JPH03195494A - 発酵法によるl―プロリンの製造方法 - Google Patents
発酵法によるl―プロリンの製造方法Info
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- JPH03195494A JPH03195494A JP33779889A JP33779889A JPH03195494A JP H03195494 A JPH03195494 A JP H03195494A JP 33779889 A JP33779889 A JP 33779889A JP 33779889 A JP33779889 A JP 33779889A JP H03195494 A JPH03195494 A JP H03195494A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、発酵法によるL−プロリンの製造方法に関す
るものである。
るものである。
し−プロリンは拮抗物質の原料など医薬品原料として重
要である。
要である。
〈従来の技術〉
従来、発酵法によるL−プロリンの製造法としては、た
とえば、コリネバクテリウム属、クルチア属などに属す
る微生物を用いる方法が知られている(相田ら編「アミ
ノ酸発酵」P218〜242学会出版センター(198
6))。
とえば、コリネバクテリウム属、クルチア属などに属す
る微生物を用いる方法が知られている(相田ら編「アミ
ノ酸発酵」P218〜242学会出版センター(198
6))。
〈発明が解決しようとする課題〉
しかしながら、従来法においては、発酵法によるL−プ
ロリン生産能を有する微生物として限られたものしか見
出されていなかった。
ロリン生産能を有する微生物として限られたものしか見
出されていなかった。
く課題を解決するための手段および作用〉そこで本発明
者らは従来の微生物とは異なった微生物であって、かつ
L−プロリン生産能を有する微生物を広く検索、研究し
た結果、10ビデンシア属に属する微生物によって通常
の炭素源を含有する栄養培地にL−プロリンを著量蓄積
せしめることがでいることを見出し、先に提案した。
者らは従来の微生物とは異なった微生物であって、かつ
L−プロリン生産能を有する微生物を広く検索、研究し
た結果、10ビデンシア属に属する微生物によって通常
の炭素源を含有する栄養培地にL−プロリンを著量蓄積
せしめることがでいることを見出し、先に提案した。
しかし、これらの方法によるL−プロリンの生成蓄積濃
度または糖などの原料からのL−プロリン生成収率は十
分に満足できるものではなかっな。
度または糖などの原料からのL−プロリン生成収率は十
分に満足できるものではなかっな。
本発明者らは、さらに生産性の高いし一プ。
リンの製造方法について鋭意研究した結果、プロビデン
シア属に属しL−プロリン生産能を有する微生物にL−
アルギニンあるいはその生合成前駆物質であるL−オル
ニチン、L−シトルリンに対する要求性を付与すること
によって、し−グロリン蓄積濃度、生成収率が著しく向
上することを見出し本発明に到達した。
シア属に属しL−プロリン生産能を有する微生物にL−
アルギニンあるいはその生合成前駆物質であるL−オル
ニチン、L−シトルリンに対する要求性を付与すること
によって、し−グロリン蓄積濃度、生成収率が著しく向
上することを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、生育の
ために少なくともL−アルギニン、L−シトルリンある
いはL−オルニチンを必要とし、かつし−プロリン生産
能を有する微生物を培養して、培養液中にL−プロリン
を生成蓄積せしめ、前記培養液よりし一プリロンを採取
す、ることを特徴とする発酵法によるL−プロリンの製
造方法である。
ために少なくともL−アルギニン、L−シトルリンある
いはL−オルニチンを必要とし、かつし−プロリン生産
能を有する微生物を培養して、培養液中にL−プロリン
を生成蓄積せしめ、前記培養液よりし一プリロンを採取
す、ることを特徴とする発酵法によるL−プロリンの製
造方法である。
以1 本発明を具体的に説明する。
本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属スる
くバージ−のマニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジーVo1.1(1984)第495〜49
6頁に従う)、生育のために少なくともL−アルギニン
、L−オルニチンあるいはし一シトルリンを必要とする
性質とL−プロリン生成能を合せもつものである。
くバージ−のマニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジーVo1.1(1984)第495〜49
6頁に従う)、生育のために少なくともL−アルギニン
、L−オルニチンあるいはし一シトルリンを必要とする
性質とL−プロリン生成能を合せもつものである。
本発明で用いられる微生物は実質的にL−アルギニンを
生育のために必要とする、ずなわちL−アルギニンの栄
養要求性を有する。しかるにL−アルギニンは、その生
合成前駆体であるL−オルニチンあるいはし一シトルリ
ンから生体内で合成されるため、微生物がそのような合
成機能を有する場合には、L−アルギニンが存在しなく
ともL−オルニチンあるいはL−シトルリンが存在すれ
ば生育できる0本発明は、そのようなL−アルギニンの
生合成機能を有する微生物も有しない微生物も包含する
ものであって、従って、本発明で用いられる微生物は、
生育のために少なくともし一アルギニン、L−シトルリ
ンあるいはL−オルニチンを必要とするものである。こ
こにいう栄養要求性とは法論の意味であり、不完全欠失
型(いわゆるLe aky型)も含むものである。さら
にその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足される
場合も含むものである。
生育のために必要とする、ずなわちL−アルギニンの栄
養要求性を有する。しかるにL−アルギニンは、その生
合成前駆体であるL−オルニチンあるいはし一シトルリ
ンから生体内で合成されるため、微生物がそのような合
成機能を有する場合には、L−アルギニンが存在しなく
ともL−オルニチンあるいはL−シトルリンが存在すれ
ば生育できる0本発明は、そのようなL−アルギニンの
生合成機能を有する微生物も有しない微生物も包含する
ものであって、従って、本発明で用いられる微生物は、
生育のために少なくともし一アルギニン、L−シトルリ
ンあるいはL−オルニチンを必要とするものである。こ
こにいう栄養要求性とは法論の意味であり、不完全欠失
型(いわゆるLe aky型)も含むものである。さら
にその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足される
場合も含むものである。
また、本発明で用いられる微生物においてチアゾリン−
4−カルボン酸などの10リンアナローグに対する耐性
はL−プロリン生成能に有効に作用するので、この特性
を合せもつ微生物がより好ましく用いられる。またこの
特性は通常の変異誘導操作により付与することが可能で
ある。
4−カルボン酸などの10リンアナローグに対する耐性
はL−プロリン生成能に有効に作用するので、この特性
を合せもつ微生物がより好ましく用いられる。またこの
特性は通常の変異誘導操作により付与することが可能で
ある。
本発明で用いられる微生物は変異株により提供されその
代表的なものとしては、たとえば、プロビデンシア・レ
トゲリARGA6 (FBRM P−111’4−’
7)(イソロイシン要求性、チアゾリン−4−カルボン
酸耐性、3.4−デヒドロプロリン耐性、L−アルギニ
ン要求性)、プロビデンシア・レトゲリARGAI O
(FERM P−111’+g ) (イソロイシ
ン要求性、チアゾリン−4−カルボン酸耐性、3,4−
デヒドロプロリン耐性、L−オルニチン、L−シトルリ
ンあるいはL−アルキ1ニン要求性)が挙げられる。い
ずれの株もプロビデンシア・レトゲリDHPR7−2(
FERM P−11150)を親株として通常の変異
処理方法によってし一アルギニン要求性株、L−シトル
リン要求性株あるいはL−オルニチン要求性株として得
られたものである。
代表的なものとしては、たとえば、プロビデンシア・レ
トゲリARGA6 (FBRM P−111’4−’
7)(イソロイシン要求性、チアゾリン−4−カルボン
酸耐性、3.4−デヒドロプロリン耐性、L−アルギニ
ン要求性)、プロビデンシア・レトゲリARGAI O
(FERM P−111’+g ) (イソロイシ
ン要求性、チアゾリン−4−カルボン酸耐性、3,4−
デヒドロプロリン耐性、L−オルニチン、L−シトルリ
ンあるいはL−アルキ1ニン要求性)が挙げられる。い
ずれの株もプロビデンシア・レトゲリDHPR7−2(
FERM P−11150)を親株として通常の変異
処理方法によってし一アルギニン要求性株、L−シトル
リン要求性株あるいはL−オルニチン要求性株として得
られたものである。
L−アルギニン要求性株、L−シトルリン要求性株ある
いはL−オルニチン要求性株を得るには親株を紫外線照
射するかあるいは変異誘発剤(たとえばN−メチル−N
′−二トローN−二トロングアニジン)で処理したのち
、ブイヨン寒天培地などの栄養培地でコロニーを作らせ
、そのコロニーを通常の最少培地(たとえばデイビスの
最少培地)およびL−オルニチン、L−シトルリンまた
はL−アルギニンを含む最少培地にレプリカし、L−オ
ルニチン、し−シトルリンまたはL−アルギニンを含む
最少培地上にのみ生育する菌株を釣菌分離すればよい。
いはL−オルニチン要求性株を得るには親株を紫外線照
射するかあるいは変異誘発剤(たとえばN−メチル−N
′−二トローN−二トロングアニジン)で処理したのち
、ブイヨン寒天培地などの栄養培地でコロニーを作らせ
、そのコロニーを通常の最少培地(たとえばデイビスの
最少培地)およびL−オルニチン、L−シトルリンまた
はL−アルギニンを含む最少培地にレプリカし、L−オ
ルニチン、し−シトルリンまたはL−アルギニンを含む
最少培地上にのみ生育する菌株を釣菌分離すればよい。
本発明におけるL−プロリン生産用の培地は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉およびセルロースの加
水分解物、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸などのごとき有aS、グリセロールのごときアル
コール類などを2〜15%、窒素源として、酢酸アンモ
ニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウムのごとき8!機アンモニウム塩、アンモニアガス
、アンモニア水、尿素などを0.5〜40%、有機微量
栄養素としては、L−イソロイシンなどの被要求物質が
0.001〜0.4%、または必要に応じてコーンステ
イブリカー、ペプトン、酵母エキスなど0〜4%をそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。かかる培
地にはこれらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム
、硫酸第1鉄7水和物、硫酸マンガン4〜6水和物など
を少量添加するのが通常である。
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉およびセルロースの加
水分解物、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸などのごとき有aS、グリセロールのごときアル
コール類などを2〜15%、窒素源として、酢酸アンモ
ニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウムのごとき8!機アンモニウム塩、アンモニアガス
、アンモニア水、尿素などを0.5〜40%、有機微量
栄養素としては、L−イソロイシンなどの被要求物質が
0.001〜0.4%、または必要に応じてコーンステ
イブリカー、ペプトン、酵母エキスなど0〜4%をそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。かかる培
地にはこれらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム
、硫酸第1鉄7水和物、硫酸マンガン4〜6水和物など
を少量添加するのが通常である。
培養は、好気的条件が望ましい、培養の間、培地のpH
は5〜9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜12
0時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。
は5〜9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜12
0時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。
培養液からL−プロリンを採取するには常法で行うこと
ができる。たとえば菌体を除去した培!IP液をpH2
に塩酸で調整したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂
に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、:a縮晶析する。不純アミノ酸が混入する場
合はアルコールを添加し、不純アミノ酸を沈澱物として
除いた後、エタノール中で晶析し、L−プロリンを得る
ことができる。
ができる。たとえば菌体を除去した培!IP液をpH2
に塩酸で調整したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂
に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、:a縮晶析する。不純アミノ酸が混入する場
合はアルコールを添加し、不純アミノ酸を沈澱物として
除いた後、エタノール中で晶析し、L−プロリンを得る
ことができる。
〈実施例〉
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例I
A、(L−アルギニン、L−オルニチンあるいはL−シ
トルリン要求性変異株の取得)プロビデンシア・レトゲ
リDHPR7−2(FERM P−1115”O,L
−インロイシン要求性、チアゾリン−4−カルボン酸耐
性、3.4−デしドロプロリン耐性)の菌体に、通常の
方法でN−メチル−N′−二トローN−二トロングアニ
ジン処理(300ur/ml、30℃で10分)した後
、この細胞をLB寒天培地(トリプトン1%、酵母エキ
ス0.5%、塩化ナトリウム0.5%、寒天1..5%
、pH7゜5)に塗布し、30℃、24時間静置培養し
た。生じたコロニーを最少培地およびL−アルギニン、
L−シトルリン、L−オルニチン各0. OO5%含有
した最少培地(グルコース0.5%、リン第1酸カリウ
ム0.3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫安0.1
%、硫酸マグネシウム・7水和物0.01%、L−イソ
ロイシン0.005%、寒天1.5%)にレプリカし、
30℃、24時間静置培養した。最少培地で生育がなく
、L−アルギニン、L−シトルリン、L−オルニチンを
含有した最少培地で生育した菌株を釣菌分離し、L−ア
ルギニン、L−シトルリン、L−オルニチンのいずれか
の要求性株(プロビデンシア・レトゲリARGA6およ
びプロビデンシア・レトゲリARGAIO)を得た。
トルリン要求性変異株の取得)プロビデンシア・レトゲ
リDHPR7−2(FERM P−1115”O,L
−インロイシン要求性、チアゾリン−4−カルボン酸耐
性、3.4−デしドロプロリン耐性)の菌体に、通常の
方法でN−メチル−N′−二トローN−二トロングアニ
ジン処理(300ur/ml、30℃で10分)した後
、この細胞をLB寒天培地(トリプトン1%、酵母エキ
ス0.5%、塩化ナトリウム0.5%、寒天1..5%
、pH7゜5)に塗布し、30℃、24時間静置培養し
た。生じたコロニーを最少培地およびL−アルギニン、
L−シトルリン、L−オルニチン各0. OO5%含有
した最少培地(グルコース0.5%、リン第1酸カリウ
ム0.3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫安0.1
%、硫酸マグネシウム・7水和物0.01%、L−イソ
ロイシン0.005%、寒天1.5%)にレプリカし、
30℃、24時間静置培養した。最少培地で生育がなく
、L−アルギニン、L−シトルリン、L−オルニチンを
含有した最少培地で生育した菌株を釣菌分離し、L−ア
ルギニン、L−シトルリン、L−オルニチンのいずれか
の要求性株(プロビデンシア・レトゲリARGA6およ
びプロビデンシア・レトゲリARGAIO)を得た。
B、(要求性の検定)
下記第1表に示す各菌株を、LB寒天培地で24時間培
養し、その菌体をごく微量かきとり、L−アルギニン、
し−シトルリン、し−オルニチンそれぞれ単独でO,O
O5%添加した最少培地にうずく塗布し、30℃で24
時間静置培養し、その生育の有無を観察した。
養し、その菌体をごく微量かきとり、L−アルギニン、
し−シトルリン、し−オルニチンそれぞれ単独でO,O
O5%添加した最少培地にうずく塗布し、30℃で24
時間静置培養し、その生育の有無を観察した。
結果は第1表に示すとおりである。
第 1
表
培地で30℃、16時間振盪して前培養した後、あらか
じめ120℃、20分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵
用培地50m1を含む11容、三角フラスコに植継ぎ3
0℃、150rpIM、振幅3csの条件下で72時間
培養した。
じめ120℃、20分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵
用培地50m1を含む11容、三角フラスコに植継ぎ3
0℃、150rpIM、振幅3csの条件下で72時間
培養した。
※ +:生育あり −:生育なし
本発明法で使用する10ビデンシア・レトゲリARGA
6は親株プロビデンシア・レトゲリD )[P R7−
2との比較により、明らかにL−アルギニン要求性を獲
得しており、プロビデンシア・レトゲリARGA10は
し一アルギニン、し−オルニチン、L−シトルリンのう
ちの少なくとも1つの要求性を獲得している。
6は親株プロビデンシア・レトゲリD )[P R7−
2との比較により、明らかにL−アルギニン要求性を獲
得しており、プロビデンシア・レトゲリARGA10は
し一アルギニン、し−オルニチン、L−シトルリンのう
ちの少なくとも1つの要求性を獲得している。
実施例2
第2表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン発酵用培地
グルコース(別滅菌)
(NH4)2304
KH2PO。
MgSO4・7H20
Fe”
M u ”
L−イソロイシン
し−アルギニン
CaCO3(別滅菌)
H
8%
2.5%
0.1%
0.04%
211p11
200亀
0.02%
0.02%
4%
7.0(KOHで中和)
培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したr液中の
L−プロリン濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子JL
C300)で定量したところ第2表に示すような結果を
得た。
L−プロリン濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子JL
C300)で定量したところ第2表に示すような結果を
得た。
第 2 表
本発明により、高い蓄積濃度でL−プロリン生成が可能
となり、より安価なL−プロリンの生産が可能となる。
となり、より安価なL−プロリンの生産が可能となる。
Claims (1)
- プロビデンシア属に属し、生育のために少なくともL−
アルギニン、L−シトルリンあるいはL−オルニチンを
必要とし、かつL−プロリン生産能を有する微生物を培
養して、培養液中にL−プロリンを生成蓄積せしめ、前
記培養液よりL−プロリンを採取することを特徴とする
発酵法によるL−プロリンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33779889A JPH03195494A (ja) | 1989-12-26 | 1989-12-26 | 発酵法によるl―プロリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33779889A JPH03195494A (ja) | 1989-12-26 | 1989-12-26 | 発酵法によるl―プロリンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03195494A true JPH03195494A (ja) | 1991-08-27 |
Family
ID=18312070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP33779889A Pending JPH03195494A (ja) | 1989-12-26 | 1989-12-26 | 発酵法によるl―プロリンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03195494A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102010003419A1 (de) | 2010-03-30 | 2012-04-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin |
CN103265467A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-28 | 华南理工大学 | 一种冷却结晶精制l-脯氨酸的方法 |
CN104276990A (zh) * | 2013-07-04 | 2015-01-14 | 江南大学 | 一种利用活性炭对l-羟脯氨酸发酵液脱色的方法 |
-
1989
- 1989-12-26 JP JP33779889A patent/JPH03195494A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102010003419A1 (de) | 2010-03-30 | 2012-04-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin |
DE102010003419B4 (de) | 2010-03-30 | 2019-09-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin |
CN103265467A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-28 | 华南理工大学 | 一种冷却结晶精制l-脯氨酸的方法 |
CN104276990A (zh) * | 2013-07-04 | 2015-01-14 | 江南大学 | 一种利用活性炭对l-羟脯氨酸发酵液脱色的方法 |
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