JPH03503002A - 蛋白質甘味料の酵母中における発現 - Google Patents
蛋白質甘味料の酵母中における発現Info
- Publication number
- JPH03503002A JPH03503002A JP2501518A JP50151889A JPH03503002A JP H03503002 A JPH03503002 A JP H03503002A JP 2501518 A JP2501518 A JP 2501518A JP 50151889 A JP50151889 A JP 50151889A JP H03503002 A JPH03503002 A JP H03503002A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- domain
- yeast
- transcription
- sequence
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
17、上記酵母がサツカロミセス・セレビシアエ(S accharomyce
s cerevisiae)であり、上記転写開始部位がGAP、上流活性化
配列由来の5゛ドメインとグリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナ
ーゼ由来の3゛ドメインを含むことを特徴とする酵母細胞。
18.5°−3゛の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位
の5゛ドメインに由来する5°ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の3°ドメイ
ンとを含む転写開始部位:上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ
ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質
的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも1個の非保存型置
換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠;およ
び転写終了部位を含む、DNA発現構築物。
19、上記転写開始部位はGAL上流活性化配列由来の5゛ドメインとグリセル
アルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼプロモター由来の3°ドメイン
を含む、DNA発現構造物。
20、上記シグナル配列がクルベロミセス・ラクチス(K 1uverosyc
es 1actis)キラー毒素の部分シグナル配列であり、上記プロセッシ
ングシグナルがIys −grgである、請求項19g1l!載のDNA発現構
築物。
21、請求項18〜20のいずれか1項記載のDNA発現構築物を含む、酵母細
胞中において安定な複製が可能なベクター。
明 細 書
諌旦
蛋白質甘味料の酵母中における発現
関連発明のクロス・リファレンス
本出願は、1987年7月19日に出願された出願番号第06441号出願の一
部継続出願である。
本発明は合成蛋白質甘味料を製造するための組換え技術及び組成物に関するもの
である。
背景技術
モネリンは、西部アフリカで生息するデオスコレフイルム・コムニシイ(D i
oscorephyllum Coo+n1nsii)という植物の実である
“不思議な成果(S erendipity berries)”の樹液に存
在する非常1こ甘い物質である。この物質は均一性物質に精製され、炭水化物が
まったく含有しない、分子量1.lX10’の塩基性蛋白質であることが判明し
た。モネリンは熱帯植物に見られる物質に由来するいくつかの甘味料または調味
料などのうちでその特性が最も良く知られた物質であり、大きさがほとんど同一
の二つのサブユニットが非共有結合で結合している。この二つのサブユニットは
同一でなく、モネリンの味を出す能力は二つのサブユニットと−っの単一メルカ
プタン基によるものであり、これを遮断すれば甘みが失われる。
植物原料から天然生成物を抽出する場合の不確実性および費用のいている。組換
え技術は多様な種類の蛋白質を合成する機会を提供する。しかし、組換え技術を
使用する場合、遺伝子を製造するための方法を開発し、蛋白質が宿主細胞から成
功裏に発現されたかどうかを立証しなければならず、生理活性を示す蛋白質を分
離する必要がある。多くの場合、有用な生成物生産の不確実性を実質的に増大す
る・・・が必要または・・・。
関連文献:
モリスら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー(J、Biol、
CheIl、XI 973)248:534〜539にモネリンの特性が説明さ
れており、その他、カガン、サイエンス(S cience)(1973)18
1:32〜35;、ウロダヮーおよびホジソン、プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーダ・ニーニスエイ(Proc、
Natl、 Acad、 Sei、 USAXI 975)72:398〜39
9;ボアクおよびシー、バイオケミ力・工・バイオロジー・アクタ(B 1oc
hi+oica et B 1ophysica Acta)(1976)
427:153〜+ 70;ハドソンおよびピーマン、バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochea、 B
iophys、 Res、 Comn、 )(1976)71 :212〜22
0;ジルゲンソン、バイオケミ力・工・バイオロジー・アクタ(Bioche+
*、 Biophys、 Acta)(1976)446 :25 S〜261
及びファン・デル・ウェルおよびロエブ、フェプス・レターズ(FEBS Le
tt、 XI 973)29:181〜+ 83にもモネリンの特性について説
明されている。米国特許第3,998,798号には天然モネリンの製造方法が
説明されている。
酵母のリーダー配列についてはスタックら、ヌクレア・アシツズ・リサーチ(N
ucl、 Ac1ds Res、 Xi 984)12:6011〜6030
及びジュリウスら、セル(CellX1984)37:1075〜1085に説
明されている。シス(cis)−作用DNA要素であるGAL上流活性化配列は
ディビス、モルキュシー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mat、Ce11
.Biol、XI 984)4:1440〜1448に説明されており、グリセ
ルアルデヒド−3−ホスファート デヒドロゲナーゼの転写開始部位はホランド
およびホランド、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J、 B
jol、 Che+i、XI 979)254:5466〜5475;9839
〜9845及びホランドら、1bid(1983)258:5291〜5299
に説明されている。
発明の概要
本発明は新規な蛋白質甘味料を製造するための方法及び組成物に関するもので、
甘味料を酵母宿主内で発現させ、発現された甘味料が活性構造で、高収率で生産
される方法および組成物を提供する。
具体的実施例の説明
本発明はA(1)とB(II)のサブユニット間の架橋と少なくとも一個のアミ
ノ酸置換を含む少なくとも1個の変異部位を有する結果として変異野生型配列を
有する合成モネリンを製造する新規方法を提供するものである。
尚、本発明は強力な転写開始部分、とくに強力な酵母転写開始部分の3°ドメイ
ンと3′ドメインの転写活性を増強する5゛ドメインを含むハイブリッド転写開
始部分を含む構造物を提供する。
目的甘味料の発現のため使用された上記DNA構造物は5゛−3゜の転写方向に
、転写開始部分、開始コドンを含有する転写解読枠、所望により、分泌およびプ
ロセッシングに備え、シグナル配列を除去して成熟したペプチド生成物を生産す
るシグナル配列、及び転写終了部分を含有し上記開始部分と終了部分は酵母中で
機能するものである。
転写開始領域は天然由来部位または、望ましくは外部から導入されたものでエン
ハンサ−及び調節部位として作用する5°ドメインと酵母RNAポリメラーゼ開
始部位として作用する転写開始のための3゛部分を有する様に選択したものであ
る。
上記5°ドメインは、熱シヨツク遺伝子、メタロチオネイン遺伝子及び代謝物誘
導遺伝子などの様な誘導調節のための部分である、促進および調節のためのドメ
インであればいかなるものでも使用され得る。
本発明の特徴的な部分はCALl、10F]節部分、特に上流活性化配列であり
、他の炭素源で宿主細胞を高密度培養した後、単一炭素源としてガラクトースを
使用して、誘導し得るものである。一般に、5°ドメインは、少なくとも50b
p以上、望ましくは75bp。
さらに望ましくは5oobp以上であるが、調節領域が約1 kbl)未満であ
る。転写の誘導調節と関連する配列は一般的に3゛部分の400bp以下、望ま
しくは250bl)以下の大きさを有する。
3°ドメイン、または5゛ドメインを存しないブロモタ一部分では酵母で機能す
る強力な転写開始部分やブロモターであればいずれでも使用可能であり、アルコ
ールデヒドロゲナーゼIまたは■、グリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒ
ドロゲナーゼ、プロコース−6−ホスフアートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキ
ナーゼ、トリオースイソマメラーゼ、ホスホグルコースキナーゼなどのような解
糖酵素の開始領域が好都合に使用し得る。本発明で特に望ましいのはグリセルア
ルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼである。
その他、ブロモタ一部分としてα−アミラーゼ部分、インベルダーゼ部分とアル
カリンホスファターゼ部分などが含まれる。3°ドメインは一般に少なくとも約
150bp、より一般には少なくとも約2sobp以上でありかつ一般に1 、
5 hbp以下、より一般には2 kbp以下である。3°ドメインは一般に、
約200bp内、より一般には約150bp内の開始コドンを宵する。
上記二つのドメインは好適な方法によって結合することができ、好都合な部位が
存在する場合にはこれを利用することができる。有用な制限部位がない場合には
、試験管内で変異させるかあるいは根本的な修正を行うことができ、他の制限部
位を利用することもてきるがアダプターを利用して二つの部分を結合させ得る。
コード化部分は5゛→3°の転写方向に、目的物を分泌させるためのシグナル配
列の開始コドン及び上記シグナル配列と成熟ペプチド生成物を提供するためのプ
ロセッシングシグナルが除去のためのプロセッシング配列と成熟ペプチド生成物
をコード化するコード化部分を含有する。
コード化配列は一般に、N−末端のモネリンサブユニットB(II)を、タンパ
ク質のC−末端としてサブユニットA(I)に結合するものである。(この時、
サブユニットは天然または変異生成されたもののいずれを使用しても良い)結合
部分は可変であり、アミノ酸なども含まれ、アミノ酸も変更し得る。
二つのサブユニットは、一般に、10個以下、より一般には8個以下のアミノ酸
の短い架橋を利用して連結するかあるいは直接的に、中間アミノ酸なしに連結す
るかまたは、望ましくは連結部位のアミノ酸を修飾する。架橋を形成する連結部
位のアミノ酸は極性結合体を作り、すなわち、サブユニット末端に存在するアミ
ノ酸のうち少なくとも50数%以上、一般には少なくとも75数%以上が極性と
なる様にし、好適には、少なくとも25数%以上、一般には約50数%をサブユ
ニット末端に天然に存在する状態に置いておく様にする。かかるアミノ酸は一つ
のループ(loop)のサブユニット■とHのものを使用可能である。
連結に関連して、連結部位はサブユニットの天然由来配列の10個以下、一般に
は6個以下のアミノ酸を連結体として含む。サブユニッ)IIのC−末端をサブ
ユニットIのN−末端と連結する場合において、連結部位はサブユニットHのl
1e(46)と介在アミノ酸を伴い得るサブユニットIのGly(6)に存在す
る。
N−末端がサブユニットDに存在するとき、サブユニットのうち一つまたは全て
において連結部位の野生型アミノ酸のうち一つ以上を除去あるいは置換させるこ
とができ、一般に12個以下、より一般には合計10個以下のアミノ酸を除去ま
たは置換させ、より一般には合計6個以下のアミノ酸を除去または置換させる。
この場合各アミノ酸の数は8個以下である。一般に、除去あるいは置換されたア
ミノ酸のうち75%以下をサブユニットのうち一つと結合させる。
望ましい架橋体としては次のような配列を含む。
aa χ−aaχ−aa χ−aa χ−aaχ−aa χ−aaχ−aa χ
ここで、−個のアミノ酸だけは存在する必要があり、各アミノ酸は次の様に定義
する。
aa’はA、D、E、に、RまたはYで、aa”はY 、 A 、 D 、 E
、 N 、 Q 、 T 、 KまたはSで、aa3はN、Q、S、T、D、
E、R,AまたはYで、aa’はF、W、Y、S、T、D、E、KまたはRで、
aa’はり、E、に、R,LまたはTで、aa@はり、E、V、1.L、Kまた
はRで、aa’はG、A、V、I、L、KまたはRで、aa”はKまたはRで、
式中、χはOまたはlで、少なくとも一つ以上のχはlである。
望ましい組成の配列は次の通りである。
aa’はYまたはEで、
aa”はり、E、YまたはKで、
aa’はN、T、AまたはYで、
aa’はR,S、KまたはEで、
aa’はE、D、RまたはTで、
aa″はに、D、EまたはRで、
aa’はG、IまたはLで、
aa’はKまたはRである。
配列が最初の二つのアミノ酸としてY及びEを有する場合、0ないし4個のχが
0の値であってもよく、最初の二個のアミノ酸としてその他のアミノ酸を宵する
場合にはOないし5個のχは0であってもよい。すなわち、上記績は一般に、3
ないし8個、より一般には4ないし8個のアミノ酸を有する。
連結部位がY−E−N−E−R−E−I−にである時、天然由来フェニルアラニ
ンが除去されるのが特に好ましい。
他の架橋体としてY−E−N−R−E−D−I−に、Y−に−T−R−E−D−
I−に、Y−E−R−E−1−に、Y−E−N−に−に、Y−E−I−に、Y−
Y−A−S−D−に−L−に、Y−A−S−D−に−L、Y−A−S−D−に、
Y−S−D−に、E−D−Y−に−T−R−G−R及びE−D−Y−T−Rが含
まれる。一般に、鎖中にY、E、D、KまたはRのうち少なくとも一個以上が存
在する様にし、より一般的にE、D、KまたはRのうち少なくとも一個が存在す
る様にする。架橋体のための望ましいアミノ酸はY、I、S。
T、D、E、に、R,NまたはQであり、架橋体のアミノ酸のうち50%以上を
上記アミノ酸グループ中から選択する様にする。
連結部位における上記変換以外にもサブユニットのうち一つから置換、削除また
は挿入などの様な少なくとも一種以上の変異があり得るが、その結果pIが減少
するかあるいは甘味度が増加する様にする。pIまたはイオン化定数は塩基性ア
ミノ酸を酸性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に、望ましくは酸性アミノ酸に置換
させるかあるいは塩基性アミノ酸を削除するか又は酸性アミノ酸を挿入すること
により減少させ得る。一般に、変異部位の数は8個以下、一般には6個以下、望
ましくは4個以下とする。この場合、一つの変異部位は一つのアミノ酸置換、挿
入または削除である。
本発明において、特に望ましくは17または43位のリジンをアスパラギン酸ま
たはグルタミン酸、特にグルタミン酸の様な酸性アミノ酸で置換するものであり
、70または86位のアルギニンの置換は不利である。望ましくはかかる置換が
pTを8以下となる様にするのであり(モネリンのprは9.3)、望ましくは
7.5以下、特に6ないし7.5、より望ましくは6.5ないし7.5の範囲内
となる様にする。
終了部位は酵母で機能できる有用なものであればいずれでも使用し得る。転写終
了部分は転写開始部分の3゛ドメインの遺伝子と同一遺伝子または転写開始部分
に有用なものとして指摘されている他の遺伝子が使用可能である。終了部位の選
択は便利性を最優先とする。
発現構築物はクローニングに便利なベクターならばいずれにも結合させ得る。一
般に、構築物を合成時、種々の切片をクローニングし、各フラグメントを分離及
び分析、結合させ、再クローニングする。最終構築物は細菌、エシェリヒア・コ
リ(E、 Co11)及び酵母の両方で複製の機能を有するシャトルベクターを
含むことができる。
酵母中で機能する種々のベクターを使用するかまたは文献に提示されたベクター
なに基づいて容易に製造し得る。望ましくはベクターは酵母宿主中の複製のため
の安定した複製システムを有するか、または、ゲノムへの組み込みのための不安
定な複製システムを有するか、または複製システムを有しなくてもよい。使用す
るベクターは2μmのプラスミツド複製システム、例えば、CEN3.AR9等
の様な動原体の組合わせを含むことができる。組み込み時に選別用のマーカー(
marker)のみ挿入することができる。
上記ベクターはまたは上記構築物を含存する宿主を選別するため、マーカーを含
むこともできる。マーカーは一般に抗生物質の耐性を宵するか、たは栄養要求性
宿主に原栄養株性を与える。抗生物質耐性はカナマイシン、クロラムフェニコー
ル、テトラサイクリン、アンピシリンなどに対するものであり、−個以上のマー
カーが存在し得る。特に、別の宿主には別のマーカーが使用される。
酵母宿主としてはサツカロミセス(S accharomyces)、特にセレ
ビシアエ(cerevisim)+−シゾーサツカロミセス(Schizo−s
accharomyces)、クルイベロミセス(K luyveromyce
s)、例えばラクチス(1,、actis)、カンジダ(Candida)など
の菌株が含まれる。望ましくは発酵で安定した工業用菌株を使用する。
宿主の特性によって、発現カセットのみを有するか又は発現カセットをベクター
や他の構築物の一部分として存する発現宿主を形質転換させるため、種々の技術
を使用し得る。発現カセットの導入は、結合、形質転換、形質感染(trans
fection)、形質導入(transducti。
n)及び融合などにより行い得る。本来の宿主細胞または原形質体、一部再生原
形質体が外来DNAの導入に使用し得る。
一旦、宿主が形質転換されると、選択培地で培養させ、マーカーまたは関連発現
カセットを有するそれらの宿主を選別することができる。抗生物質の耐性を利用
する場合、栄養素は抗生物質耐性遺伝子の不在下で細胞障害性を有する濃度の抗
生物質を含む。栄養要求性相補の場合、栄養培地は必要な代謝物質が不足する様
にする。
生成物が細胞質中に生産され、細胞質中に蓄積される場合、細胞が成長するに十
分な時間が経った後に細胞を溶解させ、従来の精製方法により目的蛋白質を得る
。この様な精製方法としては液体−液体の抽出、HPLC、クロマトグラフィー
、電気泳動などがある。
その後、生成物はゲル排除(gel exclusion)、クロマトグラフ
ィーなどによりさらに積車することができる。
得られた生成物は甘味料として多様な方法により利用することができ、缶詰製品
や炭酸飲料に添加し、コーヒー又はお茶など種々の飲料に添加するための粉末ま
たは液体として利用することができ、料理、チューイングガム、歯磨、口腔洗浄
剤、歯衛生剤、薬剤、ハムやソーセージなどの肉類製品、インスタントスープ、
ヨーグルト、デザート、穀物、動物の餌などに利用することができる。
本発明の目的物である蛋白質甘味料は液体または粉末に製剤し得る。液体の場合
、安定剤、緩衝剤、殺菌薬またはプロテアーゼ抑制剤などの様な他の添加物とと
もに使用し得る。水溶液媒体としては甘味料は一般に、組成物の0.1ないし9
0重量%になる様にする。
粉末の場合、従来の食品添加物で慣用される種々の賦形剤を添加することができ
る。
下記の実施例は具体例を例示したものであり、本発明の範囲を限定するものでは
ない。
ap)ハイブリッドプロモーターのオリゴマー化第4図に示されたオリゴヌクレ
オチドは、アプライド・バイオシステム社製DNA合成機モデル380Bを用い
て、公知の配列であるGAL上流活性化配列、シス作用DNAおよび酵母グリセ
ルアルデヒド−3−ホスファートジヒドロゲナーゼに基づいて製造した。
各オリゴマーは、8Mウレア−ポリアクリルアミドゲルで分離し、セブーバック
CI8コラム(ホワットマン社製)で精製した。
各オリゴマーは50aM Tris−HCl、pH8,010mM Mg
C1*、10mM DTT、1mM ATPとT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ5単位を含有する反応混合液38μσ中で45分間37℃に保ち燐酸化する。
反応混合物を集めて同量のフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール2.
5倍量で沈澱させ、真空下で乾燥する。15μ17蒸留水とPH7,5,0,2
+aM Tris−HCL O,IM MgCLと0.1mM DTT
を含有する結合緩衝液7ttQに上記乾燥した沈澱物を溶かして上記溶液を90
℃の水浴上に放置した後、室温で徐々に冷却し24時間放置する。上記反応混合
物に10mMATP 7μm2.T4DNA IJガーゼ40単位と蒸留水
2u(lを加えて室温で10分間放置後、フェノール/クロロホルムでDNAを
抽出して上記と同様の方法により沈澱させ、乾燥させる。固体残渣を蒸留水85
μQに溶かしてBamHIとNcoIで分解する。462bpフラグメントは7
%のアクリルアミドゲル電気泳動法により分離してエルチップ−Dかラム(シュ
ライヒャー & シューエル社製)で溶出し、精製する。
NA配列化
M13mp19のEcoRIとKpnlとの間にNcoI部位を有するM13m
p19の誘導体、M13rp9RFをガルギャップハイブリッドブロモター遺伝
子として使用した。ガルギャップハイブリッドDNAのゲル分離旦amHI−Σ
coIフラグメントを、Mi3rp9 RF分解Ncol一旦amHIと、2
0mmTris−HCI、pH7,5,101M塩化マグネシウム、10nMD
TTおよびT4DNAリガーゼ200単位中で結合させ、結合混合物を4°Cに
て一夜インキユベートする。エシェリヒア・コリ(E、 Co11)J M 1
01コンピテント菌の形質導入を上記細胞溶液200μgに結合混合液5μeを
添加して行い、ジデオキシ DNA 配列化とM13rp9−GG RF結
合生成物はエンチモロギ−(EnzymologyXl 983) 101 :
20−78記載のメッシング法およびプロシーディング・才ブ・ザ・ナシジナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニーニスエイ(Proc。
Natl、Acad、Sci、USAXl 985)74:5463−5467
GXEKサンガーらの方法により製造した。上記プロモータ一部位は第2図で示
された配列を含む。
第2図
AAACAAACACCATGG
蛋白質甘味料遺伝子の発現のためのカセット構築物で合成ガルギャップハイブリ
ッドDNAブロモターをM13rp9RF−ガルギャップから分離し、上記と同
様に7%のポリアクリルアミドゲルで精製する。エシェリヒア・コリ(E、Co
11]こおし1て合成し、クローニングされて発現された蛋白質甘味料の遺伝子
(よC1aIと5alIにより分解してptrp −M ON −1プラスミツ
ドから分離して部分的な蛋白質甘味料の遺伝子のフラグメントを1得た。(参照
:米国出願番号064341.出願日:1987.6.19.)融合モネリン
Gay Glu Trp Glu Ile Ile Asp l
ie Gly Pr。
Phe Tbr Gin Asn Leu G□y Lys Phe Ala
v、?Asp。lu Glu Asn Lys Ile。ly Gin Tyr
c?5Arg Leu Thr Phe Asn Lys Va
l Ile Arg Pr。
Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glue Asn
JArg Glu Tie Lys Gly Tyr Glu
Tyr Gin LeuAla Asp Ile Ser Gl
u Asp Tyr Lys Thr ArgGly Arg
Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly P
r。
vaI PrOPro Pro II ψ蛋白質甘味料の遺伝子のN−末端の
Ncl/C1alフラグメントに対する合成アダプターを次ぎのような配列で合
成した。
5’ −CATCGGT GAA TGG GAA ATT AT −3’3
’ −CCA CTT ACCCTT TAA TAGC−5’プラスミツド1
)LBCはpBR322の誘導体であり、次ぎの様に製造した。
EcoRIと5alIでpBR322を分解した後、これらの部位を合成リンカ
−を挿入してBaa+H1部位に変換し、単一の旦amHI部位をもつpBR3
22を得た。プラスミドpGAPはPLBCの誘導体であり、これにグリセルア
ルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子(ホランド&ホ
ランド、上掲;ホランドら、上掲)のプロモーターおよびターミネータ−を含む
1300塩基対のBamHIフラグメントがPLBCのBaaHI部位に挿入さ
れている。
得られたベクターpGAPはGAP遺伝子の5°非翻訳化領域であるGAPブロ
モター約4. OObpとGAP遺伝子の3°非翻訳化領域であるGAPターミ
ネータ約900bpを含む。これら二つのフラグメントは、一方の末端がGAP
開始暗号のメチオニンの所のNco1部位で他方の末端がGAP遺伝子の3゛非
翻訳化領域の所の5alI部位で合成アダプター(33mer、 5’−CA
OTGG GGT ACCCGG GGA TCCTCT AGA
GTCGAC−3゛)によって連結されている。GAPターミネータ約900
bpを含むSal I −BamHIはPGAPから得られ、1%のアガロスゲ
ルから分離する。
甘味料遺伝子を有するptrp322HMOH−1由来のC1al −5a11
フラグメント、Ncol−C1alアダプター(上記参照)、ガルギャップブロ
モタ一部分を提供するM13rp9−CG由来のBamHT −NeoI 4
62bpフラグメントとGAPターミネータ部分の約900bpを含有する部分
的な分解フラグメント(約4゜5 kbp) S al I−BamHlは結合
され、発現カセットを形成し、pLBCにクローニングされpGG−MONを作
る。
BamHIとpGG−MONから切除された発現カセットはエシェリヒア・コリ
(E、 Co11)−酵母シャトルベクターpYLBcc)BamH■部位に挿
入される。(pY L B Cは細菌性プラスミツドに該当する部分をpBR3
22により代替したpJDB219(ベッグス、ネイチュア(NatureXl
978)275 :l 04〜109)の誘導体である。)プラスミツドpY
L B Cは完全な酵母2μm複製システムと酵母LEU2遺伝子を有し、生
成されたプラスミツドはpYGG−MONと命名した。
分泌カセットのDNA合成及び構築物
酵母のり−ダ配列とプロセッシングシグナルはスタックら、ヌクレイツク・アシ
ッド・セル(Nucleic Ac1cb+ Ce1lX1984)37:
1075〜1089に記載の配列に基づいて合成した。M13ジデオキシDNA
配列化法により確認されたDNA配列は次ぎの通りである。
プロセッシング部位
リーダ配列とプロセッシングシグナル配列の63bpフラグメントは8Mウレア
−アクリルアミドゲル上0分離し、pH8、0,50+MTris−HCI、1
0mM DTT、1+mM ATPおよびT4 DNAリガーゼ5単位の
存在下でNcol−Clal分解プラスミツドl)GG−MON(上記参照)を
結合した。組換え分泌ベクターはエシェリヒア・コリ(E、 Co11)HB
101形質転換体の選別後に得られた。
分泌カセットはBaIIHTでpGGKL−MONを分解して切除し、フラグメ
ントはpy L B CのBamHI部位に結合してせYGGKL−MONを得
た。
酵母の形質転換lぴ蛋白質甘味料の培養及び分泌サツカロミセス・セレビシアエ
(S aceharomyces cerevisiae)DCO4(αMA
T adel 1eu2)、DBY746(MATi2、his3−1,1
eu2−3.1eu2−112、ura3−52、trpl−289)はイース
ト・ジェネティク・ストック・センター(カリポルニア大学、バークレー、カリ
ポルニア)より得、ヒネンら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシーズ/ニーニスエイ(Proc、 Natl、 Ac
ad、 Sei USAXI 987)75:1929〜1933に記載の酵
母細胞にプラスミツドDNA(pYGGKL−MON)を挿入した。形質転換体
はロイシン欠如の合成培養媒体3村中で一晩培養しくジャーマンら、メソッド・
イン・イースト・ジェネチックス(Method in Yeast G
enetics)コールド・スプリング・ハツトポル・エル・ラボラトリ−、ニ
ューヨーク、1982)、−晩装置した培養物をYEPD媒体(112当りバク
トペブトン(B actopeptone) 209、酵母抽出物109、グル
コース20g)に接種して650±10nmで0.D、値を有する様に培養する
。ガラクトースを加えて培養物の最終濃度が2%となるようにし650±25.
nmでO,D、値を有するまで培養物をインキエベートする。
サツカロミセス8セレビシアエ(S accharomyces、 cerev
isiae)の内部に発現あるいは分泌された蛋白質甘味料の確認誘導された細
胞懸濁液100μCまたは培養物の上清液(100μQ)に50μQまたは3倍
の蛋白質5DS−試料緩衝液(pH6,8,60mM Tris−HCI、2
.3%SDS、10%グリセロル、2%β−メルキャブトエタノール)を加える
。上記混合物を5分間沸騰させ、15μQの5DS−ポリアクリルアミドゲルに
lOμQをのせる。
(レミリ、ネイチュア(NatureXl 977)227:68 C1−68
5)メタノール/酢酸/水の4:1:5(V/V)溶液中0.05%クーマシー
ブリリアントブルーR−250で染色し、染色剤のみ除いた同じ溶液で脱色する
。ゲルは帯の蛋白質がほぼ正確な分子量(llkD)の蛋白質のバンドを示し、
これは対照培養体の試料では現れなかった。
効果的な発現システムは新規な蛋白質甘味料生産の提供にある。
上記生成物は種々の製品の食べ物の添加甘味料で使用される蛋白質として実際に
分離精製される様に生産される。上記生成物はもうこれ以上再生されない活性形
態で得られる様に適切に倍加されるべきである。
本明細書に記載のすべての開示および特許出願はこの発明に関与する当業者の技
術の程度を示すものである。すべての開示および特許出願は、個々の開示または
特許出願が具体的にかつ個々に、引用によって明細書としたと同程度に、引用に
よってここに記載したものとする。
先行発明が理解を容易にするために具体例および実施態様によっである程度詳細
に記載されているが、ある程度の変更および改変は従属請求項の範囲にあること
は明らかである。
国際調査報告
Claims (21)
- 1.架橋により連結されたモネリンサブユニットと実質的に同一のアミノ酸配列 を有し、上記架橋したこと以外に天然配列中に少なくとも1個の変異を有する蛋 白質甘味料の製造方法において、転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の 転写開始部位の5ドメインに由来する5′ドメインと酵母開始部位の3′ドメイ ンとを含む転写開始部位:上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび今結または上記架橋以外の架橋で相互に縛合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し・モネリン配列が少なくとも1個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠:およ び転写終了部位を含む酵母細胞を培養培地中で増殖し、上記遺伝子の発現生成物 をプロセッシングおよび分泌させ、上記蛋白質甘味料を分離することを特徴とす る方法。
- 2.上記3′ドメインが酵母解糖酵素の3′ドメインである、請求項1記載の方 法。
- 3.上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナー ゼである、請求項1記載の方法。
- 4.上記誘導性5′ドメインが代謝物誘導性ドメインである、請求項1記載の方 法。
- 5.上記代男物がD−ガラクトースである、請求項4記載の方法。
- 6.上記酵母はサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomycesc erevisiae)である、請求項1記載の方法。
- 7.架橋により連続されたモネリンサブユニットと実質的に同一のアミノ酸配列 を有し、蛋白質甘味料の天然配列中に少なくとも1個の変異を有する蛋白質甘味 料の製造方法において、転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始 部位の5′ドメインに由来する5′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の3′ド メインとを含む転写開始部位:上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列 、プロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、 実質的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも1個の非保存 型置換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解洗枠; および転写終了部位を含む酵母細胞のサッカロミセス・セレビシアエ(Sacc haromycescervisiae)酵母培養を培養培地中で行い、上記遺 伝子の発現生成物をプロセッシングおよび分泌させ、上記蛋白質甘味料を分離す ることを特徴とする方法。
- 8.上記3′ドメインが酵母デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の3′ドメインである 、請求項7記載の方法。
- 9.上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナー ゼである、請求項8記載の方法。
- 10.上記誘導性5′ドメインが代謝物誘導性ドメインである、請求項7記載の 方法。
- 11.上記代謝物がD−ガラクトースである、請求項7記載の方法。
- 12.5′→3′の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位 の5′ドメインに由来する5′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の3′ドメイ ンとを含む転写開始部位:上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも1個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含むの転写解読枠:お よび転写終了部位を含む、DNA構築物を含む酵母細胞。
- 13.上記3′ドメインが酵母解糖酵素の3′ドメインである、請求項12記載 の酵母細胞。
- 14.上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナ ーゼである、請求項13記載の酵母細胞。
- 15.上記誘導性5′ドメインが代謝物誘導性ドメインであることを特徴とする 、請求項12記載の酵母細胞。
- 16.上記代謝物がD−ガラクトースである、請求項15記載の酵母細胞。
- 17.上記酵母がサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)であり、上記転写開始部位がGAL上流活性化配列由来 の5′ドメインとグリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼ由来 の3′ドメインを含むことを特徴とする酵母細胞。
- 18.5′→3′の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位 の5′ドメインに由来する5′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の3′ドメイ ンとを含む転写開始部位;上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも1個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠:およ び転写終了部位を含む、′DNA発現構築物。
- 19.上記転写開始部位はGAL上流活性化配列由来の5′ドメインとグリセル アルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼブロモター由来の3′ドメイン を含む、DNA発現構造物。
- 20.上記シグナル配列がクルベロミセス・ラクチス(Kluveromyce slactis)キラー毒素の部分シグナル配列であり、上記プロセッシングシ グナルがlys−grgである、請求項19記載のDNA発現構築物。
- 21.請求項18〜20のいずれか1項記載のDNA発現構築物を含む、酵母細 胞中において安定な複製が可能なベクター。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29145688A | 1988-12-29 | 1988-12-29 | |
US291,456 | 1988-12-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03503002A true JPH03503002A (ja) | 1991-07-11 |
JP2715000B2 JP2715000B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=23120363
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2501518A Expired - Fee Related JP2715000B2 (ja) | 1988-12-29 | 1989-12-29 | 蛋白質甘味料の酵母中における発現 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0409928B1 (ja) |
JP (1) | JP2715000B2 (ja) |
KR (1) | KR950010818B1 (ja) |
AT (1) | ATE153379T1 (ja) |
AU (1) | AU634513B2 (ja) |
CA (1) | CA2006845C (ja) |
DE (1) | DE68928061T2 (ja) |
ES (1) | ES2101694T3 (ja) |
WO (1) | WO1990007580A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6674296A (en) * | 1995-06-23 | 1997-01-22 | University Of Hawaii | Recombinant sweet protein mabinlin |
EP0832972A3 (en) * | 1996-09-23 | 1999-11-17 | Givaudan-Roure (International) S.A. | Cloning, expression and production of tasty peptides |
US6255051B1 (en) | 1997-11-06 | 2001-07-03 | Mosaic Technologies Inc. | Multiple sequential polynucleotide displacement reactions for signal amplification and processing |
GB9724307D0 (en) * | 1997-11-17 | 1998-01-14 | Zeneca Ltd | Improvements relating to protein accumulation |
AU753191B2 (en) | 1997-11-25 | 2002-10-10 | Exact Sciences Corporation | Devices and methods for detecting target molecules in biological samples |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3998798A (en) * | 1972-12-22 | 1976-12-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Monellin, a sweet polypeptide derived from fruit of dioscoreophyllum cumminsii |
BR8807102A (pt) * | 1987-06-19 | 1989-10-17 | Lucky Biotech Corp | Preparacao de novos adocantes de proteina |
DE3850574T2 (de) * | 1987-06-19 | 1994-10-27 | Lucky Ltd | Neue klasse von niedrigkalorischen proteinsüssstoffen. |
-
1989
- 1989-12-28 CA CA002006845A patent/CA2006845C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-29 WO PCT/KR1989/000013 patent/WO1990007580A1/en active IP Right Grant
- 1989-12-29 ES ES90901037T patent/ES2101694T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-29 DE DE68928061T patent/DE68928061T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-29 EP EP90901037A patent/EP0409928B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-29 AU AU48197/90A patent/AU634513B2/en not_active Ceased
- 1989-12-29 KR KR1019900701941A patent/KR950010818B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-12-29 JP JP2501518A patent/JP2715000B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-29 AT AT90901037T patent/ATE153379T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR950010818B1 (ko) | 1995-09-23 |
WO1990007580A1 (en) | 1990-07-12 |
ATE153379T1 (de) | 1997-06-15 |
ES2101694T3 (es) | 1997-07-16 |
AU634513B2 (en) | 1993-02-25 |
EP0409928A1 (en) | 1991-01-30 |
AU4819790A (en) | 1990-08-01 |
CA2006845A1 (en) | 1990-06-29 |
DE68928061D1 (de) | 1997-06-26 |
EP0409928B1 (en) | 1997-05-21 |
DE68928061T2 (de) | 1997-09-18 |
KR910700342A (ko) | 1991-03-14 |
JP2715000B2 (ja) | 1998-02-16 |
CA2006845C (en) | 1998-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2548105B2 (ja) | ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法 | |
JP2609446B2 (ja) | スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子 | |
JP3085973B2 (ja) | 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規dna断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 | |
JP2980626B2 (ja) | ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター | |
JPH07503844A (ja) | 顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド,それらの調製およびそれらを含有する医薬組成 | |
JPH07222595A (ja) | 置換されたプロモーターを使用する宿主による異種起源蛋白質の製造方法 | |
JPS62500700A (ja) | ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 | |
JPH0771483B2 (ja) | 高収量の組換え産物の産生宿主体 | |
JPH0847393A (ja) | 酵母からタンパク質を分泌させるためのシグナル配列 | |
JPH03503002A (ja) | 蛋白質甘味料の酵母中における発現 | |
JPH03503596A (ja) | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするdna配列、該dna配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 | |
JPH02504028A (ja) | 新種の低カロリータンパク甘味料 | |
US5221624A (en) | DNA encoding (Lys46, Asp97, Asp113) and (Lys46, Asp.sup.137) thaumatin I polypeptides | |
JP2772793B2 (ja) | 細菌中に含まれるプラスミドの安定化方法及びこれにより得られる菌株 | |
Lasnik et al. | Human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) expressed by methylotrophic yeast Pichia pastoris | |
AU618011B2 (en) | Preparation of novel protein sweeteners-monellin type | |
JP2545377B2 (ja) | Dna配列体 | |
AU619193B2 (en) | Preparation of novel protein sweeteners - monellin type | |
US5882884A (en) | Expression of proteinaceous sweeteners in yeast | |
US5340732A (en) | Antiviral protein | |
JPH03201987A (ja) | ヒト血清アルブミン断片 | |
JPH06306100A (ja) | Vipアナログ調製用融合蛋白、vipアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物 | |
PT716705E (pt) | Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula | |
JPS62158487A (ja) | 突然変異体コ−デイング配列 | |
NO864206L (no) | Derivat av interleukin-2, dets fremstilling og anvendelse. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090123 Year of fee payment: 11 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |