JP2995816B2 - 発酵法によるｌ―リジンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―リジンの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。
Ｌ−リジンは飼料用、医薬品用に利用される重要なアミ
ノ酸である。
Ｌ−リジンは飼料用、医薬品用に利用される重要なアミ
ノ酸である。
従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法としては、Ｓ
−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下AECと
記す）耐性菌を使用する方法（特公昭48−28078号公
報）、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン要求性変異株を
使用する方法（特公昭42−55213号公報）、AEC耐性でか
つＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
アルギニン、あるいはＬ−アラニン要求性変異株を使用
する方法（特開昭49−36888号、特公昭55−1040号、特
公昭51−21078号各公報）、β−フロロピルビン酸感受
性変異株を使用する方法（特公昭57−14157号公報）、
ピルビン酸キナーゼ活性低下変異株を使用する方法（特
開昭58−170487号公報）、ピルビン酸キナーゼ活性及び
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変異株を使
用する方法（特開昭60−168393号公報）等が知られてい
る。
−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下AECと
記す）耐性菌を使用する方法（特公昭48−28078号公
報）、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン要求性変異株を
使用する方法（特公昭42−55213号公報）、AEC耐性でか
つＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
アルギニン、あるいはＬ−アラニン要求性変異株を使用
する方法（特開昭49−36888号、特公昭55−1040号、特
公昭51−21078号各公報）、β−フロロピルビン酸感受
性変異株を使用する方法（特公昭57−14157号公報）、
ピルビン酸キナーゼ活性低下変異株を使用する方法（特
開昭58−170487号公報）、ピルビン酸キナーゼ活性及び
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変異株を使
用する方法（特開昭60−168393号公報）等が知られてい
る。
ブレビバクテリウム属のＬ−リジン生産変異株による
Ｌ−リジンの生産収率を更に高めることを目的としてい
る。
Ｌ−リジンの生産収率を更に高めることを目的としてい
る。
本発明者らは上述の課題を解決するために種々検討の
結果、ブレビバクテリウム属の従来知られているＬ−リ
ジン生産菌に更にα−ケト酪酸に対する耐性を付与せし
めたところ、従来のＬ−リジン生産菌より更に大量にＬ
−リジンを生産することを見いだした。本発明はこの知
見に基づいて更に研究の結果完成されたものである。
結果、ブレビバクテリウム属の従来知られているＬ−リ
ジン生産菌に更にα−ケト酪酸に対する耐性を付与せし
めたところ、従来のＬ−リジン生産菌より更に大量にＬ
−リジンを生産することを見いだした。本発明はこの知
見に基づいて更に研究の結果完成されたものである。
本発明のＬ−リジン製造法において用いられる微生物
は、ブレビバクテリウム属に属し、α−ケト酪酸に耐性
を有し、かつＬ−リジンを生産能を有する変異株であ
る。これらの性質の他に更にAEC耐性、Ｌ−ホモセリン
要求性、Ｌ−スレオニン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、
Ｌ−アラニン要求性、γ−メチルリジン耐性、α−クロ
ロカプロラクタム耐性、β−フロロピルビン酸感受性、
クエン酸シンターゼ活性低下、ピルビン酸キナーゼ活性
低下、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下等の性質を
付与せしめた菌株を用いることにより、更にＬ−リジン
の生産能を増大させる事ができる。
は、ブレビバクテリウム属に属し、α−ケト酪酸に耐性
を有し、かつＬ−リジンを生産能を有する変異株であ
る。これらの性質の他に更にAEC耐性、Ｌ−ホモセリン
要求性、Ｌ−スレオニン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、
Ｌ−アラニン要求性、γ−メチルリジン耐性、α−クロ
ロカプロラクタム耐性、β−フロロピルビン酸感受性、
クエン酸シンターゼ活性低下、ピルビン酸キナーゼ活性
低下、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下等の性質を
付与せしめた菌株を用いることにより、更にＬ−リジン
の生産能を増大させる事ができる。
本発明の親株はいわゆるＬ−グルタミン酸生産菌とし
て知られているブレビバクテリウム属の微生物である。
例えば ブレビバクテリウム・デバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 等がある。本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を
親株として変異操作を施し、α−ケト酪酸耐性及びＬ−
リジン生産能、例えばAEC耐性、を付与することによっ
て得られる。なお変異操作は紫外線照射、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下NGと記
す）、亜硫酸等の変異誘起剤による処理等、通常の変異
処理法で行なうことができる。
て知られているブレビバクテリウム属の微生物である。
例えば ブレビバクテリウム・デバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 等がある。本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を
親株として変異操作を施し、α−ケト酪酸耐性及びＬ−
リジン生産能、例えばAEC耐性、を付与することによっ
て得られる。なお変異操作は紫外線照射、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下NGと記
す）、亜硫酸等の変異誘起剤による処理等、通常の変異
処理法で行なうことができる。
以下に本発明の使用菌株の２例ブレビバクテリウム・
フラバムAJ12526（FERM P−11490）とブレビバクテリウ
ム・フラバムAJ12527（FERM P−11491）の具体的な変異
誘導分離方法及びそれらのα−ケトン酪酸に対する耐性
の度合を示す実験例を示す。
フラバムAJ12526（FERM P−11490）とブレビバクテリウ
ム・フラバムAJ12527（FERM P−11491）の具体的な変異
誘導分離方法及びそれらのα−ケトン酪酸に対する耐性
の度合を示す実験例を示す。
ブレビバクテリウム・フラバムFA1−30（K.Sano,I.Sh
iio,J.Gen.Appl.Microbiol,16,373（1970）参照，特公
昭48−28078号公報記載のFAECI−30（FERMP−282）と同
株である）を親株として使用した。ブレビバクテリウム
・フラバムAJ12526の誘導は次の通りである。親株FA1−
30を1500μg/mのNGで30℃15分間処理した（生残率4.1
％）のち、第１表に示す合成培地に親株が生育できない
濃度である7mg/mのα−ケト酪酸を添加して作成した
平板培地を塗布した。30℃８日間の培養後培地上にコロ
ニーとして生育する菌株即ちα−ケト酪酸耐性株を採取
し、これよりＬ−リジン生産能のすぐれた変異株AJ1252
6株を選択した。一方ブレビバクテリウム・フラバムAJ1
2527の誘導はAJ12526株と同様の方法で誘導したが、NG
処理における生産率は33％、又合成培地には4mg/mの
α−ケト酪酸の他に4mg/mのDL−アスパラギン酸ハイ
ドロキサメートを添加し、30℃７日間の培養で現われて
きた耐性株の中から選択した。
iio,J.Gen.Appl.Microbiol,16,373（1970）参照，特公
昭48−28078号公報記載のFAECI−30（FERMP−282）と同
株である）を親株として使用した。ブレビバクテリウム
・フラバムAJ12526の誘導は次の通りである。親株FA1−
30を1500μg/mのNGで30℃15分間処理した（生残率4.1
％）のち、第１表に示す合成培地に親株が生育できない
濃度である7mg/mのα−ケト酪酸を添加して作成した
平板培地を塗布した。30℃８日間の培養後培地上にコロ
ニーとして生育する菌株即ちα−ケト酪酸耐性株を採取
し、これよりＬ−リジン生産能のすぐれた変異株AJ1252
6株を選択した。一方ブレビバクテリウム・フラバムAJ1
2527の誘導はAJ12526株と同様の方法で誘導したが、NG
処理における生産率は33％、又合成培地には4mg/mの
α−ケト酪酸の他に4mg/mのDL−アスパラギン酸ハイ
ドロキサメートを添加し、30℃７日間の培養で現われて
きた耐性株の中から選択した。
次にこれらAJ12526株、AJ12527株のα−ケト酪酸に対
する耐性の度合を調べた結果をDL−アスパラギン酸ハイ
ドロキサメート及びそれとα−ケト酪酸共存に対する結
果とともに第２表に示す。第１表の合成培地より寒天を
除いた組成の培地（5mlづつ試験管に分注）で30℃、16
時間培養したFA1−３株、AJ12526株及びAJ12527株を、
第１表の合成培地にα−ケト酪酸及びDL−アスパラギン
酸ハイドロキサメートを第２表中に示す濃度になるよう
に溶解して作成した平板培地（直径8.5cm）にそれぞれ
第２表に示した菌量接種した後、30℃で３日間培養し
た。それぞれの菌株の生育の状態を第２表に示す。
する耐性の度合を調べた結果をDL−アスパラギン酸ハイ
ドロキサメート及びそれとα−ケト酪酸共存に対する結
果とともに第２表に示す。第１表の合成培地より寒天を
除いた組成の培地（5mlづつ試験管に分注）で30℃、16
時間培養したFA1−３株、AJ12526株及びAJ12527株を、
第１表の合成培地にα−ケト酪酸及びDL−アスパラギン
酸ハイドロキサメートを第２表中に示す濃度になるよう
に溶解して作成した平板培地（直径8.5cm）にそれぞれ
第２表に示した菌量接種した後、30℃で３日間培養し
た。それぞれの菌株の生育の状態を第２表に示す。
尚本発明で言うα−ケト酪酸耐性とは上記培養条件に
おいてα−ケト酪酸を5mg/ml含む上記培地に微生物をお
よそ107コ接種し、30℃で３日間の培養後中程度以上の
生育を示す場合を言う。
おいてα−ケト酪酸を5mg/ml含む上記培地に微生物をお
よそ107コ接種し、30℃で３日間の培養後中程度以上の
生育を示す場合を言う。
また親株FA1−30は5mg/mのDL−アスパラギン酸ハイ
ドロキサメートに耐性であるが、これを共存させるとα
−ケト酪酸に対する感受性を高め、この条件下で分離し
た変異株AJ12527はDL−アスパラギン酸ハイドロキサメ
ート共存下でα−ケト酪酸に強い耐性を示した。
ドロキサメートに耐性であるが、これを共存させるとα
−ケト酪酸に対する感受性を高め、この条件下で分離し
た変異株AJ12527はDL−アスパラギン酸ハイドロキサメ
ート共存下でα−ケト酪酸に強い耐性を示した。
Ｌ−リジン生産用の培養培地は特に制限するところは
なく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量
栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては炭
水化物（グルコース、フラクトース或いはデンプン、セ
ルロース等の加水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、ク
エン酸等）、アルコール（グリセリン、エタノール等）
或いは炭化水素（ノルマルパラフィン等）が使用でき
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ア
ンモニアガス、その他を、無機塩としてはリン酸塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、その
他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微量栄養
素としては、栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸、ビ
タミン、味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母エキ
ス、ペプトン、カザミノ酸等が使用できる。
なく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量
栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては炭
水化物（グルコース、フラクトース或いはデンプン、セ
ルロース等の加水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、ク
エン酸等）、アルコール（グリセリン、エタノール等）
或いは炭化水素（ノルマルパラフィン等）が使用でき
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ア
ンモニアガス、その他を、無機塩としてはリン酸塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、その
他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微量栄養
素としては、栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸、ビ
タミン、味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母エキ
ス、ペプトン、カザミノ酸等が使用できる。
培養条件は通常の方法でpH5ないし９、温度は20ない
し40℃で好気的条件下で24ないし72時間培養すれば良
い。培養中にpHが下がる場合には炭酸カルシウムを別殺
菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガス等の
アルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場合はpH
の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
し40℃で好気的条件下で24ないし72時間培養すれば良
い。培養中にpHが下がる場合には炭酸カルシウムを別殺
菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガス等の
アルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場合はpH
の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
培養液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂
法その他公知の方法を組み合せることにより行なわれ、
培地の種類によっては直接晶析法により行なうことも可
能である。得られたものは薄層クロマトグラム上のRf
値、液体高速クロマトグラフィーにおける溶出時間或い
は微生物定量法による生物活性値により、Ｌ−リジン標
品のそれらと一致することを確かめＬ−リジンと同定し
た。以下実施例にて本発明をさらに説明する。
法その他公知の方法を組み合せることにより行なわれ、
培地の種類によっては直接晶析法により行なうことも可
能である。得られたものは薄層クロマトグラム上のRf
値、液体高速クロマトグラフィーにおける溶出時間或い
は微生物定量法による生物活性値により、Ｌ−リジン標
品のそれらと一致することを確かめＬ−リジンと同定し
た。以下実施例にて本発明をさらに説明する。
下記第３表に示した組成のＬ−リジン生産用培地20m
を500m容の肩付フラスコに分注し、これを第４表に
示す菌株をそれぞれ２白金耳接種し、30℃で72時間振盪
培養した。それぞれの培養液中のＬ−リジン生成量は第
４表の如くであった。なおＬ−リジンの定量は酸性−銅
ニンヒドリン比色法で行なった。
を500m容の肩付フラスコに分注し、これを第４表に
示す菌株をそれぞれ２白金耳接種し、30℃で72時間振盪
培養した。それぞれの培養液中のＬ−リジン生成量は第
４表の如くであった。なおＬ−リジンの定量は酸性−銅
ニンヒドリン比色法で行なった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム属に属し、α−ケト酪
酸に耐性を有しかつＬ−リジンを生産する能力を有する
変異株を培養し、生成蓄積したＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20187690A JP2995816B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 発酵法によるｌ―リジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20187690A JP2995816B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 発酵法によるｌ―リジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0488991A JPH0488991A (ja) | 1992-03-23 |
| JP2995816B2 true JP2995816B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=16448336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20187690A Expired - Fee Related JP2995816B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 発酵法によるｌ―リジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2995816B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3510331B2 (ja) * | 1994-06-30 | 2004-03-29 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
-
1990
- 1990-07-30 JP JP20187690A patent/JP2995816B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0488991A (ja) | 1992-03-23 |
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| JPH0211238B2 (ja) |
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