JPH03503002A - 蛋白質甘味料の酵母中における発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、上記酵母がサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、上記転写開始部位がＧＡＰ、上流活性化 配列由来の５゛ドメインとグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナ ーゼ由来の３゛ドメインを含むことを特徴とする酵母細胞。

１８．５°−３゛の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位 の５゛ドメインに由来する５°ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の３°ドメイ ンとを含む転写開始部位：上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも１個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠；およ び転写終了部位を含む、ＤＮＡ発現構築物。

１９、上記転写開始部位はＧＡＬ上流活性化配列由来の５゛ドメインとグリセル アルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼプロモター由来の３°ドメイン を含む、ＤＮＡ発現構造物。

２０、上記シグナル配列がクルベロミセス・ラクチス（Ｋ　１ｕｖｅｒｏｓｙｃ ｅｓ　　１ａｃｔｉｓ）キラー毒素の部分シグナル配列であり、上記プロセッシ ングシグナルがＩｙｓ　−ｇｒｇである、請求項１９ｇ１ｌ！載のＤＮＡ発現構 築物。

２１、請求項１８〜２０のいずれか１項記載のＤＮＡ発現構築物を含む、酵母細 胞中において安定な複製が可能なベクター。

明　　　細　　　書 諌旦 蛋白質甘味料の酵母中における発現 関連発明のクロス・リファレンス 本出願は、１９８７年７月１９日に出願された出願番号第０６４４１号出願の一 部継続出願である。

本発明は合成蛋白質甘味料を製造するための組換え技術及び組成物に関するもの である。

背景技術 モネリンは、西部アフリカで生息するデオスコレフイルム・コムニシイ（Ｄ　ｉ ｏｓｃｏｒｅｐｈｙｌｌｕｍ　　Ｃｏｏ＋ｎ１ｎｓｉｉ）という植物の実である “不思議な成果（Ｓ　ｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ　　ｂｅｒｒｉｅｓ）”の樹液に存 在する非常１こ甘い物質である。この物質は均一性物質に精製され、炭水化物が まったく含有しない、分子量１．ｌＸ１０’の塩基性蛋白質であることが判明し た。モネリンは熱帯植物に見られる物質に由来するいくつかの甘味料または調味 料などのうちでその特性が最も良く知られた物質であり、大きさがほとんど同一 の二つのサブユニットが非共有結合で結合している。この二つのサブユニットは 同一でなく、モネリンの味を出す能力は二つのサブユニットと−っの単一メルカ プタン基によるものであり、これを遮断すれば甘みが失われる。

植物原料から天然生成物を抽出する場合の不確実性および費用のいている。組換 え技術は多様な種類の蛋白質を合成する機会を提供する。しかし、組換え技術を 使用する場合、遺伝子を製造するための方法を開発し、蛋白質が宿主細胞から成 功裏に発現されたかどうかを立証しなければならず、生理活性を示す蛋白質を分 離する必要がある。多くの場合、有用な生成物生産の不確実性を実質的に増大す る・・・が必要または・・・。

関連文献： モリスら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅＩｌ、ＸＩ　９７３）２４８：５３４〜５３９にモネリンの特性が説明さ れており、その他、カガン、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）（１９７３）１８ １：３２〜３５；、ウロダヮーおよびホジソン、プロシーディング・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーダ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡＸＩ　９７５）７２：３９８〜３９ ９；ボアクおよびシー、バイオケミ力・工・バイオロジー・アクタ（Ｂ　１ｏｃ ｈｉ＋ｏｉｃａ　　ｅｔ　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）（１９７６） ４２７：１５３〜＋　７０；ハドソンおよびピーマン、バイオケミカル・アンド ・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅａ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎ、　）（１９７６）７１　：２１２〜２２ ０；ジルゲンソン、バイオケミ力・工・バイオロジー・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ＋ ＊、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）（１９７６）４４６　：２５　Ｓ〜２６１ 及びファン・デル・ウェルおよびロエブ、フェプス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅ ｔｔ、　ＸＩ　９７３）２９：１８１〜＋　８３にもモネリンの特性について説 明されている。米国特許第３，９９８，７９８号には天然モネリンの製造方法が 説明されている。

酵母のリーダー配列についてはスタックら、ヌクレア・アシツズ・リサーチ（Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　Ｘｉ　９８４）１２：６０１１〜６０３０ 及びジュリウスら、セル（ＣｅｌｌＸ１９８４）３７：１０７５〜１０８５に説 明されている。シス（ｃｉｓ）−作用ＤＮＡ要素であるＧＡＬ上流活性化配列は ディビス、モルキュシー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍａｔ、Ｃｅ１１ ．Ｂｉｏｌ、ＸＩ　９８４）４：１４４０〜１４４８に説明されており、グリセ ルアルデヒド−３−ホスファート　デヒドロゲナーゼの転写開始部位はホランド およびホランド、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂ ｊｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｉ、ＸＩ　９７９）２５４：５４６６〜５４７５；９８３９ 〜９８４５及びホランドら、１ｂｉｄ（１９８３）２５８：５２９１〜５２９９ に説明されている。

発明の概要 本発明は新規な蛋白質甘味料を製造するための方法及び組成物に関するもので、 甘味料を酵母宿主内で発現させ、発現された甘味料が活性構造で、高収率で生産 される方法および組成物を提供する。

具体的実施例の説明 本発明はＡ（１）とＢ（ＩＩ）のサブユニット間の架橋と少なくとも一個のアミ ノ酸置換を含む少なくとも１個の変異部位を有する結果として変異野生型配列を 有する合成モネリンを製造する新規方法を提供するものである。

尚、本発明は強力な転写開始部分、とくに強力な酵母転写開始部分の３°ドメイ ンと３′ドメインの転写活性を増強する５゛ドメインを含むハイブリッド転写開 始部分を含む構造物を提供する。

目的甘味料の発現のため使用された上記ＤＮＡ構造物は５゛−３゜の転写方向に 、転写開始部分、開始コドンを含有する転写解読枠、所望により、分泌およびプ ロセッシングに備え、シグナル配列を除去して成熟したペプチド生成物を生産す るシグナル配列、及び転写終了部分を含有し上記開始部分と終了部分は酵母中で 機能するものである。

転写開始領域は天然由来部位または、望ましくは外部から導入されたものでエン ハンサ−及び調節部位として作用する５°ドメインと酵母ＲＮＡポリメラーゼ開 始部位として作用する転写開始のための３゛部分を有する様に選択したものであ る。

上記５°ドメインは、熱シヨツク遺伝子、メタロチオネイン遺伝子及び代謝物誘 導遺伝子などの様な誘導調節のための部分である、促進および調節のためのドメ インであればいかなるものでも使用され得る。

本発明の特徴的な部分はＣＡＬｌ、１０Ｆ］節部分、特に上流活性化配列であり 、他の炭素源で宿主細胞を高密度培養した後、単一炭素源としてガラクトースを 使用して、誘導し得るものである。一般に、５°ドメインは、少なくとも５０ｂ ｐ以上、望ましくは７５ｂｐ。

さらに望ましくは５ｏｏｂｐ以上であるが、調節領域が約１　ｋｂｌ）未満であ る。転写の誘導調節と関連する配列は一般的に３゛部分の４００ｂｐ以下、望ま しくは２５０ｂｌ）以下の大きさを有する。

３°ドメイン、または５゛ドメインを存しないブロモタ一部分では酵母で機能す る強力な転写開始部分やブロモターであればいずれでも使用可能であり、アルコ ールデヒドロゲナーゼＩまたは■、グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒ ドロゲナーゼ、プロコース−６−ホスフアートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキ ナーゼ、トリオースイソマメラーゼ、ホスホグルコースキナーゼなどのような解 糖酵素の開始領域が好都合に使用し得る。本発明で特に望ましいのはグリセルア ルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼである。

その他、ブロモタ一部分としてα−アミラーゼ部分、インベルダーゼ部分とアル カリンホスファターゼ部分などが含まれる。３°ドメインは一般に少なくとも約 １５０ｂｐ、より一般には少なくとも約２ｓｏｂｐ以上でありかつ一般に１　、 ５　ｈｂｐ以下、より一般には２　ｋｂｐ以下である。３°ドメインは一般に、 約２００ｂｐ内、より一般には約１５０ｂｐ内の開始コドンを宵する。

上記二つのドメインは好適な方法によって結合することができ、好都合な部位が 存在する場合にはこれを利用することができる。有用な制限部位がない場合には 、試験管内で変異させるかあるいは根本的な修正を行うことができ、他の制限部 位を利用することもてきるがアダプターを利用して二つの部分を結合させ得る。

コード化部分は５゛→３°の転写方向に、目的物を分泌させるためのシグナル配 列の開始コドン及び上記シグナル配列と成熟ペプチド生成物を提供するためのプ ロセッシングシグナルが除去のためのプロセッシング配列と成熟ペプチド生成物 をコード化するコード化部分を含有する。

コード化配列は一般に、Ｎ−末端のモネリンサブユニットＢ（ＩＩ）を、タンパ ク質のＣ−末端としてサブユニットＡ（Ｉ）に結合するものである。（この時、 サブユニットは天然または変異生成されたもののいずれを使用しても良い）結合 部分は可変であり、アミノ酸なども含まれ、アミノ酸も変更し得る。

二つのサブユニットは、一般に、１０個以下、より一般には８個以下のアミノ酸 の短い架橋を利用して連結するかあるいは直接的に、中間アミノ酸なしに連結す るかまたは、望ましくは連結部位のアミノ酸を修飾する。架橋を形成する連結部 位のアミノ酸は極性結合体を作り、すなわち、サブユニット末端に存在するアミ ノ酸のうち少なくとも５０数％以上、一般には少なくとも７５数％以上が極性と なる様にし、好適には、少なくとも２５数％以上、一般には約５０数％をサブユ ニット末端に天然に存在する状態に置いておく様にする。かかるアミノ酸は一つ のループ（ｌｏｏｐ）のサブユニット■とＨのものを使用可能である。

連結に関連して、連結部位はサブユニットの天然由来配列の１０個以下、一般に は６個以下のアミノ酸を連結体として含む。サブユニッ）ＩＩのＣ−末端をサブ ユニットＩのＮ−末端と連結する場合において、連結部位はサブユニットＨのｌ １ｅ（４６）と介在アミノ酸を伴い得るサブユニットＩのＧｌｙ（６）に存在す る。

Ｎ−末端がサブユニットＤに存在するとき、サブユニットのうち一つまたは全て において連結部位の野生型アミノ酸のうち一つ以上を除去あるいは置換させるこ とができ、一般に１２個以下、より一般には合計１０個以下のアミノ酸を除去ま たは置換させ、より一般には合計６個以下のアミノ酸を除去または置換させる。

この場合各アミノ酸の数は８個以下である。一般に、除去あるいは置換されたア ミノ酸のうち７５％以下をサブユニットのうち一つと結合させる。

望ましい架橋体としては次のような配列を含む。

ａａ　χ−ａａχ−ａａ　χ−ａａ　χ−ａａχ−ａａ　χ−ａａχ−ａａ　χ ここで、−個のアミノ酸だけは存在する必要があり、各アミノ酸は次の様に定義 する。

ａａ’はＡ、Ｄ、Ｅ、に、ＲまたはＹで、ａａ”はＹ　、　Ａ　、　Ｄ　、　Ｅ 　、　Ｎ　、　Ｑ　、　Ｔ　、　ＫまたはＳで、ａａ３はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、 Ｅ、Ｒ，ＡまたはＹで、ａａ’はＦ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＲで、 ａａ’はり、Ｅ、に、Ｒ，ＬまたはＴで、ａａ＠はり、Ｅ、Ｖ、１．Ｌ、Ｋまた はＲで、ａａ’はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＫまたはＲで、ａａ”はＫまたはＲで、 式中、χはＯまたはｌで、少なくとも一つ以上のχはｌである。

望ましい組成の配列は次の通りである。

ａａ’はＹまたはＥで、 ａａ”はり、Ｅ、ＹまたはＫで、 ａａ’はＮ、Ｔ、ＡまたはＹで、 ａａ’はＲ，Ｓ、ＫまたはＥで、 ａａ’はＥ、Ｄ、ＲまたはＴで、 ａａ″はに、Ｄ、ＥまたはＲで、 ａａ’はＧ、ＩまたはＬで、 ａａ’はＫまたはＲである。

配列が最初の二つのアミノ酸としてＹ及びＥを有する場合、０ないし４個のχが ０の値であってもよく、最初の二個のアミノ酸としてその他のアミノ酸を宵する 場合にはＯないし５個のχは０であってもよい。すなわち、上記績は一般に、３ ないし８個、より一般には４ないし８個のアミノ酸を有する。

連結部位がＹ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−Ｉ−にである時、天然由来フェニルアラニ ンが除去されるのが特に好ましい。

他の架橋体としてＹ−Ｅ−Ｎ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｉ−に、Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｅ−Ｄ− Ｉ−に、Ｙ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−１−に、Ｙ−Ｅ−Ｎ−に−に、Ｙ−Ｅ−Ｉ−に、Ｙ− Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ−に、Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ、Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に、 Ｙ−Ｓ−Ｄ−に、Ｅ−Ｄ−Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｒ及びＥ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ｒが含 まれる。一般に、鎖中にＹ、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＲのうち少なくとも一個以上が存 在する様にし、より一般的にＥ、Ｄ、ＫまたはＲのうち少なくとも一個が存在す る様にする。架橋体のための望ましいアミノ酸はＹ、Ｉ、Ｓ。

Ｔ、Ｄ、Ｅ、に、Ｒ，ＮまたはＱであり、架橋体のアミノ酸のうち５０％以上を 上記アミノ酸グループ中から選択する様にする。

連結部位における上記変換以外にもサブユニットのうち一つから置換、削除また は挿入などの様な少なくとも一種以上の変異があり得るが、その結果ｐＩが減少 するかあるいは甘味度が増加する様にする。ｐＩまたはイオン化定数は塩基性ア ミノ酸を酸性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に、望ましくは酸性アミノ酸に置換 させるかあるいは塩基性アミノ酸を削除するか又は酸性アミノ酸を挿入すること により減少させ得る。一般に、変異部位の数は８個以下、一般には６個以下、望 ましくは４個以下とする。この場合、一つの変異部位は一つのアミノ酸置換、挿 入または削除である。

本発明において、特に望ましくは１７または４３位のリジンをアスパラギン酸ま たはグルタミン酸、特にグルタミン酸の様な酸性アミノ酸で置換するものであり 、７０または８６位のアルギニンの置換は不利である。望ましくはかかる置換が ｐＴを８以下となる様にするのであり（モネリンのｐｒは９．３）、望ましくは ７．５以下、特に６ないし７．５、より望ましくは６．５ないし７．５の範囲内 となる様にする。

終了部位は酵母で機能できる有用なものであればいずれでも使用し得る。転写終 了部分は転写開始部分の３゛ドメインの遺伝子と同一遺伝子または転写開始部分 に有用なものとして指摘されている他の遺伝子が使用可能である。終了部位の選 択は便利性を最優先とする。

発現構築物はクローニングに便利なベクターならばいずれにも結合させ得る。一 般に、構築物を合成時、種々の切片をクローニングし、各フラグメントを分離及 び分析、結合させ、再クローニングする。最終構築物は細菌、エシェリヒア・コ リ（Ｅ、　Ｃｏ１１）及び酵母の両方で複製の機能を有するシャトルベクターを 含むことができる。

酵母中で機能する種々のベクターを使用するかまたは文献に提示されたベクター なに基づいて容易に製造し得る。望ましくはベクターは酵母宿主中の複製のため の安定した複製システムを有するか、または、ゲノムへの組み込みのための不安 定な複製システムを有するか、または複製システムを有しなくてもよい。使用す るベクターは２μｍのプラスミツド複製システム、例えば、ＣＥＮ３．ＡＲ９等 の様な動原体の組合わせを含むことができる。組み込み時に選別用のマーカー（ ｍａｒｋｅｒ）のみ挿入することができる。

上記ベクターはまたは上記構築物を含存する宿主を選別するため、マーカーを含 むこともできる。マーカーは一般に抗生物質の耐性を宵するか、たは栄養要求性 宿主に原栄養株性を与える。抗生物質耐性はカナマイシン、クロラムフェニコー ル、テトラサイクリン、アンピシリンなどに対するものであり、−個以上のマー カーが存在し得る。特に、別の宿主には別のマーカーが使用される。

酵母宿主としてはサツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にセレ ビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉｍ）＋−シゾーサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏ−ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋ　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ ｓ）、例えばラクチス（１，、ａｃｔｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）など の菌株が含まれる。望ましくは発酵で安定した工業用菌株を使用する。

宿主の特性によって、発現カセットのみを有するか又は発現カセットをベクター や他の構築物の一部分として存する発現宿主を形質転換させるため、種々の技術 を使用し得る。発現カセットの導入は、結合、形質転換、形質感染（ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ。

ｎ）及び融合などにより行い得る。本来の宿主細胞または原形質体、一部再生原 形質体が外来ＤＮＡの導入に使用し得る。

一旦、宿主が形質転換されると、選択培地で培養させ、マーカーまたは関連発現 カセットを有するそれらの宿主を選別することができる。抗生物質の耐性を利用 する場合、栄養素は抗生物質耐性遺伝子の不在下で細胞障害性を有する濃度の抗 生物質を含む。栄養要求性相補の場合、栄養培地は必要な代謝物質が不足する様 にする。

生成物が細胞質中に生産され、細胞質中に蓄積される場合、細胞が成長するに十 分な時間が経った後に細胞を溶解させ、従来の精製方法により目的蛋白質を得る 。この様な精製方法としては液体−液体の抽出、ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー 、電気泳動などがある。

その後、生成物はゲル排除（ｇｅｌ　　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）、クロマトグラフ ィーなどによりさらに積車することができる。

得られた生成物は甘味料として多様な方法により利用することができ、缶詰製品 や炭酸飲料に添加し、コーヒー又はお茶など種々の飲料に添加するための粉末ま たは液体として利用することができ、料理、チューイングガム、歯磨、口腔洗浄 剤、歯衛生剤、薬剤、ハムやソーセージなどの肉類製品、インスタントスープ、 ヨーグルト、デザート、穀物、動物の餌などに利用することができる。

本発明の目的物である蛋白質甘味料は液体または粉末に製剤し得る。液体の場合 、安定剤、緩衝剤、殺菌薬またはプロテアーゼ抑制剤などの様な他の添加物とと もに使用し得る。水溶液媒体としては甘味料は一般に、組成物の０．１ないし９ ０重量％になる様にする。

粉末の場合、従来の食品添加物で慣用される種々の賦形剤を添加することができ る。

下記の実施例は具体例を例示したものであり、本発明の範囲を限定するものでは ない。

ａｐ）ハイブリッドプロモーターのオリゴマー化第４図に示されたオリゴヌクレ オチドは、アプライド・バイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂを用い て、公知の配列であるＧＡＬ上流活性化配列、シス作用ＤＮＡおよび酵母グリセ ルアルデヒド−３−ホスファートジヒドロゲナーゼに基づいて製造した。

各オリゴマーは、８Ｍウレア−ポリアクリルアミドゲルで分離し、セブーバック 　ＣＩ８コラム（ホワットマン社製）で精製した。

各オリゴマーは５０ａＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０１０ｍＭ　　Ｍｇ　 Ｃ１＊、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナー ゼ５単位を含有する反応混合液３８μσ中で４５分間３７℃に保ち燐酸化する。

反応混合物を集めて同量のフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール２． ５倍量で沈澱させ、真空下で乾燥する。１５μ１７蒸留水とＰＨ７，５，０，２ ＋ａＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　　Ｏ，ＩＭ　　ＭｇＣＬと０．１ｍＭ　　ＤＴＴ を含有する結合緩衝液７ｔｔＱに上記乾燥した沈澱物を溶かして上記溶液を９０ ℃の水浴上に放置した後、室温で徐々に冷却し２４時間放置する。上記反応混合 物に１０ｍＭＡＴＰ　　７μｍ２．Ｔ４ＤＮＡ　　ＩＪガーゼ４０単位と蒸留水 ２ｕ（ｌを加えて室温で１０分間放置後、フェノール／クロロホルムでＤＮＡを 抽出して上記と同様の方法により沈澱させ、乾燥させる。固体残渣を蒸留水８５ μＱに溶かしてＢａｍＨＩとＮｃｏＩで分解する。４６２ｂｐフラグメントは７ ％のアクリルアミドゲル電気泳動法により分離してエルチップ−Ｄかラム（シュ ライヒャー　＆　シューエル社製）で溶出し、精製する。

ＮＡ配列化 Ｍ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩとＫｐｎｌとの間にＮｃｏＩ部位を有するＭ１３ｍ ｐ１９の誘導体、Ｍ１３ｒｐ９ＲＦをガルギャップハイブリッドブロモター遺伝 子として使用した。ガルギャップハイブリッドＤＮＡのゲル分離旦ａｍＨＩ−Σ ｃｏＩフラグメントを、Ｍｉ３ｒｐ９　　ＲＦ分解Ｎｃｏｌ一旦ａｍＨＩと、２ ０ｍｍＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０１Ｍ塩化マグネシウム、１０ｎＭＤ ＴＴおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２００単位中で結合させ、結合混合物を４°Ｃに て一夜インキユベートする。エシェリヒア・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）Ｊ　Ｍ　１ ０１コンピテント菌の形質導入を上記細胞溶液２００μｇに結合混合液５μｅを 添加して行い、ジデオキシ　ＤＮＡ　　配列化とＭ１３ｒｐ９−ＧＧ　　ＲＦ結 合生成物はエンチモロギ−（ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＸｌ　９８３）　１０１　： ２０−７８記載のメッシング法およびプロシーディング・才ブ・ザ・ナシジナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＸｌ　９８５）７４：５４６３−５４６７ ＧＸＥＫサンガーらの方法により製造した。上記プロモータ一部位は第２図で示 された配列を含む。

第２図 ＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧ 蛋白質甘味料遺伝子の発現のためのカセット構築物で合成ガルギャップハイブリ ッドＤＮＡブロモターをＭ１３ｒｐ９ＲＦ−ガルギャップから分離し、上記と同 様に７％のポリアクリルアミドゲルで精製する。エシェリヒア・コリ（Ｅ、Ｃｏ １１］こおし１て合成し、クローニングされて発現された蛋白質甘味料の遺伝子 （よＣ１ａＩと５ａｌＩにより分解してｐｔｒｐ　−Ｍ　ＯＮ　−１プラスミツ ドから分離して部分的な蛋白質甘味料の遺伝子のフラグメントを１得た。（参照 ：米国出願番号０６４３４１．出願日：１９８７．６．１９．）融合モネリン Ｇａｙ　　Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ　　ｌ ｉｅ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｐｈｅ　Ｔｂｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇ□ｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　 ｖ、？Ａｓｐ。ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ。ｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ 　ｃ？５Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｖａ ｌ　　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　　Ｐｒ。

Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕｅ　Ａｓｎ 　ＪＡｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ｔｉｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　 　Ｔｙｒ　　Ｇｉｎ　　ＬｅｕＡｌａ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ ｕ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　ＡｒｇＧｌｙ　　Ａｒｇ　　 Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｐ ｒ。

ｖａＩ　ＰｒＯＰｒｏ　Ｐｒｏ　　ＩＩ　ψ蛋白質甘味料の遺伝子のＮ−末端の Ｎｃｌ／Ｃ１ａｌフラグメントに対する合成アダプターを次ぎのような配列で合 成した。

５’　−ＣＡＴＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴ　　−３’３ ’　−ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＡＣＣＣＴＴ　ＴＡＡ　ＴＡＧＣ−５’プラスミツド１ ）ＬＢＣはｐＢＲ３２２の誘導体であり、次ぎの様に製造した。

ＥｃｏＲＩと５ａｌＩでｐＢＲ３２２を分解した後、これらの部位を合成リンカ −を挿入してＢａａ＋Ｈ１部位に変換し、単一の旦ａｍＨＩ部位をもつｐＢＲ３ ２２を得た。プラスミドｐＧＡＰはＰＬＢＣの誘導体であり、これにグリセルア ルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子（ホランド＆ホ ランド、上掲；ホランドら、上掲）のプロモーターおよびターミネータ−を含む １３００塩基対のＢａｍＨＩフラグメントがＰＬＢＣのＢａａＨＩ部位に挿入さ れている。

得られたベクターｐＧＡＰはＧＡＰ遺伝子の５°非翻訳化領域であるＧＡＰブロ モター約４．　ＯＯｂｐとＧＡＰ遺伝子の３°非翻訳化領域であるＧＡＰターミ ネータ約９００ｂｐを含む。これら二つのフラグメントは、一方の末端がＧＡＰ 開始暗号のメチオニンの所のＮｃｏ１部位で他方の末端がＧＡＰ遺伝子の３゛非 翻訳化領域の所の５ａｌＩ部位で合成アダプター（３３ｍｅｒ、　　５’−ＣＡ ＯＴＧＧ　　ＧＧＴ　　ＡＣＣＣＧＧ　　ＧＧＡ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＡＧＡ　 　ＧＴＣＧＡＣ−３゛）によって連結されている。ＧＡＰターミネータ約９００ ｂｐを含むＳａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩはＰＧＡＰから得られ、１％のアガロスゲ ルから分離する。

甘味料遺伝子を有するｐｔｒｐ３２２ＨＭＯＨ−１由来のＣ１ａｌ　−５ａ１１ フラグメント、Ｎｃｏｌ−Ｃ１ａｌアダプター（上記参照）、ガルギャップブロ モタ一部分を提供するＭ１３ｒｐ９−ＣＧ由来のＢａｍＨＴ　−ＮｅｏＩ　　４ ６２ｂｐフラグメントとＧＡＰターミネータ部分の約９００ｂｐを含有する部分 的な分解フラグメント（約４゜５　ｋｂｐ）　Ｓ　ａｌ　Ｉ−ＢａｍＨｌは結合 され、発現カセットを形成し、ｐＬＢＣにクローニングされｐＧＧ−ＭＯＮを作 る。

ＢａｍＨＩとｐＧＧ−ＭＯＮから切除された発現カセットはエシェリヒア・コリ （Ｅ、　Ｃｏ１１）−酵母シャトルベクターｐＹＬＢｃｃ）ＢａｍＨ■部位に挿 入される。（ｐＹ　Ｌ　Ｂ　Ｃは細菌性プラスミツドに該当する部分をｐＢＲ３ ２２により代替したｐＪＤＢ２１９（ベッグス、ネイチュア（ＮａｔｕｒｅＸｌ 　９７８）２７５　：ｌ　０４〜１０９）の誘導体である。）プラスミツドｐＹ 　Ｌ　Ｂ　Ｃは完全な酵母２μｍ複製システムと酵母ＬＥＵ２遺伝子を有し、生 成されたプラスミツドはｐＹＧＧ−ＭＯＮと命名した。

分泌カセットのＤＮＡ合成及び構築物 酵母のり−ダ配列とプロセッシングシグナルはスタックら、ヌクレイツク・アシ ッド・セル（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｃｂ＋　　Ｃｅ１ｌＸ１９８４）３７： １０７５〜１０８９に記載の配列に基づいて合成した。Ｍ１３ジデオキシＤＮＡ 配列化法により確認されたＤＮＡ配列は次ぎの通りである。

プロセッシング部位 リーダ配列とプロセッシングシグナル配列の６３ｂｐフラグメントは８Ｍウレア −アクリルアミドゲル上０分離し、ｐＨ８、０，５０＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ ０ｍＭ　　ＤＴＴ、１＋ｍＭ　　ＡＴＰおよびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ５単位の 存在下でＮｃｏｌ−Ｃｌａｌ分解プラスミツドｌ）ＧＧ−ＭＯＮ（上記参照）を 結合した。組換え分泌ベクターはエシェリヒア・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）ＨＢ　 １０１形質転換体の選別後に得られた。

分泌カセットはＢａＩＩＨＴでｐＧＧＫＬ−ＭＯＮを分解して切除し、フラグメ ントはｐｙ　Ｌ　Ｂ　ＣのＢａｍＨＩ部位に結合してせＹＧＧＫＬ−ＭＯＮを得 た。

酵母の形質転換ｌぴ蛋白質甘味料の培養及び分泌サツカロミセス・セレビシアエ （Ｓ　ａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＣＯ４（αＭＡ Ｔ　　ａｄｅｌ　　１ｅｕ２）、ＤＢＹ７４６（ＭＡＴｉ２、ｈｉｓ３−１，１ ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐｌ−２８９）はイース ト・ジェネティク・ストック・センター（カリポルニア大学、バークレー、カリ ポルニア）より得、ヒネンら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ／ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｉ　　ＵＳＡＸＩ　９８７）７５：１９２９〜１９３３に記載の酵 母細胞にプラスミツドＤＮＡ（ｐＹＧＧＫＬ−ＭＯＮ）を挿入した。形質転換体 はロイシン欠如の合成培養媒体３村中で一晩培養しくジャーマンら、メソッド・ イン・イースト・ジェネチックス（Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ）コールド・スプリング・ハツトポル・エル・ラボラトリ−、ニ ューヨーク、１９８２）、−晩装置した培養物をＹＥＰＤ媒体（１１２当りバク トペブトン（Ｂ　ａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）　２０９、酵母抽出物１０９、グル コース２０ｇ）に接種して６５０±１０ｎｍで０．Ｄ、値を有する様に培養する 。ガラクトースを加えて培養物の最終濃度が２％となるようにし６５０±２５． ｎｍでＯ，Ｄ、値を有するまで培養物をインキエベートする。

サツカロミセス８セレビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）の内部に発現あるいは分泌された蛋白質甘味料の確認誘導された細 胞懸濁液１００μＣまたは培養物の上清液（１００μＱ）に５０μＱまたは３倍 の蛋白質５ＤＳ−試料緩衝液（ｐＨ６，８，６０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２ ．３％ＳＤＳ、１０％グリセロル、２％β−メルキャブトエタノール）を加える 。上記混合物を５分間沸騰させ、１５μＱの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに ｌＯμＱをのせる。

（レミリ、ネイチュア（ＮａｔｕｒｅＸｌ　９７７）２２７：６８　Ｃ１−６８ ５）メタノール／酢酸／水の４：１：５（Ｖ／Ｖ）溶液中０．０５％クーマシー ブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、染色剤のみ除いた同じ溶液で脱色する 。ゲルは帯の蛋白質がほぼ正確な分子量（ｌｌｋＤ）の蛋白質のバンドを示し、 これは対照培養体の試料では現れなかった。

効果的な発現システムは新規な蛋白質甘味料生産の提供にある。

上記生成物は種々の製品の食べ物の添加甘味料で使用される蛋白質として実際に 分離精製される様に生産される。上記生成物はもうこれ以上再生されない活性形 態で得られる様に適切に倍加されるべきである。

本明細書に記載のすべての開示および特許出願はこの発明に関与する当業者の技 術の程度を示すものである。すべての開示および特許出願は、個々の開示または 特許出願が具体的にかつ個々に、引用によって明細書としたと同程度に、引用に よってここに記載したものとする。

先行発明が理解を容易にするために具体例および実施態様によっである程度詳細 に記載されているが、ある程度の変更および改変は従属請求項の範囲にあること は明らかである。

国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．架橋により連結されたモネリンサブユニットと実質的に同一のアミノ酸配列 を有し、上記架橋したこと以外に天然配列中に少なくとも１個の変異を有する蛋 白質甘味料の製造方法において、転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の 転写開始部位の５ドメインに由来する５′ドメインと酵母開始部位の３′ドメイ ンとを含む転写開始部位：上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび今結または上記架橋以外の架橋で相互に縛合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し・モネリン配列が少なくとも１個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠：およ び転写終了部位を含む酵母細胞を培養培地中で増殖し、上記遺伝子の発現生成物 をプロセッシングおよび分泌させ、上記蛋白質甘味料を分離することを特徴とす る方法。
2. ２．上記３′ドメインが酵母解糖酵素の３′ドメインである、請求項１記載の方 法。
3. ３．上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナー ゼである、請求項１記載の方法。
4. ４．上記誘導性５′ドメインが代謝物誘導性ドメインである、請求項１記載の方 法。
5. ５．上記代男物がＤ−ガラクトースである、請求項４記載の方法。
6. ６．上記酵母はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１記載の方法。
7. ７．架橋により連続されたモネリンサブユニットと実質的に同一のアミノ酸配列 を有し、蛋白質甘味料の天然配列中に少なくとも１個の変異を有する蛋白質甘味 料の製造方法において、転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始 部位の５′ドメインに由来する５′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の３′ド メインとを含む転写開始部位：上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列 、プロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、 実質的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも１個の非保存 型置換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解洗枠； および転写終了部位を含む酵母細胞のサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ）酵母培養を培養培地中で行い、上記遺 伝子の発現生成物をプロセッシングおよび分泌させ、上記蛋白質甘味料を分離す ることを特徴とする方法。
8. ８．上記３′ドメインが酵母デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の３′ドメインである 、請求項７記載の方法。
9. ９．上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナー ゼである、請求項８記載の方法。
10. １０．上記誘導性５′ドメインが代謝物誘導性ドメインである、請求項７記載の 方法。
11. １１．上記代謝物がＤ−ガラクトースである、請求項７記載の方法。
12. １２．５′→３′の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位 の５′ドメインに由来する５′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の３′ドメイ ンとを含む転写開始部位：上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも１個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含むの転写解読枠：お よび転写終了部位を含む、ＤＮＡ構築物を含む酵母細胞。
13. １３．上記３′ドメインが酵母解糖酵素の３′ドメインである、請求項１２記載 の酵母細胞。
14. １４．上記酵母解糖酵素がグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナ ーゼである、請求項１３記載の酵母細胞。
15. １５．上記誘導性５′ドメインが代謝物誘導性ドメインであることを特徴とする 、請求項１２記載の酵母細胞。
16. １６．上記代謝物がＤ−ガラクトースである、請求項１５記載の酵母細胞。
17. １７．上記酵母がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、上記転写開始部位がＧＡＬ上流活性化配列由来 の５′ドメインとグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ由来 の３′ドメインを含むことを特徴とする酵母細胞。
18. １８．５′→３′の転写方向に、酵母中で機能する誘導性遺伝子の転写開始部位 の５′ドメインに由来する５′ドメインと酵母解糖遺伝子開始部位の３′ドメイ ンとを含む転写開始部位；上記開始部位の転写調節下にあり、シグナル配列、プ ロセシングシグナルおよび結合または上記架橋以外の架橋で相互に結合し、実質 的にモネリンと同一の配列を有し、モネリン配列が少なくとも１個の非保存型置 換を有する上記蛋白質甘味料をコード化した構造遺伝子を含む転写解読枠：およ び転写終了部位を含む、′ＤＮＡ発現構築物。
19. １９．上記転写開始部位はＧＡＬ上流活性化配列由来の５′ドメインとグリセル アルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼブロモター由来の３′ドメイン を含む、ＤＮＡ発現構造物。
20. ２０．上記シグナル配列がクルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅ ｓｌａｃｔｉｓ）キラー毒素の部分シグナル配列であり、上記プロセッシングシ グナルがｌｙｓ−ｇｒｇである、請求項１９記載のＤＮＡ発現構築物。
21. ２１．請求項１８〜２０のいずれか１項記載のＤＮＡ発現構築物を含む、酵母細 胞中において安定な複製が可能なベクター。