JPH01296994A - L−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
L−グルタミン酸の製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はL−グルタミン酸の!I!I這法に関ずろ。
従って本発明は、食品、医薬品の産業分野において有用
である。 従来の技術 従来、コリ木型グルタミン酸生産菌を用いる1゜−グル
タミン酸の製造法としては種々の方法が知られている。 本発明にかかわるものとしては、イソシトレートリアー
ゼ活性の低下したプレビバクデリウ!・属の変異株を用
いる方法(特開昭5Eニー927!15)や、!、−グ
ルタミンまたは!、−グルタミン酸を唯一の炭素源とし
て生育する能力の欠失または著しく低下した変異株を用
いる方法(特開昭57−138395)などが知られて
いる。 発明が解決しようとする課題 近年14−グルタミン酸の需要は増大しておLL−グル
タミン酸の生産性を向4−させるために、L−グルタミ
ン酸の!J造法の改善は常に望まれている。 課題を解決するだめの手段 本発明者は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、α−
リドグルタル酸脱水素酵素の活性が著しく低ドしたa5
’e株、イソシトレートリアーセとα−ケトグルタル酸
脱水素酵累の両方の活性が著しく低ドした変異株および
該変異株にさらにブ
である。 従来の技術 従来、コリ木型グルタミン酸生産菌を用いる1゜−グル
タミン酸の製造法としては種々の方法が知られている。 本発明にかかわるものとしては、イソシトレートリアー
ゼ活性の低下したプレビバクデリウ!・属の変異株を用
いる方法(特開昭5Eニー927!15)や、!、−グ
ルタミンまたは!、−グルタミン酸を唯一の炭素源とし
て生育する能力の欠失または著しく低下した変異株を用
いる方法(特開昭57−138395)などが知られて
いる。 発明が解決しようとする課題 近年14−グルタミン酸の需要は増大しておLL−グル
タミン酸の生産性を向4−させるために、L−グルタミ
ン酸の!J造法の改善は常に望まれている。 課題を解決するだめの手段 本発明者は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、α−
リドグルタル酸脱水素酵素の活性が著しく低ドしたa5
’e株、イソシトレートリアーセとα−ケトグルタル酸
脱水素酵累の両方の活性が著しく低ドした変異株および
該変異株にさらにブ
【]リンアナτ】グに対する耐性を
付与した変異株を用いることによりL−グルタミン酸の
生産性が向上することを見出し本発明を完成した。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明は、コリネ」14ノグルタミン酸生産菌に属し、
α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性、またはイソシトレ
ートリアーゼ活性とα−ケトグルタル酸脱水素酵ぶ活性
の両方が著しく低1ζし、かつL−グルタミン酸生産能
をイ「する微生物、または該微生物にさらにプロリンア
ナログに対する耐性を付L7゜した微生物を培地に培養
し、培養物中に1.−グルタミン酸を生成蓄積させ、該
培養物からL−グルタミン酸を採取することを特徴とす
るし一グルタミン酸の製造法を促供する。 本明細書に
おいて、−1り不望グルタミン酸生産菌とは、コリネバ
タテリウム属、プレビバクテリウ!−属、ミタτ]バク
テリウムl1iiに属する一Iffのグルタミン酸生産
菌4いう(「発酵と工業」、第40巻、 Io2rt
、 +:+g2年)。 本発明に使用する微生物としては、コリネILJグルタ
ミン酸生産菌に属し、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活
性、またはイソシトレー) IJアーゼ活性とα−ケト
グルタル酸脱水素酵素活性の両方が著しく低下した微生
物、または該微生物にさらにプロリンアナ[1グに対す
る耐性を付与した微生物であればいずれでも使用できる
。ブ[]リンアアナ】グとしては、3.4−テ゛ヒト「
】プロリン、4−チオブ[1リン、アゼチジンカルボン
酸などがあげられる。さらにこれらの微生物は、これら
の性質に加えて他の性質、例えば名種栄養要求性、桑剤
耐性。 薬剤感受性、薬剤依存性などを併せて持っていてもよい
。 このような微生物は、通常の変異処理法、例えば紫外線
照射またはN−メチル−N′−二トローN=ニトロソグ
アニジン(NTG)や亜硝酸などの化学処理を施した細
胞群の中から常法により得ることができる。また、この
ような性質を持つ微生物は、池の遺伝的手法、例えば遺
伝1組換え法。 形質導入法、細胞融合法などによっても誘導することが
できる。 イソシトレートリアーゼ活性の低下した変)′1j株は
、グルコースは資化するが、酢酸は資化しない変異株か
ら容易に分離することができる。さらに、イソシトレー
トリアーゼ活性の低下に加えてα=ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した変5^株は、1−述のインシトレ
ートリアーゼ活性の低ドした変異株を親株として変異処
理を行い、グルコースは資化するが、クエン酸は資化し
ない変異株から容易に分離することができる。 さらに、プロリンアナログに対する耐性を有ずろ変異株
は、上記の変異株を親株とし°C変異処理を行い、親株
が生育できない濃度のブ[]リンアナTJグを含む最少
寒天培地で生育できる変異株から容易に分離することが
できる。 以下に、本発明の使用菌株の代表例であるコリネバクテ
リウド・グルタミクムG−41(イソシトレートリアー
ゼ活性欠失−α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性欠失性
斐異様)の具体的な誘導法について述べろ。 コリネバクテリウl、・グルタミクムB−15(微工研
菌寄第7982号、以下!3−15と称す)の細胞を(
]、 I BJ定のトリスマレイン酸緩(÷[液(11
16、0>中に10′1個/ m lになるようにQ、
Erした。 これに、N T Gを最終濃度t)、2mg/mlにな
るように添加し、室温で30分間放置後グルコースを唯
一・の炭素源とする最少寒天培地〔グルコース()、5
g/a、 KtLPo、 0.15 g/dR,K2
tl Po。 0.05g/a、NaC1O,01g/d、Mg5O,
−71−LOO,05g/J、CaCR2・2■I20
1μg/m1.Fe5On・7H2010μg/ml。 MnCRz’ 4Ha0 7ug/ml、チアミン−1
1CI!。 [1,I μg/ml、 (N H<)2S 0.0.
15 g/a、ビスチン30 μg / a’ 、寒天
1.5 g/di! (Na011でp 117.2に
調整)〕の表面に9抹し、30℃で30間静置jΔ養し
た。 ついで、コロニー状に生育した細胞を、上述の最少寒天
培地と、酢酸を唯一の炭素源とする最少寒天培地(上述
のグルコース培地からグル:ノースを除き、0.5g/
aの酢酸を添加した培地)にレプリカ法で転写して、3
0℃で3日間静置培養を行った。その結果、グルコース
を炭素源とする最少培地では生育するが酢酸を炭素源と
する最少培地では生育しない変異株を多数()だ。 これらの変異株をグルコース右よび酢酸を炭素源とする
液体培地〔グルコース3%、酢酸アンモニウム2%、
(N+−1,)2So、 0.1%、 K al−1
t’ O−0,2%、Mg 504 ・7HaO(1
,05%、ビオチン500μg/β、チアミン・HCl
500μg/β、パントテン酸カルシウム500.z
!。 −”−、lJチン酸アミド500ttg/R,CaC0
:+ 2%。 (p H7,2) ] 50mlを含んだ300m1容
三角フラスコで21 Orpmの振盪条件下で好気的に
培養した。得られた菌体を集めて、これを超音波菌体破
砕機にかけて菌体を破砕し、これを12.00Orpm
の回転数の遠心分離機で遠心分離した。得られた」−澄
液中のイソシトレートリアーゼ活性をメンラド・インー
xンザイモロジー(Methods in Enzym
ology)。 第1:(巻、163頁(+969>記載の方法に従って
dl11定し、活性の著しく低下した変異株としてG
−40を選択した。 こうして得られたG−40を上述と同様にN i’ G
処理をして、グルコースを炭素源とする最少培地に塗抹
し、生育したコロニーを、上述のグル:ノースを炭素源
とする最少寒天培地とクエン酸を炭素源とする最少寒天
培地(上述のグルコースを炭素源とする最少寒天培地か
らグルコースを除き、クエン酸ナトリウム0.5g/a
を添加した培地〉の両方に塗抹し、グルコース培地では
生育するがクエン酸培地では生育しない変異株を多数分
離した。 これらの変異株を、上述のイソシトレートリ゛r −ゼ
活性の測定の場合と全く同様に、液体培養して集菌し菌
体破砕して菌体抽出物をi)、各々についてα−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素活性をアグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリイ(^gric、 Ri
a!、 [:hem、 )第44巻(1980)に記載
の方法に従って測定した結果、α−ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した株としてG−41株を選択した。 上記のようにして41)られたイソシトレートリアーゼ
活性およびα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性の両方が
著しく低下したG−41株は、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムG 41 (FERM BP−1652
>として、昭和63年1月14日付で工業技術院微生物
工業技術研究所(微工研)に寄託されている。 さらに、上記で得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クムG−41株を親株として、プロリンアナログ〈3,
4−デヒドロプロリン)に対する耐性を有する変異株を
、以下のようにして誘導した。 ブイヨン寒天スラント培地で一夜生育させたG−41株
(FERM BP−1652)の細胞を、■09個/m
lになるように1/15!J )リス−マレイン酸緩衝
液に懸濁し、これにNTGを250μg/mlの濃度に
なるように添加して、室温で30分間放置した。 細胞を遠心分離で集め、」−記と同じ容量の1/15M
トリスーマレイン酸緩衝液に再懸濁して、この0.1m
lを50mg/d1の3.4−デヒドロプロリンを含む
最少寒天培地〔グルコース0.5g/!1!。 (Nl+4>23O40,15g/di、 Kll□P
O40,15g / a。 KJr’On 0.0 5 g/d1. Na1
J 4.6 g/a、 !JgS口、・7112
0 (]、05g/d1. [alJ2”211JO
lμg/ml。 FcS口a ・ 71120 1 0 μg/+t+
l、 1JnlJ 2 ・ 4L0 7 μg/n+
I。 チアミン・1ltJO,lμg/1Tll、ビオチン3
0μg/It。 寒天1.5 g / c/j! (Na0llでpH7
,2に調整)〕の表面に塗抹し、30℃で3日間静置培
養した。3.4−デヒド(IIプrJIJンを添加した
培地の表面には、3.4−デヒドロプロリン耐性株が約
250個のコロニーとして生育した。これに対し、3,
4−デヒドロプロリン無添加の対照培地では、菌は培地
の全表面に生育した。生育した3、4−デヒドロプロリ
ン耐性株のうち100株を釣菌し、後述の実施例1の方
法でし一グルタミン酸生産試験を行った結末、L−グル
タミン酸生産性の優れた菌としてG−42株を選択した
。 上記のようにして得られた3、4−デヒドロプロリンに
対して耐性を有するG−42株は、コリネバクテリウム
・グルタミクムG −42(FBRM BP−1845
)古して、昭和63年51111rJ付で微工研に寄
託されている。 十、記の微生物を培養する」?1地としては、炭素源。 窒素源、無機塩類、生育因fなどを含有する栄養培地ま
たは合成培地が用いられる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 シュークロース、 糖蜜、デンプン、デンプン加水分解
物、果汁などの炭水化物、エタノール、メタノール、ブ
「1パノールなどのアルコール類が使用できる。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニノ・、リン酸アンモニウト。 MI’i12アンモニウ11.尿素、アンモニア、アミ
ン類。 ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・
リカー、カゼイン加水分解物、各種発酵菌体およびその
消化物が使用できる。 jlit 61塩としては、リン酸−カリウl4.リン
酸二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシラ!
・、塩化す) IJウド、硫酸第一鉄、硫酸マンガン。 炭酸力ルシウl、などが使用できる。 栄養便求性を示す変異株を使用する場合には、栄4%物
を枕品もしくはそれを含有する天然物として添加するこ
とができる。 培n条件としては、通気攪拌などの好気的条件下で、培
養温度は24〜37℃、培養[]数は2〜70間である
。培養液のpHは5〜9の範囲に維持する。pI−(の
1栗整には尿素、炭酸カルシウド。 アンモニアガス、アンモニア水、リン酸マグ不シウノ4
.炭酸アンモニウトなどが用いられる。 培養終了後、培養液からL−グルタミン酸をjp−離す
る方法としては公知の方法、例えばイオン交換樹脂法、
溶媒抽出法などが用いられる。 以下に実施例をあげて本発明を具体的に示す。 実施例1 種菌としてコリ不バタテリウム・グルタミン酸G −4
1(F[iRM []]P−1652を用いた。G−4
1株を、グルコース40g/II!、ペプトン10g/
L肉エキス5g/J、酵母エキス5g/l。 Kl(2PO,Ig/β、 K2HP O41g/ j
!。 Mg504 ・TIItOO,5g/ R,F e S
O*・711J0 2 (1mg/ It、Mn S
o−・ 4 O2020mg/12.尿素5 g/ R
,(NH4)2SO45g/ j’からなる種J8地(
pi−(7,2) 20mlを含んだ300m1容三角
フラスコに接種し、30℃で24時間培養した。この種
培養液7mlを生産培地〔グルコース77g/L尿素7
.7 g/R,(NIl、)、So。 3g/!!、Kl[2POa 1.5g/β、に2l−
(PO。 1.5g/j’、Mn5O+・41−1,0 30mg
/Lビオチン77μg/L バントデン酸カルシウl、
770メzg/β、ニコチン酸アミド77fb1g/j
’。 チアミン・lIC1300q/j! (plI7.2)
]113mを含んだ300m1容三角フラスコに接種し
、さらにペニシリンGを最終潰度5単位/ m lにな
るように添加して34℃で振盪培養した。培養中、培養
液のpHを6.5から8.0に保つように、殺菌したI
0%尿素溶液0.5mlを添加しながら30時間培養
した。培養終r後、培養液中の[4−グルタミン酸生成
量を測定したところ、培養液中に27,2mg / m
Iの1、−グルタミン酸が蓄積していた。対照として
親株であるB−15株を前記と同様にして培養した結果
24. :3 mg/ mlのし一グルタミン酸が生成
していた。 実施例2 下記の組成の生産培地20m1を含んだバッフル板付の
300m1容三角フラスコに、実施例1と同様にして得
たG−41株またはG −42(pt:+++J[IP
−1875)株の種培養液1mlをそれぞれ接種して、
30℃で40時間、211) rpmの振盪条件ドで振
盪培養した結果、(、−41株はl [1,2mg/
mlの1、−グルタミン酸を、G−42株は49 mg
/ ml□、) L。 −グルタミン酸をそれぞれ培養液中に蓄積していた。対
照とした親株B−15株およびG−40株の場合の【7
−グルタミン酸の蓄積−nは0.1 mg/m1以下で
あった。 生産培地の組成:廃糖蜜100g/J! (グルコース
換算)、(NH,>250.20g/R。 K112PO40,5g/L Mg5On・7H300
、5g / l 、尿素3g/1.Fe50*・7)h
。 10+ng/i’、チアミン4(Cj! 2.5mg
/J、ビオチン500ug/ J!、 Ca COz
30 g/ I!p H7,2 発明の効果 本発明によれば、L−グルタミン酸を収率よく安価に製
造することができる。
付与した変異株を用いることによりL−グルタミン酸の
生産性が向上することを見出し本発明を完成した。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明は、コリネ」14ノグルタミン酸生産菌に属し、
α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性、またはイソシトレ
ートリアーゼ活性とα−ケトグルタル酸脱水素酵ぶ活性
の両方が著しく低1ζし、かつL−グルタミン酸生産能
をイ「する微生物、または該微生物にさらにプロリンア
ナログに対する耐性を付L7゜した微生物を培地に培養
し、培養物中に1.−グルタミン酸を生成蓄積させ、該
培養物からL−グルタミン酸を採取することを特徴とす
るし一グルタミン酸の製造法を促供する。 本明細書に
おいて、−1り不望グルタミン酸生産菌とは、コリネバ
タテリウム属、プレビバクテリウ!−属、ミタτ]バク
テリウムl1iiに属する一Iffのグルタミン酸生産
菌4いう(「発酵と工業」、第40巻、 Io2rt
、 +:+g2年)。 本発明に使用する微生物としては、コリネILJグルタ
ミン酸生産菌に属し、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活
性、またはイソシトレー) IJアーゼ活性とα−ケト
グルタル酸脱水素酵素活性の両方が著しく低下した微生
物、または該微生物にさらにプロリンアナ[1グに対す
る耐性を付与した微生物であればいずれでも使用できる
。ブ[]リンアアナ】グとしては、3.4−テ゛ヒト「
】プロリン、4−チオブ[1リン、アゼチジンカルボン
酸などがあげられる。さらにこれらの微生物は、これら
の性質に加えて他の性質、例えば名種栄養要求性、桑剤
耐性。 薬剤感受性、薬剤依存性などを併せて持っていてもよい
。 このような微生物は、通常の変異処理法、例えば紫外線
照射またはN−メチル−N′−二トローN=ニトロソグ
アニジン(NTG)や亜硝酸などの化学処理を施した細
胞群の中から常法により得ることができる。また、この
ような性質を持つ微生物は、池の遺伝的手法、例えば遺
伝1組換え法。 形質導入法、細胞融合法などによっても誘導することが
できる。 イソシトレートリアーゼ活性の低下した変)′1j株は
、グルコースは資化するが、酢酸は資化しない変異株か
ら容易に分離することができる。さらに、イソシトレー
トリアーゼ活性の低下に加えてα=ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した変5^株は、1−述のインシトレ
ートリアーゼ活性の低ドした変異株を親株として変異処
理を行い、グルコースは資化するが、クエン酸は資化し
ない変異株から容易に分離することができる。 さらに、プロリンアナログに対する耐性を有ずろ変異株
は、上記の変異株を親株とし°C変異処理を行い、親株
が生育できない濃度のブ[]リンアナTJグを含む最少
寒天培地で生育できる変異株から容易に分離することが
できる。 以下に、本発明の使用菌株の代表例であるコリネバクテ
リウド・グルタミクムG−41(イソシトレートリアー
ゼ活性欠失−α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性欠失性
斐異様)の具体的な誘導法について述べろ。 コリネバクテリウl、・グルタミクムB−15(微工研
菌寄第7982号、以下!3−15と称す)の細胞を(
]、 I BJ定のトリスマレイン酸緩(÷[液(11
16、0>中に10′1個/ m lになるようにQ、
Erした。 これに、N T Gを最終濃度t)、2mg/mlにな
るように添加し、室温で30分間放置後グルコースを唯
一・の炭素源とする最少寒天培地〔グルコース()、5
g/a、 KtLPo、 0.15 g/dR,K2
tl Po。 0.05g/a、NaC1O,01g/d、Mg5O,
−71−LOO,05g/J、CaCR2・2■I20
1μg/m1.Fe5On・7H2010μg/ml。 MnCRz’ 4Ha0 7ug/ml、チアミン−1
1CI!。 [1,I μg/ml、 (N H<)2S 0.0.
15 g/a、ビスチン30 μg / a’ 、寒天
1.5 g/di! (Na011でp 117.2に
調整)〕の表面に9抹し、30℃で30間静置jΔ養し
た。 ついで、コロニー状に生育した細胞を、上述の最少寒天
培地と、酢酸を唯一の炭素源とする最少寒天培地(上述
のグルコース培地からグル:ノースを除き、0.5g/
aの酢酸を添加した培地)にレプリカ法で転写して、3
0℃で3日間静置培養を行った。その結果、グルコース
を炭素源とする最少培地では生育するが酢酸を炭素源と
する最少培地では生育しない変異株を多数()だ。 これらの変異株をグルコース右よび酢酸を炭素源とする
液体培地〔グルコース3%、酢酸アンモニウム2%、
(N+−1,)2So、 0.1%、 K al−1
t’ O−0,2%、Mg 504 ・7HaO(1
,05%、ビオチン500μg/β、チアミン・HCl
500μg/β、パントテン酸カルシウム500.z
!。 −”−、lJチン酸アミド500ttg/R,CaC0
:+ 2%。 (p H7,2) ] 50mlを含んだ300m1容
三角フラスコで21 Orpmの振盪条件下で好気的に
培養した。得られた菌体を集めて、これを超音波菌体破
砕機にかけて菌体を破砕し、これを12.00Orpm
の回転数の遠心分離機で遠心分離した。得られた」−澄
液中のイソシトレートリアーゼ活性をメンラド・インー
xンザイモロジー(Methods in Enzym
ology)。 第1:(巻、163頁(+969>記載の方法に従って
dl11定し、活性の著しく低下した変異株としてG
−40を選択した。 こうして得られたG−40を上述と同様にN i’ G
処理をして、グルコースを炭素源とする最少培地に塗抹
し、生育したコロニーを、上述のグル:ノースを炭素源
とする最少寒天培地とクエン酸を炭素源とする最少寒天
培地(上述のグルコースを炭素源とする最少寒天培地か
らグルコースを除き、クエン酸ナトリウム0.5g/a
を添加した培地〉の両方に塗抹し、グルコース培地では
生育するがクエン酸培地では生育しない変異株を多数分
離した。 これらの変異株を、上述のイソシトレートリ゛r −ゼ
活性の測定の場合と全く同様に、液体培養して集菌し菌
体破砕して菌体抽出物をi)、各々についてα−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素活性をアグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリイ(^gric、 Ri
a!、 [:hem、 )第44巻(1980)に記載
の方法に従って測定した結果、α−ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した株としてG−41株を選択した。 上記のようにして41)られたイソシトレートリアーゼ
活性およびα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性の両方が
著しく低下したG−41株は、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムG 41 (FERM BP−1652
>として、昭和63年1月14日付で工業技術院微生物
工業技術研究所(微工研)に寄託されている。 さらに、上記で得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クムG−41株を親株として、プロリンアナログ〈3,
4−デヒドロプロリン)に対する耐性を有する変異株を
、以下のようにして誘導した。 ブイヨン寒天スラント培地で一夜生育させたG−41株
(FERM BP−1652)の細胞を、■09個/m
lになるように1/15!J )リス−マレイン酸緩衝
液に懸濁し、これにNTGを250μg/mlの濃度に
なるように添加して、室温で30分間放置した。 細胞を遠心分離で集め、」−記と同じ容量の1/15M
トリスーマレイン酸緩衝液に再懸濁して、この0.1m
lを50mg/d1の3.4−デヒドロプロリンを含む
最少寒天培地〔グルコース0.5g/!1!。 (Nl+4>23O40,15g/di、 Kll□P
O40,15g / a。 KJr’On 0.0 5 g/d1. Na1
J 4.6 g/a、 !JgS口、・7112
0 (]、05g/d1. [alJ2”211JO
lμg/ml。 FcS口a ・ 71120 1 0 μg/+t+
l、 1JnlJ 2 ・ 4L0 7 μg/n+
I。 チアミン・1ltJO,lμg/1Tll、ビオチン3
0μg/It。 寒天1.5 g / c/j! (Na0llでpH7
,2に調整)〕の表面に塗抹し、30℃で3日間静置培
養した。3.4−デヒド(IIプrJIJンを添加した
培地の表面には、3.4−デヒドロプロリン耐性株が約
250個のコロニーとして生育した。これに対し、3,
4−デヒドロプロリン無添加の対照培地では、菌は培地
の全表面に生育した。生育した3、4−デヒドロプロリ
ン耐性株のうち100株を釣菌し、後述の実施例1の方
法でし一グルタミン酸生産試験を行った結末、L−グル
タミン酸生産性の優れた菌としてG−42株を選択した
。 上記のようにして得られた3、4−デヒドロプロリンに
対して耐性を有するG−42株は、コリネバクテリウム
・グルタミクムG −42(FBRM BP−1845
)古して、昭和63年51111rJ付で微工研に寄
託されている。 十、記の微生物を培養する」?1地としては、炭素源。 窒素源、無機塩類、生育因fなどを含有する栄養培地ま
たは合成培地が用いられる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 シュークロース、 糖蜜、デンプン、デンプン加水分解
物、果汁などの炭水化物、エタノール、メタノール、ブ
「1パノールなどのアルコール類が使用できる。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニノ・、リン酸アンモニウト。 MI’i12アンモニウ11.尿素、アンモニア、アミ
ン類。 ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・
リカー、カゼイン加水分解物、各種発酵菌体およびその
消化物が使用できる。 jlit 61塩としては、リン酸−カリウl4.リン
酸二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシラ!
・、塩化す) IJウド、硫酸第一鉄、硫酸マンガン。 炭酸力ルシウl、などが使用できる。 栄養便求性を示す変異株を使用する場合には、栄4%物
を枕品もしくはそれを含有する天然物として添加するこ
とができる。 培n条件としては、通気攪拌などの好気的条件下で、培
養温度は24〜37℃、培養[]数は2〜70間である
。培養液のpHは5〜9の範囲に維持する。pI−(の
1栗整には尿素、炭酸カルシウド。 アンモニアガス、アンモニア水、リン酸マグ不シウノ4
.炭酸アンモニウトなどが用いられる。 培養終了後、培養液からL−グルタミン酸をjp−離す
る方法としては公知の方法、例えばイオン交換樹脂法、
溶媒抽出法などが用いられる。 以下に実施例をあげて本発明を具体的に示す。 実施例1 種菌としてコリ不バタテリウム・グルタミン酸G −4
1(F[iRM []]P−1652を用いた。G−4
1株を、グルコース40g/II!、ペプトン10g/
L肉エキス5g/J、酵母エキス5g/l。 Kl(2PO,Ig/β、 K2HP O41g/ j
!。 Mg504 ・TIItOO,5g/ R,F e S
O*・711J0 2 (1mg/ It、Mn S
o−・ 4 O2020mg/12.尿素5 g/ R
,(NH4)2SO45g/ j’からなる種J8地(
pi−(7,2) 20mlを含んだ300m1容三角
フラスコに接種し、30℃で24時間培養した。この種
培養液7mlを生産培地〔グルコース77g/L尿素7
.7 g/R,(NIl、)、So。 3g/!!、Kl[2POa 1.5g/β、に2l−
(PO。 1.5g/j’、Mn5O+・41−1,0 30mg
/Lビオチン77μg/L バントデン酸カルシウl、
770メzg/β、ニコチン酸アミド77fb1g/j
’。 チアミン・lIC1300q/j! (plI7.2)
]113mを含んだ300m1容三角フラスコに接種し
、さらにペニシリンGを最終潰度5単位/ m lにな
るように添加して34℃で振盪培養した。培養中、培養
液のpHを6.5から8.0に保つように、殺菌したI
0%尿素溶液0.5mlを添加しながら30時間培養
した。培養終r後、培養液中の[4−グルタミン酸生成
量を測定したところ、培養液中に27,2mg / m
Iの1、−グルタミン酸が蓄積していた。対照として
親株であるB−15株を前記と同様にして培養した結果
24. :3 mg/ mlのし一グルタミン酸が生成
していた。 実施例2 下記の組成の生産培地20m1を含んだバッフル板付の
300m1容三角フラスコに、実施例1と同様にして得
たG−41株またはG −42(pt:+++J[IP
−1875)株の種培養液1mlをそれぞれ接種して、
30℃で40時間、211) rpmの振盪条件ドで振
盪培養した結果、(、−41株はl [1,2mg/
mlの1、−グルタミン酸を、G−42株は49 mg
/ ml□、) L。 −グルタミン酸をそれぞれ培養液中に蓄積していた。対
照とした親株B−15株およびG−40株の場合の【7
−グルタミン酸の蓄積−nは0.1 mg/m1以下で
あった。 生産培地の組成:廃糖蜜100g/J! (グルコース
換算)、(NH,>250.20g/R。 K112PO40,5g/L Mg5On・7H300
、5g / l 、尿素3g/1.Fe50*・7)h
。 10+ng/i’、チアミン4(Cj! 2.5mg
/J、ビオチン500ug/ J!、 Ca COz
30 g/ I!p H7,2 発明の効果 本発明によれば、L−グルタミン酸を収率よく安価に製
造することができる。
Claims (3)
- (1)コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、α−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素活性が著しく低下し、かつL−グル
タミン酸生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にL−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培養物からL
−グルタミン酸を採取することを特徴とするL−グルタ
ミン酸の製造法。 - (2)該微生物が、さらにイソシトレートリアーゼ活性
が著しく低下した微生物である請求項1記載の製造法。 - (3)該微生物が、さらにプロリンアナログに対して耐
性を有する微生物である請求項1〜2記載の製造法。
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-
1988
- 1988-05-27 JP JP12972088A patent/JP2578474B2/ja not_active Expired - Fee Related
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US8278074B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-10-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid |
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JP2578474B2 (ja) | 1997-02-05 |
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