポリアクリルアミド電気泳動で分析すると、クマシーブ
リリアントブルー(CBB)染色により分子量的8.0
00のバンドが唯一検出された。
このバンドは、ウェスタンプロットによって抗しD78
α合成ペプチド抗体と反応することから、LD78ポリ
ペプチドであることが確認された。
α合成ペプチド抗体と反応することから、LD78ポリ
ペプチドであることが確認された。
上記の方法による、酵母によるLD78α及びLD78
βポリペプチドの典型的な産生量は、LD78aについ
ては約2mg/L、LD78βについては約4 m g
/ Lであった。
βポリペプチドの典型的な産生量は、LD78aについ
ては約2mg/L、LD78βについては約4 m g
/ Lであった。
3.5c−のシャーレ(ファルコン社)で、増殖因子依
存性ヒト骨髄単球系細胞株KMT2 (Blood。
存性ヒト骨髄単球系細胞株KMT2 (Blood。
Vol 76、501−507(1990)) 2,
000個を、 1.2%メチルセルロース及び10%牛
脂児血清を含む IMDH(Iscove s mod
ified Dulbecco’s mediu++)
培地(GIBCO社> (60tt g/ml カナマ
イシン、2 w−o1/L Lグルタミン、50μmo
l 2−メルカプトエタノール、2 ng/sl ヒト
インターロイキン3含有)中で、5xCO2の存在下、
9日間培養すると、約450個のコロニーが形成される
。この系に、10〜1,00011g/mlの実施例5
で調製したリコンビナントLD78ポリペプチドを添加
して培養した。
000個を、 1.2%メチルセルロース及び10%牛
脂児血清を含む IMDH(Iscove s mod
ified Dulbecco’s mediu++)
培地(GIBCO社> (60tt g/ml カナマ
イシン、2 w−o1/L Lグルタミン、50μmo
l 2−メルカプトエタノール、2 ng/sl ヒト
インターロイキン3含有)中で、5xCO2の存在下、
9日間培養すると、約450個のコロニーが形成される
。この系に、10〜1,00011g/mlの実施例5
で調製したリコンビナントLD78ポリペプチドを添加
して培養した。
その結果、第4図に示すように、培養6日目では添加し
たリコンビナントLD78ポリペプチドの効果は見られ
なかったが、培養9日目、122日目は100 n17
11以上のLD78αを添加した場合にKMT2細胞の
増殖・コロニー形成が顕著に抑制された。
たリコンビナントLD78ポリペプチドの効果は見られ
なかったが、培養9日目、122日目は100 n17
11以上のLD78αを添加した場合にKMT2細胞の
増殖・コロニー形成が顕著に抑制された。
ヒト骨髄細胞を健康人ボランティアがら了解を得て採取
し、P B S (Phosphate Buffer
5alineHGIBCO社)で希釈し、Ficol
l−Metrizoate (Lymphoprep;
Nyegaad、0slo、Norway)に重層し
て、室温で400G、 30分間遠心した。中間層をP
BSで二回洗い、遠心してヒト骨髄単核細胞を沈澱に回
収した。
し、P B S (Phosphate Buffer
5alineHGIBCO社)で希釈し、Ficol
l−Metrizoate (Lymphoprep;
Nyegaad、0slo、Norway)に重層し
て、室温で400G、 30分間遠心した。中間層をP
BSで二回洗い、遠心してヒト骨髄単核細胞を沈澱に回
収した。
1x10’個のヒト骨髄単核細胞を、3oχヒト貧血小
板血漿、lx脱イオン化牛血清アルブミン(SIGMA
社)、50 μ腸2−メルカプトエタノールチルセルロ
ース、2 ng/mlヒトインターロイキン3を含む
51の IMDM培地に懸濁し、10〜1000ng/
園1のリコンビナントLD78ポリペプチドを添加した
.気泡除去後、1.0■1ずつ3.5cmのシャーレに
入れ、培養シャーレ二枚と、乾燥を防ぐために蒸留水を
張ったシャーレを一枚とを10cmの培養皿に入れて5
xのCO2存在下、37℃で15日間培養した。
板血漿、lx脱イオン化牛血清アルブミン(SIGMA
社)、50 μ腸2−メルカプトエタノールチルセルロ
ース、2 ng/mlヒトインターロイキン3を含む
51の IMDM培地に懸濁し、10〜1000ng/
園1のリコンビナントLD78ポリペプチドを添加した
.気泡除去後、1.0■1ずつ3.5cmのシャーレに
入れ、培養シャーレ二枚と、乾燥を防ぐために蒸留水を
張ったシャーレを一枚とを10cmの培養皿に入れて5
xのCO2存在下、37℃で15日間培養した。
倒立顕微鏡でコロニーを観察し、形成した顆粒球−マク
ロファージ(GM)コロニー及び巨核球(14eg)コ
ロニーの数を測定した。結果を第5a図、第5b図に示
す。
ロファージ(GM)コロニー及び巨核球(14eg)コ
ロニーの数を測定した。結果を第5a図、第5b図に示
す。
ヒトインターロイキン3及びリコンビナントLD78ポ
リペプチドを加えない場合には、コロニーは形成されな
い.ヒトインターロイキン3のみでは、GM−コロニー
は約90個、Meg−コロニーは約35個形成された.
リコンビナントLD78ポリペプチドの添加により、コ
ロニー形成は明らカニ抑制を受け、1,000 ng/
i+I L D 7 8ポリヘブチドを添加した場合に
は、形成されるコロニ数は、GM−コロニーで約1/2
、Meg−コロニでは約173に減少した。
リペプチドを加えない場合には、コロニーは形成されな
い.ヒトインターロイキン3のみでは、GM−コロニー
は約90個、Meg−コロニーは約35個形成された.
リコンビナントLD78ポリペプチドの添加により、コ
ロニー形成は明らカニ抑制を受け、1,000 ng/
i+I L D 7 8ポリヘブチドを添加した場合に
は、形成されるコロニ数は、GM−コロニーで約1/2
、Meg−コロニでは約173に減少した。
なお、LD78ポリペプチドそのものには細胞増殖刺激
活性はなく、マウスの骨髄細胞に対しては、LD78ポ
リペプチドは全く作用を示さなかった。
活性はなく、マウスの骨髄細胞に対しては、LD78ポ
リペプチドは全く作用を示さなかった。
(実施例8)正 ヒト CD34
1コンビ ン LD7 1べ
正常ヒト骨髄単核細胞を、F I T C(Fluor
escein 1sothiocyanate)で標識
したH P CA−1モノクロ一ナル抗体(抗CD34
抗体)で染色し、セルソーター(FAC5tar pl
us; Becton−Dickinson社)を用い
てCD34陽性細胞を分離、収集した(Blood、
Vol 75.1941−1946(1990))。
escein 1sothiocyanate)で標識
したH P CA−1モノクロ一ナル抗体(抗CD34
抗体)で染色し、セルソーター(FAC5tar pl
us; Becton−Dickinson社)を用い
てCD34陽性細胞を分離、収集した(Blood、
Vol 75.1941−1946(1990))。
2、500個のCD34陽性細胞を、30%牛脂児血清
、1%脱イオン化牛血清アルブミン(SIGMA社)、
50μm2−メルカプトエタノール、2 ng/■lヒ
トインターロイキン3 (IL−3)或いは20 ng
/mlヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−C3F)を含
む 5■lの■MDM培地、及び100 ng/mlの
リコンビナントLD78ポリペプチドと混合し、5%
CO2存在下、37℃で一週間培養した。培養後、細胞
を 1.50Orpm、で5分間遠心して集め、1,2
%メチルセルロース、5% PHA刺激リンす球培養土
清、2u/mlエリスロボイエチンを含む上記培地5謹
1に懸濁し、気泡除去後、1.01ずつ3.5cmのシ
ャーレに加えた。
、1%脱イオン化牛血清アルブミン(SIGMA社)、
50μm2−メルカプトエタノール、2 ng/■lヒ
トインターロイキン3 (IL−3)或いは20 ng
/mlヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−C3F)を含
む 5■lの■MDM培地、及び100 ng/mlの
リコンビナントLD78ポリペプチドと混合し、5%
CO2存在下、37℃で一週間培養した。培養後、細胞
を 1.50Orpm、で5分間遠心して集め、1,2
%メチルセルロース、5% PHA刺激リンす球培養土
清、2u/mlエリスロボイエチンを含む上記培地5謹
1に懸濁し、気泡除去後、1.01ずつ3.5cmのシ
ャーレに加えた。
培養シャーレ二つと、乾燥を防ぐ為に蒸留水を張ったシ
ャーレを一つを 10 cmの培養皿に入れて5χのC
O2存在下、37℃で15日間培養した。
ャーレを一つを 10 cmの培養皿に入れて5χのC
O2存在下、37℃で15日間培養した。
倒立顕微鏡でコロニーを観察し、形成した顆粒球−マク
ロファージ(GM)コロニー、マクロファージコロニー
、赤芽球コロニーの数を測定した。
ロファージ(GM)コロニー、マクロファージコロニー
、赤芽球コロニーの数を測定した。
マクロファージコロニー、赤芽球コロニーについては、
LD78ポリペプチド添加の影響は出なかったが、0M
コロニーでは顕著な効果が見られた。結果を第6図に示
す。
LD78ポリペプチド添加の影響は出なかったが、0M
コロニーでは顕著な効果が見られた。結果を第6図に示
す。
IL−3或いはG−C3Fだけを添加した培養では、1
0日目でそれぞれ、10個、12個、 15日目で9個
、15個のGM−コロニーを形成した。リコンビナント
LD78ポリペプチドを添加すると、形成されるコロニ
ーの数は、いずれの場合も減少した。培養10日目では
、添加したリコンビナントLD78の効果は顕著ではな
いが、培養15日目においては、リコンビナントLD7
8ポリペプチドの細胞増殖・コロニー形成抑制効果は明
白である。
0日目でそれぞれ、10個、12個、 15日目で9個
、15個のGM−コロニーを形成した。リコンビナント
LD78ポリペプチドを添加すると、形成されるコロニ
ーの数は、いずれの場合も減少した。培養10日目では
、添加したリコンビナントLD78の効果は顕著ではな
いが、培養15日目においては、リコンビナントLD7
8ポリペプチドの細胞増殖・コロニー形成抑制効果は明
白である。
特に、IL−3とリコンビナントLD78ポリペプチド
を共に添加した場合、形成されるコロニーの数は、IL
−3のみを添加した場合に比べて約1/3に減少した。
を共に添加した場合、形成されるコロニーの数は、IL
−3のみを添加した場合に比べて約1/3に減少した。
第1a図および第1b図は、それぞれ本発明においてク
ローニングされたLD78α及びLD78β遺伝子cD
NAのポリペプチドをコードする領域の塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す。 第2図は、LD78α及びLD78βの分泌シグナルに
改変を入れるため、PCR法を用いたDNA変異導入法
の概略を示す。 第3図は、LD78α及びLD78βポリペプチドを酵
母において発現させるための発現プラスミドの横築法を
示す。 第4図は、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞株KMT
2の増殖に関して、ヒトインターロイキン3(IL−3
>の存在下でのLD78ポリペプチドの作用を示す。 第5a図および第5b図は、それぞれ正常ヒト骨髄単核
細胞からのヒトインターロイキン3で誘導されるコロニ
ーについて、顆粒球−マクロファージ(GM)コロニー
形成および巨核球(Meg)コロニー形成に対するLD
78ポリペプチドの作用を示す。 第6図は、正常ヒト骨髄単核細胞から収集したCD34
陽性細胞に対して、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−
C3F)及びヒトインターロイキン3(IL−3>で誘
導されるコロニー形成におけるLD78ポリペプチドの
作用を示す。 第1a図 GTCAGTCCTTTCTTGGCTCTGCTGA
CAC1工負AGCCC^CATTCho 1 CGTCACCTGCTCA GA ATCATGCA
GGTCTCCACTGCTGCCCTTGCTGT
CCTCCTCTGCACCMetGInValSer
ThrAlaAlaLeuAlaValLeuLeuC
ysThr110 120 130
・140 150 160ATGGC
TCTCTGCA ACCAGTTCTCTGCATC
ACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCC
TGCTGCMet八1aLcuCysへ5nGlnP
heSerAlaSerLeuAla^IaAspTh
rProThrAlaCysCys170 t
ao 190 200 210
220TTCAGCTACACCTCCCGGC
AGATTCCACAG^^TTTCATAGCTGA
CTACTTTGAGACGAGCPheSerTyr
ThrSer^rgGln11el’roG%nAsn
f’helle^1aAspTyrT’heGluTh
rSerA GCCA GTGCTCCA AG CC
CGGTGTCA TCTTCCTA ACCAAGC
G A AGCCGG CAG GTCTGTG CT
Se rG I nCysSe rLys ProG
I yva I I IePheLeuThrLysA
r gSer ArgG l nVa ICysA 1
aG ACCCCAGTG AGGAGTGGGTCC
AGAA ATATGTCAGCGACCTAG AG
CTGAGTGCCTG AGGGAspProSer
GI uGluTrpVaIGI nLysTyrVa
lserAspLeuGluLeuserAI a**
木GTCCAGAA没ロゴCGAGGCCCAGCGA
CCTCGGTGGGHind m 第11:)図 GTCAGTCCCTTCTTGGCTCTGCTGA
CACTCΦ鴇CCC^CATTCho 1 CATCA CCTGCTCCCAATCATGCAG
GTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCC
TCCTCTGCA CCMetGlnValSerT
hrAlaAIaLeuAlaValLeuLeuCy
sThrllo 120 130
140 150 160ATG GCT
CTCTGCA ACCAGGTCCTCTCTGCA
CCA CTTGCTGCTG ACACGCCG A
CCGCCTGCMctA l aLe uCysAs
nG InValLe userA 1aProLe
uA laA I aAspThrProThrA l
aCysTGCTTCAGCTACACCTCCCG
ACAGATTCCACAGAATTTCATAGCT
GAC丁ACTTTGAGACGCys PheSe
rTy rThrser ArgG l n I 1e
ProG In As nPhe I l eA 1a
AspTy r PheG I uThr^GCAGC
CAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCT
TCCTAACC人^GAGAGGCCGGCAGGT
CTGTSerSerGlnCysScrLysPro
SerValI 1ePheLeuThrLys人rg
Gly^rgGlnValcysGCTGA CCCC
A GTG AGG AGTGGGTCCA GA A
ATACGTCAGTGA CCTA G AGCTG
AGTG CCTGA^1aAspProserGlu
GluTrpVaIGl nLysTyrValser
AspLeuGluLeuserAI a**本GGG
GTCCAG品匹TTCGAGGCCCAGCGACC
TCAGTGGGHind m 第2図 =−=−=−−−−−−−−−−−−A^^^^LD7
8 s關^ ho 1 ↓ ↓アニール ↓ブライマー#】、#2 ↓4づメラーゼ予エーノ反応 ho 1 LD711 DNA断片 ho 1 第3図 第4図 添加因子 第5a図 LD78濃度(ng/ml) 第5b図 L D 78 ?a度(ng/ml )第6図
ローニングされたLD78α及びLD78β遺伝子cD
NAのポリペプチドをコードする領域の塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す。 第2図は、LD78α及びLD78βの分泌シグナルに
改変を入れるため、PCR法を用いたDNA変異導入法
の概略を示す。 第3図は、LD78α及びLD78βポリペプチドを酵
母において発現させるための発現プラスミドの横築法を
示す。 第4図は、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞株KMT
2の増殖に関して、ヒトインターロイキン3(IL−3
>の存在下でのLD78ポリペプチドの作用を示す。 第5a図および第5b図は、それぞれ正常ヒト骨髄単核
細胞からのヒトインターロイキン3で誘導されるコロニ
ーについて、顆粒球−マクロファージ(GM)コロニー
形成および巨核球(Meg)コロニー形成に対するLD
78ポリペプチドの作用を示す。 第6図は、正常ヒト骨髄単核細胞から収集したCD34
陽性細胞に対して、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−
C3F)及びヒトインターロイキン3(IL−3>で誘
導されるコロニー形成におけるLD78ポリペプチドの
作用を示す。 第1a図 GTCAGTCCTTTCTTGGCTCTGCTGA
CAC1工負AGCCC^CATTCho 1 CGTCACCTGCTCA GA ATCATGCA
GGTCTCCACTGCTGCCCTTGCTGT
CCTCCTCTGCACCMetGInValSer
ThrAlaAlaLeuAlaValLeuLeuC
ysThr110 120 130
・140 150 160ATGGC
TCTCTGCA ACCAGTTCTCTGCATC
ACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCC
TGCTGCMet八1aLcuCysへ5nGlnP
heSerAlaSerLeuAla^IaAspTh
rProThrAlaCysCys170 t
ao 190 200 210
220TTCAGCTACACCTCCCGGC
AGATTCCACAG^^TTTCATAGCTGA
CTACTTTGAGACGAGCPheSerTyr
ThrSer^rgGln11el’roG%nAsn
f’helle^1aAspTyrT’heGluTh
rSerA GCCA GTGCTCCA AG CC
CGGTGTCA TCTTCCTA ACCAAGC
G A AGCCGG CAG GTCTGTG CT
Se rG I nCysSe rLys ProG
I yva I I IePheLeuThrLysA
r gSer ArgG l nVa ICysA 1
aG ACCCCAGTG AGGAGTGGGTCC
AGAA ATATGTCAGCGACCTAG AG
CTGAGTGCCTG AGGGAspProSer
GI uGluTrpVaIGI nLysTyrVa
lserAspLeuGluLeuserAI a**
木GTCCAGAA没ロゴCGAGGCCCAGCGA
CCTCGGTGGGHind m 第11:)図 GTCAGTCCCTTCTTGGCTCTGCTGA
CACTCΦ鴇CCC^CATTCho 1 CATCA CCTGCTCCCAATCATGCAG
GTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCC
TCCTCTGCA CCMetGlnValSerT
hrAlaAIaLeuAlaValLeuLeuCy
sThrllo 120 130
140 150 160ATG GCT
CTCTGCA ACCAGGTCCTCTCTGCA
CCA CTTGCTGCTG ACACGCCG A
CCGCCTGCMctA l aLe uCysAs
nG InValLe userA 1aProLe
uA laA I aAspThrProThrA l
aCysTGCTTCAGCTACACCTCCCG
ACAGATTCCACAGAATTTCATAGCT
GAC丁ACTTTGAGACGCys PheSe
rTy rThrser ArgG l n I 1e
ProG In As nPhe I l eA 1a
AspTy r PheG I uThr^GCAGC
CAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCT
TCCTAACC人^GAGAGGCCGGCAGGT
CTGTSerSerGlnCysScrLysPro
SerValI 1ePheLeuThrLys人rg
Gly^rgGlnValcysGCTGA CCCC
A GTG AGG AGTGGGTCCA GA A
ATACGTCAGTGA CCTA G AGCTG
AGTG CCTGA^1aAspProserGlu
GluTrpVaIGl nLysTyrValser
AspLeuGluLeuserAI a**本GGG
GTCCAG品匹TTCGAGGCCCAGCGACC
TCAGTGGGHind m 第2図 =−=−=−−−−−−−−−−−−A^^^^LD7
8 s關^ ho 1 ↓ ↓アニール ↓ブライマー#】、#2 ↓4づメラーゼ予エーノ反応 ho 1 LD711 DNA断片 ho 1 第3図 第4図 添加因子 第5a図 LD78濃度(ng/ml) 第5b図 L D 78 ?a度(ng/ml )第6図
Claims (18)
- (1)少なくとも下記のアミノ酸配列を有し、ヒト骨髄
幹細胞の増殖・分化の抑制を誘導する活性をもつペプチ
ドLD78α。 【アミノ酸配列があります】 - (2)少なくとも下記のアミノ酸配列を有し、ヒト骨髄
幹細胞の増殖・分化の抑制を誘導する活性をもつペプチ
ドLD78β。 【アミノ酸配列があります】 - (3)下記のアミノ酸配列からなる前期第(1)項記載
のペプチドLD78α。 【アミノ酸配列があります】 - (4)下記のアミノ酸配列からなる前期第(2)項記載
のペプチドLD78β。 【アミノ酸配列があります】 - (5)増殖因子依存牲骨髄単球系細胞の増殖を抑制する
活性を有する、前記第(1)項から(4)項のいずれか
に記載のペプチド。 - (6)酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵
母内で機能するプロモーターを担ったプラスミドベクタ
ーの該プロモーターの制御下にLD78αまたはLD7
8βをコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする
組換えプラスミド。 - (7)該LD78αまたはLD78βをコードする遺伝
子がヒト由来のものである前記第(6)項記載の組換え
プラスミド。 - (8)該LD78αおよび該LD78βをコードする遺
伝子がそれぞれ下記のアミノ酸配列をコードする遺伝子
である前記第(6)項記載の組換えプラスミド。 LD78α: 【アミノ酸配列があります】 - (9)該LD78αおよび該LD78βをコードする遺
伝子がそれぞれ下記の塩基配列からなる遺伝子である前
記第(8)項記載の組換えプラスミド。 LD78α: 【塩基配列があります】 LD78β: 【塩基配列があります】 - (10)該LD78αおよび該LD78βをコードする
遺伝子が、下記のアミノ酸をコードする遺伝子断片を有
する遺伝子である前記第(6)項記載のプラスミド。 LD78α: 【遺伝子配列があります】 LD78β: 【遺伝子配列があります】 - (11)該LD78αおよび該LD78βをコードする
遺伝子がそれぞれ下記の塩基配列を有する遺伝子である
前記第(10)項記載の組換えプラスミド。 LD78α: 【遺伝子配列があります】 LD78β: 【遺伝子配列があります】 - (12)該LD78αおよび該LD78βをコードする
遺伝子が、下記のアミノ酸をコードする遺伝子断片を有
する遺伝子である前記第(6)項記載のプラスミド。 LD78α: 【遺伝子配列があります】 LD78β: 【遺伝子配列があります】 - (13)該LD78αおよび該LD78βをコードする
遺伝子がそれぞれ下記の塩基配列を有する遺伝子である
前記第(12)項記載の組換えプラスミド。 LD78α: 【遺伝子配列があります】 LD78β: 【遺伝子配列があります】 - (14)前記第(6)項から第(13)項のいずれかに
記載のプラスミドにより形質転換された酵母を培養する
ことによりリコンビナントLD78αまたはLD78β
ペプチドを産生せしめ、該リコンビナントLD78αま
たはLD78βペプチドを培地中あるいは細胞中から回
収することを特徴とするリコンビナントLD78aまた
はLD78βペプチドの製法。 - (15)該リコンビナントLD78αおよび該LD78
βペプチドが、下記のアミノ酸配列からなるペプチドで
ある前記第(14)項記載の製法。 LD78a: 【アミノ酸配列があります】 - (16)該リコンビナントペプチドが下記のアミノ酸か
らなるペプチドである前記第(14)項記載の製法。 LD78a: 【アミノ酸配列があります】 LD78β: 【アミノ酸配列があります】 - (17)前記第(1)〜(5)項のいずれかに記載のL
D78αまたはLD78βペプチドを免疫原として用い
確立される、LD78αまたはLD78βペプチドに特
異的な抗体を産生するハイブリドーマ。 - (18)前記第(17)項記載のハイブリドーマにより
産生されたモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1-331619 | 1989-12-20 | ||
JP33161989 | 1989-12-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03228683A true JPH03228683A (ja) | 1991-10-09 |
Family
ID=18245680
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29689690A Pending JPH03228683A (ja) | 1989-12-20 | 1990-10-31 | 生理活性ペプチドLD78α、LD78βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03228683A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856301A (en) * | 1991-12-23 | 1999-01-05 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Stem cell inhibiting proteins |
WO2018207923A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 富士フイルム株式会社 | 間葉系幹細胞の製造方法、およびその応用 |
-
1990
- 1990-10-31 JP JP29689690A patent/JPH03228683A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856301A (en) * | 1991-12-23 | 1999-01-05 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Stem cell inhibiting proteins |
US6057123A (en) * | 1991-12-23 | 2000-05-02 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Stem cell inhibiting proteins |
WO2018207923A1 (ja) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | 富士フイルム株式会社 | 間葉系幹細胞の製造方法、およびその応用 |
US11649274B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-05-16 | FUJTFITM Corporation | Method for producing mesenchymal stem cell and application of same |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR970009935B1 (ko) | 안정하게 형질감염된 포유동물 세포에서 사람 에리트로포이에틴 유전자를 고농도 형질발현시키는 방법 | |
KR910001809B1 (ko) | Csf 단백질 생산방법 및 정제방법 | |
JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
Elliott et al. | Secretion of glycosylated human erythropoietin from yeast directed by the α-factor leader region | |
JP7061234B2 (ja) | 組換え宿主細胞内での炭素源調節タンパク質産生 | |
JPH09271A (ja) | 哺乳類のgm−csfポリペプチドとその産生方法および顆粒球とマクロファージの産生を刺激する方法 | |
CN1321745A (zh) | 巨噬细胞炎性蛋白-3,-4和-1γ | |
JPH07138292A (ja) | マウス白血病抑制因子 | |
AU616873B2 (en) | Horse gamma-interferon | |
JPS62275695A (ja) | 成熟型ヒト血清アルブミンの製造方法 | |
JPH01501283A (ja) | 新規な型のコロニー刺激因子―1 | |
JPH02501925A (ja) | ヒト インターロイキン‐3 蛋白質 | |
JPS63502795A (ja) | 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、dna配列、組換えdna分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法 | |
JPH04500508A (ja) | 非グリコシル化 ヒト インターロイキン―3 組成物 | |
JPH03228683A (ja) | 生理活性ペプチドLD78α、LD78βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミド | |
JPH1066575A (ja) | 外来性プラスミドを安定に有する細菌を用いる蛋白質の製造方法 | |
JPS6312299A (ja) | ポリペプチドの生産のための発現ベクタ−、ポリペプチドの交換発現法、発現ベクタ−を含有する宿主、それによりつくられた生産物 | |
WO1990002183A1 (en) | Production of a novel lymphokine exhibiting differentiation inhibitory activity | |
WO2021155753A1 (zh) | 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用 | |
US4970161A (en) | Human interferon-gamma | |
JPS6034915A (ja) | ポリペプチド | |
JPH03503002A (ja) | 蛋白質甘味料の酵母中における発現 | |
JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
US6444441B1 (en) | Production of human mutated proteins in human cells by means of homologous recombination | |
JPH04103599A (ja) | 融合ポリペプチド |