JPH07138292A - マウス白血病抑制因子 - Google Patents
マウス白血病抑制因子Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 マウス白血病抑制因子に関する発明を提供す
るものである。 【構成】 分離・精製されたマウス白血病抑制因子(L
IF)、マウス組換えLIF、マウス組換えLIFの精
製方法、マウスLIFコード化DNA分子アミノ酸配列
コード化組換えDNA分子、形質転換宿主細胞、ポリペ
プチドの製造方法、LIF活性ポリペプチド、アミノ酸
配列を含むLIF活性ポリペプチド、白血病細胞増殖阻
害剤および医薬組成物、診断用試薬またはプローブ。
るものである。 【構成】 分離・精製されたマウス白血病抑制因子(L
IF)、マウス組換えLIF、マウス組換えLIFの精
製方法、マウスLIFコード化DNA分子アミノ酸配列
コード化組換えDNA分子、形質転換宿主細胞、ポリペ
プチドの製造方法、LIF活性ポリペプチド、アミノ酸
配列を含むLIF活性ポリペプチド、白血病細胞増殖阻
害剤および医薬組成物、診断用試薬またはプローブ。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、白血病抑制性因子(L
IF)、実質的に純粋な形態のLIFの製法、並びに組
換LIFのクローニングおよび発現に関する。
IF)、実質的に純粋な形態のLIFの製法、並びに組
換LIFのクローニングおよび発現に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】成熟
血球は、幼弱前駆細胞のクローン増殖および付随する分
化によって生成する[メトカルフ(Metcalf,D.)、
(1984)、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・ス
ティミュレーティング・ファクターズ(The Hemopoieti
c Colony Stimulating Factors)、エルセヴィール(El
sevier)、アムステルダム(Amsterdam)]。正常な造
血細胞には、増殖および分化の2過程が密接に関連して
おり、従って短命な成熟細胞が連続的に補充される。少
なくとも4種の生化学的に異なる成長因子、すなわちコ
ロニー刺激因子(CSF)(G−CSF、M−CSF、
GM−CSFおよびMulti−CSF(IL−3))が、
イン・ビトロで顆粒球およびマクロファージの前駆細胞
の増殖および分化を促進することがわかっている[メト
カルフ、(1987)、プロシーディングス・オブ・ザ
・ロイヤル・ソサイアティ・オブ・ロンドン、シリーズ
B(Proc. R. Soc. B.)、230、389〜423]。
血球は、幼弱前駆細胞のクローン増殖および付随する分
化によって生成する[メトカルフ(Metcalf,D.)、
(1984)、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・ス
ティミュレーティング・ファクターズ(The Hemopoieti
c Colony Stimulating Factors)、エルセヴィール(El
sevier)、アムステルダム(Amsterdam)]。正常な造
血細胞には、増殖および分化の2過程が密接に関連して
おり、従って短命な成熟細胞が連続的に補充される。少
なくとも4種の生化学的に異なる成長因子、すなわちコ
ロニー刺激因子(CSF)(G−CSF、M−CSF、
GM−CSFおよびMulti−CSF(IL−3))が、
イン・ビトロで顆粒球およびマクロファージの前駆細胞
の増殖および分化を促進することがわかっている[メト
カルフ、(1987)、プロシーディングス・オブ・ザ
・ロイヤル・ソサイアティ・オブ・ロンドン、シリーズ
B(Proc. R. Soc. B.)、230、389〜423]。
【0003】正常細胞と比べて、白血病性骨髄細胞は、
増殖および分化が切り離されており、幼弱前駆細胞が蓄
積し、その増殖能を保持し、分化しないという特徴を有
する。イン・ビトロで骨髄性白血病細胞の分化を誘導し
得る生物学的因子の性質、および特定の因子が増殖を伴
わずに分化を誘導し得るかどうかに関する議論がさかん
であった。増殖および分化には、異なる因子の介在が必
須であることが提案されている[サッチス(Sachs,
L.)、(1982)、ジャーナル・オブ・セルラー・フ
ィジオロジー(J. Cell. Physiol.)補遺、1、151
〜164]。一方では、2つのグループが、マウス骨髄
性白血病細胞系M1の分化を誘導し得、正常前駆細胞の
増殖を促進しない活性物質(MGI−2またはD−因
子)について記載し、これを精製した[リプトン(Lipt
on,J.H.)およびサッチス、(1981)、ビオヒ
ミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Biochem. Biophy
s. Acta.)、673、552〜569;トミダ(Tomid
a.M.)、ヤマモト−ヤマグチ(Yamamoto-Yamaguchi,
Y.)およびホズミ(Hozumi,M.)、(1984)、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Bio
l. Chem.)、259、10978−10982]。他方
では、本発明者らが、CSFの1種であるG−CSF
が、マウス骨髄性白血病細胞系WEHI−3B D+が強
力な分化誘導促進物質であり、かつ正常細胞の増殖およ
び分化の促進物質でもあることを既に示している[ニコ
ラ(Nicola, N. A.)、メトカルフ、マツモト(Matsumo
to, M.)およびジョンソン(Johnson, G. R.)、(19
83)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、258、9017〜9023]。更に、トミダら
[トミダ、ヤマモト−ヤマグチ、ホズミ、オカベ(Okab
e,T.)およびタカカ(Takaka,F.)、(1986)、
フェブス・レターズ(FEBS Lett.)、207、271
〜275]は、組換G−CSFも、M1細胞のマクロフ
ァージ分化を誘導し得ることを示している。これらの因
子間の関連は、論争の的であった。腫瘍壊死因子α(T
NFα)はヒト骨髄芽球細胞系ML−1の分化を促進し
得るという知見[タケダ(Takeda,K.)、イワモト(Iw
amoto,S.)、スギモト(Sugimoto,H.)、タクマ(Tak
uma,T.)、カワタニ(Kawatani,N.)、ノダ(Noda,
M.)、マサキ(Masaki,A.)、モリセ(Morise,H.)、
アリムラ(Arimura,H.)およびコンノ(Konno,K.)、
(1986)、ネイチャー(Nature)、323、338
〜340]によって、状況は更に複雑なものとなった。
増殖および分化が切り離されており、幼弱前駆細胞が蓄
積し、その増殖能を保持し、分化しないという特徴を有
する。イン・ビトロで骨髄性白血病細胞の分化を誘導し
得る生物学的因子の性質、および特定の因子が増殖を伴
わずに分化を誘導し得るかどうかに関する議論がさかん
であった。増殖および分化には、異なる因子の介在が必
須であることが提案されている[サッチス(Sachs,
L.)、(1982)、ジャーナル・オブ・セルラー・フ
ィジオロジー(J. Cell. Physiol.)補遺、1、151
〜164]。一方では、2つのグループが、マウス骨髄
性白血病細胞系M1の分化を誘導し得、正常前駆細胞の
増殖を促進しない活性物質(MGI−2またはD−因
子)について記載し、これを精製した[リプトン(Lipt
on,J.H.)およびサッチス、(1981)、ビオヒ
ミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Biochem. Biophy
s. Acta.)、673、552〜569;トミダ(Tomid
a.M.)、ヤマモト−ヤマグチ(Yamamoto-Yamaguchi,
Y.)およびホズミ(Hozumi,M.)、(1984)、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Bio
l. Chem.)、259、10978−10982]。他方
では、本発明者らが、CSFの1種であるG−CSF
が、マウス骨髄性白血病細胞系WEHI−3B D+が強
力な分化誘導促進物質であり、かつ正常細胞の増殖およ
び分化の促進物質でもあることを既に示している[ニコ
ラ(Nicola, N. A.)、メトカルフ、マツモト(Matsumo
to, M.)およびジョンソン(Johnson, G. R.)、(19
83)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、258、9017〜9023]。更に、トミダら
[トミダ、ヤマモト−ヤマグチ、ホズミ、オカベ(Okab
e,T.)およびタカカ(Takaka,F.)、(1986)、
フェブス・レターズ(FEBS Lett.)、207、271
〜275]は、組換G−CSFも、M1細胞のマクロフ
ァージ分化を誘導し得ることを示している。これらの因
子間の関連は、論争の的であった。腫瘍壊死因子α(T
NFα)はヒト骨髄芽球細胞系ML−1の分化を促進し
得るという知見[タケダ(Takeda,K.)、イワモト(Iw
amoto,S.)、スギモト(Sugimoto,H.)、タクマ(Tak
uma,T.)、カワタニ(Kawatani,N.)、ノダ(Noda,
M.)、マサキ(Masaki,A.)、モリセ(Morise,H.)、
アリムラ(Arimura,H.)およびコンノ(Konno,K.)、
(1986)、ネイチャー(Nature)、323、338
〜340]によって、状況は更に複雑なものとなった。
【0004】これらのグループのデータの不一致を解明
するための試みにおいて、本発明者らは、従来の種々の
研究に用いられたクレブスII腹水癌細胞を培養したなら
し培地を生化学的に分別し、正常前駆細胞に対してもW
EHI−3B D+細胞に対しても活性な真正G−CSF
およびGM−CSFだけでなく、生化学的には異なるが
機能的には同様の、M1細胞の分化を誘導し得る2種の
因子をも含むことを示した。後者の因子は、イン・ビト
ロでM1白血病細胞の増殖を抑制する能力を有するの
で、白血病抑制性因子(LIF)−AおよびLIF−B
と呼ばれ、これらはWEHI−3B D+細胞の分化を誘
導せず、正常顆粒球/マクロファージ前駆細胞の増殖を
促進しないことがわかった。
するための試みにおいて、本発明者らは、従来の種々の
研究に用いられたクレブスII腹水癌細胞を培養したなら
し培地を生化学的に分別し、正常前駆細胞に対してもW
EHI−3B D+細胞に対しても活性な真正G−CSF
およびGM−CSFだけでなく、生化学的には異なるが
機能的には同様の、M1細胞の分化を誘導し得る2種の
因子をも含むことを示した。後者の因子は、イン・ビト
ロでM1白血病細胞の増殖を抑制する能力を有するの
で、白血病抑制性因子(LIF)−AおよびLIF−B
と呼ばれ、これらはWEHI−3B D+細胞の分化を誘
導せず、正常顆粒球/マクロファージ前駆細胞の増殖を
促進しないことがわかった。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明において、LIF
は、以下の2つの性質を有する分子として定義される:
(1)白血病細胞の分化に関連して、骨髄性白血病細
胞、例えばM1細胞の増殖を抑制する能力を有し、
(2)本発明において記載するマウスLIFまたはヒト
LIFの特定の配列を有する分子と、M1細胞またはマ
ウスもしくはヒトマクロファージの特異的な細胞レセプ
ターへの結合について競合する。LIFは、種々の形態
の骨髄性白血病を抑制する非増殖性治療剤として、並び
にマクロファージの機能および感染に対する他の応答を
改良する試薬、およびこれらに関する臨床試験および研
究用の試薬として使用する可能性を有する。
は、以下の2つの性質を有する分子として定義される:
(1)白血病細胞の分化に関連して、骨髄性白血病細
胞、例えばM1細胞の増殖を抑制する能力を有し、
(2)本発明において記載するマウスLIFまたはヒト
LIFの特定の配列を有する分子と、M1細胞またはマ
ウスもしくはヒトマクロファージの特異的な細胞レセプ
ターへの結合について競合する。LIFは、種々の形態
の骨髄性白血病を抑制する非増殖性治療剤として、並び
にマクロファージの機能および感染に対する他の応答を
改良する試薬、およびこれらに関する臨床試験および研
究用の試薬として使用する可能性を有する。
【0006】本発明において、「LIF活性を有するポ
リペプチド」とは、前記のようなLIFの性質を有する
ポリペプチドまたはグリコポリペプチドを意味し、本発
明において開示するマウスまたはヒトのLIFのアミノ
酸配列と完全にまたは部分的に相同のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを包含するが、これに限定されるもの
ではない。前記LIFの性質を有するものであれば、マ
ウスまたはヒトのLIFのアミノ酸配列の一部のみと完
全にまたは部分的に相同のポリペプチドをも包含する。
更に、宿主細胞において発現によって生成し、発現時に
は不活性であるが、宿主細胞によって処理されて活性分
子となるポリペプチドまたはグリコポリペプチド、並び
に発現時には不活性であるが、イン・ビトロまたはイン
・ビボで選択的に分解されて活性分子となるポリペプチ
ドまたはグリコポリペプチドをも包含する。
リペプチド」とは、前記のようなLIFの性質を有する
ポリペプチドまたはグリコポリペプチドを意味し、本発
明において開示するマウスまたはヒトのLIFのアミノ
酸配列と完全にまたは部分的に相同のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを包含するが、これに限定されるもの
ではない。前記LIFの性質を有するものであれば、マ
ウスまたはヒトのLIFのアミノ酸配列の一部のみと完
全にまたは部分的に相同のポリペプチドをも包含する。
更に、宿主細胞において発現によって生成し、発現時に
は不活性であるが、宿主細胞によって処理されて活性分
子となるポリペプチドまたはグリコポリペプチド、並び
に発現時には不活性であるが、イン・ビトロまたはイン
・ビボで選択的に分解されて活性分子となるポリペプチ
ドまたはグリコポリペプチドをも包含する。
【0007】マウスLIFは、以下のような生物学的性
質を有する分子である: (a)マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、
増殖能の喪失およびそのクローン原白血病細胞の死滅を
伴ってマクロファージ分化を誘導し、作用はG−CSF
によって増強される。
質を有する分子である: (a)マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、
増殖能の喪失およびそのクローン原白血病細胞の死滅を
伴ってマクロファージ分化を誘導し、作用はG−CSF
によって増強される。
【0008】(b)M1細胞、並びに腹腔、脾臓および
骨髄からの正常マウス単球およびマクロファージの高親
和性レセプター(マクロファージ成熟または機能的活性
化につれてレセプターの数は増加する。)に選択的に結
合するが、それらの組織からの顆粒球、赤血球またはリ
ンパ球には結合しない。
骨髄からの正常マウス単球およびマクロファージの高親
和性レセプター(マクロファージ成熟または機能的活性
化につれてレセプターの数は増加する。)に選択的に結
合するが、それらの組織からの顆粒球、赤血球またはリ
ンパ球には結合しない。
【0009】(c)125I−LIFの、高親和性レセプ
ターへの特異的結合は、G−CSF、GM−CSF、Mu
lti−CSF(インターロイキン−3)、M−CSF、
インターロイキン1、2、4もしくは6、内毒素または
種々の他の成長因子と競合しないが、ラベルされていな
いLIFとは競合する。
ターへの特異的結合は、G−CSF、GM−CSF、Mu
lti−CSF(インターロイキン−3)、M−CSF、
インターロイキン1、2、4もしくは6、内毒素または
種々の他の成長因子と競合しないが、ラベルされていな
いLIFとは競合する。
【0010】(d)正常または麻酔マウスの血清中の菌
体内毒素により上昇するが、内毒素耐性C3H/HeJ
マウスにおいては上昇しない。
体内毒素により上昇するが、内毒素耐性C3H/HeJ
マウスにおいては上昇しない。
【0011】(e)肺、唾液腺、腹膜細胞および骨幹を
含む種々の組織によって生成する。
含む種々の組織によって生成する。
【0012】(f)CSFの不存在下に成長する場合
の、イン・ビトロでの、正常顆粒球−マクロファージ前
駆細胞の生存時間を短縮する。
の、イン・ビトロでの、正常顆粒球−マクロファージ前
駆細胞の生存時間を短縮する。
【0013】(g)WEHI−3B D+マウス骨髄性白
血病細胞、GM−CFSまたはMulti−DSFを発現す
るレトロウイルスの感染によって形質転換して白血病誘
発性となったマウス骨髄細胞、マウス白血病細胞系WE
HI265およびWE19の増殖を抑制するか、または
分化を誘導する能力は無い。
血病細胞、GM−CFSまたはMulti−DSFを発現す
るレトロウイルスの感染によって形質転換して白血病誘
発性となったマウス骨髄細胞、マウス白血病細胞系WE
HI265およびWE19の増殖を抑制するか、または
分化を誘導する能力は無い。
【0014】(h)顆粒球、マクロファージ、好酸球、
巨核球、赤血球および肥満細胞系の正常前駆細胞の増殖
を促進する能力が無く、正常顆粒球、マクロファージ、
巨核球、好酸球または天然細胞毒性細胞の前駆細胞のク
ローン増殖を抑制するか、またはイン・ビトロにおける
CSFによる促進に対する定量的応答、もしくは連続細
胞系32CD1.13およびFDCP−1の細胞の増殖
を変える能力が無い。
巨核球、赤血球および肥満細胞系の正常前駆細胞の増殖
を促進する能力が無く、正常顆粒球、マクロファージ、
巨核球、好酸球または天然細胞毒性細胞の前駆細胞のク
ローン増殖を抑制するか、またはイン・ビトロにおける
CSFによる促進に対する定量的応答、もしくは連続細
胞系32CD1.13およびFDCP−1の細胞の増殖
を変える能力が無い。
【0015】(i)特異的細胞レセプターへの結合を、
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)のヨウ化誘導体
と競合する能力が無い。ただし、G−CSFは、M1お
よびWEHI−3B D+マウス骨髄性白血病細胞におい
て分化を誘導し、LIFのM1細胞に対する作用を増強
する能力を有する。
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)のヨウ化誘導体
と競合する能力が無い。ただし、G−CSFは、M1お
よびWEHI−3B D+マウス骨髄性白血病細胞におい
て分化を誘導し、LIFのM1細胞に対する作用を増強
する能力を有する。
【0016】(j)腫瘍壊死因子(TNF)に対して特
異的に上昇する抗血清によってLIF活性が阻害される
ことが無い。
異的に上昇する抗血清によってLIF活性が阻害される
ことが無い。
【0017】(k)マウスLIFの転写が、LB3およ
びE9.D4T細胞の細胞質の構成成分として存在し、
これら細胞中の細胞内のレクチン・コンカナバリンAに
よって誘導されず、他の多くの種類の細胞中に存在す
る。
びE9.D4T細胞の細胞質の構成成分として存在し、
これら細胞中の細胞内のレクチン・コンカナバリンAに
よって誘導されず、他の多くの種類の細胞中に存在す
る。
【0018】マウスLIFは、以下のような性質をも有
する: (l)還元剤(2−メルカプトエタノールまたはジチオ
トレイトール)存在下または不存在下にドデシル硫酸ナ
トリウムを含有する8〜25%勾配ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定した分子量58,000±5,
000、エンドグリコシダーゼ(N−グリカナーゼ)に
よる処理後の分子量23,000±5,000の単一のサ
ブユニットの糖タンパク質である。 (m)等電点8.6〜9.3である。 (n)主要なアミノ酸配列は、第10図、第11図およ
び第15図に示す通りである。 (o)第10図、第11図および第15図に示すヌクレ
オチド配列によってコード化されている。 (p)特異活性1〜2×108ユニット/mg(50ユ
ニットとは、1ml中でM1骨髄性白血病細胞によるク
ローン形成の50%の減少を導くLIFの量であると定
義する)である。 (q)第19図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られたマウス染色体11上の特有の遺伝子
によってコード化されている(マウス/チャイニーズ・
ハムスター卵巣体細胞ハイブリッドのパネルの分析によ
り決定)。 (r)第27図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られた染色体DNA中のヒト遺伝子配列と
相同である。
する: (l)還元剤(2−メルカプトエタノールまたはジチオ
トレイトール)存在下または不存在下にドデシル硫酸ナ
トリウムを含有する8〜25%勾配ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定した分子量58,000±5,
000、エンドグリコシダーゼ(N−グリカナーゼ)に
よる処理後の分子量23,000±5,000の単一のサ
ブユニットの糖タンパク質である。 (m)等電点8.6〜9.3である。 (n)主要なアミノ酸配列は、第10図、第11図およ
び第15図に示す通りである。 (o)第10図、第11図および第15図に示すヌクレ
オチド配列によってコード化されている。 (p)特異活性1〜2×108ユニット/mg(50ユ
ニットとは、1ml中でM1骨髄性白血病細胞によるク
ローン形成の50%の減少を導くLIFの量であると定
義する)である。 (q)第19図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られたマウス染色体11上の特有の遺伝子
によってコード化されている(マウス/チャイニーズ・
ハムスター卵巣体細胞ハイブリッドのパネルの分析によ
り決定)。 (r)第27図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られた染色体DNA中のヒト遺伝子配列と
相同である。
【0019】ヒトLIFは、天然および/または酵母誘
導組換体の以下のような生物学的性質を有する分子であ
る: (a)マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、
増殖能の喪失およびクローン原白血病細胞の死滅を伴っ
てマクロファージ分化を誘導する。 (b)顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球系
の正常ヒト前駆細胞の増殖を促進する能力は無い。 (c)G−CSFと組み合わせると、ヒト白血病細胞系
U937の細胞の増殖を部分的に抑制し、GM−CSF
と組み合わせると、ヒト白血病細胞系U937およびL
H60の増殖を抑制する能力を有する。 (d)M1細胞およびマウスマクロファージのマウスL
IFレセプターに特異的に結合し、そのような細胞に対
するマウス125I−LIFの結合と完全に競合する。 (e)ヒト肝癌細胞系Hep−2Gの特異的細胞レセプ
ターに結合する。 ヒトLIFは、以下のような性質をも有する: (f)成熟タンパク質中のアミノ酸残基の約80%がマ
ウスLIFと同じである。 (g)主要なアミノ酸配列は、第25図、第26図およ
び第29図に示す通りである。 (h)第27図に示すように制限エンドヌクレアーゼ分
解部位によって区切られた染色体DNA中特有の遺伝子
によってコード化されている。 (i)遺伝子配列の一部として、第25図に示すヌクレ
オチド配列を有する。
導組換体の以下のような生物学的性質を有する分子であ
る: (a)マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、
増殖能の喪失およびクローン原白血病細胞の死滅を伴っ
てマクロファージ分化を誘導する。 (b)顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球系
の正常ヒト前駆細胞の増殖を促進する能力は無い。 (c)G−CSFと組み合わせると、ヒト白血病細胞系
U937の細胞の増殖を部分的に抑制し、GM−CSF
と組み合わせると、ヒト白血病細胞系U937およびL
H60の増殖を抑制する能力を有する。 (d)M1細胞およびマウスマクロファージのマウスL
IFレセプターに特異的に結合し、そのような細胞に対
するマウス125I−LIFの結合と完全に競合する。 (e)ヒト肝癌細胞系Hep−2Gの特異的細胞レセプ
ターに結合する。 ヒトLIFは、以下のような性質をも有する: (f)成熟タンパク質中のアミノ酸残基の約80%がマ
ウスLIFと同じである。 (g)主要なアミノ酸配列は、第25図、第26図およ
び第29図に示す通りである。 (h)第27図に示すように制限エンドヌクレアーゼ分
解部位によって区切られた染色体DNA中特有の遺伝子
によってコード化されている。 (i)遺伝子配列の一部として、第25図に示すヌクレ
オチド配列を有する。
【0020】本発明の第1の態様においては、白血病抑
制性因子(LIF)を実質的に純粋な形態で提供する。本
発明は、実質的に純粋なLIFの製法、とりわけ、クレ
ブスII腹水癌細胞から精製することによる実質的に純粋
なマウスLIFの製法、およびヒト膀胱癌細胞系563
7(ATCC No.HTB9)から精製することによる実
質的に純粋なヒトLIFの製法をも提供する。実質的に
純粋なLIFは、LIFのアミノ酸配列またはその一部
をコード化する組換DNA分子を含む酵母細胞、哺乳動
物細胞および大腸菌のような宿主細胞から製造すること
もできる。
制性因子(LIF)を実質的に純粋な形態で提供する。本
発明は、実質的に純粋なLIFの製法、とりわけ、クレ
ブスII腹水癌細胞から精製することによる実質的に純粋
なマウスLIFの製法、およびヒト膀胱癌細胞系563
7(ATCC No.HTB9)から精製することによる実
質的に純粋なヒトLIFの製法をも提供する。実質的に
純粋なLIFは、LIFのアミノ酸配列またはその一部
をコード化する組換DNA分子を含む酵母細胞、哺乳動
物細胞および大腸菌のような宿主細胞から製造すること
もできる。
【0021】本発明において、「実質的に純粋な形態」と
は、適当なドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動すると、少なくとも90%が、LIF
活性に対応した単一のバンドとして現れるポリペプチド
またはグリコポリペプチドの形態を意味する。
は、適当なドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動すると、少なくとも90%が、LIF
活性に対応した単一のバンドとして現れるポリペプチド
またはグリコポリペプチドの形態を意味する。
【0022】他の態様においては、完全にまたは部分的
にLIFタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を
有する組換DNAクローンの単離方法を提供する。本発
明は、LIF固有のアミノ酸配列をコード化し、更に、
LIFの完全なアミノ酸配列を推定させるヌクレオチド
配列にも関する。
にLIFタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を
有する組換DNAクローンの単離方法を提供する。本発
明は、LIF固有のアミノ酸配列をコード化し、更に、
LIFの完全なアミノ酸配列を推定させるヌクレオチド
配列にも関する。
【0023】更に他の態様においては、本発明は、LI
F(または実質的に同様のその類縁体)をコード化する前
記ヌクレオチド配列を完全にまたは部分的に有し、その
ヌクレオチド配列がLIFを完全にまたは部分的に合成
および製造できる形態である組換DNA分子にも関す
る。本発明のこの態様は、クローニングベクター(例え
ばプラスミド)および前記組換DNA分子が挿入された
宿主細胞にも関する。更に、本発明は、前記組換DNA
分子の発現またはペプチド合成によって、完全もしくは
部分的に合成されたLIF、または実質的に同様のその
類縁体にも関する。
F(または実質的に同様のその類縁体)をコード化する前
記ヌクレオチド配列を完全にまたは部分的に有し、その
ヌクレオチド配列がLIFを完全にまたは部分的に合成
および製造できる形態である組換DNA分子にも関す
る。本発明のこの態様は、クローニングベクター(例え
ばプラスミド)および前記組換DNA分子が挿入された
宿主細胞にも関する。更に、本発明は、前記組換DNA
分子の発現またはペプチド合成によって、完全もしくは
部分的に合成されたLIF、または実質的に同様のその
類縁体にも関する。
【0024】LIFに関する本発明の研究において、と
りわけマウスおよびヒト由来のこの糖タンパク質の他の
原料を、臨床的用途および他の用途に使用可能にすると
いう観点から、クレブスII腹水癌細胞から有効な精製方
法によってマウスLIFを精製し、これを、この因子の
化学的または生合成的製造のための最初の過程として、
部分的なアミノ酸配列分析に付した。
りわけマウスおよびヒト由来のこの糖タンパク質の他の
原料を、臨床的用途および他の用途に使用可能にすると
いう観点から、クレブスII腹水癌細胞から有効な精製方
法によってマウスLIFを精製し、これを、この因子の
化学的または生合成的製造のための最初の過程として、
部分的なアミノ酸配列分析に付した。
【0025】レセプター競合アッセイにおいて、I125
で放射性ラベルしたLIFを使用して、LIFを合成お
よび製造するマウスおよびヒト由来の細胞および組織を
同定した。この試験の結果、これらの原料の1種のmR
NAによるDNAコピーの組換DNAライブラリーをス
クリーニングし、予め決定したマウスLIFアミノ酸配
列の部分をコード化する放射性ラベルされたオリゴヌク
レオチドと共にハイブリッド形成することによって、マ
ウスLIF−コード化クローンを同定し、そのマウスL
IFcDNAクローンをヌクレオチド配列分析に付し
た。更に、クローン化マウスLIFコード化配列を、ハ
イブリッド形成プローブとして使用して、マウスLIF
類縁体をコード化するヒト遺伝子を同定し、前記種交差
性ハイブリッド形成を有効に行うことのできるハイブリ
ッド形成条件を確立した。その結果、ヒトのマウスLI
F類縁体をコード化するDNA配列を有する組換DNA
クローンが同定された。
で放射性ラベルしたLIFを使用して、LIFを合成お
よび製造するマウスおよびヒト由来の細胞および組織を
同定した。この試験の結果、これらの原料の1種のmR
NAによるDNAコピーの組換DNAライブラリーをス
クリーニングし、予め決定したマウスLIFアミノ酸配
列の部分をコード化する放射性ラベルされたオリゴヌク
レオチドと共にハイブリッド形成することによって、マ
ウスLIF−コード化クローンを同定し、そのマウスL
IFcDNAクローンをヌクレオチド配列分析に付し
た。更に、クローン化マウスLIFコード化配列を、ハ
イブリッド形成プローブとして使用して、マウスLIF
類縁体をコード化するヒト遺伝子を同定し、前記種交差
性ハイブリッド形成を有効に行うことのできるハイブリ
ッド形成条件を確立した。その結果、ヒトのマウスLI
F類縁体をコード化するDNA配列を有する組換DNA
クローンが同定された。
【0026】このようなLIF−コード化配列の確立の
結果、クローン化されたマウスまたはヒトのLIF−コ
ード化DNA配列を用いて、培養哺乳動物細胞、酵母ま
たはバクテリアにおいてクローン的に純粋なLIFを完
全にまたは部分的に合成するための組換DNA分子が構
成された。本発明は、このようにして製造される実質的
に純粋なLIFにも関する。
結果、クローン化されたマウスまたはヒトのLIF−コ
ード化DNA配列を用いて、培養哺乳動物細胞、酵母ま
たはバクテリアにおいてクローン的に純粋なLIFを完
全にまたは部分的に合成するための組換DNA分子が構
成された。本発明は、このようにして製造される実質的
に純粋なLIFにも関する。
【0027】本発明の一態様においては、本発明は、酵
母細胞、繊維芽細胞および大腸菌におけるクローン化さ
れたヒトおよびマウスのLIF遺伝子の発現、そのよう
に発現するためのクローン化遺伝子の修飾、並びに組換
ヒトおよびマウスLIFの生物学的および生化学的性質
の確立に関する。
母細胞、繊維芽細胞および大腸菌におけるクローン化さ
れたヒトおよびマウスのLIF遺伝子の発現、そのよう
に発現するためのクローン化遺伝子の修飾、並びに組換
ヒトおよびマウスLIFの生物学的および生化学的性質
の確立に関する。
【0028】この態様においても、本発明は、完全にま
たは部分的にヒトまたはマウスLIF(または実質的に
同様のその類縁体)をコード化するヌクレオチド配列を
有し、そのヌクレオチド配列により酵母細胞、繊維芽細
胞または大腸菌において完全にまたは部分的にヒトまた
はマウスLIFが合成および製造される形態の組換DN
A分子に関する。本発明は、クローニングベクター(例
えばプラスミド)および前記のような組換DNA分子を
挿入された宿主細胞をも提供する。更に、本発明は、酵
母細胞におけるそのような組換DNA分子の発現によっ
て、完全にまたは部分的に合成されたヒトまたはマウス
LIF、または実質的に同様のその類縁体にも関する。
LIFに関する本発明の研究の一態様において、ヒトお
よびマウスLIF遺伝子配列を修飾し、酵母発現ベクタ
ーYEpseclに組み入れた。酵母細胞は、その組換体で
形質転換され、そのように形質転換された酵母細胞のな
らし培地は、天然ヒトおよびマウスLIFと同様の生物
学的性質を有する因子を含有することがわかった。
たは部分的にヒトまたはマウスLIF(または実質的に
同様のその類縁体)をコード化するヌクレオチド配列を
有し、そのヌクレオチド配列により酵母細胞、繊維芽細
胞または大腸菌において完全にまたは部分的にヒトまた
はマウスLIFが合成および製造される形態の組換DN
A分子に関する。本発明は、クローニングベクター(例
えばプラスミド)および前記のような組換DNA分子を
挿入された宿主細胞をも提供する。更に、本発明は、酵
母細胞におけるそのような組換DNA分子の発現によっ
て、完全にまたは部分的に合成されたヒトまたはマウス
LIF、または実質的に同様のその類縁体にも関する。
LIFに関する本発明の研究の一態様において、ヒトお
よびマウスLIF遺伝子配列を修飾し、酵母発現ベクタ
ーYEpseclに組み入れた。酵母細胞は、その組換体で
形質転換され、そのように形質転換された酵母細胞のな
らし培地は、天然ヒトおよびマウスLIFと同様の生物
学的性質を有する因子を含有することがわかった。
【0029】骨髄性白血病患者および感染症患者の処置
におけるLIFの使用の可能性の観点から、本発明は、
完全または部分的に、例えばクローン化LIF−コード
化DNA配列を用いてまたは化学的合成によって製造さ
れたLIF、とりわけヒトLIFを含有する薬剤組成
物、並びに例えば化学合成によって、または前記クロー
ン化LIF−コード化DNA配列の突然変異によって製
造されたLIF類縁体の薬剤組成物にも関する。本発明
の薬剤組成物は、少なくとも1種の他の生物学的血球レ
ギュレーター、例えばG−CSFまたはGM−CSFを
も含有し得る。更に、本発明は、血球形成疾患、例えば
白血病および感染の疑いのある先天性疾患におけるヒト
LIF遺伝子の関連した遺伝子移動、変化または障害の
検出に使用するための診断用試薬にも関する。
におけるLIFの使用の可能性の観点から、本発明は、
完全または部分的に、例えばクローン化LIF−コード
化DNA配列を用いてまたは化学的合成によって製造さ
れたLIF、とりわけヒトLIFを含有する薬剤組成
物、並びに例えば化学合成によって、または前記クロー
ン化LIF−コード化DNA配列の突然変異によって製
造されたLIF類縁体の薬剤組成物にも関する。本発明
の薬剤組成物は、少なくとも1種の他の生物学的血球レ
ギュレーター、例えばG−CSFまたはGM−CSFを
も含有し得る。更に、本発明は、血球形成疾患、例えば
白血病および感染の疑いのある先天性疾患におけるヒト
LIF遺伝子の関連した遺伝子移動、変化または障害の
検出に使用するための診断用試薬にも関する。
【0030】実施例1 第1〜5図は、以下に記載する精製法の種々の工程に関
し、各分別工程におけるLIFの貯留部およびその純度
を示す。第1図 :DEAE−セファロースCL−6BによるLI
Fの精製の工程2に関する。バーは、工程3のためにプ
ールされるフラクションを示す。第2図 :レンチル(Lentil)・レクチン・セファロース
4BによるLIFの精製の工程3に関する。バーは、工
程4のためにプールされるフラクションを示す。第3図 :CM−セファロースCL−6BによるLIFの
精製の工程4に関する。バーは、工程5のためにプール
されるフラクションを示す。第4図 :脂肪酸分析HPLCカラムによるLIFの精製
の工程5に関する。アセトニトリル39.6〜41.3%
のフラクションをプールする。第5図 :精製したLIFの分子量および純度を示す。上
図は、8〜25%ポリアクリルアミドSDSゲル上の、
タンパク質標準(分子量93,000;67,000;4
3,000;30,000;20,000および14,00
0)および精製LIF(2調製)の泳動を示す。タンパ
ク質および生物学的活性はいずれも分子量58,000
のタンパク質に関連している。
し、各分別工程におけるLIFの貯留部およびその純度
を示す。第1図 :DEAE−セファロースCL−6BによるLI
Fの精製の工程2に関する。バーは、工程3のためにプ
ールされるフラクションを示す。第2図 :レンチル(Lentil)・レクチン・セファロース
4BによるLIFの精製の工程3に関する。バーは、工
程4のためにプールされるフラクションを示す。第3図 :CM−セファロースCL−6BによるLIFの
精製の工程4に関する。バーは、工程5のためにプール
されるフラクションを示す。第4図 :脂肪酸分析HPLCカラムによるLIFの精製
の工程5に関する。アセトニトリル39.6〜41.3%
のフラクションをプールする。第5図 :精製したLIFの分子量および純度を示す。上
図は、8〜25%ポリアクリルアミドSDSゲル上の、
タンパク質標準(分子量93,000;67,000;4
3,000;30,000;20,000および14,00
0)および精製LIF(2調製)の泳動を示す。タンパ
ク質および生物学的活性はいずれも分子量58,000
のタンパク質に関連している。
【0031】工程1 クレブスII癌細胞(1×66)を、C57B16/6fj/
WEHIマウスに腹腔内注射し、7日後にマウスを殺
し、腹水を採った。細胞を遠心し、大腸菌リポポリサッ
カライド(200ng/ml)を含有するダルベッコ改良イ
ーグル培地に細胞5×106個/mlを再懸濁させ、空
気中にCO2を10%含有する湿式インキュベーターで
37℃で24時間インキュベートする。細胞を再び遠心
し、ならし培地を採り、アジ化ナトリウムを0.02%
(w/v)とし、4℃で貯蔵する。アミコン(Amicon)DC
2A濃縮器でHIP10−8中空繊維カートリッジを用
いてならし培地36lを100mlに濃縮し、1mMフ
ェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)、アジ化ナ
トリウム(0.02% w/v)およびトゥイーン(Tween)2
0(0.02% v/v)を含有するpH8.0の10mMトリ
ス−HCl緩衝液に入れ、アミコン撹拌容器でYM−1
0メンブラン上で再び20mlに濃縮する。
WEHIマウスに腹腔内注射し、7日後にマウスを殺
し、腹水を採った。細胞を遠心し、大腸菌リポポリサッ
カライド(200ng/ml)を含有するダルベッコ改良イ
ーグル培地に細胞5×106個/mlを再懸濁させ、空
気中にCO2を10%含有する湿式インキュベーターで
37℃で24時間インキュベートする。細胞を再び遠心
し、ならし培地を採り、アジ化ナトリウムを0.02%
(w/v)とし、4℃で貯蔵する。アミコン(Amicon)DC
2A濃縮器でHIP10−8中空繊維カートリッジを用
いてならし培地36lを100mlに濃縮し、1mMフ
ェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)、アジ化ナ
トリウム(0.02% w/v)およびトゥイーン(Tween)2
0(0.02% v/v)を含有するpH8.0の10mMトリ
ス−HCl緩衝液に入れ、アミコン撹拌容器でYM−1
0メンブラン上で再び20mlに濃縮する。
【0032】工程2 濃縮物を、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロ
ースCL−6B[ファルマシア(Pharmacia)]のカラム
(2.5×30cm)に通し、平衡緩衝液200mlおよ
び次いで同じ緩衝液中の0.3MまでのNaCl直線勾配
400mlで溶出する。流速は25ml/時であり5.
8mlのフラクションを集めて、アッセイに付す。(第
1図参照)
ースCL−6B[ファルマシア(Pharmacia)]のカラム
(2.5×30cm)に通し、平衡緩衝液200mlおよ
び次いで同じ緩衝液中の0.3MまでのNaCl直線勾配
400mlで溶出する。流速は25ml/時であり5.
8mlのフラクションを集めて、アッセイに付す。(第
1図参照)
【0033】工程3 勾配前段階でゲルに結合せず、マウスM1細胞に対する
活性を有するタンパク質のフラクションをプールし、Y
M−10メンブランで濃縮し、1mM MgCl2、1mM
PMSF、0.2%アジ化ナトリウムおよび0.02%ト
ゥイーン20を含有する100mM酢酸ナトリウム緩衝
液(pH6.0)に入れ、同じ緩衝液で平衡化したレン
チル・レクチン−セファロース4(ファルマシア)のカラ
ム(1×4cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液25mlお
よび次いで同じ緩衝液中の0.5Mまでのα−メチル−
D−マンノピラノシド直線勾配100mlで、流速10
ml/時で溶出する。3mlのフラクションを集め、ア
ッセイに付す。(第2図参照)
活性を有するタンパク質のフラクションをプールし、Y
M−10メンブランで濃縮し、1mM MgCl2、1mM
PMSF、0.2%アジ化ナトリウムおよび0.02%ト
ゥイーン20を含有する100mM酢酸ナトリウム緩衝
液(pH6.0)に入れ、同じ緩衝液で平衡化したレン
チル・レクチン−セファロース4(ファルマシア)のカラ
ム(1×4cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液25mlお
よび次いで同じ緩衝液中の0.5Mまでのα−メチル−
D−マンノピラノシド直線勾配100mlで、流速10
ml/時で溶出する。3mlのフラクションを集め、ア
ッセイに付す。(第2図参照)
【0034】工程4 ゲルに結合し、糖で溶出され、M1細胞に対する活性を
有するタンパク質のフラクションをプールし、濃縮し、
1mM PMSF、0.02%アジ化ナトリウムおよび0.
02%トゥイーン20を含有する100mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液(pH5.0)に入れ、同じ緩衝液で平衡化した
CM−セファロースCL−6B(ファルマシア)のカラム
(1.0×4.0cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液25m
lおよび次いで同じ緩衝液中の1.0MまでのNaCl直
線傾斜100mlおよび次いでNaOHでpH10に調節
した1.0M NaCl25mlで溶出する。流速は2.0
ml/時であり、3.0mlのフラクションを集める。
(第3図参照)
有するタンパク質のフラクションをプールし、濃縮し、
1mM PMSF、0.02%アジ化ナトリウムおよび0.
02%トゥイーン20を含有する100mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液(pH5.0)に入れ、同じ緩衝液で平衡化した
CM−セファロースCL−6B(ファルマシア)のカラム
(1.0×4.0cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液25m
lおよび次いで同じ緩衝液中の1.0MまでのNaCl直
線傾斜100mlおよび次いでNaOHでpH10に調節
した1.0M NaCl25mlで溶出する。流速は2.0
ml/時であり、3.0mlのフラクションを集める。
(第3図参照)
【0035】工程5 ゲルに結合し、NaCl勾配で溶出され、M1細胞に対
する活性を有するタンパク質のフラクションをプール
し、YM−10メンブランで2mlに濃縮し、0.02
%トゥイーン20を含有する20mM酢酸アンモニウム
緩衝液(pH5.0)に入れ、0.45μミリポア(Millipo
re)・フィルターで濾過する。ウォーターズ(Waters)
脂肪酸分析カラムおよび勾配プログラマー付き二重ポン
プを取り付けた高速液体クロマトグラフィー装置[ベッ
クマン(Beckman)]のインジャクターにプールを入れ
る。カラムを、トリフルオロ酢酸(TFA)0.1%(w/
v)を含有する水で平衡化し、試料を注入し、次いで水お
よび0.1%TFA中の34.8%(v/v)までのアセトニ
トリル5分直線勾配でカラムを溶出し、次いで水および
0.1%TFA中の49.8%(v/v)までのアセトニトリ
ル50分直線勾配で溶出する。流速は1ml/分であ
り、100mM炭酸水素アンモニウム50μlおよび0.
4%トゥイーン20を含有するポリプロピレンチューブ
内に1mlのフラクションを集める。(第4図参照)
する活性を有するタンパク質のフラクションをプール
し、YM−10メンブランで2mlに濃縮し、0.02
%トゥイーン20を含有する20mM酢酸アンモニウム
緩衝液(pH5.0)に入れ、0.45μミリポア(Millipo
re)・フィルターで濾過する。ウォーターズ(Waters)
脂肪酸分析カラムおよび勾配プログラマー付き二重ポン
プを取り付けた高速液体クロマトグラフィー装置[ベッ
クマン(Beckman)]のインジャクターにプールを入れ
る。カラムを、トリフルオロ酢酸(TFA)0.1%(w/
v)を含有する水で平衡化し、試料を注入し、次いで水お
よび0.1%TFA中の34.8%(v/v)までのアセトニ
トリル5分直線勾配でカラムを溶出し、次いで水および
0.1%TFA中の49.8%(v/v)までのアセトニトリ
ル50分直線勾配で溶出する。流速は1ml/分であ
り、100mM炭酸水素アンモニウム50μlおよび0.
4%トゥイーン20を含有するポリプロピレンチューブ
内に1mlのフラクションを集める。(第4図参照)
【0036】工程5で得られた、M1細胞に対して活性
を有するフラクションは、2つの重複する紫外吸収ピー
クを有していた。それぞれのピークは、M1細胞に対す
る活性に関連しており、それぞれ銀染色法によるドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル上のMr5
8,000の単一のタンパク質バンドに対応していた。
各場合において、(LIFも存在する)ゲルの平行のト
ラックを1mmのストリップに切断し、ゲルストリップ
からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質の、半固
形寒天培地面内のM1細胞に対する増殖抑制および分化
誘導能力をアッセイして評価することにより、Mr58,
000のタンパク質バンドがM1細胞に対して生物学的
活性を有していることがわかった。(第5図参照)
を有するフラクションは、2つの重複する紫外吸収ピー
クを有していた。それぞれのピークは、M1細胞に対す
る活性に関連しており、それぞれ銀染色法によるドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル上のMr5
8,000の単一のタンパク質バンドに対応していた。
各場合において、(LIFも存在する)ゲルの平行のト
ラックを1mmのストリップに切断し、ゲルストリップ
からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質の、半固
形寒天培地面内のM1細胞に対する増殖抑制および分化
誘導能力をアッセイして評価することにより、Mr58,
000のタンパク質バンドがM1細胞に対して生物学的
活性を有していることがわかった。(第5図参照)
【0037】実施例2 以下の実施例は、N−末端アミノ酸配列、およびトリプ
シンまたはブドウ球菌V8プロテアーゼによるタンパク
質分解によって生じる種々のペプチドのアミノ酸配列を
調べる工程を説明する。実施例1の操作によって精製し
たLIF(15μg)を、ブラウンリー(Brownlee)R
P300ビーズ(C8)を充填したミクロボア(2m
m)カラムに通し、HPLC系において0.1%トリフ
ルオロ酢酸中の0〜60%アセトニトリル直線勾配で溶
出した。タンパク質は、100μlの体積で単一のピー
クとして溶出された。これを、ガラスファイバーディス
クに適用し、乾燥させ、次いで、アプライド・バイオシ
ステム(Applied Biosystem)(モデル470A)気相
タンパク質シークエンサーのシークエンス室に入れた。
エドマン法によりタンパク質の配列分析を行い、個々の
アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体を、アプラ
イド・バイオシステム120A PTHアナライザーで
HPLCによって同定した。
シンまたはブドウ球菌V8プロテアーゼによるタンパク
質分解によって生じる種々のペプチドのアミノ酸配列を
調べる工程を説明する。実施例1の操作によって精製し
たLIF(15μg)を、ブラウンリー(Brownlee)R
P300ビーズ(C8)を充填したミクロボア(2m
m)カラムに通し、HPLC系において0.1%トリフ
ルオロ酢酸中の0〜60%アセトニトリル直線勾配で溶
出した。タンパク質は、100μlの体積で単一のピー
クとして溶出された。これを、ガラスファイバーディス
クに適用し、乾燥させ、次いで、アプライド・バイオシ
ステム(Applied Biosystem)(モデル470A)気相
タンパク質シークエンサーのシークエンス室に入れた。
エドマン法によりタンパク質の配列分析を行い、個々の
アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体を、アプラ
イド・バイオシステム120A PTHアナライザーで
HPLCによって同定した。
【0038】前記操作により精製したLIFの別の試料
(20μg)を、6Mグアニジン塩酸塩、0.2Mトリ
ス−HCl緩衝液(pH8.5)、2mMジチオトレイト
ールで希釈して2mlとし、37℃で2時間インキュベ
ートした。次いで、30倍モル過剰のヨード酢酸を加
え、溶液を37℃で更に15分間インキュベートした。
溶液を同じミクロボアHPLCカラムに通し、前記のよ
うに溶出した。還元され、カルボキシメチル化されたL
IF誘導体(RCM−LIF)は、未処理LIFの3分
後にカラムから溶出され、RCM−LIF(200μ
l)を、0.02%トゥイーン20、1mMCaCl2お
よびTPCK−処理トリプシン2μgを含有する0.1
Mトリス−HCl緩衝液(pH8.0)で希釈して1m
lとした。これを37℃で18時間インキュベートし、
混合物を再びミクロボアカラムに入れ、前記と同様に溶
出した。個々のペプチドはUV吸収ピークとしてあらわ
れ、個々に集めた。これらのペプチドのいくつかは、前
記と同様に直接配列分析に付したが、他のものは同じカ
ラムで0.9%NaCl(pH6.0)中の0〜60%ア
セトニトリル勾配を用いて再精製した後に配列分析に付
した。
(20μg)を、6Mグアニジン塩酸塩、0.2Mトリ
ス−HCl緩衝液(pH8.5)、2mMジチオトレイト
ールで希釈して2mlとし、37℃で2時間インキュベ
ートした。次いで、30倍モル過剰のヨード酢酸を加
え、溶液を37℃で更に15分間インキュベートした。
溶液を同じミクロボアHPLCカラムに通し、前記のよ
うに溶出した。還元され、カルボキシメチル化されたL
IF誘導体(RCM−LIF)は、未処理LIFの3分
後にカラムから溶出され、RCM−LIF(200μ
l)を、0.02%トゥイーン20、1mMCaCl2お
よびTPCK−処理トリプシン2μgを含有する0.1
Mトリス−HCl緩衝液(pH8.0)で希釈して1m
lとした。これを37℃で18時間インキュベートし、
混合物を再びミクロボアカラムに入れ、前記と同様に溶
出した。個々のペプチドはUV吸収ピークとしてあらわ
れ、個々に集めた。これらのペプチドのいくつかは、前
記と同様に直接配列分析に付したが、他のものは同じカ
ラムで0.9%NaCl(pH6.0)中の0〜60%ア
セトニトリル勾配を用いて再精製した後に配列分析に付
した。
【0039】RCM−LIFの別の試料(200μl=
10μg)を、0.002M EDTAおよび0.02%
トゥイーン20を含有する0.05Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH7.8)で希釈して1mlとし、黄色ブド
ウ球菌V8プロテアーゼ2μgにより37℃で18時間
分解した。反応混合物を同じミクロボアカラムに通し、
前記のように溶出した。
10μg)を、0.002M EDTAおよび0.02%
トゥイーン20を含有する0.05Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH7.8)で希釈して1mlとし、黄色ブド
ウ球菌V8プロテアーゼ2μgにより37℃で18時間
分解した。反応混合物を同じミクロボアカラムに通し、
前記のように溶出した。
【0040】LIFを同定する、アミノ末端からの26
個のアミノ酸の配列は以下の通りである: N-Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-Ile-
Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s
個のアミノ酸の配列は以下の通りである: N-Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-Ile-
Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s
【0041】数種のトリプシンペプチドのアミノ酸配列
は以下の通りである: 1.His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s 2.Met-Val-Ala-Tyr … 3.Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys … 4.Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys 5.Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-Val-Ly
s 6.Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-
Leu-Phe-Leu-Val-Glu-Leu-Tyr… 7.Leu-Val-Ile-Ser-Tyr… 8.Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Se
r-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln 9.Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-Val-Met-Arg 10.Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-X-Gln-Ala-Phe
は以下の通りである: 1.His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s 2.Met-Val-Ala-Tyr … 3.Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys … 4.Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys 5.Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-Val-Ly
s 6.Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-
Leu-Phe-Leu-Val-Glu-Leu-Tyr… 7.Leu-Val-Ile-Ser-Tyr… 8.Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Se
r-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln 9.Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-Val-Met-Arg 10.Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-X-Gln-Ala-Phe
【0042】V8プロテアーゼによるLIFの分解によ
って生じるペプチドのアミノ酸配列は以下の通りであっ
た: Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gl
y-Thr-Tyr-Lys-Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-
Phe
って生じるペプチドのアミノ酸配列は以下の通りであっ
た: Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gl
y-Thr-Tyr-Lys-Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-
Phe
【0043】実施例3 以下の実施例は、放射性ラベルしたLIFを得るため、
およびレセプター競合アッセイによってLIF原を同定
するための工程を説明する。第6図は、実施例3に関す
る:0℃における、放射性ヨウ素化純LIF(2×10
5cpm/ng)の、M1骨髄性白血病細胞への結合。競合因
子の存在下または不存在下に、M1細胞(5×106)
を125I−LIF(4×105cpm)と2時間インキュベ
ートし、その後、ウシ胎児血清の遠心によって、結合し
た放射能を未結合放射能から分離した。A.非標識純L
IFおよび競合因子としての純Multi−CSF、GM−
CSF、G−CSFまたはM−CSFの、所定の希釈に
おける滴定(各希釈10μlを加えて最終体積80μl
とした)。最高濃度は、それぞれ104ユニット/m
l;3.5×104ユニット/ml;3×104ユニット
/ml;5×104ユニット/ml;4×104ユニット
/mlであった。B.純LIFまたはリポポリサッカラ
イド(LPS)または種々の細胞の濃縮(4〜8倍)な
らし培地または内毒素注射マウスの血清の、前記125I
−LIFのM1細胞への結合を競合する能力。
およびレセプター競合アッセイによってLIF原を同定
するための工程を説明する。第6図は、実施例3に関す
る:0℃における、放射性ヨウ素化純LIF(2×10
5cpm/ng)の、M1骨髄性白血病細胞への結合。競合因
子の存在下または不存在下に、M1細胞(5×106)
を125I−LIF(4×105cpm)と2時間インキュベ
ートし、その後、ウシ胎児血清の遠心によって、結合し
た放射能を未結合放射能から分離した。A.非標識純L
IFおよび競合因子としての純Multi−CSF、GM−
CSF、G−CSFまたはM−CSFの、所定の希釈に
おける滴定(各希釈10μlを加えて最終体積80μl
とした)。最高濃度は、それぞれ104ユニット/m
l;3.5×104ユニット/ml;3×104ユニット
/ml;5×104ユニット/ml;4×104ユニット
/mlであった。B.純LIFまたはリポポリサッカラ
イド(LPS)または種々の細胞の濃縮(4〜8倍)な
らし培地または内毒素注射マウスの血清の、前記125I
−LIFのM1細胞への結合を競合する能力。
【0044】クレブスII腹水細胞ならし培地から実施例
1に記載のように精製したLIFを、文献に記載の方法
でチロシン残基において125Iで放射性ラベルし[ニコ
ラ(Nicola,N.A.)およびメトカルフ、ジャーナル・オ
ブ・セルラー・フィジオロジー(J.Cell.Physio
l.)、128:180〜188、1986]、比放射能
約2×105cpm/ngの125I−LIFを調製した。125I
−LIFは、M1骨髄性白血病細胞並びにマウス成熟骨
髄、脾臓、胸腺および腹腔滲出細胞に特異的に結合し
た。細胞オートラジオグラフィー分析により、125I−
LIFは、マクロファージおよびその前駆細胞(細胞の
成熟につれてレセプター数が増加する)のみに特異的に
結合し、他の造血細胞には結合しなかったことがわかっ
た。このことは、LIFが、種々の疾病におけるマクロ
ファージ機能の調節のための臨床的適用に有用であり得
ることを示唆している。125I−LIFのM1骨髄性白
血病細胞および腹腔マクロファージへの特異的結合は、
非標識LIFによって阻害されたが、他の造血成長因
子、例えばG−CSF、GM−CSF、M−CSF(C
SF−1)、Multi−CSF(インターロイキン3)、
インターロイキン1、2、4、6、内毒素または他の血
成長因子によっては阻害されなかった(第6図参照)。
細胞ならし培地または細胞抽出物は、そのような細胞へ
の125I−LIFの結合を阻害する能力を有するので、
種々の細胞および組織によって製造または貯蔵されるL
IFの存在を特異的アッセイすることができる。例え
ば、レクチン活性化LB3 T細胞のならし培地は、125
I−LIFのM1細胞に対する特異的結合を強力に阻害
したので、LB3細胞はLIFを製造することがわか
る。
1に記載のように精製したLIFを、文献に記載の方法
でチロシン残基において125Iで放射性ラベルし[ニコ
ラ(Nicola,N.A.)およびメトカルフ、ジャーナル・オ
ブ・セルラー・フィジオロジー(J.Cell.Physio
l.)、128:180〜188、1986]、比放射能
約2×105cpm/ngの125I−LIFを調製した。125I
−LIFは、M1骨髄性白血病細胞並びにマウス成熟骨
髄、脾臓、胸腺および腹腔滲出細胞に特異的に結合し
た。細胞オートラジオグラフィー分析により、125I−
LIFは、マクロファージおよびその前駆細胞(細胞の
成熟につれてレセプター数が増加する)のみに特異的に
結合し、他の造血細胞には結合しなかったことがわかっ
た。このことは、LIFが、種々の疾病におけるマクロ
ファージ機能の調節のための臨床的適用に有用であり得
ることを示唆している。125I−LIFのM1骨髄性白
血病細胞および腹腔マクロファージへの特異的結合は、
非標識LIFによって阻害されたが、他の造血成長因
子、例えばG−CSF、GM−CSF、M−CSF(C
SF−1)、Multi−CSF(インターロイキン3)、
インターロイキン1、2、4、6、内毒素または他の血
成長因子によっては阻害されなかった(第6図参照)。
細胞ならし培地または細胞抽出物は、そのような細胞へ
の125I−LIFの結合を阻害する能力を有するので、
種々の細胞および組織によって製造または貯蔵されるL
IFの存在を特異的アッセイすることができる。例え
ば、レクチン活性化LB3 T細胞のならし培地は、125
I−LIFのM1細胞に対する特異的結合を強力に阻害
したので、LB3細胞はLIFを製造することがわか
る。
【0045】実施例4 以下の実施例は、マウスLIFをコード化するmRNA
のクローン化相補的DNAコピーを得るための工程を説
明する。第7〜10図は、以下に記載する方法の種々の
工程に関する。第7図:LIFcDNAクローンのクロ
ーニングの工程1に関する。レクチン・コンカナバリン
A刺激による、LB3細胞の細胞質における造血成長レ
ギュレーターのmRNAの蓄積。WEHI−3B D-細
胞の細胞質ポリアデニル化RNA(5μg)(トラック
1)、5μg/mlコンカナバリンAを用いて106細
胞/mlとして5時間培養したT細胞クローンLB3細
胞(トラック2)、および非刺激LB3細胞(トラック
3)を、ホルムアミドアガロースゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、32P−GM−CSFプローブ
(パネル1)または32P−Multi−CSFプローブ(パ
ネルb)とハイブリッド形成した[ケルソ(Kelso,
A.)、メトカルフおよびゴー(Gough,N.M.)、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー(J.Immunol.)、136:
1718〜1725、1986]。
のクローン化相補的DNAコピーを得るための工程を説
明する。第7〜10図は、以下に記載する方法の種々の
工程に関する。第7図:LIFcDNAクローンのクロ
ーニングの工程1に関する。レクチン・コンカナバリン
A刺激による、LB3細胞の細胞質における造血成長レ
ギュレーターのmRNAの蓄積。WEHI−3B D-細
胞の細胞質ポリアデニル化RNA(5μg)(トラック
1)、5μg/mlコンカナバリンAを用いて106細
胞/mlとして5時間培養したT細胞クローンLB3細
胞(トラック2)、および非刺激LB3細胞(トラック
3)を、ホルムアミドアガロースゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、32P−GM−CSFプローブ
(パネル1)または32P−Multi−CSFプローブ(パ
ネルb)とハイブリッド形成した[ケルソ(Kelso,
A.)、メトカルフおよびゴー(Gough,N.M.)、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー(J.Immunol.)、136:
1718〜1725、1986]。
【0046】第8図:LIFcDNAクローンのクロー
ニングの工程3に関する。:LIFクローンの同定に使
用した合成オリゴヌクレオチド。N−末端近傍のマウス
LIFアミノ酸の部分(残基15〜26、実施例2参
照)を最初の行に示し、このペプチドをコード化するm
RNA配列の可能な組み合わせを次の行に示し、このm
RNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを下
行に示す。Cys17およびHis18を除く全てのア
ミノ酸残基について、このオリゴヌクレオチドは、哺乳
動物コード化領域に最も頻繁に使用されるコドンのみに
相補的である[グランサム(Grantham,R.)ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、
943〜73、1981]。Cys17については、こ
の配列はいずれのコドンにも相補的である。His18
については、このオリゴヌクレオチドは、頻度の低いC
AUコドンに相補的である。隣接するGlyコドン(頻
度の低いCpGジヌクオレオチド)と共に、CACコド
ンが用いられることはないと考えられた[シュヴァルツ
(Swartz,M.N.)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、238:196
1〜1967、1962]。
ニングの工程3に関する。:LIFクローンの同定に使
用した合成オリゴヌクレオチド。N−末端近傍のマウス
LIFアミノ酸の部分(残基15〜26、実施例2参
照)を最初の行に示し、このペプチドをコード化するm
RNA配列の可能な組み合わせを次の行に示し、このm
RNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを下
行に示す。Cys17およびHis18を除く全てのア
ミノ酸残基について、このオリゴヌクレオチドは、哺乳
動物コード化領域に最も頻繁に使用されるコドンのみに
相補的である[グランサム(Grantham,R.)ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、
943〜73、1981]。Cys17については、こ
の配列はいずれのコドンにも相補的である。His18
については、このオリゴヌクレオチドは、頻度の低いC
AUコドンに相補的である。隣接するGlyコドン(頻
度の低いCpGジヌクオレオチド)と共に、CACコド
ンが用いられることはないと考えられた[シュヴァルツ
(Swartz,M.N.)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、238:196
1〜1967、1962]。
【0047】第9図:LIFcDNAクローンのクロー
ニングの工程4に関する。:第8図に示すオリゴヌクレ
オチドとのハイブリッド形成によるLIFcDNAクロ
ーンの同定。
ニングの工程4に関する。:第8図に示すオリゴヌクレ
オチドとのハイブリッド形成によるLIFcDNAクロ
ーンの同定。
【0048】第10図:LIFcDNAクローンのクロ
ーニングの工程5に関する。:cDNAクローンpLI
F7.2bのヌクレオチド配列およびLIFアミノ酸配
列。mRNA類似鎖の配列を、前記LIFの予想したア
ミノ酸配列と共に5'から3'に記載する;行の端の数
は、その行の最後の残基(アミノ酸またはヌクレオチ
ド)の位置を示す。アミノ酸配列は、このクローンにお
いてコード化された最初の残基から連続して番号を付け
た。タンパク質分析により決定したアミノ酸配列の領域
には上線を付した;これら2つの間には不一致がない。
Pro9は、直接アミノ酸分析(実施例2)により決定
されたN−末端残基であった。N−結合グリコシル化の
可能性のある7個の部位は星印で示し[ノイバーガー
(Neuberger,A.)ら、グリコプロテインズ(Glycoprot
eins)、ゴットシャルク(Gottschalk,A.)編、エルセ
ヴィール、アムステルダム、450〜490頁、197
2]、O−結合グリコシル化の可能性のある4個の部位
は井桁印で示す[タカハシ(Takahashi,N.)ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、
81:2021〜2025、1984]。
ーニングの工程5に関する。:cDNAクローンpLI
F7.2bのヌクレオチド配列およびLIFアミノ酸配
列。mRNA類似鎖の配列を、前記LIFの予想したア
ミノ酸配列と共に5'から3'に記載する;行の端の数
は、その行の最後の残基(アミノ酸またはヌクレオチ
ド)の位置を示す。アミノ酸配列は、このクローンにお
いてコード化された最初の残基から連続して番号を付け
た。タンパク質分析により決定したアミノ酸配列の領域
には上線を付した;これら2つの間には不一致がない。
Pro9は、直接アミノ酸分析(実施例2)により決定
されたN−末端残基であった。N−結合グリコシル化の
可能性のある7個の部位は星印で示し[ノイバーガー
(Neuberger,A.)ら、グリコプロテインズ(Glycoprot
eins)、ゴットシャルク(Gottschalk,A.)編、エルセ
ヴィール、アムステルダム、450〜490頁、197
2]、O−結合グリコシル化の可能性のある4個の部位
は井桁印で示す[タカハシ(Takahashi,N.)ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、
81:2021〜2025、1984]。
【0049】工程1:LIFmRNA含有RNAの調製 クローン化マウスT細胞系LB3の細胞[ケルソおよび
メトカルフ、エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Expt
l.Hematol.)、13:7〜15、1985]を、レク
チン・コンカナバリンAで6時間刺激して、造血細胞の
成長および分化を調整する種々の因子をコード化するm
RNAの細胞質における蓄積を向上した[ケルソ、メト
カルフおよびゴー、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
136:1718〜1725、1986]。(例えば、
第7図は、そのような刺激により、細胞中における造血
成長因子GM−CSFおよびMulti−CSFをコード化
するmRNAの製造が上昇することを示す。)細胞質R
NAは、文献に記載の方法[ゴー、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、16
5:683〜399、1983]で、5×108コンカ
ナバリンA−刺激LB3細胞から調製した。ポリアデニ
ル化mRNA分子は、標準的な方法[マニアティス(Ma
niatis,T.)ら、モレキュラー・クローニング(Molecu
lar Cloning)、コールド・スプリング・ハーバー(Col
d Spring Harbor)、ニューヨーク、1982]によ
り、2サイクルのオリゴ−dTセルロースクロマトグラ
フィーによりリボソームRNAから分取した。
メトカルフ、エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Expt
l.Hematol.)、13:7〜15、1985]を、レク
チン・コンカナバリンAで6時間刺激して、造血細胞の
成長および分化を調整する種々の因子をコード化するm
RNAの細胞質における蓄積を向上した[ケルソ、メト
カルフおよびゴー、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
136:1718〜1725、1986]。(例えば、
第7図は、そのような刺激により、細胞中における造血
成長因子GM−CSFおよびMulti−CSFをコード化
するmRNAの製造が上昇することを示す。)細胞質R
NAは、文献に記載の方法[ゴー、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、16
5:683〜399、1983]で、5×108コンカ
ナバリンA−刺激LB3細胞から調製した。ポリアデニ
ル化mRNA分子は、標準的な方法[マニアティス(Ma
niatis,T.)ら、モレキュラー・クローニング(Molecu
lar Cloning)、コールド・スプリング・ハーバー(Col
d Spring Harbor)、ニューヨーク、1982]によ
り、2サイクルのオリゴ−dTセルロースクロマトグラ
フィーによりリボソームRNAから分取した。
【0050】後に、ノザン分析により、GM−CSFお
よびMulti−CSFのmRNAとは異なり、LIFmR
NAは、LB3細胞中に構成成分として存在し、その量
はコンカナバリンA刺激により向上しないことがわかっ
た[ギアリング(Gearing,D.P.)ら、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ
ャーナル(EMBO J.)、6:3995〜4002、19
87]。
よびMulti−CSFのmRNAとは異なり、LIFmR
NAは、LB3細胞中に構成成分として存在し、その量
はコンカナバリンA刺激により向上しないことがわかっ
た[ギアリング(Gearing,D.P.)ら、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ
ャーナル(EMBO J.)、6:3995〜4002、19
87]。
【0051】工程2:LB3cDNA分子のライブラリ
ーの合成およびクローング 前記のように調製したLB3mRNAの2本鎖DNAコ
ピーを標準的な方法[マニアティスら、モレキュラー・
クローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、1982およびゴーら、ネイチャー(Natur
e)、309:763〜767、1984]で合成し
た。トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素で触媒され、オ
リゴ−dTを用いる反応において、細胞質ポリアデニル
化LB3mRNA10μgを、1本鎖相補的DNA(c
DNA)合成の鋳型として使用した。この反応の完了
後、0.3M NaOH、1mM EDTA中で65℃で
1時間インキュベートすることによってmRNAを分解
した。塩基を中和し、エタノール沈澱によってcDNA
を回収した後、大腸菌DANポリメラーゼIのクレノウ
フラグメントで触媒された反応において、1本鎖cDN
Aを2本鎖の形態に変換した。次いで、1本鎖特異的ヌ
クレアーゼS1で処理することにより、cDNAの「ヘ
アピン・ループ」構造を切断し、酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ[マイケルソン(Michel
son,A.M.)およびオーキン(Orkin,S.)、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)、257:14773〜14782、1982]を
用いて、デオキシシチジン残基末端(残基約20〜3
0)を2本鎖cDNAの各端に付加した。dC−末端c
DNAを、1.5%アガロースゲル電気泳動により分画
し、長さ500bpを越える分子を回収し、アニーリン
グしてプラスミドDAN分子(pJL3、ゴーら、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼー
ション、4:645:653、1984)とし、これを
制限エンドヌクレアーゼSac1で切断し、それにデオ
キシグアノシン残基末端を付加した(マイケルソンおよ
びオーキン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、257:14773〜14782、198
2)。末端付加cDNAおよびプラスミド分子を文献に
記載の方法でアニーリングし[ゴーら、バイオケミスト
リー(Biochemistry)、19:2702〜2710、1
980]、アニーリングしたcDNA/プラスミド混合
物で大腸菌MC1050[カサダバン(Casadaban,
M.)およびコーヘン(Cohen,S.)、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー、138:179〜20
7、1980]を形質転換し、約50,000の独立し
て形質転換されたバクテリアコロニーを、10μg/m
lアンピシリン含有寒天プレート上で増殖させて選択し
た。50μg/mlアンピシリン含有液体増殖培地で洗
浄することにより、形質転換したバクテリアコロニーを
寒天プレートから回収し、10%グリセロール中の10
個のプールとして−70℃で貯蔵した。
ーの合成およびクローング 前記のように調製したLB3mRNAの2本鎖DNAコ
ピーを標準的な方法[マニアティスら、モレキュラー・
クローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、1982およびゴーら、ネイチャー(Natur
e)、309:763〜767、1984]で合成し
た。トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素で触媒され、オ
リゴ−dTを用いる反応において、細胞質ポリアデニル
化LB3mRNA10μgを、1本鎖相補的DNA(c
DNA)合成の鋳型として使用した。この反応の完了
後、0.3M NaOH、1mM EDTA中で65℃で
1時間インキュベートすることによってmRNAを分解
した。塩基を中和し、エタノール沈澱によってcDNA
を回収した後、大腸菌DANポリメラーゼIのクレノウ
フラグメントで触媒された反応において、1本鎖cDN
Aを2本鎖の形態に変換した。次いで、1本鎖特異的ヌ
クレアーゼS1で処理することにより、cDNAの「ヘ
アピン・ループ」構造を切断し、酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ[マイケルソン(Michel
son,A.M.)およびオーキン(Orkin,S.)、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)、257:14773〜14782、1982]を
用いて、デオキシシチジン残基末端(残基約20〜3
0)を2本鎖cDNAの各端に付加した。dC−末端c
DNAを、1.5%アガロースゲル電気泳動により分画
し、長さ500bpを越える分子を回収し、アニーリン
グしてプラスミドDAN分子(pJL3、ゴーら、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼー
ション、4:645:653、1984)とし、これを
制限エンドヌクレアーゼSac1で切断し、それにデオ
キシグアノシン残基末端を付加した(マイケルソンおよ
びオーキン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、257:14773〜14782、198
2)。末端付加cDNAおよびプラスミド分子を文献に
記載の方法でアニーリングし[ゴーら、バイオケミスト
リー(Biochemistry)、19:2702〜2710、1
980]、アニーリングしたcDNA/プラスミド混合
物で大腸菌MC1050[カサダバン(Casadaban,
M.)およびコーヘン(Cohen,S.)、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー、138:179〜20
7、1980]を形質転換し、約50,000の独立し
て形質転換されたバクテリアコロニーを、10μg/m
lアンピシリン含有寒天プレート上で増殖させて選択し
た。50μg/mlアンピシリン含有液体増殖培地で洗
浄することにより、形質転換したバクテリアコロニーを
寒天プレートから回収し、10%グリセロール中の10
個のプールとして−70℃で貯蔵した。
【0052】工程3:オリゴヌクレオチド・プローブの
デザイン LIFのアミノ末端の26個のアミノ酸配列と、トリプ
シンおよびV8プロテアーゼによるLIF分解により生
じる11の異なるペプチドの残基とを決定した(実施例
2参照)。これらのアミノ酸配列は、LIFmRNAに
対応するcDNAクローンを同定するためのハイブリッ
ド形成プローブとして使用する、LIFをコード化する
mRNAの特定の領域に相補的なオリドヌクレオチドの
デザインの基礎を供給した。
デザイン LIFのアミノ末端の26個のアミノ酸配列と、トリプ
シンおよびV8プロテアーゼによるLIF分解により生
じる11の異なるペプチドの残基とを決定した(実施例
2参照)。これらのアミノ酸配列は、LIFmRNAに
対応するcDNAクローンを同定するためのハイブリッ
ド形成プローブとして使用する、LIFをコード化する
mRNAの特定の領域に相補的なオリドヌクレオチドの
デザインの基礎を供給した。
【0053】各天然アミノ酸は、その対応するmRNA
において、3個のリボヌクレオシドトリホスフェートの
特定の組み合わせ(コドン)によりコード化される[例
えば、ワトソン(Watson,J.)、モレキュラー・バイオ
ロジー・オブ・ザ・ジーン(Molecular Biology of the
Gene)、第3版、ベンジャミン/カミングス(Benjami
n/Cummings)、メンロ・バーク(Menlo Park)、カリフ
ォルニア、1976)]。あるアミノ酸は、唯一のコド
ンによってのみ特定されるが、6種ものコドンによって
特定されるアミノ酸もある(例えば、前掲のワトソン、
モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン)。従
って、ヌクレオチド配列の多数の異なる組み合わせが実
際に特定のアミノ酸配列をコード化するので、そのペプ
チドをコード化し得るすべての可能な配列を提供するた
めには多数の異なる退化オリドヌクレオチドが構成され
る必要がある。しかし、高度に退化したオリドヌクレオ
チドをハイブリッド形成プローブとして使用することは
技術的に困難である。しかし、特定のアミノ酸のために
すべてのコドンが等しい頻度で用いられているのではな
く[グランサムら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、943〜73、1981]、哺乳動物のゲノムにお
いてCpGジヌクレオチドは表現不十分であり、塩基組
み合わせから予想される頻度の20〜25%しか起こら
ない[シュヴァルツら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、238:1961〜1967、1
962]ので、特定のペプチドをコード化するあり得る
ヌクレオチド配列を予測し、特定のオリゴヌクレオチド
プローブの複雑さを軽減することがしばしば可能であ
る。前記のように考慮して、異なるLIFペプチドに対
応する多数のオリゴヌクレオチドを標準的な方法によっ
てデザインおよび合成した。
において、3個のリボヌクレオシドトリホスフェートの
特定の組み合わせ(コドン)によりコード化される[例
えば、ワトソン(Watson,J.)、モレキュラー・バイオ
ロジー・オブ・ザ・ジーン(Molecular Biology of the
Gene)、第3版、ベンジャミン/カミングス(Benjami
n/Cummings)、メンロ・バーク(Menlo Park)、カリフ
ォルニア、1976)]。あるアミノ酸は、唯一のコド
ンによってのみ特定されるが、6種ものコドンによって
特定されるアミノ酸もある(例えば、前掲のワトソン、
モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン)。従
って、ヌクレオチド配列の多数の異なる組み合わせが実
際に特定のアミノ酸配列をコード化するので、そのペプ
チドをコード化し得るすべての可能な配列を提供するた
めには多数の異なる退化オリドヌクレオチドが構成され
る必要がある。しかし、高度に退化したオリドヌクレオ
チドをハイブリッド形成プローブとして使用することは
技術的に困難である。しかし、特定のアミノ酸のために
すべてのコドンが等しい頻度で用いられているのではな
く[グランサムら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、943〜73、1981]、哺乳動物のゲノムにお
いてCpGジヌクレオチドは表現不十分であり、塩基組
み合わせから予想される頻度の20〜25%しか起こら
ない[シュヴァルツら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、238:1961〜1967、1
962]ので、特定のペプチドをコード化するあり得る
ヌクレオチド配列を予測し、特定のオリゴヌクレオチド
プローブの複雑さを軽減することがしばしば可能であ
る。前記のように考慮して、異なるLIFペプチドに対
応する多数のオリゴヌクレオチドを標準的な方法によっ
てデザインおよび合成した。
【0054】工程4:LIF−コード化クローンのLB
3cDNAライブラリーのスクリーニング オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によ
ってバクテリアのコロニーをスクリーニングするため
に、前記LB3cDNAライブラリーの各プールからの
10,000〜15,000個のバクテリアコロニーを寒
天プレート(50μg/mlアンピシリン含有)上で増
殖させ、ニトロセルロースフィルターディスクに移し、
フィルターを200μg/mlクロラムフェニコール含
有寒天プレート上でインキュベートすることによって増
幅した[ハナハン(Hanahan,D.)およびメセルソン(M
eselson,M.)、ジーン(Gene)、10:63〜67、
1980]。コロニーを元のプレート上で再増殖させた
後、第2のニトロセルロースフィルターを前記のように
調製した。このマスタープレートを短時間増殖させ、次
いで4℃で貯蔵した。プラスミドDNAをバクテリアコ
ロニーから遊離し、前記のようにニトロセルロースフィ
ルターに固定した(マニアティスら、モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、1982)。ハイブリッド形成の前に、0.9
M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.2%
フィコル、0.2%ポリビニル−ピロリドン、0.2%ウ
シ血清アルブミン、50μg/ml熱変成サケ***DN
A、50μg/ml大腸菌tRNA、0.1M ATPお
よび2mMピロリン酸ナトリウム中でフィルターを37
℃で数時間インキュベートした。0.1%NP40を更
に添加した同じ溶液中で、37℃で18時間ハイブリッ
ド形成を行った。ポリヌクレオチドキナーゼによって触
媒され、[γ−32P]APT500μCi(比活性2,
000〜3,000Ci/mmol)を含有する反応におい
て、第8図に示す合成オリゴヌクレオチド500ngを
放射性ラベルした。次いで、NACS−PREPACカ
ラム[ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda
Research Laboratories)]をその製造者の指示に従っ
て使用したイオン交換クロマトグラフィーによって、取
り込まれなかった[γ−32P]APTを、放射性ラベル
されたオリゴヌクレオチドから分離した。放射性ラベル
したオリゴヌクレオチドを、約20ng/mlの濃度で
ハイブリッド形成反応に用いた。ハイブリッド形成後、
0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.
1%ドデシル硫酸ナトリウム中で種々の温度(以下に記
載する)でフィルターを広範囲に洗浄し、各洗浄後、オ
ートラジオグラフィーに付した。
3cDNAライブラリーのスクリーニング オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によ
ってバクテリアのコロニーをスクリーニングするため
に、前記LB3cDNAライブラリーの各プールからの
10,000〜15,000個のバクテリアコロニーを寒
天プレート(50μg/mlアンピシリン含有)上で増
殖させ、ニトロセルロースフィルターディスクに移し、
フィルターを200μg/mlクロラムフェニコール含
有寒天プレート上でインキュベートすることによって増
幅した[ハナハン(Hanahan,D.)およびメセルソン(M
eselson,M.)、ジーン(Gene)、10:63〜67、
1980]。コロニーを元のプレート上で再増殖させた
後、第2のニトロセルロースフィルターを前記のように
調製した。このマスタープレートを短時間増殖させ、次
いで4℃で貯蔵した。プラスミドDNAをバクテリアコ
ロニーから遊離し、前記のようにニトロセルロースフィ
ルターに固定した(マニアティスら、モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、1982)。ハイブリッド形成の前に、0.9
M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.2%
フィコル、0.2%ポリビニル−ピロリドン、0.2%ウ
シ血清アルブミン、50μg/ml熱変成サケ***DN
A、50μg/ml大腸菌tRNA、0.1M ATPお
よび2mMピロリン酸ナトリウム中でフィルターを37
℃で数時間インキュベートした。0.1%NP40を更
に添加した同じ溶液中で、37℃で18時間ハイブリッ
ド形成を行った。ポリヌクレオチドキナーゼによって触
媒され、[γ−32P]APT500μCi(比活性2,
000〜3,000Ci/mmol)を含有する反応におい
て、第8図に示す合成オリゴヌクレオチド500ngを
放射性ラベルした。次いで、NACS−PREPACカ
ラム[ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda
Research Laboratories)]をその製造者の指示に従っ
て使用したイオン交換クロマトグラフィーによって、取
り込まれなかった[γ−32P]APTを、放射性ラベル
されたオリゴヌクレオチドから分離した。放射性ラベル
したオリゴヌクレオチドを、約20ng/mlの濃度で
ハイブリッド形成反応に用いた。ハイブリッド形成後、
0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.
1%ドデシル硫酸ナトリウム中で種々の温度(以下に記
載する)でフィルターを広範囲に洗浄し、各洗浄後、オ
ートラジオグラフィーに付した。
【0055】洗浄を連続的に行うことの背後にある根本
原理は、低温において、オリゴヌクレオチドと少しでも
相同性(約15のヌクレオチド)を有する全てのクロー
ンが2重フィルター上にオートラジオグラフィーのスポ
ットとして現れることである。温度が上昇すると、オリ
ゴヌクレオチドプローブが相同性レベルの低いクローン
から融解し、それ故対応するオートラジオグラフィーシ
グナルが無くなる。相同性レベルの最も高いクローン
(すなわちLIFcDNA配列を有する可能性の最も高
いクローン)は、最も高い温度でハイブリッド形成を保
持する。この方法によって、最も可能性の高いクローン
を直接得ることが可能となる。第9図は、洗浄温度を4
6℃から66℃℃に上昇した際の、15,000のLB
3cDNAクローンを含有する1対のフィルター上にお
ける1組のクローンの挙動を示す。いくつかのクローン
は、低温においてのみオリゴヌクレオチドへのハイブリ
ッド形成を保持したが、66℃においてもハイブリッド
形成を保持したものもあった(例えばクローン1および
2)。更に分析するために後者のクローンを選択し、対
応するバクテリアコロニーをマスタープレートから取
り、生成し、標準的な方法で各バクテリアクローンから
プラスミドDNAを調製した(マニアティスら、モレキ
ュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ー、1982)。これらのクローンの予備構造分析(挿
入cDNAのサイズの評価、種々の制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位のマッピング、および異なるLIFペプ
チドに対応する種々のオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成の試験による)によると、これらのクローンの
各々は実際には同じであった;すなわち、これらは、同
じクローニング例からの異なった単離物であった。従っ
て、唯一のクローンpLIF7.2bについて更に詳細
な分析を行った。
原理は、低温において、オリゴヌクレオチドと少しでも
相同性(約15のヌクレオチド)を有する全てのクロー
ンが2重フィルター上にオートラジオグラフィーのスポ
ットとして現れることである。温度が上昇すると、オリ
ゴヌクレオチドプローブが相同性レベルの低いクローン
から融解し、それ故対応するオートラジオグラフィーシ
グナルが無くなる。相同性レベルの最も高いクローン
(すなわちLIFcDNA配列を有する可能性の最も高
いクローン)は、最も高い温度でハイブリッド形成を保
持する。この方法によって、最も可能性の高いクローン
を直接得ることが可能となる。第9図は、洗浄温度を4
6℃から66℃℃に上昇した際の、15,000のLB
3cDNAクローンを含有する1対のフィルター上にお
ける1組のクローンの挙動を示す。いくつかのクローン
は、低温においてのみオリゴヌクレオチドへのハイブリ
ッド形成を保持したが、66℃においてもハイブリッド
形成を保持したものもあった(例えばクローン1および
2)。更に分析するために後者のクローンを選択し、対
応するバクテリアコロニーをマスタープレートから取
り、生成し、標準的な方法で各バクテリアクローンから
プラスミドDNAを調製した(マニアティスら、モレキ
ュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ー、1982)。これらのクローンの予備構造分析(挿
入cDNAのサイズの評価、種々の制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位のマッピング、および異なるLIFペプ
チドに対応する種々のオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成の試験による)によると、これらのクローンの
各々は実際には同じであった;すなわち、これらは、同
じクローニング例からの異なった単離物であった。従っ
て、唯一のクローンpLIF7.2bについて更に詳細
な分析を行った。
【0056】工程5:pLIF7.2bのヌクレオチド
配列の決定 ジデオキシ法[サンガー(Sanger,F.)ら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、74:5463〜5467、197
7]によって、シークエンシング反応において、アルカ
リ性または熱変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型として
使用し、そのcDNAに沿うベクター(pJL3)の領
域にも、cDNAインサート中の配列にも相補的な種々
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、大腸
菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントおよび
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとし
て使用して、クローンpLIF7.2bのcDNA部分
のヌクレオチド配列分析を行った。このように決定した
クローンpLIF7.2bのcDNA部分の配列を、第
10図に示す。このような分析により、終止コドンによ
って中断されていない全cDNAに及ぶ唯一の翻訳リー
ディングフレーム中で、LIF分子の種々のペプチドに
対して予め決定された全てのアミノ酸配列がわかり得る
ので、このクローンが、LIF分子をコード化する能力
を有するmRNAのDNAコピーを含有することが確認
された。しかし、このクローンは、(a)5'末端にお
いてメチオニンコドンによって開始される推定される疎
水性リーダー配列をコード化する領域を伸長せず、
(b)3'末端においてイン−フレーム翻訳終止コドン
を含まないので、LIFコード化領域の完全なコピーを
含有する。しかし、成熟タンパク質をコード化する領域
の開始を5'末端において伸長することが、予め決定し
たアミノ末端アミノ酸配列との比較によりわかった(第
10図のPro9残基)。
配列の決定 ジデオキシ法[サンガー(Sanger,F.)ら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、74:5463〜5467、197
7]によって、シークエンシング反応において、アルカ
リ性または熱変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型として
使用し、そのcDNAに沿うベクター(pJL3)の領
域にも、cDNAインサート中の配列にも相補的な種々
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、大腸
菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントおよび
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとし
て使用して、クローンpLIF7.2bのcDNA部分
のヌクレオチド配列分析を行った。このように決定した
クローンpLIF7.2bのcDNA部分の配列を、第
10図に示す。このような分析により、終止コドンによ
って中断されていない全cDNAに及ぶ唯一の翻訳リー
ディングフレーム中で、LIF分子の種々のペプチドに
対して予め決定された全てのアミノ酸配列がわかり得る
ので、このクローンが、LIF分子をコード化する能力
を有するmRNAのDNAコピーを含有することが確認
された。しかし、このクローンは、(a)5'末端にお
いてメチオニンコドンによって開始される推定される疎
水性リーダー配列をコード化する領域を伸長せず、
(b)3'末端においてイン−フレーム翻訳終止コドン
を含まないので、LIFコード化領域の完全なコピーを
含有する。しかし、成熟タンパク質をコード化する領域
の開始を5'末端において伸長することが、予め決定し
たアミノ末端アミノ酸配列との比較によりわかった(第
10図のPro9残基)。
【0057】実施例5 以下に、マウスLIFコード化領域の全コピーを構成
し、このコード化領域を酵母発現ベクターに挿入し、マ
ウスLIFを製造する工程を説明する。第11図 :酵母細胞におけるマウスLIFの発現の工程
1に関する:LIFのC−末端アミノ酸配列。pLIF
7.2bリーディングフレームのC−末端におけるアミ
ノ酸配列を示し、その下にはブドウ球菌V8プロテアー
ゼおよびクレブス腹水癌細胞から精製されたLIFから
誘導されるトリプシンペプチドの配列を示す。後2者の
ペプチドは、pLIF7.2bLIF配列に更に9個の
アミノ酸を加えたものであり、末端が同じ残基である。
クローンpLIFNK1の対応する領域のヌクレオチド
およびアミノ酸配列は、最下行に示し、直接アミノ酸シ
ークエンシングによって決定されたC−末端を確認す
る。番号付けは第10図の通りである。
し、このコード化領域を酵母発現ベクターに挿入し、マ
ウスLIFを製造する工程を説明する。第11図 :酵母細胞におけるマウスLIFの発現の工程
1に関する:LIFのC−末端アミノ酸配列。pLIF
7.2bリーディングフレームのC−末端におけるアミ
ノ酸配列を示し、その下にはブドウ球菌V8プロテアー
ゼおよびクレブス腹水癌細胞から精製されたLIFから
誘導されるトリプシンペプチドの配列を示す。後2者の
ペプチドは、pLIF7.2bLIF配列に更に9個の
アミノ酸を加えたものであり、末端が同じ残基である。
クローンpLIFNK1の対応する領域のヌクレオチド
およびアミノ酸配列は、最下行に示し、直接アミノ酸シ
ークエンシングによって決定されたC−末端を確認す
る。番号付けは第10図の通りである。
【0058】第12図:酵母細胞におけるマウスLIF
の発現の工程2に関する:酵母発現ベクターYEpsecl
に挿入するpLIF7.2bcDNAの再構成。pLI
F7.2bcDNAの部分ヌクレオチド配列およびそれ
によってコード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
番号付けは第10図および第11図に従う。第2行およ
び第3行は、それぞれpLIFmut1およびpLIFmut
2の配列を示す。星印は、終止コドンを示す。YEpsec
l[バルダリ(Baldari,C.)ら、ヨーロピアン・モレキ
ュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナ
ル、6:229〜234、1987]およびpGEX−
2T[スミス(Smith,D.B.)およびジョンソン(Johns
on,K.G.)、ジーン、1988]中にクローニングする
ための制限部位(BamHI、HindIIIおよびEco
RI)を示す。最下行には、YEpsecl中のクルイヴェロ
ミセス・ラクティスのキラー毒素シグナル配列の部分配
列を示す。BamHI制限部位のGly−Serコード
化配列は、シグナルペプチドによって有効に認識される
(バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、6:229〜
234、1987)。
の発現の工程2に関する:酵母発現ベクターYEpsecl
に挿入するpLIF7.2bcDNAの再構成。pLI
F7.2bcDNAの部分ヌクレオチド配列およびそれ
によってコード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
番号付けは第10図および第11図に従う。第2行およ
び第3行は、それぞれpLIFmut1およびpLIFmut
2の配列を示す。星印は、終止コドンを示す。YEpsec
l[バルダリ(Baldari,C.)ら、ヨーロピアン・モレキ
ュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナ
ル、6:229〜234、1987]およびpGEX−
2T[スミス(Smith,D.B.)およびジョンソン(Johns
on,K.G.)、ジーン、1988]中にクローニングする
ための制限部位(BamHI、HindIIIおよびEco
RI)を示す。最下行には、YEpsecl中のクルイヴェロ
ミセス・ラクティスのキラー毒素シグナル配列の部分配
列を示す。BamHI制限部位のGly−Serコード
化配列は、シグナルペプチドによって有効に認識される
(バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、6:229〜
234、1987)。
【0059】第13図:酵母細胞におけるマウスLIF
発現の工程4に関する:M1白血病細胞の培養における
酵母誘導組換LIFの生物学的活性。酵母誘導組換LI
F(−●−)および精製天然LIF−A(−〇−)のM
1培養への滴定は、M1コロニーの分化(パネルA)お
よびコロニー生成の抑制(パネルB)の同様の濃度依存
性誘導を示す。各ポイントは、2培養の平均値を表す。
発現の工程4に関する:M1白血病細胞の培養における
酵母誘導組換LIFの生物学的活性。酵母誘導組換LI
F(−●−)および精製天然LIF−A(−〇−)のM
1培養への滴定は、M1コロニーの分化(パネルA)お
よびコロニー生成の抑制(パネルB)の同様の濃度依存
性誘導を示す。各ポイントは、2培養の平均値を表す。
【0060】第14図:酵母細胞におけるマウスLIF
発現の工程5に関する:種々の希釈度における、真正天
然マウスLIF−A(−〇−)、ガラクトースで誘導さ
れたLIFmut1/YEpsecl組換体を含有する酵母細胞
のならし培地(−●−)およびガラクトースで誘導され
ていない同じ酵母細胞の培地(−+−)の、天然125I
−LIF−Aとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競
合する能力を示す。
発現の工程5に関する:種々の希釈度における、真正天
然マウスLIF−A(−〇−)、ガラクトースで誘導さ
れたLIFmut1/YEpsecl組換体を含有する酵母細胞
のならし培地(−●−)およびガラクトースで誘導され
ていない同じ酵母細胞の培地(−+−)の、天然125I
−LIF−Aとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競
合する能力を示す。
【0061】工程1:マウスLIFのC−末端における
アミノ酸配列の決定 実施例4のcDNAクローンpLIF7.2bは、マウ
スLIFmRNAの不完全なコピーを含有する。5'末
端において、cDNAは、N−末端アミノ酸配列分析に
よって決定した最初の残基(第10図におけるPro
9)に結合するN−末端の8個の残基をコード化する。
しかし、3'末端においては、pLIF7.2bは、イン
-フレーム翻訳終止コドンを含まないので不完全であ
る。直接アミノ酸シークエンシング(実施例2)によっ
て決定された2種のLIFペプチドのアミノ酸配列の調
査により、pLIF7.2bは3'末端においてコード化
領域のわずかに27のヌクレオチドを欠くことが示唆さ
れた。第11図に示すように、V8−誘導ペプチドは、
cDNA配列の残基Ala162に始まり、9個の残基
によってcDNAクローンから推測されるアミノ酸配列
に至っていた。V8ペプチド中に含まれるトリプシンペ
プチドの末端が同じ残基であり、このことは、Phe1
87がタンパク質のC−末端残基であることを示唆して
いる。この推定を確認するために、pLIF7.2bと
重複し、3'方向に伸長するLIFcDNAクローンを
単離し、ヌクレオチド配列分析に付した。
アミノ酸配列の決定 実施例4のcDNAクローンpLIF7.2bは、マウ
スLIFmRNAの不完全なコピーを含有する。5'末
端において、cDNAは、N−末端アミノ酸配列分析に
よって決定した最初の残基(第10図におけるPro
9)に結合するN−末端の8個の残基をコード化する。
しかし、3'末端においては、pLIF7.2bは、イン
-フレーム翻訳終止コドンを含まないので不完全であ
る。直接アミノ酸シークエンシング(実施例2)によっ
て決定された2種のLIFペプチドのアミノ酸配列の調
査により、pLIF7.2bは3'末端においてコード化
領域のわずかに27のヌクレオチドを欠くことが示唆さ
れた。第11図に示すように、V8−誘導ペプチドは、
cDNA配列の残基Ala162に始まり、9個の残基
によってcDNAクローンから推測されるアミノ酸配列
に至っていた。V8ペプチド中に含まれるトリプシンペ
プチドの末端が同じ残基であり、このことは、Phe1
87がタンパク質のC−末端残基であることを示唆して
いる。この推定を確認するために、pLIF7.2bと
重複し、3'方向に伸長するLIFcDNAクローンを
単離し、ヌクレオチド配列分析に付した。
【0062】そのようなクローンを単離するための適当
なcDNAライブラリーを構成し、スクリーニングする
ために、ノザン法により一連の異なるmRNA試料をス
クリーニングして、LIFmRNA分子濃度が最高であ
るRNA試料を同定した。実質的に文献に記載の方法
(ゴー、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、165:683〜699、1983)で調製した細
胞質ポリアデニル化RNAを、20mMモルホリノプロ
パンスルホン酸(MOPS)、5mM酢酸ナトリウム、
1mM EDTA(pH7.0)および6%v/vホルム
アルデヒドを含有する1%アガロースゲル上で分画し、
RNA含有フィルターを、0.2%フィコル、0.2%ポ
リビニル−ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、
2mMピロリン酸ナトリウム、1mM ATP、80μ
g/ml変性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸
菌tRNAを含有する2×SSCに、67℃で数時間浸
漬した。0.1%SDSを加えた同じ緩衝液中で67℃
でハイブリッド形成を行った。LIF転写を検出するた
めに使用したプローブは、pSP65中でサブクローン
化されたpLIF7.2bのcDNAインサートを含有
する約750bpのEcoRI−HindIIIフラグメン
トから成っていた。このフラグメントは、cDNA配列
を有するだけでなく、G−C末端およびpJL3ベクタ
ー配列の約150bpをも有していた。約2×109c
pm/μgのリボプローブは、BRESA[アデライド
(Adelaide)]の試薬を用いるSDP6サブクローンの
転写により誘導した。このプローブは、約2×107c
pm/mlでハイブリッド形成に用いた。フィルター
を、オートラジオグラフィーに付す前に、2×SSC、
2mM EDTA、0.1%SDS中で67℃で、および
最後に0.2×SSC中で67℃で広範に洗浄した。
なcDNAライブラリーを構成し、スクリーニングする
ために、ノザン法により一連の異なるmRNA試料をス
クリーニングして、LIFmRNA分子濃度が最高であ
るRNA試料を同定した。実質的に文献に記載の方法
(ゴー、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、165:683〜699、1983)で調製した細
胞質ポリアデニル化RNAを、20mMモルホリノプロ
パンスルホン酸(MOPS)、5mM酢酸ナトリウム、
1mM EDTA(pH7.0)および6%v/vホルム
アルデヒドを含有する1%アガロースゲル上で分画し、
RNA含有フィルターを、0.2%フィコル、0.2%ポ
リビニル−ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、
2mMピロリン酸ナトリウム、1mM ATP、80μ
g/ml変性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸
菌tRNAを含有する2×SSCに、67℃で数時間浸
漬した。0.1%SDSを加えた同じ緩衝液中で67℃
でハイブリッド形成を行った。LIF転写を検出するた
めに使用したプローブは、pSP65中でサブクローン
化されたpLIF7.2bのcDNAインサートを含有
する約750bpのEcoRI−HindIIIフラグメン
トから成っていた。このフラグメントは、cDNA配列
を有するだけでなく、G−C末端およびpJL3ベクタ
ー配列の約150bpをも有していた。約2×109c
pm/μgのリボプローブは、BRESA[アデライド
(Adelaide)]の試薬を用いるSDP6サブクローンの
転写により誘導した。このプローブは、約2×107c
pm/mlでハイブリッド形成に用いた。フィルター
を、オートラジオグラフィーに付す前に、2×SSC、
2mM EDTA、0.1%SDS中で67℃で、および
最後に0.2×SSC中で67℃で広範に洗浄した。
【0063】このような分析により、LIF転写物は種
々の造血細胞系中に低レベルで存在し、クレブスRNA
のバッチによってLIFmRNAのレベルには大きな差
があることがわかった。クレブス腹水癌細胞RNAの2
つのバッチを選択して、2つのcDNAライブラリーを
合成した。cDNAライブラリーは、アメルシャム(Am
ersham)の試薬(製造番号RPN.1256およびRP
N.1257)を、その製造者の指示に従って用いて構
成した;クローニングベクターはλGT10であった。
約4×105の組換クローンが得られ、pLIF7.2b
の3'末端における36残基の配列に対応するオリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成によってスクリーニン
グした:第10図のヌクレオチド500〜535(両端
を含む)。
々の造血細胞系中に低レベルで存在し、クレブスRNA
のバッチによってLIFmRNAのレベルには大きな差
があることがわかった。クレブス腹水癌細胞RNAの2
つのバッチを選択して、2つのcDNAライブラリーを
合成した。cDNAライブラリーは、アメルシャム(Am
ersham)の試薬(製造番号RPN.1256およびRP
N.1257)を、その製造者の指示に従って用いて構
成した;クローニングベクターはλGT10であった。
約4×105の組換クローンが得られ、pLIF7.2b
の3'末端における36残基の配列に対応するオリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成によってスクリーニン
グした:第10図のヌクレオチド500〜535(両端
を含む)。
【0064】クレブスcDNAライブラリーに相当する
ファージプラークを、10cmのペトリ皿当たり約5
0,000のプラークの密度で増殖させ、ニトロセルロ
ースに移し、標準的な方法で処理した(マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリン
グ・ハーバー、1982)。ハイブリッド形成の前に、
6×SSC(SSC=0.15M NaCl、0.015
Mクエン酸ナトリウム)、0.2%フィコル、0.2%ポ
リビニル−ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、
2mMピロリン酸ナトリウム、1mM ATP、50m
g/ml変性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸
菌tRNA中で、フィルターを37℃で数時間インキュ
ベートした。0.1%NP40を含有する同じ溶液中
で、37℃で16〜18時間ハイブリッド形成を行っ
た。[γ−32P]ATPおよびポリヌクレオチドキナー
ゼで比活性約109cpm/μgに放射性ラベルし、取
り込まれなかったラベルからNACSカラム(ベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ)を用いるイオン交換クロ
マトグラフィーにより分離した前記オリゴヌクレオチド
プローブを、約20ng/mlの濃度でハイブリッド形
成に用いた。ハイブリッド形成後、6×SSC、0.1
%ドデシル硫酸ナトリウム中で60℃でフィルターを洗
浄した。前記のように、フィルター上で陽性のクローン
λLIFNK1に相当する1個のプラークを取り、低密
度で再スクリーニングした。
ファージプラークを、10cmのペトリ皿当たり約5
0,000のプラークの密度で増殖させ、ニトロセルロ
ースに移し、標準的な方法で処理した(マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリン
グ・ハーバー、1982)。ハイブリッド形成の前に、
6×SSC(SSC=0.15M NaCl、0.015
Mクエン酸ナトリウム)、0.2%フィコル、0.2%ポ
リビニル−ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、
2mMピロリン酸ナトリウム、1mM ATP、50m
g/ml変性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸
菌tRNA中で、フィルターを37℃で数時間インキュ
ベートした。0.1%NP40を含有する同じ溶液中
で、37℃で16〜18時間ハイブリッド形成を行っ
た。[γ−32P]ATPおよびポリヌクレオチドキナー
ゼで比活性約109cpm/μgに放射性ラベルし、取
り込まれなかったラベルからNACSカラム(ベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ)を用いるイオン交換クロ
マトグラフィーにより分離した前記オリゴヌクレオチド
プローブを、約20ng/mlの濃度でハイブリッド形
成に用いた。ハイブリッド形成後、6×SSC、0.1
%ドデシル硫酸ナトリウム中で60℃でフィルターを洗
浄した。前記のように、フィルター上で陽性のクローン
λLIFNK1に相当する1個のプラークを取り、低密
度で再スクリーニングした。
【0065】前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形
成したλLIFNK1中の約950bpのcDNAイン
サートを、プラスミドベクター[pEMBL8+、デン
テ(Dente,L.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、11:1645〜1655、1983]中にサブク
ローン化してクローンpLIFNK1を生成した。pL
IFNK1のcDNAインサートのヌクレオチド配列分
析は、ジデオキシ法(サンガーら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ、米国、74:5463〜5467、1977)によ
って、アルカリ性変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型と
して用い[チェン(Chen,E.Y.)およびシーバーグ(Se
eburg,P.H.)、DNA、4:165〜170、198
5]、cDNAに沿うベクターにもcDNA内の配列に
も相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウフラグメ
ントおよびAMV逆転写酵素をポリメラーゼとして用い
て行った。pLIFNK1中のcDNAインサートの部
分のヌクレオチド配列を第11図に示す。pLIFNK
1によって特定されるアミノ酸配列は、C−末端におい
て、直接アミノ酸シークエンシングによってLIFのC
−末端を構成すると予測される9個のアミノ酸と同じで
あり、pLIFNK1cDNA配列において、このPh
e187のコドンが直接にイン-フレーム翻訳終止コド
ンにつながっているので、Phe187がLIFのC−
末端残基であることが確認された。
成したλLIFNK1中の約950bpのcDNAイン
サートを、プラスミドベクター[pEMBL8+、デン
テ(Dente,L.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、11:1645〜1655、1983]中にサブク
ローン化してクローンpLIFNK1を生成した。pL
IFNK1のcDNAインサートのヌクレオチド配列分
析は、ジデオキシ法(サンガーら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ、米国、74:5463〜5467、1977)によ
って、アルカリ性変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型と
して用い[チェン(Chen,E.Y.)およびシーバーグ(Se
eburg,P.H.)、DNA、4:165〜170、198
5]、cDNAに沿うベクターにもcDNA内の配列に
も相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウフラグメ
ントおよびAMV逆転写酵素をポリメラーゼとして用い
て行った。pLIFNK1中のcDNAインサートの部
分のヌクレオチド配列を第11図に示す。pLIFNK
1によって特定されるアミノ酸配列は、C−末端におい
て、直接アミノ酸シークエンシングによってLIFのC
−末端を構成すると予測される9個のアミノ酸と同じで
あり、pLIFNK1cDNA配列において、このPh
e187のコドンが直接にイン-フレーム翻訳終止コド
ンにつながっているので、Phe187がLIFのC−
末端残基であることが確認された。
【0066】工程2:酵母発現ベクター中のLIFコド
ン領域の構成 LIFcDNAクローンによってコード化されたタンパ
ク質の最初の製造が真核系(酵母)において達成され、
発現された生成物はグリコシル化され、分泌され、正確
に折り畳まれた。用いた発現ベクターYEpseclは、ク
ルイヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から
誘導され、インターロイキン1の有効に分泌することが
示されており(バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラ
ー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、
6:229〜234、1987)、ガラクトース誘導性
ハイブリッドGAL−CYCプロモーターから転写され
たN−末端リーダー配列を提供する。
ン領域の構成 LIFcDNAクローンによってコード化されたタンパ
ク質の最初の製造が真核系(酵母)において達成され、
発現された生成物はグリコシル化され、分泌され、正確
に折り畳まれた。用いた発現ベクターYEpseclは、ク
ルイヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から
誘導され、インターロイキン1の有効に分泌することが
示されており(バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラ
ー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、
6:229〜234、1987)、ガラクトース誘導性
ハイブリッドGAL−CYCプロモーターから転写され
たN−末端リーダー配列を提供する。
【0067】このべクター中のpLIF7.2bによっ
てコード化されたタンパク質を発現するために、cDN
Aを幾つかの手段で修飾する必要があった(第12図参
照)。5'末端において、部分的な哺乳動物のリーダー
配列を特定する数個のヌクレオチドを除去するだけでな
く、適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位(BamH
I)を設けて、クルイヴェロミセス・ラクティスリーダ
ーを挿入させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位
(Gly−Ser)を保持することが必要であった。
3'末端においては、LIFのコード化領域の2種の構
成がなされた。1種(LIFmutl)は、pLIF7.2
bの最後のコドン(Gln178)に終止コドンがつな
がるように構成された。他方(LIFmut2)は、pL
IF7.2b(前記参照)に欠損していることが知られ
ている9個のアミノ酸残基をコード化する配列を付加
し、これに翻訳終止コドンがつながるように構成され
た。適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位(Hind
III)は、いずれの構造においても構成された。これら
の修飾はすべてオリゴヌクレオチド介在突然変異誘発に
より達成された:pLIF7.2bの535bpのcD
NAインサートを持ち、G−C末端およびpJL3ベク
ターの部分によって制限された約750bpのEcoR
I−HindIIIフラグメントは、プラスミドpEMBL
8+中にサブクローン化し(デンテら、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、11:1645〜1655、19
83)、1本鎖DNAは、文献に記載の方法で調製した
[セサリーニ(Cesarini,G.)およびマーレイ(Murra
y,J.A.H.)、セトロウ(Setlow,J.K.)およびホレン
ダー(Hollaender,A.)編、ジェニティック・エンジニ
アリング:プリンシプルズ・アンド・メソッズ(Geneti
c Engineering: Principles and Methods)、プレナム
・プレス(Plenum Press)、ニューヨーク、第8巻、1
987]。イン・ビトロの突然変異誘発は、文献に記載
のようにして[ニスベット(Nisbet,I.T.)およびベイ
ルハルツ(Beilharz,M.W.)、ジーン・アナリシス・テ
クニークス(Gene Anal.Techn.)、2:23〜29、
1985]、35、51および61塩基のオリゴヌクレ
オチドを用いて行い、概略を示したcDNAの5'末端
および3'末端を修飾した。修飾されたLIFcDNA
配列を含むBamHI−HindIIIフラグメントを、プ
ラスミドYEpseclに入れ、得られる組換体中のインサ
ートのヌクレオチド配列を決定した。
てコード化されたタンパク質を発現するために、cDN
Aを幾つかの手段で修飾する必要があった(第12図参
照)。5'末端において、部分的な哺乳動物のリーダー
配列を特定する数個のヌクレオチドを除去するだけでな
く、適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位(BamH
I)を設けて、クルイヴェロミセス・ラクティスリーダ
ーを挿入させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位
(Gly−Ser)を保持することが必要であった。
3'末端においては、LIFのコード化領域の2種の構
成がなされた。1種(LIFmutl)は、pLIF7.2
bの最後のコドン(Gln178)に終止コドンがつな
がるように構成された。他方(LIFmut2)は、pL
IF7.2b(前記参照)に欠損していることが知られ
ている9個のアミノ酸残基をコード化する配列を付加
し、これに翻訳終止コドンがつながるように構成され
た。適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位(Hind
III)は、いずれの構造においても構成された。これら
の修飾はすべてオリゴヌクレオチド介在突然変異誘発に
より達成された:pLIF7.2bの535bpのcD
NAインサートを持ち、G−C末端およびpJL3ベク
ターの部分によって制限された約750bpのEcoR
I−HindIIIフラグメントは、プラスミドpEMBL
8+中にサブクローン化し(デンテら、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、11:1645〜1655、19
83)、1本鎖DNAは、文献に記載の方法で調製した
[セサリーニ(Cesarini,G.)およびマーレイ(Murra
y,J.A.H.)、セトロウ(Setlow,J.K.)およびホレン
ダー(Hollaender,A.)編、ジェニティック・エンジニ
アリング:プリンシプルズ・アンド・メソッズ(Geneti
c Engineering: Principles and Methods)、プレナム
・プレス(Plenum Press)、ニューヨーク、第8巻、1
987]。イン・ビトロの突然変異誘発は、文献に記載
のようにして[ニスベット(Nisbet,I.T.)およびベイ
ルハルツ(Beilharz,M.W.)、ジーン・アナリシス・テ
クニークス(Gene Anal.Techn.)、2:23〜29、
1985]、35、51および61塩基のオリゴヌクレ
オチドを用いて行い、概略を示したcDNAの5'末端
および3'末端を修飾した。修飾されたLIFcDNA
配列を含むBamHI−HindIIIフラグメントを、プ
ラスミドYEpseclに入れ、得られる組換体中のインサ
ートのヌクレオチド配列を決定した。
【0068】工程3:YEpsecl/LIF組換体の、酵
母細胞への導入 ビール酵母菌株GY41[leu2 ura3 adel his4 met2 t
rp5 gal1 cir+; x 4003-5b、イースト・ジェネティック
・ストック・センター(Yeast Genetic StockCentr
e)、バークレイ(Berkeley)]を、ポリエチレングリ
コール法によって形質転換した[クレベ(Klebe,R.
J.)ら、ジーン、25:333〜341、1983]。
形質転換体は、ウラシル不存在下に合成最少培地[必要
なアミノ酸50μg/mlを追加した、2%炭素原、
0.67%酵母窒素成分(ディフコ;Difco)]上で選択
および保持した。プラスミドYEpsecl中のインサート
配列の発現は、非選択的完全培地(1%酵母抽出物、2
%ペプトン)または合成最少培地(いずれも2%ガラク
トースを含有する)中で、形質転換体を増殖することに
よって達成された。
母細胞への導入 ビール酵母菌株GY41[leu2 ura3 adel his4 met2 t
rp5 gal1 cir+; x 4003-5b、イースト・ジェネティック
・ストック・センター(Yeast Genetic StockCentr
e)、バークレイ(Berkeley)]を、ポリエチレングリ
コール法によって形質転換した[クレベ(Klebe,R.
J.)ら、ジーン、25:333〜341、1983]。
形質転換体は、ウラシル不存在下に合成最少培地[必要
なアミノ酸50μg/mlを追加した、2%炭素原、
0.67%酵母窒素成分(ディフコ;Difco)]上で選択
および保持した。プラスミドYEpsecl中のインサート
配列の発現は、非選択的完全培地(1%酵母抽出物、2
%ペプトン)または合成最少培地(いずれも2%ガラク
トースを含有する)中で、形質転換体を増殖することに
よって達成された。
【0069】工程4:酵母誘導LIFの生物学的性質の
決定 酵母ならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性の
アッセイを、ウシ胎児血清20%および寒天0.3%の
最終濃度のダルベッコ改良イーグル培地中にM1細胞3
00個を含有する培養液(ホズミ博士、サイタマ・カン
サー・リサーチ・センター(Saitama Cancer Research
Centre)、日本により提供)1ml中で行った。アッセ
イに付す材料は、連続的希釈物0.1mlとして、寒天
培地中の細胞懸濁液を添加する前に培養器に加えた。培
養は、10%CO2の水蒸気飽和雰囲気中で7日間イン
キュベートした。培養は、顕微鏡を用いて倍率35で記
録し、分散した細胞を有するコロニーまたは分散した細
胞のみから成るコロニーは、分化されたと記録した。形
態学的観察は、全培養を2.5%グルタルアルデヒド1
mlで固定し、次いで顕微鏡のスライド上で乾燥した培
養を、アセチルコリンエステラーゼ/ルクソール・ファ
スト・ブルー(Luxol Fast Blue)/ヘマトキシリンで
染色することによって行った。
決定 酵母ならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性の
アッセイを、ウシ胎児血清20%および寒天0.3%の
最終濃度のダルベッコ改良イーグル培地中にM1細胞3
00個を含有する培養液(ホズミ博士、サイタマ・カン
サー・リサーチ・センター(Saitama Cancer Research
Centre)、日本により提供)1ml中で行った。アッセ
イに付す材料は、連続的希釈物0.1mlとして、寒天
培地中の細胞懸濁液を添加する前に培養器に加えた。培
養は、10%CO2の水蒸気飽和雰囲気中で7日間イン
キュベートした。培養は、顕微鏡を用いて倍率35で記
録し、分散した細胞を有するコロニーまたは分散した細
胞のみから成るコロニーは、分化されたと記録した。形
態学的観察は、全培養を2.5%グルタルアルデヒド1
mlで固定し、次いで顕微鏡のスライド上で乾燥した培
養を、アセチルコリンエステラーゼ/ルクソール・ファ
スト・ブルー(Luxol Fast Blue)/ヘマトキシリンで
染色することによって行った。
【0070】コロニー刺激活性のアッセイは、75,0
00個のC57BL骨髄細胞を用いて文献に記載の方法
で行った(メトカルフ、ザ・ヘモポイエティック・コロ
ニー・スティミュレーティング・ファクターズ、エルセ
ヴィール、アムステルダム、1984)。WEHI−3
B D+細胞に対する分化誘導活性のアッセイは、文献に
記載のように行った(ニコラら、ザ・ヘモポイエティッ
ク・コロニー・スティミュレーティング・ファクター
ズ、258:9017〜9023、1983)。
00個のC57BL骨髄細胞を用いて文献に記載の方法
で行った(メトカルフ、ザ・ヘモポイエティック・コロ
ニー・スティミュレーティング・ファクターズ、エルセ
ヴィール、アムステルダム、1984)。WEHI−3
B D+細胞に対する分化誘導活性のアッセイは、文献に
記載のように行った(ニコラら、ザ・ヘモポイエティッ
ク・コロニー・スティミュレーティング・ファクター
ズ、258:9017〜9023、1983)。
【0071】非形質転換酵母、ベクターYEpseclのみ
を有する酵母または不完全なコード化領域(LIFmut
1)を有する酵母の培養のものではなく、全コード化領
域(LIFmut2)を有する酵母の培養の培地は、M1
コロニーの培養において典型的なマクロファージ分化を
誘導することができた(第13A図)。精製した天然L
IFを用いた場合と同様に、酵母誘導物質も、濃度を増
すと、分化するM1コロニーの数およびサイズを徐々に
低下させた(第13B図)。精製した天然LIFとの比
較により、酵母ならし培地は、16,000ユニット/
ml(約130ng/ml)までのLIFを含有するこ
とが示唆された。酵母誘導LIFは、精製した天然LI
F−Aと同様に、正常顆粒球−マクロファージ前駆細胞
によるコロニーの形成を刺激すること、またはWEHI
−3B D+白血病コロニーの分化の誘導もしくは増殖の
抑制を行うことはない。
を有する酵母または不完全なコード化領域(LIFmut
1)を有する酵母の培養のものではなく、全コード化領
域(LIFmut2)を有する酵母の培養の培地は、M1
コロニーの培養において典型的なマクロファージ分化を
誘導することができた(第13A図)。精製した天然L
IFを用いた場合と同様に、酵母誘導物質も、濃度を増
すと、分化するM1コロニーの数およびサイズを徐々に
低下させた(第13B図)。精製した天然LIFとの比
較により、酵母ならし培地は、16,000ユニット/
ml(約130ng/ml)までのLIFを含有するこ
とが示唆された。酵母誘導LIFは、精製した天然LI
F−Aと同様に、正常顆粒球−マクロファージ前駆細胞
によるコロニーの形成を刺激すること、またはWEHI
−3B D+白血病コロニーの分化の誘導もしくは増殖の
抑制を行うことはない。
【0072】セファクリル(Sephacryl)S−200カ
ラムによるサイズ分画により、クレブス細胞から誘導さ
れるLIFには58,000ダルトンであるのに対し
て、酵母誘導LIFは見掛けの分子量が67,000〜
150,000ダルトンのタンパク質と共に溶出される
ことがわかった。
ラムによるサイズ分画により、クレブス細胞から誘導さ
れるLIFには58,000ダルトンであるのに対し
て、酵母誘導LIFは見掛けの分子量が67,000〜
150,000ダルトンのタンパク質と共に溶出される
ことがわかった。
【0073】不完全なコード化領域(LIFmut1)を
有する酵母のならし培地にLIF活性が無いことは、こ
の構造に欠損している9個の疎水性C−末端残基がLI
F機能に必要であることを示唆している。これらの残基
はレセプターと相互作用し得るが、タンパク質中で疎水
性のコアの部分の形成もし、それ故その欠如は、適当な
折り畳みの妨害となり得る。または、そのような残基
は、LIFの有効な分泌に何等かの形式で必要なのであ
ろう。
有する酵母のならし培地にLIF活性が無いことは、こ
の構造に欠損している9個の疎水性C−末端残基がLI
F機能に必要であることを示唆している。これらの残基
はレセプターと相互作用し得るが、タンパク質中で疎水
性のコアの部分の形成もし、それ故その欠如は、適当な
折り畳みの妨害となり得る。または、そのような残基
は、LIFの有効な分泌に何等かの形式で必要なのであ
ろう。
【0074】工程5:酵母誘導マウスLIFおよびクレ
ブスII腹水細胞ならし培地から精製した天然LIF−A
のレセプター結合特異性 精製したマウスLIF−A(実施例1)を前記のように
ヨウ素化した(実施例3)。腹腔内でチオグリコーレー
トにより高レベルのマクロファージを誘導したマウスか
ら、洗浄によって腹腔細胞を採った。これらの細胞を洗
浄し、10%ウシ胎児血清含有Hepes−緩衝RPMI培
地に、2.5×106/50μlで再懸濁させた。細胞懸
濁液50μlを200,000cpmの125I−LIF−
A(10μl、同じ培地中)および10μl中の対照培
地または非ラベル純マウスLIF−Aもしくは酵母誘導
マウスLIFの連続2倍希釈物と共にインキュベートし
た。適当な濃度において、LIFmut2構造(第12
図)含有ガラクトース誘導酵母の上澄は、腹腔細胞レセ
プターへの結合を125I−LIF−Aと競合したが、非
誘導酵母上澄は競合しなかった(第14図)。競合の度
合いは、真正天然LIF−Aのそれと同じくらいであ
り、このことは、酵母誘導LIF−Aが、LIF−A細
胞レセプターへの結合に必要なすべての情報を有するこ
とを示唆している。
ブスII腹水細胞ならし培地から精製した天然LIF−A
のレセプター結合特異性 精製したマウスLIF−A(実施例1)を前記のように
ヨウ素化した(実施例3)。腹腔内でチオグリコーレー
トにより高レベルのマクロファージを誘導したマウスか
ら、洗浄によって腹腔細胞を採った。これらの細胞を洗
浄し、10%ウシ胎児血清含有Hepes−緩衝RPMI培
地に、2.5×106/50μlで再懸濁させた。細胞懸
濁液50μlを200,000cpmの125I−LIF−
A(10μl、同じ培地中)および10μl中の対照培
地または非ラベル純マウスLIF−Aもしくは酵母誘導
マウスLIFの連続2倍希釈物と共にインキュベートし
た。適当な濃度において、LIFmut2構造(第12
図)含有ガラクトース誘導酵母の上澄は、腹腔細胞レセ
プターへの結合を125I−LIF−Aと競合したが、非
誘導酵母上澄は競合しなかった(第14図)。競合の度
合いは、真正天然LIF−Aのそれと同じくらいであ
り、このことは、酵母誘導LIF−Aが、LIF−A細
胞レセプターへの結合に必要なすべての情報を有するこ
とを示唆している。
【0075】実施例6 本実施例は、哺乳動物細胞における組換マウスLIFの
発現のための工程を説明する。第15図は、以下に記載
する方法の工程1に関する:クローンpLIFNK3の
cDNA部分のヌクレオチド配列。mRNA同義鎖のヌ
クレオチド配列を、上部に示すLIFの推定アミノ酸配
列と共に5'から3'方向に示す。予め決定したN−末端
アミノ酸残基を+1として示す。cDNAの5'末端の
EcoRI部位および終止コドンにかかるXbaI部位
(工程2においてLIFコード化領域をpMP−Zen
に挿入するのに使用した。)を示す。
発現のための工程を説明する。第15図は、以下に記載
する方法の工程1に関する:クローンpLIFNK3の
cDNA部分のヌクレオチド配列。mRNA同義鎖のヌ
クレオチド配列を、上部に示すLIFの推定アミノ酸配
列と共に5'から3'方向に示す。予め決定したN−末端
アミノ酸残基を+1として示す。cDNAの5'末端の
EcoRI部位および終止コドンにかかるXbaI部位
(工程2においてLIFコード化領域をpMP−Zen
に挿入するのに使用した。)を示す。
【0076】工程1:マウスLIFのN−末端リーダー
配列のアミノ酸配列の決定 cDNAクローンpLIF7.2bおよびpLIFNK
1(前記)は、LIFmRNAの不完全なコピーを含有
する。これらは、LIFタンパク質の成熟部分の完全な
コード化領域をも有するが、哺乳動物細胞からのLIF
の分泌に要する完全な疎水性リーダー配列を持たない。
配列のアミノ酸配列の決定 cDNAクローンpLIF7.2bおよびpLIFNK
1(前記)は、LIFmRNAの不完全なコピーを含有
する。これらは、LIFタンパク質の成熟部分の完全な
コード化領域をも有するが、哺乳動物細胞からのLIF
の分泌に要する完全な疎水性リーダー配列を持たない。
【0077】疎水性リーダーをコード化する領域を含有
するcDNAクローンを単離するために、クレブスmR
NAの同じバッチを鋳型として用いて前記(実施例5)
のように構成した更に106のcDNAクローンを、p
LIF7.2b配列の5'末端の35残基および3'末端
の36残基の配列に対応する2つのオリゴヌクレオチド
(第10図における、ヌクレオチド67〜102および
500〜535)をプローブとして用いて(前記のよう
に)スクリーニングした。
するcDNAクローンを単離するために、クレブスmR
NAの同じバッチを鋳型として用いて前記(実施例5)
のように構成した更に106のcDNAクローンを、p
LIF7.2b配列の5'末端の35残基および3'末端
の36残基の配列に対応する2つのオリゴヌクレオチド
(第10図における、ヌクレオチド67〜102および
500〜535)をプローブとして用いて(前記のよう
に)スクリーニングした。
【0078】複製フィルター上で陽性のクローンλLI
FNK2およびλLIFNK3を表す2つのプラークを
採り、前記のように低密度でスクリーニングした。λL
IFNK3は、用いた2種のオリゴヌクレオチドの各々
と共にハイブリッド形成することが示されたので、これ
を更に分析した。
FNK2およびλLIFNK3を表す2つのプラークを
採り、前記のように低密度でスクリーニングした。λL
IFNK3は、用いた2種のオリゴヌクレオチドの各々
と共にハイブリッド形成することが示されたので、これ
を更に分析した。
【0079】λLIFNK3中の約1400bpのcD
NAインサートを、プラスミドベクターpEMBL8+
(デンテら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、1
1:1645〜1655、1983)中にサブクローニ
ングして、クローンpLIFNK3を生成した。pLI
FNK3のcDNAインサートのヌクレオチド配列分析
は、(前記)pLIF7.2bおよびpLIFNK1の
場合と同様に行った。
NAインサートを、プラスミドベクターpEMBL8+
(デンテら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、1
1:1645〜1655、1983)中にサブクローニ
ングして、クローンpLIFNK3を生成した。pLI
FNK3のcDNAインサートのヌクレオチド配列分析
は、(前記)pLIF7.2bおよびpLIFNK1の
場合と同様に行った。
【0080】pLIFNK3のcDNAインサートのヌ
クレオチド配列を第15図に示し、pLIFNK3は完
全なLIFコード化領域を含むことを示す:pLIFN
K3配列中の23〜25の位置に開始コドン(AUG)
があり、次いで、24個のアミノ酸残基の疎水性リーダ
配列をコード化する配列がある。コード化領域は、pL
IFNK1によって予め決定されたものと同じ翻訳終止
コドン(前記)に至る。
クレオチド配列を第15図に示し、pLIFNK3は完
全なLIFコード化領域を含むことを示す:pLIFN
K3配列中の23〜25の位置に開始コドン(AUG)
があり、次いで、24個のアミノ酸残基の疎水性リーダ
配列をコード化する配列がある。コード化領域は、pL
IFNK1によって予め決定されたものと同じ翻訳終止
コドン(前記)に至る。
【0081】工程2:LIFコード化領域の、哺乳動物
発現ベクターへの導入 最初に選択した哺乳動物発現ベクターは、レトロウイル
ス発現ベクターpMP−Zenであった。このベクター
は、モロニーマウス白血病ウイルス系ベクターpZIP
NeoSV(X)から、XhoI発現部位を残して、近
傍のSV40およびプラスミド配列と共にneoR遺伝
子を削除することにより誘導した。ベクターの3'領域
も修飾して、骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)のL
TR由来のエンハンサーを組み込んだ[ボウテル(Bowt
el,D.D.L.)ら、モレキュラー・バイオロジー・アンド
・メディシン(Mol.Biol.Med.)、4:229〜25
0、1987]。第1に、LIF/PMP−Zen組換
体は、ψ2細胞を通ってヘルパー-フリー感染性レトロ
ウイルス粒子中に入れられるので、このベクターを選択
した[マン(Mann,R.)ら、セル(Cell)、33:15
3〜159、1983]。このようなウイルス粒子は、
次いで、LIF/pMP−Zen組換体を種々のマウス
細胞に(感染により)有効に導入するために使用される
[マンら、セル、33:153〜159、1983]。
第2に、外来のコード化領域の発現のためのMPSV
LTRを有するこのベクターは、GM−CSFを含む特
定の他の造血増殖および分化因子の有効な発現を起こす
ことがわかっている。
発現ベクターへの導入 最初に選択した哺乳動物発現ベクターは、レトロウイル
ス発現ベクターpMP−Zenであった。このベクター
は、モロニーマウス白血病ウイルス系ベクターpZIP
NeoSV(X)から、XhoI発現部位を残して、近
傍のSV40およびプラスミド配列と共にneoR遺伝
子を削除することにより誘導した。ベクターの3'領域
も修飾して、骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)のL
TR由来のエンハンサーを組み込んだ[ボウテル(Bowt
el,D.D.L.)ら、モレキュラー・バイオロジー・アンド
・メディシン(Mol.Biol.Med.)、4:229〜25
0、1987]。第1に、LIF/PMP−Zen組換
体は、ψ2細胞を通ってヘルパー-フリー感染性レトロ
ウイルス粒子中に入れられるので、このベクターを選択
した[マン(Mann,R.)ら、セル(Cell)、33:15
3〜159、1983]。このようなウイルス粒子は、
次いで、LIF/pMP−Zen組換体を種々のマウス
細胞に(感染により)有効に導入するために使用される
[マンら、セル、33:153〜159、1983]。
第2に、外来のコード化領域の発現のためのMPSV
LTRを有するこのベクターは、GM−CSFを含む特
定の他の造血増殖および分化因子の有効な発現を起こす
ことがわかっている。
【0082】pMP−Zenへの挿入のために選択した
pLIFNK3のセグメントは、位置1(EcoRI部
位)から位置630(終止コドンにかかるXba1部
位)に至る−第15図参照。このセグメントは、プレ−
LIFのコード化領域以外はあまり含有せず、mRNA
の不安定性をもたらす配列を有し得る3'非翻訳領域の
すべてを有していないので選択した[例えば、シャウ
(Shaw,G.)およびカメン(Kamen,R.)、セル、4
6:659〜667、1986;ヴェルマ(Verma,I.
M.)およびサッソン−コルシ(Sassone-Corsi,P.)、
セル、51:513〜514、1987]。このフラグ
メントをpMP−Zenに挿入するために、標準的な方
法(マニアティスら、1982、前掲書)によって、p
IC20H[マーシュ(Marsh,J.L.)ら、ジーン、3
2:481〜485、1984]のEcoRIおよびX
baI部位の間にまず挿入した。次いで、このcDNA
インサートを、pIC20Hプラスミドのポリリンカー
から、SalIおよびXhoI分解により回収することに
よって、pMP−ZenのXhoIクローニング部位に
挿入するのに適当な結合端を有するLIFcDNAを生
成した。このLIFcDNAフラグメントのpMP−Z
enへの挿入は、標準的な方法(マニアティスら、19
82、前掲書)によって行った。
pLIFNK3のセグメントは、位置1(EcoRI部
位)から位置630(終止コドンにかかるXba1部
位)に至る−第15図参照。このセグメントは、プレ−
LIFのコード化領域以外はあまり含有せず、mRNA
の不安定性をもたらす配列を有し得る3'非翻訳領域の
すべてを有していないので選択した[例えば、シャウ
(Shaw,G.)およびカメン(Kamen,R.)、セル、4
6:659〜667、1986;ヴェルマ(Verma,I.
M.)およびサッソン−コルシ(Sassone-Corsi,P.)、
セル、51:513〜514、1987]。このフラグ
メントをpMP−Zenに挿入するために、標準的な方
法(マニアティスら、1982、前掲書)によって、p
IC20H[マーシュ(Marsh,J.L.)ら、ジーン、3
2:481〜485、1984]のEcoRIおよびX
baI部位の間にまず挿入した。次いで、このcDNA
インサートを、pIC20Hプラスミドのポリリンカー
から、SalIおよびXhoI分解により回収することに
よって、pMP−ZenのXhoIクローニング部位に
挿入するのに適当な結合端を有するLIFcDNAを生
成した。このLIFcDNAフラグメントのpMP−Z
enへの挿入は、標準的な方法(マニアティスら、19
82、前掲書)によって行った。
【0083】工程3:pMP−Zen/LIF組換体
の、マウス繊維芽球への導入 pMP−Zen/LIF DNAを、ψ2繊維芽球にエ
レクトロポレーションによって導入した[ポッター(Po
tter)ら(PNAS)、81:7161〜7165、198
4]。pMP−Zen/LIF DNA30μgおよび
pSV2NeoDNA[サザン(Southern,P.J.)およ
びバーグ(Berg,P.)、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・アンド・アプライド・ジェネティクス(J. Mol. Ap
p. Genet.)、1:327〜341、1982]3μg
を、DME/10%FCS(10%ウシ胎児血清を含有
するダルベッコ改良イーグル培地)1ml中の1×10
6個のψ2繊維芽球と混合し、キャパシタンス25μF
で500vの電流をかけた[バイオラド・ジーン・パル
サー(BioRad Gene-Pulser)モデルNo.165207
8を使用]。形質転換体は、まず、pSV2Neo D
NAの抗生物質G418に対する耐性に基づいて選択し
た。G418耐性ψ2細胞は、標準的な方法(マンら、
セル、33:153〜159、1983)によって、4
00μg/mlで選択した。試験した19個のG418
耐性クローンのうちの2個は、pMP−Zen/LIF
構造をも有しており、これは、ψ2ならし培地中におい
て検出し得るLIF活性によって評価された。
の、マウス繊維芽球への導入 pMP−Zen/LIF DNAを、ψ2繊維芽球にエ
レクトロポレーションによって導入した[ポッター(Po
tter)ら(PNAS)、81:7161〜7165、198
4]。pMP−Zen/LIF DNA30μgおよび
pSV2NeoDNA[サザン(Southern,P.J.)およ
びバーグ(Berg,P.)、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・アンド・アプライド・ジェネティクス(J. Mol. Ap
p. Genet.)、1:327〜341、1982]3μg
を、DME/10%FCS(10%ウシ胎児血清を含有
するダルベッコ改良イーグル培地)1ml中の1×10
6個のψ2繊維芽球と混合し、キャパシタンス25μF
で500vの電流をかけた[バイオラド・ジーン・パル
サー(BioRad Gene-Pulser)モデルNo.165207
8を使用]。形質転換体は、まず、pSV2Neo D
NAの抗生物質G418に対する耐性に基づいて選択し
た。G418耐性ψ2細胞は、標準的な方法(マンら、
セル、33:153〜159、1983)によって、4
00μg/mlで選択した。試験した19個のG418
耐性クローンのうちの2個は、pMP−Zen/LIF
構造をも有しており、これは、ψ2ならし培地中におい
て検出し得るLIF活性によって評価された。
【0084】工程4:ψ2誘導LIFの生物学的性質の
決定 pMP−Zen/LIF含有ψ2細胞のならし培地の分
化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイを、前記の
ように行った。DME/10%FCS3ml中の106
個のψ2細胞の培養からの培地の分化誘導活性をアッセ
イした。2つの陽性の培養の結果を次の表に示す: M1分化誘導活性クローン番号 (ユニット/106細胞/ml C.M.) ψ2−対照 検出せず ψ2−11a >16,000 ψ2−11d >16,000 このように、この発現系において、生物学的に活性な組
換マウスLIFの有意のレベルが達成できた。
決定 pMP−Zen/LIF含有ψ2細胞のならし培地の分
化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイを、前記の
ように行った。DME/10%FCS3ml中の106
個のψ2細胞の培養からの培地の分化誘導活性をアッセ
イした。2つの陽性の培養の結果を次の表に示す: M1分化誘導活性クローン番号 (ユニット/106細胞/ml C.M.) ψ2−対照 検出せず ψ2−11a >16,000 ψ2−11d >16,000 このように、この発現系において、生物学的に活性な組
換マウスLIFの有意のレベルが達成できた。
【0085】工程5:ψ2細胞から造血細胞へのpMP
−Zen/LIFレトロウイルスの伝播 感染性pMP−Zen/LIFレトロウイルスは、共培
養により、親ψ2細胞系から系FDC−P1の造血細胞
[デクスター(Dexter,T.M.)ら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン(J.Exp.Med.)、1
52:1036〜1047、1980]に移ることがで
きた。FDC−P1細胞の増殖のための最適濃度のWE
HI−3BD-ならし培地を含有するDME/10%F
CS10ml中で、106個のψ2細胞を、106個のF
DC−P1細胞と混合した。2日間インキュベートした
後、非付着FDC−P1細胞を除去し、すべての付着ψ
2細胞を洗い落とし、同じ培地3ml中で16時間増殖
させた。ならし培地を採り、前記のように分化誘導およ
び白血病抑制活性のアッセイに付した。結果を次の表に
示す。 FD培養を誘導した M1分化誘導活性クローンの番号 (ユニット/106FDC−P1細胞) ψ2−対照 検出せず ψ2−11a 約3,000 ψ2−11d 約1,500
−Zen/LIFレトロウイルスの伝播 感染性pMP−Zen/LIFレトロウイルスは、共培
養により、親ψ2細胞系から系FDC−P1の造血細胞
[デクスター(Dexter,T.M.)ら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン(J.Exp.Med.)、1
52:1036〜1047、1980]に移ることがで
きた。FDC−P1細胞の増殖のための最適濃度のWE
HI−3BD-ならし培地を含有するDME/10%F
CS10ml中で、106個のψ2細胞を、106個のF
DC−P1細胞と混合した。2日間インキュベートした
後、非付着FDC−P1細胞を除去し、すべての付着ψ
2細胞を洗い落とし、同じ培地3ml中で16時間増殖
させた。ならし培地を採り、前記のように分化誘導およ
び白血病抑制活性のアッセイに付した。結果を次の表に
示す。 FD培養を誘導した M1分化誘導活性クローンの番号 (ユニット/106FDC−P1細胞) ψ2−対照 検出せず ψ2−11a 約3,000 ψ2−11d 約1,500
【0086】このように、ψ2クローンであるψ2−1
1aおよびψ2−11dは、生物学的活性pMP−Ze
n/LIFレトロウイルスを造血細胞に透過させること
ができる。従って、これらのクローンは、Zen/GM
−CSFウイルス感染のために使用したものと同様に、
正常マウス造血に対する天然LIF高レベル発現の効果
の研究のために、照射マウスの造血系を再構成するのに
使用し得る正常マウス造血前駆細胞の感染に適用可能で
ある。
1aおよびψ2−11dは、生物学的活性pMP−Ze
n/LIFレトロウイルスを造血細胞に透過させること
ができる。従って、これらのクローンは、Zen/GM
−CSFウイルス感染のために使用したものと同様に、
正常マウス造血に対する天然LIF高レベル発現の効果
の研究のために、照射マウスの造血系を再構成するのに
使用し得る正常マウス造血前駆細胞の感染に適用可能で
ある。
【0087】実施例7 以下に、大腸菌細胞における組換マウスLIFの発現の
ための工程を説明する。第16図は、以下に記載する方
法の工程1に関する:グルタチオンS−トランスフェラ
ーゼ/トロンビン切断部位/LIF接合部におけるヌク
レオチド配列、その接合部におけるコード化された融合
タンパク質の配列。3者融合タンパク質の、グルタチオ
ンS−トランスフェラーゼのC−末端、トロンビン切断
部位およびマウスLIF部分のN−末端を、このアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列と共に示す。ト
ロンビンによって切断されると考えられる部位を矢印で
示す。
ための工程を説明する。第16図は、以下に記載する方
法の工程1に関する:グルタチオンS−トランスフェラ
ーゼ/トロンビン切断部位/LIF接合部におけるヌク
レオチド配列、その接合部におけるコード化された融合
タンパク質の配列。3者融合タンパク質の、グルタチオ
ンS−トランスフェラーゼのC−末端、トロンビン切断
部位およびマウスLIF部分のN−末端を、このアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列と共に示す。ト
ロンビンによって切断されると考えられる部位を矢印で
示す。
【0088】工程1:LIFコード化領域の大腸菌発現
ベクターへの導入 大腸菌におけるLIF発現に用いた発現ベクターは、S
j26(寄生蠕虫日本住血吸虫によってコード化された
25kDグルタチオンS−トランスフェラーゼ(E.C.2.
5.1.18))のC−末端との融合として外来ペプチドを合
成するための、pGEX−2Tであった(スミスおよび
ジョンソン、ジーン、1988)。多くの場合、融合タ
ンパク質は、水溶液に可溶であり、非変性条件下に固定
化グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーによっ
て粗溶菌液から生成し得ることがわかっている。このベ
クターpGEX−2Tは、部位特異性プロテアーゼであ
るトロンビンによる分解によってグルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼキャリヤーが融合タンパク質から切断さ
れ得るように設計されている。
ベクターへの導入 大腸菌におけるLIF発現に用いた発現ベクターは、S
j26(寄生蠕虫日本住血吸虫によってコード化された
25kDグルタチオンS−トランスフェラーゼ(E.C.2.
5.1.18))のC−末端との融合として外来ペプチドを合
成するための、pGEX−2Tであった(スミスおよび
ジョンソン、ジーン、1988)。多くの場合、融合タ
ンパク質は、水溶液に可溶であり、非変性条件下に固定
化グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーによっ
て粗溶菌液から生成し得ることがわかっている。このベ
クターpGEX−2Tは、部位特異性プロテアーゼであ
るトロンビンによる分解によってグルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼキャリヤーが融合タンパク質から切断さ
れ得るように設計されている。
【0089】プラスミドpLIFmut2から誘導される
マウスLIFの完全なコード化領域(前記実施例5およ
び第12図参照)は、BamHI−EcoRIフラグメン
トとしてpGEX−2Tの多重クローニング部位に導入
し、グルタチオンS−トランスフェラーゼおよびトロン
ビン切断部位と同じ翻訳リーディングフレームのLIF
コード化領域3'を配置した。このように、グルタチオ
ンS−トランスフェラーゼ/トロンビン切断部位/LI
Fの3者融合タンパク質において、LIFタンパク質の
C−末端をこれらの要素に配置した(第16図参照)。
トロンビン切断部位の位置は、トロンビン切断の後に2
個のアミノ酸(Gly−Ser)がLIFタンパク質の
N−末端に付属するような位置である。前記プラスミド
の構成pGEX−2T/LIFは、標準的な方法によっ
て行い、標準的な方法によってプラスミドを大腸菌NM
522に導入した(ゴーおよびマーレイ、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、166:(I)〜1
9、1983)。
マウスLIFの完全なコード化領域(前記実施例5およ
び第12図参照)は、BamHI−EcoRIフラグメン
トとしてpGEX−2Tの多重クローニング部位に導入
し、グルタチオンS−トランスフェラーゼおよびトロン
ビン切断部位と同じ翻訳リーディングフレームのLIF
コード化領域3'を配置した。このように、グルタチオ
ンS−トランスフェラーゼ/トロンビン切断部位/LI
Fの3者融合タンパク質において、LIFタンパク質の
C−末端をこれらの要素に配置した(第16図参照)。
トロンビン切断部位の位置は、トロンビン切断の後に2
個のアミノ酸(Gly−Ser)がLIFタンパク質の
N−末端に付属するような位置である。前記プラスミド
の構成pGEX−2T/LIFは、標準的な方法によっ
て行い、標準的な方法によってプラスミドを大腸菌NM
522に導入した(ゴーおよびマーレイ、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、166:(I)〜1
9、1983)。
【0090】工程2:グルタチオンS−トランスフェラ
ーゼ/LIF融合タンパク質の発現および精製 グルタチオンS−トランスフェラーゼ/LIF融合タン
パク質の発現を誘導するために、pGEX−2T/LI
F含有大腸菌NM522細胞の培養10mlをルリアブ
イヨン中で対数増殖させ、イソプロピルβ−D−チオガ
ラクトピラノシドを0.1mMの濃度に加えた。更に4
時間増殖(その間にグルタチオンS−トランスフェラー
ゼ/LIF遺伝子が発現する)後、遠心によって細胞を
採り、マウスリン酸緩衝生理食塩液(MTPBS:15
0mM NaCl、16mM Na2HPO4、4mM N
aH2PO4、pH7.3)1mlに再懸濁させた。氷上
で穏やかに超音波処理することによって細胞を溶解し、
トリトン(Triton)X−100を1%に添加した後、遠
心(10,000g、5分間、4℃)により細胞屑を除
去した。透明となった上澄を、室温で回転プラットフォ
ーム上の50mlポリプロピレンチューブ内で、50%
グルタチオン、アガロースビーズ[イオウ結合、シグマ
(Sigma)]200μlと混合した。(使用前に、ビー
ズをMTPBSに予備浸漬し、同じ緩衝液で2回洗浄
し、50%溶液v/vとしてMTPBS中で4℃で貯蔵
した。)吸収(5分間)後、ビーズを遠心(500g、
1分間)によって集め、MTPBS/トリトンX−10
0で3回洗浄した。次いで、グルタチオンS−トランス
フェラーゼ/LIF融合タンパク質を、遊離グルタチオ
ンとの競合によって溶出した:ビーズは、100μlの
50mMトリスHCl、5mM還元グルタチオン(pH
7.5)と共に、室温で2分間インキュベートし、遠心
によってビーズを除去した。溶出工程は2回行い、10
0μlずつの2つの溶出物をプールした。
ーゼ/LIF融合タンパク質の発現および精製 グルタチオンS−トランスフェラーゼ/LIF融合タン
パク質の発現を誘導するために、pGEX−2T/LI
F含有大腸菌NM522細胞の培養10mlをルリアブ
イヨン中で対数増殖させ、イソプロピルβ−D−チオガ
ラクトピラノシドを0.1mMの濃度に加えた。更に4
時間増殖(その間にグルタチオンS−トランスフェラー
ゼ/LIF遺伝子が発現する)後、遠心によって細胞を
採り、マウスリン酸緩衝生理食塩液(MTPBS:15
0mM NaCl、16mM Na2HPO4、4mM N
aH2PO4、pH7.3)1mlに再懸濁させた。氷上
で穏やかに超音波処理することによって細胞を溶解し、
トリトン(Triton)X−100を1%に添加した後、遠
心(10,000g、5分間、4℃)により細胞屑を除
去した。透明となった上澄を、室温で回転プラットフォ
ーム上の50mlポリプロピレンチューブ内で、50%
グルタチオン、アガロースビーズ[イオウ結合、シグマ
(Sigma)]200μlと混合した。(使用前に、ビー
ズをMTPBSに予備浸漬し、同じ緩衝液で2回洗浄
し、50%溶液v/vとしてMTPBS中で4℃で貯蔵
した。)吸収(5分間)後、ビーズを遠心(500g、
1分間)によって集め、MTPBS/トリトンX−10
0で3回洗浄した。次いで、グルタチオンS−トランス
フェラーゼ/LIF融合タンパク質を、遊離グルタチオ
ンとの競合によって溶出した:ビーズは、100μlの
50mMトリスHCl、5mM還元グルタチオン(pH
7.5)と共に、室温で2分間インキュベートし、遠心
によってビーズを除去した。溶出工程は2回行い、10
0μlずつの2つの溶出物をプールした。
【0091】グルタチオンS−トランスフェラーゼ/L
IF融合タンパク質100μlをトロンビンで処理した
(スミスおよびジョンソン、前掲書)。非切断およびト
ロンビン切断グルタチオンS−トランスフェラーゼLI
F融合タンパク質1μlを、ファルマシア・ファスト・
ゲル(Pharmacia Phast Gel)(8〜25%ポリアクリ
ルアミド勾配ゲル)上で電気泳動した。クーマシー・ブ
ルーで染色後、非切断試料においては、相対分子量〜4
6kDaの単一の主要なタンパク質種があらわれ、トロ
ンビン切断試料においては、〜26kDaおよび〜20
kDaの2つの主要なバンドが現れた[それぞれ、融合
タンパク質(46kDa)、グルタチオンS−トランス
フェラーゼ(26kDa)およびLIFタンパク質(2
0kDa)の推定されるサイズに相当する]。このゲル
上のクーマシー染色バンドの分子量の計算によって、元
の10mlの大腸菌培養からのグルタチオンS−トラン
スフェラーゼ/LIFタンパク質の収量は、〜1.5μ
gであったことがわかった。
IF融合タンパク質100μlをトロンビンで処理した
(スミスおよびジョンソン、前掲書)。非切断およびト
ロンビン切断グルタチオンS−トランスフェラーゼLI
F融合タンパク質1μlを、ファルマシア・ファスト・
ゲル(Pharmacia Phast Gel)(8〜25%ポリアクリ
ルアミド勾配ゲル)上で電気泳動した。クーマシー・ブ
ルーで染色後、非切断試料においては、相対分子量〜4
6kDaの単一の主要なタンパク質種があらわれ、トロ
ンビン切断試料においては、〜26kDaおよび〜20
kDaの2つの主要なバンドが現れた[それぞれ、融合
タンパク質(46kDa)、グルタチオンS−トランス
フェラーゼ(26kDa)およびLIFタンパク質(2
0kDa)の推定されるサイズに相当する]。このゲル
上のクーマシー染色バンドの分子量の計算によって、元
の10mlの大腸菌培養からのグルタチオンS−トラン
スフェラーゼ/LIFタンパク質の収量は、〜1.5μ
gであったことがわかった。
【0092】グルタチオンS−トランスフェラーゼ/L
IF融合タンパク質およびトロンビン切断LIF試料の
分化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイは、マウ
スM1細胞を用いて(前記のように)行った。いずれの
LIF試料も、生物学的に活性であり、非活性は7×1
06ユニット/mgを越えることがわかった。
IF融合タンパク質およびトロンビン切断LIF試料の
分化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイは、マウ
スM1細胞を用いて(前記のように)行った。いずれの
LIF試料も、生物学的に活性であり、非活性は7×1
06ユニット/mgを越えることがわかった。
【0093】実施例8 マウスゲノムが、クローンpLIF7.2b中に存在す
る配列をコード化する遺伝子(実施例4)に関連した他
の遺伝子を含有するかどうかを決定するための工程、お
よびLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の
位置のマップの確定を以下に説明する。図面は、以下に
記載する方法の種々の工程に関する:第17図 :工程1に関する:高および低ストリンジェン
シー条件下におけるマウスDNAのpLIF7.2b誘
導プローブとのハイブリッド形成。所定の制限酵素で分
解したBALB/c肝DNAについて、実施例8の工程
1に記載するようにLIF遺伝子配列を調べた。左図に
おいて、2×SSC中で65℃でハイブリッド形成を行
い、最終洗浄は0.2×SSC中で65℃で行った。右
図においては、ハイブリッド形成および洗浄はいずれも
6×SSC中で65℃で行った。左図において、線状p
LIF7.2bプラスミドDNA(5.6kb)は、単相
マウスゲノムの分子量を3×109bpとして単相マウ
スゲノム当たり10および1コピーに相当する量(それ
ぞれ400pgおよび40pg)で用いた[レアード
(Laired,C.D.)、クロモソーマ(Chromosoma)、3
2:378〜406、1971]。ハイブリッド形成ゲ
ノムフラグメントのサイズを示す。
る配列をコード化する遺伝子(実施例4)に関連した他
の遺伝子を含有するかどうかを決定するための工程、お
よびLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の
位置のマップの確定を以下に説明する。図面は、以下に
記載する方法の種々の工程に関する:第17図 :工程1に関する:高および低ストリンジェン
シー条件下におけるマウスDNAのpLIF7.2b誘
導プローブとのハイブリッド形成。所定の制限酵素で分
解したBALB/c肝DNAについて、実施例8の工程
1に記載するようにLIF遺伝子配列を調べた。左図に
おいて、2×SSC中で65℃でハイブリッド形成を行
い、最終洗浄は0.2×SSC中で65℃で行った。右
図においては、ハイブリッド形成および洗浄はいずれも
6×SSC中で65℃で行った。左図において、線状p
LIF7.2bプラスミドDNA(5.6kb)は、単相
マウスゲノムの分子量を3×109bpとして単相マウ
スゲノム当たり10および1コピーに相当する量(それ
ぞれ400pgおよび40pg)で用いた[レアード
(Laired,C.D.)、クロモソーマ(Chromosoma)、3
2:378〜406、1971]。ハイブリッド形成ゲ
ノムフラグメントのサイズを示す。
【0094】第18図:工程2に関する:種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分解した、1本鎖および2本鎖のマ
ウスDNAと、マウスLIFプローブとのハイブリッド
形成。分解したDNAは、0.8%アガロースゲル上で
電気泳動し、実施例8の工程1に記載のように、高スト
リンジェンシー条件下にpLIF7.2bcDNAフラ
グメントとハイブリッド形成させた。
ンドヌクレアーゼで分解した、1本鎖および2本鎖のマ
ウスDNAと、マウスLIFプローブとのハイブリッド
形成。分解したDNAは、0.8%アガロースゲル上で
電気泳動し、実施例8の工程1に記載のように、高スト
リンジェンシー条件下にpLIF7.2bcDNAフラ
グメントとハイブリッド形成させた。
【0095】第19図:工程2に関する:マウスLIF
遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ。cDNA
クローンpLIF7.2bに対応する配列を含有する染
色体DNAの領域をボックスで示す。中心線の上部(E
coR5)および下部(XbaI、BamHI、PstI
およびStuI)に示された制限部位は、中心線上に配
置できなかった。線の下部の複合群の部位の相対配置は
図に示す通りである。
遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ。cDNA
クローンpLIF7.2bに対応する配列を含有する染
色体DNAの領域をボックスで示す。中心線の上部(E
coR5)および下部(XbaI、BamHI、PstI
およびStuI)に示された制限部位は、中心線上に配
置できなかった。線の下部の複合群の部位の相対配置は
図に示す通りである。
【0096】第20図:工程3に関する:マウスLIF
遺伝子の染色体配置。レーン1においては、BALB/
cマウス胚DNAを電気泳動し、レーン2においては、
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞DNAを電気泳動
し、レーン3〜8においては、ハイブリッドクローンI
−18A HAT、I−18A−2a−8AG;EBS
58;EBS11;EBS4;およびI−13A−1a
−8AGのDNAを電気泳動した[コリー(Cory,S.)
ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガニゼーション・ジャーナル、2:213〜216、1
983]。これらのハイブリッドのマウス染色体内容
は、コリーら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、2:213〜
216、1983に記載されている。すべてのDNA
は、BamHIで分解される。マウスLIF遺伝子を有
する3kb BamHIフラグメントの位置を示す。
遺伝子の染色体配置。レーン1においては、BALB/
cマウス胚DNAを電気泳動し、レーン2においては、
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞DNAを電気泳動
し、レーン3〜8においては、ハイブリッドクローンI
−18A HAT、I−18A−2a−8AG;EBS
58;EBS11;EBS4;およびI−13A−1a
−8AGのDNAを電気泳動した[コリー(Cory,S.)
ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガニゼーション・ジャーナル、2:213〜216、1
983]。これらのハイブリッドのマウス染色体内容
は、コリーら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、2:213〜
216、1983に記載されている。すべてのDNA
は、BamHIで分解される。マウスLIF遺伝子を有
する3kb BamHIフラグメントの位置を示す。
【0097】工程1:マウスゲノム中のLIF関連遺伝
子の数の決定 クレブスII細胞のならし培地が、M1細胞の分化を誘導
し得る、2つの生化学的に異なるが、機能的には同様の
因子(LIF−AおよびLIF−B)を含有するという
データ(実施例1)に基づいて、我々は、精製およびク
ローン化した種に関連するマウスゲノム中に何個の遺伝
子があるかを決定しようとした。種々の制限エンドヌク
レアーゼによって切断したマウスゲノムDNAのサザン
ブロットを、高および低ストリンジェンシーの条件下
に、pLIF7.2bから誘導したプローブと共にハイ
ブリッド形成した。
子の数の決定 クレブスII細胞のならし培地が、M1細胞の分化を誘導
し得る、2つの生化学的に異なるが、機能的には同様の
因子(LIF−AおよびLIF−B)を含有するという
データ(実施例1)に基づいて、我々は、精製およびク
ローン化した種に関連するマウスゲノム中に何個の遺伝
子があるかを決定しようとした。種々の制限エンドヌク
レアーゼによって切断したマウスゲノムDNAのサザン
ブロットを、高および低ストリンジェンシーの条件下
に、pLIF7.2bから誘導したプローブと共にハイ
ブリッド形成した。
【0098】BALB/cマウス肝臓からの高分子量ゲ
ノムDNA20μgを種々の制限エンドヌクレアーゼで
完全に分解し、0.8%アガロースゲル電気泳動により
分画し、ニトロセルロースに移した。ハイブリッド形成
の前に、6×SSC(低ストリンジェンシー)または2
×SSC(高ストリンジェンシー)(SSC=0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、0.
2%フィコル、0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%
ウシ血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1
mM ATP、50μg/ml変性サケ***DNAおよ
び50μg/ml大腸菌tRNA中で、フィルターを6
5℃で数時間インキュベートした。ハイブリッド形成
は、0.1%SDSを含有する同じ溶液中で、65℃で
16〜18時間行った。次いで、第17図に詳細に示す
ように、6×SSC、0.1%SDS中で65℃におい
て(低ストリンジェンシー)、または2×SSC、0.
1%SDS中で65℃において、次いで0.2×SSC
により65℃で(高ストリンジェンシー)フィルターを
洗浄した。使用したハイブリッド形成プローブは、前記
のように、ニックトランスレーションにより比活性約4
×108cpm/μgに放射性ラベルしたpLIF7.2
bのcDNAインサートの約750bpのEcoRI−
HindIIIフラグメントであり、約2×107cpm/
mlの濃度でハイブリッド形成に使用した。
ノムDNA20μgを種々の制限エンドヌクレアーゼで
完全に分解し、0.8%アガロースゲル電気泳動により
分画し、ニトロセルロースに移した。ハイブリッド形成
の前に、6×SSC(低ストリンジェンシー)または2
×SSC(高ストリンジェンシー)(SSC=0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、0.
2%フィコル、0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%
ウシ血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1
mM ATP、50μg/ml変性サケ***DNAおよ
び50μg/ml大腸菌tRNA中で、フィルターを6
5℃で数時間インキュベートした。ハイブリッド形成
は、0.1%SDSを含有する同じ溶液中で、65℃で
16〜18時間行った。次いで、第17図に詳細に示す
ように、6×SSC、0.1%SDS中で65℃におい
て(低ストリンジェンシー)、または2×SSC、0.
1%SDS中で65℃において、次いで0.2×SSC
により65℃で(高ストリンジェンシー)フィルターを
洗浄した。使用したハイブリッド形成プローブは、前記
のように、ニックトランスレーションにより比活性約4
×108cpm/μgに放射性ラベルしたpLIF7.2
bのcDNAインサートの約750bpのEcoRI−
HindIIIフラグメントであり、約2×107cpm/
mlの濃度でハイブリッド形成に使用した。
【0099】マウス肝臓DNA(第17図)において
も、クレブスII細胞、LB3 T細胞およびWEHI2
65単核細胞由来のDNA(図示せず)においても、L
IFプローブは、それぞれ約11、3および13kbp
の独特のEcoRI、BamHIおよびHindIIIフラ
グメントを検出した。ハイブリッド形成の同じパターン
は、高ストリンジェンシー(0.2×SSC、65℃)
および低ストリンジェンシー(6×SSC、65℃)の
いずれにおいても明らかであった(第17図);低スト
リンジェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に
は、他の明らかなバントは無かった。同様に独特のハイ
ブリッド形成フラグメントは、PstI、StuI、Sa
cI、EcoR5およびBglII−切断ゲノムDNAに
おいても検出された(第17図)。更に、第16図に示
す実験においては、pLIF7.2bプラスミドDNA
は、単相マウスゲノム当たり10および1コピー当量の
濃度で含まれていた(トラック1および2);ゲノムL
IF配列のハイブリッド形成強度は、独特の遺伝子標準
強度と有意に異なってはいなかった(トラック2)。
も、クレブスII細胞、LB3 T細胞およびWEHI2
65単核細胞由来のDNA(図示せず)においても、L
IFプローブは、それぞれ約11、3および13kbp
の独特のEcoRI、BamHIおよびHindIIIフラ
グメントを検出した。ハイブリッド形成の同じパターン
は、高ストリンジェンシー(0.2×SSC、65℃)
および低ストリンジェンシー(6×SSC、65℃)の
いずれにおいても明らかであった(第17図);低スト
リンジェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に
は、他の明らかなバントは無かった。同様に独特のハイ
ブリッド形成フラグメントは、PstI、StuI、Sa
cI、EcoR5およびBglII−切断ゲノムDNAに
おいても検出された(第17図)。更に、第16図に示
す実験においては、pLIF7.2bプラスミドDNA
は、単相マウスゲノム当たり10および1コピー当量の
濃度で含まれていた(トラック1および2);ゲノムL
IF配列のハイブリッド形成強度は、独特の遺伝子標準
強度と有意に異なってはいなかった(トラック2)。
【0100】以上のデータより、マウスゲノム中でLI
F遺伝子は独特であり、類縁物は存在しないことがわか
る。すなわち、LIFの2つの種は、異なる遺伝子の産
物であるが、同じ遺伝子産物の転写後または翻訳後の変
種と考えられる。工程2 :マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ
切断マップの確定 マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
の位置を決定し、この遺伝子の分子フィンガープリント
を提供するために、マウス肝またはクレブス腹水癌細胞
のDNAを種々の制限エンドヌクレアーゼで分解し、工
程1に記載のようにサザン分析に付した(高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下)。このよ
うな実験の例を第18図に示す。この分解産物のサイズ
の分析により、LIF遺伝子の各切断部位の位置のマッ
プを作成することができる(第19図)。
F遺伝子は独特であり、類縁物は存在しないことがわか
る。すなわち、LIFの2つの種は、異なる遺伝子の産
物であるが、同じ遺伝子産物の転写後または翻訳後の変
種と考えられる。工程2 :マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ
切断マップの確定 マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
の位置を決定し、この遺伝子の分子フィンガープリント
を提供するために、マウス肝またはクレブス腹水癌細胞
のDNAを種々の制限エンドヌクレアーゼで分解し、工
程1に記載のようにサザン分析に付した(高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下)。このよ
うな実験の例を第18図に示す。この分解産物のサイズ
の分析により、LIF遺伝子の各切断部位の位置のマッ
プを作成することができる(第19図)。
【0101】工程3:マウスLIF遺伝子の染色体配置 マウスLIF遺伝子が位置している染色体を決定するた
めに、種々のマウス染色体を有する6つのマウス−チャ
イニーズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッド細胞系の
DNAを試験した[コリー(Cory,S.)ら、ヨーロピア
ン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション
・ジャーナル、2:213〜216、1983;フラン
ケ(Francke,U.)ら、サイトジェネティクス・アンド
・セル・ジェネティクス(Cytogenet.Cell.Gene
t.)、19:57〜84、1977]。(高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に)工程1
に記載のように行ったサザン分析により、マウスLIF
遺伝子を含む3kbp BamHIフラグメントは、すべ
てのハイブリッド存在しないことがわかった(第20
図)。染色体11は、これらの系(コリーら、ヨーロピ
アン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーショ
ン・ジャーナル、2:213〜216、1983)のい
ずれにも保持されていない唯一のマウス染色体であるの
で[マウス−チャイニーズ・ハムスターハイブリッドの
特性(フランケら、サイトジェネティクス・アンド・セ
ル・ジェネティクス、19:57〜84、197
7)]、LIF遺伝子がこの染色体上に存在すると考え
られる。同様に、マウスGM−CSF遺伝子[バーロウ
(Barlow,D.P.)ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バ
イオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、6:6
17〜623、1987]およびMulti−CSF遺伝子
[イーレ(Ihle,J.N.)およびコザック(Kozak,C.
A.)、ナショナル・カンサー・インスティテュート、フ
レデリック・カンサー・リサーチ・ファシリティ、アニ
ュアル・レポート(National Cancer Institute, Frede
rick Cancer Research Facility, Annual Report)、1
984]も染色体11に存在することが、遺伝子結合の
研究により確認されている(バーロウら、ヨーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・
ジャーナル、6:617〜623、1987)。
めに、種々のマウス染色体を有する6つのマウス−チャ
イニーズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッド細胞系の
DNAを試験した[コリー(Cory,S.)ら、ヨーロピア
ン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション
・ジャーナル、2:213〜216、1983;フラン
ケ(Francke,U.)ら、サイトジェネティクス・アンド
・セル・ジェネティクス(Cytogenet.Cell.Gene
t.)、19:57〜84、1977]。(高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に)工程1
に記載のように行ったサザン分析により、マウスLIF
遺伝子を含む3kbp BamHIフラグメントは、すべ
てのハイブリッド存在しないことがわかった(第20
図)。染色体11は、これらの系(コリーら、ヨーロピ
アン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーショ
ン・ジャーナル、2:213〜216、1983)のい
ずれにも保持されていない唯一のマウス染色体であるの
で[マウス−チャイニーズ・ハムスターハイブリッドの
特性(フランケら、サイトジェネティクス・アンド・セ
ル・ジェネティクス、19:57〜84、197
7)]、LIF遺伝子がこの染色体上に存在すると考え
られる。同様に、マウスGM−CSF遺伝子[バーロウ
(Barlow,D.P.)ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バ
イオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、6:6
17〜623、1987]およびMulti−CSF遺伝子
[イーレ(Ihle,J.N.)およびコザック(Kozak,C.
A.)、ナショナル・カンサー・インスティテュート、フ
レデリック・カンサー・リサーチ・ファシリティ、アニ
ュアル・レポート(National Cancer Institute, Frede
rick Cancer Research Facility, Annual Report)、1
984]も染色体11に存在することが、遺伝子結合の
研究により確認されている(バーロウら、ヨーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・
ジャーナル、6:617〜623、1987)。
【0102】実施例9 本実施例は、クローンマウスLIFcDNAを、ヒト遺
伝子もしくはmRNAまたはヒトLIFコード化配列含
有DNAクローンのハイブリッド形成による同定のため
に使用することのできる条件を確立する工程を説明す
る。第21図は、以下に記載する方法の工程2に関す
る:マウスおよびヒト由来のゲノムDNAに対する種々
の条件下におけるクローンpLIF7.2bのcDNA
の32P−ラベルフラグメントのハイブリッド形成。各場
合において、トラック1はマウス(LB3)DNA15
μgを含有し、トラック2および3はヒトDNA[それ
ぞれ細胞系ラジ(Raji)またはラモス(Ramos)由来]
15μgを含有する。各フィルターに適用されたハイブ
リッド形成および洗浄条件は、工程2に記載する。マウ
スLIF遺伝子を含有する約10kbpのEcoRIフ
ラグメントおよびヒトLIF遺伝子を含有する約9kb
pのEcoRIフラグメントを矢印で示す。分子量標準
を左に示す。2つの異なるオートラジオグラフィー照射
を示す(16時間および62時間)。
伝子もしくはmRNAまたはヒトLIFコード化配列含
有DNAクローンのハイブリッド形成による同定のため
に使用することのできる条件を確立する工程を説明す
る。第21図は、以下に記載する方法の工程2に関す
る:マウスおよびヒト由来のゲノムDNAに対する種々
の条件下におけるクローンpLIF7.2bのcDNA
の32P−ラベルフラグメントのハイブリッド形成。各場
合において、トラック1はマウス(LB3)DNA15
μgを含有し、トラック2および3はヒトDNA[それ
ぞれ細胞系ラジ(Raji)またはラモス(Ramos)由来]
15μgを含有する。各フィルターに適用されたハイブ
リッド形成および洗浄条件は、工程2に記載する。マウ
スLIF遺伝子を含有する約10kbpのEcoRIフ
ラグメントおよびヒトLIF遺伝子を含有する約9kb
pのEcoRIフラグメントを矢印で示す。分子量標準
を左に示す。2つの異なるオートラジオグラフィー照射
を示す(16時間および62時間)。
【0103】工程1:pLIF7.2bのcDNAのフ
ラグメントの調製および放射性ラベル pLIF7.2bプラスミドDNAを大腸菌MC106
1中で増殖させ(カサダバンおよびコーヘン、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、138:17
9〜207、1980)、標準的な方法で大腸菌から抽
出し(マニアティスら、モレキュラー・クローニング、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、19
82)、CsCl勾配遠心によって精製した。このよう
に精製したpLIF7.2bプラスミドDNAを、制限
エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで切断
して、〜770bpのcDNA含有フラグメントをベク
ター(pJL3)から遊離させ、これを1.5%アガロ
ースゲル電気泳動によってベクター配列から分画した。
ラグメントの調製および放射性ラベル pLIF7.2bプラスミドDNAを大腸菌MC106
1中で増殖させ(カサダバンおよびコーヘン、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、138:17
9〜207、1980)、標準的な方法で大腸菌から抽
出し(マニアティスら、モレキュラー・クローニング、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、19
82)、CsCl勾配遠心によって精製した。このよう
に精製したpLIF7.2bプラスミドDNAを、制限
エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで切断
して、〜770bpのcDNA含有フラグメントをベク
ター(pJL3)から遊離させ、これを1.5%アガロ
ースゲル電気泳動によってベクター配列から分画した。
【0104】このように精製したpLIF7.2bcD
NAフラグメント200ngを、100μCi[α
32P]−dATP含有反応においてニックトランスレー
ションにより放射性ラベルして、比活性約3×108c
pm/μgとした[リグビー(Rigby,P.W.J.)、ディ
ックマン(Dieckmann,M.)、ローデス(Rhodes,C.)
およびバーグ(Berg,P.)、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、113:237〜251、19
77]。1M過塩素酸ナトリウムおよび33%イソプロ
パノールの存在下に沈澱することにより、放射性ラベル
したcDNAフラグメントを、取り込まれなかったラベ
ルから精製した。
NAフラグメント200ngを、100μCi[α
32P]−dATP含有反応においてニックトランスレー
ションにより放射性ラベルして、比活性約3×108c
pm/μgとした[リグビー(Rigby,P.W.J.)、ディ
ックマン(Dieckmann,M.)、ローデス(Rhodes,C.)
およびバーグ(Berg,P.)、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、113:237〜251、19
77]。1M過塩素酸ナトリウムおよび33%イソプロ
パノールの存在下に沈澱することにより、放射性ラベル
したcDNAフラグメントを、取り込まれなかったラベ
ルから精製した。
【0105】工程2:マウスおよびヒトゲノムDNAの
サザンブロットとpLIF7.2bcDNAプローブと
のハイブリッド形成 制限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断した、マウス
T細胞系LB3(レーン1)および2種のヒトB細胞系
(ラジおよびラモス;レーン2および3)由来の高分子
量ゲノムDNA(15μg)を、標準的な方法で0.8
%アガロースゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移し
た(サザン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、98:503〜517、1975)。これらの
3種のDNAのそれぞれを含有する5個の同じサザンブ
ロットを調製した。ハイブリッド形成前に、0.9M N
aCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.2%フィコ
ル、0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%ウシ血清ア
ルブミン、50μg/ml熱変性サケ***DNA、50
μg/ml大腸菌tRNA、0.1mM ATPおよび2
mMピロリン酸ナトリウム(フィルターa、b、c、
d)、または0.3MNaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム
および同じ他の成分(フィルターe)中で、55℃で数
時間フィルターをインキュベートした。工程1において
調製した32P−ラベルpLIF7.2bcDNAのハイ
ブリッド形成は、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを更
に含有する前ハイブリッド形成と同じ溶液中で、55℃
(フィルターa、b、c)または65℃(フィルター
d、e)で16時間行った。32P−ラベルcDNAは、
ハイブリッド形成前に沸騰によって変性し、〜107c
pm/mlでハイブリッド形成に使用した。
サザンブロットとpLIF7.2bcDNAプローブと
のハイブリッド形成 制限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断した、マウス
T細胞系LB3(レーン1)および2種のヒトB細胞系
(ラジおよびラモス;レーン2および3)由来の高分子
量ゲノムDNA(15μg)を、標準的な方法で0.8
%アガロースゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移し
た(サザン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、98:503〜517、1975)。これらの
3種のDNAのそれぞれを含有する5個の同じサザンブ
ロットを調製した。ハイブリッド形成前に、0.9M N
aCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.2%フィコ
ル、0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%ウシ血清ア
ルブミン、50μg/ml熱変性サケ***DNA、50
μg/ml大腸菌tRNA、0.1mM ATPおよび2
mMピロリン酸ナトリウム(フィルターa、b、c、
d)、または0.3MNaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム
および同じ他の成分(フィルターe)中で、55℃で数
時間フィルターをインキュベートした。工程1において
調製した32P−ラベルpLIF7.2bcDNAのハイ
ブリッド形成は、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを更
に含有する前ハイブリッド形成と同じ溶液中で、55℃
(フィルターa、b、c)または65℃(フィルター
d、e)で16時間行った。32P−ラベルcDNAは、
ハイブリッド形成前に沸騰によって変性し、〜107c
pm/mlでハイブリッド形成に使用した。
【0106】ハイブリッド形成後、0.9M NaCl、
0.09Mクエン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナ
トリウム中で55℃(フィルターa)、60℃(フィル
ターb)もしくは65℃(フィルターc、d)で、また
は0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム、
0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で65℃で(フィル
ターe)、フィルターを洗浄した。完全に洗浄後、コダ
ックXAE−5フィルムおよび2つの増幅スクリーンを
用いて−70℃でフィルターをオートラジオグラフィー
に付した。第21図は、このような実験の結果を示し、
2つのハイブリッド形成/洗浄条件(フィルターdおよ
びe)において、マウスLIF遺伝子(約10kbpの
EcoRIフラグメント上に存在)およびヒトLIF遺
伝子の両方(約9kbpのEcoRIフラグメント上に
存在)が、残留バックグラウンド非特異的ハイブリッド
形成の上に検出された。試験した他のすべての条件にお
いては、バックグラウンドハイブリッド形成のレベルが
高く、許容不可能であった(フィルターa、b、c)。
0.09Mクエン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナ
トリウム中で55℃(フィルターa)、60℃(フィル
ターb)もしくは65℃(フィルターc、d)で、また
は0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム、
0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で65℃で(フィル
ターe)、フィルターを洗浄した。完全に洗浄後、コダ
ックXAE−5フィルムおよび2つの増幅スクリーンを
用いて−70℃でフィルターをオートラジオグラフィー
に付した。第21図は、このような実験の結果を示し、
2つのハイブリッド形成/洗浄条件(フィルターdおよ
びe)において、マウスLIF遺伝子(約10kbpの
EcoRIフラグメント上に存在)およびヒトLIF遺
伝子の両方(約9kbpのEcoRIフラグメント上に
存在)が、残留バックグラウンド非特異的ハイブリッド
形成の上に検出された。試験した他のすべての条件にお
いては、バックグラウンドハイブリッド形成のレベルが
高く、許容不可能であった(フィルターa、b、c)。
【0107】参考例1 本実施例は、マウスLIF類似クローン化ヒト遺伝子を
得るための工程を説明する。図面は、以下に記載する方
法の種々の工程に関する。第22図 :ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程1に
関する:マウスLIFcDNAプローブを使用するサザ
ンブロットハイブリッド形成によるLIF遺伝子の検
出。ヒト細胞系RAMOSのゲノムDNAを、所定の制
限エンドヌクレアーゼで切断し、実施例19の工程1に
記載の条件下に、pLIF7.2bから誘導したマウス
cDNAフラグメントとハイブリッド形成させた。
得るための工程を説明する。図面は、以下に記載する方
法の種々の工程に関する。第22図 :ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程1に
関する:マウスLIFcDNAプローブを使用するサザ
ンブロットハイブリッド形成によるLIF遺伝子の検
出。ヒト細胞系RAMOSのゲノムDNAを、所定の制
限エンドヌクレアーゼで切断し、実施例19の工程1に
記載の条件下に、pLIF7.2bから誘導したマウス
cDNAフラグメントとハイブリッド形成させた。
【0108】第23図:ヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程1に関する:種々のハイブリッド形成条件下に
おける、マウスLIFcDNAプローブを用いるサザン
ブロットハイブリッド形成によるLIF遺伝子の検出。
制限エンドヌクレアーゼBamHIで切断したヒト細胞
系RAMOS(H)またはマウス肝DNA(M)のゲノ
ムDNAを、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下
に、マウスLIFcDNAプローブ(pLIF7.2
b)とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成のた
めの温度およびSSC濃度を上行に、洗浄条件を次行に
示す(実施例10の工程1参照)。
グの工程1に関する:種々のハイブリッド形成条件下に
おける、マウスLIFcDNAプローブを用いるサザン
ブロットハイブリッド形成によるLIF遺伝子の検出。
制限エンドヌクレアーゼBamHIで切断したヒト細胞
系RAMOS(H)またはマウス肝DNA(M)のゲノ
ムDNAを、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下
に、マウスLIFcDNAプローブ(pLIF7.2
b)とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成のた
めの温度およびSSC濃度を上行に、洗浄条件を次行に
示す(実施例10の工程1参照)。
【0109】第24図:ヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程2に関する:LIF遺伝子クローンの3試料の
制限エンドヌクレアーゼ切断。クローンλHGLIF
1、λHGLIF2およびλHGLIF3のλファージ
のDNA1μgを、SalI、BamHIまたはPstI
で分解し、0.8%アガロースゲルで電気泳動し(左
図)、ニトロセルロースに移し、(前記のように)pL
IF7.2cDNAとハイブリッド形成させた。ハイブ
リッド形成フラグメントのおよそのサイズを示す。
グの工程2に関する:LIF遺伝子クローンの3試料の
制限エンドヌクレアーゼ切断。クローンλHGLIF
1、λHGLIF2およびλHGLIF3のλファージ
のDNA1μgを、SalI、BamHIまたはPstI
で分解し、0.8%アガロースゲルで電気泳動し(左
図)、ニトロセルロースに移し、(前記のように)pL
IF7.2cDNAとハイブリッド形成させた。ハイブ
リッド形成フラグメントのおよそのサイズを示す。
【0110】第25図:ヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程3に関する:ヒトLIF遺伝子(H)にかかる
λHGLIF1の1.3kbpのセグメントのmRNA
類似鎖のヌクレオチド配列を5'から3'方向に示す。c
DNAクローンpLIF7.2b、pLIFNK1およ
びpLIFNK3から誘導されるマウスLIFmRNA
(M)の相当するヌクレオチド配列をヒト遺伝子の下に
小文字で示す。マウスおよびヒトの配列が同じ箇所は、
星印で示す。マウスLIFと同様に推定された成熟ヒト
LIFのN−末端残基を+1とする。
グの工程3に関する:ヒトLIF遺伝子(H)にかかる
λHGLIF1の1.3kbpのセグメントのmRNA
類似鎖のヌクレオチド配列を5'から3'方向に示す。c
DNAクローンpLIF7.2b、pLIFNK1およ
びpLIFNK3から誘導されるマウスLIFmRNA
(M)の相当するヌクレオチド配列をヒト遺伝子の下に
小文字で示す。マウスおよびヒトの配列が同じ箇所は、
星印で示す。マウスLIFと同様に推定された成熟ヒト
LIFのN−末端残基を+1とする。
【0111】第26図:ヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程3に関する:ヒトLIFのアミノ酸配列および
マウスLIFとの比較。直接アミノ酸シークエンシン
グ、およびcDNAクローンpLIF7.2b、pLI
FNK1およびpLIFNK3の分析によって決定した
成熟マウスLIF(M)のアミノ酸配列を上行に示し、
λHGLIF1の配列から推測されるヒトLIF(H)
の相当する配列を下に示す。同一箇所はダッシュで示
す。相違はアミノ酸で示す。
グの工程3に関する:ヒトLIFのアミノ酸配列および
マウスLIFとの比較。直接アミノ酸シークエンシン
グ、およびcDNAクローンpLIF7.2b、pLI
FNK1およびpLIFNK3の分析によって決定した
成熟マウスLIF(M)のアミノ酸配列を上行に示し、
λHGLIF1の配列から推測されるヒトLIF(H)
の相当する配列を下に示す。同一箇所はダッシュで示
す。相違はアミノ酸で示す。
【0112】第27図:ヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程4に関する:ヒトLIF遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ切断地図。pLIF7.2b類似ヒト遺伝子
(第25図)のエクソンをボックスとして示す。遺伝子
翻訳方向は、ライン下の矢印によって示す。
グの工程4に関する:ヒトLIF遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ切断地図。pLIF7.2b類似ヒト遺伝子
(第25図)のエクソンをボックスとして示す。遺伝子
翻訳方向は、ライン下の矢印によって示す。
【0113】工程1:マウスプローブによるヒトLIF
の検出 マウスLIFcDNAクローンpLIF7.2bの放射
性ラベルしたフラグメントをハイブリッド形成プローブ
として用いて、ヒトLIF遺伝子を検出する方法は既に
開示されている。第22図は、種々の制限エンドヌクレ
アーゼで切断したヒトゲノムDNAにおいてヒトLIF
遺伝子を検出する方法を示す。このような分析および図
示されていない他のゲルにより、ヒトLIF遺伝子が存
在する、種々の制限エンドヌクレアーゼによって生成し
たDNAフラグメントのサイズがわかった。このデータ
は、ヒト遺伝子の検出のためのハイブリッド形成プロー
ブとしてマウスプローブを使用し得る条件を確立するた
めだけでなく、ヒトゲノムLIFクローンの同定に有用
な診断用制限マッピングデータを提供するためにも、本
実施例の後の工程において重要である。
の検出 マウスLIFcDNAクローンpLIF7.2bの放射
性ラベルしたフラグメントをハイブリッド形成プローブ
として用いて、ヒトLIF遺伝子を検出する方法は既に
開示されている。第22図は、種々の制限エンドヌクレ
アーゼで切断したヒトゲノムDNAにおいてヒトLIF
遺伝子を検出する方法を示す。このような分析および図
示されていない他のゲルにより、ヒトLIF遺伝子が存
在する、種々の制限エンドヌクレアーゼによって生成し
たDNAフラグメントのサイズがわかった。このデータ
は、ヒト遺伝子の検出のためのハイブリッド形成プロー
ブとしてマウスプローブを使用し得る条件を確立するた
めだけでなく、ヒトゲノムLIFクローンの同定に有用
な診断用制限マッピングデータを提供するためにも、本
実施例の後の工程において重要である。
【0114】マウスおよびヒトのLIF配列の間の相同
性が高いことは、BamHIで切断したマウスおよびヒ
トゲノムDNAを、マウスLIFcDNAプローブと共
に、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下にハイブ
リッド形成することによってわかった(第23図)。ハ
イブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを高め
ると、バックグラウンドが低下し、マウスプローブと共
にハイブリッド形成している〜3kbpの特有のフラグ
メントがあらわれた。ヒト遺伝子が、0.2×SSC中
で65℃においても実質的なハイブリッド形成を保持し
たことは重要である。
性が高いことは、BamHIで切断したマウスおよびヒ
トゲノムDNAを、マウスLIFcDNAプローブと共
に、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下にハイブ
リッド形成することによってわかった(第23図)。ハ
イブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを高め
ると、バックグラウンドが低下し、マウスプローブと共
にハイブリッド形成している〜3kbpの特有のフラグ
メントがあらわれた。ヒト遺伝子が、0.2×SSC中
で65℃においても実質的なハイブリッド形成を保持し
たことは重要である。
【0115】工程2:ヒトゲノムライブラリーのスクリ
ーニングおよびLIF遺伝子含有クローンの単離 Sau3Aで部分的に切断し、λファージクローニング
ベクターEMBL3Aに結合したヒトゲノムDNAのラ
イブラリーについて、マウスcDNAをプローブとして
ハイブリッド形成することにより、LIF遺伝子含有ク
ローンをスクリーニングした。LIFcDNAのフラグ
メントは、放射性ラベルし、ハイブリッド形成条件は、
前記の通りであった(実施例4)。ゲノムライブラリー
を示すファージプラークを、10cmのペトリ皿当たり
〜50,000プラークの密度で培養し、文献に記載の
ようにニトロセルロースに移した(マニアティスら、モ
レキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハ
ーバー、1982)。ハイブリッド形成前に、6×SS
C(SSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン
酸ナトリウム)、0.2%フィコル、0.2%ポリビニル
ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、2mMピロ
リン酸ナトリウム、1mM ATP、50μg/ml変
性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸菌tRNA
中で65℃で数時間フィルターをインキュベートした。
ハイブリッド形成は、0.1%SDSを含有する同じ溶
液中で、65℃で16〜18時間行った。[α32P]d
ATPを用いてニックトランスレーションにより比活性
〜2×108cpm/μgに放射性ラベルしたLIFc
DNAフラグメントを、〜2×106cpm/mlの濃
度でハイブリッド形成に使用した。ハイブリッド形成
後、6×SSC、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で
65℃で広範に洗浄し、次いでオートラジオグラフィー
に付した。複製フィルター上の陽性のプラークを取り、
前記のように低密度で再スクリーニングした。
ーニングおよびLIF遺伝子含有クローンの単離 Sau3Aで部分的に切断し、λファージクローニング
ベクターEMBL3Aに結合したヒトゲノムDNAのラ
イブラリーについて、マウスcDNAをプローブとして
ハイブリッド形成することにより、LIF遺伝子含有ク
ローンをスクリーニングした。LIFcDNAのフラグ
メントは、放射性ラベルし、ハイブリッド形成条件は、
前記の通りであった(実施例4)。ゲノムライブラリー
を示すファージプラークを、10cmのペトリ皿当たり
〜50,000プラークの密度で培養し、文献に記載の
ようにニトロセルロースに移した(マニアティスら、モ
レキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハ
ーバー、1982)。ハイブリッド形成前に、6×SS
C(SSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン
酸ナトリウム)、0.2%フィコル、0.2%ポリビニル
ピロリドン、0.2%ウシ血清アルブミン、2mMピロ
リン酸ナトリウム、1mM ATP、50μg/ml変
性サケ***DNAおよび50μg/ml大腸菌tRNA
中で65℃で数時間フィルターをインキュベートした。
ハイブリッド形成は、0.1%SDSを含有する同じ溶
液中で、65℃で16〜18時間行った。[α32P]d
ATPを用いてニックトランスレーションにより比活性
〜2×108cpm/μgに放射性ラベルしたLIFc
DNAフラグメントを、〜2×106cpm/mlの濃
度でハイブリッド形成に使用した。ハイブリッド形成
後、6×SSC、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で
65℃で広範に洗浄し、次いでオートラジオグラフィー
に付した。複製フィルター上の陽性のプラークを取り、
前記のように低密度で再スクリーニングした。
【0116】3種のクローンλHGLIF1、2および
3をこのようにして同定および精製した。これらのクロ
ーンの関係を調べ、ヒトLIF遺伝子を含むかどうかを
調べるために、各クローンからDNAを調製し、以下の
制限エンドヌクレアーゼで切断した:クローン化ゲノム
DNAの全セグメントを切断するSalI、並びにLI
F遺伝子内およびその周辺において切断するBamHI
およびPstI;(前記のように)それぞれ、〜3kb
pおよび1.8kbpおよび0.6kbpの固有のフラグ
メントを生成する。組換ファージDNAを切断し、アガ
ロースゲル上の電気泳動により分画(第24図、左図)
した後、DNAをニトロセルロースに移し、(前記条件
下に)マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形
成させて、LIF遺伝子を有するフラグメントを明らか
にした(第24図、右図)。この分析により、次のこと
がわかった (a)3種のクローンはいずれも同じであると考えられ
る、 (b)いずれも、マウスLIFプローブと相同の領域を
有するゲノムDNAの〜9kbpセグメントを有する; (c)マウスcDNAと相同の領域は、ヒトLIF遺伝
子に特有の3kbpBamHIフラグメント上並びに1.
8および0.6kbpPstIフラグメント上に存在する
(前記)。このように、3種のクローンはいずれもヒト
LIF遺伝子を含む染色体DNAのセグメントを有する
ことがわかった。
3をこのようにして同定および精製した。これらのクロ
ーンの関係を調べ、ヒトLIF遺伝子を含むかどうかを
調べるために、各クローンからDNAを調製し、以下の
制限エンドヌクレアーゼで切断した:クローン化ゲノム
DNAの全セグメントを切断するSalI、並びにLI
F遺伝子内およびその周辺において切断するBamHI
およびPstI;(前記のように)それぞれ、〜3kb
pおよび1.8kbpおよび0.6kbpの固有のフラグ
メントを生成する。組換ファージDNAを切断し、アガ
ロースゲル上の電気泳動により分画(第24図、左図)
した後、DNAをニトロセルロースに移し、(前記条件
下に)マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形
成させて、LIF遺伝子を有するフラグメントを明らか
にした(第24図、右図)。この分析により、次のこと
がわかった (a)3種のクローンはいずれも同じであると考えられ
る、 (b)いずれも、マウスLIFプローブと相同の領域を
有するゲノムDNAの〜9kbpセグメントを有する; (c)マウスcDNAと相同の領域は、ヒトLIF遺伝
子に特有の3kbpBamHIフラグメント上並びに1.
8および0.6kbpPstIフラグメント上に存在する
(前記)。このように、3種のクローンはいずれもヒト
LIF遺伝子を含む染色体DNAのセグメントを有する
ことがわかった。
【0117】工程3:ヒトLIF遺伝子のヌクレオチド
配列の決定 マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形成する
前記λHGLIF1の〜3kbpのBamHIフラグメ
ントをプラスミドベクターpEMBL8+に再クローン
化してクローンpHGLIFBam1を生成し、ヌクレ
オチド配列分析に付した。ヌクレオチドシークエンシン
グは、アルカリ変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型とし
て使用し、遺伝子中の配列に相補的な種々のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして使用し、大腸菌DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球
症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとして使用して、
ジデオキシ法によって行った(サンガーら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、74:5463〜5467、197
7)。
配列の決定 マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形成する
前記λHGLIF1の〜3kbpのBamHIフラグメ
ントをプラスミドベクターpEMBL8+に再クローン
化してクローンpHGLIFBam1を生成し、ヌクレ
オチド配列分析に付した。ヌクレオチドシークエンシン
グは、アルカリ変性2本鎖プラスミドDNAを鋳型とし
て使用し、遺伝子中の配列に相補的な種々のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして使用し、大腸菌DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球
症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとして使用して、
ジデオキシ法によって行った(サンガーら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、74:5463〜5467、197
7)。
【0118】LIF遺伝子にかかるBamHIフラグメ
ントの全ヌクレオチド配列(2840bp)を決定し、
そのうちの1297bpを第25図に示す。この配列を
マウスLIFmRNA配列と並べると、成熟ヒトLIF
タンパク質をコード化する配列が、693bpのイント
ロンによって分離された2つのエクソン上に存在するこ
とがわかった(第25図)。成熟タンパク質をコード化
する領域では、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列レベル
のいずれにおいても、2種間の相同性が高い。エクソン
1においては88%の核酸配列(114/129残基)
および91%のアミノ酸配列(39/43)が、成熟タ
ンパク質コード化領域(位置58〜186)と同じであ
る。エクソン2はやや相同性が低く、コード化領域にお
いて、ヌクレオチドレベルで77%(318/411)
およびアミノ酸レベルで74%(101/136)であ
る。成熟タンパク質全体としては、ここで決定したマウ
スおよびヒトLIF配列は、挿入または欠失無く140
〜179位置(78%)において同じである(第26
図)。そのうえ、相違の多くは、少々の置換にすぎない
(Lys:Arg、Glu:AspおよびLeu:Va
l:Ala)。
ントの全ヌクレオチド配列(2840bp)を決定し、
そのうちの1297bpを第25図に示す。この配列を
マウスLIFmRNA配列と並べると、成熟ヒトLIF
タンパク質をコード化する配列が、693bpのイント
ロンによって分離された2つのエクソン上に存在するこ
とがわかった(第25図)。成熟タンパク質をコード化
する領域では、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列レベル
のいずれにおいても、2種間の相同性が高い。エクソン
1においては88%の核酸配列(114/129残基)
および91%のアミノ酸配列(39/43)が、成熟タ
ンパク質コード化領域(位置58〜186)と同じであ
る。エクソン2はやや相同性が低く、コード化領域にお
いて、ヌクレオチドレベルで77%(318/411)
およびアミノ酸レベルで74%(101/136)であ
る。成熟タンパク質全体としては、ここで決定したマウ
スおよびヒトLIF配列は、挿入または欠失無く140
〜179位置(78%)において同じである(第26
図)。そのうえ、相違の多くは、少々の置換にすぎない
(Lys:Arg、Glu:AspおよびLeu:Va
l:Ala)。
【0119】成熟LIFのN−末端プロリン残基のコド
ンの5'で、(第25図の位置58)ヒト遺伝子は、ほ
とんどの疎水性リーダーをコード化する領域を通してマ
ウスLIFmRNA配列と同じである。しかし、このm
RNAおよび遺伝子配列は、特有のRNA切断部位(T
CCCAG)で異なるので、リーダー全体がこのエクソ
ンにおいてコード化されているのではない[マウント
(Mount,S.M.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、10:459〜472、1982]。5'未翻訳領
域およびリーダーの最初の残基を特定するエクソンは、
この切断部位の1097bp5'中に存在しない。マウ
スLIF遺伝子において、疎水性リーダーの最初の6個
のアミノ酸配列を特定するエクソンは、同様の切断部位
の〜1.5kbp5'に位置する。
ンの5'で、(第25図の位置58)ヒト遺伝子は、ほ
とんどの疎水性リーダーをコード化する領域を通してマ
ウスLIFmRNA配列と同じである。しかし、このm
RNAおよび遺伝子配列は、特有のRNA切断部位(T
CCCAG)で異なるので、リーダー全体がこのエクソ
ンにおいてコード化されているのではない[マウント
(Mount,S.M.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、10:459〜472、1982]。5'未翻訳領
域およびリーダーの最初の残基を特定するエクソンは、
この切断部位の1097bp5'中に存在しない。マウ
スLIF遺伝子において、疎水性リーダーの最初の6個
のアミノ酸配列を特定するエクソンは、同様の切断部位
の〜1.5kbp5'に位置する。
【0120】工程4:ヒトLIF遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ切断地図の決定 ヒトLIF遺伝子中およびその周辺の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位の位置を決定し、この遺伝子の分子フィ
ンガープリント提供するために、ヒトゲノムDNA(R
AMOS細胞系由来)を種々の制限エンドヌクレアーゼ
で1本および2本鎖の状態で切断し、使用したプローブ
が前記工程3に記載のpHGLIFBam1から誘導
し、ニックトランスレーションによって放射性ラベルし
た3kbpのBamHIフラグメントであったことを除
いては実施例8に記載のようにサザンブロット分析に付
した。λHGLIF1およびpHGLIFBam1の分
析から誘導した第22図に示すデータと同様に、そのよ
うに誘導したデータ(図示せず)を分析することによ
り、得られた制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第27
図に示す。
クレアーゼ切断地図の決定 ヒトLIF遺伝子中およびその周辺の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位の位置を決定し、この遺伝子の分子フィ
ンガープリント提供するために、ヒトゲノムDNA(R
AMOS細胞系由来)を種々の制限エンドヌクレアーゼ
で1本および2本鎖の状態で切断し、使用したプローブ
が前記工程3に記載のpHGLIFBam1から誘導
し、ニックトランスレーションによって放射性ラベルし
た3kbpのBamHIフラグメントであったことを除
いては実施例8に記載のようにサザンブロット分析に付
した。λHGLIF1およびpHGLIFBam1の分
析から誘導した第22図に示すデータと同様に、そのよ
うに誘導したデータ(図示せず)を分析することによ
り、得られた制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第27
図に示す。
【0121】参考例2 本実施例は、酵母細胞中で発現させるためのクローン化
ヒトLIF遺伝子の修飾、並びにそのように誘導された
組換ヒトLIFの生物学的および生理学的性質の決定に
関する。第28図 :工程1に関する:YEpseclに組み込むヒト
LIF遺伝子の修飾に使用するオリゴヌクレオチド。オ
リゴヌクレオチド(a)は、コード化領域の5'末端
(第25図の残基31〜69)に相当する。オリゴヌク
レオチド(b)は、コード化領域の中央(第25図の残
基163〜186および880〜903)に相当する。
エクソン1に相補的なこのオリゴヌクレオチドの部分に
は、ダッシュで下線を付し、エクソン2に相補的な部分
には、点線を付す。オリゴヌクレオチド(c)は、コー
ド化領域の3'末端(第25図の位置1279から)に
相当する。オリゴヌクレオチド(a)および(b)は、
示された制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入する。
ヒトLIF遺伝子の修飾、並びにそのように誘導された
組換ヒトLIFの生物学的および生理学的性質の決定に
関する。第28図 :工程1に関する:YEpseclに組み込むヒト
LIF遺伝子の修飾に使用するオリゴヌクレオチド。オ
リゴヌクレオチド(a)は、コード化領域の5'末端
(第25図の残基31〜69)に相当する。オリゴヌク
レオチド(b)は、コード化領域の中央(第25図の残
基163〜186および880〜903)に相当する。
エクソン1に相補的なこのオリゴヌクレオチドの部分に
は、ダッシュで下線を付し、エクソン2に相補的な部分
には、点線を付す。オリゴヌクレオチド(c)は、コー
ド化領域の3'末端(第25図の位置1279から)に
相当する。オリゴヌクレオチド(a)および(b)は、
示された制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入する。
【0122】第29図:工程1に関する:クローン化ヒ
トLIF遺伝子の突然変移誘発により誘導された合成ヒ
トLIFcDNAのヌクレオチド配列およびそれによっ
てコード化されたアミノ酸。オリゴヌクレオチド(a)
および(c)(第28図)によって導入されるBamH
IおよびHindIII切断部位を示す。(マウスと同様
に)成熟LIFの推定N−末端アミノ酸を+1とする。
トLIF遺伝子の突然変移誘発により誘導された合成ヒ
トLIFcDNAのヌクレオチド配列およびそれによっ
てコード化されたアミノ酸。オリゴヌクレオチド(a)
および(c)(第28図)によって導入されるBamH
IおよびHindIII切断部位を示す。(マウスと同様
に)成熟LIFの推定N−末端アミノ酸を+1とする。
【0123】第30図:工程3に関する:精製天然マウ
スLIF希釈物(○−−−○)およびガラクトースで誘
導したYEpsecl/HLIF組換体含有酵母細胞ならし
培地(● ●)による、M1白血病細胞コロニーに
おける分化の誘導。YEpsecl/HLIF組換体含有非
誘導酵母培養の培地(○ ○)は不活性であった。
複製7日培養の平均データを示す。
スLIF希釈物(○−−−○)およびガラクトースで誘
導したYEpsecl/HLIF組換体含有酵母細胞ならし
培地(● ●)による、M1白血病細胞コロニーに
おける分化の誘導。YEpsecl/HLIF組換体含有非
誘導酵母培養の培地(○ ○)は不活性であった。
複製7日培養の平均データを示す。
【0124】第31図:工程4に関する:酵母誘導HL
IFと天然マウス125I−LIFとの、マウスM1細胞
特異的レセプターへの結合の競合。真正天然マウスLI
F−A(実施例1)の希釈物(○ ○)、組換マウ
スLIF(● ●)並びに非誘導YEpsecl/HL
IF構造含有酵母細胞ならし培地(非誘導:■
■、誘導:□ □)の、37℃におけるマウスM1
細胞の細胞レセプターへの天然125I−LIF−Aの結
合を競合する能力を前記のように試験した。
IFと天然マウス125I−LIFとの、マウスM1細胞
特異的レセプターへの結合の競合。真正天然マウスLI
F−A(実施例1)の希釈物(○ ○)、組換マウ
スLIF(● ●)並びに非誘導YEpsecl/HL
IF構造含有酵母細胞ならし培地(非誘導:■
■、誘導:□ □)の、37℃におけるマウスM1
細胞の細胞レセプターへの天然125I−LIF−Aの結
合を競合する能力を前記のように試験した。
【0125】工程1:酵母における発現のためのヒトL
IF遺伝子の修飾 ヒトLIF遺伝子および前記ヌクレオチド配列を有する
組換DNAクローンの単離を前記のように行った(実施
例10)。成熟ヒトLIFタンパク質をコード化する2
エクソンにかかる1297bpのDNAのヌクレオチド
配列を第25図に示す。
IF遺伝子の修飾 ヒトLIF遺伝子および前記ヌクレオチド配列を有する
組換DNAクローンの単離を前記のように行った(実施
例10)。成熟ヒトLIFタンパク質をコード化する2
エクソンにかかる1297bpのDNAのヌクレオチド
配列を第25図に示す。
【0126】酵母細胞において、酵母発現ベクターYE
pseclを用いてマウス組換LIFを予め調製した(実施
例5)。このベクターは、ガラクトース誘導性ハイブリ
ッドGAL−CYCプロモーターから転写された、クル
イヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から誘
導されたN−末端リーダー配列を提供する。
pseclを用いてマウス組換LIFを予め調製した(実施
例5)。このベクターは、ガラクトース誘導性ハイブリ
ッドGAL−CYCプロモーターから転写された、クル
イヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から誘
導されたN−末端リーダー配列を提供する。
【0127】このベクター中でヒトLIF遺伝子によっ
てコード化されたタンパク質を発現するためには、いく
つかの手段で遺伝子を修飾する必要があった。成熟タン
パク質をコード化する領域の5'末端において、制限エ
ンドヌクレアーゼBamHI切断部位を導入して、クル
イヴェロミセス・ラクティスリーダーをフレームに挿入
させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位(Gly−
Ser)を保持した。ここでも、マウスcDNA(pL
IF7.2b)に適用したのと同様の修飾を行った。中
央において、693bpの間に入った配列を除去し、2
つのエクソンを同じ翻訳リーディングフレームに融合し
た。3'末端において、天然終止コドンの3'に第2の翻
訳終止コドンを直接導入し、YEpseclに挿入するHi
ndIII部位を導入した。修飾はすべてオリゴヌクレオ
チド介在突然変異誘発によって行った:LIF遺伝子に
かかる〜3kbp BamHIのフラグメントをプラスミ
ドpEMBL8+中にサブクローン化し(デンテら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ、11:1645〜1
655、1983)、1本鎖DNAはF1重感染によっ
て調製した。イン・ビトロ突然変異誘発は、それぞれ3
9、48および39塩基のオリゴヌクレオチドを用い
て、文献[ニスベット(Nisbet,I.T.)およびバイルハ
ルツ(Beilharz,M.W.)、ジーン・アナリシス・タクニ
クス(Gene Anal.Techn.)、2:23 29、198
5]に記載のように行い、前記のように遺伝子の5'末
端、中央および3'末端を修飾した(第28図参照)。
修飾ヒトLIFコード化領域のヌクレオチド配列を第2
9図に示す。
てコード化されたタンパク質を発現するためには、いく
つかの手段で遺伝子を修飾する必要があった。成熟タン
パク質をコード化する領域の5'末端において、制限エ
ンドヌクレアーゼBamHI切断部位を導入して、クル
イヴェロミセス・ラクティスリーダーをフレームに挿入
させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位(Gly−
Ser)を保持した。ここでも、マウスcDNA(pL
IF7.2b)に適用したのと同様の修飾を行った。中
央において、693bpの間に入った配列を除去し、2
つのエクソンを同じ翻訳リーディングフレームに融合し
た。3'末端において、天然終止コドンの3'に第2の翻
訳終止コドンを直接導入し、YEpseclに挿入するHi
ndIII部位を導入した。修飾はすべてオリゴヌクレオ
チド介在突然変異誘発によって行った:LIF遺伝子に
かかる〜3kbp BamHIのフラグメントをプラスミ
ドpEMBL8+中にサブクローン化し(デンテら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ、11:1645〜1
655、1983)、1本鎖DNAはF1重感染によっ
て調製した。イン・ビトロ突然変異誘発は、それぞれ3
9、48および39塩基のオリゴヌクレオチドを用い
て、文献[ニスベット(Nisbet,I.T.)およびバイルハ
ルツ(Beilharz,M.W.)、ジーン・アナリシス・タクニ
クス(Gene Anal.Techn.)、2:23 29、198
5]に記載のように行い、前記のように遺伝子の5'末
端、中央および3'末端を修飾した(第28図参照)。
修飾ヒトLIFコード化領域のヌクレオチド配列を第2
9図に示す。
【0128】工程2:YEpsecl/HLIF組換体の酵
母細胞への導入 エス・セレビシエ(S.cerevisiae)株GY1+(leu2 u
ra3 ade2 trp1 cir+;G.cesareni、EMBLハイデ
ルベルク)を、ポリエチレングリコール法によって形質
転換した(クレベら、ジーン、25:333〜341、
1983)。形質転換体を選択し、ウラシル不存在下
に、合成最少培地(必要なアミノ酸50μg/mlを補
給した、2%炭素源、0.67%酵母窒素ベース(ディ
フコ))上に保持した。2方法のいずれかにより、組換
体HLIFを調製した。(1)Ura+形質転換体を2
%ガラクトース含有非選択的培地中で定常期で増殖さ
せ、培地のLIF活性をアッセイした。(2)Ura+
形質転換体を2%グルコース含有選択的最少培地中で定
常期で増殖させた。次いで、細胞を洗浄し、同じ体積の
2%エタノール含有選択的最少培地に再懸濁させ、グル
コースリプレッションを補うために8時間増殖させた。
次いで、細胞を2%ガラクトース含有合成最少培地で希
釈(1:10)することによってHLIFインサートの
転写を誘導した。誘導から種々の時間後に培養上澄試料
を採り、ミリポアフィルター(0.2μm)で濾過し、
LIF活性を直接アッセイした。
母細胞への導入 エス・セレビシエ(S.cerevisiae)株GY1+(leu2 u
ra3 ade2 trp1 cir+;G.cesareni、EMBLハイデ
ルベルク)を、ポリエチレングリコール法によって形質
転換した(クレベら、ジーン、25:333〜341、
1983)。形質転換体を選択し、ウラシル不存在下
に、合成最少培地(必要なアミノ酸50μg/mlを補
給した、2%炭素源、0.67%酵母窒素ベース(ディ
フコ))上に保持した。2方法のいずれかにより、組換
体HLIFを調製した。(1)Ura+形質転換体を2
%ガラクトース含有非選択的培地中で定常期で増殖さ
せ、培地のLIF活性をアッセイした。(2)Ura+
形質転換体を2%グルコース含有選択的最少培地中で定
常期で増殖させた。次いで、細胞を洗浄し、同じ体積の
2%エタノール含有選択的最少培地に再懸濁させ、グル
コースリプレッションを補うために8時間増殖させた。
次いで、細胞を2%ガラクトース含有合成最少培地で希
釈(1:10)することによってHLIFインサートの
転写を誘導した。誘導から種々の時間後に培養上澄試料
を採り、ミリポアフィルター(0.2μm)で濾過し、
LIF活性を直接アッセイした。
【0129】工程3:酵母誘導HLIFの生物学的性質
の決定 マウスおよびヒトのLIFの配列が高度に類似している
という観点から、酵母誘導ヒトLIFのマウスM1細胞
に対する活性を評価した。酵母ならし培地の分化誘導活
性および白血病抑制活性のアッセイは、20%ウシ胎児
血清および0.3%寒天の最終濃度のダルベッコ改良イ
ーグル培地中にマウスM1細胞(ホズミ博士、サイタマ
・カンサー・リサーチ・センター、日本による提供)3
00個を含有する1mlの培養中で行った。アッセイす
る試料は、寒天培地中の細胞懸濁液の添加前に、連続希
釈した0.1mlの体積で培養器に加えた。培養は、空
気中10%CO2の水蒸気飽和雰囲気中で7日間インキ
ュベートした。培養は、解剖顕微鏡を用いて35倍の倍
率で、分散した細胞のコロナを有するか、または分散し
た細胞のみから成る分化したコロニーを記録した。コロ
ニーの形態学的検査は、全培養を2.5%グルタルアル
デヒド1mlで固定し、次いで顕微鏡スライド上で乾燥
した培養をアセチルコリンエステラーゼ/ルクソール・
ファスト・ブルー/ヘマトキシリンで染色することによ
って行った。
の決定 マウスおよびヒトのLIFの配列が高度に類似している
という観点から、酵母誘導ヒトLIFのマウスM1細胞
に対する活性を評価した。酵母ならし培地の分化誘導活
性および白血病抑制活性のアッセイは、20%ウシ胎児
血清および0.3%寒天の最終濃度のダルベッコ改良イ
ーグル培地中にマウスM1細胞(ホズミ博士、サイタマ
・カンサー・リサーチ・センター、日本による提供)3
00個を含有する1mlの培養中で行った。アッセイす
る試料は、寒天培地中の細胞懸濁液の添加前に、連続希
釈した0.1mlの体積で培養器に加えた。培養は、空
気中10%CO2の水蒸気飽和雰囲気中で7日間インキ
ュベートした。培養は、解剖顕微鏡を用いて35倍の倍
率で、分散した細胞のコロナを有するか、または分散し
た細胞のみから成る分化したコロニーを記録した。コロ
ニーの形態学的検査は、全培養を2.5%グルタルアル
デヒド1mlで固定し、次いで顕微鏡スライド上で乾燥
した培養をアセチルコリンエステラーゼ/ルクソール・
ファスト・ブルー/ヘマトキシリンで染色することによ
って行った。
【0130】同じ酵母細胞の非誘導培養の培地、非形質
転換酵母またはベクターYEpseclのみを含有する酵母
の培養の培地ではなく、YEpsecl中にヒトコード化領
域を含有する酵母のガラクトース誘導培養の培地は、M
1コロニーの培養において特有のマクロファージ分化を
誘導することができた(第30図)。マウスLIFの場
合のように、濃度を高めると、酵母誘導ヒト試料も、M
1コロニー分化の数およびサイズを徐々に低下した。精
製天然マウスLIFと比較すると、酵母ならし培地はヒ
トLIFを50,000ユニット/mlまで含有するこ
とがわかった。
転換酵母またはベクターYEpseclのみを含有する酵母
の培養の培地ではなく、YEpsecl中にヒトコード化領
域を含有する酵母のガラクトース誘導培養の培地は、M
1コロニーの培養において特有のマクロファージ分化を
誘導することができた(第30図)。マウスLIFの場
合のように、濃度を高めると、酵母誘導ヒト試料も、M
1コロニー分化の数およびサイズを徐々に低下した。精
製天然マウスLIFと比較すると、酵母ならし培地はヒ
トLIFを50,000ユニット/mlまで含有するこ
とがわかった。
【0131】工程4:酵母誘導ヒトLIFのレセプター
結合特異性 精製マウスLIF−A(実施例1)を前記のようにヨウ
素化した。M1細胞を洗浄し、10%ウシ胎児血清含有
Hepes−緩衝RPMI培地中に2.5×106/50
μlで再懸濁させた。50μl中の細胞を200,00
0cpmの125I−LIF−A(同じ培地中10μl)
および10μlの対照培地または非ラベル純マウスLI
F−Aの連続2倍希釈物またはYEpsecl/HLIF構
造を有する酵母形質転換体のガラクトース誘導もしくは
非誘導培養のならし培地と共にインキュベートした。
結合特異性 精製マウスLIF−A(実施例1)を前記のようにヨウ
素化した。M1細胞を洗浄し、10%ウシ胎児血清含有
Hepes−緩衝RPMI培地中に2.5×106/50
μlで再懸濁させた。50μl中の細胞を200,00
0cpmの125I−LIF−A(同じ培地中10μl)
および10μlの対照培地または非ラベル純マウスLI
F−Aの連続2倍希釈物またはYEpsecl/HLIF構
造を有する酵母形質転換体のガラクトース誘導もしくは
非誘導培養のならし培地と共にインキュベートした。
【0132】YEpsecl/HLIF組換体含有ガラクト
ース誘導酵母細胞のならし培地は、マウスM1細胞上の
特異的細胞レセプターへの天然マウス125I−LIA−
Aの結合を、天然および組換マウスLIF−Aと同程度
に、37℃(第31図)および0℃(図示せず)におい
て競合することができた。非誘導酵母細胞の培地および
ベクターYEpseclのみを含有する酵母細胞の培地は競
合しなかった。従って、1次アミノ酸配列の高度の相同
性に匹敵して、マウスおよびヒトLIFにおいてレセプ
ター結合領域は高度に保持されることがわかる。
ース誘導酵母細胞のならし培地は、マウスM1細胞上の
特異的細胞レセプターへの天然マウス125I−LIA−
Aの結合を、天然および組換マウスLIF−Aと同程度
に、37℃(第31図)および0℃(図示せず)におい
て競合することができた。非誘導酵母細胞の培地および
ベクターYEpseclのみを含有する酵母細胞の培地は競
合しなかった。従って、1次アミノ酸配列の高度の相同
性に匹敵して、マウスおよびヒトLIFにおいてレセプ
ター結合領域は高度に保持されることがわかる。
【0133】工程5:酵母誘導ヒトLIFの精製、シー
クエンシングおよびヨウ素化 DEAE−セファロースCL−6Bカラムに結合し、塩
傾斜によって溶出したLIF活性を工程2においてプー
ルしたことを除いては、YEpsecl/HLIF組換体含
有ガラクトース誘導酵母細胞のならし培地中のヒトLI
Fを、実施例1の工程2および4によって精製した。精
製した酵母誘導ヒトLIFを、0.2Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.2)50μl中のヒトLIF1μg
を、2MNaCl中のNa125I(2.7μl)1mCi
および0.2mM ICl5μlと共に60秒間インキュ
ベートすることによって放射性ラベルした。0.02%
トゥイーン20および0.02%アジ化ナトリウムを含
有するリン酸緩衝(20mM、pH7.4)生理食塩液
(0.15M)中で平衡化したセファデックスG−25
M(ファルマシア)のカラム反応混合物を通すことによ
って、125I−LIFを、取り込まれなかった125Iから
分離した。ヒト125I−LIFを8〜25%ドデシル硫
酸ナトリウムポリアミドゲル上で電気泳動すると、見掛
けの分子量170,000の単一の広いバンドがあらわ
れた。ヒト125I−LIFがマウスM1細胞および骨髄
細胞に特異的に結合したことから、ヒトLIFが、マウ
スLIFレセプターへの結合能力を有することを確認し
た。精製酵母誘導ヒトLIF(約10μg)を、実施例
2に記載のようにアミノ末端アミノ酸シークエンシング
に付し、単一の配列: Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala .... がわかった。これは、マウス配列(実施例2参照): Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala .... の4番目のアミノ酸から始まることを除いては、ヒトL
IFの推定アミノ酸配列(第26図)と同じである。こ
のことは、精製した酵母誘導ヒトLIFが、マウス配列
の対応する最初の3個のアミノ酸を欠いているが、生物
学的に活性であり、マウスLIFレセプターに結合し得
ることを示している。最初の3個のアミノ酸は、LIF
の生物学的活性に重要でないことがわかる。
クエンシングおよびヨウ素化 DEAE−セファロースCL−6Bカラムに結合し、塩
傾斜によって溶出したLIF活性を工程2においてプー
ルしたことを除いては、YEpsecl/HLIF組換体含
有ガラクトース誘導酵母細胞のならし培地中のヒトLI
Fを、実施例1の工程2および4によって精製した。精
製した酵母誘導ヒトLIFを、0.2Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.2)50μl中のヒトLIF1μg
を、2MNaCl中のNa125I(2.7μl)1mCi
および0.2mM ICl5μlと共に60秒間インキュ
ベートすることによって放射性ラベルした。0.02%
トゥイーン20および0.02%アジ化ナトリウムを含
有するリン酸緩衝(20mM、pH7.4)生理食塩液
(0.15M)中で平衡化したセファデックスG−25
M(ファルマシア)のカラム反応混合物を通すことによ
って、125I−LIFを、取り込まれなかった125Iから
分離した。ヒト125I−LIFを8〜25%ドデシル硫
酸ナトリウムポリアミドゲル上で電気泳動すると、見掛
けの分子量170,000の単一の広いバンドがあらわ
れた。ヒト125I−LIFがマウスM1細胞および骨髄
細胞に特異的に結合したことから、ヒトLIFが、マウ
スLIFレセプターへの結合能力を有することを確認し
た。精製酵母誘導ヒトLIF(約10μg)を、実施例
2に記載のようにアミノ末端アミノ酸シークエンシング
に付し、単一の配列: Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala .... がわかった。これは、マウス配列(実施例2参照): Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala .... の4番目のアミノ酸から始まることを除いては、ヒトL
IFの推定アミノ酸配列(第26図)と同じである。こ
のことは、精製した酵母誘導ヒトLIFが、マウス配列
の対応する最初の3個のアミノ酸を欠いているが、生物
学的に活性であり、マウスLIFレセプターに結合し得
ることを示している。最初の3個のアミノ酸は、LIF
の生物学的活性に重要でないことがわかる。
【0134】参考例3 本実施例は、推定天然ヒトLIF分枝を同定し、部分的
に精製するための工程を説明する。図面は、以下に記載
する方法の種々の工程に関する:第32図 :推定ヒトLIFの同定の工程2に関する:ヒ
ト膀胱癌細胞系5637(ATCC No.HTB9)
(−□−)粗もしくは(−+−)DEAE非結合フラク
ションのならし培地または天然マウスLIF−A(−○
−)の種々の希釈物の、マウス125I−LIF−Aのマ
ウス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能
力。ヒトG−CSF(−■−)は結合を競合する能力が
ないことも示されている(未希釈=5μg/ml)。
に精製するための工程を説明する。図面は、以下に記載
する方法の種々の工程に関する:第32図 :推定ヒトLIFの同定の工程2に関する:ヒ
ト膀胱癌細胞系5637(ATCC No.HTB9)
(−□−)粗もしくは(−+−)DEAE非結合フラク
ションのならし培地または天然マウスLIF−A(−○
−)の種々の希釈物の、マウス125I−LIF−Aのマ
ウス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能
力。ヒトG−CSF(−■−)は結合を競合する能力が
ないことも示されている(未希釈=5μg/ml)。
【0135】第33図:推定ヒトLIFの同定の工程3
に関する:ヒト膀胱癌細胞系5637のならし培地の、
DEAE−セファロースCL−6Bカラムによる分画、
前記マウスLIF−Aの分画(実施例1)と同様の溶
出、この分画による個々のフラクションの、マウスM1
細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。A図は塩傾
斜、B図は5637ならし培地の分画、C図は比較のた
めのクレブスII細胞ならし培地の分画を示す。
に関する:ヒト膀胱癌細胞系5637のならし培地の、
DEAE−セファロースCL−6Bカラムによる分画、
前記マウスLIF−Aの分画(実施例1)と同様の溶
出、この分画による個々のフラクションの、マウスM1
細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。A図は塩傾
斜、B図は5637ならし培地の分画、C図は比較のた
めのクレブスII細胞ならし培地の分画を示す。
【0136】第34図:推定ヒトLIFの同定の工程3
に関する:レンチル−レクチン・セファロース4Bカラ
ムによる、ヒト膀胱癌細胞系5637のならし培地の分
画(前記マウスLIF−Aの分画と同様に溶出(実施例
1))およびこの分画による個々のフラクションの、マ
ウスM1細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。A図
はα−メチル−D−マンノピラノシド傾斜、B図は56
37ならし培地の分画、C図は比較のためのクレブスII
細胞ならし培地の分画を示す。
に関する:レンチル−レクチン・セファロース4Bカラ
ムによる、ヒト膀胱癌細胞系5637のならし培地の分
画(前記マウスLIF−Aの分画と同様に溶出(実施例
1))およびこの分画による個々のフラクションの、マ
ウスM1細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。A図
はα−メチル−D−マンノピラノシド傾斜、B図は56
37ならし培地の分画、C図は比較のためのクレブスII
細胞ならし培地の分画を示す。
【0137】工程1:数種のヒト細胞系のならし培地
の、半固型寒天培養中のM1マウス骨髄性白血病細胞の
分化誘導および増殖抑制の能力をアッセイした(本発明
の実施例5の工程4と同様)。数種の細胞系はそのよう
な活性を示し、そのうち膀胱癌細胞系5637の活性は
最も高レベルであった。しかし、5637細胞系は、M
1細胞の分化を誘導し得るヒトG−CSF[ニコラら、
ネイチャー、314:625〜628、1985;ウェ
ルテ(Welte,K.)ら、プロシーディングス・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、米国、82:1
526〜1530、1985]を生成することがわかっ
ている[トミダ(Tomida,M.)ら、FEBS・レターズ(FEB
S Lett.)、207:271〜275、1986;ネカー
ズ(Neckers,L.M.)およびプルズニーク(Pluznik,D.
H.)、エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Exp.Hemat
ol.)、15:700〜703、1987]。5637
細胞が真正ヒトLIFを(G−CSFに加えて)生成す
ることを確認するために、5637ならし培地を更に以
下の工程2および3に付した。
の、半固型寒天培養中のM1マウス骨髄性白血病細胞の
分化誘導および増殖抑制の能力をアッセイした(本発明
の実施例5の工程4と同様)。数種の細胞系はそのよう
な活性を示し、そのうち膀胱癌細胞系5637の活性は
最も高レベルであった。しかし、5637細胞系は、M
1細胞の分化を誘導し得るヒトG−CSF[ニコラら、
ネイチャー、314:625〜628、1985;ウェ
ルテ(Welte,K.)ら、プロシーディングス・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、米国、82:1
526〜1530、1985]を生成することがわかっ
ている[トミダ(Tomida,M.)ら、FEBS・レターズ(FEB
S Lett.)、207:271〜275、1986;ネカー
ズ(Neckers,L.M.)およびプルズニーク(Pluznik,D.
H.)、エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Exp.Hemat
ol.)、15:700〜703、1987]。5637
細胞が真正ヒトLIFを(G−CSFに加えて)生成す
ることを確認するために、5637ならし培地を更に以
下の工程2および3に付した。
【0138】工程2:5637細胞のならし培地を20
倍濃縮し、マウス腹膜細胞の特異的細胞レセプターへの
天然マウス125I−LIF−Aの結合を競合するその能
力を試験した。この競合結合アッセイは、本発明の実施
例5の工程5に記載した通りである。5637細胞なら
し培地は、細胞レセプターへのマウス125I−LIF−
Aの結合を競合する活性を有しており、この活性を56
37CM(LIF−A)DEAE非結合フラクソン中で
濃縮した(第32図)。ヒトおよびマウスG−CSF
は、非常に高い濃度でも125I−LIF−A結合部位を
競合しないので、5637ならし培地中に、マウスLI
Fレセプターを特異性に認識し得る同様のヒトLIF活
性が存在することがわかる。このことは、1次アミノ酸
配列の高い相同性に匹敵して、レセプター結合領域にお
けるマウスおよびヒトLIFの保存が強いことを示す。
倍濃縮し、マウス腹膜細胞の特異的細胞レセプターへの
天然マウス125I−LIF−Aの結合を競合するその能
力を試験した。この競合結合アッセイは、本発明の実施
例5の工程5に記載した通りである。5637細胞なら
し培地は、細胞レセプターへのマウス125I−LIF−
Aの結合を競合する活性を有しており、この活性を56
37CM(LIF−A)DEAE非結合フラクソン中で
濃縮した(第32図)。ヒトおよびマウスG−CSF
は、非常に高い濃度でも125I−LIF−A結合部位を
競合しないので、5637ならし培地中に、マウスLI
Fレセプターを特異性に認識し得る同様のヒトLIF活
性が存在することがわかる。このことは、1次アミノ酸
配列の高い相同性に匹敵して、レセプター結合領域にお
けるマウスおよびヒトLIFの保存が強いことを示す。
【0139】工程3:ヒト膀胱癌5637細胞のならし
培地(10%v/vウシ胎児血清中2l)を40mlに
濃縮し、クレブスII腹水細胞ならし培地からのマウスL
IFに対する前記の場合と同ように、DEAE−セファ
ロースCL−6Bおよびレンチル−レクチン−セファロ
ース4Bで連続的にクロマトグラフィーに付した。56
37細胞のM1分化誘導活性(推定ヒトLIF)を、マ
ウスLIFの場合と同様にDEAE−セファロースによ
るクロマトグラフィーに付すと、いくつかの活性はカラ
ムに結合しなかったが(LIF−A)、残りは結合し、
塩傾斜により溶出された(LIF−B)(第33図)。
同様に、レンチル−レクチン−セファロースクロマトグ
ラフィーにおいて、推定ヒトLIFの挙動はマウスLI
Fと同様であり、活性の1部はカラムに結合し、このこ
とは糖タンパク質上にマンノース含有炭水化物が存在す
ることを示す(第34図)。このように、マウスM1細
胞分化誘導におけるその交差反応性、マウスLIF細胞
レセプターを特異的に認識するその能力、およびその生
化学的分画性によって、5637細胞ならし培地中のヒ
ト活性は、マウスLIFの天然ヒト類縁体の基準を満た
す。
培地(10%v/vウシ胎児血清中2l)を40mlに
濃縮し、クレブスII腹水細胞ならし培地からのマウスL
IFに対する前記の場合と同ように、DEAE−セファ
ロースCL−6Bおよびレンチル−レクチン−セファロ
ース4Bで連続的にクロマトグラフィーに付した。56
37細胞のM1分化誘導活性(推定ヒトLIF)を、マ
ウスLIFの場合と同様にDEAE−セファロースによ
るクロマトグラフィーに付すと、いくつかの活性はカラ
ムに結合しなかったが(LIF−A)、残りは結合し、
塩傾斜により溶出された(LIF−B)(第33図)。
同様に、レンチル−レクチン−セファロースクロマトグ
ラフィーにおいて、推定ヒトLIFの挙動はマウスLI
Fと同様であり、活性の1部はカラムに結合し、このこ
とは糖タンパク質上にマンノース含有炭水化物が存在す
ることを示す(第34図)。このように、マウスM1細
胞分化誘導におけるその交差反応性、マウスLIF細胞
レセプターを特異的に認識するその能力、およびその生
化学的分画性によって、5637細胞ならし培地中のヒ
ト活性は、マウスLIFの天然ヒト類縁体の基準を満た
す。
【0140】5637細胞ならし培地からの天然ヒトL
IFを、実施例1の工程2および4によって精製した;
工程2から非結合LIF活性のプールおよび工程4から
LIF活性の結合。このプールされたLIF活性を、ブ
ラウンリーRP300C8カラムを、最初は0.1%T
FA中の0〜60%CH3CN傾斜を用い、次いで0.1
%TFA中の45〜55%CH3CN傾斜を用いて2回
使用したことを除いては実施例1の工程5と同様に逆相
HPLCによって分画した。第2の傾斜において、ヒト
LIFは50%CH3CNで溶出され、8〜25%傾斜
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行うと、見掛けの分子量73,000の主要な銀染
色バンドが現れた。天然精製ヒトLIFを実施例10の
工程5に記載のように放射性ヨウ素化し、酵母誘導ヒト
125I−LIFに関して記載したように(実施例11の
工程5)、マウスM1細胞およびマウス骨髄細胞に特異
的に結合させた。
IFを、実施例1の工程2および4によって精製した;
工程2から非結合LIF活性のプールおよび工程4から
LIF活性の結合。このプールされたLIF活性を、ブ
ラウンリーRP300C8カラムを、最初は0.1%T
FA中の0〜60%CH3CN傾斜を用い、次いで0.1
%TFA中の45〜55%CH3CN傾斜を用いて2回
使用したことを除いては実施例1の工程5と同様に逆相
HPLCによって分画した。第2の傾斜において、ヒト
LIFは50%CH3CNで溶出され、8〜25%傾斜
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行うと、見掛けの分子量73,000の主要な銀染
色バンドが現れた。天然精製ヒトLIFを実施例10の
工程5に記載のように放射性ヨウ素化し、酵母誘導ヒト
125I−LIFに関して記載したように(実施例11の
工程5)、マウスM1細胞およびマウス骨髄細胞に特異
的に結合させた。
【図1】 実施例1のDEAE−セファロースCL−6
BによるLIFの精製の工程2に関するグラフである。
BによるLIFの精製の工程2に関するグラフである。
【図2】 実施例1のレンチル(Lentil)・レクチン・
セファロース4BによるLIFの精製の工程3に関する
グラフである。
セファロース4BによるLIFの精製の工程3に関する
グラフである。
【図3】 実施例1のCM−セファロースCL−6Bに
よるLIFの精製の工程4に関するグラフである。
よるLIFの精製の工程4に関するグラフである。
【図4】 実施例1の脂肪酸分析HPLCカラムによる
LIFの精製の工程5に関するグラフである。
LIFの精製の工程5に関するグラフである。
【図5】 実施例1の精製したLIFの分子量および純
度を示すグラフである。
度を示すグラフである。
【図6】 実施例3に関するグラフである。
【図7】 実施例4のLIFcDNAクローンのクロー
ニングの工程1に関する電気泳動図である。
ニングの工程1に関する電気泳動図である。
【図8】 実施例4のLIFクローンの同定に使用した
オリゴヌクレオチドの配列表を示す図である。
オリゴヌクレオチドの配列表を示す図である。
【図9】 実施例4のLIFcDNAクローンのクロー
ニングの工程4に関する1組のクローンの挙動を示す図
である。
ニングの工程4に関する1組のクローンの挙動を示す図
である。
【図10】 実施例4のcDNAクローンpLIF7.
2bのヌクレオチド配列およびLIFアミノ酸配列を示
す図である。
2bのヌクレオチド配列およびLIFアミノ酸配列を示
す図である。
【図11】 実施例5の酵母細胞におけるマウスLIF
の発現の工程1に関するアミノ酸配列およびヌクレオチ
ド配列を示す図である。
の発現の工程1に関するアミノ酸配列およびヌクレオチ
ド配列を示す図である。
【図12】 実施例5の酵母細胞におけるマウスLIF
の発現の工程2に関するものであり、pLIF7.2b
cDNAの部分ヌクレオチド配列およびそれによってコ
ード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
の発現の工程2に関するものであり、pLIF7.2b
cDNAの部分ヌクレオチド配列およびそれによってコ
ード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
【図13】 実施例5の酵母細胞におけるマウスLIF
発現の工程4に関するものであり、M1白血病細胞の培
養における酵母誘導組換LIFの生物学的活性を示す図
である。
発現の工程4に関するものであり、M1白血病細胞の培
養における酵母誘導組換LIFの生物学的活性を示す図
である。
【図14】 実施例5の酵母細胞におけるマウスLIF
発現の工程5に関するものであり、天然125I−LIF
−Aとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競合する能
力を示すグラフである。
発現の工程5に関するものであり、天然125I−LIF
−Aとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競合する能
力を示すグラフである。
【図15】 実施例6の工程1に関するものであり、ク
ローンpLIFNK3のcDNA部分のヌクレオチド配
列の前半を示す第15A図である。
ローンpLIFNK3のcDNA部分のヌクレオチド配
列の前半を示す第15A図である。
【図16】 実施例6の工程1に関するものであり、ク
ローンpLIFNK3のcDNA部分のヌクレオチド配
列(Fig.15)の後半を示す第15B図である。
ローンpLIFNK3のcDNA部分のヌクレオチド配
列(Fig.15)の後半を示す第15B図である。
【図17】 実施例7の工程1に関するものであり、グ
ルタチオンS−トランスフェラーゼ/トロンビン切断部
位/LIF接合部におけるヌクレオチド配列、その接合
部におけるコード化された融合タンパク質の配列を示す
図である。
ルタチオンS−トランスフェラーゼ/トロンビン切断部
位/LIF接合部におけるヌクレオチド配列、その接合
部におけるコード化された融合タンパク質の配列を示す
図である。
【図18】 実施例8の工程1に関するものであり、高
および低ストリンジェンシー条件下におけるマウスDN
AのpLIF7.2b誘導プローブとのハイブリッド形
成を示す図である。
および低ストリンジェンシー条件下におけるマウスDN
AのpLIF7.2b誘導プローブとのハイブリッド形
成を示す図である。
【図19】 実施例8の工程2に関する:種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分解した、1本鎖および2本鎖のマ
ウスDNAと、マウスLIFプローブとのハイブリッド
形成を示す図である。
ンドヌクレアーゼで分解した、1本鎖および2本鎖のマ
ウスDNAと、マウスLIFプローブとのハイブリッド
形成を示す図である。
【図20】 実施例8の工程2に関するものであり、マ
ウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を示す図である。
ウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を示す図である。
【図21】 実施例8の工程3に関するものであり、マ
ウスLIF遺伝子を有する3kb BamHIフラグメン
トの位置を示す図である。
ウスLIF遺伝子を有する3kb BamHIフラグメン
トの位置を示す図である。
【図22】 実施例9の工程2に関するものであり、:
マウスおよびヒト由来のゲノムDNAに対する種々の条
件下におけるクローンpLIF7.2bのcDNAの32
P−ラベルフラグメントのハイブリッド形成を示す、2
つの異なるオートファジオグラフィー照射を示す図であ
る。
マウスおよびヒト由来のゲノムDNAに対する種々の条
件下におけるクローンpLIF7.2bのcDNAの32
P−ラベルフラグメントのハイブリッド形成を示す、2
つの異なるオートファジオグラフィー照射を示す図であ
る。
【図23】 参考例1の工程1に関するものであり、種
々のエンドヌクレアーゼで切断したヒトゲノムDNAに
おいてヒト遺伝子の検出を示す図である。
々のエンドヌクレアーゼで切断したヒトゲノムDNAに
おいてヒト遺伝子の検出を示す図である。
【図24】 参考例1の工程1に関するものであり、種
々のハイブリッド形成条件下における、マウスLIFc
DNAプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成によるLIF遺伝子の検出を示す図である。
々のハイブリッド形成条件下における、マウスLIFc
DNAプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成によるLIF遺伝子の検出を示す図である。
【図25】 参考例1の工程2に関する:LIF遺伝子
クローンの3試料の制限エンドヌクレアーゼ切断を示す
図である。
クローンの3試料の制限エンドヌクレアーゼ切断を示す
図である。
【図26】 参考例1のヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程3に関するものであり、ヒトLIF遺伝子
(H)にかかるλHGLIF1の1.3kbpのセグメ
ントのmRNA類似鎖の5'から3'方向へのヌクレオチ
ド配列の前半(第25A図)を示す図である。
グの工程3に関するものであり、ヒトLIF遺伝子
(H)にかかるλHGLIF1の1.3kbpのセグメ
ントのmRNA類似鎖の5'から3'方向へのヌクレオチ
ド配列の前半(第25A図)を示す図である。
【図27】 参考例1のヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程3に関するものであり、ヒトLIF遺伝子
(H)にかかるλHGLIF1の1.3kbpのセグメ
ントのmRNA類似鎖の5'から3'方向へのヌクレオチ
ド配列の後半(第25B図)を示す図である。
グの工程3に関するものであり、ヒトLIF遺伝子
(H)にかかるλHGLIF1の1.3kbpのセグメ
ントのmRNA類似鎖の5'から3'方向へのヌクレオチ
ド配列の後半(第25B図)を示す図である。
【図28】 参考例1のヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程3に関するものであり、ヒトLIFのアミノ酸
配列およびマウスLIFとの比較を示す図である。
グの工程3に関するものであり、ヒトLIFのアミノ酸
配列およびマウスLIFとの比較を示す図である。
【図29】 参考例1のヒトLIF遺伝子のクローニン
グの工程4に関するものであり、ヒトLIF遺伝子の制
限エのンドヌクレアーゼ切断地図を示す図である。
グの工程4に関するものであり、ヒトLIF遺伝子の制
限エのンドヌクレアーゼ切断地図を示す図である。
【図30】 参考例2の工程1に関するものであり、Y
Epseclに組み込むヒトLIF遺伝子の修飾に使用する
オリゴヌクレオチドを示す図である。
Epseclに組み込むヒトLIF遺伝子の修飾に使用する
オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図31】 参考例2の工程1に関するものであり、ク
ローン化ヒトLIF遺伝子の突然変移誘発により誘導さ
れた合成ヒトLIFcDNAのヌクレオチド配列および
それによってコード化されたアミノ酸を示す図である。
ローン化ヒトLIF遺伝子の突然変移誘発により誘導さ
れた合成ヒトLIFcDNAのヌクレオチド配列および
それによってコード化されたアミノ酸を示す図である。
【図32】 参考例2の工程3に関するものであり、M
1白血病細胞コロニーにおける分化の誘導を示す図であ
る。
1白血病細胞コロニーにおける分化の誘導を示す図であ
る。
【図33】 参考例2の工程4に関するものであり、酵
母誘導HLIFと天然マウス125I−LIFとの、マウ
スM1細胞特異的レセプターへの結合の競合を示す図で
ある。
母誘導HLIFと天然マウス125I−LIFとの、マウ
スM1細胞特異的レセプターへの結合の競合を示す図で
ある。
【図34】 参考例3の推定ヒトLIFの同定の工程2
に関するものであり、マウス125I−LIF−Aのマウ
ス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能力
を示す図である。
に関するものであり、マウス125I−LIF−Aのマウ
ス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能力
を示す図である。
【図35】 参考例3の推定ヒトLIFの同定の工程3
に関するものであり、マウスM1細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。A図は塩傾斜、B図
は5637ならし培地の分画、C図は比較のためのクレ
ブスII細胞ならし培地の分画を示す。
に関するものであり、マウスM1細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。A図は塩傾斜、B図
は5637ならし培地の分画、C図は比較のためのクレ
ブスII細胞ならし培地の分画を示す。
【図36】 参考例3の推定ヒトLIFの同定の工程3
に関するものであり、マウスM1細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。A図はα−メチル−
D−マンノピラノシド傾斜、B図は5637ならし培地
の分画、C図は比較のためのクレブスII細胞ならし培地
の分画を示す。
に関するものであり、マウスM1細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。A図はα−メチル−
D−マンノピラノシド傾斜、B図は5637ならし培地
の分画、C図は比較のためのクレブスII細胞ならし培地
の分画を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 1/20 8318−4H 1/22 8318−4H C12N 1/19 7236−4B 5/10 15/09 C12P 21/02 C 9282−4B C12Q 1/68 A 9453−4B G01N 33/53 D //(C12P 21/02 C12R 1:865) (C12P 21/02 C12R 1:91) 8412−4B C12N 5/00 B 9050−4B 15/00 A (31)優先権主張番号 PI6005 (32)優先日 1987年12月21日 (33)優先権主張国 オーストラリア(AU) (72)発明者 ニコラス・マルチン・グー オーストラリア連邦ビクトリア、3104、ノ ース・バルウィン、レンジビュー・グロー ブ20番 (72)発明者 ダグラス・ジェイムズ・ヒルトン オーストラリア連邦ビクトリア、3113、ワ ランダイト、ウエスト・エンド・ロード8 番 (72)発明者 ジュリー・アン・キング オーストラリア連邦ビクトリア、3131、ヌ ナウエイディング、スプリングベール・ロ ード121番 (72)発明者 ドナルド・メットカーフ オーストラリア連邦ビクトリア、3103、バ ルウィン、ユニオン・ロード268番 (72)発明者 エドアルド・コリンズ・ナイス オーストラリア連邦ビクトリア、3182、セ ント・キルダ、オデッサ・ストリート9番 (72)発明者 ニコス・アンソニー・ニコラ オーストラリア連邦ビクトリア、3073、レ ジェント、クイーン・ストリート59番 (72)発明者 リチャード・ジョン・シンプソン オーストラリア連邦ビクトリア、3121、リ ッチモンド、スタンレイ・ストリート42番 (72)発明者 トレーシー・アン・ウイルソン オーストラリア連邦ビクトリア、3104、ノ ース・バルウィン、フォーチュナ・アベニ ュー26番
Claims (42)
- 【請求項1】 分離・精製されたマウス白血病抑制因
子。 - 【請求項2】 分離・精製された組換えマウス白血病抑
制因子。 - 【請求項3】 グルコシル化または非グルコシル化マウ
ス白血病抑制因子(LIF)の精製方法であって、(a)
粗LIFを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付
し、塩増加勾配によりLIFを溶出し、(b)工程(a)の生
成物を、マンノースに対する親和性を有するレクチンア
フィニティカラムクロマトグラフィーに付し、マンノー
ス誘導体としてLIFを溶出し、(c)工程(b)の生成物を
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、塩増加
勾配でLIFを溶出し、(d)工程(c)の生成物を、HPL
C条件下に逆相カラムクロマトグラフィーに付し、アセ
トニトリルの増加勾配でLIFを溶出することを含む方
法。 - 【請求項4】 粗LIFが、クレーブスII腹水癌細胞な
らし培地を含むものである、請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 マウス白血病抑制因子(LIF)をコー
ドし、 ヌクレオチド配列: 【化1】 CCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTGCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTC からなる組換えDNA分子、またはLIF活性を有する
ポリペプチドをコードし、1個またはそれ以上のヌクレ
オチドが欠失、置換または付加した上記ヌクレオチド配
列の機能的誘導体。 - 【請求項6】 6×SSC、65℃の条件下、またはそ
れ以上の厳しい条件下で、 ヌクレオチド配列: 【化2】 CACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGC CACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCA AGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCC TATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATG TGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGA AGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCC CTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAG CCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCA GCAATGTGCTTTGCCGTCTGTGCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGAT GTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAA GTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAAGCAAG を有するpLIF7.2b、 ヌクレオチド配列: 【化3】 GCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATAC AAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG を有するpLIFNK1、 ヌクレオチド配列: 【化4】 GAATTCCGGAGTCCAGCCCATAATGAAGGTCTTGGCCGCAGGGATTGTGC CCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAGAGAGGAGGTCTTGAAT GTACCATGGACTGAGGGACCTCAGGAGCAGGATCCGGAGGTGGGGAGGGG GCTCAAAATGTGCTGGGGTTTGGGACATTGTTAAATGCAAAACGGGGCTG CTGGCAGACCCCAGGGATTTCCAGGTACTCACTGCACTCTGGGCTGGGCC ATGATGGAATCTGGCAAAGTTGAAACTTCCATAGGCAGAGCTTCTATACA GCCCAGCACCAGCTAGAAATGGCAATGAGGGTGTTGGTCTGAGAGATTTC TGTCTCACTCACTCACTCACTCACTCTCACTCACTCACTCACTCACTCAC TCAGCCCCTTGCTTGCTGGGTGTAGAACAAGCTGCCACAAGTTGTCTACA GCAGACAGCAAAGGGCTGGGAAGTGTCCTAGACCCCTACAGAGTCACCAT CATCTGGTCCTTTGCTGTCTCTCAGAGAAACTTTGGAAGGCTTGGTTGGG ATGTGAGAGAGCTAAGGGGACTGGGATCCAGAAGGAATCCTTTTATTTTA TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATAAGTTTTGTGGGTGGAAGG GTACCCTGGGGTGGAATGATGGAATGTGTCTTCTCTTGAGTTGGATGAGA GAGTTCAGGCTTAGAGACTGTCAGATGGAAGAGTCTACCTCACCAGTGTT CAGCTCCCACAGAAGCACAGCGGCCAGCTTCCAGTTGTCAAAGCCT-ACG AACTCGGTTAGCTTCTATGCAGTTCCCCCCACAGCCTGGCGTGGTTGGGG TCTGCCAGCTGGACCTAGAGGTGAGGTGTGTGGAATTC を有するpLIFNK3、および ヌクレオチド配列: 【化5】 TCCCCAGGAGTTGTGCCCCTGCTGTTG---GTTCTGCACTGGAAACATGG GGCGGGGAGCCCCCTCCCCATCACCCCTGTCAACGCCACCTGTGCCATAC GCCACCCATGTCACAACAACCTCATGAACCAGATCAGGAGCCAACTGGCA CAGCTCAATGGCAGTGCCAATGCCCTCTTTATTCTCTATGTAAGTTACCC CTGGGATACTGACAGGAGATGGCAGGGAGGGGGCTTGTAAATATCATTAG GGGCTGTCCTGATCTGGGTTGAGGGGACCTTTTGGGGCTGGAAGGAGAGA ATGGGGAGAGGGCTTGATTAAACCACCCCCAGACTCCTGCCACTTCCTGC CCAAGCTTCCCCAGGGAAGCTTCCCCAGGGTGCCCAGTTAGCAAGGGGAG AACTGAGTGCAAAGGTGGGGACCTGGCACTTCTTATCTTGTGATTGTCCT GCTGCAGGGAGCGAGGGATGGAGGGGAAATGGGCGTGAGGCACCAGGGAG ATGCGGTTGAGAGGCAGTGGGCTGTGGGTGCTGGGCATGGAGGGGCGTCC CGGAACATTGTGAGTGCAGGGATGGAAGTACTTGTGTGTGGTGCCCCAGC TAGGGCTAGACACCGAGTTTTCCCTTCTGTCCCCTTAGGGTGGTGATGAT GATGATGATGATAATGATGACTGCGTGCATGGCTCAGTCTTTGATCTTTA GCAAGGGCACTCACATTACAATTAGTTTTGGCTCTCATGACAATTCCAGA TGCTTACAGGGCAAGGAGTTGGGTCCTCATGCGCTAGATGGGGAAACAGA CGCAAGAGCTTGCCCAAAGGGTTGGCGGCAGGGCTGGGACACTGACCCCT GACTCCCACGTCACCTCCCTTCTGCCCCTCAGTACACAGCCCAGGGGGAG CCGTTCCCCAACAACCTGGACAAGCTATGTGGCCCCAACGTGACGGACT TCCCGCCCTTCCACGCCAACGGCACGGAGAAGGCCAAGCTGGTGGAGCTGT ACCGCATAGTCGTGTACCTTGGCACCTCCCTGGGCAACATCACCCGGGAC CAGAAGATCCTCAACCCCAGTGCCCTCAGCCTCCACAGCAAGCTCAACGC CACCGCCGACATCCTGCGAGGCCTCCTTAGCAACGTGCTGTGCCGCCTGT GCAGCAAGTACCACGTGGGCCATGTGGACGTGACCTACGGCCCTGACACC TCGGGTAAGGATGTCTTCCAGAAGAAGAAGCTGGGCTGTCAACTCCTGGG GAAGTATAAGCAGATCATCGCCGTGTTGGCCCAGGCCTTCTAGCAGGAGG を有するpHGLIFBam1からなるクローン群から
選ばれる核酸プローブとハイブリダイズする、請求項5
記載の組換えDNA分子。 - 【請求項7】 上記ポリペプチドが、 (a)M1骨髄性白血病細胞の増殖を抑制し得ること、 (b)M1細胞またはマウスマクロファージの特定の細胞
レセプターの結合についてマウスLIFと競合し得るこ
とを特徴とする、LIF活性を有するポリペプチドをコ
ードする請求項5記載の組換えDNA分子。 - 【請求項8】 複製開始点を更に含み、それにより上記
分子をクローニングベクターとしての使用に適したもの
とする、請求項5〜7のいずれか1項記載の組換えDN
A分子。 - 【請求項9】 上記ヌクレオチド配列に機能可能に結合
するプロモーター配列を更に含み、それにより上記分子
を発現ベクターとしての使用に適したものとする、請求
項8記載の組換えDNA分子。 - 【請求項10】 アミノ酸配列: 【化6】 ProLeuProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGlyAsn LeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAlaAsnAlaLeuPhe IleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsnAsnValGluLysLeuCysAla ProAsnMetThrAspPheProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuVal GluLeuTyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGln LysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspVal MetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHis ValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeu GlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAlaPhe を有するヒト白血病抑制因子(LIF)、または、上記
アミノ酸配列中の1個またはそれ以上のアミノ酸が欠
失、置換または付加したLIF活性を有するその誘導体
をコードする組換えDNA分子。 - 【請求項11】 請求項4〜10のいずれか1項に記載
の組換えDNA分子で形質転換された宿主細胞。 - 【請求項12】 酵母細胞、哺乳動物細胞または他の真
核細胞である、請求項11記載の宿主細胞。 - 【請求項13】 原核細胞である、請求項11記載の宿
主細胞。 - 【請求項14】 LIF活性を有するポリペプチドの製
造方法であって、(a)請求項11〜13のいずれか1項
に記載の宿主細胞を用い、(b)上記細胞を、LIF活性
を有するポリペプチドの発現を誘導する条件下に培養
し、(c)上記ポリペプチドを回収することを含む方法。 - 【請求項15】 ポリペプチドが、 【化7】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeuPro IleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGlyAsn LeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAlaAsn AlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsnAsn ValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPheProSerPheHisGly AsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeuTyrArgMetValAlaTyr LeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGlnLysValLeuAsnPro ThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspValMetArg GlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgValGly HisValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPheGln ArgLysLysLeuGlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSer ValValValGlnAlaPhe; および ProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGly AsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAla AsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsn AsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPheProSerPheHis GlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeuTyrArgMetValAla TyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGlnLysValLeuAsn ProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspValMet ArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgVal GlyHisValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPhe GlnArgLysLysLeuGlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIle SerValValValGlnAlaPhe * * * から選ばれるアミノ酸配列と相同である成熟ポリペプチ
ドを含むものである、請求項14記載の方法。 - 【請求項16】 ポリペプチドが下記のアミノ酸配列: 【化8】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHis GlyAsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGly SerAlaAsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluPro PheProAsnAsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPhe ProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeu TyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArg AspGlnLysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeu AsnAlaThrIleAspValMetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCys ArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHisValAspValProProVal ProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeuGlyCys GlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAla Phe * * * と相同である成熟ポリペプチドを含むものである、請求
項14記載の方法。 - 【請求項17】 ポリペプチドが宿主細胞によってグリ
コシル化されているものである、請求項14〜16のい
ずれか1項記載の方法。 - 【請求項18】 宿主細胞が酵母細胞である、請求項1
7記載の方法。 - 【請求項19】 プロモーターが、ガラクトース誘導ハ
イブリッドGAL−CYCプロモーターである、請求項
14〜16のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項20】 上記ポリペプチドが、ポリペプチドの
分泌を目的とするリーダー配列を更に含むものである、
請求項14〜16のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項21】 リーダー配列が、クルイヴェロミセス
・ラクティスのキラー毒素から誘導されるものである、
請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 宿主細胞が、サッカロミセス・セレビ
シアエである、請求項18記載の方法。 - 【請求項23】 宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請
求項14〜16のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項24】 宿主細胞が、レトロウイルス発現ベク
ターで形質転換されたものである、請求項23記載の方
法。 - 【請求項25】 ベクターが、モロニーマウス白血病ウ
イルスから誘導されたものである、請求項24記載の方
法。 - 【請求項26】 ベクターが、骨髄増殖性肉腫ウイルス
のLTRエンハンサーを更に含むものである、請求項2
5記載の方法。 - 【請求項27】 上記ベクターが、天然LIFmRNA
の3'非翻訳領域を欠くものである、請求項26記載の
方法。 - 【請求項28】 宿主細胞が、造血細胞である、請求項
23記載の方法。 - 【請求項29】 宿主細胞が、E.coli細胞である、請
求項14〜16のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項30】 ベクターが、グルタチオンS−トラン
スフェラーゼ/LIF融合タンパク質の発現を目的とす
るベクターである、請求項29記載の方法。 - 【請求項31】 ベクターが、グルタチオンS−トラン
スフェラーゼ/トロンビン分解部位/LIF融合タンパ
ク質の発現を目的とするベクターである、請求項30記
載の方法。 - 【請求項32】 請求項14〜16のいずれか1項に記
載の方法により製造され、LIF活性を有するポリペプ
チド。 - 【請求項33】 請求項5に記載のDNA分子によって
コードされているアミノ酸配列を含み、LIF活性を有
するポリペプチド。 - 【請求項34】 マウスLIFのアミノ酸残基179〜
187個を含み、LIF活性を有するポリペプチド。 - 【請求項35】 天然由来マウスLIFの最初から少な
くとも3個のアミノ酸残基を欠くN−末端を有する、L
IF活性を有するポリペプチド。 - 【請求項36】 請求項1または2に記載のポリペプチ
ドを含む、医薬的に許容され得る形態の骨髄性白血病細
胞増殖阻害剤。 - 【請求項37】 薬学的担体および/または希釈剤と組
み合わせた、請求項1、2、32および33のいずれか
1項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。 - 【請求項38】 請求項5に記載のDNA分子によって
コードされた成熟ポリペプチドを含む、請求項37記載
の組成物。 - 【請求項39】 アミノ酸配列: 【化9】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHis GlyAsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGly SerAlaAsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluPro PheProAsnAsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPhe ProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeu TyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArg AspGlnLysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeu AsnAlaThrIleAspValMetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCys ArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHisValAspValProProVal ProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeuGlyCys GlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAla Phe * * * と全く相同である成熟ポリペプチドを含むものである、
請求項37記載の組成物。 - 【請求項40】 少なくとも1種の他の生物学的血球調
節物質を更に含むものである、請求項37記載の組成
物。 - 【請求項41】 上記他の調節物質が、G−CSFまた
はGM−CSF活性を有するポリペプチドである、請求
項40記載の組成物。 - 【請求項42】 pLIF7.2b: 【化10】 CACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGC CACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCA AGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCC TATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATG TGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGA AGACCAACTTGGTGGAGCTGTATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCC CTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAG CCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCA GCAATGTGCTTTGCCGTCTGTGCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGAT GTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAA GTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAAGCAAG pLIFNK3: 【化11】 GAATTCCGGAGTCCAGCCCATAATGAAGGTCTTGGCCGCAGGGATTGTGC CCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAGAGAGGAGGTCTTGAAT GTACCATGGACTGAGGGACCTCAGGAGCAGGATCCGGAGGTGGGGAGGGG GCTCAAAATGTGCTGGGGTTTGGGACATTGTTAAATGCAAAACGGGGCTG CTGGCAGACCCCAGGGATTTCCAGGTACTCACTGCACTCTGGGCTGGGCC ATGATGGAATCTGGCAAAGTTGAAACTTCCATAGGCAGAGCTTCTATACA GCCCAGCACCAGCTAGAAATGGCAATGAGGGTGTTGGTCTGAGAGATTTC TGTCTCACTCACTCACTCACTCACTCTCACTCACTCACTCACTCACTCAC TCAGCCCCTTGCTTGCTGGGTGTAGAACAAGCTGCCACAAGTTGTCTACA GCAGACAGCAAAGGGCTGGGAAGTGTCCTAGACCCCTACAGAGTCACCAT CATCTGGTCCTTTGCTGTCTCTCAGAGAAACTTTGGAAGGCTTGGTTGGG ATGTGAGAGAGCTAAGGGGACTGGGATCCAGAAGGAATCCTTTTATTTTA TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATAAGTTTTGTGGGTGGAAGG GTACCCTGGGGTGGAATGATGGAATGTGTCTTCTCTTGAGTTGGATGAGA GAGTTCAGGCTTAGAGACTGTCAGATGGAAGAGTCTACCTCACCAGTGTT CAGCTCCCACAGAAGCACAGCGGCCAGCTTCCAGTTGTCAAAGCCT-ACG AACTCGGTTAGCTTCTATGCAGTTCCCCCCACAGCCTGGCGTGGTTGGGG TCTGCCAGCTGGACCTAGAGGTGAGGTGTGTGGAATTC pLIFNK1: 【化12】 GCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATAC AAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG および、pHGLIFBam1: 【化13】 GGGATTGTGCCCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCA GGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATAC GCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAA CTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCCTAT TACACAGCTCAAGGAGAG CCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTT CCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGT ATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGAC CAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGC TACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGTGCTTTGCCGTCTGT GCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCAC TCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGG GACATACAAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG-AG-AGG からなるクローン群から選ばれる配列に対応する、少な
くとも1種の核酸配列を含む、診断用試薬またはプロー
ブ。
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