JPH07138292A - マウス白血病抑制因子 - Google Patents

マウス白血病抑制因子

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JPH07138292A JP6151184A JP15118494A JPH07138292A JP H07138292 A JPH07138292 A JP H07138292A JP 6151184 A JP6151184 A JP 6151184A JP 15118494 A JP15118494 A JP 15118494A JP H07138292 A JPH07138292 A JP H07138292A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 マウス白血病抑制因子に関する発明を提供す
るものである。 【構成】 分離・精製されたマウス白血病抑制因子（Ｌ
ＩＦ）、マウス組換えＬＩＦ、マウス組換えＬＩＦの精
製方法、マウスＬＩＦコード化ＤＮＡ分子アミノ酸配列
コード化組換えＤＮＡ分子、形質転換宿主細胞、ポリペ
プチドの製造方法、ＬＩＦ活性ポリペプチド、アミノ酸
配列を含むＬＩＦ活性ポリペプチド、白血病細胞増殖阻
害剤および医薬組成物、診断用試薬またはプローブ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、白血病抑制性因子（Ｌ
ＩＦ）、実質的に純粋な形態のＬＩＦの製法、並びに組
換ＬＩＦのクローニングおよび発現に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】成熟
血球は、幼弱前駆細胞のクローン増殖および付随する分
化によって生成する［メトカルフ（Metcalf，D.）、
（１９８４）、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・ス
ティミュレーティング・ファクターズ（The Hemopoieti
c Colony Stimulating Factors）、エルセヴィール（El
sevier）、アムステルダム（Amsterdam）］。正常な造
血細胞には、増殖および分化の２過程が密接に関連して
おり、従って短命な成熟細胞が連続的に補充される。少
なくとも４種の生化学的に異なる成長因子、すなわちコ
ロニー刺激因子（ＣＳＦ）（Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦおよびMulti−ＣＳＦ（ＩＬ−３））が、
イン・ビトロで顆粒球およびマクロファージの前駆細胞
の増殖および分化を促進することがわかっている［メト
カルフ、（１９８７）、プロシーディングス・オブ・ザ
・ロイヤル・ソサイアティ・オブ・ロンドン、シリーズ
Ｂ（Proc. R. Soc. B.）、２３０、３８９〜４２３］。
【０００３】正常細胞と比べて、白血病性骨髄細胞は、
増殖および分化が切り離されており、幼弱前駆細胞が蓄
積し、その増殖能を保持し、分化しないという特徴を有
する。イン・ビトロで骨髄性白血病細胞の分化を誘導し
得る生物学的因子の性質、および特定の因子が増殖を伴
わずに分化を誘導し得るかどうかに関する議論がさかん
であった。増殖および分化には、異なる因子の介在が必
須であることが提案されている［サッチス（Sachs，
L.）、（１９８２）、ジャーナル・オブ・セルラー・フ
ィジオロジー（J. Cell. Physiol.）補遺、１、１５１
〜１６４］。一方では、２つのグループが、マウス骨髄
性白血病細胞系Ｍ１の分化を誘導し得、正常前駆細胞の
増殖を促進しない活性物質（ＭＧＩ−２またはＤ−因
子）について記載し、これを精製した［リプトン（Lipt
on，Ｊ．Ｈ.）およびサッチス、（１９８１）、ビオヒ
ミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochem. Biophy
s. Acta.）、６７３、５５２〜５６９；トミダ（Tomid
a．M.)、ヤマモト−ヤマグチ（Yamamoto-Yamaguchi,
Y.）およびホズミ（Hozumi，M.）、（１９８４）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.）、２５９、１０９７８−１０９８２］。他方
では、本発明者らが、ＣＳＦの１種であるＧ−ＣＳＦ
が、マウス骨髄性白血病細胞系ＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ+が強
力な分化誘導促進物質であり、かつ正常細胞の増殖およ
び分化の促進物質でもあることを既に示している［ニコ
ラ（Nicola, N. A.）、メトカルフ、マツモト（Matsumo
to, M.）およびジョンソン（Johnson, G. R.）、（１９
８３）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、２５８、９０１７〜９０２３］。更に、トミダら
［トミダ、ヤマモト−ヤマグチ、ホズミ、オカベ（Okab
e，T.）およびタカカ（Takaka，F.）、（１９８６）、
フェブス・レターズ（FEBS Lett.）、２０７、２７１
〜２７５］は、組換Ｇ−ＣＳＦも、Ｍ１細胞のマクロフ
ァージ分化を誘導し得ることを示している。これらの因
子間の関連は、論争の的であった。腫瘍壊死因子α（Ｔ
ＮＦα）はヒト骨髄芽球細胞系ＭＬ−１の分化を促進し
得るという知見［タケダ（Takeda，K.）、イワモト（Iw
amoto，S.）、スギモト（Sugimoto，H.）、タクマ（Tak
uma，T.）、カワタニ（Kawatani，N.）、ノダ（Noda，
M.）、マサキ（Masaki，A.）、モリセ（Morise，H.）、
アリムラ（Arimura，H.）およびコンノ（Konno，K.）、
（１９８６）、ネイチャー（Nature）、３２３、３３８
〜３４０］によって、状況は更に複雑なものとなった。
【０００４】これらのグループのデータの不一致を解明
するための試みにおいて、本発明者らは、従来の種々の
研究に用いられたクレブスII腹水癌細胞を培養したなら
し培地を生化学的に分別し、正常前駆細胞に対してもＷ
ＥＨＩ−３Ｂ Ｄ+細胞に対しても活性な真正Ｇ−ＣＳＦ
およびＧＭ−ＣＳＦだけでなく、生化学的には異なるが
機能的には同様の、Ｍ１細胞の分化を誘導し得る２種の
因子をも含むことを示した。後者の因子は、イン・ビト
ロでＭ１白血病細胞の増殖を抑制する能力を有するの
で、白血病抑制性因子（ＬＩＦ）−ＡおよびＬＩＦ−Ｂ
と呼ばれ、これらはＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ+細胞の分化を誘
導せず、正常顆粒球／マクロファージ前駆細胞の増殖を
促進しないことがわかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明において、ＬＩＦ
は、以下の２つの性質を有する分子として定義される：
（１）白血病細胞の分化に関連して、骨髄性白血病細
胞、例えばＭ１細胞の増殖を抑制する能力を有し、
（２）本発明において記載するマウスＬＩＦまたはヒト
ＬＩＦの特定の配列を有する分子と、Ｍ１細胞またはマ
ウスもしくはヒトマクロファージの特異的な細胞レセプ
ターへの結合について競合する。ＬＩＦは、種々の形態
の骨髄性白血病を抑制する非増殖性治療剤として、並び
にマクロファージの機能および感染に対する他の応答を
改良する試薬、およびこれらに関する臨床試験および研
究用の試薬として使用する可能性を有する。
【０００６】本発明において、「ＬＩＦ活性を有するポ
リペプチド」とは、前記のようなＬＩＦの性質を有する
ポリペプチドまたはグリコポリペプチドを意味し、本発
明において開示するマウスまたはヒトのＬＩＦのアミノ
酸配列と完全にまたは部分的に相同のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを包含するが、これに限定されるもの
ではない。前記ＬＩＦの性質を有するものであれば、マ
ウスまたはヒトのＬＩＦのアミノ酸配列の一部のみと完
全にまたは部分的に相同のポリペプチドをも包含する。
更に、宿主細胞において発現によって生成し、発現時に
は不活性であるが、宿主細胞によって処理されて活性分
子となるポリペプチドまたはグリコポリペプチド、並び
に発現時には不活性であるが、イン・ビトロまたはイン
・ビボで選択的に分解されて活性分子となるポリペプチ
ドまたはグリコポリペプチドをも包含する。
【０００７】マウスＬＩＦは、以下のような生物学的性
質を有する分子である： （ａ）マウス骨髄性白血病細胞系Ｍ１の細胞において、
増殖能の喪失およびそのクローン原白血病細胞の死滅を
伴ってマクロファージ分化を誘導し、作用はＧ−ＣＳＦ
によって増強される。
【０００８】（ｂ）Ｍ１細胞、並びに腹腔、脾臓および
骨髄からの正常マウス単球およびマクロファージの高親
和性レセプター（マクロファージ成熟または機能的活性
化につれてレセプターの数は増加する。）に選択的に結
合するが、それらの組織からの顆粒球、赤血球またはリ
ンパ球には結合しない。
【０００９】（ｃ）125Ｉ−ＬＩＦの、高親和性レセプ
ターへの特異的結合は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Mu
lti−ＣＳＦ（インターロイキン−３）、Ｍ−ＣＳＦ、
インターロイキン１、２、４もしくは６、内毒素または
種々の他の成長因子と競合しないが、ラベルされていな
いＬＩＦとは競合する。
【００１０】（ｄ）正常または麻酔マウスの血清中の菌
体内毒素により上昇するが、内毒素耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ
マウスにおいては上昇しない。
【００１１】（ｅ）肺、唾液腺、腹膜細胞および骨幹を
含む種々の組織によって生成する。
【００１２】（ｆ）ＣＳＦの不存在下に成長する場合
の、イン・ビトロでの、正常顆粒球−マクロファージ前
駆細胞の生存時間を短縮する。
【００１３】（ｇ）ＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ+マウス骨髄性白
血病細胞、ＧＭ−ＣＦＳまたはMulti−ＤＳＦを発現す
るレトロウイルスの感染によって形質転換して白血病誘
発性となったマウス骨髄細胞、マウス白血病細胞系ＷＥ
ＨＩ２６５およびＷＥ１９の増殖を抑制するか、または
分化を誘導する能力は無い。
【００１４】（ｈ）顆粒球、マクロファージ、好酸球、
巨核球、赤血球および肥満細胞系の正常前駆細胞の増殖
を促進する能力が無く、正常顆粒球、マクロファージ、
巨核球、好酸球または天然細胞毒性細胞の前駆細胞のク
ローン増殖を抑制するか、またはイン・ビトロにおける
ＣＳＦによる促進に対する定量的応答、もしくは連続細
胞系３２ＣＤ１.１３およびＦＤＣＰ−１の細胞の増殖
を変える能力が無い。
【００１５】（ｉ）特異的細胞レセプターへの結合を、
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のヨウ化誘導体
と競合する能力が無い。ただし、Ｇ−ＣＳＦは、Ｍ１お
よびＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ+マウス骨髄性白血病細胞におい
て分化を誘導し、ＬＩＦのＭ１細胞に対する作用を増強
する能力を有する。
【００１６】（ｊ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対して特
異的に上昇する抗血清によってＬＩＦ活性が阻害される
ことが無い。
【００１７】（ｋ）マウスＬＩＦの転写が、ＬＢ３およ
びＥ９.Ｄ４Ｔ細胞の細胞質の構成成分として存在し、
これら細胞中の細胞内のレクチン・コンカナバリンＡに
よって誘導されず、他の多くの種類の細胞中に存在す
る。
【００１８】マウスＬＩＦは、以下のような性質をも有
する： （ｌ）還元剤（２−メルカプトエタノールまたはジチオ
トレイトール）存在下または不存在下にドデシル硫酸ナ
トリウムを含有する８〜２５％勾配ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定した分子量５８,０００±５,
０００、エンドグリコシダーゼ（Ｎ−グリカナーゼ）に
よる処理後の分子量２３,０００±５,０００の単一のサ
ブユニットの糖タンパク質である。 （ｍ）等電点８.６〜９.３である。 （ｎ）主要なアミノ酸配列は、第１０図、第１１図およ
び第１５図に示す通りである。 （ｏ）第１０図、第１１図および第１５図に示すヌクレ
オチド配列によってコード化されている。 （ｐ）特異活性１〜２×１０8ユニット／ｍｇ（５０ユ
ニットとは、１ｍｌ中でＭ１骨髄性白血病細胞によるク
ローン形成の５０％の減少を導くＬＩＦの量であると定
義する）である。 （ｑ）第１９図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られたマウス染色体１１上の特有の遺伝子
によってコード化されている（マウス／チャイニーズ・
ハムスター卵巣体細胞ハイブリッドのパネルの分析によ
り決定）。 （ｒ）第２７図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位
によって区切られた染色体ＤＮＡ中のヒト遺伝子配列と
相同である。
【００１９】ヒトＬＩＦは、天然および／または酵母誘
導組換体の以下のような生物学的性質を有する分子であ
る： （ａ）マウス骨髄性白血病細胞系Ｍ１の細胞において、
増殖能の喪失およびクローン原白血病細胞の死滅を伴っ
てマクロファージ分化を誘導する。 （ｂ）顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球系
の正常ヒト前駆細胞の増殖を促進する能力は無い。 （ｃ）Ｇ−ＣＳＦと組み合わせると、ヒト白血病細胞系
Ｕ９３７の細胞の増殖を部分的に抑制し、ＧＭ−ＣＳＦ
と組み合わせると、ヒト白血病細胞系Ｕ９３７およびＬ
Ｈ６０の増殖を抑制する能力を有する。 （ｄ）Ｍ１細胞およびマウスマクロファージのマウスＬ
ＩＦレセプターに特異的に結合し、そのような細胞に対
するマウス125Ｉ−ＬＩＦの結合と完全に競合する。 （ｅ）ヒト肝癌細胞系Ｈｅｐ−２Ｇの特異的細胞レセプ
ターに結合する。 ヒトＬＩＦは、以下のような性質をも有する： （ｆ）成熟タンパク質中のアミノ酸残基の約８０％がマ
ウスＬＩＦと同じである。 （ｇ）主要なアミノ酸配列は、第２５図、第２６図およ
び第２９図に示す通りである。 （ｈ）第２７図に示すように制限エンドヌクレアーゼ分
解部位によって区切られた染色体ＤＮＡ中特有の遺伝子
によってコード化されている。 （ｉ）遺伝子配列の一部として、第２５図に示すヌクレ
オチド配列を有する。
【００２０】本発明の第１の態様においては、白血病抑
制性因子(ＬＩＦ)を実質的に純粋な形態で提供する。本
発明は、実質的に純粋なＬＩＦの製法、とりわけ、クレ
ブスII腹水癌細胞から精製することによる実質的に純粋
なマウスＬＩＦの製法、およびヒト膀胱癌細胞系５６３
７(ＡＴＣＣ Ｎo．ＨＴＢ９)から精製することによる実
質的に純粋なヒトＬＩＦの製法をも提供する。実質的に
純粋なＬＩＦは、ＬＩＦのアミノ酸配列またはその一部
をコード化する組換ＤＮＡ分子を含む酵母細胞、哺乳動
物細胞および大腸菌のような宿主細胞から製造すること
もできる。
【００２１】本発明において、「実質的に純粋な形態」と
は、適当なドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動すると、少なくとも９０％が、ＬＩＦ
活性に対応した単一のバンドとして現れるポリペプチド
またはグリコポリペプチドの形態を意味する。
【００２２】他の態様においては、完全にまたは部分的
にＬＩＦタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を
有する組換ＤＮＡクローンの単離方法を提供する。本発
明は、ＬＩＦ固有のアミノ酸配列をコード化し、更に、
ＬＩＦの完全なアミノ酸配列を推定させるヌクレオチド
配列にも関する。
【００２３】更に他の態様においては、本発明は、ＬＩ
Ｆ(または実質的に同様のその類縁体)をコード化する前
記ヌクレオチド配列を完全にまたは部分的に有し、その
ヌクレオチド配列がＬＩＦを完全にまたは部分的に合成
および製造できる形態である組換ＤＮＡ分子にも関す
る。本発明のこの態様は、クローニングベクター(例え
ばプラスミド)および前記組換ＤＮＡ分子が挿入された
宿主細胞にも関する。更に、本発明は、前記組換ＤＮＡ
分子の発現またはペプチド合成によって、完全もしくは
部分的に合成されたＬＩＦ、または実質的に同様のその
類縁体にも関する。
【００２４】ＬＩＦに関する本発明の研究において、と
りわけマウスおよびヒト由来のこの糖タンパク質の他の
原料を、臨床的用途および他の用途に使用可能にすると
いう観点から、クレブスII腹水癌細胞から有効な精製方
法によってマウスＬＩＦを精製し、これを、この因子の
化学的または生合成的製造のための最初の過程として、
部分的なアミノ酸配列分析に付した。
【００２５】レセプター競合アッセイにおいて、Ｉ125
で放射性ラベルしたＬＩＦを使用して、ＬＩＦを合成お
よび製造するマウスおよびヒト由来の細胞および組織を
同定した。この試験の結果、これらの原料の１種のmＲ
ＮＡによるＤＮＡコピーの組換ＤＮＡライブラリーをス
クリーニングし、予め決定したマウスＬＩＦアミノ酸配
列の部分をコード化する放射性ラベルされたオリゴヌク
レオチドと共にハイブリッド形成することによって、マ
ウスＬＩＦ−コード化クローンを同定し、そのマウスＬ
ＩＦcＤＮＡクローンをヌクレオチド配列分析に付し
た。更に、クローン化マウスＬＩＦコード化配列を、ハ
イブリッド形成プローブとして使用して、マウスＬＩＦ
類縁体をコード化するヒト遺伝子を同定し、前記種交差
性ハイブリッド形成を有効に行うことのできるハイブリ
ッド形成条件を確立した。その結果、ヒトのマウスＬＩ
Ｆ類縁体をコード化するＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ
クローンが同定された。
【００２６】このようなＬＩＦ−コード化配列の確立の
結果、クローン化されたマウスまたはヒトのＬＩＦ−コ
ード化ＤＮＡ配列を用いて、培養哺乳動物細胞、酵母ま
たはバクテリアにおいてクローン的に純粋なＬＩＦを完
全にまたは部分的に合成するための組換ＤＮＡ分子が構
成された。本発明は、このようにして製造される実質的
に純粋なＬＩＦにも関する。
【００２７】本発明の一態様においては、本発明は、酵
母細胞、繊維芽細胞および大腸菌におけるクローン化さ
れたヒトおよびマウスのＬＩＦ遺伝子の発現、そのよう
に発現するためのクローン化遺伝子の修飾、並びに組換
ヒトおよびマウスＬＩＦの生物学的および生化学的性質
の確立に関する。
【００２８】この態様においても、本発明は、完全にま
たは部分的にヒトまたはマウスＬＩＦ(または実質的に
同様のその類縁体)をコード化するヌクレオチド配列を
有し、そのヌクレオチド配列により酵母細胞、繊維芽細
胞または大腸菌において完全にまたは部分的にヒトまた
はマウスＬＩＦが合成および製造される形態の組換ＤＮ
Ａ分子に関する。本発明は、クローニングベクター(例
えばプラスミド)および前記のような組換ＤＮＡ分子を
挿入された宿主細胞をも提供する。更に、本発明は、酵
母細胞におけるそのような組換ＤＮＡ分子の発現によっ
て、完全にまたは部分的に合成されたヒトまたはマウス
ＬＩＦ、または実質的に同様のその類縁体にも関する。
ＬＩＦに関する本発明の研究の一態様において、ヒトお
よびマウスＬＩＦ遺伝子配列を修飾し、酵母発現ベクタ
ーＹＥpseclに組み入れた。酵母細胞は、その組換体で
形質転換され、そのように形質転換された酵母細胞のな
らし培地は、天然ヒトおよびマウスＬＩＦと同様の生物
学的性質を有する因子を含有することがわかった。
【００２９】骨髄性白血病患者および感染症患者の処置
におけるＬＩＦの使用の可能性の観点から、本発明は、
完全または部分的に、例えばクローン化ＬＩＦ−コード
化ＤＮＡ配列を用いてまたは化学的合成によって製造さ
れたＬＩＦ、とりわけヒトＬＩＦを含有する薬剤組成
物、並びに例えば化学合成によって、または前記クロー
ン化ＬＩＦ−コード化ＤＮＡ配列の突然変異によって製
造されたＬＩＦ類縁体の薬剤組成物にも関する。本発明
の薬剤組成物は、少なくとも１種の他の生物学的血球レ
ギュレーター、例えばＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦを
も含有し得る。更に、本発明は、血球形成疾患、例えば
白血病および感染の疑いのある先天性疾患におけるヒト
ＬＩＦ遺伝子の関連した遺伝子移動、変化または障害の
検出に使用するための診断用試薬にも関する。
【００３０】実施例１ 第１〜５図は、以下に記載する精製法の種々の工程に関
し、各分別工程におけるＬＩＦの貯留部およびその純度
を示す。第１図 ：ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６ＢによるＬＩ
Ｆの精製の工程２に関する。バーは、工程３のためにプ
ールされるフラクションを示す。第２図 ：レンチル（Lentil）・レクチン・セファロース
４ＢによるＬＩＦの精製の工程３に関する。バーは、工
程４のためにプールされるフラクションを示す。第３図 ：ＣＭ−セファロースＣＬ−６ＢによるＬＩＦの
精製の工程４に関する。バーは、工程５のためにプール
されるフラクションを示す。第４図 ：脂肪酸分析ＨＰＬＣカラムによるＬＩＦの精製
の工程５に関する。アセトニトリル３９.６〜４１.３％
のフラクションをプールする。第５図 ：精製したＬＩＦの分子量および純度を示す。上
図は、８〜２５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上の、
タンパク質標準（分子量９３,０００；６７,０００；４
３,０００；３０,０００；２０,０００および１４,００
０）および精製ＬＩＦ（２調製）の泳動を示す。タンパ
ク質および生物学的活性はいずれも分子量５８,０００
のタンパク質に関連している。
【００３１】工程１ クレブスII癌細胞(１×６6)を、Ｃ５７Ｂ１６／６fj／
ＷＥＨＩマウスに腹腔内注射し、７日後にマウスを殺
し、腹水を採った。細胞を遠心し、大腸菌リポポリサッ
カライド(２００ng／ｍｌ)を含有するダルベッコ改良イ
ーグル培地に細胞５×１０6個／ｍｌを再懸濁させ、空
気中にＣＯ2を１０％含有する湿式インキュベーターで
３７℃で２４時間インキュベートする。細胞を再び遠心
し、ならし培地を採り、アジ化ナトリウムを０.０２％
(w／v)とし、４℃で貯蔵する。アミコン(Ａmicon)ＤＣ
２Ａ濃縮器でＨＩＰ１０−８中空繊維カートリッジを用
いてならし培地３６ｌを１００ｍｌに濃縮し、１mＭフ
ェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)、アジ化ナ
トリウム(０.０２％ w／v)およびトゥイーン(Ｔween)２
０(０.０２％ v／v)を含有するpＨ８.０の１０mＭトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液に入れ、アミコン撹拌容器でＹＭ−１
０メンブラン上で再び２０ｍｌに濃縮する。
【００３２】工程２ 濃縮物を、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ[ファルマシア(Ｐharmacia)]のカラム
(２.５×３０ｃｍ)に通し、平衡緩衝液２００ｍｌおよ
び次いで同じ緩衝液中の０.３ＭまでのＮaＣｌ直線勾配
４００ｍｌで溶出する。流速は２５ｍｌ／時であり５.
８ｍｌのフラクションを集めて、アッセイに付す。(第
１図参照)
【００３３】工程３ 勾配前段階でゲルに結合せず、マウスＭ１細胞に対する
活性を有するタンパク質のフラクションをプールし、Ｙ
Ｍ−１０メンブランで濃縮し、１mＭ ＭgＣｌ2、１mＭ
ＰＭＳＦ、０.２％アジ化ナトリウムおよび０.０２％ト
ゥイーン２０を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６.０）に入れ、同じ緩衝液で平衡化したレン
チル・レクチン−セファロース４(ファルマシア)のカラ
ム(１×４cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液２５ｍｌお
よび次いで同じ緩衝液中の０.５Ｍまでのα−メチル−
Ｄ−マンノピラノシド直線勾配１００ｍｌで、流速１０
ｍｌ／時で溶出する。３ｍｌのフラクションを集め、ア
ッセイに付す。(第２図参照)
【００３４】工程４ ゲルに結合し、糖で溶出され、Ｍ１細胞に対する活性を
有するタンパク質のフラクションをプールし、濃縮し、
１mＭ ＰＭＳＦ、０.０２％アジ化ナトリウムおよび０.
０２％トゥイーン２０を含有する１００mＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液(pＨ５.０)に入れ、同じ緩衝液で平衡化した
ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ(ファルマシア)のカラム
(１.０×４.０cm)に通す。カラムを、平衡緩衝液２５ｍ
ｌおよび次いで同じ緩衝液中の１.０ＭまでのＮaＣｌ直
線傾斜１００ｍｌおよび次いでＮaＯＨでpＨ１０に調節
した１.０Ｍ ＮaＣｌ２５ｍｌで溶出する。流速は２.０
ｍｌ／時であり、３.０ｍｌのフラクションを集める。
(第３図参照)
【００３５】工程５ ゲルに結合し、ＮaＣｌ勾配で溶出され、Ｍ１細胞に対
する活性を有するタンパク質のフラクションをプール
し、ＹＭ−１０メンブランで２ｍｌに濃縮し、０.０２
％トゥイーン２０を含有する２０mＭ酢酸アンモニウム
緩衝液(pＨ５.０)に入れ、０.４５μミリポア（Millipo
re）・フィルターで濾過する。ウォーターズ（Waters）
脂肪酸分析カラムおよび勾配プログラマー付き二重ポン
プを取り付けた高速液体クロマトグラフィー装置［ベッ
クマン（Beckman)］のインジャクターにプールを入れ
る。カラムを、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)０.１％(w／
v)を含有する水で平衡化し、試料を注入し、次いで水お
よび０.１％ＴＦＡ中の３４.８％(v／v)までのアセトニ
トリル５分直線勾配でカラムを溶出し、次いで水および
０.１％ＴＦＡ中の４９.８％(v／v)までのアセトニトリ
ル５０分直線勾配で溶出する。流速は１ｍｌ／分であ
り、１００mＭ炭酸水素アンモニウム５０μｌおよび０.
４％トゥイーン２０を含有するポリプロピレンチューブ
内に１ｍｌのフラクションを集める。(第４図参照)
【００３６】工程５で得られた、Ｍ１細胞に対して活性
を有するフラクションは、２つの重複する紫外吸収ピー
クを有していた。それぞれのピークは、Ｍ１細胞に対す
る活性に関連しており、それぞれ銀染色法によるドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル上のＭr５
８,０００の単一のタンパク質バンドに対応していた。
各場合において、（ＬＩＦも存在する）ゲルの平行のト
ラックを１ｍｍのストリップに切断し、ゲルストリップ
からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質の、半固
形寒天培地面内のＭ１細胞に対する増殖抑制および分化
誘導能力をアッセイして評価することにより、Ｍr５８,
０００のタンパク質バンドがＭ１細胞に対して生物学的
活性を有していることがわかった。（第５図参照）
【００３７】実施例２ 以下の実施例は、Ｎ−末端アミノ酸配列、およびトリプ
シンまたはブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼによるタンパク
質分解によって生じる種々のペプチドのアミノ酸配列を
調べる工程を説明する。実施例１の操作によって精製し
たＬＩＦ（１５μｇ）を、ブラウンリー（Brownlee）Ｒ
Ｐ３００ビーズ（Ｃ８）を充填したミクロボア（２ｍ
ｍ）カラムに通し、ＨＰＬＣ系において０.１％トリフ
ルオロ酢酸中の０〜６０％アセトニトリル直線勾配で溶
出した。タンパク質は、１００μｌの体積で単一のピー
クとして溶出された。これを、ガラスファイバーディス
クに適用し、乾燥させ、次いで、アプライド・バイオシ
ステム（Applied Biosystem）（モデル４７０Ａ）気相
タンパク質シークエンサーのシークエンス室に入れた。
エドマン法によりタンパク質の配列分析を行い、個々の
アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体を、アプラ
イド・バイオシステム１２０Ａ ＰＴＨアナライザーで
ＨＰＬＣによって同定した。
【００３８】前記操作により精製したＬＩＦの別の試料
（２０μｇ）を、６Ｍグアニジン塩酸塩、０.２Ｍトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.５)、２ｍＭジチオトレイト
ールで希釈して２ｍｌとし、３７℃で２時間インキュベ
ートした。次いで、３０倍モル過剰のヨード酢酸を加
え、溶液を３７℃で更に１５分間インキュベートした。
溶液を同じミクロボアＨＰＬＣカラムに通し、前記のよ
うに溶出した。還元され、カルボキシメチル化されたＬ
ＩＦ誘導体（ＲＣＭ−ＬＩＦ）は、未処理ＬＩＦの３分
後にカラムから溶出され、ＲＣＭ−ＬＩＦ（２００μ
ｌ）を、０.０２％トゥイーン２０、１ｍＭＣaＣｌ2お
よびＴＰＣＫ−処理トリプシン２μｇを含有する０.１
Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）で希釈して１ｍ
ｌとした。これを３７℃で１８時間インキュベートし、
混合物を再びミクロボアカラムに入れ、前記と同様に溶
出した。個々のペプチドはＵＶ吸収ピークとしてあらわ
れ、個々に集めた。これらのペプチドのいくつかは、前
記と同様に直接配列分析に付したが、他のものは同じカ
ラムで０.９％ＮaＣｌ（ｐＨ６.０）中の０〜６０％ア
セトニトリル勾配を用いて再精製した後に配列分析に付
した。
【００３９】ＲＣＭ−ＬＩＦの別の試料（２００μｌ＝
１０μｇ）を、０.００２Ｍ ＥＤＴＡおよび０.０２％
トゥイーン２０を含有する０.０５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７.８）で希釈して１ｍｌとし、黄色ブド
ウ球菌Ｖ８プロテアーゼ２μｇにより３７℃で１８時間
分解した。反応混合物を同じミクロボアカラムに通し、
前記のように溶出した。
【００４０】ＬＩＦを同定する、アミノ末端からの２６
個のアミノ酸の配列は以下の通りである： N-Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-Ile-
Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s
【００４１】数種のトリプシンペプチドのアミノ酸配列
は以下の通りである： １．His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Ly
s ２．Met-Val-Ala-Tyr … ３．Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys … ４．Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys ５．Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-Val-Ly
s ６．Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-
Leu-Phe-Leu-Val-Glu-Leu-Tyr… ７．Leu-Val-Ile-Ser-Tyr… ８．Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Se
r-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln ９．Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-Val-Met-Arg １０．Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-X-Gln-Ala-Phe
【００４２】Ｖ８プロテアーゼによるＬＩＦの分解によ
って生じるペプチドのアミノ酸配列は以下の通りであっ
た： Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gl
y-Thr-Tyr-Lys-Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-
Phe
【００４３】実施例３ 以下の実施例は、放射性ラベルしたＬＩＦを得るため、
およびレセプター競合アッセイによってＬＩＦ原を同定
するための工程を説明する。第６図は、実施例３に関す
る：０℃における、放射性ヨウ素化純ＬＩＦ（２×１０
5cpm／ng）の、Ｍ１骨髄性白血病細胞への結合。競合因
子の存在下または不存在下に、Ｍ１細胞（５×１０6）
を125Ｉ−ＬＩＦ（４×１０5cpm）と２時間インキュベ
ートし、その後、ウシ胎児血清の遠心によって、結合し
た放射能を未結合放射能から分離した。Ａ．非標識純Ｌ
ＩＦおよび競合因子としての純Multi−ＣＳＦ、ＧＭ−
ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦの、所定の希釈に
おける滴定（各希釈１０μｌを加えて最終体積８０μｌ
とした）。最高濃度は、それぞれ１０4ユニット／ｍ
ｌ；３.５×１０4ユニット／ｍｌ；３×１０4ユニット
／ｍｌ；５×１０4ユニット／ｍｌ；４×１０4ユニット
／ｍｌであった。Ｂ．純ＬＩＦまたはリポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）または種々の細胞の濃縮（４〜８倍）な
らし培地または内毒素注射マウスの血清の、前記125Ｉ
−ＬＩＦのＭ１細胞への結合を競合する能力。
【００４４】クレブスII腹水細胞ならし培地から実施例
１に記載のように精製したＬＩＦを、文献に記載の方法
でチロシン残基において125Ｉで放射性ラベルし［ニコ
ラ（Nicola，N.A.）およびメトカルフ、ジャーナル・オ
ブ・セルラー・フィジオロジー（J．Cell．Physio
l.）、１２８：１８０〜１８８、１９８６］、比放射能
約２×１０5cpm/ngの125Ｉ−ＬＩＦを調製した。125Ｉ
−ＬＩＦは、Ｍ１骨髄性白血病細胞並びにマウス成熟骨
髄、脾臓、胸腺および腹腔滲出細胞に特異的に結合し
た。細胞オートラジオグラフィー分析により、125Ｉ−
ＬＩＦは、マクロファージおよびその前駆細胞（細胞の
成熟につれてレセプター数が増加する）のみに特異的に
結合し、他の造血細胞には結合しなかったことがわかっ
た。このことは、ＬＩＦが、種々の疾病におけるマクロ
ファージ機能の調節のための臨床的適用に有用であり得
ることを示唆している。125Ｉ−ＬＩＦのＭ１骨髄性白
血病細胞および腹腔マクロファージへの特異的結合は、
非標識ＬＩＦによって阻害されたが、他の造血成長因
子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ（Ｃ
ＳＦ−１）、Multi−ＣＳＦ（インターロイキン３）、
インターロイキン１、２、４、６、内毒素または他の血
成長因子によっては阻害されなかった（第６図参照）。
細胞ならし培地または細胞抽出物は、そのような細胞へ
の125Ｉ−ＬＩＦの結合を阻害する能力を有するので、
種々の細胞および組織によって製造または貯蔵されるＬ
ＩＦの存在を特異的アッセイすることができる。例え
ば、レクチン活性化ＬＢ３ Ｔ細胞のならし培地は、125
Ｉ−ＬＩＦのＭ１細胞に対する特異的結合を強力に阻害
したので、ＬＢ３細胞はＬＩＦを製造することがわか
る。
【００４５】実施例４ 以下の実施例は、マウスＬＩＦをコード化するｍＲＮＡ
のクローン化相補的ＤＮＡコピーを得るための工程を説
明する。第７〜１０図は、以下に記載する方法の種々の
工程に関する。第７図：ＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロ
ーニングの工程１に関する。レクチン・コンカナバリン
Ａ刺激による、ＬＢ３細胞の細胞質における造血成長レ
ギュレーターのｍＲＮＡの蓄積。ＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ-細
胞の細胞質ポリアデニル化ＲＮＡ（５μｇ）（トラック
１）、５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを用いて１０6細
胞／ｍｌとして５時間培養したＴ細胞クローンＬＢ３細
胞（トラック２）、および非刺激ＬＢ３細胞（トラック
３）を、ホルムアミドアガロースゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、32Ｐ−ＧＭ−ＣＳＦプローブ
（パネル１）または32Ｐ−Multi−ＣＳＦプローブ（パ
ネルｂ）とハイブリッド形成した［ケルソ（Kelso，
A.）、メトカルフおよびゴー（Gough，N.M.）、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol.）、１３６：
１７１８〜１７２５、１９８６］。
【００４６】第８図：ＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロー
ニングの工程３に関する。：ＬＩＦクローンの同定に使
用した合成オリゴヌクレオチド。Ｎ−末端近傍のマウス
ＬＩＦアミノ酸の部分（残基１５〜２６、実施例２参
照）を最初の行に示し、このペプチドをコード化するｍ
ＲＮＡ配列の可能な組み合わせを次の行に示し、このｍ
ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを下
行に示す。Ｃｙｓ１７およびＨｉｓ１８を除く全てのア
ミノ酸残基について、このオリゴヌクレオチドは、哺乳
動物コード化領域に最も頻繁に使用されるコドンのみに
相補的である［グランサム（Grantham，R.）ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、
９４３〜７３、１９８１］。Ｃｙｓ１７については、こ
の配列はいずれのコドンにも相補的である。Ｈｉｓ１８
については、このオリゴヌクレオチドは、頻度の低いＣ
ＡＵコドンに相補的である。隣接するＧｌｙコドン（頻
度の低いＣｐＧジヌクオレオチド）と共に、ＣＡＣコド
ンが用いられることはないと考えられた［シュヴァルツ
（Swartz，M.N.）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J．Biol．Chem.）、２３８：１９６
１〜１９６７、１９６２］。
【００４７】第９図：ＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロー
ニングの工程４に関する。：第８図に示すオリゴヌクレ
オチドとのハイブリッド形成によるＬＩＦｃＤＮＡクロ
ーンの同定。
【００４８】第１０図：ＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロ
ーニングの工程５に関する。：ｃＤＮＡクローンｐＬＩ
Ｆ７.２ｂのヌクレオチド配列およびＬＩＦアミノ酸配
列。ｍＲＮＡ類似鎖の配列を、前記ＬＩＦの予想したア
ミノ酸配列と共に５'から３'に記載する；行の端の数
は、その行の最後の残基（アミノ酸またはヌクレオチ
ド）の位置を示す。アミノ酸配列は、このクローンにお
いてコード化された最初の残基から連続して番号を付け
た。タンパク質分析により決定したアミノ酸配列の領域
には上線を付した；これら２つの間には不一致がない。
Ｐｒｏ９は、直接アミノ酸分析（実施例２）により決定
されたＮ−末端残基であった。Ｎ−結合グリコシル化の
可能性のある７個の部位は星印で示し［ノイバーガー
（Neuberger，A.）ら、グリコプロテインズ（Glycoprot
eins）、ゴットシャルク（Gottschalk，A.）編、エルセ
ヴィール、アムステルダム、４５０〜４９０頁、１９７
２］、Ｏ−結合グリコシル化の可能性のある４個の部位
は井桁印で示す［タカハシ（Takahashi，N.）ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ（Proc．Natl．Acad．Sci.）、米国、
８１：２０２１〜２０２５、１９８４］。
【００４９】工程１：ＬＩＦｍＲＮＡ含有ＲＮＡの調製 クローン化マウスＴ細胞系ＬＢ３の細胞［ケルソおよび
メトカルフ、エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Expt
l．Hematol.）、１３：７〜１５、１９８５］を、レク
チン・コンカナバリンＡで６時間刺激して、造血細胞の
成長および分化を調整する種々の因子をコード化するｍ
ＲＮＡの細胞質における蓄積を向上した［ケルソ、メト
カルフおよびゴー、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
１３６：１７１８〜１７２５、１９８６］。（例えば、
第７図は、そのような刺激により、細胞中における造血
成長因子ＧＭ−ＣＳＦおよびMulti−ＣＳＦをコード化
するｍＲＮＡの製造が上昇することを示す。）細胞質Ｒ
ＮＡは、文献に記載の方法［ゴー、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（J．Mol．Biol.）、１６
５：６８３〜３９９、１９８３］で、５×１０８コンカ
ナバリンＡ−刺激ＬＢ３細胞から調製した。ポリアデニ
ル化ｍＲＮＡ分子は、標準的な方法［マニアティス（Ma
niatis，T.）ら、モレキュラー・クローニング（Molecu
lar Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー（Col
d Spring Harbor）、ニューヨーク、１９８２］によ
り、２サイクルのオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラ
フィーによりリボソームＲＮＡから分取した。
【００５０】後に、ノザン分析により、ＧＭ−ＣＳＦお
よびMulti−ＣＳＦのｍＲＮＡとは異なり、ＬＩＦｍＲ
ＮＡは、ＬＢ３細胞中に構成成分として存在し、その量
はコンカナバリンＡ刺激により向上しないことがわかっ
た［ギアリング（Gearing，D.P.）ら、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ
ャーナル（EMBO J.）、６：３９９５〜４００２、１９
８７］。
【００５１】工程２：ＬＢ３ｃＤＮＡ分子のライブラリ
ーの合成およびクローング 前記のように調製したＬＢ３ｍＲＮＡの２本鎖ＤＮＡコ
ピーを標準的な方法［マニアティスら、モレキュラー・
クローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、１９８２およびゴーら、ネイチャー（Natur
e）、３０９：７６３〜７６７、１９８４］で合成し
た。トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素で触媒され、オ
リゴ−ｄＴを用いる反応において、細胞質ポリアデニル
化ＬＢ３ｍＲＮＡ１０μｇを、１本鎖相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）合成の鋳型として使用した。この反応の完了
後、０.３Ｍ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃で
１時間インキュベートすることによってｍＲＮＡを分解
した。塩基を中和し、エタノール沈澱によってｃＤＮＡ
を回収した後、大腸菌ＤＡＮポリメラーゼIのクレノウ
フラグメントで触媒された反応において、１本鎖ｃＤＮ
Ａを２本鎖の形態に変換した。次いで、１本鎖特異的ヌ
クレアーゼＳ１で処理することにより、ｃＤＮＡの「ヘ
アピン・ループ」構造を切断し、酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ［マイケルソン（Michel
son，A.M.）およびオーキン（Orkin，S.）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Che
m.）、２５７：１４７７３〜１４７８２、１９８２］を
用いて、デオキシシチジン残基末端（残基約２０〜３
０）を２本鎖ｃＤＮＡの各端に付加した。ｄＣ−末端ｃ
ＤＮＡを、１.５％アガロースゲル電気泳動により分画
し、長さ５００ｂｐを越える分子を回収し、アニーリン
グしてプラスミドＤＡＮ分子（ｐＪＬ３、ゴーら、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼー
ション、４：６４５：６５３、１９８４）とし、これを
制限エンドヌクレアーゼＳａｃ１で切断し、それにデオ
キシグアノシン残基末端を付加した（マイケルソンおよ
びオーキン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２５７：１４７７３〜１４７８２、１９８
２）。末端付加ｃＤＮＡおよびプラスミド分子を文献に
記載の方法でアニーリングし［ゴーら、バイオケミスト
リー（Biochemistry）、１９：２７０２〜２７１０、１
９８０］、アニーリングしたｃＤＮＡ／プラスミド混合
物で大腸菌ＭＣ１０５０［カサダバン（Casadaban，
M.）およびコーヘン（Cohen，S.）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー、１３８：１７９〜２０
７、１９８０］を形質転換し、約５０,０００の独立し
て形質転換されたバクテリアコロニーを、１０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン含有寒天プレート上で増殖させて選択し
た。５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有液体増殖培地で洗
浄することにより、形質転換したバクテリアコロニーを
寒天プレートから回収し、１０％グリセロール中の１０
個のプールとして−７０℃で貯蔵した。
【００５２】工程３：オリゴヌクレオチド・プローブの
デザイン ＬＩＦのアミノ末端の２６個のアミノ酸配列と、トリプ
シンおよびＶ８プロテアーゼによるＬＩＦ分解により生
じる１１の異なるペプチドの残基とを決定した（実施例
２参照）。これらのアミノ酸配列は、ＬＩＦｍＲＮＡに
対応するｃＤＮＡクローンを同定するためのハイブリッ
ド形成プローブとして使用する、ＬＩＦをコード化する
ｍＲＮＡの特定の領域に相補的なオリドヌクレオチドの
デザインの基礎を供給した。
【００５３】各天然アミノ酸は、その対応するｍＲＮＡ
において、３個のリボヌクレオシドトリホスフェートの
特定の組み合わせ（コドン）によりコード化される［例
えば、ワトソン（Watson，J.）、モレキュラー・バイオ
ロジー・オブ・ザ・ジーン（Molecular Biology of the
Gene）、第３版、ベンジャミン／カミングス（Benjami
n/Cummings）、メンロ・バーク（Menlo Park）、カリフ
ォルニア、１９７６）］。あるアミノ酸は、唯一のコド
ンによってのみ特定されるが、６種ものコドンによって
特定されるアミノ酸もある（例えば、前掲のワトソン、
モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン）。従
って、ヌクレオチド配列の多数の異なる組み合わせが実
際に特定のアミノ酸配列をコード化するので、そのペプ
チドをコード化し得るすべての可能な配列を提供するた
めには多数の異なる退化オリドヌクレオチドが構成され
る必要がある。しかし、高度に退化したオリドヌクレオ
チドをハイブリッド形成プローブとして使用することは
技術的に困難である。しかし、特定のアミノ酸のために
すべてのコドンが等しい頻度で用いられているのではな
く［グランサムら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、９４３〜７３、１９８１］、哺乳動物のゲノムにお
いてＣｐＧジヌクレオチドは表現不十分であり、塩基組
み合わせから予想される頻度の２０〜２５％しか起こら
ない［シュヴァルツら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、２３８：１９６１〜１９６７、１
９６２］ので、特定のペプチドをコード化するあり得る
ヌクレオチド配列を予測し、特定のオリゴヌクレオチド
プローブの複雑さを軽減することがしばしば可能であ
る。前記のように考慮して、異なるＬＩＦペプチドに対
応する多数のオリゴヌクレオチドを標準的な方法によっ
てデザインおよび合成した。
【００５４】工程４：ＬＩＦ−コード化クローンのＬＢ
３ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によ
ってバクテリアのコロニーをスクリーニングするため
に、前記ＬＢ３ｃＤＮＡライブラリーの各プールからの
１０,０００〜１５,０００個のバクテリアコロニーを寒
天プレート（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）上で増
殖させ、ニトロセルロースフィルターディスクに移し、
フィルターを２００μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含
有寒天プレート上でインキュベートすることによって増
幅した［ハナハン（Hanahan，D.）およびメセルソン（M
eselson，M.）、ジーン（Gene）、１０：６３〜６７、
１９８０］。コロニーを元のプレート上で再増殖させた
後、第２のニトロセルロースフィルターを前記のように
調製した。このマスタープレートを短時間増殖させ、次
いで４℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡをバクテリアコ
ロニーから遊離し、前記のようにニトロセルロースフィ
ルターに固定した（マニアティスら、モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８２）。ハイブリッド形成の前に、０.９
Ｍ ＮａＣｌ、０.０９Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％
フィコル、０.２％ポリビニル−ピロリドン、０.２％ウ
シ血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌ熱変成サケ***ＤＮ
Ａ、５０μｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ、０.１Ｍ ＡＴＰお
よび２ｍＭピロリン酸ナトリウム中でフィルターを３７
℃で数時間インキュベートした。０.１％ＮＰ４０を更
に添加した同じ溶液中で、３７℃で１８時間ハイブリッ
ド形成を行った。ポリヌクレオチドキナーゼによって触
媒され、［γ−32Ｐ］ＡＰＴ５００μＣｉ（比活性２,
０００〜３,０００Ｃｉ／mmoｌ）を含有する反応におい
て、第８図に示す合成オリゴヌクレオチド５００ｎｇを
放射性ラベルした。次いで、ＮＡＣＳ−ＰＲＥＰＡＣカ
ラム［ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda
Research Laboratories）］をその製造者の指示に従っ
て使用したイオン交換クロマトグラフィーによって、取
り込まれなかった［γ−32Ｐ］ＡＰＴを、放射性ラベル
されたオリゴヌクレオチドから分離した。放射性ラベル
したオリゴヌクレオチドを、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で
ハイブリッド形成反応に用いた。ハイブリッド形成後、
０.９Ｍ ＮａＣｌ、０.０９Ｍクエン酸ナトリウム、０.
１％ドデシル硫酸ナトリウム中で種々の温度（以下に記
載する）でフィルターを広範囲に洗浄し、各洗浄後、オ
ートラジオグラフィーに付した。
【００５５】洗浄を連続的に行うことの背後にある根本
原理は、低温において、オリゴヌクレオチドと少しでも
相同性（約１５のヌクレオチド）を有する全てのクロー
ンが２重フィルター上にオートラジオグラフィーのスポ
ットとして現れることである。温度が上昇すると、オリ
ゴヌクレオチドプローブが相同性レベルの低いクローン
から融解し、それ故対応するオートラジオグラフィーシ
グナルが無くなる。相同性レベルの最も高いクローン
（すなわちＬＩＦｃＤＮＡ配列を有する可能性の最も高
いクローン）は、最も高い温度でハイブリッド形成を保
持する。この方法によって、最も可能性の高いクローン
を直接得ることが可能となる。第９図は、洗浄温度を４
６℃から６６℃℃に上昇した際の、１５,０００のＬＢ
３ｃＤＮＡクローンを含有する１対のフィルター上にお
ける１組のクローンの挙動を示す。いくつかのクローン
は、低温においてのみオリゴヌクレオチドへのハイブリ
ッド形成を保持したが、６６℃においてもハイブリッド
形成を保持したものもあった（例えばクローン１および
２）。更に分析するために後者のクローンを選択し、対
応するバクテリアコロニーをマスタープレートから取
り、生成し、標準的な方法で各バクテリアクローンから
プラスミドＤＮＡを調製した（マニアティスら、モレキ
ュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ー、１９８２）。これらのクローンの予備構造分析（挿
入ｃＤＮＡのサイズの評価、種々の制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位のマッピング、および異なるＬＩＦペプ
チドに対応する種々のオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成の試験による）によると、これらのクローンの
各々は実際には同じであった；すなわち、これらは、同
じクローニング例からの異なった単離物であった。従っ
て、唯一のクローンｐＬＩＦ７.２ｂについて更に詳細
な分析を行った。
【００５６】工程５：ｐＬＩＦ７.２ｂのヌクレオチド
配列の決定 ジデオキシ法［サンガー（Sanger，F.）ら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、７４：５４６３〜５４６７、１９７
７］によって、シークエンシング反応において、アルカ
リ性または熱変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として
使用し、そのｃＤＮＡに沿うベクター（ｐＪＬ３）の領
域にも、ｃＤＮＡインサート中の配列にも相補的な種々
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントおよび
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとし
て使用して、クローンｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡ部分
のヌクレオチド配列分析を行った。このように決定した
クローンｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡ部分の配列を、第
１０図に示す。このような分析により、終止コドンによ
って中断されていない全ｃＤＮＡに及ぶ唯一の翻訳リー
ディングフレーム中で、ＬＩＦ分子の種々のペプチドに
対して予め決定された全てのアミノ酸配列がわかり得る
ので、このクローンが、ＬＩＦ分子をコード化する能力
を有するｍＲＮＡのＤＮＡコピーを含有することが確認
された。しかし、このクローンは、（ａ）５'末端にお
いてメチオニンコドンによって開始される推定される疎
水性リーダー配列をコード化する領域を伸長せず、
（ｂ）３'末端においてイン−フレーム翻訳終止コドン
を含まないので、ＬＩＦコード化領域の完全なコピーを
含有する。しかし、成熟タンパク質をコード化する領域
の開始を５'末端において伸長することが、予め決定し
たアミノ末端アミノ酸配列との比較によりわかった（第
１０図のＰｒｏ９残基）。
【００５７】実施例５ 以下に、マウスＬＩＦコード化領域の全コピーを構成
し、このコード化領域を酵母発現ベクターに挿入し、マ
ウスＬＩＦを製造する工程を説明する。第１１図 ：酵母細胞におけるマウスＬＩＦの発現の工程
１に関する：ＬＩＦのＣ−末端アミノ酸配列。ｐＬＩＦ
７.２ｂリーディングフレームのＣ−末端におけるアミ
ノ酸配列を示し、その下にはブドウ球菌Ｖ８プロテアー
ゼおよびクレブス腹水癌細胞から精製されたＬＩＦから
誘導されるトリプシンペプチドの配列を示す。後２者の
ペプチドは、ｐＬＩＦ７.２ｂＬＩＦ配列に更に９個の
アミノ酸を加えたものであり、末端が同じ残基である。
クローンｐＬＩＦＮＫ１の対応する領域のヌクレオチド
およびアミノ酸配列は、最下行に示し、直接アミノ酸シ
ークエンシングによって決定されたＣ−末端を確認す
る。番号付けは第１０図の通りである。
【００５８】第１２図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
の発現の工程２に関する：酵母発現ベクターＹＥpsecl
に挿入するｐＬＩＦ７.２ｂｃＤＮＡの再構成。ｐＬＩ
Ｆ７.２ｂｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列およびそれ
によってコード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
番号付けは第１０図および第１１図に従う。第２行およ
び第３行は、それぞれｐＬＩＦmut１およびｐＬＩＦmut
２の配列を示す。星印は、終止コドンを示す。ＹＥpsec
l［バルダリ（Baldari，C.）ら、ヨーロピアン・モレキ
ュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナ
ル、６：２２９〜２３４、１９８７］およびｐＧＥＸ−
２Ｔ［スミス（Smith，D.B.）およびジョンソン（Johns
on，K.G.）、ジーン、１９８８]中にクローニングする
ための制限部位（ＢａｍＨI、ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏ
ＲI）を示す。最下行には、ＹＥpsecl中のクルイヴェロ
ミセス・ラクティスのキラー毒素シグナル配列の部分配
列を示す。ＢａｍＨI制限部位のＧｌｙ−Ｓｅｒコード
化配列は、シグナルペプチドによって有効に認識される
（バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６：２２９〜
２３４、１９８７）。
【００５９】第１３図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
発現の工程４に関する：Ｍ１白血病細胞の培養における
酵母誘導組換ＬＩＦの生物学的活性。酵母誘導組換ＬＩ
Ｆ（−●−）および精製天然ＬＩＦ−Ａ（−〇−）のＭ
１培養への滴定は、Ｍ１コロニーの分化（パネルＡ）お
よびコロニー生成の抑制（パネルＢ）の同様の濃度依存
性誘導を示す。各ポイントは、２培養の平均値を表す。
【００６０】第１４図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
発現の工程５に関する：種々の希釈度における、真正天
然マウスＬＩＦ−Ａ（−〇−）、ガラクトースで誘導さ
れたＬＩＦmut１／ＹＥpsecl組換体を含有する酵母細胞
のならし培地（−●−）およびガラクトースで誘導され
ていない同じ酵母細胞の培地（−＋−）の、天然125Ｉ
−ＬＩＦ−Ａとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競
合する能力を示す。
【００６１】工程１：マウスＬＩＦのＣ−末端における
アミノ酸配列の決定 実施例４のｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.２ｂは、マウ
スＬＩＦｍＲＮＡの不完全なコピーを含有する。５'末
端において、ｃＤＮＡは、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に
よって決定した最初の残基（第１０図におけるＰｒｏ
９）に結合するＮ−末端の８個の残基をコード化する。
しかし、３'末端においては、ｐＬＩＦ７.２ｂは、イン
-フレーム翻訳終止コドンを含まないので不完全であ
る。直接アミノ酸シークエンシング（実施例２）によっ
て決定された２種のＬＩＦペプチドのアミノ酸配列の調
査により、ｐＬＩＦ７.２ｂは３'末端においてコード化
領域のわずかに２７のヌクレオチドを欠くことが示唆さ
れた。第１１図に示すように、Ｖ８−誘導ペプチドは、
ｃＤＮＡ配列の残基Ａｌａ１６２に始まり、９個の残基
によってｃＤＮＡクローンから推測されるアミノ酸配列
に至っていた。Ｖ８ペプチド中に含まれるトリプシンペ
プチドの末端が同じ残基であり、このことは、Ｐｈｅ１
８７がタンパク質のＣ−末端残基であることを示唆して
いる。この推定を確認するために、ｐＬＩＦ７.２ｂと
重複し、３'方向に伸長するＬＩＦｃＤＮＡクローンを
単離し、ヌクレオチド配列分析に付した。
【００６２】そのようなクローンを単離するための適当
なｃＤＮＡライブラリーを構成し、スクリーニングする
ために、ノザン法により一連の異なるｍＲＮＡ試料をス
クリーニングして、ＬＩＦｍＲＮＡ分子濃度が最高であ
るＲＮＡ試料を同定した。実質的に文献に記載の方法
（ゴー、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、１６５：６８３〜６９９、１９８３）で調製した細
胞質ポリアデニル化ＲＮＡを、２０ｍＭモルホリノプロ
パンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、５ｍＭ酢酸ナトリウム、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.０）および６％ｖ／ｖホルム
アルデヒドを含有する１％アガロースゲル上で分画し、
ＲＮＡ含有フィルターを、０.２％フィコル、０.２％ポ
リビニル−ピロリドン、０.２％ウシ血清アルブミン、
２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、８０μ
ｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡおよび５０μｇ／ｍｌ大腸
菌ｔＲＮＡを含有する２×ＳＳＣに、６７℃で数時間浸
漬した。０.１％ＳＤＳを加えた同じ緩衝液中で６７℃
でハイブリッド形成を行った。ＬＩＦ転写を検出するた
めに使用したプローブは、ｐＳＰ６５中でサブクローン
化されたｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡインサートを含有
する約７５０ｂｐのＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIIIフラグメン
トから成っていた。このフラグメントは、ｃＤＮＡ配列
を有するだけでなく、Ｇ−Ｃ末端およびｐＪＬ３ベクタ
ー配列の約１５０ｂｐをも有していた。約２×１０9ｃ
ｐｍ／μｇのリボプローブは、ＢＲＥＳＡ［アデライド
（Adelaide）］の試薬を用いるＳＤＰ６サブクローンの
転写により誘導した。このプローブは、約２×１０7ｃ
ｐｍ／ｍｌでハイブリッド形成に用いた。フィルター
を、オートラジオグラフィーに付す前に、２×ＳＳＣ、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ中で６７℃で、および
最後に０.２×ＳＳＣ中で６７℃で広範に洗浄した。
【００６３】このような分析により、ＬＩＦ転写物は種
々の造血細胞系中に低レベルで存在し、クレブスＲＮＡ
のバッチによってＬＩＦｍＲＮＡのレベルには大きな差
があることがわかった。クレブス腹水癌細胞ＲＮＡの２
つのバッチを選択して、２つのｃＤＮＡライブラリーを
合成した。ｃＤＮＡライブラリーは、アメルシャム（Am
ersham）の試薬（製造番号ＲＰＮ．１２５６およびＲＰ
Ｎ．１２５７）を、その製造者の指示に従って用いて構
成した；クローニングベクターはλＧＴ１０であった。
約４×１０5の組換クローンが得られ、ｐＬＩＦ７.２ｂ
の３'末端における３６残基の配列に対応するオリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成によってスクリーニン
グした：第１０図のヌクレオチド５００〜５３５（両端
を含む）。
【００６４】クレブスｃＤＮＡライブラリーに相当する
ファージプラークを、１０ｃｍのペトリ皿当たり約５
０,０００のプラークの密度で増殖させ、ニトロセルロ
ースに移し、標準的な方法で処理した（マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリン
グ・ハーバー、１９８２）。ハイブリッド形成の前に、
６×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）、０.２％フィコル、０.２％ポ
リビニル−ピロリドン、０.２％ウシ血清アルブミン、
２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍ
ｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡおよび５０μｇ／ｍｌ大腸
菌ｔＲＮＡ中で、フィルターを３７℃で数時間インキュ
ベートした。０.１％ＮＰ４０を含有する同じ溶液中
で、３７℃で１６〜１８時間ハイブリッド形成を行っ
た。［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナー
ゼで比活性約１０9ｃｐｍ／μｇに放射性ラベルし、取
り込まれなかったラベルからＮＡＣＳカラム（ベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ）を用いるイオン交換クロ
マトグラフィーにより分離した前記オリゴヌクレオチド
プローブを、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でハイブリッド形
成に用いた。ハイブリッド形成後、６×ＳＳＣ、０.１
％ドデシル硫酸ナトリウム中で６０℃でフィルターを洗
浄した。前記のように、フィルター上で陽性のクローン
λＬＩＦＮＫ１に相当する１個のプラークを取り、低密
度で再スクリーニングした。
【００６５】前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形
成したλＬＩＦＮＫ１中の約９５０ｂｐのｃＤＮＡイン
サートを、プラスミドベクター［ｐＥＭＢＬ８＋、デン
テ（Dente，L.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１１：１６４５〜１６５５、１９８３］中にサブク
ローン化してクローンｐＬＩＦＮＫ１を生成した。ｐＬ
ＩＦＮＫ１のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列分
析は、ジデオキシ法（サンガーら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ、米国、７４：５４６３〜５４６７、１９７７）によ
って、アルカリ性変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型と
して用い［チェン（Chen，E.Y.）およびシーバーグ（Se
eburg，P.H.）、ＤＮＡ、４：１６５〜１７０、１９８
５］、ｃＤＮＡに沿うベクターにもｃＤＮＡ内の配列に
も相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメ
ントおよびＡＭＶ逆転写酵素をポリメラーゼとして用い
て行った。ｐＬＩＦＮＫ１中のｃＤＮＡインサートの部
分のヌクレオチド配列を第１１図に示す。ｐＬＩＦＮＫ
１によって特定されるアミノ酸配列は、Ｃ−末端におい
て、直接アミノ酸シークエンシングによってＬＩＦのＣ
−末端を構成すると予測される９個のアミノ酸と同じで
あり、ｐＬＩＦＮＫ１ｃＤＮＡ配列において、このＰｈ
ｅ１８７のコドンが直接にイン-フレーム翻訳終止コド
ンにつながっているので、Ｐｈｅ１８７がＬＩＦのＣ−
末端残基であることが確認された。
【００６６】工程２：酵母発現ベクター中のＬＩＦコド
ン領域の構成 ＬＩＦｃＤＮＡクローンによってコード化されたタンパ
ク質の最初の製造が真核系（酵母）において達成され、
発現された生成物はグリコシル化され、分泌され、正確
に折り畳まれた。用いた発現ベクターＹＥpseclは、ク
ルイヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から
誘導され、インターロイキン１の有効に分泌することが
示されており（バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラ
ー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、
６：２２９〜２３４、１９８７）、ガラクトース誘導性
ハイブリッドＧＡＬ−ＣＹＣプロモーターから転写され
たＮ−末端リーダー配列を提供する。
【００６７】このべクター中のｐＬＩＦ７.２ｂによっ
てコード化されたタンパク質を発現するために、ｃＤＮ
Ａを幾つかの手段で修飾する必要があった（第１２図参
照）。５'末端において、部分的な哺乳動物のリーダー
配列を特定する数個のヌクレオチドを除去するだけでな
く、適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢａｍＨ
I）を設けて、クルイヴェロミセス・ラクティスリーダ
ーを挿入させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位
（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を保持することが必要であった。
３'末端においては、ＬＩＦのコード化領域の２種の構
成がなされた。１種（ＬＩＦmutl）は、ｐＬＩＦ７.２
ｂの最後のコドン（Ｇｌｎ１７８）に終止コドンがつな
がるように構成された。他方（ＬＩＦmut２）は、ｐＬ
ＩＦ７.２ｂ（前記参照）に欠損していることが知られ
ている９個のアミノ酸残基をコード化する配列を付加
し、これに翻訳終止コドンがつながるように構成され
た。適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（Ｈｉｎｄ
III）は、いずれの構造においても構成された。これら
の修飾はすべてオリゴヌクレオチド介在突然変異誘発に
より達成された：ｐＬＩＦ７.２ｂの５３５ｂｐのｃＤ
ＮＡインサートを持ち、Ｇ−Ｃ末端およびｐＪＬ３ベク
ターの部分によって制限された約７５０ｂｐのＥｃｏＲ
I−ＨｉｎｄIIIフラグメントは、プラスミドｐＥＭＢＬ
８＋中にサブクローン化し（デンテら、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、１１：１６４５〜１６５５、１９
８３）、１本鎖ＤＮＡは、文献に記載の方法で調製した
［セサリーニ（Cesarini，G.）およびマーレイ（Murra
y，J.A.H.）、セトロウ（Setlow，J.K.）およびホレン
ダー（Hollaender，A.)編、ジェニティック・エンジニ
アリング：プリンシプルズ・アンド・メソッズ（Geneti
c Engineering: Principles and Methods）、プレナム
・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、第８巻、１
９８７］。イン・ビトロの突然変異誘発は、文献に記載
のようにして［ニスベット（Nisbet，I.T.）およびベイ
ルハルツ（Beilharz，M.W.）、ジーン・アナリシス・テ
クニークス（Gene Anal．Techn.）、２：２３〜２９、
１９８５］、３５、５１および６１塩基のオリゴヌクレ
オチドを用いて行い、概略を示したｃＤＮＡの５'末端
および３'末端を修飾した。修飾されたＬＩＦｃＤＮＡ
配列を含むＢａｍＨI−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、プ
ラスミドＹＥpseclに入れ、得られる組換体中のインサ
ートのヌクレオチド配列を決定した。
【００６８】工程３：ＹＥpsecl／ＬＩＦ組換体の、酵
母細胞への導入 ビール酵母菌株ＧＹ４１［leu2 ura3 adel his4 met2 t
rp5 gal1 cir+; x 4003-5b、イースト・ジェネティック
・ストック・センター（Yeast Genetic StockCentr
e）、バークレイ（Berkeley）］を、ポリエチレングリ
コール法によって形質転換した［クレベ（Klebe，R.
J.）ら、ジーン、２５：３３３〜３４１、１９８３］。
形質転換体は、ウラシル不存在下に合成最少培地［必要
なアミノ酸５０μｇ／ｍｌを追加した、２％炭素原、
０.６７％酵母窒素成分（ディフコ；Difco）］上で選択
および保持した。プラスミドＹＥpsecl中のインサート
配列の発現は、非選択的完全培地（１％酵母抽出物、２
％ペプトン）または合成最少培地（いずれも２％ガラク
トースを含有する）中で、形質転換体を増殖することに
よって達成された。
【００６９】工程４：酵母誘導ＬＩＦの生物学的性質の
決定 酵母ならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性の
アッセイを、ウシ胎児血清２０％および寒天０.３％の
最終濃度のダルベッコ改良イーグル培地中にＭ１細胞３
００個を含有する培養液（ホズミ博士、サイタマ・カン
サー・リサーチ・センター（Saitama Cancer Research
Centre）、日本により提供）１ｍｌ中で行った。アッセ
イに付す材料は、連続的希釈物０.１ｍｌとして、寒天
培地中の細胞懸濁液を添加する前に培養器に加えた。培
養は、１０％ＣＯ2の水蒸気飽和雰囲気中で７日間イン
キュベートした。培養は、顕微鏡を用いて倍率３５で記
録し、分散した細胞を有するコロニーまたは分散した細
胞のみから成るコロニーは、分化されたと記録した。形
態学的観察は、全培養を２.５％グルタルアルデヒド１
ｍｌで固定し、次いで顕微鏡のスライド上で乾燥した培
養を、アセチルコリンエステラーゼ／ルクソール・ファ
スト・ブルー（Luxol Fast Blue）／ヘマトキシリンで
染色することによって行った。
【００７０】コロニー刺激活性のアッセイは、７５,０
００個のＣ５７ＢＬ骨髄細胞を用いて文献に記載の方法
で行った（メトカルフ、ザ・ヘモポイエティック・コロ
ニー・スティミュレーティング・ファクターズ、エルセ
ヴィール、アムステルダム、１９８４）。ＷＥＨＩ−３
Ｂ Ｄ+細胞に対する分化誘導活性のアッセイは、文献に
記載のように行った（ニコラら、ザ・ヘモポイエティッ
ク・コロニー・スティミュレーティング・ファクター
ズ、２５８：９０１７〜９０２３、１９８３）。
【００７１】非形質転換酵母、ベクターＹＥpseclのみ
を有する酵母または不完全なコード化領域（ＬＩＦmut
１）を有する酵母の培養のものではなく、全コード化領
域（ＬＩＦmut２）を有する酵母の培養の培地は、Ｍ１
コロニーの培養において典型的なマクロファージ分化を
誘導することができた（第１３Ａ図）。精製した天然Ｌ
ＩＦを用いた場合と同様に、酵母誘導物質も、濃度を増
すと、分化するＭ１コロニーの数およびサイズを徐々に
低下させた（第１３Ｂ図）。精製した天然ＬＩＦとの比
較により、酵母ならし培地は、１６,０００ユニット／
ｍｌ（約１３０ｎｇ／ｍｌ）までのＬＩＦを含有するこ
とが示唆された。酵母誘導ＬＩＦは、精製した天然ＬＩ
Ｆ−Ａと同様に、正常顆粒球−マクロファージ前駆細胞
によるコロニーの形成を刺激すること、またはＷＥＨＩ
−３Ｂ Ｄ+白血病コロニーの分化の誘導もしくは増殖の
抑制を行うことはない。
【００７２】セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００カ
ラムによるサイズ分画により、クレブス細胞から誘導さ
れるＬＩＦには５８,０００ダルトンであるのに対し
て、酵母誘導ＬＩＦは見掛けの分子量が６７,０００〜
１５０,０００ダルトンのタンパク質と共に溶出される
ことがわかった。
【００７３】不完全なコード化領域（ＬＩＦmut１）を
有する酵母のならし培地にＬＩＦ活性が無いことは、こ
の構造に欠損している９個の疎水性Ｃ−末端残基がＬＩ
Ｆ機能に必要であることを示唆している。これらの残基
はレセプターと相互作用し得るが、タンパク質中で疎水
性のコアの部分の形成もし、それ故その欠如は、適当な
折り畳みの妨害となり得る。または、そのような残基
は、ＬＩＦの有効な分泌に何等かの形式で必要なのであ
ろう。
【００７４】工程５：酵母誘導マウスＬＩＦおよびクレ
ブスII腹水細胞ならし培地から精製した天然ＬＩＦ−Ａ
のレセプター結合特異性 精製したマウスＬＩＦ−Ａ（実施例１）を前記のように
ヨウ素化した（実施例３）。腹腔内でチオグリコーレー
トにより高レベルのマクロファージを誘導したマウスか
ら、洗浄によって腹腔細胞を採った。これらの細胞を洗
浄し、１０％ウシ胎児血清含有Hepes−緩衝ＲＰＭＩ培
地に、２.５×１０6／５０μｌで再懸濁させた。細胞懸
濁液５０μｌを２００,０００ｃｐｍの125Ｉ−ＬＩＦ−
Ａ（１０μｌ、同じ培地中）および１０μｌ中の対照培
地または非ラベル純マウスＬＩＦ−Ａもしくは酵母誘導
マウスＬＩＦの連続２倍希釈物と共にインキュベートし
た。適当な濃度において、ＬＩＦmut２構造（第１２
図）含有ガラクトース誘導酵母の上澄は、腹腔細胞レセ
プターへの結合を125Ｉ−ＬＩＦ−Ａと競合したが、非
誘導酵母上澄は競合しなかった（第１４図）。競合の度
合いは、真正天然ＬＩＦ−Ａのそれと同じくらいであ
り、このことは、酵母誘導ＬＩＦ−Ａが、ＬＩＦ−Ａ細
胞レセプターへの結合に必要なすべての情報を有するこ
とを示唆している。
【００７５】実施例６ 本実施例は、哺乳動物細胞における組換マウスＬＩＦの
発現のための工程を説明する。第１５図は、以下に記載
する方法の工程１に関する：クローンｐＬＩＦＮＫ３の
ｃＤＮＡ部分のヌクレオチド配列。ｍＲＮＡ同義鎖のヌ
クレオチド配列を、上部に示すＬＩＦの推定アミノ酸配
列と共に５'から３'方向に示す。予め決定したＮ−末端
アミノ酸残基を＋１として示す。ｃＤＮＡの５'末端の
ＥｃｏＲI部位および終止コドンにかかるＸｂａI部位
（工程２においてＬＩＦコード化領域をｐＭＰ−Ｚｅｎ
に挿入するのに使用した。）を示す。
【００７６】工程１：マウスＬＩＦのＮ−末端リーダー
配列のアミノ酸配列の決定 ｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.２ｂおよびｐＬＩＦＮＫ
１（前記）は、ＬＩＦｍＲＮＡの不完全なコピーを含有
する。これらは、ＬＩＦタンパク質の成熟部分の完全な
コード化領域をも有するが、哺乳動物細胞からのＬＩＦ
の分泌に要する完全な疎水性リーダー配列を持たない。
【００７７】疎水性リーダーをコード化する領域を含有
するｃＤＮＡクローンを単離するために、クレブスｍＲ
ＮＡの同じバッチを鋳型として用いて前記（実施例５）
のように構成した更に１０6のｃＤＮＡクローンを、ｐ
ＬＩＦ７.２ｂ配列の５'末端の３５残基および３'末端
の３６残基の配列に対応する２つのオリゴヌクレオチド
（第１０図における、ヌクレオチド６７〜１０２および
５００〜５３５）をプローブとして用いて（前記のよう
に）スクリーニングした。
【００７８】複製フィルター上で陽性のクローンλＬＩ
ＦＮＫ２およびλＬＩＦＮＫ３を表す２つのプラークを
採り、前記のように低密度でスクリーニングした。λＬ
ＩＦＮＫ３は、用いた２種のオリゴヌクレオチドの各々
と共にハイブリッド形成することが示されたので、これ
を更に分析した。
【００７９】λＬＩＦＮＫ３中の約１４００ｂｐのｃＤ
ＮＡインサートを、プラスミドベクターｐＥＭＢＬ８+
（デンテら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１
１：１６４５〜１６５５、１９８３）中にサブクローニ
ングして、クローンｐＬＩＦＮＫ３を生成した。ｐＬＩ
ＦＮＫ３のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列分析
は、（前記）ｐＬＩＦ７.２ｂおよびｐＬＩＦＮＫ１の
場合と同様に行った。
【００８０】ｐＬＩＦＮＫ３のｃＤＮＡインサートのヌ
クレオチド配列を第１５図に示し、ｐＬＩＦＮＫ３は完
全なＬＩＦコード化領域を含むことを示す：ｐＬＩＦＮ
Ｋ３配列中の２３〜２５の位置に開始コドン（ＡＵＧ）
があり、次いで、２４個のアミノ酸残基の疎水性リーダ
配列をコード化する配列がある。コード化領域は、ｐＬ
ＩＦＮＫ１によって予め決定されたものと同じ翻訳終止
コドン（前記）に至る。
【００８１】工程２：ＬＩＦコード化領域の、哺乳動物
発現ベクターへの導入 最初に選択した哺乳動物発現ベクターは、レトロウイル
ス発現ベクターｐＭＰ−Ｚｅｎであった。このベクター
は、モロニーマウス白血病ウイルス系ベクターｐＺＩＰ
ＮｅｏＳＶ（Ｘ）から、ＸｈｏI発現部位を残して、近
傍のＳＶ４０およびプラスミド配列と共にｎｅｏR遺伝
子を削除することにより誘導した。ベクターの３'領域
も修飾して、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）のＬ
ＴＲ由来のエンハンサーを組み込んだ［ボウテル（Bowt
el，D.D.L.）ら、モレキュラー・バイオロジー・アンド
・メディシン（Mol．Biol．Med.）、４：２２９〜２５
０、１９８７］。第１に、ＬＩＦ／ＰＭＰ−Ｚｅｎ組換
体は、ψ２細胞を通ってヘルパー-フリー感染性レトロ
ウイルス粒子中に入れられるので、このベクターを選択
した［マン（Mann，R.）ら、セル（Cell）、３３：１５
３〜１５９、１９８３］。このようなウイルス粒子は、
次いで、ＬＩＦ／ｐＭＰ−Ｚｅｎ組換体を種々のマウス
細胞に（感染により）有効に導入するために使用される
［マンら、セル、３３：１５３〜１５９、１９８３］。
第２に、外来のコード化領域の発現のためのＭＰＳＶ
ＬＴＲを有するこのベクターは、ＧＭ−ＣＳＦを含む特
定の他の造血増殖および分化因子の有効な発現を起こす
ことがわかっている。
【００８２】ｐＭＰ−Ｚｅｎへの挿入のために選択した
ｐＬＩＦＮＫ３のセグメントは、位置１（ＥｃｏＲI部
位）から位置６３０（終止コドンにかかるＸｂａ１部
位）に至る−第１５図参照。このセグメントは、プレ−
ＬＩＦのコード化領域以外はあまり含有せず、ｍＲＮＡ
の不安定性をもたらす配列を有し得る３'非翻訳領域の
すべてを有していないので選択した［例えば、シャウ
（Shaw，G.）およびカメン（Kamen，R.）、セル、４
６：６５９〜６６７、１９８６；ヴェルマ（Verma，I.
M.）およびサッソン−コルシ（Sassone-Corsi，P.）、
セル、５１：５１３〜５１４、１９８７］。このフラグ
メントをｐＭＰ−Ｚｅｎに挿入するために、標準的な方
法（マニアティスら、１９８２、前掲書）によって、ｐ
ＩＣ２０Ｈ［マーシュ（Marsh，J.L.）ら、ジーン、３
２：４８１〜４８５、１９８４］のＥｃｏＲIおよびＸ
ｂａI部位の間にまず挿入した。次いで、このｃＤＮＡ
インサートを、ｐＩＣ２０Ｈプラスミドのポリリンカー
から、ＳａｌIおよびＸｈｏI分解により回収することに
よって、ｐＭＰ−ＺｅｎのＸｈｏIクローニング部位に
挿入するのに適当な結合端を有するＬＩＦｃＤＮＡを生
成した。このＬＩＦｃＤＮＡフラグメントのｐＭＰ−Ｚ
ｅｎへの挿入は、標準的な方法（マニアティスら、１９
８２、前掲書）によって行った。
【００８３】工程３：ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ組換体
の、マウス繊維芽球への導入 ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ ＤＮＡを、ψ２繊維芽球にエ
レクトロポレーションによって導入した［ポッター（Po
tter）ら（PNAS）、８１：７１６１〜７１６５、１９８
４］。ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ ＤＮＡ３０μｇおよび
ｐＳＶ２ＮｅｏＤＮＡ［サザン（Southern，P.J.）およ
びバーグ（Berg，P.）、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・アンド・アプライド・ジェネティクス（J. Mol. Ap
p. Genet.）、１：３２７〜３４１、１９８２］３μｇ
を、ＤＭＥ／１０％ＦＣＳ（１０％ウシ胎児血清を含有
するダルベッコ改良イーグル培地）１ｍｌ中の１×１０
6個のψ２繊維芽球と混合し、キャパシタンス２５μＦ
で５００ｖの電流をかけた［バイオラド・ジーン・パル
サー（BioRad Gene-Pulser）モデルＮｏ．１６５２０７
８を使用］。形質転換体は、まず、ｐＳＶ２Ｎｅｏ Ｄ
ＮＡの抗生物質Ｇ４１８に対する耐性に基づいて選択し
た。Ｇ４１８耐性ψ２細胞は、標準的な方法（マンら、
セル、３３：１５３〜１５９、１９８３）によって、４
００μｇ／ｍｌで選択した。試験した１９個のＧ４１８
耐性クローンのうちの２個は、ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ
構造をも有しており、これは、ψ２ならし培地中におい
て検出し得るＬＩＦ活性によって評価された。
【００８４】工程４：ψ２誘導ＬＩＦの生物学的性質の
決定 ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ含有ψ２細胞のならし培地の分
化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイを、前記の
ように行った。ＤＭＥ／１０％ＦＣＳ３ｍｌ中の１０6
個のψ２細胞の培養からの培地の分化誘導活性をアッセ
イした。２つの陽性の培養の結果を次の表に示す： Ｍ１分化誘導活性クローン番号 （ユニット／１０6細胞／ｍｌ C.M.） ψ２−対照 検出せず ψ２−１１ａ ＞１６,０００ ψ２−１１ｄ ＞１６,０００ このように、この発現系において、生物学的に活性な組
換マウスＬＩＦの有意のレベルが達成できた。
【００８５】工程５：ψ２細胞から造血細胞へのｐＭＰ
−Ｚｅｎ／ＬＩＦレトロウイルスの伝播 感染性ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦレトロウイルスは、共培
養により、親ψ２細胞系から系ＦＤＣ−Ｐ１の造血細胞
［デクスター（Dexter，T.M.）ら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（J．Exp．Med.）、１
５２：１０３６〜１０４７、１９８０］に移ることがで
きた。ＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖のための最適濃度のＷＥ
ＨＩ−３ＢＤ-ならし培地を含有するＤＭＥ／１０％Ｆ
ＣＳ１０ｍｌ中で、１０6個のψ２細胞を、１０6個のＦ
ＤＣ−Ｐ１細胞と混合した。２日間インキュベートした
後、非付着ＦＤＣ−Ｐ１細胞を除去し、すべての付着ψ
２細胞を洗い落とし、同じ培地３ｍｌ中で１６時間増殖
させた。ならし培地を採り、前記のように分化誘導およ
び白血病抑制活性のアッセイに付した。結果を次の表に
示す。 ＦＤ培養を誘導した Ｍ１分化誘導活性クローンの番号 （ユニット／１０6ＦＤＣ−Ｐ１細胞） ψ２−対照 検出せず ψ２−１１ａ 約３,０００ ψ２−１１ｄ 約１,５００
【００８６】このように、ψ２クローンであるψ２−１
１ａおよびψ２−１１ｄは、生物学的活性ｐＭＰ−Ｚｅ
ｎ／ＬＩＦレトロウイルスを造血細胞に透過させること
ができる。従って、これらのクローンは、Ｚｅｎ／ＧＭ
−ＣＳＦウイルス感染のために使用したものと同様に、
正常マウス造血に対する天然ＬＩＦ高レベル発現の効果
の研究のために、照射マウスの造血系を再構成するのに
使用し得る正常マウス造血前駆細胞の感染に適用可能で
ある。
【００８７】実施例７ 以下に、大腸菌細胞における組換マウスＬＩＦの発現の
ための工程を説明する。第１６図は、以下に記載する方
法の工程１に関する：グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ／トロンビン切断部位／ＬＩＦ接合部におけるヌク
レオチド配列、その接合部におけるコード化された融合
タンパク質の配列。３者融合タンパク質の、グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼのＣ−末端、トロンビン切断
部位およびマウスＬＩＦ部分のＮ−末端を、このアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列と共に示す。ト
ロンビンによって切断されると考えられる部位を矢印で
示す。
【００８８】工程１：ＬＩＦコード化領域の大腸菌発現
ベクターへの導入 大腸菌におけるＬＩＦ発現に用いた発現ベクターは、Ｓ
ｊ２６（寄生蠕虫日本住血吸虫によってコード化された
２５ｋＤグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（E.C.2.
5.1.18））のＣ−末端との融合として外来ペプチドを合
成するための、ｐＧＥＸ−２Ｔであった（スミスおよび
ジョンソン、ジーン、１９８８）。多くの場合、融合タ
ンパク質は、水溶液に可溶であり、非変性条件下に固定
化グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーによっ
て粗溶菌液から生成し得ることがわかっている。このベ
クターｐＧＥＸ−２Ｔは、部位特異性プロテアーゼであ
るトロンビンによる分解によってグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼキャリヤーが融合タンパク質から切断さ
れ得るように設計されている。
【００８９】プラスミドｐＬＩＦmut２から誘導される
マウスＬＩＦの完全なコード化領域（前記実施例５およ
び第１２図参照）は、ＢａｍＨI−ＥｃｏＲIフラグメン
トとしてｐＧＥＸ−２Ｔの多重クローニング部位に導入
し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびトロン
ビン切断部位と同じ翻訳リーディングフレームのＬＩＦ
コード化領域３'を配置した。このように、グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ／トロンビン切断部位／ＬＩ
Ｆの３者融合タンパク質において、ＬＩＦタンパク質の
Ｃ−末端をこれらの要素に配置した（第１６図参照）。
トロンビン切断部位の位置は、トロンビン切断の後に２
個のアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）がＬＩＦタンパク質の
Ｎ−末端に付属するような位置である。前記プラスミド
の構成ｐＧＥＸ−２Ｔ／ＬＩＦは、標準的な方法によっ
て行い、標準的な方法によってプラスミドを大腸菌ＮＭ
５２２に導入した（ゴーおよびマーレイ、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、１６６：(I)〜１
９、１９８３）。
【００９０】工程２：グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ／ＬＩＦ融合タンパク質の発現および精製 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／ＬＩＦ融合タン
パク質の発現を誘導するために、ｐＧＥＸ−２Ｔ／ＬＩ
Ｆ含有大腸菌ＮＭ５２２細胞の培養１０ｍｌをルリアブ
イヨン中で対数増殖させ、イソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシドを０.１ｍＭの濃度に加えた。更に４
時間増殖（その間にグルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ／ＬＩＦ遺伝子が発現する）後、遠心によって細胞を
採り、マウスリン酸緩衝生理食塩液（ＭＴＰＢＳ：１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭ Ｎ
ａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７.３）１ｍｌに再懸濁させた。氷上
で穏やかに超音波処理することによって細胞を溶解し、
トリトン（Triton）Ｘ−１００を１％に添加した後、遠
心（１０,０００ｇ、５分間、４℃）により細胞屑を除
去した。透明となった上澄を、室温で回転プラットフォ
ーム上の５０ｍｌポリプロピレンチューブ内で、５０％
グルタチオン、アガロースビーズ［イオウ結合、シグマ
（Sigma）］２００μｌと混合した。（使用前に、ビー
ズをＭＴＰＢＳに予備浸漬し、同じ緩衝液で２回洗浄
し、５０％溶液ｖ／ｖとしてＭＴＰＢＳ中で４℃で貯蔵
した。）吸収（５分間）後、ビーズを遠心（５００ｇ、
１分間）によって集め、ＭＴＰＢＳ／トリトンＸ−１０
０で３回洗浄した。次いで、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ／ＬＩＦ融合タンパク質を、遊離グルタチオ
ンとの競合によって溶出した：ビーズは、１００μｌの
５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ還元グルタチオン（ｐＨ
７.５）と共に、室温で２分間インキュベートし、遠心
によってビーズを除去した。溶出工程は２回行い、１０
０μｌずつの２つの溶出物をプールした。
【００９１】グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／Ｌ
ＩＦ融合タンパク質１００μｌをトロンビンで処理した
（スミスおよびジョンソン、前掲書）。非切断およびト
ロンビン切断グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＬＩ
Ｆ融合タンパク質１μｌを、ファルマシア・ファスト・
ゲル（Pharmacia Phast Gel）（８〜２５％ポリアクリ
ルアミド勾配ゲル）上で電気泳動した。クーマシー・ブ
ルーで染色後、非切断試料においては、相対分子量〜４
６ｋＤａの単一の主要なタンパク質種があらわれ、トロ
ンビン切断試料においては、〜２６ｋＤａおよび〜２０
ｋＤａの２つの主要なバンドが現れた［それぞれ、融合
タンパク質（４６ｋＤａ）、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（２６ｋＤａ）およびＬＩＦタンパク質（２
０ｋＤａ）の推定されるサイズに相当する］。このゲル
上のクーマシー染色バンドの分子量の計算によって、元
の１０ｍｌの大腸菌培養からのグルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ／ＬＩＦタンパク質の収量は、〜１.５μ
ｇであったことがわかった。
【００９２】グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／Ｌ
ＩＦ融合タンパク質およびトロンビン切断ＬＩＦ試料の
分化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイは、マウ
スＭ１細胞を用いて（前記のように）行った。いずれの
ＬＩＦ試料も、生物学的に活性であり、非活性は７×１
０6ユニット／ｍｇを越えることがわかった。
【００９３】実施例８ マウスゲノムが、クローンｐＬＩＦ７.２ｂ中に存在す
る配列をコード化する遺伝子（実施例４）に関連した他
の遺伝子を含有するかどうかを決定するための工程、お
よびＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の
位置のマップの確定を以下に説明する。図面は、以下に
記載する方法の種々の工程に関する：第１７図 ：工程１に関する：高および低ストリンジェン
シー条件下におけるマウスＤＮＡのｐＬＩＦ７.２ｂ誘
導プローブとのハイブリッド形成。所定の制限酵素で分
解したＢＡＬＢ／ｃ肝ＤＮＡについて、実施例８の工程
１に記載するようにＬＩＦ遺伝子配列を調べた。左図に
おいて、２×ＳＳＣ中で６５℃でハイブリッド形成を行
い、最終洗浄は０.２×ＳＳＣ中で６５℃で行った。右
図においては、ハイブリッド形成および洗浄はいずれも
６×ＳＳＣ中で６５℃で行った。左図において、線状ｐ
ＬＩＦ７.２ｂプラスミドＤＮＡ（５.６ｋｂ）は、単相
マウスゲノムの分子量を３×１０9ｂｐとして単相マウ
スゲノム当たり１０および１コピーに相当する量（それ
ぞれ４００ｐｇおよび４０ｐｇ）で用いた［レアード
（Laired，C.D.）、クロモソーマ（Chromosoma）、３
２：３７８〜４０６、１９７１］。ハイブリッド形成ゲ
ノムフラグメントのサイズを示す。
【００９４】第１８図：工程２に関する：種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分解した、１本鎖および２本鎖のマ
ウスＤＮＡと、マウスＬＩＦプローブとのハイブリッド
形成。分解したＤＮＡは、０.８％アガロースゲル上で
電気泳動し、実施例８の工程１に記載のように、高スト
リンジェンシー条件下にｐＬＩＦ７.２ｂｃＤＮＡフラ
グメントとハイブリッド形成させた。
【００９５】第１９図：工程２に関する：マウスＬＩＦ
遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ。ｃＤＮＡ
クローンｐＬＩＦ７.２ｂに対応する配列を含有する染
色体ＤＮＡの領域をボックスで示す。中心線の上部（Ｅ
ｃｏＲ５）および下部（ＸｂａI、ＢａｍＨI、ＰｓｔI
およびＳｔｕI）に示された制限部位は、中心線上に配
置できなかった。線の下部の複合群の部位の相対配置は
図に示す通りである。
【００９６】第２０図：工程３に関する：マウスＬＩＦ
遺伝子の染色体配置。レーン１においては、ＢＡＬＢ／
ｃマウス胚ＤＮＡを電気泳動し、レーン２においては、
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＤＮＡを電気泳動
し、レーン３〜８においては、ハイブリッドクローンＩ
−１８Ａ ＨＡＴ、Ｉ−１８Ａ−２ａ−８ＡＧ；ＥＢＳ
５８；ＥＢＳ１１；ＥＢＳ４；およびＩ−１３Ａ−１ａ
−８ＡＧのＤＮＡを電気泳動した［コリー（Cory，S.）
ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガニゼーション・ジャーナル、２：２１３〜２１６、１
９８３］。これらのハイブリッドのマウス染色体内容
は、コリーら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロ
ジー・オーガニゼーション・ジャーナル、２：２１３〜
２１６、１９８３に記載されている。すべてのＤＮＡ
は、ＢａｍＨIで分解される。マウスＬＩＦ遺伝子を有
する３ｋｂ ＢａｍＨIフラグメントの位置を示す。
【００９７】工程１：マウスゲノム中のＬＩＦ関連遺伝
子の数の決定 クレブスII細胞のならし培地が、Ｍ１細胞の分化を誘導
し得る、２つの生化学的に異なるが、機能的には同様の
因子（ＬＩＦ−ＡおよびＬＩＦ−Ｂ）を含有するという
データ（実施例１）に基づいて、我々は、精製およびク
ローン化した種に関連するマウスゲノム中に何個の遺伝
子があるかを決定しようとした。種々の制限エンドヌク
レアーゼによって切断したマウスゲノムＤＮＡのサザン
ブロットを、高および低ストリンジェンシーの条件下
に、ｐＬＩＦ７.２ｂから誘導したプローブと共にハイ
ブリッド形成した。
【００９８】ＢＡＬＢ／ｃマウス肝臓からの高分子量ゲ
ノムＤＮＡ２０μｇを種々の制限エンドヌクレアーゼで
完全に分解し、０.８％アガロースゲル電気泳動により
分画し、ニトロセルロースに移した。ハイブリッド形成
の前に、６×ＳＳＣ（低ストリンジェンシー）または２
×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー）（ＳＳＣ＝０.１５
Ｍ ＮａＣｌ、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０.
２％フィコル、０.２％ポリビニルピロリドン、０.２％
ウシ血清アルブミン、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１
ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡおよ
び５０μｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ中で、フィルターを６
５℃で数時間インキュベートした。ハイブリッド形成
は、０.１％ＳＤＳを含有する同じ溶液中で、６５℃で
１６〜１８時間行った。次いで、第１７図に詳細に示す
ように、６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６５℃におい
て（低ストリンジェンシー）、または２×ＳＳＣ、０.
１％ＳＤＳ中で６５℃において、次いで０.２×ＳＳＣ
により６５℃で（高ストリンジェンシー）フィルターを
洗浄した。使用したハイブリッド形成プローブは、前記
のように、ニックトランスレーションにより比活性約４
×１０8ｃｐｍ／μｇに放射性ラベルしたｐＬＩＦ７.２
ｂのｃＤＮＡインサートの約７５０ｂｐのＥｃｏＲI−
ＨｉｎｄIIIフラグメントであり、約２×１０7ｃｐｍ／
ｍｌの濃度でハイブリッド形成に使用した。
【００９９】マウス肝臓ＤＮＡ（第１７図）において
も、クレブスII細胞、ＬＢ３ Ｔ細胞およびＷＥＨＩ２
６５単核細胞由来のＤＮＡ（図示せず）においても、Ｌ
ＩＦプローブは、それぞれ約１１、３および１３ｋｂｐ
の独特のＥｃｏＲI、ＢａｍＨIおよびＨｉｎｄIIIフラ
グメントを検出した。ハイブリッド形成の同じパターン
は、高ストリンジェンシー（０.２×ＳＳＣ、６５℃）
および低ストリンジェンシー（６×ＳＳＣ、６５℃）の
いずれにおいても明らかであった（第１７図）；低スト
リンジェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に
は、他の明らかなバントは無かった。同様に独特のハイ
ブリッド形成フラグメントは、ＰｓｔI、ＳｔｕI、Ｓａ
ｃI、ＥｃｏＲ５およびＢｇｌII−切断ゲノムＤＮＡに
おいても検出された（第１７図）。更に、第１６図に示
す実験においては、ｐＬＩＦ７.２ｂプラスミドＤＮＡ
は、単相マウスゲノム当たり１０および１コピー当量の
濃度で含まれていた（トラック１および２）；ゲノムＬ
ＩＦ配列のハイブリッド形成強度は、独特の遺伝子標準
強度と有意に異なってはいなかった（トラック２）。
【０１００】以上のデータより、マウスゲノム中でＬＩ
Ｆ遺伝子は独特であり、類縁物は存在しないことがわか
る。すなわち、ＬＩＦの２つの種は、異なる遺伝子の産
物であるが、同じ遺伝子産物の転写後または翻訳後の変
種と考えられる。工程２ ：マウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ
切断マップの確定 マウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
の位置を決定し、この遺伝子の分子フィンガープリント
を提供するために、マウス肝またはクレブス腹水癌細胞
のＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで分解し、工
程１に記載のようにサザン分析に付した（高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下）。このよ
うな実験の例を第１８図に示す。この分解産物のサイズ
の分析により、ＬＩＦ遺伝子の各切断部位の位置のマッ
プを作成することができる（第１９図）。
【０１０１】工程３：マウスＬＩＦ遺伝子の染色体配置 マウスＬＩＦ遺伝子が位置している染色体を決定するた
めに、種々のマウス染色体を有する６つのマウス−チャ
イニーズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッド細胞系の
ＤＮＡを試験した［コリー（Cory，S.）ら、ヨーロピア
ン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション
・ジャーナル、２：２１３〜２１６、１９８３；フラン
ケ（Francke，U.）ら、サイトジェネティクス・アンド
・セル・ジェネティクス（Cytogenet．Cell．Gene
t.）、１９：５７〜８４、１９７７］。（高ストリンジ
ェンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に）工程１
に記載のように行ったサザン分析により、マウスＬＩＦ
遺伝子を含む３ｋｂｐ ＢａｍＨIフラグメントは、すべ
てのハイブリッド存在しないことがわかった（第２０
図）。染色体１１は、これらの系（コリーら、ヨーロピ
アン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーショ
ン・ジャーナル、２：２１３〜２１６、１９８３）のい
ずれにも保持されていない唯一のマウス染色体であるの
で［マウス−チャイニーズ・ハムスターハイブリッドの
特性（フランケら、サイトジェネティクス・アンド・セ
ル・ジェネティクス、１９：５７〜８４、１９７
７）］、ＬＩＦ遺伝子がこの染色体上に存在すると考え
られる。同様に、マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子［バーロウ
（Barlow，D.P.）ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バ
イオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６：６
１７〜６２３、１９８７］およびMulti−ＣＳＦ遺伝子
［イーレ（Ihle，J.N.）およびコザック（Kozak，C.
A.）、ナショナル・カンサー・インスティテュート、フ
レデリック・カンサー・リサーチ・ファシリティ、アニ
ュアル・レポート（National Cancer Institute, Frede
rick Cancer Research Facility, Annual Report）、１
９８４］も染色体１１に存在することが、遺伝子結合の
研究により確認されている（バーロウら、ヨーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・
ジャーナル、６：６１７〜６２３、１９８７）。
【０１０２】実施例９ 本実施例は、クローンマウスＬＩＦｃＤＮＡを、ヒト遺
伝子もしくはｍＲＮＡまたはヒトＬＩＦコード化配列含
有ＤＮＡクローンのハイブリッド形成による同定のため
に使用することのできる条件を確立する工程を説明す
る。第２１図は、以下に記載する方法の工程２に関す
る：マウスおよびヒト由来のゲノムＤＮＡに対する種々
の条件下におけるクローンｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡ
の32Ｐ−ラベルフラグメントのハイブリッド形成。各場
合において、トラック１はマウス（ＬＢ３）ＤＮＡ１５
μｇを含有し、トラック２および３はヒトＤＮＡ［それ
ぞれ細胞系ラジ（Raji）またはラモス（Ramos）由来］
１５μｇを含有する。各フィルターに適用されたハイブ
リッド形成および洗浄条件は、工程２に記載する。マウ
スＬＩＦ遺伝子を含有する約１０ｋｂｐのＥｃｏＲIフ
ラグメントおよびヒトＬＩＦ遺伝子を含有する約９ｋｂ
ｐのＥｃｏＲIフラグメントを矢印で示す。分子量標準
を左に示す。２つの異なるオートラジオグラフィー照射
を示す（１６時間および６２時間）。
【０１０３】工程１：ｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡのフ
ラグメントの調製および放射性ラベル ｐＬＩＦ７.２ｂプラスミドＤＮＡを大腸菌ＭＣ１０６
１中で増殖させ（カサダバンおよびコーヘン、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１３８：１７
９〜２０７、１９８０）、標準的な方法で大腸菌から抽
出し（マニアティスら、モレキュラー・クローニング、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９
８２）、ＣｓＣｌ勾配遠心によって精製した。このよう
に精製したｐＬＩＦ７.２ｂプラスミドＤＮＡを、制限
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIで切断
して、〜７７０ｂｐのｃＤＮＡ含有フラグメントをベク
ター（ｐＪＬ３）から遊離させ、これを１.５％アガロ
ースゲル電気泳動によってベクター配列から分画した。
【０１０４】このように精製したｐＬＩＦ７.２ｂｃＤ
ＮＡフラグメント２００ｎｇを、１００μＣｉ［α
32Ｐ］−ｄＡＴＰ含有反応においてニックトランスレー
ションにより放射性ラベルして、比活性約３×１０8ｃ
ｐｍ／μｇとした［リグビー（Rigby，P.W.J.）、ディ
ックマン（Dieckmann，M.）、ローデス（Rhodes，C.）
およびバーグ（Berg，P.）、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、１１３：２３７〜２５１、１９
７７］。１Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび３３％イソプロ
パノールの存在下に沈澱することにより、放射性ラベル
したｃＤＮＡフラグメントを、取り込まれなかったラベ
ルから精製した。
【０１０５】工程２：マウスおよびヒトゲノムＤＮＡの
サザンブロットとｐＬＩＦ７.２ｂｃＤＮＡプローブと
のハイブリッド形成 制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIで切断した、マウス
Ｔ細胞系ＬＢ３（レーン１）および２種のヒトＢ細胞系
（ラジおよびラモス；レーン２および３）由来の高分子
量ゲノムＤＮＡ（１５μｇ）を、標準的な方法で０.８
％アガロースゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移し
た（サザン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、９８：５０３〜５１７、１９７５）。これらの
３種のＤＮＡのそれぞれを含有する５個の同じサザンブ
ロットを調製した。ハイブリッド形成前に、０.９Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０.０９Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％フィコ
ル、０.２％ポリビニルピロリドン、０.２％ウシ血清ア
ルブミン、５０μｇ／ｍｌ熱変性サケ***ＤＮＡ、５０
μｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ、０.１ｍＭ ＡＴＰおよび２
ｍＭピロリン酸ナトリウム（フィルターａ、ｂ、ｃ、
ｄ）、または０.３ＭNaCl、0.０３Ｍクエン酸ナトリウム
および同じ他の成分（フィルターｅ）中で、５５℃で数
時間フィルターをインキュベートした。工程１において
調製した32Ｐ−ラベルｐＬＩＦ７.２ｂｃＤＮＡのハイ
ブリッド形成は、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを更
に含有する前ハイブリッド形成と同じ溶液中で、５５℃
（フィルターａ、ｂ、ｃ）または６５℃（フィルター
ｄ、ｅ）で１６時間行った。32Ｐ−ラベルｃＤＮＡは、
ハイブリッド形成前に沸騰によって変性し、〜１０7ｃ
ｐｍ／ｍｌでハイブリッド形成に使用した。
【０１０６】ハイブリッド形成後、０.９Ｍ ＮａＣｌ、
０.０９Ｍクエン酸ナトリウム、０.１％ドデシル硫酸ナ
トリウム中で５５℃（フィルターａ）、６０℃（フィル
ターｂ）もしくは６５℃（フィルターｃ、ｄ）で、また
は０.３Ｍ ＮａＣｌ、０.０３Ｍクエン酸ナトリウム、
０.１％ドデシル硫酸ナトリウム中で６５℃で（フィル
ターｅ）、フィルターを洗浄した。完全に洗浄後、コダ
ックＸＡＥ−５フィルムおよび２つの増幅スクリーンを
用いて−７０℃でフィルターをオートラジオグラフィー
に付した。第２１図は、このような実験の結果を示し、
２つのハイブリッド形成／洗浄条件（フィルターｄおよ
びｅ）において、マウスＬＩＦ遺伝子（約１０ｋｂｐの
ＥｃｏＲIフラグメント上に存在）およびヒトＬＩＦ遺
伝子の両方（約９ｋｂｐのＥｃｏＲIフラグメント上に
存在）が、残留バックグラウンド非特異的ハイブリッド
形成の上に検出された。試験した他のすべての条件にお
いては、バックグラウンドハイブリッド形成のレベルが
高く、許容不可能であった（フィルターａ、ｂ、ｃ）。
【０１０７】参考例１ 本実施例は、マウスＬＩＦ類似クローン化ヒト遺伝子を
得るための工程を説明する。図面は、以下に記載する方
法の種々の工程に関する。第２２図 ：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程１に
関する：マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブを使用するサザ
ンブロットハイブリッド形成によるＬＩＦ遺伝子の検
出。ヒト細胞系ＲＡＭＯＳのゲノムＤＮＡを、所定の制
限エンドヌクレアーゼで切断し、実施例１９の工程１に
記載の条件下に、ｐＬＩＦ７.２ｂから誘導したマウス
ｃＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成させた。
【０１０８】第２３図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程１に関する：種々のハイブリッド形成条件下に
おける、マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブを用いるサザン
ブロットハイブリッド形成によるＬＩＦ遺伝子の検出。
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨIで切断したヒト細胞
系ＲＡＭＯＳ（Ｈ）またはマウス肝ＤＮＡ（Ｍ）のゲノ
ムＤＮＡを、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下
に、マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブ（ｐＬＩＦ７.２
ｂ）とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成のた
めの温度およびＳＳＣ濃度を上行に、洗浄条件を次行に
示す（実施例１０の工程１参照）。
【０１０９】第２４図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程２に関する：ＬＩＦ遺伝子クローンの３試料の
制限エンドヌクレアーゼ切断。クローンλＨＧＬＩＦ
１、λＨＧＬＩＦ２およびλＨＧＬＩＦ３のλファージ
のＤＮＡ１μｇを、ＳａｌI、ＢａｍＨIまたはＰｓｔI
で分解し、０.８％アガロースゲルで電気泳動し（左
図）、ニトロセルロースに移し、（前記のように）ｐＬ
ＩＦ７.２ｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。ハイブ
リッド形成フラグメントのおよそのサイズを示す。
【０１１０】第２５図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程３に関する：ヒトＬＩＦ遺伝子（Ｈ）にかかる
λＨＧＬＩＦ１の１.３ｋｂｐのセグメントのｍＲＮＡ
類似鎖のヌクレオチド配列を５'から３'方向に示す。ｃ
ＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.２ｂ、ｐＬＩＦＮＫ１およ
びｐＬＩＦＮＫ３から誘導されるマウスＬＩＦｍＲＮＡ
（Ｍ）の相当するヌクレオチド配列をヒト遺伝子の下に
小文字で示す。マウスおよびヒトの配列が同じ箇所は、
星印で示す。マウスＬＩＦと同様に推定された成熟ヒト
ＬＩＦのＮ−末端残基を＋１とする。
【０１１１】第２６図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程３に関する：ヒトＬＩＦのアミノ酸配列および
マウスＬＩＦとの比較。直接アミノ酸シークエンシン
グ、およびｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.２ｂ、ｐＬＩ
ＦＮＫ１およびｐＬＩＦＮＫ３の分析によって決定した
成熟マウスＬＩＦ（Ｍ）のアミノ酸配列を上行に示し、
λＨＧＬＩＦ１の配列から推測されるヒトＬＩＦ（Ｈ）
の相当する配列を下に示す。同一箇所はダッシュで示
す。相違はアミノ酸で示す。
【０１１２】第２７図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程４に関する：ヒトＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ切断地図。ｐＬＩＦ７.２ｂ類似ヒト遺伝子
（第２５図）のエクソンをボックスとして示す。遺伝子
翻訳方向は、ライン下の矢印によって示す。
【０１１３】工程１：マウスプローブによるヒトＬＩＦ
の検出 マウスＬＩＦｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.２ｂの放射
性ラベルしたフラグメントをハイブリッド形成プローブ
として用いて、ヒトＬＩＦ遺伝子を検出する方法は既に
開示されている。第２２図は、種々の制限エンドヌクレ
アーゼで切断したヒトゲノムＤＮＡにおいてヒトＬＩＦ
遺伝子を検出する方法を示す。このような分析および図
示されていない他のゲルにより、ヒトＬＩＦ遺伝子が存
在する、種々の制限エンドヌクレアーゼによって生成し
たＤＮＡフラグメントのサイズがわかった。このデータ
は、ヒト遺伝子の検出のためのハイブリッド形成プロー
ブとしてマウスプローブを使用し得る条件を確立するた
めだけでなく、ヒトゲノムＬＩＦクローンの同定に有用
な診断用制限マッピングデータを提供するためにも、本
実施例の後の工程において重要である。
【０１１４】マウスおよびヒトのＬＩＦ配列の間の相同
性が高いことは、ＢａｍＨIで切断したマウスおよびヒ
トゲノムＤＮＡを、マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブと共
に、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下にハイブ
リッド形成することによってわかった（第２３図）。ハ
イブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを高め
ると、バックグラウンドが低下し、マウスプローブと共
にハイブリッド形成している〜３ｋｂｐの特有のフラグ
メントがあらわれた。ヒト遺伝子が、０.２×ＳＳＣ中
で６５℃においても実質的なハイブリッド形成を保持し
たことは重要である。
【０１１５】工程２：ヒトゲノムライブラリーのスクリ
ーニングおよびＬＩＦ遺伝子含有クローンの単離 Ｓａｕ３Ａで部分的に切断し、λファージクローニング
ベクターＥＭＢＬ３Ａに結合したヒトゲノムＤＮＡのラ
イブラリーについて、マウスｃＤＮＡをプローブとして
ハイブリッド形成することにより、ＬＩＦ遺伝子含有ク
ローンをスクリーニングした。ＬＩＦｃＤＮＡのフラグ
メントは、放射性ラベルし、ハイブリッド形成条件は、
前記の通りであった（実施例４）。ゲノムライブラリー
を示すファージプラークを、１０ｃｍのペトリ皿当たり
〜５０,０００プラークの密度で培養し、文献に記載の
ようにニトロセルロースに移した（マニアティスら、モ
レキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハ
ーバー、１９８２）。ハイブリッド形成前に、６×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１５Ｍクエン
酸ナトリウム）、０.２％フィコル、０.２％ポリビニル
ピロリドン、０.２％ウシ血清アルブミン、２ｍＭピロ
リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ変
性サケ***ＤＮＡおよび５０μｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ
中で６５℃で数時間フィルターをインキュベートした。
ハイブリッド形成は、０.１％ＳＤＳを含有する同じ溶
液中で、６５℃で１６〜１８時間行った。［α32Ｐ］ｄ
ＡＴＰを用いてニックトランスレーションにより比活性
〜２×１０8ｃｐｍ／μｇに放射性ラベルしたＬＩＦｃ
ＤＮＡフラグメントを、〜２×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃
度でハイブリッド形成に使用した。ハイブリッド形成
後、６×ＳＳＣ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム中で
６５℃で広範に洗浄し、次いでオートラジオグラフィー
に付した。複製フィルター上の陽性のプラークを取り、
前記のように低密度で再スクリーニングした。
【０１１６】３種のクローンλＨＧＬＩＦ１、２および
３をこのようにして同定および精製した。これらのクロ
ーンの関係を調べ、ヒトＬＩＦ遺伝子を含むかどうかを
調べるために、各クローンからＤＮＡを調製し、以下の
制限エンドヌクレアーゼで切断した：クローン化ゲノム
ＤＮＡの全セグメントを切断するＳａｌI、並びにＬＩ
Ｆ遺伝子内およびその周辺において切断するＢａｍＨI
およびＰｓｔI；（前記のように）それぞれ、〜３ｋｂ
ｐおよび１.８ｋｂｐおよび０.６ｋｂｐの固有のフラグ
メントを生成する。組換ファージＤＮＡを切断し、アガ
ロースゲル上の電気泳動により分画（第２４図、左図）
した後、ＤＮＡをニトロセルロースに移し、（前記条件
下に）マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブとハイブリッド形
成させて、ＬＩＦ遺伝子を有するフラグメントを明らか
にした（第２４図、右図）。この分析により、次のこと
がわかった （ａ）３種のクローンはいずれも同じであると考えられ
る、 （ｂ）いずれも、マウスＬＩＦプローブと相同の領域を
有するゲノムＤＮＡの〜９ｋｂｐセグメントを有する； （ｃ）マウスｃＤＮＡと相同の領域は、ヒトＬＩＦ遺伝
子に特有の３ｋｂｐＢａｍＨIフラグメント上並びに１.
８および０.６ｋｂｐＰｓｔIフラグメント上に存在する
（前記）。このように、３種のクローンはいずれもヒト
ＬＩＦ遺伝子を含む染色体ＤＮＡのセグメントを有する
ことがわかった。
【０１１７】工程３：ヒトＬＩＦ遺伝子のヌクレオチド
配列の決定 マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成する
前記λＨＧＬＩＦ１の〜３ｋｂｐのＢａｍＨIフラグメ
ントをプラスミドベクターｐＥＭＢＬ８+に再クローン
化してクローンｐＨＧＬＩＦＢａｍ１を生成し、ヌクレ
オチド配列分析に付した。ヌクレオチドシークエンシン
グは、アルカリ変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て使用し、遺伝子中の配列に相補的な種々のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして使用し、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球
症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとして使用して、
ジデオキシ法によって行った（サンガーら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ、米国、７４：５４６３〜５４６７、１９７
７）。
【０１１８】ＬＩＦ遺伝子にかかるＢａｍＨIフラグメ
ントの全ヌクレオチド配列（２８４０ｂｐ）を決定し、
そのうちの１２９７ｂｐを第２５図に示す。この配列を
マウスＬＩＦｍＲＮＡ配列と並べると、成熟ヒトＬＩＦ
タンパク質をコード化する配列が、６９３ｂｐのイント
ロンによって分離された２つのエクソン上に存在するこ
とがわかった（第２５図）。成熟タンパク質をコード化
する領域では、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列レベル
のいずれにおいても、２種間の相同性が高い。エクソン
１においては８８％の核酸配列（１１４／１２９残基）
および９１％のアミノ酸配列（３９／４３）が、成熟タ
ンパク質コード化領域（位置５８〜１８６）と同じであ
る。エクソン２はやや相同性が低く、コード化領域にお
いて、ヌクレオチドレベルで７７％（３１８／４１１）
およびアミノ酸レベルで７４％（１０１／１３６）であ
る。成熟タンパク質全体としては、ここで決定したマウ
スおよびヒトＬＩＦ配列は、挿入または欠失無く１４０
〜１７９位置（７８％）において同じである（第２６
図）。そのうえ、相違の多くは、少々の置換にすぎない
（Ｌｙｓ：Ａｒｇ、Ｇｌｕ：ＡｓｐおよびＬｅｕ：Ｖａ
ｌ：Ａｌａ）。
【０１１９】成熟ＬＩＦのＮ−末端プロリン残基のコド
ンの５'で、（第２５図の位置５８）ヒト遺伝子は、ほ
とんどの疎水性リーダーをコード化する領域を通してマ
ウスＬＩＦｍＲＮＡ配列と同じである。しかし、このｍ
ＲＮＡおよび遺伝子配列は、特有のＲＮＡ切断部位（Ｔ
ＣＣＣＡＧ）で異なるので、リーダー全体がこのエクソ
ンにおいてコード化されているのではない［マウント
（Mount，S.M.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１０：４５９〜４７２、１９８２］。５'未翻訳領
域およびリーダーの最初の残基を特定するエクソンは、
この切断部位の１０９７ｂｐ５'中に存在しない。マウ
スＬＩＦ遺伝子において、疎水性リーダーの最初の６個
のアミノ酸配列を特定するエクソンは、同様の切断部位
の〜１.５ｋｂｐ５'に位置する。
【０１２０】工程４：ヒトＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ切断地図の決定 ヒトＬＩＦ遺伝子中およびその周辺の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位の位置を決定し、この遺伝子の分子フィ
ンガープリント提供するために、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒ
ＡＭＯＳ細胞系由来）を種々の制限エンドヌクレアーゼ
で１本および２本鎖の状態で切断し、使用したプローブ
が前記工程３に記載のｐＨＧＬＩＦＢａｍ１から誘導
し、ニックトランスレーションによって放射性ラベルし
た３ｋｂｐのＢａｍＨIフラグメントであったことを除
いては実施例８に記載のようにサザンブロット分析に付
した。λＨＧＬＩＦ１およびｐＨＧＬＩＦＢａｍ１の分
析から誘導した第２２図に示すデータと同様に、そのよ
うに誘導したデータ（図示せず）を分析することによ
り、得られた制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２７
図に示す。
【０１２１】参考例２ 本実施例は、酵母細胞中で発現させるためのクローン化
ヒトＬＩＦ遺伝子の修飾、並びにそのように誘導された
組換ヒトＬＩＦの生物学的および生理学的性質の決定に
関する。第２８図 ：工程１に関する：ＹＥpseclに組み込むヒト
ＬＩＦ遺伝子の修飾に使用するオリゴヌクレオチド。オ
リゴヌクレオチド（ａ）は、コード化領域の５'末端
（第２５図の残基３１〜６９）に相当する。オリゴヌク
レオチド（ｂ）は、コード化領域の中央（第２５図の残
基１６３〜１８６および８８０〜９０３）に相当する。
エクソン１に相補的なこのオリゴヌクレオチドの部分に
は、ダッシュで下線を付し、エクソン２に相補的な部分
には、点線を付す。オリゴヌクレオチド（ｃ）は、コー
ド化領域の３'末端（第２５図の位置１２７９から）に
相当する。オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）は、
示された制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入する。
【０１２２】第２９図：工程１に関する：クローン化ヒ
トＬＩＦ遺伝子の突然変移誘発により誘導された合成ヒ
トＬＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによっ
てコード化されたアミノ酸。オリゴヌクレオチド（ａ）
および（ｃ）（第２８図）によって導入されるＢａｍＨ
IおよびＨｉｎｄIII切断部位を示す。（マウスと同様
に）成熟ＬＩＦの推定Ｎ−末端アミノ酸を＋１とする。
【０１２３】第３０図：工程３に関する：精製天然マウ
スＬＩＦ希釈物（○−−−○）およびガラクトースで誘
導したＹＥpsecl／ＨＬＩＦ組換体含有酵母細胞ならし
培地（● ●）による、Ｍ１白血病細胞コロニーに
おける分化の誘導。ＹＥpsecl／ＨＬＩＦ組換体含有非
誘導酵母培養の培地（○ ○）は不活性であった。
複製７日培養の平均データを示す。
【０１２４】第３１図：工程４に関する：酵母誘導ＨＬ
ＩＦと天然マウス125Ｉ−ＬＩＦとの、マウスＭ１細胞
特異的レセプターへの結合の競合。真正天然マウスＬＩ
Ｆ−Ａ（実施例１）の希釈物（○ ○）、組換マウ
スＬＩＦ（● ●）並びに非誘導ＹＥpsecl／ＨＬ
ＩＦ構造含有酵母細胞ならし培地（非誘導：■
■、誘導：□ □）の、３７℃におけるマウスＭ１
細胞の細胞レセプターへの天然125Ｉ−ＬＩＦ−Ａの結
合を競合する能力を前記のように試験した。
【０１２５】工程１：酵母における発現のためのヒトＬ
ＩＦ遺伝子の修飾 ヒトＬＩＦ遺伝子および前記ヌクレオチド配列を有する
組換ＤＮＡクローンの単離を前記のように行った（実施
例１０）。成熟ヒトＬＩＦタンパク質をコード化する２
エクソンにかかる１２９７ｂｐのＤＮＡのヌクレオチド
配列を第２５図に示す。
【０１２６】酵母細胞において、酵母発現ベクターＹＥ
pseclを用いてマウス組換ＬＩＦを予め調製した（実施
例５）。このベクターは、ガラクトース誘導性ハイブリ
ッドＧＡＬ−ＣＹＣプロモーターから転写された、クル
イヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から誘
導されたＮ−末端リーダー配列を提供する。
【０１２７】このベクター中でヒトＬＩＦ遺伝子によっ
てコード化されたタンパク質を発現するためには、いく
つかの手段で遺伝子を修飾する必要があった。成熟タン
パク質をコード化する領域の５'末端において、制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨI切断部位を導入して、クル
イヴェロミセス・ラクティスリーダーをフレームに挿入
させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位（Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ）を保持した。ここでも、マウスｃＤＮＡ（ｐＬ
ＩＦ７.２ｂ）に適用したのと同様の修飾を行った。中
央において、６９３ｂｐの間に入った配列を除去し、２
つのエクソンを同じ翻訳リーディングフレームに融合し
た。３'末端において、天然終止コドンの３'に第２の翻
訳終止コドンを直接導入し、ＹＥpseclに挿入するＨｉ
ｎｄIII部位を導入した。修飾はすべてオリゴヌクレオ
チド介在突然変異誘発によって行った：ＬＩＦ遺伝子に
かかる〜３ｋｂｐ ＢａｍＨIのフラグメントをプラスミ
ドｐＥＭＢＬ８+中にサブクローン化し（デンテら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ、１１：１６４５〜１
６５５、１９８３）、１本鎖ＤＮＡはＦ１重感染によっ
て調製した。イン・ビトロ突然変異誘発は、それぞれ３
９、４８および３９塩基のオリゴヌクレオチドを用い
て、文献［ニスベット（Nisbet，I.T.）およびバイルハ
ルツ（Beilharz，M.W.）、ジーン・アナリシス・タクニ
クス（Gene Anal．Techn.）、２：２３ ２９、１９８
５］に記載のように行い、前記のように遺伝子の５'末
端、中央および３'末端を修飾した（第２８図参照）。
修飾ヒトＬＩＦコード化領域のヌクレオチド配列を第２
９図に示す。
【０１２８】工程２：ＹＥpsecl／ＨＬＩＦ組換体の酵
母細胞への導入 エス・セレビシエ（S.cerevisiae）株ＧＹ１+（leu2 u
ra3 ade2 trp1 cir+；G.cesareni、ＥＭＢＬハイデ
ルベルク）を、ポリエチレングリコール法によって形質
転換した（クレベら、ジーン、２５：３３３〜３４１、
１９８３）。形質転換体を選択し、ウラシル不存在下
に、合成最少培地（必要なアミノ酸５０μｇ／ｍｌを補
給した、２％炭素源、０.６７％酵母窒素ベース（ディ
フコ））上に保持した。２方法のいずれかにより、組換
体ＨＬＩＦを調製した。（１）Ｕｒａ+形質転換体を２
％ガラクトース含有非選択的培地中で定常期で増殖さ
せ、培地のＬＩＦ活性をアッセイした。（２）Ｕｒａ+
形質転換体を２％グルコース含有選択的最少培地中で定
常期で増殖させた。次いで、細胞を洗浄し、同じ体積の
２％エタノール含有選択的最少培地に再懸濁させ、グル
コースリプレッションを補うために８時間増殖させた。
次いで、細胞を２％ガラクトース含有合成最少培地で希
釈（１：１０）することによってＨＬＩＦインサートの
転写を誘導した。誘導から種々の時間後に培養上澄試料
を採り、ミリポアフィルター（０.２μｍ）で濾過し、
ＬＩＦ活性を直接アッセイした。
【０１２９】工程３：酵母誘導ＨＬＩＦの生物学的性質
の決定 マウスおよびヒトのＬＩＦの配列が高度に類似している
という観点から、酵母誘導ヒトＬＩＦのマウスＭ１細胞
に対する活性を評価した。酵母ならし培地の分化誘導活
性および白血病抑制活性のアッセイは、２０％ウシ胎児
血清および０.３％寒天の最終濃度のダルベッコ改良イ
ーグル培地中にマウスＭ１細胞（ホズミ博士、サイタマ
・カンサー・リサーチ・センター、日本による提供）３
００個を含有する１ｍｌの培養中で行った。アッセイす
る試料は、寒天培地中の細胞懸濁液の添加前に、連続希
釈した０.１ｍｌの体積で培養器に加えた。培養は、空
気中１０％ＣＯ2の水蒸気飽和雰囲気中で７日間インキ
ュベートした。培養は、解剖顕微鏡を用いて３５倍の倍
率で、分散した細胞のコロナを有するか、または分散し
た細胞のみから成る分化したコロニーを記録した。コロ
ニーの形態学的検査は、全培養を２.５％グルタルアル
デヒド１ｍｌで固定し、次いで顕微鏡スライド上で乾燥
した培養をアセチルコリンエステラーゼ／ルクソール・
ファスト・ブルー／ヘマトキシリンで染色することによ
って行った。
【０１３０】同じ酵母細胞の非誘導培養の培地、非形質
転換酵母またはベクターＹＥpseclのみを含有する酵母
の培養の培地ではなく、ＹＥpsecl中にヒトコード化領
域を含有する酵母のガラクトース誘導培養の培地は、Ｍ
１コロニーの培養において特有のマクロファージ分化を
誘導することができた（第３０図）。マウスＬＩＦの場
合のように、濃度を高めると、酵母誘導ヒト試料も、Ｍ
１コロニー分化の数およびサイズを徐々に低下した。精
製天然マウスＬＩＦと比較すると、酵母ならし培地はヒ
トＬＩＦを５０,０００ユニット／ｍｌまで含有するこ
とがわかった。
【０１３１】工程４：酵母誘導ヒトＬＩＦのレセプター
結合特異性 精製マウスＬＩＦ−Ａ（実施例１）を前記のようにヨウ
素化した。Ｍ１細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清含有
Ｈｅｐｅｓ−緩衝ＲＰＭＩ培地中に２.５×１０6／５０
μｌで再懸濁させた。５０μｌ中の細胞を２００,００
０ｃｐｍの125Ｉ−ＬＩＦ−Ａ（同じ培地中１０μｌ）
および１０μｌの対照培地または非ラベル純マウスＬＩ
Ｆ−Ａの連続２倍希釈物またはＹＥpsecl／ＨＬＩＦ構
造を有する酵母形質転換体のガラクトース誘導もしくは
非誘導培養のならし培地と共にインキュベートした。
【０１３２】ＹＥpsecl／ＨＬＩＦ組換体含有ガラクト
ース誘導酵母細胞のならし培地は、マウスＭ１細胞上の
特異的細胞レセプターへの天然マウス125Ｉ−ＬＩＡ−
Ａの結合を、天然および組換マウスＬＩＦ−Ａと同程度
に、３７℃（第３１図）および０℃（図示せず）におい
て競合することができた。非誘導酵母細胞の培地および
ベクターＹＥpseclのみを含有する酵母細胞の培地は競
合しなかった。従って、１次アミノ酸配列の高度の相同
性に匹敵して、マウスおよびヒトＬＩＦにおいてレセプ
ター結合領域は高度に保持されることがわかる。
【０１３３】工程５：酵母誘導ヒトＬＩＦの精製、シー
クエンシングおよびヨウ素化 ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムに結合し、塩
傾斜によって溶出したＬＩＦ活性を工程２においてプー
ルしたことを除いては、ＹＥpsecl／ＨＬＩＦ組換体含
有ガラクトース誘導酵母細胞のならし培地中のヒトＬＩ
Ｆを、実施例１の工程２および４によって精製した。精
製した酵母誘導ヒトＬＩＦを、０.２Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７.２）５０μｌ中のヒトＬＩＦ１μｇ
を、２ＭＮａＣｌ中のＮａ125Ｉ（２.７μｌ）１ｍＣｉ
および０.２ｍＭ ＩＣｌ５μｌと共に６０秒間インキュ
ベートすることによって放射性ラベルした。０.０２％
トゥイーン２０および０.０２％アジ化ナトリウムを含
有するリン酸緩衝（２０ｍＭ、ｐＨ７.４）生理食塩液
（０.１５Ｍ）中で平衡化したセファデックスＧ−２５
Ｍ（ファルマシア）のカラム反応混合物を通すことによ
って、125Ｉ−ＬＩＦを、取り込まれなかった125Ｉから
分離した。ヒト125Ｉ−ＬＩＦを８〜２５％ドデシル硫
酸ナトリウムポリアミドゲル上で電気泳動すると、見掛
けの分子量１７０,０００の単一の広いバンドがあらわ
れた。ヒト125Ｉ−ＬＩＦがマウスＭ１細胞および骨髄
細胞に特異的に結合したことから、ヒトＬＩＦが、マウ
スＬＩＦレセプターへの結合能力を有することを確認し
た。精製酵母誘導ヒトＬＩＦ（約１０μｇ）を、実施例
２に記載のようにアミノ末端アミノ酸シークエンシング
に付し、単一の配列： Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala .... がわかった。これは、マウス配列（実施例２参照）： Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala .... の４番目のアミノ酸から始まることを除いては、ヒトＬ
ＩＦの推定アミノ酸配列（第２６図）と同じである。こ
のことは、精製した酵母誘導ヒトＬＩＦが、マウス配列
の対応する最初の３個のアミノ酸を欠いているが、生物
学的に活性であり、マウスＬＩＦレセプターに結合し得
ることを示している。最初の３個のアミノ酸は、ＬＩＦ
の生物学的活性に重要でないことがわかる。
【０１３４】参考例３ 本実施例は、推定天然ヒトＬＩＦ分枝を同定し、部分的
に精製するための工程を説明する。図面は、以下に記載
する方法の種々の工程に関する：第３２図 ：推定ヒトＬＩＦの同定の工程２に関する：ヒ
ト膀胱癌細胞系５６３７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ９）
（−□−）粗もしくは（−＋−）ＤＥＡＥ非結合フラク
ションのならし培地または天然マウスＬＩＦ−Ａ（−○
−）の種々の希釈物の、マウス125Ｉ−ＬＩＦ−Ａのマ
ウス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能
力。ヒトＧ−ＣＳＦ（−■−）は結合を競合する能力が
ないことも示されている（未希釈＝５μｇ／ｍｌ）。
【０１３５】第３３図：推定ヒトＬＩＦの同定の工程３
に関する：ヒト膀胱癌細胞系５６３７のならし培地の、
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムによる分画、
前記マウスＬＩＦ−Ａの分画（実施例１）と同様の溶
出、この分画による個々のフラクションの、マウスＭ１
細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。Ａ図は塩傾
斜、Ｂ図は５６３７ならし培地の分画、Ｃ図は比較のた
めのクレブスII細胞ならし培地の分画を示す。
【０１３６】第３４図：推定ヒトＬＩＦの同定の工程３
に関する：レンチル−レクチン・セファロース４Ｂカラ
ムによる、ヒト膀胱癌細胞系５６３７のならし培地の分
画（前記マウスＬＩＦ−Ａの分画と同様に溶出（実施例
１））およびこの分画による個々のフラクションの、マ
ウスＭ１細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。Ａ図
はα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド傾斜、Ｂ図は５６
３７ならし培地の分画、Ｃ図は比較のためのクレブスII
細胞ならし培地の分画を示す。
【０１３７】工程１：数種のヒト細胞系のならし培地
の、半固型寒天培養中のＭ１マウス骨髄性白血病細胞の
分化誘導および増殖抑制の能力をアッセイした（本発明
の実施例５の工程４と同様）。数種の細胞系はそのよう
な活性を示し、そのうち膀胱癌細胞系５６３７の活性は
最も高レベルであった。しかし、５６３７細胞系は、Ｍ
１細胞の分化を誘導し得るヒトＧ−ＣＳＦ［ニコラら、
ネイチャー、３１４：６２５〜６２８、１９８５；ウェ
ルテ（Welte，K.)ら、プロシーディングス・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、米国、８２：１
５２６〜１５３０、１９８５］を生成することがわかっ
ている［トミダ（Tomida，M.)ら、FEBS・レターズ（FEB
S Lett.)、２０７：２７１〜２７５、１９８６；ネカー
ズ（Neckers，L.M.）およびプルズニーク（Pluznik，D.
H.）、エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Exp．Hemat
ol.）、１５：７００〜７０３、１９８７］。５６３７
細胞が真正ヒトＬＩＦを（Ｇ−ＣＳＦに加えて）生成す
ることを確認するために、５６３７ならし培地を更に以
下の工程２および３に付した。
【０１３８】工程２：５６３７細胞のならし培地を２０
倍濃縮し、マウス腹膜細胞の特異的細胞レセプターへの
天然マウス125Ｉ−ＬＩＦ−Ａの結合を競合するその能
力を試験した。この競合結合アッセイは、本発明の実施
例５の工程５に記載した通りである。５６３７細胞なら
し培地は、細胞レセプターへのマウス125Ｉ−ＬＩＦ−
Ａの結合を競合する活性を有しており、この活性を５６
３７ＣＭ（ＬＩＦ−Ａ）ＤＥＡＥ非結合フラクソン中で
濃縮した（第３２図）。ヒトおよびマウスＧ−ＣＳＦ
は、非常に高い濃度でも125Ｉ−ＬＩＦ−Ａ結合部位を
競合しないので、５６３７ならし培地中に、マウスＬＩ
Ｆレセプターを特異性に認識し得る同様のヒトＬＩＦ活
性が存在することがわかる。このことは、１次アミノ酸
配列の高い相同性に匹敵して、レセプター結合領域にお
けるマウスおよびヒトＬＩＦの保存が強いことを示す。
【０１３９】工程３：ヒト膀胱癌５６３７細胞のならし
培地（１０％ｖ／ｖウシ胎児血清中２ｌ）を４０ｍｌに
濃縮し、クレブスII腹水細胞ならし培地からのマウスＬ
ＩＦに対する前記の場合と同ように、ＤＥＡＥ−セファ
ロースＣＬ−６Ｂおよびレンチル−レクチン−セファロ
ース４Ｂで連続的にクロマトグラフィーに付した。５６
３７細胞のＭ１分化誘導活性（推定ヒトＬＩＦ）を、マ
ウスＬＩＦの場合と同様にＤＥＡＥ−セファロースによ
るクロマトグラフィーに付すと、いくつかの活性はカラ
ムに結合しなかったが（ＬＩＦ−Ａ）、残りは結合し、
塩傾斜により溶出された（ＬＩＦ−Ｂ）（第３３図）。
同様に、レンチル−レクチン−セファロースクロマトグ
ラフィーにおいて、推定ヒトＬＩＦの挙動はマウスＬＩ
Ｆと同様であり、活性の１部はカラムに結合し、このこ
とは糖タンパク質上にマンノース含有炭水化物が存在す
ることを示す（第３４図）。このように、マウスＭ１細
胞分化誘導におけるその交差反応性、マウスＬＩＦ細胞
レセプターを特異的に認識するその能力、およびその生
化学的分画性によって、５６３７細胞ならし培地中のヒ
ト活性は、マウスＬＩＦの天然ヒト類縁体の基準を満た
す。
【０１４０】５６３７細胞ならし培地からの天然ヒトＬ
ＩＦを、実施例１の工程２および４によって精製した；
工程２から非結合ＬＩＦ活性のプールおよび工程４から
ＬＩＦ活性の結合。このプールされたＬＩＦ活性を、ブ
ラウンリーＲＰ３００Ｃ８カラムを、最初は０.１％Ｔ
ＦＡ中の０〜６０％ＣＨ3ＣＮ傾斜を用い、次いで０.１
％ＴＦＡ中の４５〜５５％ＣＨ3ＣＮ傾斜を用いて２回
使用したことを除いては実施例１の工程５と同様に逆相
ＨＰＬＣによって分画した。第２の傾斜において、ヒト
ＬＩＦは５０％ＣＨ3ＣＮで溶出され、８〜２５％傾斜
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行うと、見掛けの分子量７３,０００の主要な銀染
色バンドが現れた。天然精製ヒトＬＩＦを実施例１０の
工程５に記載のように放射性ヨウ素化し、酵母誘導ヒト
125Ｉ−ＬＩＦに関して記載したように（実施例１１の
工程５）、マウスＭ１細胞およびマウス骨髄細胞に特異
的に結合させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１のＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６
ＢによるＬＩＦの精製の工程２に関するグラフである。
【図２】 実施例１のレンチル（Lentil）・レクチン・
セファロース４ＢによるＬＩＦの精製の工程３に関する
グラフである。
【図３】 実施例１のＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂに
よるＬＩＦの精製の工程４に関するグラフである。
【図４】 実施例１の脂肪酸分析ＨＰＬＣカラムによる
ＬＩＦの精製の工程５に関するグラフである。
【図５】 実施例１の精製したＬＩＦの分子量および純
度を示すグラフである。
【図６】 実施例３に関するグラフである。
【図７】 実施例４のＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロー
ニングの工程１に関する電気泳動図である。
【図８】 実施例４のＬＩＦクローンの同定に使用した
オリゴヌクレオチドの配列表を示す図である。
【図９】 実施例４のＬＩＦｃＤＮＡクローンのクロー
ニングの工程４に関する１組のクローンの挙動を示す図
である。
【図１０】 実施例４のｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７.
２ｂのヌクレオチド配列およびＬＩＦアミノ酸配列を示
す図である。
【図１１】 実施例５の酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
の発現の工程１に関するアミノ酸配列およびヌクレオチ
ド配列を示す図である。
【図１２】 実施例５の酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
の発現の工程２に関するものであり、ｐＬＩＦ７.２ｂ
ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列およびそれによってコ
ード化されたアミノ酸配列を上の行に示す。
【図１３】 実施例５の酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
発現の工程４に関するものであり、Ｍ１白血病細胞の培
養における酵母誘導組換ＬＩＦの生物学的活性を示す図
である。
【図１４】 実施例５の酵母細胞におけるマウスＬＩＦ
発現の工程５に関するものであり、天然125Ｉ−ＬＩＦ
−Ａとマウス腹腔細胞上の細胞レセプターを競合する能
力を示すグラフである。
【図１５】 実施例６の工程１に関するものであり、ク
ローンｐＬＩＦＮＫ３のｃＤＮＡ部分のヌクレオチド配
列の前半を示す第１５Ａ図である。
【図１６】 実施例６の工程１に関するものであり、ク
ローンｐＬＩＦＮＫ３のｃＤＮＡ部分のヌクレオチド配
列（Fig.１５）の後半を示す第１５Ｂ図である。
【図１７】 実施例７の工程１に関するものであり、グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／トロンビン切断部
位／ＬＩＦ接合部におけるヌクレオチド配列、その接合
部におけるコード化された融合タンパク質の配列を示す
図である。
【図１８】 実施例８の工程１に関するものであり、高
および低ストリンジェンシー条件下におけるマウスＤＮ
ＡのｐＬＩＦ７.２ｂ誘導プローブとのハイブリッド形
成を示す図である。
【図１９】 実施例８の工程２に関する：種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分解した、１本鎖および２本鎖のマ
ウスＤＮＡと、マウスＬＩＦプローブとのハイブリッド
形成を示す図である。
【図２０】 実施例８の工程２に関するものであり、マ
ウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を示す図である。
【図２１】 実施例８の工程３に関するものであり、マ
ウスＬＩＦ遺伝子を有する３ｋｂ ＢａｍＨIフラグメン
トの位置を示す図である。
【図２２】 実施例９の工程２に関するものであり、：
マウスおよびヒト由来のゲノムＤＮＡに対する種々の条
件下におけるクローンｐＬＩＦ７.２ｂのｃＤＮＡの32
Ｐ−ラベルフラグメントのハイブリッド形成を示す、２
つの異なるオートファジオグラフィー照射を示す図であ
る。
【図２３】 参考例１の工程１に関するものであり、種
々のエンドヌクレアーゼで切断したヒトゲノムＤＮＡに
おいてヒト遺伝子の検出を示す図である。
【図２４】 参考例１の工程１に関するものであり、種
々のハイブリッド形成条件下における、マウスＬＩＦｃ
ＤＮＡプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成によるＬＩＦ遺伝子の検出を示す図である。
【図２５】 参考例１の工程２に関する：ＬＩＦ遺伝子
クローンの３試料の制限エンドヌクレアーゼ切断を示す
図である。
【図２６】 参考例１のヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程３に関するものであり、ヒトＬＩＦ遺伝子
（Ｈ）にかかるλＨＧＬＩＦ１の１.３ｋｂｐのセグメ
ントのｍＲＮＡ類似鎖の５'から３'方向へのヌクレオチ
ド配列の前半（第２５Ａ図）を示す図である。
【図２７】 参考例１のヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程３に関するものであり、ヒトＬＩＦ遺伝子
（Ｈ）にかかるλＨＧＬＩＦ１の１.３ｋｂｐのセグメ
ントのｍＲＮＡ類似鎖の５'から３'方向へのヌクレオチ
ド配列の後半（第２５Ｂ図）を示す図である。
【図２８】 参考例１のヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程３に関するものであり、ヒトＬＩＦのアミノ酸
配列およびマウスＬＩＦとの比較を示す図である。
【図２９】 参考例１のヒトＬＩＦ遺伝子のクローニン
グの工程４に関するものであり、ヒトＬＩＦ遺伝子の制
限エのンドヌクレアーゼ切断地図を示す図である。
【図３０】 参考例２の工程１に関するものであり、Ｙ
Ｅpseclに組み込むヒトＬＩＦ遺伝子の修飾に使用する
オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３１】 参考例２の工程１に関するものであり、ク
ローン化ヒトＬＩＦ遺伝子の突然変移誘発により誘導さ
れた合成ヒトＬＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列および
それによってコード化されたアミノ酸を示す図である。
【図３２】 参考例２の工程３に関するものであり、Ｍ
１白血病細胞コロニーにおける分化の誘導を示す図であ
る。
【図３３】 参考例２の工程４に関するものであり、酵
母誘導ＨＬＩＦと天然マウス125Ｉ−ＬＩＦとの、マウ
スＭ１細胞特異的レセプターへの結合の競合を示す図で
ある。
【図３４】 参考例３の推定ヒトＬＩＦの同定の工程２
に関するものであり、マウス125Ｉ−ＬＩＦ−Ａのマウ
ス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能力
を示す図である。
【図３５】 参考例３の推定ヒトＬＩＦの同定の工程３
に関するものであり、マウスＭ１細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。Ａ図は塩傾斜、Ｂ図
は５６３７ならし培地の分画、Ｃ図は比較のためのクレ
ブスII細胞ならし培地の分画を示す。
【図３６】 参考例３の推定ヒトＬＩＦの同定の工程３
に関するものであり、マウスＭ１細胞の分化コロニー生
成を誘導する能力を示す図である。Ａ図はα−メチル−
Ｄ−マンノピラノシド傾斜、Ｂ図は５６３７ならし培地
の分画、Ｃ図は比較のためのクレブスII細胞ならし培地
の分画を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/20 8318−4Ｈ 1/22 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/19 7236−4Ｂ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9050−4Ｂ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ＰＩ６００５ (32)優先日 1987年12月21日 (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (72)発明者 ニコラス・マルチン・グー オーストラリア連邦ビクトリア、3104、ノ ース・バルウィン、レンジビュー・グロー ブ20番 (72)発明者 ダグラス・ジェイムズ・ヒルトン オーストラリア連邦ビクトリア、3113、ワ ランダイト、ウエスト・エンド・ロード８ 番 (72)発明者 ジュリー・アン・キング オーストラリア連邦ビクトリア、3131、ヌ ナウエイディング、スプリングベール・ロ ード121番 (72)発明者 ドナルド・メットカーフ オーストラリア連邦ビクトリア、3103、バ ルウィン、ユニオン・ロード268番 (72)発明者 エドアルド・コリンズ・ナイス オーストラリア連邦ビクトリア、3182、セ ント・キルダ、オデッサ・ストリート９番 (72)発明者 ニコス・アンソニー・ニコラ オーストラリア連邦ビクトリア、3073、レ ジェント、クイーン・ストリート59番 (72)発明者 リチャード・ジョン・シンプソン オーストラリア連邦ビクトリア、3121、リ ッチモンド、スタンレイ・ストリート42番 (72)発明者 トレーシー・アン・ウイルソン オーストラリア連邦ビクトリア、3104、ノ ース・バルウィン、フォーチュナ・アベニ ュー26番

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 分離・精製されたマウス白血病抑制因
    子。
  2. 【請求項２】 分離・精製された組換えマウス白血病抑
    制因子。
  3. 【請求項３】 グルコシル化または非グルコシル化マウ
    ス白血病抑制因子（ＬＩＦ）の精製方法であって、(a)
    粗ＬＩＦを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付
    し、塩増加勾配によりＬＩＦを溶出し、(b)工程(a)の生
    成物を、マンノースに対する親和性を有するレクチンア
    フィニティカラムクロマトグラフィーに付し、マンノー
    ス誘導体としてＬＩＦを溶出し、(c)工程(b)の生成物を
    陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、塩増加
    勾配でＬＩＦを溶出し、(d)工程(c)の生成物を、ＨＰＬ
    Ｃ条件下に逆相カラムクロマトグラフィーに付し、アセ
    トニトリルの増加勾配でＬＩＦを溶出することを含む方
    法。
  4. 【請求項４】 粗ＬＩＦが、クレーブスII腹水癌細胞な
    らし培地を含むものである、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 マウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）をコー
    ドし、 ヌクレオチド配列： 【化１】 CCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTGCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTC からなる組換えＤＮＡ分子、またはＬＩＦ活性を有する
    ポリペプチドをコードし、１個またはそれ以上のヌクレ
    オチドが欠失、置換または付加した上記ヌクレオチド配
    列の機能的誘導体。
  6. 【請求項６】 ６×ＳＳＣ、６５℃の条件下、またはそ
    れ以上の厳しい条件下で、 ヌクレオチド配列： 【化２】 CACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGC CACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCA AGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCC TATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATG TGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGA AGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCC CTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAG CCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCA GCAATGTGCTTTGCCGTCTGTGCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGAT GTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAA GTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAAGCAAG を有するｐＬＩＦ７.２ｂ、 ヌクレオチド配列： 【化３】 GCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATAC AAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG を有するｐＬＩＦＮＫ１、 ヌクレオチド配列： 【化４】 GAATTCCGGAGTCCAGCCCATAATGAAGGTCTTGGCCGCAGGGATTGTGC CCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAGAGAGGAGGTCTTGAAT GTACCATGGACTGAGGGACCTCAGGAGCAGGATCCGGAGGTGGGGAGGGG GCTCAAAATGTGCTGGGGTTTGGGACATTGTTAAATGCAAAACGGGGCTG CTGGCAGACCCCAGGGATTTCCAGGTACTCACTGCACTCTGGGCTGGGCC ATGATGGAATCTGGCAAAGTTGAAACTTCCATAGGCAGAGCTTCTATACA GCCCAGCACCAGCTAGAAATGGCAATGAGGGTGTTGGTCTGAGAGATTTC TGTCTCACTCACTCACTCACTCACTCTCACTCACTCACTCACTCACTCAC TCAGCCCCTTGCTTGCTGGGTGTAGAACAAGCTGCCACAAGTTGTCTACA GCAGACAGCAAAGGGCTGGGAAGTGTCCTAGACCCCTACAGAGTCACCAT CATCTGGTCCTTTGCTGTCTCTCAGAGAAACTTTGGAAGGCTTGGTTGGG ATGTGAGAGAGCTAAGGGGACTGGGATCCAGAAGGAATCCTTTTATTTTA TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATAAGTTTTGTGGGTGGAAGG GTACCCTGGGGTGGAATGATGGAATGTGTCTTCTCTTGAGTTGGATGAGA GAGTTCAGGCTTAGAGACTGTCAGATGGAAGAGTCTACCTCACCAGTGTT CAGCTCCCACAGAAGCACAGCGGCCAGCTTCCAGTTGTCAAAGCCT-ACG AACTCGGTTAGCTTCTATGCAGTTCCCCCCACAGCCTGGCGTGGTTGGGG TCTGCCAGCTGGACCTAGAGGTGAGGTGTGTGGAATTC を有するｐＬＩＦＮＫ３、および ヌクレオチド配列： 【化５】 TCCCCAGGAGTTGTGCCCCTGCTGTTG---GTTCTGCACTGGAAACATGG GGCGGGGAGCCCCCTCCCCATCACCCCTGTCAACGCCACCTGTGCCATAC GCCACCCATGTCACAACAACCTCATGAACCAGATCAGGAGCCAACTGGCA CAGCTCAATGGCAGTGCCAATGCCCTCTTTATTCTCTATGTAAGTTACCC CTGGGATACTGACAGGAGATGGCAGGGAGGGGGCTTGTAAATATCATTAG GGGCTGTCCTGATCTGGGTTGAGGGGACCTTTTGGGGCTGGAAGGAGAGA ATGGGGAGAGGGCTTGATTAAACCACCCCCAGACTCCTGCCACTTCCTGC CCAAGCTTCCCCAGGGAAGCTTCCCCAGGGTGCCCAGTTAGCAAGGGGAG AACTGAGTGCAAAGGTGGGGACCTGGCACTTCTTATCTTGTGATTGTCCT GCTGCAGGGAGCGAGGGATGGAGGGGAAATGGGCGTGAGGCACCAGGGAG ATGCGGTTGAGAGGCAGTGGGCTGTGGGTGCTGGGCATGGAGGGGCGTCC CGGAACATTGTGAGTGCAGGGATGGAAGTACTTGTGTGTGGTGCCCCAGC TAGGGCTAGACACCGAGTTTTCCCTTCTGTCCCCTTAGGGTGGTGATGAT GATGATGATGATAATGATGACTGCGTGCATGGCTCAGTCTTTGATCTTTA GCAAGGGCACTCACATTACAATTAGTTTTGGCTCTCATGACAATTCCAGA TGCTTACAGGGCAAGGAGTTGGGTCCTCATGCGCTAGATGGGGAAACAGA CGCAAGAGCTTGCCCAAAGGGTTGGCGGCAGGGCTGGGACACTGACCCCT GACTCCCACGTCACCTCCCTTCTGCCCCTCAGTACACAGCCCAGGGGGAG CCGTTCCCCAACAACCTGGACAAGCTATGTGGCCCCAACGTGACGGACT TCCCGCCCTTCCACGCCAACGGCACGGAGAAGGCCAAGCTGGTGGAGCTGT ACCGCATAGTCGTGTACCTTGGCACCTCCCTGGGCAACATCACCCGGGAC CAGAAGATCCTCAACCCCAGTGCCCTCAGCCTCCACAGCAAGCTCAACGC CACCGCCGACATCCTGCGAGGCCTCCTTAGCAACGTGCTGTGCCGCCTGT GCAGCAAGTACCACGTGGGCCATGTGGACGTGACCTACGGCCCTGACACC TCGGGTAAGGATGTCTTCCAGAAGAAGAAGCTGGGCTGTCAACTCCTGGG GAAGTATAAGCAGATCATCGCCGTGTTGGCCCAGGCCTTCTAGCAGGAGG を有するｐＨＧＬＩＦＢａｍ１からなるクローン群から
    選ばれる核酸プローブとハイブリダイズする、請求項５
    記載の組換えＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 上記ポリペプチドが、 (a)Ｍ１骨髄性白血病細胞の増殖を抑制し得ること、 (b)Ｍ１細胞またはマウスマクロファージの特定の細胞
    レセプターの結合についてマウスＬＩＦと競合し得るこ
    とを特徴とする、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコ
    ードする請求項５記載の組換えＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 複製開始点を更に含み、それにより上記
    分子をクローニングベクターとしての使用に適したもの
    とする、請求項５〜７のいずれか１項記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。
  9. 【請求項９】 上記ヌクレオチド配列に機能可能に結合
    するプロモーター配列を更に含み、それにより上記分子
    を発現ベクターとしての使用に適したものとする、請求
    項８記載の組換えＤＮＡ分子。
  10. 【請求項１０】 アミノ酸配列： 【化６】 ProLeuProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGlyAsn LeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAlaAsnAlaLeuPhe IleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsnAsnValGluLysLeuCysAla ProAsnMetThrAspPheProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuVal GluLeuTyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGln LysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspVal MetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHis ValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeu GlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAlaPhe を有するヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、または、上記
    アミノ酸配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸が欠
    失、置換または付加したＬＩＦ活性を有するその誘導体
    をコードする組換えＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 請求項４〜１０のいずれか１項に記載
    の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 酵母細胞、哺乳動物細胞または他の真
    核細胞である、請求項１１記載の宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 原核細胞である、請求項１１記載の宿
    主細胞。
  14. 【請求項１４】 ＬＩＦ活性を有するポリペプチドの製
    造方法であって、(a)請求項１１〜１３のいずれか１項
    に記載の宿主細胞を用い、(b)上記細胞を、ＬＩＦ活性
    を有するポリペプチドの発現を誘導する条件下に培養
    し、(c)上記ポリペプチドを回収することを含む方法。
  15. 【請求項１５】 ポリペプチドが、 【化７】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeuPro IleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGlyAsn LeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAlaAsn AlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsnAsn ValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPheProSerPheHisGly AsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeuTyrArgMetValAlaTyr LeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGlnLysValLeuAsnPro ThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspValMetArg GlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgValGly HisValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPheGln ArgLysLysLeuGlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSer ValValValGlnAlaPhe; および ProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHisGly AsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGlySerAla AsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluProPheProAsn AsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPheProSerPheHis GlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeuTyrArgMetValAla TyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArgAspGlnLysValLeuAsn ProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeuAsnAlaThrIleAspValMet ArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCysArgLeuCysAsnLysTyrArgVal GlyHisValAspValProProValProAspHisSerAspLysGluAlaPhe GlnArgLysLysLeuGlyCysGlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIle SerValValValGlnAlaPhe * * * から選ばれるアミノ酸配列と相同である成熟ポリペプチ
    ドを含むものである、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ポリペプチドが下記のアミノ酸配列： 【化８】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHis GlyAsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGly SerAlaAsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluPro PheProAsnAsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPhe ProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeu TyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArg AspGlnLysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeu AsnAlaThrIleAspValMetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCys ArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHisValAspValProProVal ProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeuGlyCys GlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAla Phe * * * と相同である成熟ポリペプチドを含むものである、請求
    項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドが宿主細胞によってグリ
    コシル化されているものである、請求項１４〜１６のい
    ずれか１項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 宿主細胞が酵母細胞である、請求項１
    ７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 プロモーターが、ガラクトース誘導ハ
    イブリッドＧＡＬ−ＣＹＣプロモーターである、請求項
    １４〜１６のいずれか１項記載の方法。
  20. 【請求項２０】 上記ポリペプチドが、ポリペプチドの
    分泌を目的とするリーダー配列を更に含むものである、
    請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 リーダー配列が、クルイヴェロミセス
    ・ラクティスのキラー毒素から誘導されるものである、
    請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 宿主細胞が、サッカロミセス・セレビ
    シアエである、請求項１８記載の方法。
  23. 【請求項２３】 宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請
    求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 宿主細胞が、レトロウイルス発現ベク
    ターで形質転換されたものである、請求項２３記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 ベクターが、モロニーマウス白血病ウ
    イルスから誘導されたものである、請求項２４記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 ベクターが、骨髄増殖性肉腫ウイルス
    のＬＴＲエンハンサーを更に含むものである、請求項２
    ５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 上記ベクターが、天然ＬＩＦｍＲＮＡ
    の３'非翻訳領域を欠くものである、請求項２６記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 宿主細胞が、造血細胞である、請求項
    ２３記載の方法。
  29. 【請求項２９】 宿主細胞が、Ｅ.coli細胞である、請
    求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ベクターが、グルタチオンＳ−トラン
    スフェラーゼ／ＬＩＦ融合タンパク質の発現を目的とす
    るベクターである、請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ベクターが、グルタチオンＳ−トラン
    スフェラーゼ／トロンビン分解部位／ＬＩＦ融合タンパ
    ク質の発現を目的とするベクターである、請求項３０記
    載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１４〜１６のいずれか１項に記
    載の方法により製造され、ＬＩＦ活性を有するポリペプ
    チド。
  33. 【請求項３３】 請求項５に記載のＤＮＡ分子によって
    コードされているアミノ酸配列を含み、ＬＩＦ活性を有
    するポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 マウスＬＩＦのアミノ酸残基１７９〜
    １８７個を含み、ＬＩＦ活性を有するポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 天然由来マウスＬＩＦの最初から少な
    くとも３個のアミノ酸残基を欠くＮ−末端を有する、Ｌ
    ＩＦ活性を有するポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 請求項１または２に記載のポリペプチ
    ドを含む、医薬的に許容され得る形態の骨髄性白血病細
    胞増殖阻害剤。
  37. 【請求項３７】 薬学的担体および／または希釈剤と組
    み合わせた、請求項１、２、３２および３３のいずれか
    １項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
  38. 【請求項３８】 請求項５に記載のＤＮＡ分子によって
    コードされた成熟ポリペプチドを含む、請求項３７記載
    の組成物。
  39. 【請求項３９】 アミノ酸配列： 【化９】 MetLysValLeuAlaAlaGlyIleValPro LeuLeuLeuLeuValLeuHisTrpLysHisGlyAlaGlySerProLeu ProIleThrProValAsnAlaThrCysAlaIleArgHisProCysHis GlyAsnLeuMetAsnGlnIleLysAsnGlnLeuAlaGlnLeuAsnGly SerAlaAsnAlaLeuPheIleSerTyrTyrThrAlaGlnGlyGluPro PheProAsnAsnValGluLysLeuCysAlaProAsnMetThrAspPhe ProSerPheHisGlyAsnGlyThrGluLysThrLysLeuValGluLeu TyrArgMetValAlaTyrLeuSerAlaSerLeuThrAsnIleThrArg AspGlnLysValLeuAsnProThrAlaValSerLeuGlnValLysLeu AsnAlaThrIleAspValMetArgGlyLeuLeuSerAsnValLeuCys ArgLeuCysAsnLysTyrArgValGlyHisValAspValProProVal ProAspHisSerAspLysGluAlaPheGlnArgLysLysLeuGlyCys GlnLeuLeuGlyThrTyrLysGlnValIleSerValValValGlnAla Phe * * * と全く相同である成熟ポリペプチドを含むものである、
    請求項３７記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 少なくとも１種の他の生物学的血球調
    節物質を更に含むものである、請求項３７記載の組成
    物。
  41. 【請求項４１】 上記他の調節物質が、Ｇ−ＣＳＦまた
    はＧＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドである、請求
    項４０記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 ｐＬＩＦ７.２ｂ： 【化１０】 CACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGC CACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCA AGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCC TATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATG TGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGA AGACCAACTTGGTGGAGCTGTATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCC CTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAG CCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCA GCAATGTGCTTTGCCGTCTGTGCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGAT GTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAA GTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAAGCAAG ｐＬＩＦＮＫ３： 【化１１】 GAATTCCGGAGTCCAGCCCATAATGAAGGTCTTGGCCGCAGGGATTGTGC CCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCAGGGAGCCCTCTT CCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATACGCCACCCATGCCACGG CAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAACTGGCACAGCTCAATGGCAGCG CCAATGCTCTCTTCATTTCCTATTACACAGCTCAAGGAGAGCCGTTTCCC AACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTTCCCATCTTT CCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGTATCGGATGG TCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGACCAGAAGGTC CTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGCTACTATAGA CGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGT-CTTTGCCGTCTGTGCAACAAGT ACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCACTCTGACAAA GAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATACAA GCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAGAGAGGAGGTCTTGAAT GTACCATGGACTGAGGGACCTCAGGAGCAGGATCCGGAGGTGGGGAGGGG GCTCAAAATGTGCTGGGGTTTGGGACATTGTTAAATGCAAAACGGGGCTG CTGGCAGACCCCAGGGATTTCCAGGTACTCACTGCACTCTGGGCTGGGCC ATGATGGAATCTGGCAAAGTTGAAACTTCCATAGGCAGAGCTTCTATACA GCCCAGCACCAGCTAGAAATGGCAATGAGGGTGTTGGTCTGAGAGATTTC TGTCTCACTCACTCACTCACTCACTCTCACTCACTCACTCACTCACTCAC TCAGCCCCTTGCTTGCTGGGTGTAGAACAAGCTGCCACAAGTTGTCTACA GCAGACAGCAAAGGGCTGGGAAGTGTCCTAGACCCCTACAGAGTCACCAT CATCTGGTCCTTTGCTGTCTCTCAGAGAAACTTTGGAAGGCTTGGTTGGG ATGTGAGAGAGCTAAGGGGACTGGGATCCAGAAGGAATCCTTTTATTTTA TTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATAAGTTTTGTGGGTGGAAGG GTACCCTGGGGTGGAATGATGGAATGTGTCTTCTCTTGAGTTGGATGAGA GAGTTCAGGCTTAGAGACTGTCAGATGGAAGAGTCTACCTCACCAGTGTT CAGCTCCCACAGAAGCACAGCGGCCAGCTTCCAGTTGTCAAAGCCT-ACG AACTCGGTTAGCTTCTATGCAGTTCCCCCCACAGCCTGGCGTGGTTGGGG TCTGCCAGCTGGACCTAGAGGTGAGGTGTGTGGAATTC ｐＬＩＦＮＫ１： 【化１２】 GCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGGGACATAC AAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG および、ｐＨＧＬＩＦＢａｍ１： 【化１３】 GGGATTGTGCCCTTACTGCTGCTGGTTCTGCACTGGAAACACGGGGCA GGGAGCCCTCTTCCCATCACCCCTGTAAATGCCACCTGTGCCATAC GCCACCCATGCCACGGCAACCTCATGAACCAGATCAAGAATCAA CTGGCACAGCTCAATGGCAGCGCCAATGCTCTCTTCATTTCCTAT TACACAGCTCAAGGAGAG CCGTTTCCCAACAACGTGGAAAAGCTATGTGCGCCTAACATGACAGACTT CCCATCTTTCCATGGCAACGGGACAGAGAAGACCAAGTTGGTGGAGCTGT ATCGGATGGTCGCATACCTGAGCGCCTCCCTGACCAATATCACCCGGGAC CAGAAGGTCCTGAACCCCACTGCCGTGAGCCTCCAGGTCAAGCTCAATGC TACTATAGACGTCATGAGGGGCCTCCTCAGCAATGTGCTTTGCCGTCTGT GCAACAAGTACCGTGTGGGCCACGTGGATGTGCCACCTGTCCCCGACCAC TCTGACAAAGAAGCCTTCCAAAGGAAAAAGTTGGGTTGCCAGCTTCTGGG GACATACAAGCAAGTCATAAGTGTGGTGGTCCAGGCCTTCTAG-AG-AGG からなるクローン群から選ばれる配列に対応する、少な
    くとも１種の核酸配列を含む、診断用試薬またはプロー
    ブ。
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT87133B (pt) * 1987-04-02 1992-07-31 Amrad Corp Ltd Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif
US20030032178A1 (en) * 1988-08-04 2003-02-13 Williams Robert Lindsay In vitro propagation of embryonic stem cells
JP2740320B2 (ja) * 1988-08-04 1998-04-15 アムラド・コーポレイション・リミテッド 胚幹細胞のインビトロ増殖
WO1990002183A1 (en) * 1988-08-18 1990-03-08 Genetics Institute, Inc. Production of a novel lymphokine exhibiting differentiation inhibitory activity
US5284756A (en) * 1988-10-11 1994-02-08 Lynn Grinna Heterodimeric osteogenic factor
WO1990009442A1 (en) * 1989-02-08 1990-08-23 Uab Research Foundation Antiproliferation factor
CA2045630A1 (en) * 1989-11-24 1991-05-25 Lawrence Austin Proliferative action of leukaemia inhibitory factor on satellite cells
DE69119759T2 (de) 1990-03-20 1997-01-16 Amrad Corp Ltd Verfahren zur steuerung der neuronentwicklung und des neuronunterhalts
IL97779A (en) * 1990-04-10 2000-01-31 Genentech Inc Compositions for cytoprotection against radiation and chemotherapy injury or risk thereof
US5595887A (en) * 1990-07-16 1997-01-21 Bionebraska, Inc. Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment
KR940702380A (ko) * 1991-12-24 1994-08-20 스튜와트 슈트 종양 및 육종의 치료 방법(A Method for the treatment of Tumours and Sarcomas)
US5916871A (en) * 1992-04-27 1999-06-29 Kansas State University Research Foundation Inhibitory factor
WO1994001464A1 (en) * 1992-07-01 1994-01-20 Amrad Corporation Limited Leukaemia inhibitory factor-binding protein
WO1994018236A1 (en) * 1993-02-03 1994-08-18 Amrad Corporation Limited Receptor-binding determinant from leukaemia inhibitory factor
US6849427B1 (en) * 1993-03-12 2005-02-01 Immulogic Pharmaceutical Corp. Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p VII, and uses therefor
WO1995020661A1 (en) * 1994-01-27 1995-08-03 Bresatec Ltd. Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation
US5849991A (en) * 1994-01-27 1998-12-15 Bresatch Limited Mice homozygous for an inactivated α 1,3-galactosyl transferase gene
US6184370B1 (en) * 1994-02-03 2001-02-06 Amrad Corporation Limited Receptor-binding determinant from leukaemia inhibitory factor
US5824838A (en) * 1996-05-09 1998-10-20 Cedars-Sinai Medical Center Transgenic mouse model for pituitary disorders associated with LIF overexpression and/or GH underexpression, and its use for testing therapeutic drugs for the conditions
AU4229897A (en) * 1996-07-25 1998-02-20 New York University Polypeptide cofactors that mediate alpha-tubulin and beta-tubulin folding
US6156729A (en) 1997-10-15 2000-12-05 California Institute Of Technology Leukemia inhibitory factor for use in modulating inflammation and pain
AUPP053197A0 (en) * 1997-11-26 1997-12-18 Amrad Operations Pty. Limited Compositions
JP2002519387A (ja) 1998-07-06 2002-07-02 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ レプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 体外受精のための組成物および方法
US20040234539A1 (en) * 1999-11-03 2004-11-25 Powderject Research Limited Nucleic acid vaccine compositions having a mammalian cd80/cd86 gene promoter driving antigen expression
ES2334639T3 (es) * 2000-06-14 2010-03-15 Vistagen, Inc. Tipificacion de toxicidad empleando celulas madre hepaticas.
JP4480329B2 (ja) 2000-10-20 2010-06-16 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｇｌｐ−１ペプチドによる冬眠心筋および糖尿病性心筋症の治療
US7604807B2 (en) * 2000-12-01 2009-10-20 Auburn University Use of pullulan to isolate and preserve biological material
JP2005503759A (ja) * 2001-01-24 2005-02-10 アメリカ合衆国 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法
US20030211605A1 (en) * 2001-05-01 2003-11-13 Lee Sang-Hun Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells
CA2461290C (en) 2001-09-24 2014-11-25 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
GB0220145D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Thromb X Nv Novel compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (ES) cell lines with germline transmission capability
WO2003054170A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability and for the culture of adult stem cells
US20050010231A1 (en) * 2003-06-20 2005-01-13 Myers Thomas H. Method and apparatus for strengthening the biomechanical properties of implants
FR2870854B1 (fr) * 2004-05-26 2010-12-31 Oreal Utilisation du lif en ingenierie cellulaire et tissulaire
FR2870739B1 (fr) * 2004-05-26 2008-05-16 Oreal Utilisation du lif en cosmetique et en dermatologie
US20050277124A1 (en) 2004-06-10 2005-12-15 White Steven M Cardiac conduction system cells and uses thereof
BRPI0713572A2 (pt) * 2006-06-20 2012-10-23 Stephen Duguay meios livres de soro e seus usos para expansão de condrócitos
US20130059375A1 (en) 2010-04-02 2013-03-07 Riken Method for preparing es cells
KR101434739B1 (ko) * 2012-08-23 2014-09-01 울산대학교 산학협력단 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법
WO2014130706A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
HUE056903T2 (hu) 2013-04-16 2022-04-28 Regeneron Pharma Patkány genom célzott módosítása
US20210046193A1 (en) * 2018-03-02 2021-02-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Drug stabilized therapeutic transgenes delivered by adeno-associated virus expression

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4578355A (en) * 1983-01-12 1986-03-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Plasmid cloning vector pAS1
JPS60105621A (ja) * 1983-11-14 1985-06-11 Agency Of Ind Science & Technol 細胞の分化誘導作用を有する生理活性物質およびその製法
US4616079A (en) * 1984-08-24 1986-10-07 Imreg, Inc. Immunoamplifiers and processes for the extraction thereof
US5104650A (en) * 1985-02-05 1992-04-14 Cetus Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung
JPS62223126A (ja) * 1986-03-25 1987-10-01 Sankyo Co Ltd 血液幹細胞成長因子
PT87133B (pt) * 1987-04-02 1992-07-31 Amrad Corp Ltd Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif
JPS6448197A (en) * 1987-08-19 1989-02-22 Sanden Corp Goods takeoff port unit for vending machine
JPH01148197A (ja) * 1987-12-04 1989-06-09 Green Cross Corp:The 腫瘍細胞障害因子

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